Efeitos da Atividade Física na Estrutura da Cartilagem ... · Aos funcionários do Departamento de...
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RENATA GABRIEL FONTINELE
Efeitos da Atividade Física na Estrutura da Cartilagem Articular
do Joelho de Ratas Ooforectomizadas
São Paulo
2007
RENATA GABRIEL FONTINELE
Efeitos da atividade física na estrutura da cartilagem articular do joelho de
ratas ooforectomizadas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências
Departamento:
Cirurgia
Área de Concentração:
Anatomia dos Animais Domésticos e
Silvestres
Orientador:
Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza
São Paulo
2007
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.1939 Fontinele, Renata Gabriel FMVZ Efeitos da atividade física na estrutura da cartilagem articular do joelho de ratas
ooforectomizadas / Renata Gabriel Fontinele. – São Paulo: R. G. Fontinele, 2007. 86 f. : il.
Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, 2008.
Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres. Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.
Orientador: Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza.
1. Cartilagem Articular. 2. Tíbia. 3. Ooforectomia. 4. Exercícios Físicos. 5. Morfometria. 6. Rato Wistar. I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: FONTINELE, Renata Gabriel
Título: Efeitos da atividade física na estrutura da cartilagem articular do joelho de ratas
ooforectomizadas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências
Data: _____/_____/_____
Banca Examinadora
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: ________________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: _______________________
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: ________________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: _______________________
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: ________________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: _______________________
“Senhor, meu futuro está em tuas mãos. Não sei o
que aguarda o amanhã, mas sei que estarás
comigo, aconteça o que acontecer, e isto
enche o meu coração de paz”.
DEDICATÓRIA
A minha mãe, Adelina da C. G. C. Fontinele e ao meu pai,
Francisco das C. C. Fontinele que são dádivas em minha
vida. Obrigada pelos ensinamentos de fé, pelos caminhos
guiados, pela compreensão, por todo amor e carinho. Esta
jornada não seria possível sem o apoio de vocês.
Eu amo vocês!
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao meu orientador Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza pela confiança, atenção,
paciência, orientação, amizade e respeito. Já disse isso antes e repito: “O Senhor é como
um pai para mim nos ensinamentos e na pesquisa”. Obrigada.
As minhas irmãs lindas, Daniela G. Fontinele e Camila G. Fontinele pelo carinho, apoio
e amizade.
Ao meu noivo, Alexandre J. Rosário pela paciência, compreensão e dedicação.
Ao meu cunhado, William T. S. Filho pelo apoio e incentivo.
Aos meus amigos Fabiana Santos Matsumoto, Amanda Messias Vazzoler, Claudia
Kanashiro, Joel Alves de Sousa, Evander Bueno, Guilherme Buzzon, e Ana Paula
Castello por todos os momentos de alegria e companheirismo. Vocês têm um lugar
especial em meu coração.
AGRADECIMENTOS
A Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, pela
oportunidade de aprimoramento científico e profissional.
A Prof. Dra. Maria Angélica Miglino pela confiança, ensinamentos, apoio e também por
disponibilizar o uso do Laboratório de Histologia e Embriologia. Muito obrigada!
Aos técnicos e amigos do Laboratório de Histologia e Embriologia, Dra. Sandra Freiberger
Affonso e Ronaldo Agostinho da Silva. Vocês foram fundamentais para o desenvolvimento
da Microscopia Eletrônica e da Histologia. Obrigada pela força!
Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Ambrósio, por ter cedido gentilmente o espaço para a
realização do protocolo experimental no canil GRMD.
Aos colegas do canil GRMD, em especial ao José Augusto Eulálio e Marina Brolio pelo
apoio e paciência.
Ao Prof. Dr. José Roberto Kfoury, pelos ensinamentos e por disponibilizar o uso do
laboratório LTIAM.
Aos colegas do LTIAM pela paciência e compreensão, em especial a Janaina Munuera
Monteiro, Ana Rita de Lima, Gerlane Medeiros e Rosemary Viola Bosch.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação do Setor de Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres, em especial ao Prof. Dr. Ii-Sei Watanabe e ao Prof. Dr. Francisco
Javier H. Blasquez pelos ensinamentos.
As minhas avós Sra. Carminda Camila e Sra. Maria Regina C. Fontinele (em memória), ao
meu avô Sr. Henrique Augusto Gabriel (em memória) por todo amor e carinho.
As minhas tias Maria de Fátima Gabriel e Maria da Salete Fontinele, a minha prima Maise
J. Oliveira e ao meu primo Marcio P. Oliveira por todo apoio e carinho.
Aos meus amigos de pós-graduação: Fernando Ladd Lobo, Silvio Pires Gomes, Valquiria
Mariotti, Felipe da Roza Oliveira, Juliana Plácido Guimarães, Renata de Britto Mari,
Daniela Cagnoto, Fernando Garbelotti, Thiago Aloia, Ana Paula Silva, João Carlos Morini,
Marcelo Mendes, Miryan Lança Alberto Gutierrez, Hugo Andres Gutierrez e Caue
Procópio.
A todos os colegas de pós-graduação pela amizade.
Aos técnicos do setor de Anatomia, Ednaldo Ribas Farias (Indio), Diogo Mader, João do
Carmo Freitas, Raimundo Leal de Sousa e Natalia Garcia de Andrade (Branca), pelo
carinho, respeito e amizade.
Aos funcionários do Departamento de Anatomia, Jaqueline Martins de Santana e Maicon
Barbosa da Silva pela ajuda e carinho.
As funcionárias da secretaria de pós-graduação, Claudia Lima, Deise Maria Alves Flexa e
Joana Ferreira Dias Vasconcelos.
Aos funcionários da biblioteca da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, em especial a Elza Maria R. B. Faquim, pela colaboração e
correção desta dissertação.
A Prof. Dra. Laura Beatriz Mesiano Maifrino e Prof. Dra Eliane Gama pela ajuda e
ensinamentos.
Ao pessoal do Laboratório Rhesus Veterinária, em especial a Márcia, pela seriedade.
RESUMO
FONTINELE, R. G. Efeitos da atividade física na estrutura da cartilagem articular do joelho de ratas ooforectomizadas. [The Effects of the physical activity in the articular cartilage structure in the knee of ovariectomized rats]. 2008. 86 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
A incidência de osteoartose, ou degeneração da cartilagem articular aumenta na pós-
menopausa, condição esta relacionada à deficiência de estrógeno. Por outro lado, tem sido
demonstrado que a atividade física regular e moderada tem efeitos benéficos sobre o sistema
esquelético, em qualquer condição, mas especialmente na menopausa. Utilizando ratos
Wistar, como modelo experimental, os objetivos deste trabalho são: a) verificar se a
ooforectomia produz alterações na estrutura da cartilagem articular da epífise proximal da
tíbia e b) verificar se a realização de exercícios físicos aeróbicos tem efeito sobre estas
alterações. Para a realização deste estudo foram utilizadas 24 ratas com 6 meses de idade, da
linhagem Wistar, distribuídas em 3 grupos de oito ratas cada: GC-Ratas com seis meses de
idade, não submetidas à ooforectomia nem atividade física; GOS-Ratas com seis meses de
idade, que sofreram ooforectomia bilateral, mas que não fizeram atividade física e, GOT-
Ratas com seis meses de idade que foram submetidas à ooforectomia bilateral mais atividade
física (corrida em esteira) durante 3 meses. Todos os animais foram eutanasiados com 9
meses de idade. A avaliação foi realizada através de microscopia de luz em cortes
histológicos corados pela Hematoxilina-Eosina e pelo Picrossírius e estudos à microscopia
eletrônica de varredura. À microscopia de luz, foram feitas medidas da espessura das zonas
da cartilagem articular, contado o número de condrócitos por área, determinados os volumes
dos núcleos dos condrócitos e a densidade de volume das fibras colágenas e à microscopia
eletrônica de varredura foi analisada a superfície da cartilagem nos três grupos. Os dados
quantitativos foram comparados estatisticamente pelo ANOVA e teste de Tukey. Os
resultados mostraram que houve um aumento de peso nos animais do GOS e GOT em relação
ao GC. Quanto ao treinamento, os animais do GOT tiveram melhor rendimento nos TEMs.
