ANDRIELE DOS SANTOS MAIA

MARISTELA DE LIMA BUENO

Efeito de glifosato sobre o desenvolvimento embrionrio de Xenopus laevis (teratognese e glifosato)

Relatrio preliminar Andres E. Carrasco Molecular Embriologia Laboratrio

Paranagu

2012

UEPR- CAMPUS FAFIPAR

Introduo

O comrcio mundial de pesticidas cresce a cada ano. Embora muitas mudanas e inovaes surjam conforme as necessidades do mercado, entre elas o advento das culturas transgnicas, resistentes a algumas pragas, o uso de herbicidas destacado visto que a maioria destas inovaes no impede o florescimento de ervas daninhas no campo.

Introduo

Atualmente, o herbicida glifosato (N-(fosfonometil) glicina, C3H8NO5P) no-seletivo, sistmico, ps-emergente, representa 60% do mercado mundial de herbicidas no seletivos, contabilizando um total de US$ 1,2 bilho/ano com vendas do produto.

Introduo

Um dos mais comuns herbicidas usados na agricultura, so do tipo Roundup contendo glifosato em vrias concentraes mais adjuvantes, detergentes que facilitam a absoro de glifosato pela planta.

Introduo

Todos os detergentes ou surfactantes so txicos para as clulas vivas, porque alteram sua membrana e mudam suas propriedades alterando a atividade metablica. As experincias foram realizadas para estudar os efeitos que podem ocorrer no desenvolvimento dos vertebrados, particularmente durante o perodo crtico de gastrulao, morfognese ( precoce).

introduo

As diluies recomendadas para a fumigao da indstria agroqumica, variando de 1 a 2% da soluo comercial (10 a20ml por litro) .Na realidade, as diluies utilizadas hoje em dia so acima destes valores (10% ou mais). No entanto, difcil determinar qual a situao real no modo de utilizao destes herbicidas, devido falta de informao e de controle do uso de doses necessrias nas culturas, no havendo estudos sobre a progressiva resistncia de plantas daninhas, biodegradao e possveis efeito no ambiente e na sade humana.

Introduo

Estudos anteriores experimentais do dano celular causado por glifosato em linhas de clulas animais utilizando marcadores de enzimas de dano mitocondrial (succinato desidrogenase) e morte celular programada (caspase 3/7) mostraram o efeito txico em doses inferiores a 10 a 1000 vezes menores do que as utilizadas na agricultura produzidas tanto pelo herbicida comercial como glifosato puro.

(BENACHOUR et al, 2005; BENACHOUR e SERALINI, 1997; ERIC, 2009) .

introduo

A morte celular programada (apoptose) um mecanismo que modula populaes e processos de formao e construo embrionria, de diviso celular, eliminando clulas que puderam se alterar de uma forma indesejada, cooperar para proporcionar e manter a forma do estruturas durante o desenvolvimento do embrio. Caspases so essenciais na apoptose celular, um dos principais tipos de morte celular programada durante o desenvolvimento

Outra contribuio reveladora realizada pelo grupo SERALINI, argumenta que as diluies do herbicida glifosato de ordem 1/1000 , podem destruir membranas e causar danos mitocondriais em culturas de clulas animais. necessrio analisar rigorosamente o problema em relao ao possvel efeito txico de misturas comerciais de herbicidas, incluindo qual a contribuio de glifosato puro sobre os possveis efeitos que foram at agora observados.

Introduo

De acordo com SERALINI glifosato puro parece atuar ao longo de primeiras 24 horas de ativao das caspases e induzir a morte celular (apoptose), em culturas de clulas, com a dose de 500 a 1000 vezes menores do que as utilizadas na agricultura e a 200 vezes inferiores s necessrias para causar dano membrana

Introduo

O glifosato pode interferir com um mecanismo, ainda no explorado, que faz parte da fisiologia normal das clulas no nosso modelo e, eventualmente, a formao de tecidos e rgos, enviados de receptores celulares especficos (intracelular ou membrana).Alm disso, chamou a ateno como uma interferncia no mecanismo de reparo fisiolgico do DNA que pode conduzir a acumulao e mutao em alguns tipos de clulas aumentando o risco de processos celulares malignos.

