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EFEITOS ANTINEOPLÁSICOS INDUZIDOS IN VITRO POR ISOQUINOLINO QUINONAS SINTÉTICAS EM LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS WILLIAM RODRIGUES DE FREITAS UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ FEVEREIRO DE 2011

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EFEITOS ANTINEOPLÁSICOS INDUZIDOS IN VITRO POR ISOQUINOLINO QUINONAS SINTÉTICAS EM LINHAGENS DE

CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS

WILLIAM RODRIGUES DE FREITAS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ FEVEREIRO DE 2011

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EFEITOS ANTINEOPLÁSICOS INDUZIDOS IN VITRO POR ISOQUINOLINO QUINONAS SINTÉTICAS EM LINHAGENS DE

CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS

WILLIAM RODRIGUES DE FREITAS

Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.

CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ

FEVEREIRO DE 2011

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“Dedico esta tese aos meus pais, sem os quais eu não teria condições de alcançar a realização deste feito”

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AGRADECIMENTOS

A Deus por tudo.

Aos meus familiares, que sempre me apoiaram e depositaram votos de confiança e

motivação.

Ao professor Dr. Milton M. Kanashiro, pela orientação e oportunidade de desenvolver

os trabalhos apresentados nesta dissertação.

A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e ao Centro de

Biociências e Biotecnologia, pela oportunidade de realização deste trabalho de

pesquisa.

Aos Professores Dr. Paulo Miranda e Dr. Almir Andreão, pelo fornecimento das IQQ

cedidas para os experimentos.

Aos amigos do Laboratório de Biologia do Reconhecer: Layla, Thatiana, Monique,

Maíra, Andreza, Marlon, Isabela, Sanderson, Eduardo, Fabrício, Giliane, Marcela,

Lívia, Flávia, David, Cláudia Letícia, Bruno, Sara, Poliana, Marcelle e Simone, pela

amizade que foi erguida durante o mestrado e que levaram a momentos de

companheirismo, sugestões e ajudas experimentais, conselhos, e troca de

informações.

Aos técnicos do LBR: Juliana, Rita, Fernando, Núbia, Flávia e Verônica, pela

dedicação aos trabalhos do laboratório que permitiram a manutenção das condições

necessárias para o desenvolvimento das pesquisas.

A CAPES e pela bolsa de demanda social que foi cedida.

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

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SUMÁRIO

TÍTULO PÁGINA

1. Introdução ................................................................................................. 1

1.1. Câncer .................................................................................................... 1

1.1.1. Epidemiologia ....................................................................................... 1

1.1.2. Conceitos ............................................................................................. 1

1.1.3. Classificação ........................................................................................ 2

1.1.3.1. Carcinomas ....................................................................................... 2

1.1.3.2. Sarcomas .......................................................................................... 3

1.1.3.3. Leucemias ......................................................................................... 4

1.2. Mecanismos de morte celular ................................................................. 4

1.2.1. Necrose ............................................................................................... 5

1.2.2. Apoptose .............................................................................................. 5

1.3. Tratamentos antineoplásicos ............................................................... 10

1.3.1. Radioterapia ...................................................................................... 11

1.3.2. Quimioterapia .................................................................................... 12

1.3.2.1. Alquilantes ....................................................................................... 13

1.3.2.2. Antimetabólicos ............................................................................... 13

1.3.2.3. Antibióticos ...................................................................................... 13

1.3.2.4. Inibidores Mitóticos ..........................................................................14

1.4. Quinonas ............................................................................................... 14

1.4.1. Lapachol ............................................................................................. 16

1.5. Isoquinolino quinonas – IQQ ................................................................ 17

2. Objetivos .................................................................................................. 20

2.1 Objetivo geral ......................................................................................... 20

2.2 Objetivos específicos.............................................................................. 20

3. Justificativa ............................................................................................... 21

4. Metodologia .............................................................................................. 22

4.1. Culturas da linhagem celulares de origem tumoral ............................... 22

4.2. Culturas de células mononucleares do sangue periférico .................... 22

4.3. Quantificação e ajuste das culturas celulares ...................................... 23

4.4. Diluição e armazenamento das IQQ e do lapachol ............................... 23

4.5. Testes de viabilidade celular ................................................................. 23

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4.5.1. Determinação da liberação de Lactato Desidrogenase (LDH) ........... 23

4.5.2. Ensaio Metabólico do MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-brometo de

difeniltetrazolium) ..........................................................................................24

4.6. Testes de investigação do tipo de morte celular ....................................25

4.6.1. Microscopia de Fluorescência com coloração de Laranja de Acridina e

Brometo de Etíde ..........................................................................................25

4.6.2. Citometria de fluxo para análise de fragmen. e liberação de dna .......26

4.6.3. Eletroforese do DNA de baixo peso molecular ...................................26

4.7. Análises Estatísticas ............................................................................. 27

5. Resultados ............................................................................................... 28

5.1. Viabilidade e liberação de LDH das culturas de células tumorais ........ 28

5.2. Viabilidade das PBMC tratadas com o lapachol e as IQQ .................... 40

5.3. Análises do tipo de morte celular induzido por IQQ e lapachol ............ 43

5.3.1. Microscopias de Fluorescência ......................................................... 43

5.3.2. Citometrias de fluxo para quantificação do DNA celular ................... 49

5.3.3. Eletroforese do DNA celula ............................................................... 52

6. Discussão ................................................................................................. 54

7. Conclusão ................................................................................................ 60

8. Referências bibliográficas ........................................................................ 61

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RESUMO

O crescimento no número de casos de câncer tem preocupado as autoridades

internacionais de saúde, já que se trata de uma enfermidade de difícil tratamento e

corresponde por 12% de todos os óbitos. Na busca por novas drogas para o

tratamento do câncer, foram testados nesta dissertação os efeitos antineoplásicos

induzidos in vitro por doze isoquinolino quinonas (IQQ), sendo três Caulibugulonas e

outros nove análogos sintéticos. Os resultados obtidos foram comparados com o do

lapachol e indicaram que nove IQQ foram efetoras e reduziram a viabilidade de

células tumorais quando tratadas por 48 horas. Dessas nove IQQ, quatro não foram

ativas na redução da viabilidade de PBMC, sugerindo um possível mecanismo de

ação seletivo também sobre células cancerígenas. O tipo de morte celular que as

IQQ induzem foi investigado através de cinética de tempo por microscopia de

fluorescência, sendo possível verificar que as células U937 mortas apresentavam

majoritariamente morfologia de apoptose. Pela técnica de citometria de fluxo com

marcação por PI foi confirmado que 78,29% das células U937 submetidas ao

tratamento com a Caulibugulona A por 48 horas estavam em apoptose,

apresentando DNA fragmentado em ladder e que foi facilmente extraído pelo

tampão de fosfato-citrato. As concentrações das IQQ utilizadas para a obtenção dos

efeitos antineoplásicos foram muito menores que as necessárias pelo lapachol para

obter os mesmos resultados. Os dados estatísticos de IC50 dos testes de viabilidade

mostram ser até 294 vezes menores para as IQQ quando comparados aos do

lapachol, demonstrando que estas substâncias são promissoras para a continuidade

dos estudos farmacológicos no contexto do câncer.

Palavras-chave: Caulibugulonas, Isoquinolino Quinonas, Antineoplásicos.

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ABSTRACT

The growth in the number of cases of cancer has been worrying the

international authorities of health, since it is an illness of difficult treatment and

correspond for 12% of all the deaths. In the search for new drugs for the treatment of

cancer, we tested in this work the antineoplastic effects induced in vitro for twelve

synthetic isoquinoline quinones (IQQ), being three Caulibugulones and other nine

similar. The obtained results were compared with the one of the lapachol and

indicated that nine IQQ was effective and reduced the viability of cancer cells when

treated for 48 hours and evaluated by MTT assay. Of those nine IQQ, four were not

capable to reduce the viability of PBMC cells, suggesting a selective action

mechanism on cancerous cells. The type of cellular death induced by IQQ was

evaluated by ethidium bromide/acridine orange cell stain and scored by fluorescence

microscope; by this method apoptosis was observed in U937 leukemia cell treated

with most of IQQ. The evaluation of apoptosis by flow cytometry in U937 cell treated

with Caulibugulone A for 48 hours and stained with PI confirmed that 78,29% of cells

were in apoptosis. Oligonucleossomal fragments of DNA was also observed in

agarose gel. The concentrations of IQQ used to induce apoptosis in all cell tested

was much smaller than the concentration used for the lapachol. The IC50 data

calculated for viability tests showed to be up to 294 smaller times for IQQ when

compared to the lapachol, demonstrating that these substances are promising for the

continuity of the pharmacology studies.

Keywords: Caulibugulones, Isoquinoline Quinones, Antineoplastic.

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x

LISTA DE FIGURAS

TÍTULO PÁGINA

Figura 1: Micrografias eletrônicas de células normais, apoptoses e necroses .......... 6

Figura 2. Vias de indução de apoptose ...................................................................... 8

Figura 3: Estruturas moleculares básicas: Orto-benzoquinona, Para-benzoquinona,

Quinona, Isoquinolina ............................................................................................... 15

Figura 4: Estruturas básicas dos medicamentos Quinoxalina, Quinaldina,

Quinazolina, Morfina, Prazosin ................................................................................. 16

Figura 5: Estrutura molecular do Lapachol ............................................................... 17

Figura 6. Estruturas moleculares das Isoquinolino quinonas - IQQ testadas ........... 19

Figura 7. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com lapachol ...................... 28

Figura 8. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a Caulibugulona A ...... 29

Figura 9. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a Caulibugulona C ...... 30

Figura 10. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a Caulibugulona D ...... 31

Figura 11. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-12 ........................ 32

Figura 12. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-18 ..................... 33

Figura 13. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-19 ........................ 34

Figura 14. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-21 ........................ 34

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Figura 15. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-22 ........................ 36

Figura 16. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-23 ........................ 37

Figura 17. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-24 ........................ 38

Figura 18. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-25 ........................ 39

Figura 19. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-26 ........................ 39

Figura 20. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT com PBMC. IQQ seletivas ............................................................................... 41

Figura 21. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de

MTT com PBMC. IQQ não seletivas ........................................................................ 42

Figura 22. Micrografias das microscopias de fluorescência de células U937 tratadas

com caulibugulona A ................................................................................................ 46

Figura 23. Citometrias de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular das

células U937 ............................................................................................................. 50

Figura 24. Citometrias de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular das

células MOLT4 ......................................................................................................... 51

Figura 25. Citometrias de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular das

células COLO205 ..................................................................................................... 52

Figura 26. Perfil do DNA extraído das células COLO205 (A), U937 (B) e MOLT4 (C)

tratadas com IQQ e lapachol por 48 horas ............................................................... 53

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xii

LISTA DE TABELAS

TÍTULO PÁGINA

Tabela 1: IC50 dos experimentos de metabolização do MTT das células tumorais e

PBMC tratadas com as IQQ e lapachol....................................................................40

Tabela 2. Cinética do tratamento de células U937 com o lapachol ........................ 45

Tabela 3. Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona A ............ 45

Tabela 4. Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona D ............ 47

Tabela 5. Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-24 .......................... 48

Tabela 6. Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-26 .......................... 48

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LISTA DE ABREVIATURAS

2N - Células em Diplóides

A1 - BCL2-Related Protein A1

ANOVA – Análise de Variância Entre Grupos

ANVISA – Agencia Nacional de Vigilância Sanitária

APAF-1 - Apoptosis Protease Activating Factor-1

APO-1 - Apoptosis Antigen-1

ATCC - American Type Culture Collection

ATP – Adenosina Tri-Fosfato

BAD - BCL2 Antagonist of Cell Death

BAX - BCL2 Associated X Protein

BCL-2 - B-Cell Lymphoma/Leukemia-2

BCL-W – BCL2-Related Protein W

Bcl-XL - B-Cell Lymphoma/Leukemia-2 Related Protein X Large

BID - Interacting Domain Death Agonist

CA – Caulibugulona A

Ca++ - Cátion de Cálcio

CCT – Centro de Ciência e Tecnologia

CD - Caulibugulona D

CD95 - Cluster of Differentiation

Cis - Quando os Ligantes de Maior Massa Situam-se do Mesmo Lado da Molécula

CO2 – Dióxido de Carbono

COLO205 – Linhagem de Adenocarcinoma de Cólon Humano

CTL - Controle,

D-MEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12

DMSO – Dimetilsulfóxido

DNA – Ácido Desoxirribonucléico

DNAse - Desoxirribunuclease

Fase G1 – Fase de Gap 1

Fase G2 – Fase de Gap 2

Fase M – Fase de Mitose

Fase S – Fase de Síntese

H460 – Linhagem de Câncer de Pulmão Humano de Células Grandes

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xiv

HCl – Ácido Clorídrico

HTLV-I - Vírus Linfotrópico dos Linfócitos T Humanos Tipo I

I24 – Isoquinolino Quinona 24

I26 – Isoquinolino Quinona 26

IC50 - Concentração Necessária Para Matar 50% das Células

IQQ - Isoquinolino Quinonas

LAP - Lapachol

LCQUI – Laboratório de Ciências Químicas

LDH - Lactato Desidrogenase

MAPK p38 - Mitogen-Activated Protein Kinases p38

Mcl-1 - Myeloid Cell Leukemia Sequence 1

MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo

MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo

MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo

MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo

MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste

MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste

min - Minuto

mL - Mililitro

MOLT4 - Human Acute Lymphoblastic Leukemia Cell Line 4

MTT - (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-brometo de difeniltetrazolium)

NAD - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo

NADH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzida

NCA= Número de Células em Apoptose

NCN=Número de Células em Necrose

NCNM=Número de Células Normais

ºC – Graus Celsius

OMS – Organização Mundial de Saúde

pb – Par de Base

PBMC – Células Mononucleares do Sangue Periférico

PBS - Phosphate Buffered Saline

pH – Potencial Hidrogeniônico

PI – Iodeto de Propidio

RNA – Acido Ribonucléico

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xv

RNAse A – Ribonuclease A

rpm – Rotações por Minuto

RPMI - Roswell Park Memorial Institute medium

SEB - Enterotoxina B de Staphilococcus

Sub-G1 – Sub Gap 1

TA - Taxa de Apoptose

TLLDH = Taxa de Liberação de Lactato Desidrogenase

TNF – Fator de Necrose Tumoral

Trans - Quando os Ligantes de Maior Massa Não se Situam do Mesmo Lado da

Molécula

TVC - Taxa de Viabilidade Celular

U937 – Linhagem Celular Humana Estabelecida de um Linfoma Histiocítico

ug – Micrograma

VM-26 - Teniposídeo

VP-l6 - Etoposídeo

ηm - Nanometro

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1

1. INTRODUÇÃO

1.1. CÂNCER

1.1.1. EPIDEMIOLOGIA

O câncer é uma doença crônica de importante repercussão na saúde pública

mundial. Levantamentos realizados pela organização mundial de saúde apontam

que no ano de 2008 foram registrados 12.662.554 casos novos de câncer, excluindo

os cânceres de pele não melanoma, com a ocorrência de 7.564.802 (WHO, 2008).

Os órgãos internacionais de pesquisa e levantamentos do câncer estimam a

incidência de novos casos de câncer com base no método proposto por Black et al.,

(1997). Esse método permite estimar a taxa de incidência de câncer para uma

determinada região, multiplicando-se a taxa observada de mortalidade da região

pela razão entre os valores de incidência e mortalidade da localidade, e assim,

traçam estratégias para o combate ao câncer. Usando-se dessa metodologia, a

Sociedade de Câncer Norte Americana projetou para os Estados Unidos 1.529.560

casos novos de câncer para o ano de 2010, com 569.490 registros de mortes, ou

seja, uma em cada quatros mortes nos USA devem-se ao câncer. Estes valores,

quando comparados aos obtidos por ano no período entre 2000 e 2006, são 1,3%

menores para homens e 0,5% menores para as mulheres. Mesmo assim, o câncer

responde por mais mortes do que as doenças coronarianas, em pessoas com idades

inferiores á 85 anos (Ahmedin, 2010). No Brasil, o processo de industrialização pela

qual o país passou após 1980 levou a um aumento no número de casos de câncer.