Quanto à espessura da cartilagem observamos um aumento da espessura da zona superficial
no côndilo medial da tíbia no GOS em relação ao GC. O número de condrócitos por campo
foi alterado apenas no GOS, que mostrou um aumento de 34% em relação ao GC, o que, ao
que parece, se deveu ao aumento do número de condrócitos da camada profunda. O volume
nuclear dos condrócitos da zona superficial foi menor no GOS que no GC. O mesmo ocorreu
na zona média do côndilo medial. Quanto aos valores da cartilagem da epífise proximal como
um todo, observamos que o volume nuclear dos condrocitos do GOS e também do GOT
foram menores do que do GC. Para o colágeno observamos um aumento da densidade de
volume do colágeno no GOS e no GOT em relação ao GC. A microscopia eletrônica revelou a
presença de lesões degenerativas semelhantes tanto para o GOS, quanto para o GOT.
Podemos concluir que a depressão dos níveis de estrógeno acarreta alterações importantes na
cartilagem articular da epífise proximal da tíbia tanto no componente celular, quanto na
matriz e que a realização de exercícios físicos, isoladamente, parece não influenciar essas
alterações.
Palavras-Chave: Cartilagem Articular. Tíbia. Ooforectomia. Exercícios Físicos. Morfometria.
Rato Wistar.
ABSTRACT
FONTINELE, R. G. The effects of the physical activity in the articular cartilage structure in the knee of ovariectomized rats. [Efeitos da atividade física na estrutura da cartilagem articular do joelho de ratas ooforectomizadas]. 2008. 86 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
The incidence of osteoarthritis increase in women in the post-menopausal period. This
condition is relationed with the estrogen deficiency. Otherwise, it’s being demonstrated that
regular or moderate physical activity have beneficial effects on the skeletal system, in any
condition, but especially in the menopause. Using Wistar rats, as an experimental model, the
aims of this work are: a) to check if the ovariectomy produces alterations in the articular
cartilage structure of the tibial proximal epiphysis and b) To check if aerobic physical
exercises have effects on this alterations. To achieve these goals it was used 24 Wistar rats of
6 months of age, distributed in 3 groups of eight rats each: Control group- Rats with six
months of age without ovariectomy and physical activity; GOS- Rats with six months of age
with ovariectomy bilateral and without physical activity and, GOT- Rats with six months of
age with ovariectomy bilateral and physical activity during 3 months. Al rats were
euthanasied with 9 months of age. The results were obtained by using light microscopy to
observe the histological sections stained with Hematoxylin and Eosin, and Picrosirius stain
and the Scanning Electron Microscope. For light microscopy, were measured the thickness of
cartilage, counted the number of chondrocytes, determined the volumes nuclei of
chondrocytes and the density of volume of the collagens fibers. For the Scanning Electron
Microscope, was analyzed the cartilage surface in the three groups. The data were statistically
compared for the ANOVA and Tukey´s test. The results showed that there was an increase in
the weight in the animals of GOS and of GOT. In relation to training, the animals of GOT
obtained the best income in the TEMs. In relation to the thickness of the articular cartilage it
was observed a decrease in the superficial layer of the medial condyle in the GOS and GOT.
The number of chondrocytes was altered only in the GOS, that obtained an increase of the
34% on GC in the deep layer. The nuclear volume of chondrocytes in the superficial layer was
higher in the GC than the GOS .The same occurred in the medium layer when the two tibial
condyles, lateral and medial were assessed separately, but when the values of the epiphysial
cartilage was considered as a whole, we found that the volume nuclei of chondrocytes in the
GC was higher than the GOS and the GOT. For the collagen, the values of density of volume
of the collagen fibers was higher in the GOS and in the GOT than the GC. The Scanning
Electron microscopy showed the presence of degenerative lesions in both GOS and GOT. We
can conclude that the depression levels of estrogen produced important changes in the tibial
cartilage and that the physical activity doesn't have effects on these changes.
Key Words: Physical activity. Articular cartilage. Oophorectomy. Rat. Morphometry
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Médias das pesagens, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística........................................45
Tabela 2 - Valores das velocidades médias em cada TEM, seguidos pelo desvio padrão e significância estatística,
seguidas pelo desvio padrão e significância estatística...........................................................................47
Tabela 3 - Demonstrativo das médias das espessuras das zonas da cartilagem articular do côndilo lateral da tíbia
nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística.......................52
Tabela 4 - Demonstrativo das médias das espessuras das zonas da cartilagem articular do côndilo medial da tíbia
nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística.......................52
Tabela 5 - Demonstrativo das médias das espessuras das zonas da cartilagem articular da epífise proximal da tíbia
nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística......................53
Tabela 6 - Demonstrativo das médias do número de condrócitos das zonas da cartilagem articular do côndilo
lateral da tíbia nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância
estatística.................................................................................................................................................55
Tabela 7 - Demonstrativo das médias do número de condrócitos das zonas da cartilagem articular do côndilo
medial da tíbia nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância
estatística................................................................................................................................................ 56
Tabela 8 - Demonstrativo das médias do número de condrócitos das zonas da articular da epífise proximal da tíbia
nos diferentes grupos avaliados seguidas pelo desvio padrão e significância
estatística................................................................................................................................................ 56
Tabela 9 - Demonstrativo das médias do volume nuclear dos condrócitos das zonas da cartilagem articular do
côndilo lateral da tíbia entre os diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância
estatística.................................................................................................................................................59
Tabela 10 - Demonstrativo das médias do volume nuclear dos condrócitos das zonas da cartilagem articular do
côndilo medial da tíbia entre os diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e
significância estatística............................................................................................................................59
Tabela 11 - Demonstrativo das médias volume nuclear do condrócitos das zonas da cartilagem articular da epífise
proximal da tíbia entre os diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância
estatística.................................................................................................................................................60
Tabela 12 - Demonstrativo das médias da densidade de volume do colágeno no côndilo lateral da tíbia entre os
diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância
estatística.................................................................................................................................................63
Tabela 13 - Demonstrativo das médias da densidade de volume do colágeno no côndilo medial da tíbia entre os
diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância
estatística.................................................................................................................................................63
Tabela 14 - Demonstrativo das médias da densidade de volume do colágeno cartilagem articular da epífise
proximal da tíbia entre os diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância
estatística.................................................................................................................................................63
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação esquemática da epífise proximal da tíbia (A), demonstrando os cortes perpendiculares à
superfície da cartilagem (B)....................................................................................................................38
Figura 2 – Representação esquemática do sistema teste utilizado para a determinação da densidade do volume de
colágeno. Picrosirius; aumento 400X. ...................................................................................................40
Figura 3 - Representação esquemática da epífise proximal da tíbia (A), montada em base apropriada para a
microscopia eletrônica de varredura (C).................................................................................................42
Figura 4 - Médias das pesagens obtidas no pré-operatório, em cada um dos três testes de esforço máximo e no dia
da eutanásia, para os animais do GC, GOS e GOT.................................................................................44
Figura 5 - Os dados mostram a velocidade máxima média obtida no GC, GOS e GOT..........................................46
Figura 6 - Os dados mostram a média das velocidades do treinamento do GOT e da atividade do GC e GOS nos