Introduo

O estudo do desenvolvimento embrionrio ideal para determinar a concentrao de um agroqumico, como o glifosato tanto para estudar mecanismos fisiolgicos que conduzem a produzir clulas cancerosas ou as alteraes durante o desenvolvimento, como observado nesse estudo.

Objetivos

Descriminar a possvel atividade txica de cada componente na mistura comercial e determinar as semelhanas e as diferenas entre os herbicidas e seus aditivos, e a ao do glifosato puro.

Metodologia

Concentraes da soluo de herbicida:

A concentrao estimada de glifosato no herbicida utilizado esta estimada entre 500 e 600 g / l.

Diluies para a pulverizao na agricultura so definidos entre 1% e 30%.

Isto iguala sprays que variam de 6 g / litro a 200 g / l, respectivamente.

Metodologia

Anlise dos resultados e estratgias empregadas:1. Por imerso: como embries desenvolvem num meio lquido, imerso numa soluo salina semelhante ao ambiente natural, com as diluies do herbicida comercial de 1/5000.2. Para microinjeo. Glifosato puro foi injetada em uma das duas primeiras clulas embrionrias. (PERUZZO et al, 2008 )

Metodologia

3. Marcadores moleculares.

Anlise de efeitos nos embries em diferentes estgios de desenvolvimento foi realizada utilizando a tcnica de hibridao in situ para detectar a expresso especfica de genes marcadores de territrios e populaes de clulas da placa neural precoce, formao eixo anteroposterior embrionrio, estruturas rombencefallicas e crista neural, etc.) O padro de formao da cartilagem enceflica em girinos, foram analisados utilizando colorao com azul Alcian.

Resultados

1. Embries de anfbios Xenopus laevis foram incubadas por imerso no herbicida em diluies de 1/5000, a partir de duas clulas para anlise de fase experimental. A diluio correspondente a doses de glifosato entre 50 e 1540 vezes menos do que os utilizados no campo (nas faixas de diluio de 1% a 30%, respectivamente) e 5000 vezes menores que a soluo comercial. Doses maiores matam os embries.

Resultados

2. Embries de Xenopus laevis foram injetados com 5 nl(nanolitro) de glifosato puro em um blastmero no estdio de duas clulas e deixa-se desenvolver a diferentes fases do desenvolvimento embrionrio. O glifosato em embries injetados representa cerca de 10.000 a 300.000 vezes menores do que as utilizadas no campo (nas faixas de diluio compreendida entre 1% e 30%, respectivamente).

Resultados

Experincias de Imerso de Herbicida :A reduo do comprimento do embrio, alteraes que sugerem defeitos na formao do eixo embrionrio.Alterao do tamanho da regio ceflica comprometendo a formao do crebro e reduo dos olhos e alterao dos arcos branquiais e placode auditiva. A alterao dos mecanismos de formao da placa neural evidenciado por uma diminuio nos neuronios primrios que podem como anteriormente observados em outros casos, afetar o desenvolvimento normal do crebro, tubo neural ou outros dficits no sistema nervoso. (FRANCO et al, 1999 e PAGANELLI et al,2001)

Resultados

Experimentos com glifosato puro:

Alteraes na formao e / ou especificao da crista neural craniana. (A crista neural craniana um conjunto de clulas ordenadas em uma rea adjacente as bordas externas da placa neural que tem como destino, entre outros, com os arcos branquiais, a formao de ossos e cartilagens facial).

Metodologia

Qualquer alterao deformada pelo fracasso da diviso celular ou a morte celular programada nesta regio conduz a graves deformidades faciais.No caso dos embries injetados observamos uma diminuio nos marcadores de tecido embrionrio compatvel com uma inibio da expresso do mesmo ou de um nmero baixo de clulas.Sugere-se que a consequncia disto vai resultar em uma deformao da cartilagem (condrognese craniana) ceflica que constituem um padro que forma os ossos da face.

Metodologia

Isto compatvel com a alterao da morte celular programada necessria para a organizao de forma e, portanto, malformaes do crnio, como sugerido em estudos ecotoxicolgicos em anuros por (LAJMANOVICH et al __).O tubo intestinal mostra alteraes na rotao e tamanho, bem como possveis mudanas na regio cardiognica.

