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EFEITOS ANTINEOPLÁSICOS INDUZIDOS IN VITRO POR ISOQUINOLINO QUINONAS SINTÉTICAS EM LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS WILLIAM RODRIGUES DE FREITAS UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ FEVEREIRO DE 2011
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  • EFEITOS ANTINEOPLÁSICOS INDUZIDOS IN VITRO POR ISOQUINOLINO QUINONAS SINTÉTICAS EM LINHAGENS DE

    CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS

    WILLIAM RODRIGUES DE FREITAS

    UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – UENF

    CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ FEVEREIRO DE 2011

  • ii

    EFEITOS ANTINEOPLÁSICOS INDUZIDOS IN VITRO POR ISOQUINOLINO QUINONAS SINTÉTICAS EM LINHAGENS DE

    CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS

    WILLIAM RODRIGUES DE FREITAS

    Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.

    CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ

    FEVEREIRO DE 2011

  • ii

  • iii

  • iv

    “Dedico esta tese aos meus pais, sem os quais eu não teria condições de alcançar a realização deste feito”

  • v

    AGRADECIMENTOS

    A Deus por tudo.

    Aos meus familiares, que sempre me apoiaram e depositaram votos de confiança e

    motivação.

    Ao professor Dr. Milton M. Kanashiro, pela orientação e oportunidade de desenvolver

    os trabalhos apresentados nesta dissertação.

    A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e ao Centro de

    Biociências e Biotecnologia, pela oportunidade de realização deste trabalho de

    pesquisa.

    Aos Professores Dr. Paulo Miranda e Dr. Almir Andreão, pelo fornecimento das IQQ

    cedidas para os experimentos.

    Aos amigos do Laboratório de Biologia do Reconhecer: Layla, Thatiana, Monique,

    Maíra, Andreza, Marlon, Isabela, Sanderson, Eduardo, Fabrício, Giliane, Marcela,

    Lívia, Flávia, David, Cláudia Letícia, Bruno, Sara, Poliana, Marcelle e Simone, pela

    amizade que foi erguida durante o mestrado e que levaram a momentos de

    companheirismo, sugestões e ajudas experimentais, conselhos, e troca de

    informações.

    Aos técnicos do LBR: Juliana, Rita, Fernando, Núbia, Flávia e Verônica, pela

    dedicação aos trabalhos do laboratório que permitiram a manutenção das condições

    necessárias para o desenvolvimento das pesquisas.

    A CAPES e pela bolsa de demanda social que foi cedida.

    A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

  • vi

    SUMÁRIO

    TÍTULO PÁGINA

    1. Introdução ................................................................................................. 1

    1.1. Câncer .................................................................................................... 1

    1.1.1. Epidemiologia ....................................................................................... 1

    1.1.2. Conceitos ............................................................................................. 1

    1.1.3. Classificação ........................................................................................ 2

    1.1.3.1. Carcinomas ....................................................................................... 2

    1.1.3.2. Sarcomas .......................................................................................... 3

    1.1.3.3. Leucemias ......................................................................................... 4

    1.2. Mecanismos de morte celular ................................................................. 4

    1.2.1. Necrose ............................................................................................... 5

    1.2.2. Apoptose .............................................................................................. 5

    1.3. Tratamentos antineoplásicos ............................................................... 10

    1.3.1. Radioterapia ...................................................................................... 11

    1.3.2. Quimioterapia .................................................................................... 12

    1.3.2.1. Alquilantes ....................................................................................... 13

    1.3.2.2. Antimetabólicos ............................................................................... 13

    1.3.2.3. Antibióticos ...................................................................................... 13

    1.3.2.4. Inibidores Mitóticos ..........................................................................14

    1.4. Quinonas ............................................................................................... 14

    1.4.1. Lapachol ............................................................................................. 16

    1.5. Isoquinolino quinonas – IQQ ................................................................ 17

    2. Objetivos .................................................................................................. 20

    2.1 Objetivo geral ......................................................................................... 20

    2.2 Objetivos específicos.............................................................................. 20

    3. Justificativa ............................................................................................... 21

    4. Metodologia .............................................................................................. 22

    4.1. Culturas da linhagem celulares de origem tumoral ............................... 22

    4.2. Culturas de células mononucleares do sangue periférico .................... 22

    4.3. Quantificação e ajuste das culturas celulares ...................................... 23

    4.4. Diluição e armazenamento das IQQ e do lapachol ............................... 23

    4.5. Testes de viabilidade celular ................................................................. 23

  • vii

    4.5.1. Determinação da liberação de Lactato Desidrogenase (LDH) ........... 23

    4.5.2. Ensaio Metabólico do MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-brometo de

    difeniltetrazolium) ..........................................................................................24

    4.6. Testes de investigação do tipo de morte celular ....................................25

    4.6.1. Microscopia de Fluorescência com coloração de Laranja de Acridina e

    Brometo de Etíde ..........................................................................................25

    4.6.2. Citometria de fluxo para análise de fragmen. e liberação de dna .......26

    4.6.3. Eletroforese do DNA de baixo peso molecular ...................................26

    4.7. Análises Estatísticas ............................................................................. 27

    5. Resultados ............................................................................................... 28

    5.1. Viabilidade e liberação de LDH das culturas de células tumorais ........ 28

    5.2. Viabilidade das PBMC tratadas com o lapachol e as IQQ .................... 40

    5.3. Análises do tipo de morte celular induzido por IQQ e lapachol ............ 43

    5.3.1. Microscopias de Fluorescência ......................................................... 43

    5.3.2. Citometrias de fluxo para quantificação do DNA celular ................... 49

    5.3.3. Eletroforese do DNA celula ............................................................... 52

    6. Discussão ................................................................................................. 54

    7. Conclusão ................................................................................................ 60

    8. Referências bibliográficas ........................................................................ 61

  • viii

    RESUMO

    O crescimento no número de casos de câncer tem preocupado as autoridades

    internacionais de saúde, já que se trata de uma enfermidade de difícil tratamento e

    corresponde por 12% de todos os óbitos. Na busca por novas drogas para o

    tratamento do câncer, foram testados nesta dissertação os efeitos antineoplásicos

    induzidos in vitro por doze isoquinolino quinonas (IQQ), sendo três Caulibugulonas e

    outros nove análogos sintéticos. Os resultados obtidos foram comparados com o do

    lapachol e indicaram que nove IQQ foram efetoras e reduziram a viabilidade de

    células tumorais quando tratadas por 48 horas. Dessas nove IQQ, quatro não foram

    ativas na redução da viabilidade de PBMC, sugerindo um possível mecanismo de

    ação seletivo também sobre células cancerígenas. O tipo de morte celular que as

    IQQ induzem foi investigado através de cinética de tempo por microscopia de

    fluorescência, sendo possível verificar que as células U937 mortas apresentavam

    majoritariamente morfologia de apoptose. Pela técnica de citometria de fluxo com

    marcação por PI foi confirmado que 78,29% das células U937 submetidas ao

    tratamento com a Caulibugulona A por 48 horas estavam em apoptose,

    apresentando DNA fragmentado em ladder e que foi facilmente extraído pelo

    tampão de fosfato-citrato. As concentrações das IQQ utilizadas para a obtenção dos

    efeitos antineoplásicos foram muito menores que as necessárias pelo lapachol para

    obter os mesmos resultados. Os dados estatísticos de IC50 dos testes de viabilidade

    mostram ser até 294 vezes menores para as IQQ quando comparados aos do

    lapachol, demonstrando que estas substâncias são promissoras para a continuidade

    dos estudos farmacológicos no contexto do câncer.

    Palavras-chave: Caulibugulonas, Isoquinolino Quinonas, Antineoplásicos.

  • ix

    ABSTRACT

    The growth in the number of cases of cancer has been worrying the

    international authorities of health, since it is an illness of difficult treatment and

    correspond for 12% of all the deaths. In the search for new drugs for the treatment of

    cancer, we tested in this work the antineoplastic effects induced in vitro for twelve

    synthetic isoquinoline quinones (IQQ), being three Caulibugulones and other nine

    similar. The obtained results were compared with the one of the lapachol and

    indicated that nine IQQ was effective and reduced the viability of cancer cells when

    treated for 48 hours and evaluated by MTT assay. Of those nine IQQ, four were not

    capable to reduce the viability of PBMC cells, suggesting a selective action

    mechanism on cancerous cells. The type of cellular death induced by IQQ was

    evaluated by ethidium bromide/acridine orange cell stain and scored by fluorescence

    microscope; by this method apoptosis was observed in U937 leukemia cell treated

    with most of IQQ. The evaluation of apoptosis by flow cytometry in U937 cell treated

    with Caulibugulone A for 48 hours and stained with PI confirmed that 78,29% of cells

    were in apoptosis. Oligonucleossomal fragments of DNA was also observed in

    agarose gel. The concentrations of IQQ used to induce apoptosis in all cell tested

    was much smaller than the concentration used for the lapachol. The IC50 data

    calculated for viability tests showed to be up to 294 smaller times for IQQ when

    compared to the lapachol, demonstrating that these substances are promising for the

    continuity of the pharmacology studies.

    Keywords: Caulibugulones, Isoquinoline Quinones, Antineoplastic.

