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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: SAÚDE COLETIVA ____________________________________________________________
Emanuelle Dayana Vieira Dantas
EFEITO IN VITRO DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA
ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA.
Dissertação de Mestrado
Natal, 2011
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Emanuelle Dayana Vieira Dantas
EFEITO IN VITRO DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA
ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA.
Dissertação de Mestrado
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Saúde Coletiva.
Orientador: Prof Dr Kenio Costa Lima.
Natal, 2011
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Dantas, Emanuelle Dayana Vieira.
Efeito in vitro da terapia fotodinâmica sobre bactérias orais em suspensão e
na formação de biofilme: ensaio com azul de metileno e toluidina ativados por
luz halógena.\ Emanuelle Dayana Vieira Dantas. – Natal, RN, 2011.
67 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Kenio Costa Lima.
Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade Federal do Rio Grande
do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em
Odontologia.
1. Fotoquimioterapia – Dissertação. 2. Halogenação – Dissertação. 3. Azul de
metileno – Dissertação. 4. Cloreto de tolônio – Dissertação. 5. Biofilmes -
Dissertação – Dissertação. 6. Cárie dentária. I. Lima, Kenio Costa. II. Título.
RN/UF/BSO Black D17
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
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Emanuelle Dayana Vieira Dantas
EFEITO IN VITRO DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA
ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Saúde Coletiva.
Aprovada em: _______/_______/__________
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________________ Prof. Dr. Kenio Costa de Lima
Orientador
_______________________________________________________________ Profa. Dra Isauremi Vieira de Assunção Pinheiro
Examinador Interno – UFRN
_______________________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Antônio Japiassú Resende Montes
Examinador Externo – UPE
5
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Jacinto Moreira Dantas e Sônia Maria Vieira Dantas,
pelo amor incondicional e pelo esforço em tornar possível cada um dos meus
sonhos. Obrigada por sempre acreditarem em mim! Todas as minhas conquistas
sempre serão dedicadas a vocês... Amo muito!!!
Aos meus irmãos, Emanuell e Ellyommany, pela amizade e pela certeza
de saber que sempre poderei contar com vocês.
Ao meu sobrinho, Emanuell Júnior, por me fazer conhecer uma nova
forma de amor e por encher nossa família de alegria com a sua chegada.
A Igor, meu amor e melhor amigo, pelo apoio, paciência, generosidade, e
por tantas outras razões que não caberiam aqui em palavras, mas que foram
essenciais ao longo desta jornada. Amo você!
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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu orientador, o Prof. Dr. Kenio Costa de Lima, pela amizade,
ensinamentos e paciência ao longo deste trabalho. Agradeço a oportunidade de
estar ao seu lado e poder aprender com você. Admiro sua competência, seu
caráter e sua inquietude em busca de conhecimento. Sem dúvida, uma fonte de
inspiração... Muito obrigada por tudo!
À Profa Dra Elizabethe Cristina Fagundes de Souza, minha orientadora
durante a iniciação científica e em parte deste curso de mestrado, pela
contribuição em minha formação acadêmica, pelo desprendimento e por ter me
permitido seguir em busca de novos anseios. Sempre lhe serei grata.
Aos alunos de iniciação científica, Annie Karoline e Hugo Lopes, pela
dedicação e empenho na etapa final deste trabalho. Meus sinceros
agradecimentos!
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AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, na pessoa de sua
Magnífica Reitora Profa. Dra. Ângela Maria Paiva Cruz; à Faculdade de
Odontologia, na pessoa de seu chefe de departamento Prof. Dr. Antonio
Ricardo Calazans e do coordenador do Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Prof. Dr. Kenio Costa de Lima, pela participação desta
conceituada instituição no meu crescimento profissional e pessoal.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão de bolsa de mestrado.
A todos os professores que integram o corpo docente do Programa de
Pós-Graduação em Odontologia da UFRN, pela contribuição acadêmica ao
longo deste curso de mestrado.
Às professoras Dra. Maria Celeste Nunes de Melo e Dra. Isauremi
Vieira de Assunção Pinheiro, membros da banca de qualificação, pelas
sugestões dadas para finalização deste trabalho.
Aos secretários Sandra Abrantes de Souza e Lucas Soares de Araújo,
pelo incentivo e inestimável ajuda.
Às queridas Amanda, Ana e Isabel, pela colaboração constante durante
os experimentos realizados no Laboratório de Microbiologia.
Às bibliotecárias Mônica Reis e Cecília dos Santos, pelo auxílio
dispensado para a organização deste trabalho.
Aos colegas de turma, em especial a Ângela Medeiros, Camila
Resende, Jônia Cybele e Neusa Sales, que trilharam comigo esse caminho,
compartilhando angústias e alegrias.
Às melhores amigas que alguém poderia ter, Adélia Danielli, Mércia
Cunha, Saziane de Sá, Silvana Nobre, Sofia Mariz e Virgínia Helena, pelo
apoio e incentivo constantes.
Ao Sr. Ronaldo Martins e Sra. Francilene Martins, meus sogros, por
terem me acolhido como uma filha.
E enfim, a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram
para concretização desta pesquisa.
Meus sinceros agradecimentos.
8
“O homem é do tamanho do seu sonho”.
- Fernando Pessoa
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RESUMO
A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido proposta como um método alternativo para o tratamento de doenças orais biofilme-dependentes, como a cárie dentária. Tal terapia consiste na ação simultânea de uma fonte luminosa (FL) e de um agente fotossensibilizante (FS), na presença de oxigênio tecidual, levando à produção de radicais livres que ao interagirem com componentes celulares bacterianos, promovem a morte celular. Este estudo tem como objetivo avaliar a ação antimicrobiana da TFD sobre bactérias orais em suspensão, bem como na formação de biofilmes mono e multiespécies, in vitro, a partir de uma cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e de amostras de saliva, respectivamente. Os corantes azul de metileno (CM) e azul de toluidina (CT) foram administrados na concentração de 100 mg/L e ativados por luz halógena (600 a 750 nm) proveniente de um aparelho fotopolimerizador modificado (Ultralux®, Dabi Atlante, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil.). Suspensões monoespécies e mistas foram preparadas e submetidas a diferentes condições experimentais: 1. TFD na presença de CT; 2. TFD na presença de CM; 3. irradiação sem administração de qualquer corante; 4. sensibilização com CT e ausência de luz; 5. sensibilização com CM e ausência de luz; 6. ausência de irradiação e sem qualquer corante (controle negativo) e 7. administração de solução de digluconato de clorexidina a 0,12% (controle positivo) (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA). A ação imediata e mediata da TFD sobre as suspensões bacterianas, bem como seu efeito sobre a formação de biofilme foram verificados, a partir do número de unidade formadoras de colônias por mL (UFC/mL) e de medidas de densidade ótica (DO). Os dados obtidos foram analisados estatisticamente através dos Testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, para o nível de significância de 5%. De acordo com os resultados, a TFD não apresentou ação antibacteriana sobre as suspensões de S. mutans, independente do corante utilizado. A TFD com CM ativado por luz halógena foi capaz de reduzir em 86,6% o número de UFC/mL diante de suspensões multiespécies, entretanto, tal redução não foi significativa (p > 0,05). A TFD apresentou efeito antibacteriano, mediato, sobre suspensões mistas, quer na presença de CT (p < 0,001) ou CM (p < 0,001), ativados por luz halógena. A TFD preveniu a formação de biofilme multiespécie, através da ativação de CT por luz halógena (p = 0,01). Conclui-se que a ativação dos corantes azul de toluidina e azul de metileno, pela luz halógena (TFD) apresentou ação antimicrobiana, frente a suspensões multiespécies preparadas a partir de amostras de saliva, ressaltando a possibilidade da utilização da terapia fotodinâmica como um método coadjuvante no tratamento de lesões de cárie dentária.
Palavras-Chave: Terapia fotodinâmica. Luz halógena. Azul de metileno. Azul de
toluidina. Bactérias orais. S. mutans. Cárie dentária.
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ABSTRACT
Photodynamic therapy (PDT) has been proposed as an alternative method for
the treatment of biofilm-dependent oral diseases like dental caries. This therapy
consists of simultaneous action of a visible light (L) and a photosensitizer (FS) in
the presence of oxygen, which leads to production of different reactive oxygen
species that can interact with the bacterial cell components, and promote cell
death. This study aims to evaluate the antimicrobial action of PDT on oral
bacteria in suspension, as well as the formation of mono and multi-species
biofilms, in vitro, from a standard strain of Streptococcus mutans (ATCC 25175)
and saliva samples, respectively. The dye methylene blue (MB) and toluidine
blue (TB) were used at a concentration of 100 mg/ L and activated by halogen
light (600 to 750 nm) from a modified hand held photopolymerizer (Ultralux ®,
Dabi Atlante, Ribeirão Preto , São Paulo, Brazil.). Planktonic cultures were
prepared and submitted to different experimental conditions: 1. PDT using TB 2.
PDT using MB, 3. L+ FS- , 4. TB + L - ; 5. MB+ L-; 6. L- FS- (negative control)
and 7. administration of 0.12% chlorhexidine digluconate (positive control)
(Periogard ®, Colgate-Palmolive Company, New York, USA). The immediate and
mediated action of PDT on bacterial suspensions, as well as its effect on biofilm
formation were observed from the number of colony-forming units per milliliter
(CFU/mL) and measures optical density (OD). The data were statistically
analyzed using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test for the significance
level of 5%. According to the results, the PDT showed no antibacterial action on
suspensions of S. mutans, regardless of the dye used. PDT with MB activated by
halogen light was able to reduce 86.6% CFU/mL multi-species planktonic
cultures, however, this reduction was not significant (p > 0.05). PDT showed
antibacterial effect, mediate on multi-species planktonic cultures with TB (p <
0.001) and MB (p < 0.001), activated by halogen light. PDT was able to prevent
the formation of multispecies biofilm, through the activation of TB by halogen light
(p = 0.01). We conclude that activation of the dye toluidine blue and methylene
blue, by halogen light (PDT) showed antimicrobial activity, compared to multi-
species planktonic cultures prepared from saliva samples.
Keywords: Photodynamic therapy. Halogen light. Methylene blue. Toluidine
blue. Oral bacteria. S. mutans. Dental caries.