Discusso

A ao do glifosato em embries sugere um efeito especfico que distorce ou altera os processos biolgicos normais em regies e tecidos especficos. As doses utilizadas de glifosato so baixas oque permite a especular que no so suficientes para afetar membranas mitocondriais com a morte celular em massa, mas ato com o tempo necessrio para a ativao de caspases (enzimas associadas a apoptose) que provocam a morte celular programada em territrios especficos.

Discusso

Os efeitos observados de glifosato puro, em particular na crista neural cranial e os seus derivados, que pode ser eficazmente compatveis com alteraes na regulao da morte celular programada tal como foi referido por outros grupos de pesquisa e so particularmente relevantes j que ressaltamos experimentos de cultura celular do grupo de Seralini na Frana e no trabalho do grupo da Universidade Nacional del Litoral, em larvas de anfbios (Lajmanovich Touro et al. Enviro. Contam Toxicologia., 2003).

Discusso

Os resultados deste grupo de anfbios so incompatveis com as nossas observaes de experimentos embriolgicos. Por conseguinte, o fato de que nas experincias aqui apresentadas, tanto o glifosato quanto o herbicidas comercial afetam o desenvolvimento embrionrio afetando reas embrionrias discretas (cabea, olhos, intestinos guelras) formadas por tecidos e rgos especficos sugere que:

Discusso

1. Em cada ponto do desenvolvimento do embrio grupos de clulas selecionadas parecem ser mais sensveis ao glifosato do que outros, provavelmente devido a diferentes estados de funcionamento (diferenciao, proliferao ou migrao de clulas). Algumas clulas podem ter mais sensibilidade do que outros em um dado momento e possibilitando a ser afetados por glifosato (por exemplo, as populaes de clulas que esto em fase de diviso celular ou a morte celular ou apoptose).

Discusso

2. Consequentemente, os efeitos observados com doses aqui empregadas, em ambos os experimentos no destruram completamente o embrio (uma forma de morte celular massiva), mas alteram com uma intensidade diferente a forma e o desenvolvimento de regies morfognicas discretas.

Discusso

3. Outro aspecto a salientar que concentraes muito baixas de glifosato tal como aqui utilizado em relao aos utilizados no solo, produzem no embrio efeitos reprodutveis tanto morfolgicas quanto moleculares dimensionalmente. Pelo menos at aonde a interpretao dos marcadores moleculares permitiram-nos.

Discusso

4. Isto torna possvel interpretar que a subsistncia dos efeitos aqui relatados, produzido pelo glifosato, est associado com a interferncia dos mecanismos normais de regulao de desenvolvimento embrionrio.

Discusso

A conservao da mecnica, a regulao gentica, especificao e determinao de reas e populaes celulares durante o desenvolvimento embrionrio, bem estabelecido desde os anos 80, com a descoberta dos programas que conduzem a morfognese (genes Hox) e os avanos na interpretao de bases evolutivas de vertebrados podem ser inferidas a partir do princpio da preveno da cincia mdica que alteraes descritas so efetivamente extrapolados para o efeito sobre o desenvolvimento de qualquer vertebrado.

Discusso

O princpio da precauo tem precedncia sobre qualquer suspeita de danos na sade pblica. Os experimentos de microinjeo com posterior utilizao de marcadores moleculares de reas e/ou populaes celulares com quantidades discretas e controladas de glifosato puro em blastmeros embrionrios, tm a vantagem de estudar os efeitos nos estgios iniciais de desenvolvimento, quando os processos de morfognese esto moldando o embrio e associar diretamente o frmaco com o efeito observado, evitando as possveis variaes do ambiente e a interferncia de outros componentes.

Discusso

O enfoque estratgico desse estudo no ecotoxicolgico, mas trata com marcadores moleculares e outras tcnicas, a investigao dos mecanismos celulares prprios do desenvolvimento embrionrio normal, que puderam estar envolvidos em sua alterao.

Discusso

Portanto trata de independentes observaes experimentais das variaes do meio ambiente e das conhecidas diferentes sensibilidades prprias de cada espcie em seu meio natural (Ph, temperatura, concentraes variadas e diferentes mecanismos de absoro e excreo).