A isso, deve a uniformização das condições de trabalho, nutrição e consumo da

população mundial, bem como o aumento da expectativa de vida (Cervi, 2005).

Dados brasileiros do Instituto Nacional do Câncer apontam a incidência de 489.270

casos novos de câncer no ano de 2010, sendo os tipos mais incidentes, à exceção

do câncer de pele do tipo não melanoma, os cânceres de próstata e de pulmão no

sexo masculino e os cânceres de mama e do colo do útero no sexo feminino (INCA,

2009).

1.1.2. CONCEITOS

No âmbito da patologia, o câncer compreende mais de 100 doenças

caracterizadas por uma proliferação desordenada de células malignas, ou seja, que

apresentam alterações genéticas que lhes conferem a capacidade de proliferar

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2

desordenadamente e invadir outros tecidos e órgãos. As células cancerígenas são

próprias do organismo, porém, as alterações genéticas pelas quais passaram,

resultam na perda da funcionalidade e assim, tais células prejudicam o

funcionamento normal do organismo. Dentre as várias características das células

cancerígenas, podemos citar a pouca diferenciação e a capacidade de proliferação

rápida (Kumar et al., 2005).

Devido a sua baixa diferenciação, as células cancerígenas migram para

diversos órgãos, sendo esse o fenômeno das metástases, que é caracterizado pela

disseminação das células tumorais malignas para sítios diferentes dos que lhes

deram origem (Kumar et al., 2005; Bacac e Stamenkovic, 2008).

Quando um tumor apresenta células que proliferam lentamente e possuem

alto grau de diferenciação, esses tumores não são considerados cânceres, sendo

denominados de tumores benignos, que raramente trazem riscos a saúde e por

apresentarem uma localização bem delimitada, podem ser removidos por excisão

cirúrgica sem haver recorrência (Domingo et al., 2008). Por outro lado, as

metástases são os principais entraves dos tumores malignos, pois as células

colonizam outros órgãos e com isto, as recidivas são freqüentes (Gavrilovic e

Darzynkiewicz, 2005; Bacac e Stamenkovic, 2008).

Os diferentes tipos de câncer advêm da grande variedade de células

existentes no corpo. Assim, para cada tipo de célula do organismo poderia ter um

tipo de câncer, bastando para tanto, que essa sofra mutações que venham a conferir

agressividade e malignidade (Kumar et al., 2005).

Os cânceres se classificam em três grupos: os de mucosas e células epiteliais

são denominados carcinomas, os de tecidos conjuntivos, como ossos, músculos ou

cartilagens são os sarcomas e o terceiro grupo de cânceres são os de tecido

sanguíneo, conhecidos como leucemias (Kumar et al., 2005).

1.1.3. CLASSIFICAÇÃO

1.1.3.1. CARCINOMAS

Os carcinomas de pele apresentam maior distribuição na população de pele

clara. Estima-se que mais de 50% das pessoas de pele branca com mais de 60 anos

de idade apresentam algum carcinoma de pele e que nessa população, os cânceres

de pele são muito mais freqüentes que em outras. Além disso, os carcinomas de

pele apresentam distribuição mundial, variando pouco dentre os grupos étnicos

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3

(From et al., 2007). Em estudo retrospectivo com 545 pacientes acometidos por

carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular e melanoma atendidos no hospital

da faculdade de medicina do ABC, em São Paulo, Brasil, demonstrou-se uma maior

prevalência de câncer de pele entre mulheres (62,9%) e quanto aos grupos étnicos,

98,2% dos pacientes eram de pele branca, confirmando os achados mundiais e

relatados pela OMS. Quanto à distribuição do tipo de câncer de pele nestes

pacientes, foi encontrada a maior prevalência para o carcinoma basocelular e a de

menor freqüência foi para o melanoma (Machado-Filho et al., 1996).

Em relação aos cânceres de mucosa, segundo a organização mundial de

saúde, os mais freqüentes são: câncer de pulmão, cólon, reto e estômago. No Brasil,

dentre os sexos a maior prevalência entre os homens fica a cargo do câncer de

próstata, seguido pelos de pulmão, estômago, cólon, reto e esôfago. Já entre as

mulheres, a maior prevalência observada é para os cânceres de mama, colo uterino,

cólon, reto e estômago (Guerra et al., 2005).

1.1.3.2. SARCOMAS

Os sarcomas são tumores raros de tecidos conjuntivos e são subdivididos em

sarcomas de tecidos ósseos e sarcomas de partes moles. Os sarcomas ósseos

(osteossarcomas) acometem principalmente os ossos dos braços e das pernas

(Lacerda, 2007). São formados pelo crescimento desordenado das células

mesenquimais que formam os tecidos ósseos, dando origem a massas tumorais. Os

tumores de partes moles acometem os vasos sanguíneos e linfáticos, os músculos,

os tecidos fibrosos e adiposos, o tecido de suporte aos epitélios e o tecido nervoso

periférico (Coindre, 2006), e assim como os osteossarcomas, advêm da proliferação

de células mesenquimais dos tecidos conjuntivos (Kumar et al., 2005; Coindre,

2006). Os sarcomas acometem principalmente as crianças e adultos jovens, com

pico em torno dos 15 anos de idade. No Brasil, a freqüência de distribuição dos

sarcomas é de 2,8 casos para cada grupo de 100.000 crianças e adolescentes. A

principal forma de tratamento consiste na quimioterapia e com suporte, admite-se a

radioterapia e a cirurgia para excisão das massas tumorais (Lacerda, 2007; Coindre,

2006).

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1.1.3.3. LEUCEMIAS

As leucemias são cânceres das células do sangue. Sua origem consiste de

alterações genéticas nas células das linhagens eritrocitárias, leucocitárias e

plaquetárias, ainda na medula óssea. As células tumorais das leucemias apresentam

como sítio inicial de proliferação a medula óssea, e em estágios avançados da

doença, as células passam a proliferar também no sangue (Vicent, 1990; Kumar et

al., 2005). A parte majoritária das leucemias é constituída de células das linhagens

leucocitárias (Leal e Wunsch, 2002) e os fatores que predispõem ao

desenvolvimento das leucemias são os mesmos para os outros tipos de câncer,

basicamente radiações ionizantes, agentes químicos, como benzeno, e agentes

virais. Dentre os agentes virais, ressalta-se o vírus linfotrópico dos linfócitos T

humanos tipo I (HTLV-I), que está implicado na maioria dos casos de leucemia de

células T do adulto. Alguns tipos de alterações genéticas também têm sido

descobertas como possíveis causas de leucemias (Bernard, 2010).

Existem quatro tipos principais de leucemia leucocitária, e sua classificação

considera a rapidez de sua evolução e o tipo de leucócito afetado. As leucemias

agudas evoluem rapidamente enquanto que as leucemias crônicas evoluem

lentamente. Quanto ao tipo celular, as leucemias linfocíticas afetam os linfócitos

enquanto que as leucemias mielocíticas afetam os mielócitos, precursores dos

neutrófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos. Assim, existem quatro tipos básicos

de leucemias leucocitárias: leucemias mielócíticas agudas, leucemias mielocíticas

crônicas, leucemias linfocíticas agudas e as leucemias linfocíticas crônicas (Kumar

et al., 2005; Leal e Wunsch, 2002).

1.2. MECANISMOS DE MORTE CELULAR

Os mecanismos de morte celular são divididos em morte autofágica, necrose

e apoptose. Estímulos de injúrias sofridas pelas células desencadeiam reações que

as levam a perda da estrutura celular necessária para a manutenção da vida. Esses

estímulos podem ser internos ou externos. Dentre os estímulos externos pode ser

citado o calor, que em excesso promove a perda da integridade da membrana

plasmática e a célula se rompe. Um exemplo de extímulo interno é a perda da

integridade mitocôndrial, o que leva a liberação de mediadores pró-apotóticos e

desencadeiam o processo de apoptose. Na morte autofágica, um processo ainda

não muito bem entendido, as células passam a destruir suas próprias organelas,

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levando a falência funcional e a ativação de caspases, deflagrando o estímulo de

morte (Alberts et al., 2009).

1.2.1. NECROSE

A necrose é o mecanismo pelo qual as células morrem de modo não-

fisiológico, promovendo lesões tissulares e sintomatologia de várias doenças. A

morte é patológica ou "acidental" quando a célula é impedida de manter seus

processos vitais por lesões físicas ou químicas causadas por fatores externos, como

temperaturas extremas, radiação, traumas, produtos tóxicos e falta de oxigênio que

ocorre no infarto do miocárdio e na gangrena (Alberts et al., 2009; Kanduc et al.,

2002). As lesões podem ter ainda origem biológica, como nas infecções por

bactérias ou vírus. Esse tipo de morte celular foi o único conhecido pelos cientistas

mais antigos e é morfologicamente caracterizado por um inchaço celular e de

organelas do citoplasma, em particular as mitocôndrias, as quais são danificadas,

mas o núcleo não sofre alterações significativas. Tais lesões impedem o controle do

equilíbrio interno exercido pela água e alguns íons (em especial sódio e cálcio),

normalmente bombeados para fora, que passam a fluir livremente para dentro da

célula, que incha e se rompe. A ruptura libera, no próprio tecido, o conteúdo celular

que é rico em proteases e outras substâncias tóxicas, que atraem células do sistema

imune causando intensa reação inflamatória. Alguns tipos de glóbulos brancos

convergem para o tecido em necrose e fagocitam as células mortas. A inflamação,

típica da necrose, é importante para limitar infecções e remover restos de células,

mas a atividade e as secreções dos glóbulos brancos podem também danificar

tecidos normais vizinhos, às vezes de maneira devastadora (Kanduc et al., 2002).

1.2.2. APOPTOSE

A apoptose é um tipo de "auto-destruição celular" que ocorre de forma

ordenada e demanda energia para a sua execução (diferentemente da necrose).

Está relacionada com a manutenção da homeostase e com a regulação fisiológica

do tamanho dos tecidos, mas pode também ser causada por um estímulo patológico

(como a lesão ao DNA celular). A apoptose é um processo com gasto energético,

marcado pela autodigestão controlada dos constituintes celulares, devido à ativação

de proteases endógenas e pode ser comparada metaforicamente a um "suicídio

celular" (Alberts et al., 2009; Elmore, 2007). A ativação dessas proteases

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compromete a integridade do citoesqueleto, levando a perda na estrutura do

arcabouço celular. Em resposta à contração do volume citoplasmático, a membrana

celular forma bolhas e altera o posicionamento de seus lipídios constituintes, como

ocorre com a fosfatidilserina, que em células normais está presente na camada

interna de lipídios da membrana e nas células em apoptose apresenta-se na

camada externa, servindo como sinalizador para que células fagocíticas das

proximidades englobem os fragmentos celulares e completem o processo de

degradação. Durante a apoptose ocorrem alterações características no núcleo

celular graças à ativação de endonucleases que degradam o DNA. Como resultado,

o núcleo torna-se picnótico e a cromatina se condensa nas porções adjacentes à

membrana nuclear. Finalmente, o núcleo entra em colapso e se fragmenta (Figura

1-D).

Figura 1: Micrografias eletrônicas de células THP1 estimuladas para apoptose com uma droga de coordenação de cobre. A e B - Célula Normal: Núcleo volumoso (N), com presença de Mitocôndrias (M) e Retículo Endoplasmático Rugoso (RE). C – Célula em apoptose, com cromatina condensada (CD) e ausência de mitocôndrias e Retículo Endoplasmático Rugoso. D - Célula em apoptose: Célula picnótica, com núcleo compactado e cromatina condensada (CD). (BORGES, 2009).

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Simultaneamente, as bolhas que se formam no citoplasma separam a célula

em fragmentos circundados por membrana, contendo partes do núcleo e organelas

intactas (corpos apoptóticos). Os restos celulares são fagocitados pelos macrófagos

teciduais ou células adjacentes (Elmore, 2007).

A apoptose pode ser deflagrada por estímulos externos através de receptores

específicos na superfície celular chamados receptores de morte ou por estímulos

internos de estresse intracelular, tais como lesão do DNA ou perturbações no ciclo

celular ou nas vias metabólicas, conforme pode ser observado na Figura 2. Essas

diferentes vias culminam com a ativação de proteases conhecidas como caspases,

que possuem um papel fundamental neste tipo de morte celular. As caspases estão

presentes no citoplasma e já foram descritas em mamíferos 14 membros da família

que estão envolvidos no processo de inflamação e apoptose (Elmore, 2007).

Quando ativadas, as caspases ativam outros membros da família e

amplificam a cascata proteolítica. Alguns membros, tais como a caspase-8, ocupam

posição proximal na cascata e agem como reguladores e iniciadores, enquanto

outros como a caspase-3 são mais distais e agem como efetores da fragmentação

celular. Contrariamente às proteases armazenadas nos lisossomos ou ativadas no

citoplasma por íons como o cálcio, que têm espectro amplo de substratos

inespecíficos, as caspases têm substratos bem restritos, o que lhes asseguram

maior seletividade e especificidade no processo de proteólise. Tais substratos

incluem proteínas envolvidas no reparo de danos e na replicação do DNA, na

sinalização de transdução e na manutenção da integridade da estrutura celular

(Elmore, 2007; Alberts et al., 2009).

A ação sobre seus substratos promove a desestruturação do citoesqueleto e

do núcleo, levando a célula à morte. Um dos mecanismos que pode iniciar o

processo de apoptose é a ativação dos receptores de morte presentes na superfície

celular quando ligantes específicos se acoplam a essa. A maior parte dos receptores

de morte identificados é da família de receptores do TNF e são classificados assim

pela presença na porção extracelular rica em cisteína ("domínios de morte") que

transmite o sinal de morte para o meio intracelular. Entre esses receptores, um dos

mais estudados e melhor caracterizados é o receptor FAS (CD95 ou APO-1).

Quando o ligante-FAS se acopla ao receptor FAS, as moléculas individuais do

receptor se trimerizam formando agregado de cadeias da morte que se ligam a uma

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proteína adaptadora presente no citosol, chamada cadeia da morte associada ao

FAS, que por sua vez se liga à pro-caspase-8 resultando na ativação dessa enzima

que atua como proteolítica ativando a caspase-3 (Tatsuya et al., 2001; Elmore,

2007).

Figura 2. Vias de indução de apoptose (Adaptado de GUPTA, 2006).

Citocinas inflamatórias, tais como a interleucina-1, ou a presença de estresse

oxidativo, que resulta na lesão de DNA e ativação da p53, podem aumentar a

expressão dos receptores-FAS, tornando as células mais suscetíveis a apoptose

pelo sistema FAS. Simultaneamente, o estresse oxidativo aumenta a expressão do

ligante-FAS, o que pode levar o processo conhecido como "fratricídio", no qual

células adjacentes podem destruir umas as outras pela indução de apoptose. Além

dos receptores de morte, a apoptose pode também ser deflagrada por sinais de

estresse intracelular que resultem em disfunção mitocondrial, tais como lesão do

DNA (via gene p53), alterações nas vias metabólicas, drogas, toxinas ou privação

dos fatores de crescimento (Figura 2). Na presença de sinais de estresse

intracelular ocorre a translocação das proteínas BAX e BID do citosol para a

mitocôndria. Essas proteínas são membros da família de proteínas BCL-2 que

exercem importante função reguladora de apoptose. A translocação das proteínas

pró-apoptóticas para a mitocôndria resulta na liberação para o citosol do citocromo-c,

presente no espaço existente entre a membrana mitocondrial externa e interna. No

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citoplasma, o citocromo-c forma um complexo com o APAF-1, levando à ativação da

caspase-9, que ativa as caspases efetoras (Kanduc et al., 2002; Elmore, 2007).