  • x

    LISTA DE FIGURAS

    TÍTULO PÁGINA

    Figura 1: Micrografias eletrônicas de células normais, apoptoses e necroses .......... 6

    Figura 2. Vias de indução de apoptose ...................................................................... 8

    Figura 3: Estruturas moleculares básicas: Orto-benzoquinona, Para-benzoquinona,

    Quinona, Isoquinolina ............................................................................................... 15

    Figura 4: Estruturas básicas dos medicamentos Quinoxalina, Quinaldina,

    Quinazolina, Morfina, Prazosin ................................................................................. 16

    Figura 5: Estrutura molecular do Lapachol ............................................................... 17

    Figura 6. Estruturas moleculares das Isoquinolino quinonas - IQQ testadas ........... 19

    Figura 7. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com lapachol ...................... 28

    Figura 8. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a Caulibugulona A ...... 29

    Figura 9. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a Caulibugulona C ...... 30

    Figura 10. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a Caulibugulona D ...... 31

    Figura 11. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-12 ........................ 32

    Figura 12. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-18 ..................... 33

    Figura 13. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-19 ........................ 34

    Figura 14. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-21 ........................ 34

  • xi

    Figura 15. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-22 ........................ 36

    Figura 16. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-23 ........................ 37

    Figura 17. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-24 ........................ 38

    Figura 18. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-25 ........................ 39

    Figura 19. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-26 ........................ 39

    Figura 20. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT com PBMC. IQQ seletivas ............................................................................... 41

    Figura 21. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

    MTT com PBMC. IQQ não seletivas ........................................................................ 42

    Figura 22. Micrografias das microscopias de fluorescência de células U937 tratadas

    com caulibugulona A ................................................................................................ 46

    Figura 23. Citometrias de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular das

    células U937 ............................................................................................................. 50

    Figura 24. Citometrias de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular das

    células MOLT4 ......................................................................................................... 51

    Figura 25. Citometrias de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular das

    células COLO205 ..................................................................................................... 52

    Figura 26. Perfil do DNA extraído das células COLO205 (A), U937 (B) e MOLT4 (C)

    tratadas com IQQ e lapachol por 48 horas ............................................................... 53

  • xii

    LISTA DE TABELAS

    TÍTULO PÁGINA

    Tabela 1: IC50 dos experimentos de metabolização do MTT das células tumorais e

    PBMC tratadas com as IQQ e lapachol....................................................................40

    Tabela 2. Cinética do tratamento de células U937 com o lapachol ........................ 45

    Tabela 3. Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona A ............ 45

    Tabela 4. Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona D ............ 47

    Tabela 5. Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-24 .......................... 48

    Tabela 6. Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-26 .......................... 48

  • xiii

    LISTA DE ABREVIATURAS

    2N - Células em Diplóides

    A1 - BCL2-Related Protein A1

    ANOVA – Análise de Variância Entre Grupos

    ANVISA – Agencia Nacional de Vigilância Sanitária

    APAF-1 - Apoptosis Protease Activating Factor-1

    APO-1 - Apoptosis Antigen-1

    ATCC - American Type Culture Collection

    ATP – Adenosina Tri-Fosfato

    BAD - BCL2 Antagonist of Cell Death

    BAX - BCL2 Associated X Protein

    BCL-2 - B-Cell Lymphoma/Leukemia-2

    BCL-W – BCL2-Related Protein W

    Bcl-XL - B-Cell Lymphoma/Leukemia-2 Related Protein X Large

    BID - Interacting Domain Death Agonist

    CA – Caulibugulona A

    Ca++ - Cátion de Cálcio

    CCT – Centro de Ciência e Tecnologia

    CD - Caulibugulona D

    CD95 - Cluster of Differentiation

    Cis - Quando os Ligantes de Maior Massa Situam-se do Mesmo Lado da Molécula

    CO2 – Dióxido de Carbono

    COLO205 – Linhagem de Adenocarcinoma de Cólon Humano

    CTL - Controle,

    D-MEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12

    DMSO – Dimetilsulfóxido

    DNA – Ácido Desoxirribonucléico

    DNAse - Desoxirribunuclease

    Fase G1 – Fase de Gap 1

    Fase G2 – Fase de Gap 2

    Fase M – Fase de Mitose

    Fase S – Fase de Síntese

    H460 – Linhagem de Câncer de Pulmão Humano de Células Grandes

  • xiv

    HCl – Ácido Clorídrico

    HTLV-I - Vírus Linfotrópico dos Linfócitos T Humanos Tipo I

    I24 – Isoquinolino Quinona 24

    I26 – Isoquinolino Quinona 26

    IC50 - Concentração Necessária Para Matar 50% das Células

    IQQ - Isoquinolino Quinonas

    LAP - Lapachol

    LCQUI – Laboratório de Ciências Químicas

    LDH - Lactato Desidrogenase

    MAPK p38 - Mitogen-Activated Protein Kinases p38

    Mcl-1 - Myeloid Cell Leukemia Sequence 1

    MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo

    MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo

    MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo

    MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo

    MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste

    MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste

    min - Minuto

    mL - Mililitro

    MOLT4 - Human Acute Lymphoblastic Leukemia Cell Line 4

    MTT - (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-brometo de difeniltetrazolium)

    NAD - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo

    NADH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzida

    NCA= Número de Células em Apoptose

    NCN=Número de Células em Necrose

    NCNM=Número de Células Normais

    ºC – Graus Celsius

    OMS – Organização Mundial de Saúde

    pb – Par de Base

    PBMC – Células Mononucleares do Sangue Periférico

    PBS - Phosphate Buffered Saline

    pH – Potencial Hidrogeniônico

    PI – Iodeto de Propidio

    RNA – Acido Ribonucléico

  • xv

    RNAse A – Ribonuclease A

    rpm – Rotações por Minuto

    RPMI - Roswell Park Memorial Institute medium

    SEB - Enterotoxina B de Staphilococcus

    Sub-G1 – Sub Gap 1

    TA - Taxa de Apoptose

    TLLDH = Taxa de Liberação de Lactato Desidrogenase

    TNF – Fator de Necrose Tumoral

    Trans - Quando os Ligantes de Maior Massa Não se Situam do Mesmo Lado da

    Molécula

    TVC - Taxa de Viabilidade Celular

    U937 – Linhagem Celular Humana Estabelecida de um Linfoma Histiocítico

    ug – Micrograma

    VM-26 - Teniposídeo

    VP-l6 - Etoposídeo

    ηm - Nanometro

  • 1

    1. INTRODUÇÃO

    1.1. CÂNCER

    1.1.1. EPIDEMIOLOGIA

    O câncer é uma doença crônica de importante repercussão na saúde pública

    mundial. Levantamentos realizados pela organização mundial de saúde apontam

    que no ano de 2008 foram registrados 12.662.554 casos novos de câncer, excluindo

    os cânceres de pele não melanoma, com a ocorrência de 7.564.802 (WHO, 2008).

    Os órgãos internacionais de pesquisa e levantamentos do câncer estimam a

    incidência de novos casos de câncer com base no método proposto por Black et al.,

    (1997). Esse método permite estimar a taxa de incidência de câncer para uma

    determinada região, multiplicando-se a taxa observada de mortalidade da região

    pela razão entre os valores de incidência e mortalidade da localidade, e assim,

    traçam estratégias para o combate ao câncer. Usando-se dessa metodologia, a

    Sociedade de Câncer Norte Americana projetou para os Estados Unidos 1.529.560

    casos novos de câncer para o ano de 2010, com 569.490 registros de mortes, ou

    seja, uma em cada quatros mortes nos USA devem-se ao câncer. Estes valores,

    quando comparados aos obtidos por ano no período entre 2000 e 2006, são 1,3%

    menores para homens e 0,5% menores para as mulheres. Mesmo assim, o câncer

    responde por mais mortes do que as doenças coronarianas, em pessoas com idades

    inferiores á 85 anos (Ahmedin, 2010). No Brasil, o processo de industrialização pela

    qual o país passou após 1980 levou a um aumento no número de casos de câncer.

    A isso, deve a uniformização das condições de trabalho, nutrição e consumo da

    população mundial, bem como o aumento da expectativa de vida (Cervi, 2005).

    Dados brasileiros do Instituto Nacional do Câncer apontam a incidência de 489.270

    casos novos de câncer no ano de 2010, sendo os tipos mais incidentes, à exceção

    do câncer de pele do tipo não melanoma, os cânceres de próstata e de pulmão no

    sexo masculino e os cânceres de mama e do colo do útero no sexo feminino (INCA,

    2009).

    1.1.2. CONCEITOS

    No âmbito da patologia, o câncer compreende mais de 100 doenças

    caracterizadas por uma proliferação desordenada de células malignas, ou seja, que

    apresentam alterações genéticas que lhes conferem a capacidade de proliferar

  • 2

    desordenadamente e invadir outros tecidos e órgãos. As células cancerígenas são

    próprias do organismo, porém, as alterações genéticas pelas quais passaram,

    resultam na perda da funcionalidade e assim, tais células prejudicam o

    funcionamento normal do organismo. Dentre as várias características das células

    cancerígenas, podemos citar a pouca diferenciação e a capacidade de proliferação

    rápida (Kumar et al., 2005).

    Devido a sua baixa diferenciação, as células cancerígenas migram para

    diversos órgãos, sendo esse o fenômeno das metástases, que é caracterizado pela

    disseminação das células tumorais malignas para sítios diferentes dos que lhes

    deram origem (Kumar et al., 2005; Bacac e Stamenkovic, 2008).

    Quando um tumor apresenta células que proliferam lentamente e possuem

    alto grau de diferenciação, esses tumores não são considerados cânceres, sendo

    denominados de tumores benignos, que raramente trazem riscos a saúde e por

    apresentarem uma localização bem delimitada, podem ser removidos por excisão

    cirúrgica sem haver recorrência (Domingo et al., 2008). Por outro lado, as

    metástases são os principais entraves dos tumores malignos, pois as células

    colonizam outros órgãos e com isto, as recidivas são freqüentes (Gavrilovic e

    Darzynkiewicz, 2005; Bacac e Stamenkovic, 2008).

    Os diferentes tipos de câncer advêm da grande variedade de células

    existentes no corpo. Assim, para cada tipo de célula do organismo poderia ter um

    tipo de câncer, bastando para tanto, que essa sofra mutações que venham a conferir

    agressividade e malignidade (Kumar et al., 2005).

    Os cânceres se classificam em três grupos: os de mucosas e células epiteliais

    são denominados carcinomas, os de tecidos conjuntivos, como ossos, músculos ou

    cartilagens são os sarcomas e o terceiro grupo de cânceres são os de tecido

    sanguíneo, conhecidos como leucemias (Kumar et al., 2005).