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo I ............................................................................................................................. 24
Figura 2: Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo II ............................................................................................................................. 24
Figura 3: Fórmula molecular do corante azul de metileno.................................. 27
Figura 4: Fórmula molecular do corante azul de toluidina................................... 27
Figura 5: Esquema ilustrativo da obtenção de cultura a partir de uma cepa padrão de S. mutans............................................................................................ 32
Figura 6: Esquema ilustrativo da obtenção de culturas multiespécies, a partir de amostras de saliva.......................................................................................... 33
Figura 7: Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado................................................................................................................ 34
Figura 8: Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado, após remoção do filtro de onda............................................................. 34
Figura 9: Esquema ilustrativo da preparação das condições experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies....................................................... 36
Figura 10: Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito imediato da TFD............................................................ 37
Figura 11: Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD............................................................ 38
Figura 12: Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD na formação de biofilmes mono e multiespécies........................................................................................................ 39
Figura 13: Fotografia demonstrando grande crescimento bacteriano................. 44
Figura 14: Fotografia demonstrando ausência de crescimento bacteriano......... 44
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica e significância estatística para cada condição testada. Natal, 2011................................................................................................................... 39
Tabela 2. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 40
Tabela 3. Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 41
Tabela 4. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011.................................................................................................................. 42
Tabela 5. Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans. Natal, 2011................................................................................................................... 43
Tabela 6. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 45
Tabela 7. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 46
Tabela 8. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de metileno. Natal, 2011................................................................................................................... 47
Tabela 9. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011................................................................................................................... 48
Tabela 10. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies, e significância estatística, com o corante azul de toluidina. Natal, 2011................................................................................................................... 50
Tabela 11. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies, e significância estatística, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.......................... 51
Tabela 12. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies e significância estatística, com o corante azul de metileno. Natal, 2011............................................................................................................... 52
13
Tabela 13. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies e significância estatística, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011...................................................................................................................
53
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
FA - : ausência de fotoativação
FS - : ausência de fotossensibilizante
% : por cento
FA + : sem fotoativação
°C: graus Celsius
AlPcS2: fitalacionia dissulfonado de alumínio
ATCC: American Type Culture Collection / Coleção de Culturas Americanas BHI : brain heart infusion / infusão cérebro coração
CLX: clorexidina CM: corante azul de metileno CT: corante azul de orto-toluidina
DNA: deoxyribonucleic acid / ácido desoxirribonucleico
DO: densidade ótica
ERO: espécies reativas de oxigênio
FA: fotoativação
FL: fonte luminosa
FS: fotossensibilizante
h: hora
LED: light emmiting diode /diodo emissor de luz
M: meio puro
mg/L: miligrama por litro
mL: mililitro
mW/cm2: miliWatt por centímetro quadrado
nm: nanometro
PPgO: Programa de Pós-graduação em Odontologia
Q 25-75: quartis 25 e 75
RPM: rotações por minuto
15
S. mutans: Streptococcus mutans SPSS: Statistical Package for Social Sciences / Programa Estatístico para Ciências Socias
TFD: terapia fotodinâmica
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Zn: zinco
µl: microlitro
16
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 17 2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................... 19 2.1. Formação de biofilmes dentários e sua relação com a cárie.................... 19 2.2. Cárie dentária e sua abordagem terapêutica menos invasiva................... 21 2.3. Terapia Fotodinâmica................................................................................ 22 2.3.1. Substâncias fotossensíveis....................................................................... 25 2.3.2. Corantes fenotiazínicos............................................................................. 26 2.3.3. Fontes de luz............................................................................................ 28 2.3.4. Perspectivas de aplicação da TFD na Odontologia.................................. 29 3. OBJETIVOS.............................................................................................. 30 3.1. Objetivo geral ............................................................................................ 30 3.2. Objetivos específicos ................................................................................ 30 4. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................ 31 4.1. Tipo do estudo........................................................................................... 31 4.2. Ensaios in vitro.......................................................................................... 31 4.2.1. Linhagem bacteriana padrão..................................................................... 31 4.2.2. Preparo das suspensões de S. mutans..................................................... 32 4.2.3. Obtenção de amostras de saliva estimulada............................................. 32 4.2.4. Substâncias fotossensibilizantes e fonte luminosa.................................... 33 4.2.5. Preparação das placas.............................................................................. 34 4.2.6. Terapia Fotodinâmica................................................................................ 36 4.2.7. Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica............................... 37 4.2.8. Avaliação do efeito mediato da terapia fotodinâmica................................ 37 4.2.9. Avaliação do efeito da TFD na formação de biofilmes mono e
multiespécie............................................................................................... 38
4.3. Análise estatística...................................................................................... 39 5. RESULTADOS.......................................................................................... 40 5.1. Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização do
corante azul de toluidina............................................................................ 40 5.1.1. Suspensões multiespécies........................................................................ 40 5.1.2. Suspensões de S. mutans......................................................................... 41 5.2.
Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de metileno............................................................................
42
5.2.1. Suspensões multiespécies........................................................................ 42 5.2.2. Suspensões de S. mutans........................................................................ 43 5.3. Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com
utilização do corante azul de toluidina....................................................... 43 5.3.1. Análise a partir da contagem do número de UFC/mL............................... 43 5.3.2. Análise a partir da densidade ótica........................................................... 45 5.3.2.1. Influência dos produtos testados sobre a densidade ótica do meio de
cultura puro................................................................................................ 45 5.3.2.2. Suspensões multiespécies........................................................................ 46 5.3.2.3. Suspensões de S. mutans......................................................................... 47 5.4. Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com
utilização do corante azul de metileno....................................................... 48 5.4.1. Análise a partir da densidade ótica........................................................... 48
17
5.4.1.1. Suspensões multiespécies .................................................................. 48 5.4.1.2. Suspensões de S. mutans........................................................................ 49 5.5. Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de
biofilme com utilização do corante azul de toluidina.......................... 50 5.5.1. Análise a partir da contagem do número de UFC/mL............................... 50 5.5.2. Análise a partir da densidade ótica............................................................ 50 5.5.2.1. Suspensões multiespécies................................................................... 50 5.5.2.2. Suspensões de S. mutans......................................................................... 51 5.6. Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de
biofilme, com utilização do corante azul de metileno................................ 52 5.6.1. Análise a partir da densidade ótica............................................................ 52 5.6.1.1. Suspensões multiespécies........................................................................ 52 5.6.1.2. Suspensões de S. mutans......................................................................... 52 6. DISCUSSÃO.............................................................................................. 55 7. CONCLUSÃO............................................................................................ 61 REFERÊNCIAS........................................................................................ 62
18
1. INTRODUÇÃO
A terapia fotodinâmica consiste em um processo fotoquímico, no qual uma
substância fotossensibilizante (FS) é ativada pela exposição a uma luz, de
comprimento de onda específico, na presença do oxigênio26. Após ativação,
componentes moleculares da FS transferem energia para o oxigênio tecidual,
ocasionando a produção de formas iônicas altamente reativas, capazes de
promover oxidação de componentes essenciais à célula bacteriana, levando à
morte celular 50;57.
A terapia fotodinâmica tem sido estudada há mais de 100 anos, desde
que a morte de um microrganismo unicelular foi observada por Oscar Raab41,
em consequência da aplicação de um corante associado a uma fonte luminosa.
A partir da década de 70, seu uso clínico passou a ser difundido na área médica
devido aos bons resultados terapêuticos frente a diferentes tipos de câncer, além
de desordens oftalmológicas e dermatológicas 24. Desde a década de 90, o
interesse pelo efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica tem crescido e sua
aplicação no tratamento de infecções localizadas tem sido proposta7.
Nesse contexto, pesquisas envolvendo o desenvolvimento de terapias
antimicrobianas alternativas, como a fitoterapia e a TFD, têm sido conduzidas.
Uma das razões para justificar o desenvolvimento de tais terapias tem sido o
gradativo aumento da resistência de inúmeras espécies bacterianas frente às
terapias convencionais, pautadas basicamente no uso de antibióticos25.
A terapia fotodinâmica apresenta algumas vantagens frente à utilização
dos antimicrobianos químicos usuais: sua ação está confinada ao local de
aplicação, restrita à área de interesse; apresenta baixo risco de ocorrência de
resistência bacteriana, devido ao curto período de tempo necessário para causar
dano ou morte à célula bacteriana; é seletiva às células-alvo, diminuindo o risco
de lesar células do hospedeiro; e ainda não há relatos de ocorrência de reações
sistêmicas, mesmo após repetições de sua aplicação29.
No campo de pesquisas da Odontologia, a terapia fotodinâmica é
relativamente recente e tem sido investigada no tratamento das infecções orais
mais prevalentes: a cárie dentária, as doenças periodontais e infecções do canal
radicular 53;55.Os resultados obtidos em alguns trabalhos mostram seu efeito
antibacteriano, in vitro, frente a S. mutans 1; S. sobrinus59 e lactobacilos19. P.
19
gingivalis 28 e F. nucleatum 43, além de E. faecalis 48, patógenos frequentemente
envolvidos no desenvolvimento de infecções orais.
Diante disso, a terapia fotodinâmica poderia ser empregada como um
método coadjuvante ao tratamento conservador de lesões de cárie dentária,
devido à sua ação antibacteriana. Trata-se de um método não-invasivo, o que
contribuiria sobremaneira para a diminuição da quantidade de tecido dentinário a
ser removido, e conseqüentemente, preveniria o comprometimento do órgão
pulpar 55.
O aprimoramento do protocolo de aplicação da terapia fotodinâmica deve
visar além de segurança e efetividade, fatores como praticidade e custo, para
que sua adoção clínica seja viável. Logo, a utilização de aparelhos
fotopolimerizadores, como fontes de irradiação de luz, tem sido experimentada e
incentivada pelo fato destes equipamentos estarem usualmente presentes na
prática odontológica clínica e em nível de saúde pública 38;21;6.
Diante da grande variabilidade de metodologias descritas na literatura,
ainda se faz necessária a realização de estudos in vitro que busquem avaliar o
efeito TFD sobre bactérias orais, envolvidas com o desenvolvimento da cárie
dentária, quer em suspensões, quer organizadas em biofilme. Tais estudos irão
contribuir para a consolidação da terapia fotodinâmica como método coadjuvante
ao tratamento da cárie dentária, e conseqüentemente, para preservação de um
maior número de elementos dentários.
20
2. REVISÃO DE LITERATURA
Com o intuito de tornar a revisão de literatura mais elucidativa, essa foi
dividida, didaticamente, em três tópicos. O primeiro versará a respeito do
biofilme dentário e seu papel na rede de causalidade da cárie; o segundo
discorre sobre a cárie e a nova abordagem terapêutica em curso, menos
invasiva – Odontologia Minimamente Invasiva; e por fim, o terceiro, acerca da
terapia fotodinâmica e sua aplicação na Odontologia, como um método
coadjuvante no tratamento da cárie dentária, devido ao seu potencial
antibacteriano.