Alguns genes têm sido identificados como capazes de influenciar o processo

de apoptose. Entre eles destacam-se os da família das proteínas BCL-2, que

desempenham papel importante na regulação de apoptose por vias fisiológicas ou

patológicas. Dos 15 membros já identificados, alguns como BCL-2 e BCL-XL, BCL-

W, MCL-1 e A1 são anti-apoptóticos, enquanto outros, tais como BAX, BAD e BID

são pró-apoptóticos (Harrison e Wunsch, 2006). Estas proteínas se distribuem por

várias partes da célula, como na membrana externa da mitocôndria, na membrana

nuclear e no retículo endoplasmático rugoso. Na mitocôndria, distribuem-se

focalmente, nos locais de contato entre a membrana interna e externa. Três funções

têm sido descritas para essas proteínas: dimerização, atividade formadora de poro

ou canal de íons e ligação a outras proteínas. Os principais antagonistas da

apoptose, BCL-2 e BCL-XL, localizam-se, principalmente, na membrana mitocondrial

e recentemente, demonstrou-se que a BCL-2 bloqueia a penetração nuclear de

perforina e granzima, substâncias liberadas pelos linfócitos T citotóxicos contra seus

alvos e que podem ser ativadoras de caspases (Mignotte e Vayssiere, 2001;

Morgan, 1997). Os membros pró-apoptóticos da família BCL-2 são normalmente

encontrados no citosol e quando ativados, se deslocam para a mitocôndria,

alterando a permeabilidade da membrana dessa organela e permitindo a liberação

de proteínas pró-apoptóticas, tais como o citocromo-c, o fator indutor da apoptose,

DNAse e pró-caspases 2 e 9 (Figura 2). A mitocôndria participa da manutenção de

funções celulares vitais, tais como respiração celular e síntese de ATP, modulação

do estado redox da célula, regulação osmótica, controle do pH, homeostasia do

cálcio no citosol e sinalização intracelular. Paradoxalmente, a mitocôndria guarda no

espaço intermembranoso substâncias letais, capazes de deflagrar o processo de

morte celular, entre as quais figura o citocromo-c. Quando liberado da mitocôndria, o

citocromo-c se associa a duas proteínas presentes no citosol, a APAF-1 e a pró-

caspase-9, e na presença de ATP ativa a caspase-9 que por sua vez, ativa as pró-

caspases-3 e 7, que executam o processo de apoptose. A caspase-3 pode amplificar

a cascata de proteólise pela ativação da caspase-8 e pela clivagem da proteína anti-

apoptótica BCL-2 que, normalmente, garante a integridade da membrana

mitocondrial. A caspase-8 ativada cliva a proteína pró-apoptótica BID presente no

citosol, gerando um fragmento que se liga à mitocôndria, permeabilizando as suas

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membranas. Lesões do DNA celular ativam o gene p53 que favorece maior

expressão da proteína pró-apoptótica BAX que promove a abertura de poros na

membrana mitocondrial (Mignotte e Vayssiere, 2001, Mayer e Oberbauer, 2003).

A membrana mitocondrial interna, por apresentar várias pregas, pode

acomodar o aumento do volume da matriz, enquanto a membrana externa, que é

esférica, se rompe, liberando componentes pró-apoptóticos, como o fator indutor da

apoptose e o citocromo-c. A abertura de poros de permeabilidade na membrana

mitocondrial causa, simultaneamente, ativação das caspases e queda da síntese de

ATP que irá orientar a morte celular, seja por apoptose, seja por necrose. A disputa

pode ser vencida pelas caspases quando estas são diretamente ativadas pelos

receptores da superfície celular ou granzima B, processo que ocorre quando

algumas mitocôndrias continuam a funcionar enquanto outras liberam os mediadores

pró-apoptóticos, circunstância esta em que as células entram em apoptose. Por

outro lado, se o poro de permeabilidade é aberto rapidamente e a célula não pode

obter energia suficiente a partir da glicólise anaeróbia, a depleção do ATP impede

que a apoptose se inicie e a célula morre por necrose (Mayer e Oberbauer, 2003;

Wang, 2001).

1.3. TRATAMENTOS ANTINEOPLÁSICOS

Os tratamentos aplicados aos pacientes com câncer visam sempre à

destruição das células tumorais. Como as células tumorais são próprias do

organismo, células normais do paciente também ficam suscetíveis a ação dos

fármacos. Buscando peculiaridades existentes entre as células tumorais e normais,

têm-se percebido que as primeiras proliferam-se muito mais rápido que as

segundas, sendo o ciclo celular o principal alvo de tratamento e combate as células

tumorais (Brasileiro-Filho, 2006; Casciato, 2008).

Os tecidos humanos normais que proliferam rapidamente, como as mucosas

e os anexos epidérmicos, passam a sofrer com as terapias aplicadas. Dentre as

terapias, existem as que utilizam feixes de radiação para promoverem a morte das

células tumorais (radioterapia) e as quimioterapias, onde são administrados

fármacos que interferem no funcionamento normal das células, impedindo sua

replicação e levando-as a morte (Casciato, 2006; Kumar et al., 2005; Brasileiro-Filho,

2006).

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1.3.1. RADIOTERAPIA

Os principais tratamentos antineoplásicos têm por objetivo induzir a morte das

células cancerígenas por apoptose, evitando processos inflamatórios indesejáveis

advindos da necrose (Vermeulen e Ermeman, 2003; Kumar et al., 2005). A premissa

desse sucesso parte do princípio de que a grande maioria das células tumorais

apresenta danos em seu DNA, o que as tornam mais sensíveis a agentes externos,

como a radioterapia e a quimioterapia (Casciato, 2008; Lowe e Lin, 2000). Na

radioterapia, um feixe de radiação ionizante é regulado para incidir sobre uma região

pré-estabelecida em que se encontram as células cancerígenas. A quantidade de

radiação a ser empregada depende do tipo tumoral e do tecido em que irá incidir,

pois as células do organismo apresentam sensibilidades diferentes à radiação. O

sucesso desta terapia é obtido quando todas as células tumorais são erradicadas

(Janneke et al., 2010).

A radioterapia pode ser utilizada também como suporte a quimioterapia ou a

cirurgia para excisão da massa tumoral (Janneke et al., 2010). O princípio de ação

da radioterapia está relacionada às ondas eletromagnéticas aplicadas aos tecidos

que possuem grande quantidade de energia, promovendo a ionização de moléculas

intracelulares, como a água e as cadeias de DNA (Lowe e Lin, 2000). Um efeito

importante da radiação, de relevância clínica para a radioterapia, é a indução da

morte celular por falência reprodutiva ou morte clonogênica, que se caracteriza pela

perda da capacidade de divisão celular. Neste caso, a célula irradiada permanece

morfologicamente íntegra, às vezes conseguindo até processar algumas divisões,

mas perde a capacidade de se dividir por inúmeras vezes e morre. Considerando o

ciclo celular, a fase de divisão celular ou mitose (M) é extremamente sensível à

radiação, pois existe grande possibilidade de que os danos provocados pela

radiação fiquem permanentemente no DNA, provocando aberrações cromossômicas

e morte celular (Jones, 2001; Ross, 1999). Isso acontece devido à grande

compactação da cromatina durante a mitose tornando as lesões inacessíveis às

enzimas reparadoras. Quando os danos sofridos pelo DNA são percebidos e o

sistema de reparo não os consegue recuperar, é deflagrado um sinal de morte

celular que culmina em apoptose, pela ativação de caspases (Alberts et al., 2009).

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1.3.2. QUIMIOTERAPIA

O primeiro quimioterápico antineoplásico foi desenvolvido a partir do gás

mostarda, usado nas duas Guerras Mundiais como arma química. Após a exposição

de soldados a este agente, observou-se que eles desenvolveram hipoplasia medular

e linfóide, o que levou ao seu uso no tratamento dos linfomas malignos (Fuchs e

Wannmacher, 2010). A partir da publicação, em 1946, dos estudos clínicos feitos

com o gás mostarda e das observações sobre os efeitos do ácido fólico em crianças

com leucemias, verificou-se um avanço crescente no combate ao câncer. O

conhecimento acerca do funcionamento da maquinaria celular abriu um leque de

opções a serem exploradas para a busca de novas drogas antineoplásicas. A

maioria dos agentes utilizados atualmente no tratamento do câncer afetam

diretamente o DNA celular, promovendo danos tanto as células normais como as

neoplásicas, porém, acarretam maior dano às células malignas do que às dos

tecidos normais, devido às diferenças quantitativas entre os processos metabólicos e

ao ciclo de divisões celulares dessas duas populações celulares (Leen et al., 2005).

Por esses motivos a quimioterapia obtém sucesso no tratamento do câncer.

A maioria das drogas utilizadas na quimioterapia antineoplásica interfere de

algum modo nesses mecanismos celulares, e a melhor compreensão do ciclo celular

normal levou à definição clara dos mecanismos de ação da maioria das drogas. Foi

a partir dessa definição que Bruce em 1969 classificou os quimioterápicos conforme

sua atuação sobre o ciclo celular:

• Ciclo-inespecíficos - Aqueles que atuam nas células que estão ou não no

ciclo proliferativo, como, por exemplo, a mostarda nitrogenada.

• Ciclo-específicos - Os quimioterápicos que atuam somente nas células que

se encontram em proliferação, como é o caso da ciclofosfamida.

• Fase-específicos - Aqueles que atuam em determinadas fases do ciclo

celular, como, por exemplo, o metotrexato (fase S), o etoposídeo (fase G2) e a

vincristina (fase M).

Os agentes antineoplásicos mais empregados no tratamento do câncer

incluem os alquilantes polifuncionais, os antimetabólitos, os antibióticos

antineoplásicos e os inibidores mitóticos (Fuchs e Wannmacher, 2010). Novas

drogas estão sendo permanentemente isoladas e aplicadas experimentalmente em

modelos animais antes de serem usadas no homem (Casciato, 2008).

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1.3.2.1. ALQUILANTES

Os compostos alquilantes são capazes de substituir em outra molécula um

átomo de hidrogênio por um radical alquil. Eles se ligam ao DNA de modo a impedir

a separação dos dois filamentos do DNA de dupla fita espiralar, fenômeno este

indispensável para a replicação. Os alquilantes afetam as células em todas as fases

do ciclo celular de modo inespecífico (Kostova, 2006). Apesar de efetivos como

agentes isolados para inúmeras formas de câncer, raramente produzem efeito

clínico ótimo sem a combinação com agentes fase-específicos do ciclo celular. As

principais drogas empregadas dessa categoria incluem a mostarda nitrogenada, a

mostarda fenil-alanina, a ciclofosfamida, o bussulfam, as nitrosuréias, a cisplatina e o

seu análago carboplatina, e a ifosfamida (Bruce e Lin, 1969; Almeida, 2005).

1.3.2.2. ANTIMETABÓLICOS

Os antimetabólicos afetam as células inibindo a biossíntese dos componentes

essenciais do DNA e do RNA. Deste modo, impedem a multiplicação e função

normais da célula (Fuchs e Wannmacher, 2010). Esta inibição da biossíntese pode

ser dirigida às purinas (como é a ação dos quimioterápicos 6-mercaptopurina e 6-

tioguanina), à produção de ácido timidílico (5-fluoruracil e metotrexato) e à outras

etapas da síntese de ácidos nucléicos (citosina-arabinosídeo C) (Almeida, 2005).

Essas drogas são particularmente ativas contra células que se encontram na fase de

síntese do ciclo celular (fase S). A duração da vida das células tumorais suscetíveis

determina a média de destruição dessas células, as quais são impedidas de entrar

em mitose pela ação dos agentes metabólicos que atuam na fase S (Fuchs e

Wannmacher, 2010).

1.3.2.3. ANTIBIÓTICOS

Os antibióticos antineoplásicos formam um grupo de substâncias com

estrutura química variada que, embora interajam com o DNA e inibam a síntese

deste ácido ou de proteínas, não atuam especificamente sobre uma determinada

fase do ciclo celular (Fuchs e Wannmacher, 2010). Apesar de apresentarem tal

variação, possuem em comum a presença de anéis insaturados que permitem a

incorporação de excesso de elétrons e a conseqüente produção de radicais livres

reativos. Podem apresentar outro grupo funcional que lhes acrescentam novos

mecanismos de ação, como alquilação (mitomicina C), inibição enzimática

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(actinomicina D e mitramicina) ou inibição da função do DNA por intercalação

(bleomicina, daunorrubicina, actinomicina D e adriamicina e seus análogos

mitroxantona e epirrubicina) (Almeida, 2005). Como todos os quimioterápicos, os

antibióticos atuam tanto sobre as células normais como sobre as malignas. Por isso,

também apresentam efeitos colaterais indesejáveis (Almeida, 2005, Casciato, 2008).

1.3.2.4. INIBIDORES MITÓTICOS

Os inibidores mitóticos podem paralisar a mitose na metáfase, devido à sua

ação sobre a proteína tubulina, formadora dos microtúbulos que constituem o fuso

espiralar, pelo qual migram os cromossomos. Deste modo, os cromossomos,

durante a metáfase, ficam impedidos de migrar, ocorrendo à interrupção da divisão

celular. Esta função tem sido útil na "sincronização" das células quando os inibidores

mitóticos são combinados com agentes específicos da fase S do ciclo. Devido ao

seu modo de ação específico, os inibidores mitóticos devem ser associados a outros

agentes para maior efetividade da quimioterapia (Almeida, 2005). Neste grupo de

drogas estão incluídos os alcalóides da vinca rósea (vincristina, vimblastina e

vindesina) e os derivados da podofilotoxina (o VP-l6, etoposídeo; e o VM-26,

teniposídeo) (Fuchs e Wannmacher, 2010).

Algumas drogas não podem ser agrupadas em uma determinada classe de

ação farmacológica (Bruce e Lin, 1969). Entre elas, destacam-se a dacarbazina,

indicada no tratamento do melanoma avançado, sarcomas de partes moles e

linfomas; a procarbazina, cujo mecanismo de ação não foi ainda completamente

explicado, e que é utilizada no tratamento da doença de Hodgkin; a L-asparaginase,

que hidrolisa a L-asparagina e impede a síntese protéica, utilizada no tratamento da

leucemia linfocítica aguda (Fuchs e Wannmacher, 2010; Casciato, 2008).

1.4. QUINONAS

Na busca para minimizar os danos provocados ao material genético e os

efeitos colaterais que os fármacos antineoplásicos de uso corrente promovem,

diversas linhas de pesquisas baseadas principalmente nas vias de apoptose buscam

em moléculas indutoras de tal tipo de morte celular protótipos que possam ser

aprimorados para o uso no tratamento do câncer (Casciato, 2008). Dentre as

moléculas pesquisadas chamam a atenção os derivados da quinona (Figura 3).

Essas moléculas são isômeros de posição da ciclohexanodiona e possuem a

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fórmula molecular C6H4O2 e nomes orto-benzoquinona (benzoquin-1,2-ona) e a

para-benzoquinona (benzoquin-1,4-ona) (antitumorais, leischmanicida, anti-

inflamatória, antifúngica e tripanomicida (Marsik et al., 2005).

As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de

distribuição natural. As orto-quinonas metídios estão presentes numa grande

variedade de compostos bioativos que têm sido objeto de interesse durante muitos

anos. Estes compostos têm sido estudados para atividades antineoplásicas,

antinflamatórias e antiparasitárias (Steinberg et al., 2003).

A Quinolina ou 1-azanaphthalene é um composto aromático azotado

caracterizado por uma dupla estrutura que contém um anel de benzeno fundido a

uma piridina em dois átomos de carbono adjacentes. De característica higroscópica,

amarelada e pouco polar, está presente no alcatrão. Para a indústria farmacêutica,

sua síntese é feita partindo-se de uma reação entre a anilina e o ácido sulfúrico

(Sedic et al., 2008). A isoquinolina difere da quinolina pela posição do heteroátomo

que na primeira molécula está presente na posição 2. Ambos os compostos são

muito empregados na indústria farmacêutica como estruturas orgânicas bases para

a síntese de fármacos e na modelagem e aprimoramento de compostos já

existentes. Dentre as drogas comercializadas, encontram-se anti-maláricos,

fungicidas, anti-sépticos e antipiréticos (Martirosyan et al., 2003).

Figura 3: Estruturas moleculares básicas: Orto-benzoquinona, Para-benzoquinona, Quinolina, Isoquinolina.

A Quinaldina, 2-metilquinolina (Figura 4), é utilizada como um anti-malárico e

está sendo testado como suporte para a produção de anti-maláricos mais potentes.