três meses do experimento.......................................................................................................................47
Figura 7 - Cortes histológicos da cartilagem articular da tíbia mostrando as zonas superficial (S), média (M),
profunda (P) e calcificada (C), e o aspecto dos condrócitos (setas) nas lacunas nos três grupos
estudados (GC, GOS e GOT) HE; barra= 10µm.....................................................................................49
Figura 8 - Cortes histológicos da cartilagem articular da tíbia mostrando a distribuição das fibras colágenas nas
zonas da cartilagem nos três grupos estudados (GC, GOS e GOT). Picrosirius; aumento:
400X........................................................................................................................................................61
Figura 9 - Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GC
demonstrando superfície irregular com a presença de algumas lascas (seta branca) e fissuras (seta
preta). Aumento: 1.000X.........................................................................................................................65
Figura 10 - Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GOS
demonstrando área de degeneração da cartilagem articular com exposição de osso subcondral
(estrela); a seta indica a cartilagem articular nas margens da região degenerada. Aumento:
1.000X.....................................................................................................................................................65
Figura 11 - Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GOT
demonstrando área degenerada com a presença de condrócitos (interior da elipse), lascas (seta negra) e
fissuras profundas (seta branca). Aumento: 1.000X...............................................................................65
Figura 12 - Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GC
evidenciando superfície irregular com rede colágena. Aumento: 10.000X............................................66
Figura 13 - Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GOS
evidenciando condrócitos (seta) da cartilagem articular nas margens de região degenerada. Aumento:
10.000X...................................................................................................................................................66
Figura 14 - Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GOT
evidenciando fissura profunda (indicada na 11 com uma seta branca). Fibras colágenas (setas brancas);
condrócitos (seta negra). Aumento: 10.000X........................................................................................66
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......... .........................................................................................21
2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 25
3 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 27
3.1 CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DAS CARTILAGENS ARTICULARES ................................................................................................... 27
3.2 EFEITOS DA DEPRIVAÇÃO E ESTRÓGENOS SOBRE AS CARTILAGENS ARTICULARES ...................................................................... 29
3.3 EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO NAS CARTILAGENS ARTICULARES ................................................................................................... 30
4 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 33
4.1 ANIMAIS.............................................................................................................. 33
4.2 OOFORECTOMIA.................................................................................................33
4.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ....................................................................... 34
4.4 CITOLOGIA VAGINAL E EXAME DE SANGUE............................................ 35
4.5 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS............................................................................. 35
4.6 MICROSCOPIA DE LUZ..................................................................................... 36
4.6.1 Preparação do Material para Análise ao Microscópio de Luz........................ 36
4.6.2 Análise Morfométrica e Estereológica............................................................... 38
4.6.2.1 Análise da Espessura das Zonas (camadas) da Cartilagem Articular ....................39
4.6.2.2 Análise da Densidade Numérica de Condrócitos .................................................. 39
4.6.2.3 Determinação do Volume dos Núcleos dos Condrócitos...................................... 39
4.6.2.4 Determinação da Densidade de Volume do Colágeno.......................................... 40
4.7 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ....................................... 41
4.7.1 Preparação do Material para Análise à Microscopia Eletrônica de Varredura..............................................................................................................41
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................42
5 RESULTADOS .................................................................................................... 44
5.1 VARIAÇÃO DO PESO DOS ANIMAIS ............................................................. 44
5.2 DESEMPENHO FÍSICO ...................................................................................... 45
5.3 RESULTADO DAS ANÁLISES MORFOMÉTRICA E ESTEREOLÓGICA .............................................................................................. 48
5.3.1 Análise da Espessura das Zonas da Cartilagem Articular ............................. 50
5.3.2 Análise da Densidade Numérica dE Condrócitos............................................. 53
5.3.3 Determinação do Volume dos Núcleos dos Condrócitos.................................. 57
5.3.4 Determinação da Densidade de Volume do Colágeno ..................................... 60
5.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ......................................... 64
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 68
6.1 VARIAÇÃO DO PESO DOS ANIMAIS ............................................................. 69
6.2 DESEMPENHO FÍSICO ...................................................................................... 70
6.3 ANÁLISE MORFOMÉTRICA E ESTEREOLÓGICA........................................ 70
6.3.1 Análise da Espessura das zonas (camadas) da Cartilagem Articular ........... 70
6.3.2 Análise da Densidade Numérica de Condrócitos.............................................. 71
6.3.3 Determinação do Volume dos Núcleos dos Condrócitos.................................. 72
6.3.4 Determinação da Densidade de Volume do Colágeno ..................................... 73
6.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VAREDURA............................................ 74
7 CONCLUSÕES ................................................................................................... 76
REFERÊNCIAS .................................................................................................. 78
INTRODUÇÃO
21
1 INTRODUÇÃO
O tecido conjuntivo é formado por células e matriz extracelular. A matriz é constituída
principalmente por três tipos de moléculas: colágenos, proteoglicanos (PGs) e glicoproteínas.
A cartilagem articular é um tipo de tecido conjuntivo que reveste as superfícies dos ossos nas
articulações sinoviais e tem funções biomecânicas de absorção de choques e distribuição de
peso, com um baixo coeficiente de atrito (LEVANON; STEIN, 1991; RASCH, 1991;
HARDINGHAM et al., 1992; HEISE; TOLEDO, 1993; TRATTNIG, 1997; HUBER et al.,
2000). É constituída por células (condrócitos) e matriz extracelular (BURSTEIN et al., 2000).
A matriz extracelular cartilagínea é constituída por uma rede de fibrilas de colágeno II,
V e XI e uma grande quantidade de PGs (HARDINGHAM et al., 1992; TRATTNIG, 1997;
HUBER et al., 2000). Variações na quantidade de colágeno têm uma influência direta no
comportamento mecânico da cartilagem articular (O’CONNOR et al., 1988). Desse modo, a
cartilagem depende totalmente da integridade da rede macromolecular que forma a matriz
extracelular. O colágeno é responsável pela resistência à deformação e os PGs atuam frente às
forças de compressão (ROUGHLEY;WHITE, 1980; SCHMIDT et al, 1990).
Os PGs são macromoléculas constituídas por um esqueleto protéico, ligado a cadeias
de glicosaminoglicanos (GAGs) (HASCALL; KIMURA, 1982; VAN KUPPEVELT et al.,
1984; RUOSLAHTI; YAMAGUCHI, 1991; YANAGISHITA, 1993; BRANDAN, 1994;
NISHIMURA et al., 1996; HUBER et al., 2000). Estas moléculas permitem a hidratação da
matriz e estabilização da rede colágena (MAROUDAS, 1976; PALMOSKI; BRANDT, 1981;
O’CONNOR, 1988; WIGHT et al., 1991; HARDINGHAM et al., 1992; SÄÄMÄMEN et al.,
1994; CULAV et al., 1999; HUBER et al., 2000).
O PG predominante da cartilagem articular é o agrecam, um PG de alto peso
molecular. Devido ao arranjo macromolecular das fibrilas colágenas entremeadas por
moléculas de agrecam, a matriz é altamente hidrofílica (MCDEVITT; MUIR, 1976;
GRODZINSKY, 1983; HARDINGHAM et al., 1992; STEVENS; LOWE, 1997; HUBER et
al., 2000).
A estrutura da matriz extracelular da cartilagem articular varia consideravelmente com
diferentes fatores, entre eles, a idade e a deprivação de hormônios estrogênios, no caso da
22
mulher (ROUGHLEY, 2001; CHRISTGAU et al., 2004). Mudanças na estrutura da matriz
cartilaginosa resultam em um tecido com menor capacidade para suportar o estresse mecânico
(LOESER, 2000; HULDELMAIER et al., 2001) ficando mais sensível a doenças.