    1.1.3. CLASSIFICAÇÃO

    1.1.3.1. CARCINOMAS

    Os carcinomas de pele apresentam maior distribuição na população de pele

    clara. Estima-se que mais de 50% das pessoas de pele branca com mais de 60 anos

    de idade apresentam algum carcinoma de pele e que nessa população, os cânceres

    de pele são muito mais freqüentes que em outras. Além disso, os carcinomas de

    pele apresentam distribuição mundial, variando pouco dentre os grupos étnicos

  • 3

    (From et al., 2007). Em estudo retrospectivo com 545 pacientes acometidos por

    carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular e melanoma atendidos no hospital

    da faculdade de medicina do ABC, em São Paulo, Brasil, demonstrou-se uma maior

    prevalência de câncer de pele entre mulheres (62,9%) e quanto aos grupos étnicos,

    98,2% dos pacientes eram de pele branca, confirmando os achados mundiais e

    relatados pela OMS. Quanto à distribuição do tipo de câncer de pele nestes

    pacientes, foi encontrada a maior prevalência para o carcinoma basocelular e a de

    menor freqüência foi para o melanoma (Machado-Filho et al., 1996).

    Em relação aos cânceres de mucosa, segundo a organização mundial de

    saúde, os mais freqüentes são: câncer de pulmão, cólon, reto e estômago. No Brasil,

    dentre os sexos a maior prevalência entre os homens fica a cargo do câncer de

    próstata, seguido pelos de pulmão, estômago, cólon, reto e esôfago. Já entre as

    mulheres, a maior prevalência observada é para os cânceres de mama, colo uterino,

    cólon, reto e estômago (Guerra et al., 2005).

    1.1.3.2. SARCOMAS

    Os sarcomas são tumores raros de tecidos conjuntivos e são subdivididos em

    sarcomas de tecidos ósseos e sarcomas de partes moles. Os sarcomas ósseos

    (osteossarcomas) acometem principalmente os ossos dos braços e das pernas

    (Lacerda, 2007). São formados pelo crescimento desordenado das células

    mesenquimais que formam os tecidos ósseos, dando origem a massas tumorais. Os

    tumores de partes moles acometem os vasos sanguíneos e linfáticos, os músculos,

    os tecidos fibrosos e adiposos, o tecido de suporte aos epitélios e o tecido nervoso

    periférico (Coindre, 2006), e assim como os osteossarcomas, advêm da proliferação

    de células mesenquimais dos tecidos conjuntivos (Kumar et al., 2005; Coindre,

    2006). Os sarcomas acometem principalmente as crianças e adultos jovens, com

    pico em torno dos 15 anos de idade. No Brasil, a freqüência de distribuição dos

    sarcomas é de 2,8 casos para cada grupo de 100.000 crianças e adolescentes. A

    principal forma de tratamento consiste na quimioterapia e com suporte, admite-se a

    radioterapia e a cirurgia para excisão das massas tumorais (Lacerda, 2007; Coindre,

    2006).

  • 4

    1.1.3.3. LEUCEMIAS

    As leucemias são cânceres das células do sangue. Sua origem consiste de

    alterações genéticas nas células das linhagens eritrocitárias, leucocitárias e

    plaquetárias, ainda na medula óssea. As células tumorais das leucemias apresentam

    como sítio inicial de proliferação a medula óssea, e em estágios avançados da

    doença, as células passam a proliferar também no sangue (Vicent, 1990; Kumar et

    al., 2005). A parte majoritária das leucemias é constituída de células das linhagens

    leucocitárias (Leal e Wunsch, 2002) e os fatores que predispõem ao

    desenvolvimento das leucemias são os mesmos para os outros tipos de câncer,

    basicamente radiações ionizantes, agentes químicos, como benzeno, e agentes

    virais. Dentre os agentes virais, ressalta-se o vírus linfotrópico dos linfócitos T

    humanos tipo I (HTLV-I), que está implicado na maioria dos casos de leucemia de

    células T do adulto. Alguns tipos de alterações genéticas também têm sido

    descobertas como possíveis causas de leucemias (Bernard, 2010).

    Existem quatro tipos principais de leucemia leucocitária, e sua classificação

    considera a rapidez de sua evolução e o tipo de leucócito afetado. As leucemias

    agudas evoluem rapidamente enquanto que as leucemias crônicas evoluem

    lentamente. Quanto ao tipo celular, as leucemias linfocíticas afetam os linfócitos

    enquanto que as leucemias mielocíticas afetam os mielócitos, precursores dos

    neutrófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos. Assim, existem quatro tipos básicos

    de leucemias leucocitárias: leucemias mielócíticas agudas, leucemias mielocíticas

    crônicas, leucemias linfocíticas agudas e as leucemias linfocíticas crônicas (Kumar

    et al., 2005; Leal e Wunsch, 2002).

    1.2. MECANISMOS DE MORTE CELULAR

    Os mecanismos de morte celular são divididos em morte autofágica, necrose

    e apoptose. Estímulos de injúrias sofridas pelas células desencadeiam reações que

    as levam a perda da estrutura celular necessária para a manutenção da vida. Esses

    estímulos podem ser internos ou externos. Dentre os estímulos externos pode ser

    citado o calor, que em excesso promove a perda da integridade da membrana

    plasmática e a célula se rompe. Um exemplo de extímulo interno é a perda da

    integridade mitocôndrial, o que leva a liberação de mediadores pró-apotóticos e

    desencadeiam o processo de apoptose. Na morte autofágica, um processo ainda

    não muito bem entendido, as células passam a destruir suas próprias organelas,

  • 5

    levando a falência funcional e a ativação de caspases, deflagrando o estímulo de

    morte (Alberts et al., 2009).

    1.2.1. NECROSE

    A necrose é o mecanismo pelo qual as células morrem de modo não-

    fisiológico, promovendo lesões tissulares e sintomatologia de várias doenças. A

    morte é patológica ou "acidental" quando a célula é impedida de manter seus

    processos vitais por lesões físicas ou químicas causadas por fatores externos, como

    temperaturas extremas, radiação, traumas, produtos tóxicos e falta de oxigênio que

    ocorre no infarto do miocárdio e na gangrena (Alberts et al., 2009; Kanduc et al.,

    2002). As lesões podem ter ainda origem biológica, como nas infecções por

    bactérias ou vírus. Esse tipo de morte celular foi o único conhecido pelos cientistas

    mais antigos e é morfologicamente caracterizado por um inchaço celular e de

    organelas do citoplasma, em particular as mitocôndrias, as quais são danificadas,

    mas o núcleo não sofre alterações significativas. Tais lesões impedem o controle do

    equilíbrio interno exercido pela água e alguns íons (em especial sódio e cálcio),

    normalmente bombeados para fora, que passam a fluir livremente para dentro da

    célula, que incha e se rompe. A ruptura libera, no próprio tecido, o conteúdo celular

    que é rico em proteases e outras substâncias tóxicas, que atraem células do sistema

    imune causando intensa reação inflamatória. Alguns tipos de glóbulos brancos

    convergem para o tecido em necrose e fagocitam as células mortas. A inflamação,

    típica da necrose, é importante para limitar infecções e remover restos de células,

    mas a atividade e as secreções dos glóbulos brancos podem também danificar

    tecidos normais vizinhos, às vezes de maneira devastadora (Kanduc et al., 2002).

    1.2.2. APOPTOSE

    A apoptose é um tipo de "auto-destruição celular" que ocorre de forma

    ordenada e demanda energia para a sua execução (diferentemente da necrose).

    Está relacionada com a manutenção da homeostase e com a regulação fisiológica

    do tamanho dos tecidos, mas pode também ser causada por um estímulo patológico

    (como a lesão ao DNA celular). A apoptose é um processo com gasto energético,

    marcado pela autodigestão controlada dos constituintes celulares, devido à ativação

    de proteases endógenas e pode ser comparada metaforicamente a um "suicídio

    celular" (Alberts et al., 2009; Elmore, 2007). A ativação dessas proteases

  • 6

    compromete a integridade do citoesqueleto, levando a perda na estrutura do

    arcabouço celular. Em resposta à contração do volume citoplasmático, a membrana

    celular forma bolhas e altera o posicionamento de seus lipídios constituintes, como

    ocorre com a fosfatidilserina, que em células normais está presente na camada

    interna de lipídios da membrana e nas células em apoptose apresenta-se na

    camada externa, servindo como sinalizador para que células fagocíticas das

    proximidades englobem os fragmentos celulares e completem o processo de

    degradação. Durante a apoptose ocorrem alterações características no núcleo

    celular graças à ativação de endonucleases que degradam o DNA. Como resultado,

    o núcleo torna-se picnótico e a cromatina se condensa nas porções adjacentes à

    membrana nuclear. Finalmente, o núcleo entra em colapso e se fragmenta (Figura

    1-D).

    Figura 1: Micrografias eletrônicas de células THP1 estimuladas para apoptose com uma droga de coordenação de cobre. A e B - Célula Normal: Núcleo volumoso (N), com presença de Mitocôndrias (M) e Retículo Endoplasmático Rugoso (RE). C – Célula em apoptose, com cromatina condensada (CD) e ausência de mitocôndrias e Retículo Endoplasmático Rugoso. D - Célula em apoptose: Célula picnótica, com núcleo compactado e cromatina condensada (CD). (BORGES, 2009).

  • 7

    Simultaneamente, as bolhas que se formam no citoplasma separam a célula

    em fragmentos circundados por membrana, contendo partes do núcleo e organelas

    intactas (corpos apoptóticos). Os restos celulares são fagocitados pelos macrófagos

    teciduais ou células adjacentes (Elmore, 2007).