A quinazolina é utilizada como intermediário para a produção de alguns anti-

hipertensivos periféricos, como o prazosin e doxazosina (Figura 4). Já as

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quinoxalinas são intermediários na síntese de fungicidas (Figura 4). A síntese de

outras drogas importantes também passam pela estrutura básica das isoquinolinas,

como é feito para a obtenção da morfina. A atividade destes compostos sugere uma

ação na via das quinases celulares, mas ainda não estão bem esclarecidos os

mecanismos de ação (Sedic et al., 2008).

Figura 4: Estruturas básicas dos medicamentos Quinoxalina, Quinaldina, Quinazolina, Morfina, Prazosin.

1.4.1. LAPACHOL

O lapachol é uma naftoquinona de conhecida atividade biológica (Figura 5). A

presença do anel de quinona na porção central da molécula é a responsável pela

atividade biológica exibida pelo composto. O mecanismo de ação do lapachol deve-

se a capacidade de gerar radicais semiquinônicos, através da biorredução da

molécula e estes radicais irão atuar então nas rotas celulares (Hussain et al., 2007).

O emprego do lapachol tem sido relatado no combate às doenças tropicais. Esse

emprego é feito indiretamente, pois há relatos da utilização popular do extrato ou

infusões de plantas que sintetizam altas concentrações dessa molécula (Almeida,

2009).

O lapachol foi isolado pela primeira ver por Paterno em 1882 da planta

Tabebuia avellanedae, conhecida popularmente como Ipê-Rosa. A planta também é

popularmente conhecida no Brasil como “Pau d'arco”, e seu extrato é empregado

quando se deseja ações analgésicas, anti-inflamatórias, antineoplásicas e diuréticas.

Os efeitos anti-inflamatórios, antineoplásicos e antimicrobianos devem-se a

saponinas, flavonóides, cumarinas e outros antibióticos derivados do lapachol ou

que se encontram no extrato da planta. Os extratos aquosos e metanólico da T.

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avellanedae mostraram atividades antifúngica, antinociceptiva e antiedematogênica

(Hussain et al., 2007; Almeida, 2009).

Figura 5: Estrutura molecular do Lapachol, uma Naftoquinona.

Os primeiros relatos científicos da atividade antineoplásica do lapachol datam

de 1974, quando um estudo mostrou a atividade antitumoral contra tumores de

ratos, porém, estudos posteriores não resultaram em significantes atividades

antineoplásicas em testes clínicos. Em 1978, foi feita uma nova tentativa, desta vez,

utilizou-se de nove pacientes com vários tipos de cânceres e o lapachol exibiu efeito

antineoplásico considerável, reduzindo os tumores e as dores sentidas pelos

pacientes (Hussain et al., 2007).

Os principais entraves nas terapias com lapachol é a obtenção de

concentrações plasmáticas terapêuticas, pois apesar da tolerância, as doses

administradas são elevadas devido ao metabolismo acelerado que reduz a

biodisponibilidade do lapachol (Said, 2003).

Assim, tem-se feito estudos de modelagem molecular na busca de compostos

análogos ao lapachol que tenham elevada atividade antitumoral e que a sua

biodisponibilidade seja aumentada. Seguindo esta linha de pesquisa, foram

sintetizados muitos análogos, com atividades contra células de câncer de mama,

pulmão, próstata, ovário, leucemias e melanomas (Hussain et al., 2007; Almeida,

2009).

1.5. ISOQUINOLINO QUINONAS - IQQ

As IQQ são moléculas orgânicas que apresentam em suas estruturas tanto as

funções de isoquinolina quanto a de quinonas. A indústria farmacêutica tem

despertado interesse nos estudos com essas moléculas, pois seu esqueleto serve

de suporte para a síntese de novas drogas (Kouznetsov et al., 2005). Segundo

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Kouznetsov (2005), o interesse nessas substâncias deve-se ao fato de que elas

apresentam uma grande variedade de atividades biológicas.

Recentemente, estudos com IQQ obtidas do Bryozoan marinho Caulibugula

intermis revelaram uma ação destes compostos diretamente sobre a via das MAPK

P38, com conseqüente indução de apoptose em várias linhagens de células

cancerígenas. As moléculas isoladas deste animal são conhecidas como

caulibugulonas e são em número de seis, denominadas pelas seis primeiras letras

do alfabeto (A-F) (Brisson et al., 2007; Milanowski et al., 2004).

Um projeto de pesquisa, desenvolvido no Laboratório de Ciências Químicas

(LCQUI) do Centro de Ciências Tecnológicas (CCT) da UENF, coordenado pelo

Professor Dr. Paulo César Muniz de Lacerda Miranda resultou no desenvolvimento

de uma rota inédita para a síntese de três caulibugulonas e nove análogos. As

estruturas das moléculas foram confirmadas por ressonância Magnética-Nuclear e

por espectros de radiação ultravioleta, e estão apresentadas na Figura 6. As

moléculas sintetizadas foram gentilmente cedidas e testadas nos experimentos

dessa dissertação de mestrado. Foram investigados os efeitos antineoplásicos das

doze IQQ cedidas e do lapachol contra linhagens de células tumorais humanas.

Através de ensaios de viabilidade celular foi possível identificar nove IQQ que foram

biologicamente ativas e induziram morte em células tumorais. Em seguida, foi feita

uma avaliação da toxicidade das drogas sobre células humanas normais do sangue

periférico, onde quatro IQQ obtiveram dados de IC50 superiores aos das células

tumorais, indicando a existência de seletividade. Essas substâncias foram testadas

então para investigar o tipo de morte celular induzido. Por microscopia de

fluorescência com coloração por laranja de acridina e brometo de etídeo foi possível

verificar que as células tratadas apresentavam morfologia de apoptose e que a

necrose era rara. As mortes por apoptose foram confirmadas por citometria de fluxo

para picos de DNA Sub-G1 e por eletroforese do DNA celular.

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Figura 6. Estruturas moleculares das isoquinolino quinonas - IQQ testadas.

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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

• Avaliar in vitro o efeito antineoplásico de doze isoquinolino quinonas

sintéticas sobre células tumorais humanas e comparar com os efeitos do lapachol,

que é uma droga aprovada para uso contra o câncer e que possui estrutura

molecular semelhante às IQQ.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar e comparar in vitro a capacidade redutora da viabilidade celular

e promotora de danos das células de câncer humano tratadas com as IQQ e com o

lapachol.

• Selecionar as IQQ efetivas em reduzir a viabilidade das células

tumorais humanas e investigar seus efeitos sobre a viabilidade de PBMC de

indivíduos sadios.

• Identificar o tipo de morte celular e quantificar a cinética de morte em

culturas celulares tratadas por IQQ e lapachol utilizando técnicas de microscopia de

fluorescência, citometria de fluxo Sub-G1 e eletroforese do DNA celular.

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3. JUSTIFICATIVA

O Câncer é a segunda doença que mais causa mortes em todo o mundo.

Segundo estimativas da organização mundial de saúde, 13% de todas as mortes

ocorridas no ano de 2008 foram provocadas pelo câncer, dimensionando assim o

seu impacto econômico, que vem crescendo juntamente com o surgimento de novos

casos (WHO, 2008). Associados ao câncer surgem também outras doenças que

impossibilitam o trabalhador de exercer suas atividades e que mesmo após a

terapia, alguns pacientes podem ficar mutilados, e impossibilitados

permanentemente de terem uma vida normal (Guerra, 2005).

As atuais drogas antitumorais são muito agressivas, promovendo diversos

efeitos colaterais e colocando inclusive, a vida dos pacientes em risco. Quedas de

cabelos, degeneração da mucosa do trato digestivo, vasculites, nefrotoxicidade e

hepatotoxicidade figuram entre os efeitos colaterais que tornam as atuais terapias

muito penosas (Casciato, 2008). A descoberta de drogas que possam atuar

seletivamente sobre células tumorais, levando-as a morte e que possam trazer

poucos efeitos colaterais, interferindo o mínimo possível na qualidade de vida do

paciente, são os objetivos das pesquisas que visam o desenvolvimento de novos

fármacos antineopláscos.

As caulibugulonas são biomoléculas de ocorrência natural, encontradas no

Bryozoan marinho Caulibugula intermis. Esse animal vive a grandes profundidades

no Oceano Índico, o que dificulta a obtenção dessas biomoléculas em quantidades

suficientes para a realização de estudos farmacológicos (Milanowski et al., 2004). O

grupo de pesquisa coordenado pelo Dr. Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda,

pesquisador de química e síntese de produtos naturais e colaborador do grupo de

pesquisa do Dr. Milton Masahiko Kanashiro, dispõe de uma rota de síntese inédita

que permite a obtenção de grandes quantidades das caulibugulonas naturais A, C e

D e mais nove análogos sintéticos.

Dessa forma, a existência de quantidades suficientes das IQQ para a

realização dos estudos farmacológicos, bem como das linhagens celulares

cancerígenas justificaram a realização desse trabalho de pesquisa, embasado na

avaliação da atividade antineoplásica dessas três IQQ naturais e nove IQQ

sintéticas.

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4. METODOLOGIA

4.1. CULTURA DAS LINHAGENS CELULARES DE ORIGEM TUMORAL

As células U937, MOLT4, H460 e COLO205 foram adquiridas da American

Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas de acordo com seus respectivos

protocolos. As células leucêmicas humanas de linhagem pró-monocítica U937 e de

linhagem linfocítica MOLT4 foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Gibco, BRL). As

células cancerígenas humanas de linhagens epitelióides pulmonar e de cólon

intestinal, H460 e COLO205, respectivamente, foram cultivadas em meio de cultura

RPMI (Gibco, BRL). Ambos os meios de cultura foram suplementados com 20ug/mL

de gentamicina (Gibco, BRL) e 10% de soro fetal bovino (Gibco, BRL) e as culturas

celulares foram mantidas em garrafas de cultura de 40mL em estufa (Forma

Scientific Inc., modelo 3159) a 37º C, com 5% de CO2 e unidade controlada, com

troca do meio de cultura ocorrendo a cada dois dias.

4.2. CULTURA DE CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE

PERIFÉRICO

As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram

obtidas a partir de 30mL de sangue de indivíduos saudáveis quanto a neoplasias

malignas do sangue. A separação foi processada conforme a metodologia descrita

por Bennett e Breit (1994) utilizando centrifugação em gradiente de FICOLL (GE,

PM400). Em tubos cônicos de 50mL foram adicionados 7,5mL de FICOLL e em

seguida, 15mL do sangue foi adicionado lentamente sobre o FICOLL. O material foi

então centrifugado (Centrifuga Sorval, RT7) à 1500rpm por 40min a 20ºC e o anel de

células mononucleares foram removidas e lavadas três vezes com meio de cultura

DMEM/F12 gelado, sendo a lavagem processada por ciclos de 1500rpm por 10min,

a 4ºC. Após as lavagens, as PBMC foram quantificadas e ressuspendidas em meio

DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 20ug/mL de gentamicina e

0,25ug/mL Enterotoxina B de Staphilococcus (SEB) (Sigma, S0812). Em seguida,

foram plaqueadas em placas de culturas de células de 96 poços (TPP, 92096), onde

foram distribuídos 100uL da cultura celular na concentração de 1,0x106células/mL.

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4.3. QUANTIFICAÇÃO E AJUSTE DAS CULTURAS CELULARES

A quantificação celular foi feita em câmara de Neubauer (Boeco) com

coloração vital por Trypan Azul (Sigma, T6146) na concentração de 0,4mM. Uma

alíquota das células de cada cultura foi quantificada e as células ressuspendidas em

meio de cultura DMEM/F12 completo, de modo a obter-se a concentração final de

1,0x106 células/mL de cultura.

4.4. DILUIÇÃO E ARMAZENAMENTO DAS IQQ E DO LAPACHOL

As IQQ sintetizadas no Laboratório de Ciências Químicas (LCQUI) da

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) sob coordenação

do prof. Dr. Paulo César Muniz de Lacerda Miranda foram cedidas gentilmente para

os testes, enquanto o lapachol (Sigma, 142905) foi adquirido da Sigma-Aldrich. As

alíquotas, após pesagem, foram diluídas em 100µL de DMSO (Sigma, D1650) e

armazenadas em freezer (Freezer Forma Scientific) à temperatura de -70ºC até o

momento de montagem dos experimentos. Para a realização dos testes os

compostos eram re-diluídos, desta vez em meio de cultura DMEM/F12

suplementado, de modo a obter as seguintes concentrações: 8µg/mL, 4µg/mL,

2µg/mL, 1µg/mL e 0,5µg/mL.

4.5. TESTES DE VIABILIDADE CELULAR

4.5.1. DETERMINAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE LACTATO DESIDROGENASE

A determinação da taxa de liberação de lactato desidrogenase (LDH) foi feita

segundo a metodologia descrita por Racher (1990). O volume de 100µL/poço das

culturas de células tumorais na concentração de 1,0x106células/mL foi distribuído em

placas de cultura com 96 poços, seguidos de mais 100µL/poço das IQQ diluídas no

meio de cultura DMEM/F12 suplementado, nas concentrações de 8µg/mL, 4µg/mL,

2µg/mL, 1µg/ml e 0,5µg/mL ou do lapachol, também solubilizado em meio

DMEM/F12 e nas concentrações de 80µg/mL, 40µg/mL, 20µg/ml e 10µg/mL. Como

controles negativos e positivos, as células foram incubadas somente no meio de

cultura. Após 48 horas de incubação, foram acrescentados 10µL de uma solução de

Triton 10X (Vetec, 777) aos poços do controle positivo de liberação de LDH ou

negativos para a viabilidade celular por metabolização do MTT e em seguida, 50µL

do sobrenadante de todas as culturas foi transferido para outra placa de 96 poços.

Os 150µL restantes foram reservados para o ensaio metabólico do MTT. A

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quantidade da enzima LDH foi mensurada pelo Kit Deidrogenase Láctica

Colorimétrico, fabricado pela Doles. A densidade óptica das amostras foi medida em

espectrofotômetro multicanal (Labsystems Multiskan) com comprimento de onda

ajustado para 492ηm. A taxa de liberação de LDH foi calculada pela fórmula a

seguir:

TLLDH = ((MDOT – MDOCN) x 100) / (MDOCP – MDOCN)

Onde:

TLLDH = Taxa de Liberação de Lactato Desidrogenase

MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste

MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo

MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo

4.5.2. ENSAIO METABÓLICO DO MTT (3-(4,5-DIMETILTIAZOL-2-YL)-2,5-

BROMETO DE DIFENILTETRAZOLIUM)

O teste de viabilidade celular utilizando a metabolização do MTT (Sigma,

M2128) foi feito de acordo com a metodologia de Mosmann (1983). Para os testes

com as PBMC, processou-se o plaqueamento de 100µL das células com mais 100µL

das IQQ e do lapachol em placas de cultura de 96 poços, de modo que a

concentração final das isoquinolino quinonas fosse de 4µg/mL, 2µg/mL, 1µg/mL,

0,5µg/mL e 0,25µg/ml e do lapachol de 40µg/mL, 20µg/mL, 10µg/mL e 5µg/mL. As

PBMC foram submetidas ao tratamento por 48 horas e a seguir a viabilidade foi

avaliada pelo teste de metabolização do MTT. Para as células de linhagens

tumorais, utilizaram-se os 150µL das culturas reservados dos ensaios para a

determinação de liberação da enzima Lactado Desidrogenase e a esses,

acrescentados 15µL de uma solução de MTT em PBS na concentração de

5,0mg/mL nas culturas de células tumorais e 20µL foi acrescentado às culturas de

PBMC. Após 4 horas de incubação, foram retirados 100µL do sobrenadante das

culturas de células tumorais e 150µL das culturas de PBMC e os cristais púrpuras

precipitados de MTT foram solubilizados em 100µL de solução de isopropanol

(Merck, 1009781000) com 0,0014% de HCl fumegante. Para separar o precipitado,

as placas foram submetidas à centrifugação por 10min a 1500rpm e 100µL do

sobrenadante foi transferido para outra placa de cultura de 96 poços e lida na

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seqüência em espectrofotômetro multicanal com comprimento de onda ajustado para

570ηm. A taxa de viabilidade celular foi calculada de acordo com a fórmula a abaixo:

TVC = ((MDOT – MDOCN) x 100))/ (MDOCP – MDOCN)

Onde:

TVC = Taxa de Viabilidade Celular

MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste

MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo

MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo

4.6. TESTES DE INVESTIGAÇÃO DO TIPO DE MORTE CELULAR

Para avaliação do tipo de morte celular induzida pelos tratamentos, às células

tumorais foram submetidas aos tratamentos com as IQQ que demonstraram

seletividade e mataram as células tumorais em concentrações menores que as

necessárias para matar as células PBMC.