A manutenção das propriedades físicas e da estrutura e função da cartilagem articular
dependem do movimento e das cargas sobre ela (PALMOSKI et al., 1980; KIVIRANTA et
al., 1987; AROKOSKI et al., 1993; VAN DEN HOOGEN et al., 1998). Estudos mostram que
em animais jovens, a carga contribui para o desenvolvimento e em adultos para a conservação
da matriz extracelular (SÄÄMÄMEN et al., 1994).
A osteoartrose ou doença degenerativa articular está entre as causas mais comuns de
dor, incapacidade e diminuição da qualidade de vida em indivíduos de meia idade e idosos
(ATRA, 1995; NEWTON et al., 1997). A incidência desta doença aumenta com a idade, mas
não é causada apenas pelo envelhecimento (NEWTON et al., 1997), podendo também ocorrer
devido a vários fatores (NEWTON et al., 1997; PARKER et al., 2003), incluindo a pós-
menopausa (CHRISTGAU et al., 2004; HOEG-ANDERSEN et al., 2004). É mais comum em
mulheres do que em homens e, naquelas, mais comum após a menopausa. Esta alteração
crônica produz problemas econômicos e sociais significantes, principalmente quando incide
sobre joelhos e a coluna vertebral (ATRA, 1995; WALKER, 1996).
Na prática médica é muito importante dirigir a atenção a estes problemas, pois a
prevalência da osteoartrose vai aumentar com o aumento progressivo da idade média da
população nas próximas décadas (WARD; TIDSWELL, 1987; WALKER, 1996).
Mulheres na menopausa podem se beneficiar de exercícios aeróbios tais como
programas de caminhada ou de exercícios na água como estratégias de proteção articular
contra a degeneração da cartilagem, segundo Loeser (2000).
Diversos são os relatos na literatura sobre as alterações morfológicas na cartilagem
articular de animais jovens e em envelhecimento após exercícios moderados (PALMOSKI;
BRANDT, 1981; KIVIRANTA et al., 1988; SÄÄMÄMEN et al., 1988; VAN DEN
HOOGEN et al., 1998; DE GROOT et al., 1999; JONES et al., 2000; HULDELMEIER et al,
2001), excessivos (ARAKOSKI, 1993; BUCKWALTER, 1995; PAP et al., 1998) ou
imobilização (HÄÄPALA et al., 1999), porém, não foram encontradas informações após
atividade física aeróbica. Em relação aos estudos sobre o movimento a maior parte dos
autores se preocupa com parâmetros fisiológicos e não com as alterações morfológicas
23
articulares relacionadas ao exercício. Deste modo, o presente trabalho visa detectar possíveis
alterações morfológicas na cartilagem articular de joelhos de ratas ooforectomizadas, quando
submetidas ou não à atividade física de corrida em esteira.
OBJETIVOS
25
2 OBJETIVOS
• Utilizando como modelo experimental o rato Wistar, verificar as alterações que
ocorrem na cartilagem articular da epífise proximal da tíbia, após a menopausa.
• Verificar se a realização de exercícios físicos aeróbicos aplicados a ratas
ovariectomizadas influencia a espessura da cartilagem, a densidade numérica
dos condrócitos, a densidade de volume do colágeno, e a morfologia
ultraestrutural da superfície articular da cartilagem articular da epífise proximal
da tíbia.
A importância clínica e a inexistência de trabalhos sobre o tema em animais de
experimentação justificam a realização do presente trabalho. Os resultados poderão servir
como base para a realização de trabalhos fisiológicos e em patologia em cartilagens
articulares.
REVISÃO DE LITERATURA
27
3 REVISÃO DE LITERATURA
Neste capitulo será apresentada revisão da literatura sobre o tema, cujos tópicos serão
abordados na seguinte ordem: características estruturais das cartilagens articulares, alterações
da cartilagem articular devidas a deprivação de hormônios estrogênicos e efeitos do exercício
físico nas cartilagens articulares.
3.1 CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DAS CARTILAGENS ARTICULARES
As cartilagens articulares, que revestem as superfícies dos ossos nas articulações
sinoviais têm origem a partir de moldes de cartilagem hialina. Quando ocorre a maturidade
esquelética, a cartilagem articular é o único indício do molde de cartilagem original e persiste
durante toda a vida adulta (HUBER et al., 2000).
A cartilagem articular permite a realização de movimentos entre as superfícies
articulares com baixo índice de atrito, serve como suporte de peso, e também transmite estas
cargas igualmente de um segmento do corpo para outro (ECKSTEIN et al., 1999; HUBER et
al., 2000; ECKSTEIN et al., 2006).
Por ser um tipo de tecido conjuntivo, caracterizado como aneural, avascular e alinfático
(ODA, 2005), mecanismos normais de reparo tecidual, como recrutamento de células para o
local da lesão, não ocorrem nas cartilagens articulares (HARDINGHAM et al., 2002). A
cartilagem articular depende principalmente de difusão para o transporte molecular de
nutrientes (FETTER et al., 2006). A cartilagem articular é um tecido aparentemente simples
que contém apenas um tipo de célula (condrócitos). No entanto tem uma matrix extracelular
altamente organizada (MAFFULI; KING, 1992; HARDINGHAM et al., 2002).
Os condrócitos são responsáveis pela manutenção da matriz (BUCKWALTER;
MANKIN, 1998; CORVOL 2000; POOLE et al., 2001; ODA, 2005), através do controle da
produção e renovação dos seus componentes (colágeno, proteoglicanas e proteinas não
colágenas), sendo altamente influenciados por citocinas, fatores de crescimento, sinais
28
elétricos e mecânicos. A renovação da matriz depende da capacidade dos condrócitos em
detectar alterações na composição macromolecular e organização da matriz, e em responder
através da síntese de tipos e quantidades adequadas de novas moléculas (HARDINGHAM et
al., 1994; BUCKWALTER; MANKIN, 1998). Sua forma e concentração volumétrica mudam
em função da profundidade na cartilagem articular, parecendo estar relacionadas com a
estabilidade mecânica da matriz (WU; HERZOG, 2002). Segundo Buckwalter e Mankin,
(1998) e Huber et al. (2000), as propriedades mecânicas e biológicas da cartilagem articular,
dependem fundamentalmente da interação entre os condrócitos e a matriz.
A matriz extracelular tem 60% de seu volume total representado pela água, enquanto a
matriz orgânica é composta por, aproximadamente, 60% de fibrilas colágenas tipo II (80 –
90%), VI, IX, X e Xl, 30% de proteoglicanas e 10% de proteinas não colágenas
(MOLLENHAUER et al., 1984; MAFFULI; KING, 1992; HARDINGHAM et al., 1994;
BUCKWALTER; MANKIN, 1998; CULAV et al., 1999; HUBER et al., 2000; KIM et al.,
2001; HARDINGHAM et al., 2002; ODA, 2005). As fibrilas colágenas garantem à cartilagem
articular, resistência a forças de tensão. As proteoglicanas proporcionam, resistência à
compressão (BUCKWALTER; MANKIN, 1998; CULAV et al., 1999; HARDINGHAM et
al., 2002; POOLE et al., 2001), enquanto as proteínas não colágenas, parecem influenciar nas
interações entre os condrócitos e a matrix (BUCKWALTER; MANKIN, 1998; CULAV et al.,
1999; POOLE et al., 2001).