2.1 Formação de biofilmes dentários e sua relação com a cárie
A cavidade oral dos seres humanos é colonizada por uma grande
diversidade de microrganismos: fungos, protozoários, vírus e em maior número,
por bactérias31. A manutenção desses microrganismos na cavidade é
dependente da capacidade de se manterem aderidos a estruturas orais, diante
do desafio imposto por fatores locais como a função salivar de limpeza; as ações
de mastigação e de deglutição, além da descamação das superfícies mucosas
14.
Nesse sentido, certas bactérias orais apresentam vantagens competitivas,
principalmente, devido à sua capacidade de aderir seletivamente às superfícies
dentárias, estruturas duras, que não sofrem descamação, favoráveis à formação
e maturação do biofilme dentário 48. O termo biofilme é usado para descrever
uma comunidade de microrganismos aderidos a uma superfície, encerrados em
uma matriz extracelular e organizados em estrutura tridimensional 33.
A formação do biofilme dentário se dá minutos após a limpeza das
superfícies dos dentes, quando se inicia a deposição de uma camada acelular
sobre o esmalte, denominada película adquirida 36. Componentes salivares e do
fluido gengival (proteínas, glicoproteínas e lípidios), além de remanescentes
celulares bacterianos são os principais constituintes da película,
desempenhando papel determinante na colonização dos microrganismos
pioneiros 8.
Os estreptococos são os colonizadores iniciais, principalmente o S. mitis,
S. sanguinis e S. oralis, os quais juntos, correspondem a cerca de 95% da
21
microbiota total inicial, a qual ainda se somam o Actinomyces spp., Haemophilus
spp. e Neisseria spp. 14.
A especificidade da colonização bacteriana nos estágios iniciais é
mediada por interações físico-químicas entre moléculas presentes na superfície
bacteriana e proteínas salivares adsorvidas no esmalte, as quais atuam como
receptores no mecanismo de adesão bacteriana 15. O crescimento das bactérias
pioneiras aderidas leva à formação de microcolônias distintas, que através de
relações interbacterianas como coagregação, interações nutricionais e liberação
de bacteriocinas, mediam a sucessão microbiana, contribuindo para o aumento
da diversidade de espécies, até que uma comunidade clímax seja atingida 33.
A formação, crescimento e maturação dos biofilmes dentários ocorrem de
forma natural, logo após as superfícies dentárias serem limpas. Devido a
relações metabólicas e competitivas, as bactérias constituintes do biofilme
dentário conferem proteção frente à colonização do ambiente oral por
microrganismos potencialmente patogênicos. A manutenção de níveis de saúde
está intimamente relacionada à capacidade do indivíduo de controlar o acúmulo
do biofilme sobre as superfícies dentárias 57.
O surgimento de doenças, dentre elas a cárie dentária, ocorre quando um
desequilíbrio é formado, predispondo à seleção de microrganismos patogênicos
específicos. A cárie dentária é uma doença socialmente determinada, que se
configura como o mais prevalente agravo à saúde bucal, acometendo indivíduos
em todas as faixas etárias 35;38. Trata-se de uma doença crônica, progressiva e
localizada, causada pela dissolução ácida dos tecidos duros do elemento
dentário 39.
Dentre os fatores que compõem a rede de causalidade da cárie, o biofilme
dentário pode ser apontado como o fator etiológico primário 32. A produção de
ácidos por microrganismos presentes no biofilme, a partir da degradação de
carboidratos fermentáveis oriundos da dieta, é essencial para o processo de
desmineralização da estrutura dentária 48. As frequentes quedas de pH levam à
seleção de espécies bacterianas acidúricas e acidogências, dentre elas S.
mutans e Lactobacillus casei, responsáveis, respectivamente, pela iniciação e
propagação das lesões cariosas 13.
Atualmente, novas abordagens terapêuticas vêm sendo propostas como
métodos auxiliares no tratamento de doenças biofilme-dependentes, como a
22
cárie dentária, convencionalmente pautado na remoção mecânica e no controle
químico do acúmulo de biofilme dentário.
2.2 Cárie dentária e sua abordagem terapêutica menos invasiva
A cárie dentária é uma doença infecciosa causada por bactérias orais
aderidas à superfície dos elementos dentários, que se não tratada, pode
culminar na perda dentária 60. É sem dúvida a afecção oral mais pesquisada,
tendo seu processo histopatológico bem fundamentado na literatura, sendo
considerada como a mais prevalente dentre as doenças que acometem o meio
ambiente oral 10. Embora dados apontem para a redução na prevalência de cárie
dentária ao redor do mundo, essa ainda pode ser tida como um sério problema
de saúde pública em populações menos favorecidas economicamente 35.
Devido à complexa rede de causalidade que envolve a doença, o que se
preconiza é que o controle da cárie dentária englobe desde ações de promoção
à saúde e de prevenção dos agravos, como ações de recuperação, reabilitação
e manutenção da saúde 3. O que nos parece ser bastante óbvio, na verdade,
contrasta com a prática odontológica adotada tradicionalmente, pautada quase
que exclusivamente no tratamento cirúrgico restaurador das lesões cariosas, e
não da doença em si.
Com o avanço das pesquisas que aprimoraram as técnicas restauradoras
adesivas e, principalmente, no aprofundamento do conhecimento da doença e
sua rede de causalidade, tendo como novo enfoque o processo saúde-doença
que acomete o indivíduo, procedimentos restauradores menos invasivos vêm
sendo adotados 5. Neste contexto, o conceito de Odontologia minimamente
invasiva ou de mínima intervenção, baseia-se nos novos conhecimentos acerca
do processo carioso, bem como no uso de materiais de proteção capazes de
estimular a recuperação dos tecidos dentários e/ou de materiais restauradores
adesivos, a fim de realizar uma abordagem preventiva e conservadora, na
medida em que busca a paralisação da lesão, pautada na preservação da
estrutura dentária sadia e do órgão pulpar 42;5.
A paralisação da lesão cariosa seria possível, a partir da remoção do
biofilme presente, dependendo da capacidade do complexo dentino-pulpar de
recuperar-se, ativando o processo de deposição de dentina reparadora e
23
esclerótica 27. De acordo com Fejerskov e Kidd 14, a lesão pode ser paralisada
pelo controle do biofilme presente. Logo, a remoção da dentina cariada, ao
diminuir o número de microrganismos presentes no tecido dentinário, auxiliaria
na interrupção da progressão da lesão.
Quanto à sua estrutura química e morfológica, a lesão de cárie pode ser
dividida em duas camadas distintas. A camada superficial, denominada camada
infectada, é bastante desmineralizada, amolecida e com grande quantidade de
bactérias. Localizada abaixo dessa, a camada afetada, apresenta-se mais
endurecida, apenas parcialmente desmineralizada, com menor carga bacteriana.
É constituída de fibras colágenas e ainda passível de sofrer o processo de
remineralização 47. Daí, em situações clínicas que houvesse risco de exposição
do tecido pulpar, a remoção apenas da camada superficial, infectada, com
preservação da dentina afetada, proporcionaria uma maior proteção do órgão
pulpar 16;22.
Desde o início dos anos 90, muitos estudos vêm sendo realizados com o
objetivo de propor técnicas capazes de eliminar ou reduzir ao máximo a carga
microbiana na porção de dentina afetada remanescente, em lesões profundas de
cárie, onde a remoção total do tecido cariado poderia levar á exposição pulpar
52.
Nesse contexto, a realização de um maior número de estudos envolvendo
a aplicação da terapia fotodinâmica ainda é necessária, a fim de consolidar sua
abordagem preventiva na formação de biofilmes orais cariogênicos, bem como
sua ação terapêutica na paralisação de lesões de cárie ativas, quer em estágios
iniciais, como na lesão branca de esmalte, quer em estágios avançados, nos
quais a remoção total do tecido cariado pode levar ao comprometimento do
órgão pulpar.
2.3. Terapia fotodinâmica
A terapia fotodinâmica, também denominada fotoquimioterapia ou
fototerapia, representa uma promissora alternativa para o tratamento de algumas
doenças.
Os primeiros trabalhos publicados envolvendo o estudo da terapia
fotodinâmica datam do início do século XX, quando Oscar Raab e Von
24
Tappeiner, através de seus experimentos, perceberam o efeito letal da
associação do corante vermelho acridina e a luz solar sobre o protozoário
causador da malária 41. Desde então, a TFD tem sido proposta como um método
alternativo para algumas áreas da Medicina, como no diagnóstico e tratamento
de determinados tipos de câncer 11 e de infecções virais, bacterianas e fúngicas,
devido à sua ação antimicrobiana 26;4.
No campo de pesquisas da Odontologia, a terapia fotodinâmica é
relativamente recente e tem sido investigada como uma alternativa para o
tratamento das infecções orais mais prevalentes: a cárie dentária, as doenças
periodontais e infecções do canal radicular 53;55.
De maneira geral, o mecanismo de ação da TFD é o mesmo,
independentemente do tipo de células-alvo, quer sejam células tumorais, quer
sejam microrganismos patogênicos. É decorrente da ação simultânea de um
agente sensibilizante, também chamado de corante fotossensível, e de uma
fonte de luz, na presença do oxigênio dos tecidos 21.
Após irradiação, a molécula da FS absorve fótons de energia, passando a
um primeiro estágio excitado singleto, altamente instável, podendo retornar ao
estado fundamental, pela liberação de energia na forma de luz visível
(fluorescência), ou por conversão interna de mesma multiplicidade, sendo
convertida ao estado excitado tripleto, através de cruzamento intersistema. O
estado tripleto, apesar de ser menos energético do que o estado singleto, possui
tempo de vida longo, o bastante para permitir a interação da substância
fotossensível com as moléculas vizinhas 23.
A ação da terapia fotodinâmica, sobre as células-alvo, pode ocorrer a
partir de dois mecanismos distintos, denominados: reação de Tipo I ou reação
de Tipo II 24. Na primeira, o corante interage com o substrato, desencadeando a
produção de radicais livres, os quais, posteriormente, irão reagir com o oxigênio
molecular, produzindo espécies altamente reativas (Figura 1). Na segunda, o
agente fotossensibilizante interage diretamente com a molécula de oxigênio,
dando origem ao oxigênio singleto (Figura 2) 9.
As espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas - superóxido,
hidroxila, peróxido e oxigênio singleto – são altamente instáveis e reativas,
sendo responsáveis por causar danos às células-alvo, seja devido ao efeito
lesivo sobre estruturas essenciais, como membrana plasmática e DNA, ou por
25
provocar alterações irreversíveis em atividades metabólicas, levando à morte
celular 7.
FIGURA 1 - Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo I.
Fonte: Elaboração própria.
FIGURA 2 - Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo II.
Fonte: Elaboração própria.
26
Para que a reação fotoquímica ocorra, é necessário que o agente
fotossensibilizante seja capaz de absorver a energia irradiada pela fonte de
luminosa 57. Embora alguns componentes bacterianos apresentem tal
capacidade, a grande maioria das bactérias orais não possui esses
componentes, sendo indispensável o uso de fotossensibilizadores exógenos,
para o sucesso da TFD 30.
2.3.1 Substâncias fotossensíveis
Uma substância fotossensibilizante deve ser inócua aos tecidos; seus
componentes em estado excitado devem apresentar tempo de vida suficiente
para interagir com células vizinhas e com oxigênio molecular eficientemente; e
ainda, deve apresentar alta absortividade, com picos de absorção próximos ao
comprimento de onda da luz utilizada 26;21. Características inerentes a uma
substância fotossensibilizante podem ser vistas no Quadro 1.
QUADRO 1 - Resumo das propriedades requeridas para uma substância fotossensibilizante ideal
PROPRIEDADES DE UM FOTOSSENSIBILIZANTE IDEAL
Ser quimicamente puro e ter composição constante e conhecida
Ter mínima toxicidade no escuro
Seletividade às células-alvo
Ser rapidamente eliminado do organismo
Ser solúvel em água
Facilidade de obtenção em escala industrial
Características fotofísicas favoráveis
Fonte: Bonnett 2.
27
O termo “características fotofísicas favoráveis” refere-se basicamente a
duas características ideais para os agentes fotossensibilizantes, sendo a
primeira, a capacidade de absorver luz na região de 600-800 nm, faixa espectral
conhecida como janela terapêutica, na qual devido aos maiores comprimentos
de onda, há uma maior penetração do FS nos tecidos e, consequentemente, um
maior efeito terapêutico12. Comprimentos de onda abaixo dessa faixa sofrem
maior espalhamento e podem ser absorvidas por cromóferos endógenos,
diminuindo a penetração de luz, ao passo que comprimentos acima de 800 nm,
além de serem absorvidas pela água, não possuem energia suficiente para
produção de oxigênio singleto 49.
A segunda característica fotofísica favorável seria uma alta reatividade
foquímica, para que um alto rendimento do estado excitado tripleto seja
alcançado, o qual deve possuir um tempo de vida longo para produzir outras
espécies reativas de oxigênio, como o estado singleto 2.
Em muitos estudos, uma grande variedade de agentes
fotossensibilizantes tem sido empregada diante de microrganismos orais. O
corante rosa-bengala 38; os derivados de fitalacionina, como fitalacionina
dissulfonado alumínio (AlPcS2) e fitalacionina catiônica com Zn (II) 54; porfirinas
23; verde de malaquita 40; além do azul de metileno e azul de orto-toluidina 61.
Estes dois últimos são as substâncias fotossensíveis mais testadas,
representantes do grupo dos corantes fenotiazínicos.
2.3.2 Corantes fenotiazínicos
Os corantes fenotiazínicos são compostos catiônicos com estrutura
fundamental composta por um anel aromático tricíclico planar, constituindo um
sistema altamente conjugado, o qual funciona como o componente cromóforo
destes corantes 44. Os compostos fenotiazínicos possuem propriedades
adequadas para utilização na terapia fotodinâmica devido à sua intensa
absorção de luz na região de 620-660 nm, região espectral inserida na faixa que
compreende a janela 18.
Os corantes azul de metileno e azul de toluidina são representantes dos
compostos fenotiazínicos e vêm sendo largamente empregados nas pesquisas
envolvendo a TFD 37. Trata-se de compostos similares no tocante às suas
28
estruturas químicas (Figuras 3 e 4) e propriedades físico-químicas 44. O pico de
absorção de energia para cada um desses compostos pode ser observado no
Quadro 2.
FIGURA 3 - Fórmula molecular do corante azul de metileno
Fonte: Soukos
44. FIGURA 4 - Fórmula molecular do corante azul de toluidina
Fonte: Soukos 44.
QUADRO 2 - Compostos fenotiazínicos mais utilizados, com seus respectivos picos de absorção
de luz em nm.
COMPOSTOS FENOTIZÍNICOS PICO DE ABSORÇÃO DE LUZ (nm)
Azul de metileno 660
Azul de toluidina 625
Fonte: Gonçalves 21.
29
Grande parte da capacidade de uma substância atuar como agente
sensibilizante é dependente de sua capacidade de absorver a luz no
comprimento de onda complementar àquele emitido pela fonte de luz 56.
2.3.3 Fontes de luz
Embora os lasers de baixa potência sejam, convencionalmente, utilizados
como fonte de irradiação na TFD, o uso dos diodos emissores de luz (LED) tem
se intensificado 19. Em parte, devido a certas propriedades dos LED que
resultam em bandas de emissão mais largas, favorecendo a complementaridade
com a substância fotossensível, e conseqüentemente, a absorção de energia
luminosa por parte dessa 30;62.
A maioria dos trabalhos ainda apresenta a associação da terapia
fotodinâmica com lasers ou LED, entretanto, outras fontes luminosas têm sido
testadas, como as lâmpadas de tungstênio 57 ou halogênio 38, o que reduz o
custo da terapia, já que os equipamentos, tradicionalmente utilizados,
apresentam alto valor de mercado.
A terapia fotodinâmica, decorrente da associação entre o corante rosa-
bengala e luz halógena, proveniente de um aparelho fotopolimerizador,
apresentou atividade antimicrobiana, in vitro, frente a suspensões de S. mutans
38. Resultados semelhantes foram apresentados por Gonçalves 21, que observou
uma redução percentual na viabilidade bacteriana de 99,5% , quando da
associação do corante azul de metileno e luz halógena proveniente de um
aparelho fotopolimerizador, frente a suspensões de S. mutans, in vitro.
Além dos bons resultados obtidos, mediante o uso do aparelho
fotopolimerizador, como fonte luminosa, sua utilização reduz os custos da
terapia, na medida em que tal equipamento já se faz presente no conjunto de
tecnologias duras da prática odontológica 38;21. Nesse sentido, a aquisição de um
novo aparelho para realização da TFD não seria necessária, o que tornaria a
técnica mais acessível, principalmente, em nível de setor público.
De maneira geral, o efeito antimicrobiano da TFD sobre microrganismos
orais envolvidos no processo carioso tem sido descrito na literatura, seja sobre
culturas planctônicas 38;51;45, seja sobre bactérias organizadas em biofilmes
58;37;17;57;34.
30
2.3.4 Perspectivas de aplicação da TFD na Odontologia
Pesquisas vêm sendo realizadas, visando à aplicação da Terapia
Fotodinâmica em diferentes áreas da Odontologia como: Periodontia,
Endodontia, Implantondontia e Cariologia 28;40;44;19. A consolidação da TFD na
Odontologia, como método auxiliar no tratamento da cárie dentária, poderia
contribuir na paralisação de inúmeras lesões, em razão de sua ação
antimicrobiana sobre bactérias envolvidas no processo carioso, como o S.
mutans 61. A interrupção da atividade de cárie, principalmente, no que diz
respeito à progressão de lesões profundas, contribuiria para adoção de
procedimentos menos invasivos, com consequente conservação de tecido
dentário, adiando, ou mesmo, evitando a realização de métodos mais invasivos
e onerosos, como o tratamento endodôntico e, mais importante, evitaria a perda
dentária, nos casos em que a única medida terapêutica possível seria a
exodontia, meramente, devido a limitações financeiras.
31
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
A presente pesquisa tem como objetivo avaliar o efeito in vitro da terapia
fotodinâmica, com ativação por luz halógena, sobre bactérias orais em culturas
planctônicas e na formação, de biofilmes mono e multiespécies, a partir de uma
cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e de amostras de saliva,
respectivamente.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar a ação, in vitro, dos corantes azul de metileno e azul de orto-
toluidina, na concentração de 100mg/L, sobre microrganismos orais em
culturas planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies.
Avaliar a ação, in vitro, da luz halógena, proveniente de um aparelho
fotopolimerizador com espectros de emissão entre 600 e 750 nm, como
fonte luminosa, sobre microrganismos orais em culturas planctônicas e na
formação de biofilmes mono e multiespécies.
Avaliar o efeito da TFD, in vitro, sobre microrganismos orais em culturas
planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies, através da
fotoativação do corante azul de metileno por luz halógena com espectro
de emissão entre 600 e 750nm.
Avaliar o efeito da TFD, in vitro, sobre microrganismos orais em culturas
planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies, através da
fotoativação do corante azul de toluidina por luz halógena com espectro
de emissão entre 600 e 750nm.
32
4. MATERIAIS E MÉTODOS
A avaliação da eficácia antimicrobiana da TFD foi realizada a partir de
ensaios in vitro, nos quais foram utilizados os agentes fotossensibilizantes azul
de metileno e azul de orto-toluidina, na concentração de 100mg/L. O aparelho
fotopolimerizador Ultralux® (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, Brasil) foi usado na
reação de fotoativação.
4.1 Tipo do estudo
Trata-se de um estudo experimental, in vitro, realizado no Laboratório de
Microbiologia do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, referente à Linha de Pesquisa Prevenção dos agravos à saúde
bucal em sua expressão individual e coletiva, Área de concentração em Saúde
Coletiva, Grupo de Estudos em Saúde Bucal, do Programa de Pós-Graduação
em Odontologia/UFRN.
4.2 Ensaios in vitro
A fase experimental foi dividida em duas etapas. A primeira foi realizada a
fim de avaliar o efeito da terapia fotodinâmica sobre bactérias orais em culturas
planctônicas, obtidas a partir de uma linhagem bacteriana de referência e de
amostras de saliva. A segunda etapa teve como objetivo avaliar o efeito
preventivo da terapia fotodinâmica, frente à formação de biofilmes mono e
multiespécies, in vitro.
Os ensaios foram realizados com a utilização de microplacas estéreis de
poliestireno inerte de fundo chato, contendo 96 poços (Nunclon®; InterMed,
Roskilde, Dinamarca), adaptado de Stepanovic 46.