4.6.1. AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR POR APOPTOSE EM CÉLULAS

CORADAS COM LARANJA DE ACRIDINA E BROMETO DE ETÍDEO

As células U937 foram submetidas ao tratamento com as IQQ nas

concentrações finais de 4µg/mL, 2µg/mL, 1µg/ml, 0,5µg/mL e 0,25µg/mL e do

lapachol de 40µg/mL, 20µg/mL, 10µg/mL e 5µg/mL e avaliadas por microscopia de

fluorescência com coloração de laranja de acridina (5µg/mL, Sigma, A6529) e

brometo de etídio (10µg/mL, Sigma E8751) nos tempos de 12, 24 e 48 horas de

incubação. Como controles negativos, as células foram cultivadas apenas em meio

de cultura DMEM/F12 completo, não sofrendo assim qualquer estimulo de morte.

Para a coloração, 60µL das culturas de células foram corados com 10µL da solução

de laranja de acridina e brometo de etídeo e em seguida, 10µL foram depositados

em lâmina de microscópica e foram cobertos com uma lamínula para serem

analisados no microscópio de fluorescência (Nikon Labophot), onde foram contadas

300 células por lâmina e em campos aleatórios, com diferenciação entre células

normais, apoptose e necrose de acordo com as características morfológicas. Foram

obtidas micrografias das células tratadas com a caulibugulona A na concentração de

4µg/mL, sendo capturadas no microscópio Zeiss Axioplan através do software

Axiovision 4.6. As taxas de apoptose para cada experimento foram obtidas de

acordo com o a seguinte fórmula:

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TA = NCA x 100 / NCA + NCN + NCNM

Onde:

TA= Taxa de apoptose

NCA= Número de células em apoptose

NCN=Número de células em necrose

NCNM=Número de células normais

4.6.2. CITOMETRIA DE FLUXO PARA ANÁLISE DE FRAGMENTAÇÃO E

LIBERAÇÃO DE DNA

Para a quantificação de células em apoptose, foi utilizada a metodologia

descrita por Gong (1994). As células U937, MOLT4, COLO205 foram submetidas ao

tratamento com as IQQ pelo período de 48 horas e nas concentrações de 4µg/mL e

do lapachol na concentração de 40µg/mL. Como controles negativos de indução de

apoptose, as células foram cultivadas em meio de cultura DMEM/F12 ou RPMI

completos. Após o período de incubação, as células foram lavadas em PBS e

centrifugadas por 5min a 1500rpm. O pellet foi fixado com a adição lenta de etanol

70% gelado, a -20ºC e sob agitação constante por vórtex. As células ficaram fixando

por 30min a 4ºC. Depois de fixadas, as células foram sedimentadas com

centrifugação a 1500rpm por 5min, sendo lavada com tampão de fosfato-citrato 0.2M

e pH=7.8 Ao pellet foi acrescentado 50µL de RNAse A (100µg/mL Sigma, R4875) e

incubado a temperatura ambiente por 15min. A seguir, foi adicionado de 400µL de

iodeto de propidium (concentração final 50µg/mL; Sigma, P4170). As células foram

avaliadas, então, para a marcação do conteúdo de DNA por PI, em citômetro FACS

Calibur, sendo contados 10.000 eventos, por amostra. Os histogramas foram

gerados através das analises dos resultados pelo software WinMDI versão 2.9.

4.6.3. ELETROFORESE DO DNA DE BAIXO PESO MOLECULAR

Os perfis do DNA encontrado no núcleo das células, após o tratamento de 48

horas com as IQQ na concentração de 4µg/mL e do lapachol na concentração de

40µg/mL por 48 horas, foi investigado por eletroforese em gel de agarose (Sigma,

A9539), seguindo a metodologia proposta por Gong (1994). Para tanto, 2,0x106

células U937, MOLT4 e COLO205 foram tratadas e em seguida, lavadas duas vezes

em PBS, com centrifugação de 1500rpm por 10min. Após a segunda centrifugação,

o PBS foi descartado e o pellet de células foi fixado com 1mL de etanol 70% gelado,

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por 24 horas. Após a fixação, as células foram centrifugadas a 1500rpm por dez

minutos e o etanol descartado. Para cada amostra foi acrescentada 50µL de tampão

fosfato-citrato de concentração 0,2M e com PH=7,8. As células foram incubadas por

30min a 37ºC e depois foi feita uma centrifugação a 1500rpm por 5min. Foi coletado

em seguida, 40µL do sobrenadante, que foi transferido para outro ependorff estéril,

onde foi acrescentado 5µL de RNAse A, na concentração de 1mg/mL. As amostras

foram incubadas por mais 30 minutos a 37ºC e depois, foi acrescentado mais 5µL de

proteinase K (Sigma, P8044) na concentração de 1mg/mL, e as amostras foram

novamente incubadas por 30min a 37ºC. Por fim, 20µL de cada amostra foram

recolhidos para o processamento da eletroforese. Os géis utilizados continham

agarose na concentração de 1,0% e brometo de etídeo na concentração de 5µg/mL.

As eletroforeses foram corridas em fontes BIO-RAD (164-5070), com voltagem de

60V pelo período de 2 horas. Após, os géis foram registrados em câmara Gel Doc-

XR+ BioRad, e analisadas com o software Image Lab.

4.7. ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os gráficos representam os valores médios e foram obtidos através do

software Microsoft Excel 2007 aplicando-se das fórmulas descritas na metodologia e

as barras representam os desvios padrões dos experimentos, que foram realizados

em triplicata. Aos resultados obtidos foi aplicado o teste estatístico ANOVA e o pós-

teste de Tukey, sendo empregado o software GraphPad Prism Versão 5.0 para gerar

os dados. Os resultados de p<0,05 foram considerados estatisticamente

significantes.

Os resultados obtidos para a inibição da viabilidade de 50% das células

corresponde ao IC50, que foi calculado pelo software GraphPad Prism Versão 5.0,

através do teste de regressão não-linear.

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5. RESULTADOS

5.1. VIABILIDADE E LIBERAÇÃO DE LDH DAS CULTURAS DE CÉLULAS

TUMORAIS

Os dados obtidos para o lapachol estão apresentados na Figura 7. Nessa

figura podemos observar que as células U937 (Figura 7-A), MOLT4 (Figura 7-B) e

COLO205 (Figura 7-C) foram sensíveis aos tratamentos com a maior concentração

de lapachol testada, onde se observa uma baixa taxa de viabilidade celular. As

células H460 (Figura 7-D) mostraram-se resistentes aos tratamentos, exibindo uma

taxa de viabilidade celular superior a 40% quando tratadas com a maior

concentração do lapachol, sendo a redução da taxa de viabilidade seguida por um

aumento proporcional na taxa de liberação de LDH.

Figura 7. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com lapachol. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com lapachol. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

Os dados obtidos para o tratamento das células de COLO205 (Figura 7-C)

com a maior concentração testada sugerem um processo de morte por

apoptose.Nota-se que a liberação de LDH foi baixa (12,5%) enquanto que a

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viabilidade da cultura foi inferior a 10%, ou seja, em torno de 90% das células

morreram, porém, permaneceram com a membrana plasmática integra e não

liberaram LDH. O fato dos tratamentos das células U937 (Figura 7-A) e MOLT4

(Figura 7-B) apresentarem elevadas taxas de liberação de LDH pode ser explicado

pela manutenção por muitas horas de células em apoptose em meio de cultura,

onde não existem fagócitos para remover as células em apoptose, evoluindo assim

para um processo de necrose secundária.

Figura 8. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a caulibugulona A. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com a caulibugulona A. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

Quando são observados os resultados obtidos pelo tratamento com a

caulibugulona A (Figura 8), nota-se que nenhuma das linhagens celulares mostrou-

se resistente ao tratamento e em relação ao lapachol, as concentrações necessárias

para a indução de morte foram inferiores. A linhagem MOLT4 (Figura 8-B) foi a mais

sensível ao tratamento, exibindo taxa de viabilidade zero na concentração de

1µg/mL, enquanto que todas as células U937 (Figura 8-A), COLO205 (Figura 8-C)

e H460 (Figura 8-D) tiveram suas taxas de viabilidade reduzidas à zero apenas com

a concentração de 4µg/mL. Quando são observados os dados obtidos para as

células H460 (Figura 8-D), nota-se que na máxima concentração há ausência de

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viabilidade enquanto que nem todas as células liberaram LDH, o que se sugere um

processo de morte por apoptose.

Os resultados obtidos para as células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e

H460 (D) tratadas com a caulibugulona C estão apresentados na Figura 9. Nessa

figura observa-se que assim como o obtido para o lapachol, as células H460

mostraram-se resistentes ao tratamento nas concentrações testadas. Novamente, a

célula MOLT4 foi a mais sensível, apresentando ausência de viabilidade quando

tratadas com a concentração de 2µg/mL, enquanto que as células U937 e COLO205

obtiveram reduções significativamente grandes das viabilidades apenas na

concentração máxima testada de 4µg/mL. Os tratamentos aplicados as células

cancerígenas com essa caulibugulona são sugestivos de um processo de morte

celular por apoptose, pois se observa que apesar da ausência (Figura 9-B) ou da

elevada redução de viabilidade (Figuras 9-A e C), as taxas de liberação de LDH não

foram proporcionais.

Figura 9. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a caulibugulona C. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com caulibugulona C. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

Na Figura 10 estão apresentados os resultados obtidos dos experimentos de

viabilidade e liberação de LDH aplicados as células U937 (Figura 10-A), MOLT4

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(Figura 10-B), COLO205 (Figura 10-C) e H460 (Figura 10-D) quando foram

submetidas ao tratamento com a caulibugulona D pelo tempo de 48 horas. Essa

caulibugulona foi muito efetiva, induzindo morte celular em todas as linhagens

testadas, sendo a célula U937 a menos sensível, apresentando uma discreta

viabilidade na concentração de 4µg/mL (Figura 10-A). Os resultados obtidos para as

células U937 (Figura 10-A), COLO205 (Figura 10-C) e H460 (Figura 10-D) são

sugestivos de morte celular por apoptose. Nesses testes, pode-se observar que

apesar da redução da taxa de viabilidade celular na concentração de 4µg/mL, a

liberação de LDH não indica uma proporcionalidade de células rompidas com a

redução da viabilidade apresentada. Uma observação interessante quanto aos

dados obtidos para a caulibugulona D é que diferente do lapachol e da

caulibugulona C, as células H460 não mostraram resistência e apresentaram

resultados sugestivos de indução de apoptose (Figura 10-D).

Figura 10. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a caulibugulona D. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com caulibugulona D. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

Os resultados obtidos para a IQQ-12 demonstraram que essa substância foi

capaz de reduzir totalmente a quantidade de células vivas nas culturas de U937,

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MOLT4, COLO205 e H460 (Figura 11). A linhagem celular mais sensível a essa IQQ

foi a U937 (Figura 11-A), em que a viabilidade celular estava praticamente ausente

na concentração de 0,5µg/mL, e com uma taxa de liberação de LDH não

proporcional a redução da taxa de viabilidade. Estes resultados são sugestivos de

morte celular por apoptose. As células MOLT4 (Figura 11-B), COLO205 (Figura 11-

C) e H460 (Figura 11-D) também não resistiram ao tratamento, obtendo-se uma

redução total ou quase total das taxas de viabilidades na concentração de 4µg/mL.

Assim como o observado para as células U937 (Figura 11-A), as células COLO205

(Figura 11-C) e H460 (Figura 11-D) também não apresentaram taxas de liberações

de LDH compatíveis com a redução das taxas de viabilidade, sustentando a

indicação de morte celular por apoptose.

Figura 11. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-12. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-12. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

Quando as células tumorais foram tratadas com a IQQ-18 (Figura 12), as

linhagens de células epitelióides COLO205 (Figura 12-C) e H460 (Figura 12-D)

demonstraram resistência, com uma discreta redução da taxa de viabilidade celular

e ausência de liberação de LDH. Já as células de origem leucêmica foram sensíveis

ao tratamento, sendo as células MOLT4 (Figura 12-B) mais sensíveis que as células

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U937 (Figura 12-A). Na Figura 12-A, referente ao tratamento aplicado as células

U937, nota-se que apesar da taxa de viabilidade celular ser nula na concentração de

4µg/mL, a taxa de liberação de LDH não é total, indicando que nem todas as células

mortas sofreram rompimento da membrana plasmática. A mesma observação pode

ser verificada na Figura 12-B, onde se pode notar que na concentração de 1µg/mL

não ocorre uma proporcionalidade entre a perda da taxa de viabilidade e a taxa de

liberação de LDH. Esses achados sugerem que essa IQQ também induz morte

celular por apoptose.

Figura 12. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-18. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-18. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

Das IQQ testadas a IQQ-19 foi a menos ativa, com pode ser observado na

Figura 13. Nessa figura, os resultados obtidos pelo tratamento das linhagens de

células U937 (Figura 13-A), MOLT4 (Figura 13-B), COLO205 (Figura 13-C) e H460

(Figura 13-D) não indicam taxas de liberação de LDH. Quanto às taxas de

viabilidade celular, ocorre uma discreta redução apenas nas culturas de células

H460 (Figura 13-D) sendo considerada estatisticamente significante.

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Figura 13. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-19. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-19. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

Figura 14. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-21. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-21. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

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Os resultados dos testes de viabilidade celular por metabolização de MTT e

as taxas de liberação de LDH das células tratadas com a IQQ-21 estão

apresentados na Figura 14. Nessa figura, podemos observar que essa IQQ também

foi pouco ativa. As células U937 (Figura 14-A), MOLT4 (Figura 14-B) e COLO205

(Figura 14-C) mostraram-se resistentes aos tratamentos, não sendo identificadas

reduções nas taxas de viabilidade e liberação de LDH. Por outro lado, as células da

linhagem H460 foram sensíveis ao tratamento, apresentando redução

estatisticamente significante na taxa de viabilidade, assim como uma elevação

também significante na taxa de liberação de LDH (Figura 14-D).

As análises dos resultados obtidos para os experimentos de viabilidade e de

liberação de LDH, aplicados as culturas celulares tratadas com a IQQ-22 estão

expressos na Figura 15, onde se pode observar que todas as quatro linhagens

celulares foram sensíveis aos tratamentos. A linhagem de células leucêmicas U937

(Figura 15-A) e MOLT4 (Figura 15-B) foram as mais sensíveis, não exibindo células

viáveis quando o tratamento utilizado tinha 2µg/mL da IQQ-22. A viabilidade foi

reduzida drasticamente também nas culturas de célula COLO205 (Figura 15-C) na

concentração de 4µg/mL. As células H460 exibiram considerável resistência,

apresentando quase 50% das células viáveis com o tratamento na concentração de

4µg/mL. Quanto à liberação de LDH, as taxas não foram proporcionais com a

redução das viabilidades. Quando se comparam as taxas de liberação de LDH e as

taxas de viabilidade pela metabolização do MTT nas culturas de células MOLT4

(Figura 15-B), observa-se na concentração de 2µg/mL uma ausência de viabilidade

e de liberação de LDH, um forte indicativo de morte por apoptose. Não tão

proeminente, pode-se observar também nas culturas de células COLO205 (Figura

15-C) e H460 (Figura 15-D) que as liberações de LDH também não são

proporcionais a viabilidade perdida pelas culturas, sendo a liberação de LDH pelas

culturas de H460 (Figura 15-D) não estatisticamente significantes.

A IQQ-23 mostrou-se fracamente ativa nas concentrações testadas (Figura

16). As reduções nas taxas de viabilidade foram discretas, sendo que as culturas de

células COLO205 (Figura 16-C) e H460 (Figura 16-D) não apresentaram reduções

das taxas viabilidades e nem elevações das taxas de liberação de LDH

estatisticamente significantes (p>0,05). Por outro lado houve elevação da taxa de

liberação de LDH e redução da taxa de viabilidade estatisticamente significante para

os experimentos com as células U937 (Figura 16-A) na máxima concentração

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testada. Nessa concentração, essa IQQ foi capaz de matar todas as células MOLT4

(Figura 16-B), enquanto que a taxa de liberação de LDH ficou próxima de 50%,

resultado esse, sugestivo de indução de apoptose.