As proteoglicanas são caracterizadas por uma proteína central, ligada covalentemente a
uma ou mais cadeias de glicosaminoglicanas (CULAV et al., 1999; ODA, 2005;
BOGOSLAVSKY, 2006). O principal tipo de proteoglicana, o agrecan, juntamente com as
glicosaminoglicanas, possui cargas negativas e tem propensão a atrair íons, criando um
desbalanceamento osmótico, resultando na absorção de água pelo tecido. Esta absorção de
água fornece à cartilagem resistência a compressão (CULAV et al., 1999; HARDINGHAM et
al., 1992; HARDINGHAM et al., 2002).
A combinação das proteoglicanas da matriz, a orientação das fibras colágenas, e a forma
dos condrócitos parecem estar intimamente ligadas e adaptadas para otimizar a estabilidade
mecânica e a capacidade da cartilagem de suportar peso (WU; HERZOG, 2002).
29
A habilidade da cartilagem articular, em sofrer deformação reversível depende da
organização estrutural, incluindo a organização especifica das macromoléculas da matriz e
dos condrócitos (KUETTNER, 1991; HUBER et al., 2000).
3.2 EFEITOS DA DEPRIVAÇÃO DE ESTRÓGENOS SOBRE AS CARTILAGENS
ARTICULARES
Diversos estudos indicam que a deficiência de estrógeno acelera a remodelação e
aumenta a erosão da cartilagem articular (CHRISTGAU et al., 2004). Alguns estudos sobre
cartilagem articular em mulheres na pós-menopausa sugerem que depois da menopausa, há
perda de cartilagem articular mais rapidamente do que em homens da mesma idade
(CHRISTGAU et al., 2004;). Wluka et al. (2004) demonstraram que mulheres na pós-
menopausa apresentam uma redução de 2,4% ao ano do volume total da cartilagem articular
da tíbia.
O papel dos hormônios sexuais na osteoartrose permanece controverso. Existem
evidencias epidemiológicas que sugerem que os hormônios sexuais, particularmente o
estrógeno, tem um papel significante em mulheres com osteoartrose (PARKER et al., 2003).
Receptores de estrógeno, progesterona e testosterona estão presentes no tecido cartilaginoso
do feto humano e andrógenos podem estimular a proliferação de condrócitos assim como a
síntese de colágeno e PGs (DING et al., 2003). Vários estudos indicam que a terapia de
reposição de estrógeno reduz a incidência e progressão de osteoartrose em mulheres na pós-
menopausa (MOURITZEN et al., 2003; PARKER et al., 2003; CHRISTGAU et al., 2004).
Mulheres na pós-menopausa podem beneficiar-se com um aumento de volume de cartilagem
fazendo terapia de reposição hormonal (DING et al., 2003).
O colágeno tipo II, corresponde a 85% do total de colágeno da cartilagem articular
(KIM et al., 2001). O produto de degradação do colágeno tipo II (CTX II) é um marcador da
degradação da cartilagem. Sua mensuração é realizada através de amostras de urina
(MOURITZEN et al., 2003; CHRISTGAU et al., 2004). Estudos têm demonstrado que níveis
aumentados de CTX II estão associados com imagens radiológicas de erosão de cartilagem
articular (CHRISTGAU et al., 2001; GARNERO et al., 2001). Mouritzen et al. (2003)
30
mostraram que a concentração de CTX II na urina de mulheres na pós-menopausa era
significativamente maior do que em mulheres na pré-menopausa. Christgau et al. (2004)
demonstraram que ratas ooforectomizadas apresentam alta excreção de CTX II através da
urina, após nove semanas da remoção dos ovários, comparadas com ratas não
ooforectomizadas. Esta alta excreção de CTX II corresponde radiograficamente a um aumento
da erosão da superfície da cartilagem articular do joelho (GARNERO et al., 2001).
3.3 EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO NAS CARTILAGENS ARTICULARES
Existem diversos relatos na literatura, sobre alterações morfológicas na cartilagem
articular de animais após exercícios moderados ou excessivos (BUCKWALTER, 1995). Em
animais jovens, cargas moderadas contribuem para o desenvolvimento e em adultos para a
conservação da matriz extracelular (SÄÄMÄMEN et al., 1994). Tecidos jovens respondem
melhor às forças do que tecidos mais envelhecidos (LANE; BUKWALTER, 1993).
Geralmente, a redução do estresse e da tensão diminui a organização da matriz cartilagínea e a
função de síntese celular, enquanto que o aumento destas forças leva ao aumento das suas
funções.
O exercício moderado melhora as propriedades biomecânicas e biológicas da cartilagem
articular (KIVIRANTA et al., 1988). O exercício de carga moderada na cartilagem de
articulações de joelhos de ratos, cães e coelhos causou aumento da síntese e concentração de
PGs e GAGs (KIVIRANTA et al., 1987), aumento do volume da cartilagem (JONES et al.,
2000) e adaptação ao esforço, além de estimular os condrócitos a produzir os elementos que
compõem a matriz extracelular (BIHARI-VARGA et al., 1984). Da mesma forma, Otterness
et al. (1998), mostraram que o exercício moderado mantém o conteúdo de PGs da matriz
extracelular em animais jovens e a falta do exercício pode acarretar na diminuição destes
elementos. Cargas constantes são importantes para manutenção da saúde da cartilagem
(HALL et al., 1991; KIM et al., 1994).
Estudos mostram que articulações saudáveis de indivíduos de diferentes idades
apresentam boa tolerância a exercícios prolongados, sem conseqüências adversas e sem
promover o desenvolvimento de doença degenerativa (LANE; BUCKWALTER, 1993).
31
Leanne et al. (1999) sugerem que níveis moderados de atividade física, se realizados
respeitando os limites de conforto não aumentam o risco de desenvolvimento de osteoartrose.
Yasunori et al. (2001) demonstram que a atividade física em ratas ooforectomizadas aumenta
significativamente os níveis de progesterona no sangue.
Entretanto, forças acima de níveis críticos podem levar a ruptura e degeneração do
tecido cartilagíneo. No caso do exercício físico, o estresse continuado nas articulações pode
resultar em microtrauma e degeneração da cartilagem, cuja gravidade depende da freqüência,
intensidade e duração do exercício (MAFFULI; KING, 1992). Assim por exemplo, a
participação em esportes de alto impacto, por período prolongado, pode aumentar o risco de
desenvolvimento de degeneração grave (LEANNE et al., 1999), pois pode estimular um
processo de reparo exagerado (MARTI et al., 1989). O primeiro sinal da degeneração da
cartilagem articular induzida pelo exercício, é provavelmente fadiga e falência, pelo estresse
repetitivo, das fibras colágenas e PGs da matriz (ANDERSON, 1962).
Exercícios forçados causam desagregação da cartilagem com diminuição das PGs em
animais adultos jovens (ARAKOSKI et al., 1993). Ocorre um aumento do fluxo de água
levando a ruptura da matriz, diminuindo a integridade da cartilagem e aumentando a
susceptibilidade às alterações degenerativas (BUCKWALTER, 1995). Estudos de Pap et al.
(1998) demonstraram que o esforço excessivo leva ao aumento da produção e da atividade das
enzimas que degradam as PGs ocorrendo degradação da matriz com diminuição dos
componentes extracelulares (PGs e condroitin-4 e 6 sulfato).
Como se pode deduzir, pela análise da literatura apresentada, são escassos os trabalhos
que relacionam exercícios físicos e alterações morfológicas e quantitativas em cartilagens
articulares após a menopausa.
MATERIAIS E MÉTODOS
33
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Para a realização deste estudo foram utilizados 24 ratas com 6 meses de idade da
linhagem Wistar provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade de São Paulo.
Os animais foram distribuídos em 3 grupos com oito ratas cada:
• GC (grupo controle). Ratas com seis meses de idade sem ooforectomia e sem
atividade física.