    A apoptose pode ser deflagrada por estímulos externos através de receptores

    específicos na superfície celular chamados receptores de morte ou por estímulos

    internos de estresse intracelular, tais como lesão do DNA ou perturbações no ciclo

    celular ou nas vias metabólicas, conforme pode ser observado na Figura 2. Essas

    diferentes vias culminam com a ativação de proteases conhecidas como caspases,

    que possuem um papel fundamental neste tipo de morte celular. As caspases estão

    presentes no citoplasma e já foram descritas em mamíferos 14 membros da família

    que estão envolvidos no processo de inflamação e apoptose (Elmore, 2007).

    Quando ativadas, as caspases ativam outros membros da família e

    amplificam a cascata proteolítica. Alguns membros, tais como a caspase-8, ocupam

    posição proximal na cascata e agem como reguladores e iniciadores, enquanto

    outros como a caspase-3 são mais distais e agem como efetores da fragmentação

    celular. Contrariamente às proteases armazenadas nos lisossomos ou ativadas no

    citoplasma por íons como o cálcio, que têm espectro amplo de substratos

    inespecíficos, as caspases têm substratos bem restritos, o que lhes asseguram

    maior seletividade e especificidade no processo de proteólise. Tais substratos

    incluem proteínas envolvidas no reparo de danos e na replicação do DNA, na

    sinalização de transdução e na manutenção da integridade da estrutura celular

    (Elmore, 2007; Alberts et al., 2009).

    A ação sobre seus substratos promove a desestruturação do citoesqueleto e

    do núcleo, levando a célula à morte. Um dos mecanismos que pode iniciar o

    processo de apoptose é a ativação dos receptores de morte presentes na superfície

    celular quando ligantes específicos se acoplam a essa. A maior parte dos receptores

    de morte identificados é da família de receptores do TNF e são classificados assim

    pela presença na porção extracelular rica em cisteína ("domínios de morte") que

    transmite o sinal de morte para o meio intracelular. Entre esses receptores, um dos

    mais estudados e melhor caracterizados é o receptor FAS (CD95 ou APO-1).

    Quando o ligante-FAS se acopla ao receptor FAS, as moléculas individuais do

    receptor se trimerizam formando agregado de cadeias da morte que se ligam a uma

  • 8

    proteína adaptadora presente no citosol, chamada cadeia da morte associada ao

    FAS, que por sua vez se liga à pro-caspase-8 resultando na ativação dessa enzima

    que atua como proteolítica ativando a caspase-3 (Tatsuya et al., 2001; Elmore,

    2007).

    Figura 2. Vias de indução de apoptose (Adaptado de GUPTA, 2006).

    Citocinas inflamatórias, tais como a interleucina-1, ou a presença de estresse

    oxidativo, que resulta na lesão de DNA e ativação da p53, podem aumentar a

    expressão dos receptores-FAS, tornando as células mais suscetíveis a apoptose

    pelo sistema FAS. Simultaneamente, o estresse oxidativo aumenta a expressão do

    ligante-FAS, o que pode levar o processo conhecido como "fratricídio", no qual

    células adjacentes podem destruir umas as outras pela indução de apoptose. Além

    dos receptores de morte, a apoptose pode também ser deflagrada por sinais de

    estresse intracelular que resultem em disfunção mitocondrial, tais como lesão do

    DNA (via gene p53), alterações nas vias metabólicas, drogas, toxinas ou privação

    dos fatores de crescimento (Figura 2). Na presença de sinais de estresse

    intracelular ocorre a translocação das proteínas BAX e BID do citosol para a

    mitocôndria. Essas proteínas são membros da família de proteínas BCL-2 que

    exercem importante função reguladora de apoptose. A translocação das proteínas

    pró-apoptóticas para a mitocôndria resulta na liberação para o citosol do citocromo-c,

    presente no espaço existente entre a membrana mitocondrial externa e interna. No

  • 9

    citoplasma, o citocromo-c forma um complexo com o APAF-1, levando à ativação da

    caspase-9, que ativa as caspases efetoras (Kanduc et al., 2002; Elmore, 2007).

    Alguns genes têm sido identificados como capazes de influenciar o processo

    de apoptose. Entre eles destacam-se os da família das proteínas BCL-2, que

    desempenham papel importante na regulação de apoptose por vias fisiológicas ou

    patológicas. Dos 15 membros já identificados, alguns como BCL-2 e BCL-XL, BCL-

    W, MCL-1 e A1 são anti-apoptóticos, enquanto outros, tais como BAX, BAD e BID

    são pró-apoptóticos (Harrison e Wunsch, 2006). Estas proteínas se distribuem por

    várias partes da célula, como na membrana externa da mitocôndria, na membrana

    nuclear e no retículo endoplasmático rugoso. Na mitocôndria, distribuem-se

    focalmente, nos locais de contato entre a membrana interna e externa. Três funções

    têm sido descritas para essas proteínas: dimerização, atividade formadora de poro

    ou canal de íons e ligação a outras proteínas. Os principais antagonistas da

    apoptose, BCL-2 e BCL-XL, localizam-se, principalmente, na membrana mitocondrial

    e recentemente, demonstrou-se que a BCL-2 bloqueia a penetração nuclear de

    perforina e granzima, substâncias liberadas pelos linfócitos T citotóxicos contra seus

    alvos e que podem ser ativadoras de caspases (Mignotte e Vayssiere, 2001;

    Morgan, 1997). Os membros pró-apoptóticos da família BCL-2 são normalmente

    encontrados no citosol e quando ativados, se deslocam para a mitocôndria,

    alterando a permeabilidade da membrana dessa organela e permitindo a liberação

    de proteínas pró-apoptóticas, tais como o citocromo-c, o fator indutor da apoptose,

    DNAse e pró-caspases 2 e 9 (Figura 2). A mitocôndria participa da manutenção de

    funções celulares vitais, tais como respiração celular e síntese de ATP, modulação

    do estado redox da célula, regulação osmótica, controle do pH, homeostasia do

    cálcio no citosol e sinalização intracelular. Paradoxalmente, a mitocôndria guarda no

    espaço intermembranoso substâncias letais, capazes de deflagrar o processo de

    morte celular, entre as quais figura o citocromo-c. Quando liberado da mitocôndria, o

    citocromo-c se associa a duas proteínas presentes no citosol, a APAF-1 e a pró-

    caspase-9, e na presença de ATP ativa a caspase-9 que por sua vez, ativa as pró-

    caspases-3 e 7, que executam o processo de apoptose. A caspase-3 pode amplificar

    a cascata de proteólise pela ativação da caspase-8 e pela clivagem da proteína anti-

    apoptótica BCL-2 que, normalmente, garante a integridade da membrana

    mitocondrial. A caspase-8 ativada cliva a proteína pró-apoptótica BID presente no

    citosol, gerando um fragmento que se liga à mitocôndria, permeabilizando as suas

  • 10

    membranas. Lesões do DNA celular ativam o gene p53 que favorece maior

    expressão da proteína pró-apoptótica BAX que promove a abertura de poros na

    membrana mitocondrial (Mignotte e Vayssiere, 2001, Mayer e Oberbauer, 2003).

    A membrana mitocondrial interna, por apresentar várias pregas, pode

    acomodar o aumento do volume da matriz, enquanto a membrana externa, que é

    esférica, se rompe, liberando componentes pró-apoptóticos, como o fator indutor da

    apoptose e o citocromo-c. A abertura de poros de permeabilidade na membrana

    mitocondrial causa, simultaneamente, ativação das caspases e queda da síntese de

    ATP que irá orientar a morte celular, seja por apoptose, seja por necrose. A disputa

    pode ser vencida pelas caspases quando estas são diretamente ativadas pelos

    receptores da superfície celular ou granzima B, processo que ocorre quando

    algumas mitocôndrias continuam a funcionar enquanto outras liberam os mediadores

    pró-apoptóticos, circunstância esta em que as células entram em apoptose. Por

    outro lado, se o poro de permeabilidade é aberto rapidamente e a célula não pode

    obter energia suficiente a partir da glicólise anaeróbia, a depleção do ATP impede

    que a apoptose se inicie e a célula morre por necrose (Mayer e Oberbauer, 2003;

    Wang, 2001).

    1.3. TRATAMENTOS ANTINEOPLÁSICOS

    Os tratamentos aplicados aos pacientes com câncer visam sempre à

    destruição das células tumorais. Como as células tumorais são próprias do

    organismo, células normais do paciente também ficam suscetíveis a ação dos

    fármacos. Buscando peculiaridades existentes entre as células tumorais e normais,

    têm-se percebido que as primeiras proliferam-se muito mais rápido que as

    segundas, sendo o ciclo celular o principal alvo de tratamento e combate as células

    tumorais (Brasileiro-Filho, 2006; Casciato, 2008).

    Os tecidos humanos normais que proliferam rapidamente, como as mucosas

    e os anexos epidérmicos, passam a sofrer com as terapias aplicadas. Dentre as

    terapias, existem as que utilizam feixes de radiação para promoverem a morte das

    células tumorais (radioterapia) e as quimioterapias, onde são administrados

    fármacos que interferem no funcionamento normal das células, impedindo sua

    replicação e levando-as a morte (Casciato, 2006; Kumar et al., 2005; Brasileiro-Filho,

    2006).

  • 11

    1.3.1. RADIOTERAPIA

    Os principais tratamentos antineoplásicos têm por objetivo induzir a morte das

    células cancerígenas por apoptose, evitando processos inflamatórios indesejáveis

    advindos da necrose (Vermeulen e Ermeman, 2003; Kumar et al., 2005). A premissa

    desse sucesso parte do princípio de que a grande maioria das células tumorais

    apresenta danos em seu DNA, o que as tornam mais sensíveis a agentes externos,

    como a radioterapia e a quimioterapia (Casciato, 2008; Lowe e Lin, 2000). Na

    radioterapia, um feixe de radiação ionizante é regulado para incidir sobre uma região

    pré-estabelecida em que se encontram as células cancerígenas. A quantidade de

    radiação a ser empregada depende do tipo tumoral e do tecido em que irá incidir,

    pois as células do organismo apresentam sensibilidades diferentes à radiação. O

    sucesso desta terapia é obtido quando todas as células tumorais são erradicadas

    (Janneke et al., 2010).