4.2.1 Linhagem bacteriana padrão
Na presente pesquisa foi utilizada uma amostra de referência para
Streptococcus mutans (ATCC 25175), obtida mediante solicitação à Fundação
Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro/RJ), a partir da qual culturas de células
planctônicas e biofilmes monoespécies foram preparados.
33
4.2.2. Preparo das suspensões de S. mutans
A partir do estoque, uma alíquota da cepa padrão foi semeada por
esgotamento em placa de Petri contendo ágar Brain Heart Infusion (BHI),
(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) e incubada por 24 horas a 37º C, em
microaerofilia. Passado o tempo de incubação, três colônias foram retiradas da
placa e então repicadas para um tubo de ensaio contendo 2 mL de caldo BHI,
suplementado com sacarose 10%. Após homogeneização, o tubo contendo o
inóculo foi armazenado em estufa a 37 ºC, por 24 horas em microaerofilia
(Figura 5).
FIGURA 5 - Esquema ilustrativo da obtenção da cultura planctônica a partir de uma cepa padrão de S. mutans.
Fonte: Elaboração própria.
4.2.3 Obtenção de amostras de saliva estimulada
Nesta etapa experimental, três pesquisadores envolvidos no estudo
tiveram sua saliva coletada. A estimulação foi feita através da mastigação de um
tablete de parafina (Parafilm “M” – Laboratory Film – American National Can –
Chicago, IL.) por um minuto. Passado esse tempo, o pesquisador deglutiu toda a
saliva e, em seguida, passou a expelir a saliva produzida em um Becker estéril,
34
durante 5 min. As amostras de saliva coletadas foram armazenadas no gelo
durante o experimento (Figura 6).
FIGURA 6 - Esquema ilustrativo da obtenção da culturas planctônicas mistas, a partir de amostras de saliva.
Fonte: Elaboração própria
4.2.4 Substâncias fotossensibilizantes e fonte luminosa
As soluções contendo azul de metileno e azul de orto-toluidina foram
obtidas a partir de diluições dos corantes em água destilada e mantidas no
escuro até sua utilização. A concentração de 100mg/L foi testada para ambas
substâncias fotossensibilizantes 1; 62.
Com o propósito de tornar a técnica acessível clinicamente, em caso de
sucesso in vitro, foi utilizada nesta metodologia a fotoativação por luz halógena,
o aparelho fotopolimerizador de luz halógena Ultralux® (Dabi Atlante, Ribeirão
Preto, São Paulo, Brasil), com potência entre 350 e 500 mW/cm² e filtro de luz
capaz de produzir luz de comprimento de onda na faixa entre 400 e 500 nm.
Para realização dos experimentos, o filtro de onda foi removido (Figuras 6 e 7), a
fim de obter-se luz visível com comprimento de onda na faixa de 600 e 750nm,
compatível com os corantes utilizados, mantendo-se, entretanto, o filtro para
radiações infravermelho 21.
35
Figura 7 – Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado.
Fonte: Elaboração própria Figura 8 – Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado, após remoção do filtro de onda.
Fonte: Elaboração própria
4.2.5 Preparação das placas
Para cada suspensão bacteriana obtida foram preparados 05 grupos de
comparação e 02 grupos experimentais relativos à terapia fotodinâmica
propriamente dita:
Controle positivo: 90 µl de solução de digluconato de clorexidina
a 0,12% foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl
de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura
em teste (S. mutans ou amostra de saliva, previamente
preparadas).
Controle negativo: suspensão contendo 990 µl de caldo BHI
sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.
36
Controle (CT + FA- ): 90 µl de solução do corante azul de toluidina
(100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl
de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.
Controle (CM + FA-): 90 µl de solução do corante azul de metileno
(100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl
de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.
Controle (FS - FA + ) : uma suspensão, contendo 990 µl de caldo
BHI sacarosado a 10% e 10 µl do inóculo.
Terapia fotodinâmica (CT + FA +): 90 µl de solução do corante
azul de toluidina (100mg/L) foram adicionados a um tubo de
ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e
inoculado com 10 µl da cultura.
Terapia fotodinâmica (CM + FA +): 90 µl de solução do corante
azul de metileno (100mg/L) foram adicionados a um tubo de
ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e
inoculado com 10 µl da cultura.
Cada uma das sete condições experimentais preparadas, a partir de
suspensões de células mono (S. mutans) e multiespécies (amostras de saliva),
foram dispensadas em tubos de ensaio estéreis, perfazendo um volume total de
01 mL para cada tubo.
Os tubos de ensaio foram agitados, para homogeneização das
suspensões. Em seguida, 200 µL foram retirados de cada tubo e repicados para
os poços da placa de microtitulação, em triplicata.
A Figura 9 apresenta de maneira esquemática a preparação dos grupos
experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies.
37
FIGURA 9 - Esquema ilustrativo da preparação das condições experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies.
Fonte: Elaboração própria
4.2.6 Terapia fotodinâmica
Após preparação das placas, os poços destinados à terapia fotodinâmica
foram irradiados. Como protocolo para aplicação da TFD, os corantes foram
mantidos em contato com as suspensões microbianas durante 5 minutos,
correspondendo ao tempo de pré-irradiação. Em seguida, realizou-se a
fotoativação de cada poço por 60 segundos. Durante a irradiação, a ponteira do
aparelho fotopolimerizador foi mantida em contato com a embocadura do poço,
para evitar variação nessa distância. Um anteparo negro fosco foi utilizado para
evitar o espalhamento de luz. Anteriormente à irradiação de cada placa, a
intensidade de luz visível emitida pelo aparelho fotopolimerizador foi aferida,
através de um radiômetro (Radiômetro RD-7, ECEL, Ribeirão Preto, SP, Brasil).
O mesmo protocolo de fotoativação foi seguido para os grupos controle
Fa + FS -, no quais o efeito da luz halógena foi verificado na ausência de
qualquer corante.
38
4.2.7 Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica
Imediatamente após o experimento, uma alíquota de 10 µL de suspensão
bacteriana foi retirada de cada poço e diluída em 5mL de solução salina estéril,
homogeneizada e semeada em placas contendo ágar BHI, suplementado com
sacarose a 10%, para posterior avaliação do efeito imediato da terapia
fotodinâmica sobre as suspensões mistas e de S. mutans, a partir da contagem
do número de unidades formadoras de colônia por mL. As placas de Petri e de
microtitulação foram então incubadas a 37 ºC, em microaerofilia, durante
overnight (Figura 10).
Após o período de incubação, o número de unidades formadoras de
colônia foi obtido, e a conversão para a unidade UFC/mL, foi realizada a partir da
multiplicação do valor obtido pelo fator de diluição em questão (2 X 10-3).
Figura 10 – Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito imediato da TFD.
Fonte: Elaboração própria.
4.2.8 Avaliação do efeito mediato da terapia fotodinâmica
Após o tempo de incubação, foi realizada a leitura das placas de
microtitulação através de um aparelho espectofotômetro (μQuant®, BioTek,
Londres, Inglaterra), ajustado em 570 nm, para obtenção da medida de
densidade ótica de cada poço. A DO foi uma das medidas utilizadas nesta
pesquisa para aferição do crescimento bacteriano. Obtida a DO inicial,
novamente uma alíquota de 10 µL foi retirada, repetindo-se os mesmos
39
procedimentos descritos anteriormente, desta vez, para avaliação do efeito
mediato da terapia fotodinâmica, a partir da contagem de UFC/mL (Figura 11).
Figura 11 – Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD.
Fonte: Elaboração própria.
4.2.9 Avaliação do efeito da TFD na formação de biofilmes mono e
multiespécie
O sobrenadante foi aspirado de cada poço e em seguida descartado.
Foram realizadas três lavagens com solução salina estéril, a fim de remover as
células não aderidas. Em sequência, com o auxílio de alças estéreis
descartáveis, o biofilme aderido foi desalojado das paredes dos poços e
ressuspendido com a adição de 200 µL de solução salina estéril, adaptado de
Stepanovic 46.
Para avaliação da viabilidade dos microrganismos ora aderidos, uma
terceira alíquota de 10 µL de suspensão foi retirada de cada poço e diluída em
5ml de solução salina estéril, homogeneizada e semeada em triplicata em placas
contendo ágar BHI, suplementado com sacarose a 10%. As placas de Petri
foram então incubadas a 37 ºC, em microaerofilia, durante 48 horas.
40
Ao fim do experimento, as placas de microtitulação foram submentidas a
uma segunda leitura através do espectofotômetro, para obtenção da DO final,
correspondendo à medida de densidade ótica dos biofilmes multiespécies
formados a partir das amostras de saliva e dos biofilmes monoespécie, a partir
das suspensões de S. mutans (Figura 12).
Figura 12 – Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD na formação de biofilmes mono e multiespécies.
Fonte: Elaboração própria.
4.3 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente através dos
testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, já que os dados não apresentaram
uma distribuição normal. O nível de confiança utilizado para os testes foi de
95%.
Os dados foram analisados mediante o emprego do programa SPSS
(Statistical Package for Social Sciences), versão 17.0.
41
5. RESULTADOS
Os resultados ora apresentados se referem aos ensaios realizados com
as amostras de saliva e de S. mutans.
5.1 Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização
do corante azul de toluidina
5.1.1 Suspensões multiespécies
No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre
as suspensões obtidas a partir das amostras de saliva, com a utilização do
corante azul de toluidina, imediatamente após o experimento, uma diferença
estatisticamente significativa foi observada para a comparação realizada entre
os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 1.
TABELA 1 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25-75 p
TFD CT a 9 10.000 5.000 – 13.000
< 0,001
Controle negativo a 9 30.000 21.000 – 101.000
Controle positivo b 9 0 0
FA+ FS- a 9 76.000 16.000 – 113.000
FA- CT+ a 9 59.000 33.000 – 68.500
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
A partir da análise da Tabela 1, podemos observar que há uma redução
nos valores de mediana obtidos para o grupo em que se aplicou a TFD e a
solução de clorexidina 0,12%, representando uma redução percentual de 66,7%
e 100%, respectivamente, ambos em relação ao controle negativo. Não foi
observada redução nos valores de mediana para os grupos nos quais se avaliou
a ação isolada da luz halógena e do corante azul de toluidina. Ao contrário, a
42
ação destes aumentou aos valores de mediana. No entanto, a diferença
significativa, foi mantida apenas para a comparação 2 a 2, realizada entre o
controle positivo e demais grupos, com o valor de p permanecendo sempre
menor do que 0,05.