• GOS (grupo operado e sedentário). Ratas com seis meses de idade com
ooforectomia bilateral sem atividade física.
• GOT (grupo operado e treinado). Ratas com seis meses de idade com
ooforectomia bilateral mais atividade física durante 3 meses.
Todos os animais foram eutanasiadas com 9 meses de idade.
4.2 OOFORECTOMIA
As ratas do GOS e GOT foram submetidas a ooforectomia bilateral sob anestesia
geral com injeções intraperitoneais de Ketamina (75mg/kg) e diazepan (5mg/kg). (TUFFERY,
1995).
Com o animal em decúbito dorsal, foi realizada uma pequena incisão na região pré-
umbilical mais precisamente, no centro do abdôme, com a finalidade de expor as vísceras
pélvicas e abdominais. Os ovários e tubas uterinas foram tracionados para fora da cavidade
abdominal, através daquela abertura, por uma pinça, seguindo-se sutura nas tubas dos dois
34
lados para posterior remoção bilateral dos ovários. Ao final, a parede abdominal do animal foi
novamente suturada.
Após as cirurgias, foi administrado por via subcutânea o antiinflamatório e analgésico
Flunixin-Meglumine uma vez ao dia durante 3 dias consecutivos, a uma dosagem de 2,5
mg/kg (FLECKNELL, 1999).
Depois do procedimento, as ratas ficaram em observação por uma semana,
permanecendo alojadas em caixas de polipropileno providas de bebedouro e comedouro, e
mantidas em condições ambientais controladas de temperatura (22ºC) e de iluminação (ciclo
de 12 horas claro/12 horas escuro. Passado este período foi iniciada a atividade física
(YASUNORI et al., 2001). Os animais do GOT realizaram atividade física, constando de
corrida em esteira, cinco vezes por semana conforme protocolo descrito no item a seguir. Para
todos os grupos foi fornecida ração comercial referência para ratos (Nuvital®) e água ad
libitum).
4.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
O programa de atividade física teve duração de 3 meses, e foi dividido em períodos de 4
semanas.
Um teste de esforço máximo (TEM) foi realizado no início do experimento em uma
esteira elétrica com velocidade de 0,3k/h. A cada 4 minutos a velocidade da esteira foi
aumentada na mesma proporção (0,3km/h) (SILVA et al., 1997). Os TEMs foram realizados a
cada 4 semanas no GOT.
Após o TEM, os animais do GOT foram submetidos a 3 meses de treinamento em
esteira, 5 dias por semana, com velocidade progressiva até 60% daquela conseguida no teste
de esforço. Na primeira semana após o teste, os animais correram por 30 minutos,
aumentando este tempo em 10 minutos por semana até chegar a 60 minutos na quarta semana,
onde ao final da mesma, outro TEM foi realizado para ajustar a intensidade do exercício para
as próximas 4 semanas.
35
Os animais do GC e GOS foram submetidos à atividade física apenas uma vez por
semana durante 10 minutos com 30% do seu respectivo teste de esforço. A cada quatro
semanas os animais do GC e GOS foram também, submetidos a testes de esforço máximo. Os
dados obtidos para as velocidades para os três grupos de animais foram tabulados, as médias
calculadas e comparadas estatisticamente.
Os animais de todos os grupos foram pesados antes do experimento, antes de cada
TEM e antes da eutanásia. As médias dos pesos foram calculadas, os dados tabulados e
comparados estatisticamente.
4.4 CITOLOGIA VAGINAL E EXAME DE SANGUE
A duração do ciclo estrogênico de ratas ocorre em torno de 4 dias e é caracterizada por
quatro fases: diestro, próestro, estro e metaestro (MARCONDES et al., 2002; MARTINS et
al., 2005). A fase estro corresponde à máxima estimulação estrogênica no tecido.
Foram realizadas oito citologias vaginais, nos animais do GOS e GOT, divididas em
dois períodos: quatro (uma por dia) e após um mês, mais quatro (uma por dia).
Após a anestesia, no momento da eutanásia, os corações foram evidenciados por meio
de toracotomia e antes da lavagem do sistema, retiramos uma pequena amostra de sangue dos
animais do GC, GOS e GOT, as quais foram enviadas para um laboratório especializado, para
dosagem do estradiol através do método de Radioimunoensaio. Tanto a citologia vaginal
quanto o exame de sangue dos animais do GOS e GOT, mostraram resultados compatíveis
com fêmeas castradas.
4.5 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS
O protocolo sob o nº 940/2006 de eutanásia dos animais, foi submetido à Comissão de
Bioética da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
36
Ao final, os animais foram pesados e eutanasiados com dose excessiva de anestésico,
via peritoneal (Tiopental - Sigma® , USA, 40mg/kg de peso corpóreo).
4.6 MICROSCOPIA DE LUZ
Após a anestesia, em cinco animais de cada grupo, os corações, evidenciados por meio
de toracotomia, foram perfundidos através do ventrículo esquerdo com solução salina
tamponada fosfatada (PBS, Sigma®, USA) a 0,1M e pH 7,4 e heparina a 2% (Roche®, BRA)
para a lavagem do sistema arterial e venoso. Posteriormente, foi realizada perfusão com
solução fixadora (paraformaldeido 40%).
4.6.1 Preparação do Material Para Análise ao Microscópio de Luz
Após a última sessão de corrida, os animais dos três grupos foram eutanasiados e
manipulados em prancha de cortiça. Foram retiradas as articulações dos joelhos esquerdos dos
animais, sob microscópio estereoscópico. Durante o procedimento cirúrgico, foi feita
irrigação contínua com solução fisiológica para manter os espécimes livres de resíduos
(STOCKWELL, 1967; BLOEBAUM; WILSON, 1980).
Foram utilizadas as patas traseiras, pois, são as que mantêm a propulsão durante a
marcha. Foi examinada a cartilagem da epífise proximal da tíbia por ser um local comum de
degeneração devido à relação com a descarga do peso corporal em várias espécies (KÄÁB et
al., 1998). Foram dissecados os músculos das regiões anterior e posterior do joelho, expondo
a articulação. A cápsula foi então aberta, os ligamentos cruzados e colaterais foram
seccionados e a epífise proximal da tíbia separada e isolada.
Para microscopia de luz, as peças foram colocadas em solução de paraformoldeido 40%
em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, durante 24 horas a 4ºC. Após lavagem, foi realizada a
descalcificação das peças em solução de EDTA (ácido etileno diamino tetracético) a 10%
dissolvidos no mesmo tampão, durante 5 meses, ou até que as peças não apresentassem mais
37
cálcio (esta verificação pode ser feita a partir de uma reação química de 5ml da solução, na
qual os fragmentos estavam imersos, composta por 1ml de oxalato de amônio e 1ml de
hidróxido de amônia). Após a descalcificação, as peças foram lavadas em água destilada,
desidratadas em séries crescentes de álcoois (70% ao 100%), diafanizadas em xilol e incluídas
em parafina a 65ºC formando blocos. Destes blocos foram obtidos 6 cortes histológicos com 6
µm de espessura, perpendiculares à superfície da cartilagem, com intervalo de 300µm (Figura
1). Os cortes foram coletados em lâminas histológicas e corados através dos seguintes
métodos:
• Hematoxilina-Eosina (HE), para análise da espessura das camadas da
cartilagem, da cartilagem como um todo, quantificação dos condrócitos e
determinação dos volumes dos núcleos da cartilagem articular.
• Picrosirius F3BA (JUNQUEIRA et al., 1979) para quantificação de colágeno.
As fibras colágenas fora examinadas por meio de microscópio dotado de luz
polarizada, processo no qual, as fibras são visíveis por sua coloração e
birrefringência.