    A radioterapia pode ser utilizada também como suporte a quimioterapia ou a

    cirurgia para excisão da massa tumoral (Janneke et al., 2010). O princípio de ação

    da radioterapia está relacionada às ondas eletromagnéticas aplicadas aos tecidos

    que possuem grande quantidade de energia, promovendo a ionização de moléculas

    intracelulares, como a água e as cadeias de DNA (Lowe e Lin, 2000). Um efeito

    importante da radiação, de relevância clínica para a radioterapia, é a indução da

    morte celular por falência reprodutiva ou morte clonogênica, que se caracteriza pela

    perda da capacidade de divisão celular. Neste caso, a célula irradiada permanece

    morfologicamente íntegra, às vezes conseguindo até processar algumas divisões,

    mas perde a capacidade de se dividir por inúmeras vezes e morre. Considerando o

    ciclo celular, a fase de divisão celular ou mitose (M) é extremamente sensível à

    radiação, pois existe grande possibilidade de que os danos provocados pela

    radiação fiquem permanentemente no DNA, provocando aberrações cromossômicas

    e morte celular (Jones, 2001; Ross, 1999). Isso acontece devido à grande

    compactação da cromatina durante a mitose tornando as lesões inacessíveis às

    enzimas reparadoras. Quando os danos sofridos pelo DNA são percebidos e o

    sistema de reparo não os consegue recuperar, é deflagrado um sinal de morte

    celular que culmina em apoptose, pela ativação de caspases (Alberts et al., 2009).

  • 12

    1.3.2. QUIMIOTERAPIA

    O primeiro quimioterápico antineoplásico foi desenvolvido a partir do gás

    mostarda, usado nas duas Guerras Mundiais como arma química. Após a exposição

    de soldados a este agente, observou-se que eles desenvolveram hipoplasia medular

    e linfóide, o que levou ao seu uso no tratamento dos linfomas malignos (Fuchs e

    Wannmacher, 2010). A partir da publicação, em 1946, dos estudos clínicos feitos

    com o gás mostarda e das observações sobre os efeitos do ácido fólico em crianças

    com leucemias, verificou-se um avanço crescente no combate ao câncer. O

    conhecimento acerca do funcionamento da maquinaria celular abriu um leque de

    opções a serem exploradas para a busca de novas drogas antineoplásicas. A

    maioria dos agentes utilizados atualmente no tratamento do câncer afetam

    diretamente o DNA celular, promovendo danos tanto as células normais como as

    neoplásicas, porém, acarretam maior dano às células malignas do que às dos

    tecidos normais, devido às diferenças quantitativas entre os processos metabólicos e

    ao ciclo de divisões celulares dessas duas populações celulares (Leen et al., 2005).

    Por esses motivos a quimioterapia obtém sucesso no tratamento do câncer.

    A maioria das drogas utilizadas na quimioterapia antineoplásica interfere de

    algum modo nesses mecanismos celulares, e a melhor compreensão do ciclo celular

    normal levou à definição clara dos mecanismos de ação da maioria das drogas. Foi

    a partir dessa definição que Bruce em 1969 classificou os quimioterápicos conforme

    sua atuação sobre o ciclo celular:

    • Ciclo-inespecíficos - Aqueles que atuam nas células que estão ou não no

    ciclo proliferativo, como, por exemplo, a mostarda nitrogenada.

    • Ciclo-específicos - Os quimioterápicos que atuam somente nas células que

    se encontram em proliferação, como é o caso da ciclofosfamida.

    • Fase-específicos - Aqueles que atuam em determinadas fases do ciclo

    celular, como, por exemplo, o metotrexato (fase S), o etoposídeo (fase G2) e a

    vincristina (fase M).

    Os agentes antineoplásicos mais empregados no tratamento do câncer

    incluem os alquilantes polifuncionais, os antimetabólitos, os antibióticos

    antineoplásicos e os inibidores mitóticos (Fuchs e Wannmacher, 2010). Novas

    drogas estão sendo permanentemente isoladas e aplicadas experimentalmente em

    modelos animais antes de serem usadas no homem (Casciato, 2008).

  • 13

    1.3.2.1. ALQUILANTES

    Os compostos alquilantes são capazes de substituir em outra molécula um

    átomo de hidrogênio por um radical alquil. Eles se ligam ao DNA de modo a impedir

    a separação dos dois filamentos do DNA de dupla fita espiralar, fenômeno este

    indispensável para a replicação. Os alquilantes afetam as células em todas as fases

    do ciclo celular de modo inespecífico (Kostova, 2006). Apesar de efetivos como

    agentes isolados para inúmeras formas de câncer, raramente produzem efeito

    clínico ótimo sem a combinação com agentes fase-específicos do ciclo celular. As

    principais drogas empregadas dessa categoria incluem a mostarda nitrogenada, a

    mostarda fenil-alanina, a ciclofosfamida, o bussulfam, as nitrosuréias, a cisplatina e o

    seu análago carboplatina, e a ifosfamida (Bruce e Lin, 1969; Almeida, 2005).

    1.3.2.2. ANTIMETABÓLICOS

    Os antimetabólicos afetam as células inibindo a biossíntese dos componentes

    essenciais do DNA e do RNA. Deste modo, impedem a multiplicação e função

    normais da célula (Fuchs e Wannmacher, 2010). Esta inibição da biossíntese pode

    ser dirigida às purinas (como é a ação dos quimioterápicos 6-mercaptopurina e 6-

    tioguanina), à produção de ácido timidílico (5-fluoruracil e metotrexato) e à outras

    etapas da síntese de ácidos nucléicos (citosina-arabinosídeo C) (Almeida, 2005).

    Essas drogas são particularmente ativas contra células que se encontram na fase de

    síntese do ciclo celular (fase S). A duração da vida das células tumorais suscetíveis

    determina a média de destruição dessas células, as quais são impedidas de entrar

    em mitose pela ação dos agentes metabólicos que atuam na fase S (Fuchs e

    Wannmacher, 2010).

    1.3.2.3. ANTIBIÓTICOS

    Os antibióticos antineoplásicos formam um grupo de substâncias com

    estrutura química variada que, embora interajam com o DNA e inibam a síntese

    deste ácido ou de proteínas, não atuam especificamente sobre uma determinada

    fase do ciclo celular (Fuchs e Wannmacher, 2010). Apesar de apresentarem tal

    variação, possuem em comum a presença de anéis insaturados que permitem a

    incorporação de excesso de elétrons e a conseqüente produção de radicais livres

    reativos. Podem apresentar outro grupo funcional que lhes acrescentam novos

    mecanismos de ação, como alquilação (mitomicina C), inibição enzimática

  • 14

    (actinomicina D e mitramicina) ou inibição da função do DNA por intercalação

    (bleomicina, daunorrubicina, actinomicina D e adriamicina e seus análogos

    mitroxantona e epirrubicina) (Almeida, 2005). Como todos os quimioterápicos, os

    antibióticos atuam tanto sobre as células normais como sobre as malignas. Por isso,

    também apresentam efeitos colaterais indesejáveis (Almeida, 2005, Casciato, 2008).

    1.3.2.4. INIBIDORES MITÓTICOS

    Os inibidores mitóticos podem paralisar a mitose na metáfase, devido à sua

    ação sobre a proteína tubulina, formadora dos microtúbulos que constituem o fuso

    espiralar, pelo qual migram os cromossomos. Deste modo, os cromossomos,

    durante a metáfase, ficam impedidos de migrar, ocorrendo à interrupção da divisão

    celular. Esta função tem sido útil na "sincronização" das células quando os inibidores

    mitóticos são combinados com agentes específicos da fase S do ciclo. Devido ao

    seu modo de ação específico, os inibidores mitóticos devem ser associados a outros

    agentes para maior efetividade da quimioterapia (Almeida, 2005). Neste grupo de

    drogas estão incluídos os alcalóides da vinca rósea (vincristina, vimblastina e

    vindesina) e os derivados da podofilotoxina (o VP-l6, etoposídeo; e o VM-26,

    teniposídeo) (Fuchs e Wannmacher, 2010).

    Algumas drogas não podem ser agrupadas em uma determinada classe de

    ação farmacológica (Bruce e Lin, 1969). Entre elas, destacam-se a dacarbazina,

    indicada no tratamento do melanoma avançado, sarcomas de partes moles e

    linfomas; a procarbazina, cujo mecanismo de ação não foi ainda completamente

    explicado, e que é utilizada no tratamento da doença de Hodgkin; a L-asparaginase,

    que hidrolisa a L-asparagina e impede a síntese protéica, utilizada no tratamento da

    leucemia linfocítica aguda (Fuchs e Wannmacher, 2010; Casciato, 2008).

    1.4. QUINONAS

    Na busca para minimizar os danos provocados ao material genético e os

    efeitos colaterais que os fármacos antineoplásicos de uso corrente promovem,

    diversas linhas de pesquisas baseadas principalmente nas vias de apoptose buscam

    em moléculas indutoras de tal tipo de morte celular protótipos que possam ser

    aprimorados para o uso no tratamento do câncer (Casciato, 2008). Dentre as

    moléculas pesquisadas chamam a atenção os derivados da quinona (Figura 3).

    Essas moléculas são isômeros de posição da ciclohexanodiona e possuem a

  • 15

    fórmula molecular C6H4O2 e nomes orto-benzoquinona (benzoquin-1,2-ona) e a

    para-benzoquinona (benzoquin-1,4-ona) (antitumorais, leischmanicida, anti-

    inflamatória, antifúngica e tripanomicida (Marsik et al., 2005).

    As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de

    distribuição natural. As orto-quinonas metídios estão presentes numa grande

    variedade de compostos bioativos que têm sido objeto de interesse durante muitos

    anos. Estes compostos têm sido estudados para atividades antineoplásicas,

    antinflamatórias e antiparasitárias (Steinberg et al., 2003).