5.1.2 Suspensões de S. mutans
No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre
as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de toluidina,
imediatamente após o experimento, uma diferença estatisticamente significativa
foi observada para a comparação realizada entre os grupos experimentais,
conforme pode ser observado na Tabela 2.
TABELA 2 - Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25 p
TFD CT a 3 2.000 0
0,02
Controle negativo a 3 2.000 2.000
Controle positivo a 3 0 0
FA+ FS- a 3 2.000 2.000
FA- CT+ a 3 8.000 4.000
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
A partir da análise da Tabela 2, podemos observar que não houve
qualquer alteração no valor de mediana obtido para os grupos em que se aplicou
a TFD, em relação controle negativo. No entanto, naquele em que a solução de
clorexidina a 0,12% foi utilizada, houve uma redução percentual de 100%,
também em relação ao controle negativo. Não foi observada redução nos
valores de mediana para os grupos nos quais se avaliou a ação isolada da luz
halógena e do corante azul de toluidina. Ao contrário, a ação deste último
aumentou o valor de mediana. No entanto, a diferença significativa previamente
encontrada, não se manteve após comparação grupo a grupo.
43
5.2 Avaliação do efeito imediato da terapia Fotodinâmica com utilização
do corante azul de metileno
5.2.1 Suspensões multiespécies
No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre
as suspensões obtidas a partir das amostras de saliva, com a utilização do
corante azul de metileno, imediatamente após o experimento, uma diferença
estatisticamente significativa foi observada para a comparação realizada entre
os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 3.
TABELA 3 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25-75 p
TFD CM a, b 9 4.000 1.000 – 14.000
< 0,001
Controle negativo a 9 30.000 21.000 – 101.000
Controle positivo b 9 0 0
FA+ FS- a 9 76.000 16.000 – 113.000
FA- CM+ a 9 42.000 16.000 – 48.000
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
A partir da análise da Tabela 3, podemos observar que houve uma
redução nos valores de mediana obtidos para os grupos em que se aplicou a
TFD e a solução de clorexidina 0,12%, representando uma redução percentual
de 86,6% e 100%, respectivamente, ambos em relação ao controle negativo.
Não foi observada redução nos valores de mediana para os grupos nos quais se
avaliou a ação isolada da luz halógena e do corante azul de metileno. Ao
contrário, a ação destes, aumentou aos valores de mediana. No entanto, a
diferença significativa foi mantida apenas para a comparação 2 a 2, realizada
entre o controle positivo e os seguintes grupos: controle negativo (p = 0,01), FA
+ FS – (p = 0,02) e FA + CM – (p = 0,01). Não foi encontrada nenhuma
44
diferença significativa entre o controle positivo e o grupo no qual se aplicou a
terapia fotodinâmica (p = 0,17), nem entre este último e o controle negativo,
mesmo diante da acentuada redução provocada no valor de mediana (86, 6%).
5.2.2 Suspensões de S. mutans
No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre
as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de metileno,
imediatamente após o experimento, não foi observada qualquer diferença
estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os grupos
experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 4.
TABELA 4 - Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25 p
TFD CM 3 4.000 2.000
0,07
Controle negativo 3 2.000 2.000
Controle positivo 3 0 0
FA+ FS- 3 2.000 2.000
FA- CM+ 3 2.000 2.000
Fonte: Elaboração própria.
5.3 Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com
utilização do corante azul de toluidina
5.3.1 Análise a partir da contagem do número de UFC/mL
Após o período de incubação, o número de UFC/mL de algumas placas
não foi possível de ser obtido devido ao grande crescimento bacteriano
observado, inviabilizando a contagem, tanto para as supensões de S. mutans,
quanto para aquelas obtidas a partir da saliva (Figura 13). Mesmo naquelas
45
onde se foi possíver fazer a contagem, o número de UFC/mL foi bastante
elevado. Esta situação foi semelhante para todos os grupos experimentais, com
exceção para aqueles em que se utilizou a solução de digluconato de clorexidina
a 0,12%, para os quais não foi verificado crescimento bacteriano, sendo o
número de UFC/mL igual a zero (Figura 14).
Figura 13 – Fotografia demonstrando grande crescimento bacteriano.
Fonte: Acervo do pesquisador
Figura 14 – Fotografia demonstrando ausência de crescimento bacteriano.
Fonte: Acervo do pesquisador
46
5.3.2 Análise a partir da densidade ótica
5.3.2.1 Influência dos produtos testados sobre a densidade ótica do meio
de cultura puro
Inicialmente, foi vista a necessidade de avaliar se a presença dos
corantes azul de metileno e azul de toluidina e da solução de clorexidina alteraria
a densidade ótica do meio de cultura puro. Tal alteração poderia causar erros
quando da interpretação dos resultados, já que a DO final poderia estar
aumentada, mas não devido ao crescimento bacteriano, e sim, pelo aumento na
densidade ótica causada pelas substâncias adicionas ao meio de cultura. Os
resultados dessa avaliação encontram-se na Tabela 5.
TABELA 5 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica e significância estatística para cada condição testada. Natal, 2011.
Condição n MED Q 25-75 p
Meio Puro 3 0,074 0,072-0,074
0,021
Meio + Clorexidina 3 0,075 0,073-0,086
Meio + Azul de Toluidina 3 0,339 0,327– 0,341
Meio + Azul de Metileno 3 0,189 0,187– 0,196
Fonte: Elaboração própria
Conforme observado na Tabela 5, os valores das medianas das DO foram
mais altos, quando o meio de cultura foi adicionado de CT ou CM. A adição
destas substâncias ao meio provocou um aumento no valor de densidade ótica,
quando comparado ao meio puro, e este aumento foi estatisticamente
significativo. Daí, para os cálculos subseqüentes, foi realizado um ajuste no
valor da DO obtido para cada poço, a fim de se compensar o efeito da presença
dos corantes sobre o valor da densidade ótica do meio puro.
47
5.3.2.2 Suspensões multiespécies
Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as
suspensões mistas, com a utilização do corante azul de toluidina, aferida a partir
da densidade ótica, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente
significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais,
conforme pode ser observado na Tabela 6.
TABELA 6 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de toluidina. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25-75 p
TFD CT a 9 0,143 0,049 – 0,364
< 0,001
Controle negativo b 9 1,039 0,931 – 1,094
Controle positivo a 9 0,084 0,079 – 0,093
FA+ FS- b 9 0,897 0,833 – 0,994
FA- CT+ a 9 0,154 0,095 – 0,448
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
De acordo com a Tabela 6, os menores valores de densidade ótica
exibidos foram referentes aos grupos TFD CT, FA – CT + e o controle positivo.
Tal redução foi estatisticamente significativa quando da comparação entre o
controle negativo e grupo na qual a TFD foi aplicada (p < 0,001), bem como
entre os controles positivo e negativo (p < 0,001) e entre o grupo FA – CT + e o
controle negativo, evidenciando a atividade antibacteriana do corante azul de
toluidina, mesmo na ausência de fotoativação (p = 0,05).
48
5.3.2.3 Suspensões de S. mutans
No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre
as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de toluidina,
aferida a partir da densidade ótica, após overnight, foi verificada ocorrência de
diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os
grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 7.
TABELA 7 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25 p
TFD CT a 3 0,613 0,561
0,013
Controle negativo a 3 0,655 0,589
Controle positivo a 3 0,067 0,063
FA+ FS- a 3 0,716 0,673
FA- CT+ a 3 0,343 0,305
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
A partir da análise da Tabela 7, é possível observar que houve apenas
uma pequena redução no valor da mediana obtido para o grupo em que se
aplicou a TFD, em relação ao controle negativo. No entanto, naquele em que a
solução de clorexidina a 0,12% foi utilizada, houve uma acentuada redução,
apresentando valor próximo ao zero, também em relação ao controle negativo.
Uma redução também foi observada no valor de mediana obtido para o grupo
FA- CT+, referente à ação do corante azul de toluidina. No entanto, a diferença
significativa previamente encontrada, não se manteve após comparação grupo a
grupo (p > 0,05).
49
5.4 Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica, com
utilização do corante azul de metileno
5.4.1 Análise a partir da densidade ótica
5.4.1.1 Suspensões multiespécies
Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as
suspensões mistas, com a utilização do corante azul de metileno, aferida a partir
da densidade ótica, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente
significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais,
conforme pode ser observado na Tabela 8.
TABELA 8 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de metileno. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25-75 p
TFD CM a 9 0,421 0,304 – 0,503
< 0,001
Controle negativo b 9 1,039 0,931 – 1,094
Controle positivo c 9 0,084 0,079 – 0,093
FA+ FS- b 9 0,897 0,833 – 0,994
FA- CM+ a, b 9 0,307 0,254 – 0,947
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
De acordo com a Tabela 8, os menores valores de densidade ótica
exibidos foram referentes aos grupos TFD CM, FA – CM + e o controle positivo.
Tal redução foi estatisticamente significativa quando da comparação entre o
controle negativo e grupo na qual a TFD foi aplicada (p < 0,001), bem como
entre os controles positivo e negativo (p < 0,001). O corante azul de metileno
(FA – CM+), apesar de apresentar redução nos valores de densidade ótica,
quando comparado ao controle negativo, tal diferença não se mostrou
significativa (p > 0,05).
50
5.4.1.2 Suspensões de S. mutans
No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre
as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de metileno,
aferida a partir da densidade ótica, após overnight, foi verificada ocorrência de
diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os
grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 9.
TABELA 9 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25-75 p
TFD CMa 3 0,630 0,464
0,013
Controle negativo a 3 0,655 0,589
Controle positivo a 3 0,067 0,063
FA+ FS- a 3 0,716 0,673
FA- CM+ a 3 0,270 0,259
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
A partir da análise da Tabela 9, é possível observar que houve apenas
uma pequena redução no valor da mediana obtido para os grupos em que se
aplicou a TFD em relação ao controle negativo. No entanto, naquele em que a
solução de clorexidina a 0,12% foi utilizada, houve uma acentuada redução,
apresentando valor próximo ao zero, também em relação ao controle negativo.
Uma redução também foi observada no valor de mediana obtido para o grupo
FA- CM+, referente à ação do corante azul de metileno. No entanto, a diferença
significativa previamente encontrada, não se manteve após comparação grupo a
grupo (p > 0,05).