38
Figura 1 – Representação esquemática da epífise proximal da tíbia (A), demonstrando os cortes perpendiculares
à superfície da cartilagem (B).
4.6.2 Análise Morfométrica e Estereológica
O estudo morfométrico e estereológico foi feito utilizando-se um sistema digital de
processamento e análise de imagens em computador, do Laboratório de Anatomia da FMVZ.
O sistema consiste de Microscópio Leica, ao qual está acoplada uma microcâmera de vídeo
Sony que capta as imagens das lâminas histológicas, e as transmite para um computador
equipado com processador Pentium IV e placa digitalizadora. A análise foi realizada em
imagens digitalizadas, de maneira semi-automática, com programa de análise Leica. Neste
estudo foram considerados os seguintes parâmetros:
A
B
39
4.6.2.1 Análise da Espessura das Zonas (camadas) da Cartilagem Articular
A espessura de cada uma das três zonas da cartilagem e da cartilagem total foi
determinada nas imagens digitalizadas com objetivas de aumento de 10X. A exclusão da zona
calcificada deveu-se a dificuldade de diferenciação desta com o osso subcondral, o que
poderia comprometer as análises (ODA, 2005). Foram feitas, em cada um dos 6 cortes de
cada animal, a medida da espessura de cada zona, em 6 locais (3 em cada côndilo),
totalizando 36 medidas para cada zona por animal. A seguir, foram calculados a média e o
desvio-padrão para cada zona, nos 5 animais de cada grupo.
4.6.2.2 Análise da Densidade Numérica de Condrócitos
Para contagem dos condrócitos, foram utilizados 6 cortes não sucessivos por animal,
com intervalo de 300 µm entre os cortes, para evitar a contagem dupla de uma mesma célula.
Segundo Lothe et al. (1979), a contagem de condrócitos é representativa quando se utiliza a
média de 6 cortes. Foram contados os núcleos dos condrócitos de cada zona situados em 4
campos da cartilagem (2 campos no côndilo, medial e 2 no lateral, de cada animal) através de
imagens digitalizadas utilizando o programa de análise Axio Visio (Zeiss).
4.6.2.3 Determinação do Volume dos Núcleos dos Condrócitos
Foram feitas medidas dos diâmetros maior e menor do núcleo de cada condrócito
situado em cada um dos 6 campos da cartilagem (3 por côndilo, medial e lateral, sendo 1 por
zona da cartilagem) de cada animal, através de imagens digitalizadas utilizando o programa
de análise Axio Visio (Zeiss). O cálculo do volume nuclear foi feito segundo a fórmula: V =
a2 x b/1,91 onde, V = volume nuclear, a = diâmetro menor do núcleo, b = diâmetro maior do
núcleo e 1,91 é uma constante utilizada (SALVATORE; SCHREIDER, 1947).
40
4.6.2.4 Determinação da Densidade de Volume do Colágeno
A densidade de volume expressa a fração do volume ocupado pela estrutura de interesse
pelo volume total (volume referência). Para estimar a densidade de volume, um sistema teste
composto por pontos aleatórios delimitados por linhas de inclusão e exclusão, sistemática e
uniformemente alocados, foi sobreposto sobre as secções de referência usadas para a
estimação da densidade numérica, utilizando objetiva de 40 vezes (Figura 2). O número total
de pontos sobre o espaço referência será obtido (P[CA]); de igual forma, o número total de
pontos sobre as fibras colágenas será registrado (PC) e então, a seguinte equação será utilizada
(BRÜEL; OXLUND, 2002; WULFSOHN et al., 2004):
VV[C] (fibras colágenas) = ∑P[C] (fibras colágenas) / ∑P[CA] (cartilagem articular)
Onde:
P[C] (fibras colágenas) = número de pontos que tocam as fibras colágenas da cartilagem
articular;
P[CA] = número total de pontos que tocam a cartilagem articular.
Figura 2 - Representação esquemática do sistema teste utilizado para a determinação da densidade do volume de colágeno. Picrosirius; aumento: 400X.
41
4.7 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Outros três animais de cada grupo foram perfundidos através do ventrículo esquerdo,
utilizando-se uma bomba perfusora Masterflex® S/L® ,com solução salina tamponada
fosfatada (PBS, Sigma®, USA) a 0,1M e pH 7,4 e heparina a 2% (Roche®, BRA) para a
lavagem do sistema arterial e venoso. Posteriormente, foi realizada perfusão com solução
fixadora de Karnovsky modificado (Solução de glutaraldeído 3% [MerchTM] e formaldeído
1% [SigmaTM] em tampão cacodilato de sódio [EMSTM] [0.125M; pH 7.4]).
4.7.1 Preparação do Material Para Análise à Microscopia Eletrônica de Varredura
Após a fixação, as epífises proximais da tíbia foram isoladas do restante do osso através
de corte transversal, com a utilização de uma lâmina apropriada, caudalmente ao nível da
inserção da cartilagem articular. Em seguida, as peças foram lavadas em tampão fosfato 0,1M,
pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1%, desidratadas em séries crescentes de álcoois
(50%,70%, 90% e 100%) e no aparelho de ponto crítico (usando CO2), montadas em bases
apropriadas (Figura 3), seguida por recobrimento metálico com ouro por “sputtering” para
posterior observação ao microscópio eletrônico de varredura (LEO 435VP), localizado na
FMVZ/USP.
As eletromicrografias de varredura foram analisadas qualitativamente, observando-se
os aspectos gerais da superfície quanto a: regularidade (presença de elevações e depressões),
continuidade (crateras) e degeneração (existências de fissuras, lascas ou crateras).
42
B
A
Figura 3 - Representação esquemática da epífise proximal da tíbia (A) montada em base apropriada para a
microscopia eletrônica de varredura (B).
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises foram feitas pelo procedimento ANOVA ara a análise de variância e em
casos de identificação de efeitos significativos (P<0,05), utilizou-se o teste de Tukey. Foram
calculadas as médias de cada variável para cada unidade experimental (rato). As análises
foram feitas com estas médias. Foram testados os efeitos das variáveis: exercício (corrida e
sedentarismo), deprivação de hormônios e a interação exercício X deprivação sobre as
medidas de espessura da cartilagem, número de núcleos por unidade de área, volume dos
núcleos dos condrócitos, quantidade de matriz e condrócitos (em volume ponderado do total
das regiões estudadas).
RESULTADOS
44
5 RESULTADOS
Os resultados serão apresentados de acordo com os seguintes itens: variação do peso dos
animais, desempenho físico, análise morfométrica e estereológica, microscopia eletrônica de
varredura.
5.1 VARIAÇÃO DO PESO DOS ANIMAIS
A figura 4 e a tabela 1 mostram os resultados das pesagens dos animais. Como já citado,
os animais foram pesados no pré-operatório, nos testes de esforço máximo (1TEM, 2TEM,
3TEM) e na pré-eutanásia. Temos então, cinco medições para cada um dos grupos (GC, GOS
e GOT), (Figura 4).
Peso dos Animais
200220240260280
Pré-op
ratóri
o1 T
EM2 T
EM3 T
EM
Eutaná
sia
Período
gra
mas Grupo Controle
GOSGOT
Figura 4 - Médias das pesagens obtidas no pré-operatório, em cada um
dos três testes de esforço máximo e no dia da eutanásia, para os animais dos GC, GOS e GOT
Os valores das médias no GC foram de 234,37 (± 22,07) no pré-operatório 235 g
(±22,03) no primeiro TEM, 235,5 g (±19,61) no segundo TEM, 252,75 g (±49,98) no terceiro
TEM e 237g (±29,45 ) no dia da eutanásia. A comparação estatística das médias do pré-
45
operatório e no dia da eutanásia não mostrou diferença significante (P>0,05), (Tabela1).