Figura 15. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-22. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-22. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas. A IQQ-24 é um isômero da IQQ-23. Apesar de possuírem a mesma fórmula

química, o rearranjo molecular é diferente e essa diferença conferiu a IQQ-24 uma

maior efetividade, como pode ser observado na Figura 17. Os resultados dos

experimentos de viabilidade celular demonstram que essa IQQ foi ativa nas células

das linhagens U937 (Figura 17-A), MOLT4 (Figura 17-B) e H460 (Figura 17-D),

com uma intensa redução da taxa de viabilidade e uma discreta liberação de LDH,

sugerindo que essa IQQ também induz morte celular por apoptose. Diferente das

outras células, a linhagem COLO205 (Figura 17-C) foi resistente a todas as

concentrações testadas, sem reduções significativas das taxas de viabilidade. Uma

observação interessante é com relação aos dados obtidos do tratamento das células

H460 (Figura 17-D), em que essa linhagem celular teve sua viabilidade totalmente

reduzida com o tratamento na concentração de 2µg/mL e com uma discreta taxa de

liberação de LDH.

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Figura 16. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-23. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-23. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

A IQQ-25 é um isômero de posição da IQQ-19. Diferente do que ocorreu

com os isômeros IQQ-23 e IQQ-24, a IQQ-25 apresentou resultados semelhantes

aos de seu isômero. Os resultados dos experimentos de viabilidade celular e de

liberação de LDH demonstram uma discreta redução nas taxas de viabilidade dos

testes feitos com as células U937 (Figura 18-A) e MOLT4 (Figura 18-B). Através de

análises estatísticas, foi possível verificar que nas culturas de U937 a redução da

taxa de viabilidade na maior concentração testada foi estatisticamente significante,

assim como uma taxa de liberação de LDH de 7,5%, ambos os resultados com

p<0,05. Nos testes com as células MOLT4, apesar de não haver liberação de LDH, o

resultado das taxas de viabilidade obtido demonstram uma redução da viabilidade

estatisticamente significante (P<0,05), sem liberação de LDH, o que sugere a

existência de morte celular por apoptose. As células COLO205 (Figura 18-C) e

H460 (Figura 18-D) não apresentaram nem reduções das taxas de viabilidade e de

liberação de LDH estatisticamente significantes.

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Figura 17. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-24. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-24. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

A IQQ-26 também foi muito ativa, sendo capaz de interferir na viabilidade e

induzir a liberação de LDH em todas as células tratadas, como pode ser isto na

Figura 19. A linhagem MOLT4 (Figura 19-B) foi a mais sensível, demonstrando

ausência total de viabilidade já na concentração de 0,25µg/mL, e com uma pequena

taxa de liberação de LDH nos experimentos com as células COLO205 e H460,

resultado esse sugestivo de apoptose. As células U937 (Figura 19-A) sofreram

reduções drásticas na taxa de viabilidade de suas culturas quando tratadas com a

concentração de 0,5µg/mL, também acompanhada de uma discreta liberação de

LDH. As células de linhagens epitelióides COLO205 (Figura 19-C) e H460 (Figura

19-D) sofreram reduções consideráveis nas suas taxas de viabilidade nas

concentrações de 1µg/mL, sempre acompanhadas de uma discreta taxa de

liberação de LDH, que são indicativos de morte celular por apoptose.

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Figura 18. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-25. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-25. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

Figura 19. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-26. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-26. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

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40

5.2. VIABILIDADE DAS PBMC TRATADAS COM O LAPACHOL E IQQ

As nove IQQ ativas contra as células tumorais foram testadas para a

viabilidade por metabolização do MTT com as PBMC, e os resultados dos IC50 estão

expressos na Tabela 1.

Tabela 1: IC50 (µg/mL) dos experimentos de metabolização do MTT das células tumorais e PBMC tratadas com as IQQ e lapachol.

Isoquinolino Quinona PBMC U937 MOLT4 COLO205 H460 IQQ-12 0,6 <0,25 0,5 0,7 0,6 IQQ-18 2,3 2,0 0,9 >4,0 >4,0 IQQ-22 1,6 1,1 0,5 2,1 4,0 IQQ-23 >4,0 >4,0 2,3 >4,0 3,3 IQQ-24 >4,0 2,0 1,8 >4,0 0,8 IQQ-26 1,1 <0,25 <0,25 0,5 0,2

Caulibugulona A >4,0 1,1 0,3 3,0 0,6 Caulibugulona C 3,2 3,0 1,1 3,2 >4,0 Caulibugulona D >4,0 3,5 2,6 2,5 1,4

Lapachol >40,0 29,4 18.8 13,4 22,9 As células tumorais e PBMC foram tratadas por 48 horas com as IQQ e com o lapachol. Os valores de IC50 foram calculados pelo software Graphpad Prism versão 5.0, pelo método de regressão não linear. As linhas sombreadas representam as IQQ que apresentaram IC50 para as PBMC maiores que para as células tumorais.

Das nove IQQ testadas, quatro reduziram menos a viabilidade das PBMC

quando comparadas com as células tumorais, e os resultados estão apresentados

na Figura 20. Enquanto o tratamento com lapachol na concentração de 40µg/mL foi

capaz de reduzir para menos de 50% a viabilidade de todas as quatro linhagens

celulares (Figura 7), nos testes de MTT com as mesmas concentrações e para as

PBMC (Figura 20-A), a taxa de viabilidade reduziu menos de 20%, não sendo essa

redução estatisticamente significante (p>0,05). Das quatro IQQ que demonstraram

seletividade, a única que reduziu de forma estatisticamente significante a viabilidade

das células PBMC foi a 26 (Figura 20-C). As toxicidades apresentadas pelo lapachol

e pelas IQQ estão representadas na forma da concentração necessária para matar

50% das células (IC50), sendo que este índice encontrado para o lapachol e para

essas quatro IQQ foi menor que o necessário para matar as linhagens celulares

tumorais (Figura 20). Esse resultado demonstra que essas IQQ foram seletivas, e

mataram as células tumorais em concentrações menores que as necessárias para

promover a morte das PBMC.

Os testes com PBMC revelaram também que cinco IQQ não foram seletivas,

reduzindo a viabilidade dessas células em concentrações inferiores às necessárias

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para matar as células tumorais (Figura 21), ou seja, num tratamento conjunto,

espera-se que as células tumorais permaneçam vivas em concentrações em que as

células humanas normais já não apresentem mais viabilidade. Como pode ser

observada nos resultados obtidos para a caulibugulona C (Figura 21-A), na

concentração de 4µg/mL a viabilidade das culturas de PBMC era praticamente nula

e o valor de IC50 obtido para as PBMC indica que a concentração necessária para

reduzir 50% da viabilidade das PBMC supera, com uma diferença razoável, apenas

a obtida para as células MOLT4, sendo praticamente o mesmo obtido para as

células U937 e COLO205 e é menor que o obtido para as células H460.

Figura 20. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT com PBMC tratadas com as IQQ seletivas e o lapachol. As PBMC foram tratadas por 48 horas com as IQQ e com o lapachol e os resultados obtidos indicam as taxas de viabilidade celular quanto à metabolização de MTT. A: lapachol, B:IQQ-24, C:IQQ-26, D:caulibugulona A, E:caulibugulona D. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

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42

A IQQ-12 foi muito ativa, reduzindo a viabilidade das células tumorais em

concentrações inferiores a 1µg/mL (Figura 21-B). Porém, reduziu muito a viabilidade

das células PBMC, apresentando IC50 elevado apenas quando comparado ao

encontrado para as células U937. Os IC50 obtidos para as células MOLT4, COLO205

e H460 são muito próximos ao obtido com as PBMC, indicando uma ausência de

seletividade quanto à indução de morte nas células tratadas in vitro. Os dados

obtidos para a IQQ-18 (Figura 21-C) dão conta de que essa substância também

exibiu uma baixa seletividade, atuando apenas nas células leucêmicas. Mesmo

assim, o IC50 obtido foi de 2,3µg/mL, muito próximo ao obtido para a célula U937,

que foi de 2µg/mL.

Figura 21. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT com PBMC tratadas com as IQQ não seletivas. As PBMC foram tratadas por 48 horas com as IQQ e os resultados obtidos indicam as taxas de viabilidade celular quanto à metabolização de MTT. A: Caulibugulona C, B:IQQ-12, C:IQQ-18, D:IQQ-22, E:IQQ-23. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.

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43

A IQQ-18 exibiu seletividade somente quando comparado com a célula

MOLT4, apresentando IC50 mais de duas vezes maior do que o da célula tumoral.

Quanto a IQQ-22 (Figura 21-D), essa também foi pouco seletiva e assim como a

IQQ-18, demonstrou seletividade apenas quando comparada com a célula MOLT4,

exibindo IC50 menor do que os apresentados pelas células COLO205 e H460,

próximo ao da célula U937 e três vezes maior que o apresentado pelas células

MOLT4. Outra IQQ que não demonstrou seletividade foi a 23 (Figura 21-E). Essa

substância não foi capaz de reduzir significantemente a viabilidade das células

PBMC e o IC50 obtido não permitiu concluir a existência de seletividade.

5.3. ANÁLISES DO TIPO DE MORTE CELULAR INDUZIDO POR IQQ E

LAPACHOL

A indução de morte celular por apoptose é muito importante quando se tratam

de alvos terapêuticos com drogas antitumorais, devido ao fato que o processo de

apoptose não é seguido de autólise e assim, consegue-se evitar a liberação de

mediadores pró - inflamatórios. Tendo em vista que quatro das IQQ demonstraram

seletividade quanto à redução da viabilidade celular em células tumorais, foi

investigado então o tipo de morte celular por elas induzido. Os resultados obtidos

dos testes de viabilidade celular pela metabolização do MTT e da liberação de LDH

davam indícios de que o principal mecanismo de morte celular observado seria a

apoptose. Para confirmar essa hipótese, foram realizados testes de análises

morfológicas por microscopia de fluorescência, testes de citometria de fluxo para

conteúdo de DNA celular e eletroforeses do perfil de DNA das células após o

tratamento com as IQQ.

5.3.1. MICROSCOPIAS DE FLUORESCÊNCIA

Os testes de microscopia de fluorescência foram realizados com a célula

leucêmica U937. As células foram submetidas ao tratamento com as IQQ que

demonstraram seletividade em atuarem sobre as células tumorais. O tratamento

durou 48 horas, e nos tempos de 12, 24 e 48 horas as culturas foram analisadas e

as células contabilizadas e diferenciadas em normais, apoptose ou necrose, de

acordo com a morfologia e os padrões de fluorescência exibidos, conforme podem

ser observados na Figura 22, referente a micrografias de fluorescência das células

U937 submetidas ao tratamento com a caulibugulona A na concentração de

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44

4,0µg/mL. As células normais emitiam fluorescência verde, com núcleo volumoso e

cromatina frouxa (Figura 22-A2) e citoplasma nítido e emitindo fluorescência verde,

com pequenas inclusões basófilas emitindo uma discreta fluorescência laranja

(Figura 22-A1). As micrografias de células em apoptose (Figura 22 – B, C e D)

foram obtidas do tratamento com a caulibugulona A na concentração de 4µg/mL,

onde foi possível avaliar toda a etapa de evolução no processo de apoptose. No

primeiro ponto de avaliação, com observação celular após 12 horas de tratamento,

puderam ser observadas as características morfológicas de apoptose, com o

aparecimento de núcleo picnótico e com cromatina condensada (Figura 22-B1),

sendo possível observar as etapas iniciais de fragmentação nuclear (Figura 22-B3)

e até mesmo, o aparecimento de pequenos fragmentos nucleares (Figura 22-B2),

sempre emitindo intensa fluorescência verde devido à condensação da cromatina.

Após 24 horas de tratamento, tornaram-se evidentes a fragmentação nuclear

(Figura 22-C1), com a presença de múltiplos fragmentos nucleares dentro das

células. No tempo final de observação, já com 48 horas de tratamento, as células

apresentavam sinais da perda da integridade da membrana plasmática, sendo

possível observar que a membrana celular já estava permeável ao fluorocromo

brometo de etídeo e os fragmentos nucleares mesclavam as fluorescências verde e

laranja (Figura 22-D1). Etapas de necrose secundárias ao processo de apoptose

também foram observadas, sendo visível a emissão de fluorescência laranja intensa

pelos fragmentos nucleares (Figura 22-D2). Em todos os tempos e concentrações

analisados, a necrose (Figura 22-E) era rara, e sua identificação era feita pela

identificação de núcleos túrgidos emitindo intensa fluorescência laranja (Figura 22-

E1) e a ausência de fluorescência citoplasmática

Nas tabelas a seguir podem ser visualizados os resultados das cinéticas do

tratamento das células U937 com as quatro IQQ seletivas em comparação com o

lapachol.

Na Tabela 2 estão os dados da cinética obtidos para o lapachol. Nessa

tabela, podemos observar que a necrose foi escassa. Assim como no controle, em

que as células foram cultivadas apenas em meio de cultura DMEM/F12 completo, as

células tratadas com as concentrações de 5µg/mL, 10µg/mL e 20µg/mL não

sofreram aumento na porcentagem de apoptose com o decorrer do tempo. Apenas

a concentração de 40µg/mL promoveu um aumento significativo nas porcentagens

de células em apoptose, já se observando 45% de apoptose nas primeiras 12 horas

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45

e chegando a 100% de células em apoptose no tempo de 48 horas. Proporcional a

elevação das porcentagens de apoptose ocorria à redução das porcentagens de

células normais, já que as porcentagens de necrose foram insignificantes e não

contribuíram para a porcentagem de células mortas.

Tabela 2. Análises das microscopias de fluorescências das células U937 tratadas com o lapachol

Concentração

% Normais % Apoptose % Necrose

12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas

Controle 96+/-0,06 97+/-0,12 96+/-0,13 4+/-0,00 2+/-0,24 2,8+/-0,71 0+/-0,24 1+/-0,48 1+/-0,48

5,0µg/mL 89+/-0,00 85+/-0,21 90+/-0,19 10+/-0,52 14+/-0,67 9,2+/-1,56 0+/-0,00 2+/-0,80 0+/-0,74

10,0µg/mL 88+/-0,00 89+/-0,13 92+/-0,00 12+/-1,87 11+/-0,04 8,0+/-2,08 0+/-0,00 0+/-0,50 0+/-0,00

20,0µg/mL 91+/-0,06 91+/-0,06 89+/-0,07 8+/-1,84 9+/-0,22 11,1+/-1,75 0+/-0,25 0+/-0,25 0+/-0,26

40,0µg/mL 53+/-0,08 40+/-0,01 0+/-0,00 45+/-1,77 59+/-0,92 100,0+/-0,00 2+/-0,30 1+/-0,03 0+/-0,00

Cinética do tratamento de células U937 com o lapachol. As porcentagens de células foram obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração por laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas aleatoriamente 300 células.

Na Tabela 3 estão apresentados os resultados das análises de microscopia

de fluorescência dos tratamentos com a caulibugulona A aplicados as células U937.

Nessa tabela, podemos observar que a apoptose começou a ser observada a partir

da concentração de 1,5µg/mL, atingindo 57% das células contabilizadas no tempo

de 48 horas. No entanto, na concentração de 2,0µg/mL, 66% das células já estavam

em apoptose nas 12 primeiras horas de tratamento, e todas as células analizadas já

estavam em apoptose com 24 horas, assim como na maior concentração testada,

em que 100% das células já estavam em apoptose nas primeiras 12 horas de

tratamento. A necrose foi insignificante.