    A Quinolina ou 1-azanaphthalene é um composto aromático azotado

    caracterizado por uma dupla estrutura que contém um anel de benzeno fundido a

    uma piridina em dois átomos de carbono adjacentes. De característica higroscópica,

    amarelada e pouco polar, está presente no alcatrão. Para a indústria farmacêutica,

    sua síntese é feita partindo-se de uma reação entre a anilina e o ácido sulfúrico

    (Sedic et al., 2008). A isoquinolina difere da quinolina pela posição do heteroátomo

    que na primeira molécula está presente na posição 2. Ambos os compostos são

    muito empregados na indústria farmacêutica como estruturas orgânicas bases para

    a síntese de fármacos e na modelagem e aprimoramento de compostos já

    existentes. Dentre as drogas comercializadas, encontram-se anti-maláricos,

    fungicidas, anti-sépticos e antipiréticos (Martirosyan et al., 2003).

    Figura 3: Estruturas moleculares básicas: Orto-benzoquinona, Para-benzoquinona, Quinolina, Isoquinolina.

    A Quinaldina, 2-metilquinolina (Figura 4), é utilizada como um anti-malárico e

    está sendo testado como suporte para a produção de anti-maláricos mais potentes.

    A quinazolina é utilizada como intermediário para a produção de alguns anti-

    hipertensivos periféricos, como o prazosin e doxazosina (Figura 4). Já as

  • 16

    quinoxalinas são intermediários na síntese de fungicidas (Figura 4). A síntese de

    outras drogas importantes também passam pela estrutura básica das isoquinolinas,

    como é feito para a obtenção da morfina. A atividade destes compostos sugere uma

    ação na via das quinases celulares, mas ainda não estão bem esclarecidos os

    mecanismos de ação (Sedic et al., 2008).

    Figura 4: Estruturas básicas dos medicamentos Quinoxalina, Quinaldina, Quinazolina, Morfina, Prazosin.

    1.4.1. LAPACHOL

    O lapachol é uma naftoquinona de conhecida atividade biológica (Figura 5). A

    presença do anel de quinona na porção central da molécula é a responsável pela

    atividade biológica exibida pelo composto. O mecanismo de ação do lapachol deve-

    se a capacidade de gerar radicais semiquinônicos, através da biorredução da

    molécula e estes radicais irão atuar então nas rotas celulares (Hussain et al., 2007).

    O emprego do lapachol tem sido relatado no combate às doenças tropicais. Esse

    emprego é feito indiretamente, pois há relatos da utilização popular do extrato ou

    infusões de plantas que sintetizam altas concentrações dessa molécula (Almeida,

    2009).

    O lapachol foi isolado pela primeira ver por Paterno em 1882 da planta

    Tabebuia avellanedae, conhecida popularmente como Ipê-Rosa. A planta também é

    popularmente conhecida no Brasil como “Pau d'arco”, e seu extrato é empregado

    quando se deseja ações analgésicas, anti-inflamatórias, antineoplásicas e diuréticas.

    Os efeitos anti-inflamatórios, antineoplásicos e antimicrobianos devem-se a

    saponinas, flavonóides, cumarinas e outros antibióticos derivados do lapachol ou

    que se encontram no extrato da planta. Os extratos aquosos e metanólico da T.

  • 17

    avellanedae mostraram atividades antifúngica, antinociceptiva e antiedematogênica

    (Hussain et al., 2007; Almeida, 2009).

    Figura 5: Estrutura molecular do Lapachol, uma Naftoquinona.

    Os primeiros relatos científicos da atividade antineoplásica do lapachol datam

    de 1974, quando um estudo mostrou a atividade antitumoral contra tumores de

    ratos, porém, estudos posteriores não resultaram em significantes atividades

    antineoplásicas em testes clínicos. Em 1978, foi feita uma nova tentativa, desta vez,

    utilizou-se de nove pacientes com vários tipos de cânceres e o lapachol exibiu efeito

    antineoplásico considerável, reduzindo os tumores e as dores sentidas pelos

    pacientes (Hussain et al., 2007).

    Os principais entraves nas terapias com lapachol é a obtenção de

    concentrações plasmáticas terapêuticas, pois apesar da tolerância, as doses

    administradas são elevadas devido ao metabolismo acelerado que reduz a

    biodisponibilidade do lapachol (Said, 2003).

    Assim, tem-se feito estudos de modelagem molecular na busca de compostos

    análogos ao lapachol que tenham elevada atividade antitumoral e que a sua

    biodisponibilidade seja aumentada. Seguindo esta linha de pesquisa, foram

    sintetizados muitos análogos, com atividades contra células de câncer de mama,

    pulmão, próstata, ovário, leucemias e melanomas (Hussain et al., 2007; Almeida,

    2009).

    1.5. ISOQUINOLINO QUINONAS - IQQ

    As IQQ são moléculas orgânicas que apresentam em suas estruturas tanto as

    funções de isoquinolina quanto a de quinonas. A indústria farmacêutica tem

    despertado interesse nos estudos com essas moléculas, pois seu esqueleto serve

    de suporte para a síntese de novas drogas (Kouznetsov et al., 2005). Segundo

  • 18

    Kouznetsov (2005), o interesse nessas substâncias deve-se ao fato de que elas

    apresentam uma grande variedade de atividades biológicas.

    Recentemente, estudos com IQQ obtidas do Bryozoan marinho Caulibugula

    intermis revelaram uma ação destes compostos diretamente sobre a via das MAPK

    P38, com conseqüente indução de apoptose em várias linhagens de células

    cancerígenas. As moléculas isoladas deste animal são conhecidas como

    caulibugulonas e são em número de seis, denominadas pelas seis primeiras letras

    do alfabeto (A-F) (Brisson et al., 2007; Milanowski et al., 2004).

    Um projeto de pesquisa, desenvolvido no Laboratório de Ciências Químicas

    (LCQUI) do Centro de Ciências Tecnológicas (CCT) da UENF, coordenado pelo

    Professor Dr. Paulo César Muniz de Lacerda Miranda resultou no desenvolvimento

    de uma rota inédita para a síntese de três caulibugulonas e nove análogos. As

    estruturas das moléculas foram confirmadas por ressonância Magnética-Nuclear e

    por espectros de radiação ultravioleta, e estão apresentadas na Figura 6. As

    moléculas sintetizadas foram gentilmente cedidas e testadas nos experimentos

    dessa dissertação de mestrado. Foram investigados os efeitos antineoplásicos das

    doze IQQ cedidas e do lapachol contra linhagens de células tumorais humanas.

    Através de ensaios de viabilidade celular foi possível identificar nove IQQ que foram

    biologicamente ativas e induziram morte em células tumorais. Em seguida, foi feita

    uma avaliação da toxicidade das drogas sobre células humanas normais do sangue

    periférico, onde quatro IQQ obtiveram dados de IC50 superiores aos das células

    tumorais, indicando a existência de seletividade. Essas substâncias foram testadas

    então para investigar o tipo de morte celular induzido. Por microscopia de

    fluorescência com coloração por laranja de acridina e brometo de etídeo foi possível

    verificar que as células tratadas apresentavam morfologia de apoptose e que a

    necrose era rara. As mortes por apoptose foram confirmadas por citometria de fluxo

    para picos de DNA Sub-G1 e por eletroforese do DNA celular.

  • 19

    Figura 6. Estruturas moleculares das isoquinolino quinonas - IQQ testadas.

  • 20

    2. OBJETIVOS

    2.1 OBJETIVO GERAL

    • Avaliar in vitro o efeito antineoplásico de doze isoquinolino quinonas

    sintéticas sobre células tumorais humanas e comparar com os efeitos do lapachol,

    que é uma droga aprovada para uso contra o câncer e que possui estrutura

    molecular semelhante às IQQ.

    2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

    • Avaliar e comparar in vitro a capacidade redutora da viabilidade celular

    e promotora de danos das células de câncer humano tratadas com as IQQ e com o

    lapachol.

    • Selecionar as IQQ efetivas em reduzir a viabilidade das células

    tumorais humanas e investigar seus efeitos sobre a viabilidade de PBMC de

    indivíduos sadios.

    • Identificar o tipo de morte celular e quantificar a cinética de morte em

    culturas celulares tratadas por IQQ e lapachol utilizando técnicas de microscopia de

    fluorescência, citometria de fluxo Sub-G1 e eletroforese do DNA celular.

  • 21

    3. JUSTIFICATIVA

    O Câncer é a segunda doença que mais causa mortes em todo o mundo.

    Segundo estimativas da organização mundial de saúde, 13% de todas as mortes

    ocorridas no ano de 2008 foram provocadas pelo câncer, dimensionando assim o

    seu impacto econômico, que vem crescendo juntamente com o surgimento de novos

    casos (WHO, 2008). Associados ao câncer surgem também outras doenças que

    impossibilitam o trabalhador de exercer suas atividades e que mesmo após a

    terapia, alguns pacientes podem ficar mutilados, e impossibilitados

    permanentemente de terem uma vida normal (Guerra, 2005).

    As atuais drogas antitumorais são muito agressivas, promovendo diversos

    efeitos colaterais e colocando inclusive, a vida dos pacientes em risco. Quedas de

    cabelos, degeneração da mucosa do trato digestivo, vasculites, nefrotoxicidade e

    hepatotoxicidade figuram entre os efeitos colaterais que tornam as atuais terapias

    muito penosas (Casciato, 2008). A descoberta de drogas que possam atuar

    seletivamente sobre células tumorais, levando-as a morte e que possam trazer

    poucos efeitos colaterais, interferindo o mínimo possível na qualidade de vida do

    paciente, são os objetivos das pesquisas que visam o desenvolvimento de novos

    fármacos antineopláscos.