51
5.5 Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de
biofilme com utilização do corante azul de toluidina
5.5.1 Análise a partir da contagem do número de UFC/mL
Após o período de incubação, o número de UFC/mL de algumas placas
não foi possível de ser obtido devido ao grande crescimento bacteriano
observado, inviabilizando a contagem, tanto para as supensões de S. mutans,
quanto para aquelas obtidas a partir da saliva, quer para TFD aplicada com o
corante azul de toluidina, quer com o azul de metileno. Mesmo naquelas onde se
foi possível fazer a contagem, o número de UFC/mL foi bastante elevado. Esta
situação foi semelhante para todos os grupos experimentais, com exceção para
aqueles em que se utilizou a solução de digluconato de clorexidina a 0,12%,
para os quais não foi verificado crescimento bacteriano, sendo o número de
UFC/mL igual a zero.
5.5.2 Análise a partir da densidade ótica
5.5.2.1 Suspensões multiespécies
Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre a
formação de biofilmes multiespécies, a partir de suspensões mistas, com a
utilização do corante azul de toluidina, aferida a partir da densidade ótica, foi
verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa para a
comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser
observado na Tabela 10.
52
TABELA 10 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies, e significância estatística, com o corante azul de toluidina. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25-75 p
TFD CT a 9 0,131 0,081 – 0,246
< 0,001
Controle negativo b 9 0,558 0,494 – 0,781
Controle positivo a 9 0,052 0,049 – 0,055
FA+ FS- b 9 0,528 0,387 – 0,630
FA- CT+ a 9 0,047 0,045 – 0,074
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
De acordo com a Tabela 10, os menores valores de densidade ótica
exibidos foram referentes aos grupos TFD CT, controle positivo e o FA – CT +.
Tal redução foi estatisticamente significativa quando da comparação entre o
controle negativo e grupo na qual a TFD foi aplicada (p = 0,01), bem como entre
os controles positivo e negativo (p < 0,001) e entre o grupo FA – CT + e o
controle negativo, evidenciando a atividade antibacteriana do corante azul de
toluidina, prevenindo assim a formação de biofilme, mesmo na ausência de
fotoativação (p = 0,01).
5.5.2.2 Suspensões de S. mutans
No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre
formação de biofilmes monoespécies, a partir de suspensões de S. mutans, com
a utilização do corante azul de toluidina, aferida a partir da densidade ótica, após
overnight, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa
para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser
observado na Tabela 11.
53
TABELA 11 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies, e significância estatística, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25 p
TFD CT a 3 0,229 0,228
0,016
Controle negativo a 3 0,300 0,286
Controle positivo a 3 0,046 0,046
FA+ FS- a 3 0,621 0,261
FA- CT+ a 3 0,173 0,157
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
A partir da análise da Tabela 11, é possível observar que houve apenas
uma pequena redução no valor da mediana obtido para o grupo em que se
aplicou a TFD, em relação ao controle negativo. No entanto, naquele em que a
solução de clorexidina a 0,12% foi utilizada, houve uma acentuada redução,
apresentando valor próximo ao zero, também em relação ao controle negativo.
Uma redução também foi observada no valor de mediana obtido para o grupo
FA- CT+, referente à ação do corante azul de toluidina. No entanto, a diferença
significativa previamente encontrada, não se manteve após comparação grupo a
grupo (p > 0,05).
5.6 Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de
biofilme, com utilização do corante azul de metileno
5.6.1 Análise a partir da densidade ótica
5.6.1.1 Suspensões multiespécies
Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre a
formação de biofilmes multiespécies, a partir de suspensões mistas, com a
utilização do corante azul de metileno, aferida a partir da densidade ótica, foi
54
verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa para a
comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser
observado na Tabela 12.
TABELA 12 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies e significância estatística, com o corante azul de metileno. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25-75 p
TFD CM a 9 0,532 0,366 – 0,576
< 0,001
Controle negativo a 9 0,558 0,494 – 781
Controle positivo b 9 0,052 0,049 – 0,055
FA+ FS- a 9 0,528 0,387 – 0,630
FA- CM+ a 9 0,338 0,142 – 0,457
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
De acordo com a Tabela 12, os menores valores de densidade ótica
exibidos foram referentes ao controle positivo e ao grupo FA – CM +, embora tal
redução só tenha sido estatisticamente significativa quando da comparação
entre o controle positivo e o negativo (p < 0,001). Com relação à pequena
redução nos valores de DO, causada pela ação da TFD, essa não foi
significativa, quando comparada ao controle negativo (p > 0,05).
5.6.1.2 Suspensões de S. mutans
A ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre formação de
biofilmes monoespécies, a partir de suspensões de S. mutans, com a utilização
do corante azul de metileno, foi aferida a partir da densidade ótica. A presença
de diferença estatisticamente significativa foi encontrada para a comparação
entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 13.
55
TABELA 13 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies e significância estatística, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011.
Condição N MED Q 25-75 p
TFD CMa 3 0,185 0,133
0,016
Controle negativo a 3 0,300 0,286
Controle positivo a 3 0,046 0,046
FA+ FS- a 3 0,621 0,261
FA- CM+ a 3 0,208 0,159
Fonte: Elaboração própria. Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.
A partir da análise da Tabela 13, é possível observar que houve apenas
uma pequena redução no valor da mediana obtido para o grupo em que se
aplicou a TFD, em relação ao controle negativo. No entanto, naquele em que a
solução de clorexidina a 0,12% foi utilizada, houve uma acentuada redução,
apresentando valor próximo ao zero, também em relação ao controle negativo.
Uma redução também foi observada no valor de mediana obtido para o grupo
FA- CM+, referente à ação do corante azul de metileno. No entanto, a diferença
significativa previamente encontrada não se manteve após comparação grupo a
grupo (p > 0,05).
56
6. DISCUSSÃO
Até o início dos anos 90, a aplicação da terapia fotodinâmica como
modalidade terapêutica para doenças causadas por microrganismos sofreu
poucos avanços, muito embora sua descoberta tenha se dado, exatamente,
devido à sua ação antimicrobiana 41. Tal intervalo pode, em parte, ser justificado
em razão do desenvolvimento dos antibióticos na mesma época 22. Tais
medicamentos representavam uma promissora alternativa para o tratamento de
doenças de origem microbiana e sua eficácia tem sido, de fato, comprovada ao
longo dos últimos 50 anos 23. Entretanto, o rápido crescimento do número de
patógenos antibiótico-resistentes tem contribuído, sobremaneira, para o aumento
no desenvolvimento de pesquisas que objetivam o aprimoramento de terapias
antimicrobianas alternativas 49.
Neste sentido, desde os anos 90 tem sido observada a retomada pelo
interesse acerca do efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica frente a um
variado número de microrganismos 7. O mecanismo de ação da TFD é
decorrente da ativação de uma substância fotossensibilizante por uma fonte de
luz visível, com comprimento de onda específico, na presença de oxigênio,
podendo gerar produtos de reação como o oxigênio singleto e superóxidos 55.
Essas espécies de oxigênio são altamente reativas e têm capacidade de causar
danos irreversíveis a componentes celulares, levando à morte da célula
bacteriana 50.
O efeito da TFD frente a bactérias orais em suspensão tem sido descrito
na literatura, a partir de seus resultados promissores 53-45-51-1. O mesmo tem sido
observado em relação aos biofilmes mono e multiespécies 58;60;37;19.
Recentemente, um estudo realizado in situ também demonstrou a ação
microbiana frente a bactérias envolvidas no processo cariogênico 29.
Entretanto, a maioria desses trabalhos discorre sobre o efeito da terapia
fotodinâmica, decorrente da ativação de fotossensibilizantes específicos, a partir
da irradiação por aparelhos de alto custo como lasers e alguns tipos de LED.
Os lasers de baixa intensidade têm sido as fontes de radiação
convencionalmente utilizadas para a aplicação da terapia fotodinâmica, embora
recentemente, outras fontes venham sendo experimentadas, como aquelas
emissoras de luz halógena, com o objetivo de tornar a disseminação da técnica
57
mais viável clinicamente 49;21;38. Um fator de fundamental importância para
escolha da fonte luminosa, diz respeito à ressonância que deve haver entre o
corante fotossensível e a luz irradiada, no que diz respeito a seus espectros de
absorção e irradiação, respectivamente. Nesse sentido, uma alternativa viável e
mais econômica em relação aos lasers é a o emprego dos LED 60;30, os quais
cobrem praticamente todo o espectro visível. Mais recentemente, aparelhos
fotopolimerizadores, emissores de luz halógena, foram utilizados em pesquisas
com o objetivo avaliar o efeito da TFD sobre microrganismos orais, bem como
associar o uso dessa terapia a um equipamento comumente usado na prática
odontológica 21;38.
Nesse contexto, a presente pesquisa teve como objetivo avaliar o efeito
da terapia fotodinâmica, com ativação por luz halógena, sobre bactérias orais em
culturas planctônicas e na formação, in vitro, de biofilmes mono e multiespécies,
a partir de uma cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e
amostras de saliva, respectivamente.
Para tal, foram utilizados os agentes fotossensibilizantes azul de metileno
e azul de orto-toluidina, na concentração de 100mg/L 1;62, fotoativados através
da irradiação de luz visível na faixa de 600 a 750 nm, obtida a partir de um
aparelho fotopolimerizador Ultralux® (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, São Paulo,
Brasil). Esta escolha se deu pelo fato do fotopolimerizador ser um equipamento
largamente utilizado na prática odontológica, quer em nível privado, quer em
nível público, o que possibilitaria a realização da terapia, sem a necessidade de
aquisição de um novo equipamento por parte de clínicos e serviços públicos de
saúde.
Dentre a variedade de substâncias fotossensibilizantes disponíveis para
utilização na TFD, os compostos fenotiazínicos, azul de toluidina e azul de
metileno têm sido os mais frequentemente utilizados no processo fotoquímico
53;52;19. Além da variabilidade do tipo de corante empregado, também há variação
no que diz respeito à concentração de FS utilizada, e tempo de pré-irradiação a
que o fotossensibilizante deve ser submetido.
O tempo de pré- irradiação se refere ao período de tempo necessário para
que o corante possa interagir com as células-alvo, antes da sua fotoativação 1.
Ainda não existe um consenso por parte dos pesquisadores quanto a esse
tempo, tendo o mesmo variado geralmente de 1 a 5 minutos na maioria dos
58
trabalhos 50. Com o objetivo de provocar a sensibilização das células bacterianas
em suspensão, estas foram colocadas em contato com as substâncias
fotossensibilizantes por 5 minutos, previamente à irradiação.