Tabela 3.Análises das microscopias de fluorescências de células U937 tratadas com a caulibugulona A

Concentração

% Normais % Apoptose % Necrose

12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas

Controle 97+/-0,00 97+/-0,06 95+/-0,11 3+/-0,25 2+/-1,47 4+/-0,48 0+/-0,00 0+/-0,23 1+/-0,44

0,25µg/mL 95+/-0,11 93+/-0,05 96+/-0,06 4+/-0,53 7+/-0,87 4+/-0,03 0+/-0,44 0+/-0,18 0+/-0,22

0,5µg/mL 96+/-0,06 94+/-0,11 92+/-0,06 4+/-1,98 6+/-0,78 8+/-0,55 0+/-0,22 0+/-0,42 0+/-0,22

1,0µg/mL 92+/-0,16 93+/-0,05 89+/-0,06 8+/-0,54 7+/-3,0 10+/-2,79 0+/-0,65 0+/-0,22 0+/-0,23

1,5µg/mL 72+/-0,07 69+/-0,00 43+/-0,00 28+/-1,43 31+/-0,00 57+/-7,5 0+/-0,28 0+/-0,00 0+/-0,00

2,0µg/mL 33+/-0,56 0+/-0,00 0+/-0,00 66+/-2,36 100+/-0,00 100+/-0,00 1+/-2,03 0+/-0,00 0+/-0,00

4,0µg/mL 0+/-0,00 0+/-0,00 0+/-0,00 100+/-0,00 100+/-0,00 100+/-0,00 0+/-0,00 0+/-0,00 0+/-0,00

Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona A. As porcentagens de células foram obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração por laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas aleatoriamente 300 células.

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Figura 22. Micrografias das microscopias de fluorescência de células U937 tratadas com a caulibugulona A nos períodos de 12, 24 e 48 horas. As células foram coradas com laranja de acridina e brometo de etídeo e observadas em microscópio de fluorescência. A- Células controles (normais), com citoplasma emitindo fluorescência verde e com poucas inclusões basófilas emitindo discreta fluorescência laranja (1) e núcleos volumosos, com cromatina frouxa e com emissão intensa de fluorescência verde. B- Células após 12 horas de tratamento, exibindo núcleo picnótico (1), com cromatina condensada na periferia (3) e iniciando o processo de fragmentação nuclear (2). Nota-se também a intensa emissão de fluorescência verde, devido a condensação da cromatina. C- Células após 24 horas de tratamento, com núcleo intensamente fragmentado e emitindo fluorescência verde (1). D- Células após 48 horas de tratamento, com permeabilização da membrana plasmática (1) em estágios de necrose secundária, com fragmentos nucleares emitindo intensamente a fluorescência laranja. E- Necrose, onde nota-se a ausência de fluorescência emitida pelo citoplasma e núcleos túrgidos (1), emitindo fluorescência laranja.

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A caulibugulona D não foi tão efetiva em induzir apoptose quanto a

caulibugulona A. Os resultados apresentados na Tabela 4 indicam que houve

considerável indução de apoptose apenas a partir da concentração de 3,0µg/mL,

onde alcançou 44% de apoptoses após 24 horas, e esse percentual se manteve

após 48 horas de tratamento. Na concentração de 4,0µg/mL já se encontravam em

apoptose 33% das células analisadas em 12 horas, e com 24 horas, 86% das

células estavam em apoptose. Este percentual se manteve também em 48 horas de

tratamento. A necrose observada foi escassa e na maioria das análises estavam

ausentes, não superando 2% do total de eventos considerados.

Tabela 4.Análises das microscopias de fluorescências de células U937 tratadas com a caulibugulona D

Concentração

% Normais % Apoptose % Necrose

12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas

Controle 96+/-0,00 97+/-0,06 98+/-0,04 4+/-0,55 2+/-1,18 2+/-0,43 0+/-0,00 1+/-0,22 0+/-0,17

0,25µg/mL 95+/-0,00 96+/-0,01 97+/-0,00 5+/-0,22 4+/-0,55 3+/-1,11 0+/-0,00 1+/-0,02 0+/-0,00

0,5µg/mL 95+/-0,00 95+/-0,31 94+/-0,00 5+/-0,16 5+/-0,41 6+/-1,93 0+/-0,00 1+/-1,20 0+/-0,00

1,0µg/mL 96+/-0,00 92+/-0,06 96+/-0,00 4+/-0,15 7+/-0,42 4+/-2,31 0+/-0,00 0+/-0,23 0+/-0,00

2,0µg/mL 86+/-0,07 89+/-0,19 94+/-0,00 14+/-1,33 10+/-1,95 6+/-0,22 0+/-0,28 0+/-0,76 0+/-0,00

3,0µg/mL 77+/-0,15 54+/-0,67 56+/-0,20 23+/-0,43 44+/-2,19 44+/-1,86 0+/-0,60 2+/-2,46 0+/-0,76

4,0µg/mL 66+/-0,26 14+/-0,72 18+/-0,00 33+/-0,70 86+/-3,14 83+/-6,36 0+/-1,03 0+/-2,73 0+/-0,00

Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona D. As porcentagens de células foram obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração por laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas aleatoriamente 300 células.

Na Tabela 5 estão os resultados das análises dos tratamentos das células

U937 com a IQQ-24. Essa substância demonstrou uma capacidade de induzir

apoptose de forma tardia. Conforme pode ser observado na Tabela 5, nos tempos

iniciais do tratamento a porcentagem de células em apoptose não superava 21%,

inclusive na maior concentração testada. Por outro lado, a partir da concentração de

2,0µg/mL e no tempo de 48 horas foi possível identificar que 25% das células

estavam em apoptose, e alcançou a porcentagem de 94% com a concentração de

4,0µg/mL. Nas demais IQQ e com o lapachol, a necrose ou estava ausente ou não

superou 1% do total de células.

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Tabela 5. Análises das microscopias de fluorescências das células U937 tratadas com a IQQ-24

Concentração

% Normais % Apoptose % Necrose

12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas

Controle 97+/-0,11 98+/-0,06 98+/-0,00 2+/-1,09 2+/-1,39 2+/-0,19 0+/-0,45 0+/-0,23 0+/-0,00

0,25µg/mL 98+/-0,07 96+/-0,22 98+/-0,00 2+/-1,62 3+/-1,34 2+/-0,80 0+/-0,28 1+/-0,86 0+/-0,00

0,5µg/mL 98+/-0,00 98+/-0,11 97+/-0,00 2+/-0,12 2+/-0,00 3+/-0,60 1+/-0,00 0+/-0,45 0+/-0,00

1,0µg/mL 92+/-0,06 98+/-0,06 96+/-0,12 8+/-0,51 2+/-0,54 4+/-0,80 0+/-0,24 0+/-0,23 0+/-0,47

2,0µg/mL 94+/-0,00 96+/-0,00 75+/-0,06 6+/-0,17 4+/-0,15 25+/-2,57 0+/-0, 0+/-0,00 0+/-0,23

3,0µg/mL 96+/-0,06 95+/-0,00 61+/-0,00 4+/-0,02 5+/-0,39 39+/-7,83 0+/-0,25 0+/-0,00 0+/-0,00

4,0µg/mL 79+/-0,00 86+/-0,06 5+/-3,03 21+/-2,68 14+/-0,60 94+/-0,24 0+/-0,00 0+/-0,23 0+/-9,64

Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-24. As porcentagens de células foram obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração por laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas aleatoriamente 300 células.

Das IQQ testadas, a mais ativa e seletiva foi a IQQ-26. Nos testes para

verificação do tipo de morte celular induzidos, as análises de microscopia de

fluorescência (Tabela 6) revelaram que as concentrações inferiores a 0,75µg/mL

não foram capazes de induzir apoptose em quantidades expressivas, ou seja, não

ultrapassando 13% no tempo máximo dos experimentos. Por outro lado, no tempo

inicial de 12 horas a concentração de 0,75µg/mL foi suficiente para induzir apoptose

em 62% das células, com uma pequena queda e permanecendo com 50% após 48

horas de tratamento. Já nas concentrações iguais ou superiores a 1,0µg/mL, todas

as células entraram em apoptose com 24 horas de tratamento. As taxas de necrose

encontradas também não foram elevadas, sendo a máxima porcentagem obtida foi

3%.

Tabela 6. Análises das microscopias de fluorescências das células U937 tratadas com a IQQ-26

Concentração

% Normais % Apoptose % Necrose

12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas 12 horas 24 horas 48 horas

Controle 97+/-0,17 96+/-0,12 96+/-0,17 2+/-1,29 4+/-0,79 3+/-0,16 1+/-0,65 0+/-0,47 0+/-0,68

0,25µg/mL 89+/-0,26 91+/-0,05 95+/-0,00 10+/-3,88 8+/-0,26 4+/-2,07 1+/-1,01 1+/-0,19 1+/-0,01

0,5µg/mL 87+/-0,02 87+/-0,00 94+/-0,04 11+/-2,04 13+/-1,18 5+/-0,06 2+/-0,09 0+/-0,00 1+/-0,16

0,75µg/mL 38+/-0,17 40+/-0,35 49+/-0,90 62+/-1,91 59+/-1,71 50+/-4,36 1+/-0,64 1+/-1,29 1+/-3,28

1,0µg/mL 9+/-6,44 0+/-0,00 0+/-0,00 89+/-6,49 100+/-0,00 100+/-0,00 2+/-13,29 0+/-0,00 0+/-0,00

2,0µg/mL 6+/-7,83 0+/-0,00 0+/-0,00 91+/-0,39 100+/-0,00 100+/-0,00 3+/-6,5 0+/-0,00 0+/-0,00

4,0µg/mL 8+/-4,86 0+/-0,00 0+/-0,00 89+/-2,25 100+/-0,00 100+/-0,00 2+/-10,62 0+/-0,00 0+/-0,00

Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-26. As porcentagens de células foram obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração por laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas aleatoriamente 300 células.

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49

5.3.2. CITOMETRIA DE FLUXO PARA ANÁLISE DE FRAGMENTAÇÃO E

LIBERAÇÃO DE DNA

As células U937, MOLT4 e COLO205 foram submetidas ao tratamento com

as IQQ e com o lapachol. O tempo escolhido foi de 48 horas e as concentrações

foram às máximas, visto que nessas condições os dados da microscopia de

fluorescência indicavam que a maioria das células U937 encontravam-se em

apoptose.

Durante a evolução do processo de apoptose, ocorre a ativação de

endonucleases, que clivam o DNA nuclear em fragmentos internucleossomais com

200pb ou múltiplos. Pela metodologia proposta por Gong (1994), esses fragmentos

podem ser facilmente extraídos dessas células, quando as mesmas são fixadas com

etanol 70% gelado e depois tratadas com tampão de extração de DNA de baixo

peso molecular (fosfato-citrato com concentração de 0,2M e pH=7,8). Na Figura 23

estão representados os histogramas de distribuição das células U937, conforme a

quantidade de DNA que permaneceu após o tratamento com etanol e com o tampão

de extração. Nessa figura, pode-se observar que as células que não foram

submetidas aos tratamentos, portanto, as células controle (Figura 23-A),

apresentam conteúdo de DNA compatíveis com um ciclo celular normal, ou seja,

células diplóides (2N) no estágio G1 da intérfase. À medida que as células entram

em fase de divisão, inicia-se a duplicação do material genético, sendo essa etapa

correspondente no histograma ao intervalo entre os dois picos de DNA, ou seja, a

fase S da intérfase. Quando o DNA já se encontra duplicado, as células encontram-

se na fase G2, e entra então no processo de mitose (G2/M). Quando uma célula está

em apoptose, ocorre a formação de fragmentos oligonucleossomais de DNA, que

são extraídos com o tratamento efetuado. Assim, na análise por citometria de fluxo

estas células se localizam na região denominada Sub-G1. Na Figura 23-A, observa-

se que a maioria das células está em G1, e que 1,22% das células exibiram

conteúdo de DNA menor que G1, ou seja, estão em apoptose. Quando foram

analisados os resultados das células U937 tratadas com o lapachol (Figura 23-B),

70,45% das células encontravam-se na região Sub-G1 e, portanto, em apoptose.

Por essa metodologia foi possível confirmar que 78,25% das células U937 entraram

em apoptose quando tratadas com a caulibugulona A (Figura 23-C), e 51,15% com

a caulibugulona D (Figura 23-D), 75,81% com a IQQ-24 (Figura 23-E) e 63,18%

quando o tratamento aplicado foi com a IQQ-26 (Figura 23-F).

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50

Utilizando-se da técnica de citometria de fluxo para quantificação do DNA

celular foi possível identificar que as células MOLT4 quando submetidas aos

tratamentos com as IQQ e o lapachol apresentaram deslocamento da população

celular em direção a região Sub-G1, o que confirma a capacidade de induzir

apoptose dessas substâncias. As células do controle (Figura 24-A) apresentavam

um discreto pico de células na região Sub-G1, equivalendo a 14,94%, enquanto que

o tratamento com lapachol (Figura 24-B) elevou essa quantidade para 39,18%, com

uma tendência para a formação de apenas uma população em Sub-G1.

Figura 23. Citometria de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular. Células U937 foram submetidas ao tratamento com as IQQ e o lapachol, pelo período de 48 horas e com as concentrações de 4,0µg/mL para as IQQ e 40,0µg/mL para o lapachol. Como controle, as células foram cultivadas em condições ideais, apenas com meio de cultura DMEM/F12 completo. As células foram analisadas em citômetro FACS Calibur, e os histogramas obtidos pelo software WinMDI2.9. A-controle, B-lapachol, C-caulibugulona A, D-caulibugulona D, E-IQQ-24 e F-IQQ-26.

O mesmo foi observado para o tratamento com a caulibugulona A, com forte

tendência para a formação de um único pico populacional em Sub-G1 (Figura 24-C).

O tratamento com a caulibugulona D foi o menos efetivo, mostrando apenas 21%

das células em Sub-G1. Os tratamentos com IQQ-24 e IQQ-26 foram os mais

efetivos. Quando tratadas com a IQQ-24 (Figura 24-E), mais de 64% das células

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apresentavam baixas quantidades de DNA, e, portanto, foi possível confirmar que

mais de 64% das células estavam em apoptose. Os resultados mais expressivos

foram com a IQQ-26 (Figura 24-F), confirmando-se mais de 85% das células em

Sub-G1. Tendo em vista a grande amostragem dos experimentos, foi possível

confirmar que o tratamento com essas substâncias foram capazes de induzir morte

por apoptose nas células MOLT4.

Figura 24. Citometria de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular. Células MOLT4 foram submetidas ao tratamento com as IQQ e o lapachol, pelo período de 48 horas e com as concentrações de 4,0µg/mL para as IQQ e 40,0µg/mL para o lapachol. Como controle, as células foram cultivadas em condições ideais, apenas com meio de cultura DMEM/F12 completo. As células foram analisadas em citômetro FACS Calibur, e os histogramas obtidos pelo software WinMDI2.9. A-controle, B-lapachol, C-caulibugulona A, D-caulibugulona D, E-IQQ-24 e F-IQQ-26.

As análises por citometria de fluxo para as células COLO205 demonstraram o

aparecimento de células com baixo conteúdo de DNA, enquanto que as células

controles apresentavam apenas 4,3% na região de Sub-G1 (Figura 25-A). O

tratamento com lapachol deslocou uma boa parte das populações para Sub-G1

(Figura 25-B), atingindo a porcentagem de 30,02%. O tratamento com a

caulibugulona A elevou a quantidade de células para a região de Sub-G1,

alcançando a proporção de 24,55% (Figura 25-C), quando comparado com o grupo

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controle. Da mesma forma foi possível confirmar apoptose em 16,25% das células

tratadas com a caulibugulona D (Figura 25-D). A substância mais ativa sobre as

células COLO205 foi a IQQ-26, e assim como nos experimentos de viabilidade, na

citometria de fluxo foram possíveis confirmar que 49,38% das células estavam em

apoptose, apresentando conteúdo de DNA Sub-G1 (Figura 25-E).

Figura 25. Citometria de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular. Células COLO205 foram submetidas ao tratamento com as IQQ e o lapachol, pelo período de 48 horas e com as concentrações de 4,0µg/mL para as IQQ e 40,0µg/mL para o lapachol . Como controle, as células foram cultivadas em condições ideais, apenas com meio de cultura RPMI completo. As células foram analisadas em citômetro FACS Calibur, e os histogramas obtidos pelo software WinMDI2.9. A-controle, B-lapachol, C-caulibugulona A, D-caulibugulona D, E-IQQ-26.