    As caulibugulonas são biomoléculas de ocorrência natural, encontradas no

    Bryozoan marinho Caulibugula intermis. Esse animal vive a grandes profundidades

    no Oceano Índico, o que dificulta a obtenção dessas biomoléculas em quantidades

    suficientes para a realização de estudos farmacológicos (Milanowski et al., 2004). O

    grupo de pesquisa coordenado pelo Dr. Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda,

    pesquisador de química e síntese de produtos naturais e colaborador do grupo de

    pesquisa do Dr. Milton Masahiko Kanashiro, dispõe de uma rota de síntese inédita

    que permite a obtenção de grandes quantidades das caulibugulonas naturais A, C e

    D e mais nove análogos sintéticos.

    Dessa forma, a existência de quantidades suficientes das IQQ para a

    realização dos estudos farmacológicos, bem como das linhagens celulares

    cancerígenas justificaram a realização desse trabalho de pesquisa, embasado na

    avaliação da atividade antineoplásica dessas três IQQ naturais e nove IQQ

    sintéticas.

  • 22

    4. METODOLOGIA

    4.1. CULTURA DAS LINHAGENS CELULARES DE ORIGEM TUMORAL

    As células U937, MOLT4, H460 e COLO205 foram adquiridas da American

    Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas de acordo com seus respectivos

    protocolos. As células leucêmicas humanas de linhagem pró-monocítica U937 e de

    linhagem linfocítica MOLT4 foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Gibco, BRL). As

    células cancerígenas humanas de linhagens epitelióides pulmonar e de cólon

    intestinal, H460 e COLO205, respectivamente, foram cultivadas em meio de cultura

    RPMI (Gibco, BRL). Ambos os meios de cultura foram suplementados com 20ug/mL

    de gentamicina (Gibco, BRL) e 10% de soro fetal bovino (Gibco, BRL) e as culturas

    celulares foram mantidas em garrafas de cultura de 40mL em estufa (Forma

    Scientific Inc., modelo 3159) a 37º C, com 5% de CO2 e unidade controlada, com

    troca do meio de cultura ocorrendo a cada dois dias.

    4.2. CULTURA DE CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE

    PERIFÉRICO

    As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram

    obtidas a partir de 30mL de sangue de indivíduos saudáveis quanto a neoplasias

    malignas do sangue. A separação foi processada conforme a metodologia descrita

    por Bennett e Breit (1994) utilizando centrifugação em gradiente de FICOLL (GE,

    PM400). Em tubos cônicos de 50mL foram adicionados 7,5mL de FICOLL e em

    seguida, 15mL do sangue foi adicionado lentamente sobre o FICOLL. O material foi

    então centrifugado (Centrifuga Sorval, RT7) à 1500rpm por 40min a 20ºC e o anel de

    células mononucleares foram removidas e lavadas três vezes com meio de cultura

    DMEM/F12 gelado, sendo a lavagem processada por ciclos de 1500rpm por 10min,

    a 4ºC. Após as lavagens, as PBMC foram quantificadas e ressuspendidas em meio

    DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 20ug/mL de gentamicina e

    0,25ug/mL Enterotoxina B de Staphilococcus (SEB) (Sigma, S0812). Em seguida,

    foram plaqueadas em placas de culturas de células de 96 poços (TPP, 92096), onde

    foram distribuídos 100uL da cultura celular na concentração de 1,0x106células/mL.

  • 23

    4.3. QUANTIFICAÇÃO E AJUSTE DAS CULTURAS CELULARES

    A quantificação celular foi feita em câmara de Neubauer (Boeco) com

    coloração vital por Trypan Azul (Sigma, T6146) na concentração de 0,4mM. Uma

    alíquota das células de cada cultura foi quantificada e as células ressuspendidas em

    meio de cultura DMEM/F12 completo, de modo a obter-se a concentração final de

    1,0x106 células/mL de cultura.

    4.4. DILUIÇÃO E ARMAZENAMENTO DAS IQQ E DO LAPACHOL

    As IQQ sintetizadas no Laboratório de Ciências Químicas (LCQUI) da

    Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) sob coordenação

    do prof. Dr. Paulo César Muniz de Lacerda Miranda foram cedidas gentilmente para

    os testes, enquanto o lapachol (Sigma, 142905) foi adquirido da Sigma-Aldrich. As

    alíquotas, após pesagem, foram diluídas em 100µL de DMSO (Sigma, D1650) e

    armazenadas em freezer (Freezer Forma Scientific) à temperatura de -70ºC até o

    momento de montagem dos experimentos. Para a realização dos testes os

    compostos eram re-diluídos, desta vez em meio de cultura DMEM/F12

    suplementado, de modo a obter as seguintes concentrações: 8µg/mL, 4µg/mL,

    2µg/mL, 1µg/mL e 0,5µg/mL.

    4.5. TESTES DE VIABILIDADE CELULAR

    4.5.1. DETERMINAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE LACTATO DESIDROGENASE

    A determinação da taxa de liberação de lactato desidrogenase (LDH) foi feita

    segundo a metodologia descrita por Racher (1990). O volume de 100µL/poço das

    culturas de células tumorais na concentração de 1,0x106células/mL foi distribuído em

    placas de cultura com 96 poços, seguidos de mais 100µL/poço das IQQ diluídas no

    meio de cultura DMEM/F12 suplementado, nas concentrações de 8µg/mL, 4µg/mL,

    2µg/mL, 1µg/ml e 0,5µg/mL ou do lapachol, também solubilizado em meio

    DMEM/F12 e nas concentrações de 80µg/mL, 40µg/mL, 20µg/ml e 10µg/mL. Como

    controles negativos e positivos, as células foram incubadas somente no meio de

    cultura. Após 48 horas de incubação, foram acrescentados 10µL de uma solução de

    Triton 10X (Vetec, 777) aos poços do controle positivo de liberação de LDH ou

    negativos para a viabilidade celular por metabolização do MTT e em seguida, 50µL

    do sobrenadante de todas as culturas foi transferido para outra placa de 96 poços.

    Os 150µL restantes foram reservados para o ensaio metabólico do MTT. A

  • 24

    quantidade da enzima LDH foi mensurada pelo Kit Deidrogenase Láctica

    Colorimétrico, fabricado pela Doles. A densidade óptica das amostras foi medida em

    espectrofotômetro multicanal (Labsystems Multiskan) com comprimento de onda

    ajustado para 492ηm. A taxa de liberação de LDH foi calculada pela fórmula a

    seguir:

    TLLDH = ((MDOT – MDOCN) x 100) / (MDOCP – MDOCN)

    Onde:

    TLLDH = Taxa de Liberação de Lactato Desidrogenase

    MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste

    MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo

    MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo

    4.5.2. ENSAIO METABÓLICO DO MTT (3-(4,5-DIMETILTIAZOL-2-YL)-2,5-

    BROMETO DE DIFENILTETRAZOLIUM)

    O teste de viabilidade celular utilizando a metabolização do MTT (Sigma,

    M2128) foi feito de acordo com a metodologia de Mosmann (1983). Para os testes

    com as PBMC, processou-se o plaqueamento de 100µL das células com mais 100µL

    das IQQ e do lapachol em placas de cultura de 96 poços, de modo que a

    concentração final das isoquinolino quinonas fosse de 4µg/mL, 2µg/mL, 1µg/mL,

    0,5µg/mL e 0,25µg/ml e do lapachol de 40µg/mL, 20µg/mL, 10µg/mL e 5µg/mL. As

    PBMC foram submetidas ao tratamento por 48 horas e a seguir a viabilidade foi

    avaliada pelo teste de metabolização do MTT. Para as células de linhagens

    tumorais, utilizaram-se os 150µL das culturas reservados dos ensaios para a

    determinação de liberação da enzima Lactado Desidrogenase e a esses,

    acrescentados 15µL de uma solução de MTT em PBS na concentração de

    5,0mg/mL nas culturas de células tumorais e 20µL foi acrescentado às culturas de

    PBMC. Após 4 horas de incubação, foram retirados 100µL do sobrenadante das

    culturas de células tumorais e 150µL das culturas de PBMC e os cristais púrpuras

    precipitados de MTT foram solubilizados em 100µL de solução de isopropanol

    (Merck, 1009781000) com 0,0014% de HCl fumegante. Para separar o precipitado,

    as placas foram submetidas à centrifugação por 10min a 1500rpm e 100µL do

    sobrenadante foi transferido para outra placa de cultura de 96 poços e lida na

  • 25

    seqüência em espectrofotômetro multicanal com comprimento de onda ajustado para

    570ηm. A taxa de viabilidade celular foi calculada de acordo com a fórmula a abaixo:

    TVC = ((MDOT – MDOCN) x 100))/ (MDOCP – MDOCN)

    Onde:

    TVC = Taxa de Viabilidade Celular

    MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste

    MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo

    MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo

    4.6. TESTES DE INVESTIGAÇÃO DO TIPO DE MORTE CELULAR

    Para avaliação do tipo de morte celular induzida pelos tratamentos, às células

    tumorais foram submetidas aos tratamentos com as IQQ que demonstraram

    seletividade e mataram as células tumorais em concentrações menores que as

    necessárias para matar as células PBMC.

    4.6.1. AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR POR APOPTOSE EM CÉLULAS

    CORADAS COM LARANJA DE ACRIDINA E BROMETO DE ETÍDEO

    As células U937 foram submetidas ao tratamento com as IQQ nas

    concentrações finais de 4µg/mL, 2µg/mL, 1µg/ml, 0,5µg/mL e 0,25µg/mL e do

    lapachol de 40µg/mL, 20µg/mL, 10µg/mL e 5µg/mL e avaliadas por microscopia de

    fluorescência com coloração de laranja de acridina (5µg/mL, Sigma, A6529) e

    brometo de etídio (10µg/mL, Sigma E8751) nos tempos de 12, 24 e 48 horas de

    incubação. Como controles negativos, as células foram cultivadas apenas em meio

    de cultura DMEM/F12 completo, não sofrendo assim qualquer estimulo de morte.