A metodologia adotada nesta pesquisa foi semelhante à desenvolvida por
Gonçalves 21, que utilizou em seu trabalho um aparelho fotopolimerizador, cujo
filtro de comprimento de onda foi removido, com o objetivo de aumentar o
comprimento de onda da luz emitida (550 nm e 730 nm). Entretanto, o filtro para
radiações infravermelho foi mantido, a fim de se prevenir efeitos térmicos
indesejados. Ainda em relação a esse estudo, os corantes azul de metileno e
azul de toluidina foram utilizados frente a suspensões de S. mutans, ambos na
concentração de 25mg/L, e irradiados durante um minuto, após tempo de pré-
irradiação de 5 minutos.
Em seu trabalho, Gonçalves 21 verificou uma redução percentual de 99,5
% sobre o número de UFC viáveis para a associação azul de metileno/luz
halógena. Tal associação apresentou resultados superiores, quando
comparados àqueles obtidos para o azul de toluidina. Ainda neste trabalho, um
aparelho de laser vermelho, emissor de luz de comprimento de onda de 660 nm,
foi empregado na fotoativação do corante azul de metileno, frente a suspensões
de S. mutans, mantendo-se a mesma metodologia anteriormente descrita,
obtendo-se uma redução percentual de 81,3%.
Em nosso estudo, logo após a aplicação da terapia fotodinâmica com
utilização dos corantes azul de toluidina e azul de metileno, ativados por luz
halógena frente a suspensões mistas e de S. mutans, uma alíquota de cada
condição experimental foi retirada, semeada em placas contendo ágar BHI
sacarosado a 10% e incubada em microerofilia, por aproximadamente 20h. A
avaliação da ação bacteriostática da TFD foi verificada a partir da contagem do
número de UFC/mL viáveis, após o período de incubação.
Com relação ao efeito imediato da TFD sobre as suspensões mistas,
preparadas a partir de amostras de saliva, foi verificada uma redução percentual
no número de UFC/mL, em torno de 66,7% para o azul de toluidina, e de 86,6%
no o azul de metileno, ambos associados à luz halógena, e em comparação ao
controle negativo. Os melhores resultados para associação da luz halógena e o
corante azul de metileno, em detrimento do azul de toluidina, corroboram os
resultados obtidos por Gonçalves 21.
59
A terapia fotodinâmica, nas condições experimentadas neste estudo, não
apresentou qualquer atividade antibacteriana diante das suspensões de S.
mutans, nem inibiu a formação de biofilme a partir dessas, independente do
corante utilizado, na reação de fotoativação, pela luz halógena. Analisando os
resultados obtidos com a solução de clorexidina, esta foi capaz de provocar uma
redução de 100% no número de UFC/mL em relação às suspensões de S.
mutans, entretanto essa redução não se apresentou estatisticamente
significativa. Uma possível explicação para orrência desses resultados, é que o
número de amostras usados neste estudo (n =3), pode ter sido insuficiente para
que a TFD, bem como a solução de clorexidina, viessem apresentar ação
antibacteriana significativa frente às suspensões de S. mutans preparadas.
No que diz respeito à ação bactericida, esta foi avaliada a partir de dois
métodos quantitativos para aferição de crescimento bacteriano. O primeiro foi
realizado após o período de incubação, quando se procedeu a leitura das placas
de microtitulação, a fim de se obter os valores da densidade ótica para cada
poço. O segundo foi realizado após a leitura das placas, quando uma nova
alíquota de 10 µL foi retirada de cada poço e semeada, conforme já descrito
anteriormente. Após o período de incubação, o número de UFC/mL viáveis foi
obtido. Para algumas placas, a obtenção desse número não foi possível devido
ao grande crescimento bacteriano observado, inviabilizando a contagem, tanto
para as suspensões de S. mutans, quanto para as suspensões mistas. Mesmo
nas situações nas quais a contagem foi realizada, o número de UFC/mL foi
bastante elevado. Tais resultados foram semelhantes para a TFD aplicada com
azul de toluidina e com azul de metileno, entretanto, não se repetiram para o
controle positivo, para o qual o número de UFC/mL foi igual a zero.
Uma possível explicação para o grande crescimento bacteriano
observado em determinadas placas, poderia ser o fator de diluição, que pode ter
sido baixo. Entretanto, analisando o controle positivo, para o qual o mesmo fator
de diluição foi utilizado, vê-se que a solução de digluconato de clorexidina a
0,12% foi capaz de impedir o crescimento bacteriano. Os efeitos antimicrobianos
das soluções à base de clorexidina já estão bem fundamentados na literatura.
Trata-se de um antimicrobiano de largo espectro de ação, com atividade
bactericida e bacteriostática, bastante utilizado no tratamento e prevenção de
doenças orais como doenças periodontais e cárie dentária 15.
60
O que parece ser razoável, é que mesmo em condição favorável ao
grande crescimento bacteriano, que pode ter acontecido em decorrência de uma
baixa diluição das suspensões, a solução de clorexidina foi capaz de inibir o
crescimento bacteriano devido à sua ação antimicrobiana. Nesse contexto,
recaímos sobre a discussão que envolve a capacidade da terapia fotodinâmica
em matar um número suficiente de microrganismos, ou causar dano irreversível
às estruturas, de maneira a impedir o crescimento bacteriano, a partir dos
microrganismos remanescentes, evidenciando a necessidade de que a terapia
fotodinâmica apresente tanto ação bactericida, quanto bacteriostática para a
eficácia de sua aplicação 23.
Com relação ao efeito mediato da terapia fotodinâmica frente às
suspensões mistas, a partir dos valores de densidade ótica obtidos, verificou-se
a ocorrência de ação antimicrobiana altamente significativa, quer para
associação entre azul de toluidina e luz halógena, quer para o azul de metileno,
ativado por luz halógena. Entretanto, comparando esses resultados, percebeu-
se que a TFD apresentou uma maior redução microbiana, quando da associação
entre o corante azul de toluidina e a luz halógena. A ação antimicrobiana
decorrente dessa associação não apresentou diferença em relação à ação
antimicrobiana da solução de digluconato de clorexidina a 0,12%, frente às
suspensões microbianas mistas. O que pode ser visto como excelente resultado,
tendo em vista à clorexidina ser consensualmente aceita, como um
antimicrobiano considerado padrão ouro no controle de microrganismos orais 20.
Quando analisada a ação mediata do corante azul de toluidina, sobre as
suspensões mistas, a ocorrência de ação antimicrobiana foi verificada, mesmo
na ausência de fotoativação. A ação antibacteriana no escuro, foi descrita para o
azul de toluidina na concentração de 0,127 mg/mL 19 e 100mg/mL 1. No estudo
conduzido por Wilson, Dobson e Sarkar 53, o azul de metileno e azul de toluidina
foram testados, mas apenas o CT apresentou ação bacteriana em ausência de
fotoativação, na concentração de 25 µg/mL.
A terapia fotodinâmica apresentou ação antimicrobiana mediata,
prevenindo a formação de biofilme multiespécies. Entretanto, essa ação só foi
significativa quando a reação fotoquímica foi realizada através da ativação do
corante azul de toluidina por luz halógena, o mesmo não ocorrendo quando o
61
azul de metileno foi utilizado. A ação do corante azul de toluidina, per si, também
provocou tal ação preventiva, embora em menor proporção.
Nas condições experimentadas neste estudo, a luz halógena quando
usada isoladamente na irradiação de suspensões mistas e de S. mutans, não
apresentou qualquer ação antibacteriana, tal resultado está em consonância
com os obtidos em estudos anteriores 6;57;38;53.
Neste estudo, a utilização do azul de toluidina, como fotossensibilizante,
conferiu melhores resultados em relação à ação antimicrobiana da terapia
fotodinâmica, frente a suspensões mistas de microrganismos orais. Tal
constatação encontra suporte na literatura, mediante o grande número de
trabalhos que afirmam a eficácia do azul de toluidina, como substância
fotossensível, na aplicação da TFD 44.
A grande diferença de susceptibilidade entre as suspensões obtidas a
partir da saliva e de S. mutans, frente à ação da terapia fotodinâmica pode ter
ocorrido em decorrência dos poucos casos utilizados neste estudo em relação a
S. mutans (n = 3), em oposição a um maior número de amostras de saliva (n =
9), já que algumas vezes a análise das condições experimentais para as
amostras de S. mutans residiu no limiar de significância.
Os resultados obtidos neste estudo corroboram o proposto por Paulino et
al.38 e Gonçalves21, diante da possibilidade de utilização da luz halógena
proveniente de um aparelho fotopolimerizador, como fonte de irradiação da
terapia fotodinâmica, o que contribuiria para reprodutibilidade, na medida em que
tal aparelho é largamente utilizado na prática odontológica, quer em nível
público, quer em nível privado.
Diante do exposto, a ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica frente a
microrganismos orais, pôde ser comprovada, entretanto a realização de outros
estudos ainda são necessários a fim de se aprimorar seu protocolo de aplicação,
principalmente no tocante à utilização equipamentos, de baixo custo, acessíveis
a maioria dos profissionais, socializando a técnica, e ainda vislumbrando a
realização de estudos in vivo.
62
7. CONCLUSÕES
O corante azul de orto-toluidina, na concentração de 100mg/L, apresentou
ação antimicrobiana sobre microrganismos orais em culturas planctônicas
mistas e na prevenção da formação, in vitro, de biofilmes multiespécies,
mesmo em ausência de fotoativação.
O corante azul de metileno, na concentração de 100mg/L, per si, não
apresentou ação antimicrobiana nas condições experimentadas.
A luz halógena, proveniente de um aparelho fotopolimerizador com
espectros de emissão entre 600 e 750 nm, per si, não foi capaz de
provocar morte bacteriana, em nenhuma das condições testadas.
A terapia fotodinâmica apresentou ação antimicrobiana sobre culturas
planctônicas mistas e preveniu a formação, in vitro, de biofilmes
multiespécies, através da fotoativação do corante azul de toluidina por luz
halógena com espectro de emissão entre 600 e 750 nm.
A terapia fotodinâmica apresentou ação antimicrobiana sobre culturas
planctônicas mistas. Entretanto, não preveniu a formação, in vitro, de
biofilmes multiespécies, através da fotoativação do corante azul de
metileno por luz halógena, com espectro de emissão entre 600 e 750 nm.
A terapia fotodinâmica não apresentou ação antimicrobiana sobre culturas
planctônicas de S. mutans, nem impediu a formação, in vitro, de biofilmes
por esses microrganismos, quando da utilização dos corantes azul de
metileno e azul de toluidina, fotoativados por luz halógena com espectro
de emissão entre 600 e 750 nm.
63
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