5.3.3. ELETROFORESE DO DNA CELULAR

Para analisar o perfil do DNA das células tratadas com as IQQ e o lapachol foi

realizada a eletroforese em gel de agarose, utilizando a metodologia de Gong (1994)

para a extração do DNA celular. As células U937, MOLT4 e COLO205 foram

tratadas nas mesmas condições utilizadas nos experimentos de citometria de fluxo.

Na Figura 26 pode ser visto o perfil do DNA extraído das células COLO205 (A),

U937 (B) e MOLT4 (C). Nota-se que os grupos controles, em que as células foram

cultivadas em condições ideais, uma pequena fração de DNA foi extraído, e mesmo

assim, o perfil não indicava o padrão em ladder (fragmentos oligonucleossomais)

típico de células em apoptose. As células COLO205 foram as que apresentaram

menor quantidade de DNA extraído, sendo possível verificar a presença de bandas

apenas nos tratamentos com a IQQ-26 (Figura 2-A/I26) e com a caulibugulona A

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(Figura 26-A/CA). Os tratamentos com a caulibugulona D e com o lapachol não

produziram DNA de baixo peso molecular que pudesse formar bandas e ser

observado por essa metodologia. O perfil do DNA extraído das células U937 foi mais

intenso, onde pode ser notada a presença de bandas de DNA em todos os

tratamentos (Figura 26-B). Nas análises do perfil do DNA extraído das células

MOLT4 (Figura 26-C) pode ser observado após o tratamento com as IQQ-24 e 26

(Figura 26-C/I24 e I26) e com o lapachol (Figura 26-C/LAP) apresentava o perfil de

ladder.

Figura 26. Eletroforese em gel de agarose (1%) para perfil do DNA extraido das células COLO205 (A), U937 (B) e MOLT4 (C) tratadas com IQQ e lapachol por 48 horas. Como controle, as células foram cultivadas em meio de cultura DMEM/F12 (U937 e MOLT4) e RPMI (COLO205) completos. O DNA celular foi extraído pela metodologia de Gong e analidado por eletroforese em gel de agarose a 1%, com voltagem de 60V por 120 minutos. CTL-controle, I26-IQQ-26, I24-IQQ-24, CA-caulibugulona A, CD-caulibugulona D e LAP-lapachol.

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6. DISCUSSÃO

Pelo método de LDH, as células que sofrem danos na membrana plasmática

liberam para o meio extracelular a enzima LDH, que reduz o NAD a NADH e esse

último converte um substrato colorimétrico que tem sua intensidade de cor

mensurada por espectrofotômetro (Racher et al., 1990).

O teste de metabolização do MTT avalia a viabilidade celular pela presença

de mitocôndrias viáveis, sendo essas últimas capazes de reduzir o MTT, um

metabólito solúvel de coloração amarelada, para cristais de coloração púrpura.

Esses cristais são solubilizados e quanto maior a coloração gerada, maior é a

quantidade de mitocôndrias viáveis e, portanto, maior a quantidade de células vivas

(Morgan, 1997).

Quando são confrontados os dados experimentais de liberação de LDH e de

metabolização do MTT, os achados indicam que se as células estiverem vivas as

taxas de metabolização de MTT serão altas e as taxas de liberação de LDH mínimas

ou ausentes. Por outro lado, quando as células estão mortas por necrose ocorre

uma ausência na redução de MTT e intensa liberação de LDH e, se as células

estiverem em apoptose, não se observa a redução de MTT e nem a liberação de

LDH, tendo em vista a manutenção da integridade da membrana plasmática. Porém,

se as células permanecem por um longo período de tempo em apoptose, esgotam-

se as reservas energéticas necessárias para manter o gradiente iônico entre os

folhetos interno e externo da membrana plasmática, o que leva as células a um

processo de necrose secundária ao processo de apoptose que ocorreu

anteriormente (Lobner, 2000).

Nesse trabalho, os experimentos de viabilidade por metabolização de MTT e

os testes de liberação de LDH com as células tumorais foram realizados

conjuntamente. Através do teste de viabilidade celular foi possível avaliar a

capacidade de indução de morte celular apresentado pelas caulibugulonas. Os

testes realizados por Milanowski et al., (2004), com as caulibugulonas extraídas

diretamente do Bryozoan marinho indicaram que essas moléculas foram capazes de

reduzir a viabilidade das culturas celulares de origens tumorais murinas IC2WT e com

IC50 variando entre 0,34µg/mL e 1,67µg/mL, enquanto que as sintéticas aqui

testadas obtiveram IC50 entre 0,3µg/mL (Figura 8-B e D) e 3,5µg/mL (Figura 10-A).

O lapachol foi empregado como droga controle, por se tratar de um medicamento de

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uso aprovado pela ANVISA e que tem a estrutura molecular mais próxima das IQQ.

Assim como as IQQ, o lapachol também foi efetivo sobre as linhagens de células

tumorais U937, MOLT4 e COLO205, porém, não exibiu efeito redutor da taxa de

viabilidade celular sobre as células de linhagem pulmonar H460. As concentrações

necessárias para que as células tivessem sua viabilidade reduzida foi muito maior no

lapachol do que nas IQQ, chegando a ser 294 vezes maior (Figura 7-A) onde pode

ser observado IC50=29,4 e (Figura 11-A) onde o IC50=<0,25. Em outros testes

realizados com o lapachol também foi demonstrado que outras linhagens celulares

mostraram-se sensíveis a essa droga. Nos estudos de Rao et al., (1968), as células

de carcinossarcoma de Walker 256 e Linfosarcoma de Murphy Sturm foram

sensíveis ao lapachol, enquanto que para as neoplasias de ratos adenossarcoma

755, carcinoma pulmonar de Lewis, Leucemia Linfocítica P388 e leucemia L-1210

esta droga não teve atividade.

Dentre as IQQ, a mais efetiva foi a IQQ-26 (Figura 19), onde os IC50 dos

testes de viabilidade não excederam 0,5µg/mL, sendo a caulibugulona A mais

efetiva do que as demais caulibugulonas. Enquanto que as IQQ-19, IQQ-21 e IQQ-

25 não foram efetivas sobre as células testadas, sendo que IQQ-19 e IQQ-25 são

isômeros e mesmo a mudança na estrutura molecular não foi suficiente para tornar

as substâncias mais potentes. Contudo, algumas mudanças estruturais podem

acarretar efeitos farmacológicos diferentes, conforme foi observado nos ensaios de

viabilidade com as IQQ-23 e IQQ-24 que também são isômeros. A IQQ-23 foi ativa

apenas contra a linhagem MOLT4 e a IQQ-24 foi ativa também contra as linhagens

U937 e H460 (Figura 18). Efeitos semelhantes já foram relatados anteriormente na

literatura. Um exemplo é a observação de que o verapamil, que é empregado como

antagonista do Ca++ no tratamento da angina pectoris e em arritmias cardíacas, a

sua atividade é observada quando é comercializado na forma de mistura racêmica

de seus isômeros cis e trans, pois a atividade farmacológica do dexverapamil - cis é

diferente e mais tóxica que a de seu enantiômero – Trans (Surakitbanharn et al.,

1995).

Os resultados obtidos para os experimentos conjuntos de liberação de LDH e

de viabilidade celular pela metabolização do MTT foram sugestivos de morte celular

por apoptose. Em muitos dos experimentos pode ser observado que a taxa de

liberação de LDH não foi proporcional com a perda da viabilidade celular, como se

observa na Figura 19, indicando que a morte celular não promoveu ruptura da

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membrana plasmática. Experimentos conjuntos com dados de LDH e MTT foram

realizados por Upadhyaya et al., (2007), que obteve dados semelhantes, com baixas

taxas de viabilidade e liberação de LDH quando trataram células U937 e HL-60 com

β-caroteno.

Os efeitos tóxicos das drogas antitumorais se devem a baixa seletividade, ou

seja, as drogas matam tanto as células cancerígenas quanto as células normais

humanas. Dessa forma, substâncias que possam atuar diretamente sobre as células

tumorais e poupar as células normais são um bom indicador para a continuidade dos

testes de avaliação do potencial antitumoral. Diante dos resultados com as linhagens

celulares cancerígenas foram realizados experimentos de viabilidade para investigar

se as IQQ atuavam promovendo a morte em células humanas normais. Em culturas

de PBMC estimuladas com SEB foi possível separar as IQQ em dois grupos. No

primeiro, quatro IQQ e o lapachol não foram capazes de reduzir a viabilidade das

culturas de PBMC nas concentrações testadas, demonstrando certa seletividade

sobre as células tumorais, enquanto que outras cinco IQQ foram ativas em reduzir

tanto a viabilidade de células tumorais quanto de células PBMC. Esses dados foram

importantes, pois se busca drogas que tenham como alvo terapêutico apenas as

células tumorais, e assim, conferindo menos efeitos tóxicos durante o tratamento.

Upadhyaya et al., (2007) em seus testes identificou que os β-carotenos atuavam

seletivamente sobre as linhagens U937 e HL-60, poupando as células PBMC.

Além de serem seletivas atuando sobre as células tumorais, é necessário que

as drogas antineoplásicas promovam morte celular por apoptose. Dados de

patologia indicam que um processo de necrose superior a 5% das células totais de

um organismo geram reações inflamatórias incompatíveis com a vida (Kumar et al.,

2005). Assim, promover apoptose sem liberar mediadores pró-inflamatórios é um

fator importante na identificação de uma droga antineoplásica. Para confirmar os

achados dos experimentos de LDH e viabilidade, foram feitos testes com

microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e eletroforese de DNA em gel de

agarose buscando a confirmação da capacidade de induzir morte celular por

apoptose das IQQ que demonstraram ser seletivas.

As cinéticas de morte celular realizadas por microscopia de fluorescência com

as células U937 confirmaram a morte celular por apoptose induzida pelos compostos

testados. A necrose foi rara e a partir de 12 horas já foi possível identificar que todas

as células tratadas com a caulibugulona A estavam em etapa inicial de apoptose

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(Tabela 3) e, portanto, esse foi o processo majoritário de morte induzido pelas IQQ.

De acordo com as morfologias observadas na microscopia de fluorescência (Figura

22), é possível verificar que células que em 12 horas já se encontravam em

apoptose inicial, com 48 horas não conseguiam manter o gradiente iônico entre os

folhetos da membrana plasmática e entravam em necrose secundária (Figura 22 –

D). Esses dados são compatíveis com os encontrados nos experimentos de

liberação de LDH. Os tratamentos com a caulibugulona A na concentração de

4µg/mL levaram 100% das células a apoptose com 12 horas, e como esperado, em

48 horas todas já estavam em necrose secundária e liberando LDH (Figura 8). De

semelhante resultado, as células U937 tratadas com a caulibugulona D

apresentavam-se 33% em apoptose com 12 horas (Tabela 4) e com 48 horas a taxa

de liberação de LDH obtida indicava que 25% das células haviam perdido a

integridade da membrana (Figura 10), assegurando, portanto, que os dados de

liberação de LDH foram compatíveis com os dados de microscopia de fluorescência

no tempo de 12 horas.

A condensação de cromatina, acompanhada de fragmentação nuclear e por

fim, o aparecimento de corpos apoptóticos está entre as características morfológicas

mais marcantes do processo de morte por apoptose e que podem ser facilmente

observados nas células em apoptose por testes de microscopia de fluorescência.

Por isso, esses testes geralmente são os primeiros a serem realizados para

investigar o tipo de morte celular. Alguns autores, no entanto, consideram essa

metodologia muito subjetiva, pois para ser executada de maneira correta, o avaliador

deve ser imparcial e possuir um conhecimento suficiente para diferenciar as

morfologias celulares (Leite et al., 1999). Apesar dos valores da cinética de

microscopia de fluorescência serem compatíveis com os dados encontrados para a

viabilidade celular e as taxas de liberação de LDH, processou-se também outras

duas metodologias de análises de apoptose.

Por citometria de fluxo para marcação do ciclo celular, a utilização do tampão

de fosfato-citrato remove os fragmentos de DNA de baixo peso molecular gerados

durante o processo de apoptose. A geração desses fragmentos depende da ativação

de endonucleases, que clivam o DNA em fragmentos de 200pb. As células em

apoptose, quando tratadas com o tampão de fosfato-citrato, têm esses fragmentos

de DNA removidos e passam a emitir menos fluorescência quando tratadas com o

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fluorocromo iodeto de propídeo, passando a ocupar a região de Sub-G1 no

histograma populacional (Gong et al., 1994).

Quando o DNA das células em apoptose é observado por eletroforese, nota-

se o padrão de bandas em ladder. Os dados obtidos da citometria de fluxo foram

compatíveis com as observações do perfil do DNA extraído das células após os

estímulos. Por citometria de fluxo, as células U937 exibiram deslocamento da

população em direção a região Sub-G1 quando tratadas com todas as quatro IQQ

seletivas e com o lapachol e o perfil do DNA analisado por eletroforese indicou a

formação de bandas em ladder. Por citometria de fluxo, 78,29% das células tratadas

estavam com pouco conteúdo de DNA e, portanto, morreram por apoptose. O perfil

do DNA celular extraído confirmou sua fragmentação, uma vez que nos grupos

controles em que as células apresentavam DNA integro, não foram visualizados

fragmentos de DNA (Figura 26:CTL - A, B e C). As células MOLT4 também

apresentaram formação de população Sub-G1 após o tratamento com as IQQ e com

o lapachol, confirmando a presença de apoptose, principalmente no tratamento com

a IQQ-26, em que foram confirmadas mais de 85% das células em apoptose e com

perfil de DNA fragmentado. As células COLO205 apresentaram perfil de DNA com

pouca fragmentação o que refletiu na baixa confirmação de células em apoptose

pela metodologia de Sub-G1, pois o DNA pouco fragmentado não pôde ser extraído

das células.

Como não foram realizados experimentos de cinética de viabilidade, liberação

de LDH e nem de microscopia de fluorescência com as linhagens celulares MOLT4 e

COLO205, não foi possível confrontar os dados obtidos nos testes de viabilidade e

de liberação de LDH com as citometrias de fluxo e as eletroforeses do DNA. Dados

semelhantes foram obtidos por Vashishtha et al., (1998), quando comparou dados

de viabilidade celular com fragmentação de DNA nuclear, concluindo-se que no

momento em que foi realizada a extração do DNA ainda não havia ocorrido a

ativação das endonucleases. Tal feito ocorre nas diversas linhagens celulares

apresentam perfis diferenciados de ativação de endonucleases, e com isso, a

formação de fragmentos de DNA não segue o mesmo tempo para todas as células

submetidas aos estímulos de indução de apoptose.

A linhagem celular COLO205 é conhecida pela multi-resistência a diversas

drogas antitumorais (Medina et al., 1998). Nos testes realizados nesse trabalho, as

células COLO205 demonstraram serem sensíveis aos tratamentos com as IQQ e

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com o lapachol, inclusive, com resultados sugestivos de indução de morte celular por

apoptose quando são confrontados os dados dos experimentos de viabilidade e de

liberação de LDH. Os resultados das citometrias de fluxo e de eletroforese do DNA

celular, ambos realizados com 48 horas, evidenciaram pequenos picos de células

em Sub-G1 com discreta ou ausente fragmentação do DNA nuclear, sugerindo que

os eventos de apoptose são tardios e no tempo de 48 horas a ativação de

endonucleases não foi suficiente para a clivagem do DNA de modo a ser observado

por essas metodologias.

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7. CONCLUSÃO

• As caulibugulonas sintéticas mantiveram a capacidade de induzir morte

celular por apoptose.

• Quatro IQQ demonstraram seletividade em induzir morte celular nas

células cancerígenas, sendo que IQQ-24, caulibugulona A e caulibugulona D não

foram capazes de induzir morte nas células PBMC.

• A IQQ-26 foi à substância mais promissora levando em consideração

atividade e seletividade.

• O processo de morte celular por apoptose foi identificado através de

microscopia de fluorescência e confirmado por citometria de fluxo para população

Sub-G1 e por eletroforese do DNA celular.

• Os resultados apontam as IQQ como indutoras de apoptose em células

tumorais humanas e abre perspectivas para a continuidade da investigação dos

efeitos antineoplásicos dessas substâncias.

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