    Para a coloração, 60µL das culturas de células foram corados com 10µL da solução

    de laranja de acridina e brometo de etídeo e em seguida, 10µL foram depositados

    em lâmina de microscópica e foram cobertos com uma lamínula para serem

    analisados no microscópio de fluorescência (Nikon Labophot), onde foram contadas

    300 células por lâmina e em campos aleatórios, com diferenciação entre células

    normais, apoptose e necrose de acordo com as características morfológicas. Foram

    obtidas micrografias das células tratadas com a caulibugulona A na concentração de

    4µg/mL, sendo capturadas no microscópio Zeiss Axioplan através do software

    Axiovision 4.6. As taxas de apoptose para cada experimento foram obtidas de

    acordo com o a seguinte fórmula:

  • 26

    TA = NCA x 100 / NCA + NCN + NCNM

    Onde:

    TA= Taxa de apoptose

    NCA= Número de células em apoptose

    NCN=Número de células em necrose

    NCNM=Número de células normais

    4.6.2. CITOMETRIA DE FLUXO PARA ANÁLISE DE FRAGMENTAÇÃO E

    LIBERAÇÃO DE DNA

    Para a quantificação de células em apoptose, foi utilizada a metodologia

    descrita por Gong (1994). As células U937, MOLT4, COLO205 foram submetidas ao

    tratamento com as IQQ pelo período de 48 horas e nas concentrações de 4µg/mL e

    do lapachol na concentração de 40µg/mL. Como controles negativos de indução de

    apoptose, as células foram cultivadas em meio de cultura DMEM/F12 ou RPMI

    completos. Após o período de incubação, as células foram lavadas em PBS e

    centrifugadas por 5min a 1500rpm. O pellet foi fixado com a adição lenta de etanol

    70% gelado, a -20ºC e sob agitação constante por vórtex. As células ficaram fixando

    por 30min a 4ºC. Depois de fixadas, as células foram sedimentadas com

    centrifugação a 1500rpm por 5min, sendo lavada com tampão de fosfato-citrato 0.2M

    e pH=7.8 Ao pellet foi acrescentado 50µL de RNAse A (100µg/mL Sigma, R4875) e

    incubado a temperatura ambiente por 15min. A seguir, foi adicionado de 400µL de

    iodeto de propidium (concentração final 50µg/mL; Sigma, P4170). As células foram

    avaliadas, então, para a marcação do conteúdo de DNA por PI, em citômetro FACS

    Calibur, sendo contados 10.000 eventos, por amostra. Os histogramas foram

    gerados através das analises dos resultados pelo software WinMDI versão 2.9.

    4.6.3. ELETROFORESE DO DNA DE BAIXO PESO MOLECULAR

    Os perfis do DNA encontrado no núcleo das células, após o tratamento de 48

    horas com as IQQ na concentração de 4µg/mL e do lapachol na concentração de

    40µg/mL por 48 horas, foi investigado por eletroforese em gel de agarose (Sigma,

    A9539), seguindo a metodologia proposta por Gong (1994). Para tanto, 2,0x106

    células U937, MOLT4 e COLO205 foram tratadas e em seguida, lavadas duas vezes

    em PBS, com centrifugação de 1500rpm por 10min. Após a segunda centrifugação,

    o PBS foi descartado e o pellet de células foi fixado com 1mL de etanol 70% gelado,

  • 27

    por 24 horas. Após a fixação, as células foram centrifugadas a 1500rpm por dez

    minutos e o etanol descartado. Para cada amostra foi acrescentada 50µL de tampão

    fosfato-citrato de concentração 0,2M e com PH=7,8. As células foram incubadas por

    30min a 37ºC e depois foi feita uma centrifugação a 1500rpm por 5min. Foi coletado

    em seguida, 40µL do sobrenadante, que foi transferido para outro ependorff estéril,

    onde foi acrescentado 5µL de RNAse A, na concentração de 1mg/mL. As amostras

    foram incubadas por mais 30 minutos a 37ºC e depois, foi acrescentado mais 5µL de

    proteinase K (Sigma, P8044) na concentração de 1mg/mL, e as amostras foram

    novamente incubadas por 30min a 37ºC. Por fim, 20µL de cada amostra foram

    recolhidos para o processamento da eletroforese. Os géis utilizados continham

    agarose na concentração de 1,0% e brometo de etídeo na concentração de 5µg/mL.

    As eletroforeses foram corridas em fontes BIO-RAD (164-5070), com voltagem de

    60V pelo período de 2 horas. Após, os géis foram registrados em câmara Gel Doc-

    XR+ BioRad, e analisadas com o software Image Lab.

    4.7. ANÁLISES ESTATÍSTICAS

    Os gráficos representam os valores médios e foram obtidos através do

    software Microsoft Excel 2007 aplicando-se das fórmulas descritas na metodologia e

    as barras representam os desvios padrões dos experimentos, que foram realizados

    em triplicata. Aos resultados obtidos foi aplicado o teste estatístico ANOVA e o pós-

    teste de Tukey, sendo empregado o software GraphPad Prism Versão 5.0 para gerar

    os dados. Os resultados de p

  • 28

    5. RESULTADOS

    5.1. VIABILIDADE E LIBERAÇÃO DE LDH DAS CULTURAS DE CÉLULAS

    TUMORAIS

    Os dados obtidos para o lapachol estão apresentados na Figura 7. Nessa

    figura podemos observar que as células U937 (Figura 7-A), MOLT4 (Figura 7-B) e

    COLO205 (Figura 7-C) foram sensíveis aos tratamentos com a maior concentração

    de lapachol testada, onde se observa uma baixa taxa de viabilidade celular. As

    células H460 (Figura 7-D) mostraram-se resistentes aos tratamentos, exibindo uma

    taxa de viabilidade celular superior a 40% quando tratadas com a maior

    concentração do lapachol, sendo a redução da taxa de viabilidade seguida por um

    aumento proporcional na taxa de liberação de LDH.

    Figura 7. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com lapachol. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com lapachol. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P

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    viabilidade da cultura foi inferior a 10%, ou seja, em torno de 90% das células

    morreram, porém, permaneceram com a membrana plasmática integra e não

    liberaram LDH. O fato dos tratamentos das células U937 (Figura 7-A) e MOLT4

    (Figura 7-B) apresentarem elevadas taxas de liberação de LDH pode ser explicado

    pela manutenção por muitas horas de células em apoptose em meio de cultura,

    onde não existem fagócitos para remover as células em apoptose, evoluindo assim

    para um processo de necrose secundária.

    Figura 8. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a caulibugulona A. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com a caulibugulona A. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P

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    viabilidade enquanto que nem todas as células liberaram LDH, o que se sugere um

    processo de morte por apoptose.

    Os resultados obtidos para as células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e

    H460 (D) tratadas com a caulibugulona C estão apresentados na Figura 9. Nessa

    figura observa-se que assim como o obtido para o lapachol, as células H460

    mostraram-se resistentes ao tratamento nas concentrações testadas. Novamente, a

    célula MOLT4 foi a mais sensível, apresentando ausência de viabilidade quando

    tratadas com a concentração de 2µg/mL, enquanto que as células U937 e COLO205

    obtiveram reduções significativamente grandes das viabilidades apenas na

    concentração máxima testada de 4µg/mL. Os tratamentos aplicados as células

    cancerígenas com essa caulibugulona são sugestivos de um processo de morte

    celular por apoptose, pois se observa que apesar da ausência (Figura 9-B) ou da

    elevada redução de viabilidade (Figuras 9-A e C), as taxas de liberação de LDH não

    foram proporcionais.

    Figura 9. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a caulibugulona C. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com caulibugulona C. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P

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    (Figura 10-B), COLO205 (Figura 10-C) e H460 (Figura 10-D) quando foram

    submetidas ao tratamento com a caulibugulona D pelo tempo de 48 horas. Essa

    caulibugulona foi muito efetiva, induzindo morte celular em todas as linhagens

    testadas, sendo a célula U937 a menos sensível, apresentando uma discreta

    viabilidade na concentração de 4µg/mL (Figura 10-A). Os resultados obtidos para as

    células U937 (Figura 10-A), COLO205 (Figura 10-C) e H460 (Figura 10-D) são

    sugestivos de morte celular por apoptose. Nesses testes, pode-se observar que

    apesar da redução da taxa de viabilidade celular na concentração de 4µg/mL, a

    liberação de LDH não indica uma proporcionalidade de células rompidas com a

    redução da viabilidade apresentada. Uma observação interessante quanto aos

    dados obtidos para a caulibugulona D é que diferente do lapachol e da

    caulibugulona C, as células H460 não mostraram resistência e apresentaram

    resultados sugestivos de indução de apoptose (Figura 10-D).

    Figura 10. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a caulibugulona D. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com caulibugulona D. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P

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    MOLT4, COLO205 e H460 (Figura 11). A linhagem celular mais sensível a essa IQQ

    foi a U937 (Figura 11-A), em que a viabilidade celular estava praticamente ausente

    na concentração de 0,5µg/mL, e com uma taxa de liberação de LDH não

    proporcional a redução da taxa de viabilidade. Estes resultados são sugestivos de

    morte celular por apoptose. As células MOLT4 (Figura 11-B), COLO205 (Figura 11-

    C) e H460 (Figura 11-D) também não resistiram ao tratamento, obtendo-se uma

    redução total ou quase total das taxas de viabilidades na concentração de 4µg/mL.

    Assim como o observado para as células U937 (Figura 11-A), as células COLO205

    (Figura 11-C) e H460 (Figura 11-D) também não apresentaram taxas de liberações

    de LDH compatíveis com a redução das taxas de viabilidade, sustentando a

    indicação de morte celular por apoptose.

    Figura 11. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-12. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-12. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P

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    U937 (Figura 12-A). Na Figura 12-A, referente ao tratamento aplicado as células

    U937, nota-se que apesar da taxa de viabilidade celular ser nula na concentração de

    4µg/mL, a taxa de liberação de LDH não é total, indicando que nem todas as c