O GOS obteve média de 229,75 g (±29,12) no pré-operatório, 231,75g (±23,16) no
primeiro TEM, 250,75 g (±31,90) no segundo TEM, 262,75g (±34,32) no terceiro TEM e
273,75g (±36,58) no dia da eutanásia. A comparação estatística das médias do pré-operatório
e no dia da eutanásia, para este grupo, mostrou diferença significante (P<0,05). Ou seja, os
pesos dos animais ao final do experimento foram significantemente maiores do que no início,
(Tabela1).
Os animais do GOT obtiveram médias de 228,75g (±22,97) no pré-operatório, 232g
(25,47) no primeiro TEM, 252,75g (±20,36) no segundo TEM, 249,25g (±22,72) no terceiro
TEM e 263,5 g (±23,12) no dia da eutanásia. A comparação estatística das médias do pré-
operatório e no dia da eutanásia mostrou diferença significante (P<0.01). Ou seja, do início
ao final do experimento, ganharam peso significantemente, (Tabela1).
A comparação entre os valores das médias dos pesos entre os grupos tanto no pré-
operatório como ao final do experimento, não mostrou diferença significante entre eles
(P>0,05), (Tabela1).
Tabela 1 - Médias das pesagens, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo - 2007
*Significante em relação ao pré-operatório no GOS; **Significante em relação ao pré-operatório no GOT.
5.2 DESEMPENHO FÍSICO
As figuras 5 e 6 e a tabela 2 mostram os resultados obtidos pelos animais nos TEMs. As
médias das velocidades máximas alcançadas no GC, GOS e GOT, foram calculadas a partir
Pesagens GC GOS GOT Pré-operatório 234,37 ± 22,07 229,75 ±29,12 228,75 ±22,97
1TEM 235 ±22,03 231,75 ±23,16 232 ±25,47 2TEM 235,5 ±19,61 250,75 ±31,90 252,75 ±20,36. 3TEM 252,75 ±49,98 262,75 ±34,32 249,25 ±22,72
Eutanásia 237 ±29,45 273,75 ±36,58* 263,5 ±23,12**
46
dos TEMs (Figura 5).
Velocidade
0
0,5
1
1,5
1 TEM 2 TEM 3 TEM
TEM
Km
/hGrupo ControleGOSGOT
Figura 5 - Os dados mostram a velocidade máxima média obtida no
GC, GOS e GOT
No GC, os animais apresentaram velocidade média de 0,93 Km/h (±0,25) no primeiro
TEM, 0,9 Km/h (±0,22) no segundo TEM e 0,67 Km/h (±0,13) no terceiro TEM. A
comparação estatística das médias das velocidades nos TEMs realizados pelos animais deste
grupo, mostrou diferença significante (P<0.05), ou seja as velocidades médias do 1TEM e
2TEM foram maiores do que do 3TEM, (Tabela 2).
Os animais do GOS apresentaram velocidade média de 0,63 Km/h (±0,25) no primeiro
TEM, 0,78 Km/h (±0,22) no segundo TEM e 0,95 Km/h (± 0,36) no terceiro TEM. A
comparação estatística das médias das velocidades nos TEMs realizados, não mostrou
diferença significante (P>0.05), (Tabela 2).
Os valores referentes à velocidade média dos animais do GOT foram de 0,82 Km/h
(±0,21) no primeiro TEM, 1,38 Km/h (±0,31) no segundo TEM e 1,08 Km/h (±0,31) no
terceiro TEM. A comparação estatística das médias das velocidades nos TEMs realizados,
neste grupo mostrou significância (P<0,01). Os valores das médias das velocidades do 2TEM
foram significativamente maiores que do 1TEM, (Tabela 2).
A comparação entre os valores das médias do 1TEM entre os grupos, mão mostrou
significância (P>0.05), (Tabela 2).
Os valores das médias comparadas entre os grupos no 2TEM, mostrou diferenças
significantes (P<0,01). As médias das velocidades do 2TEM do GC e GOS foram menores
47
do que do GOT, (Tabela 2).
A comparação entre os valores das médias no 3TEM entre os grupos, mostrou
significância (P<0,05). As velocidades médias do 3TEM no grupo GOT foram
significativamente maiores que no GC, (Tabela 2).
Tabela 2 - Valores das velocidades médias em cada TEM, seguidos pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo – 2007
TEM GC GOS GOT
1TEM 0,93 ±0,25a 0,63 ±0,25 0,82 ±0,21
2TEM 0,9 ±0,22***a 0,78 ±0,22# 1,38 ±0,31**
3TEM 0,67 ±0,13b 0,95 ± 0,36 1,08 ±0,31* ** Significante em relação ao 1TEM no GOT (P<0,01); *** Significante em relação ao GOT no 2TEM (P<0,01); # Significante em relação ao GOT no 2TEM (P<0,001); *Significante em relação ao GC no 3TEM(P<0,05). Letras diferentes em uma mesma coluna mostram diferença significante (P<0,05).
As médias das velocidades de treinamento para o GOT com 60% da velocidade máxima,
e da atividade física realizada para o GC e GOS com 30% da velocidade média, para os três
meses de treinamento serão mostrados na figura 6.
Velocidade
00,20,40,60,8
1
1º Mês 2º Mês 3º Mês
Período
Km/h
Grupo C (30% TEM)
GOS (30% TEM)
GOT (60% TEM)
Figura 6 - Os dados mostram a média das velocidades do
treinamento do GOT e da atividade GC e GOS nos três meses do experimento
48
5.3 RESULTADOS DAS ANÁLISES MORFOMÉTRICA E ESTEREOLÓGICA
A figura 7 mostra o aspecto dos cortes histológicos da cartilagem articular dos animais
dos 3 grupos, corados pela HE. Nestas figuras pode ser observada a distribuição dos
condrócitos nas 3 zonas da cartilagem articular da tíbia.
49
Figura 7 – Cortes histológicos da cartilagem articular da tíbia mostrando as zonas superficial (S), média (M),
profunda (P) e calcificada (C), e o aspecto dos condrócitos (setas) nas lacunas nos três grupos estudados (GC, GOS e GOT) HE; barra= 10µm
50
5.3.1 Análise da Espessura das Zonas da Cartilagem Articular
As tabelas 3, 4 e 5 mostram os resultados da análise da espessura das zonas superficial,
média e profunda da cartilagem articular, bem como a média da espessura total da cartilagem
nos côndilos lateral e medial no GC, GOS e GOT.
No GC, os animais apresentaram média da espessura de 6,13 (±0,99) para zona
superficial, 95,89 (±20,90) para a média e 58,56 (±10,07) para a profunda, com uma
espessura total média de 160,58 (±28,42) no côndilo lateral, (Tabela 3).
Para o côndilo medial, nos animais do mesmo grupo, foi observada média da espessura
de 5,30 (±0,71) na zona superficial, 132,84 (±23,05) na média e 61,63 (±1,05) na
profunda, com uma espessura total média de 199,77 (±21,64), (Tabela 4).
As médias totais das espessuras dos côndilos lateral e medial, para este grupo, foram 5,72
(±0,55) para zona superficial, 114,37 (±7,84) para a média e 60,10 (±5,29) para a profunda,
com uma espessura total média de 180,18 (±11,01), (Tabela 5).
No GOS, os valores das médias foram 7,14 (±0,95) para zona superficial, 103,88 (±39,05)
para a média e 64,42 (±13,09) para a profunda, com uma espessura total média de 175,44
(±41,96) no côndilo lateral, (Tabela 3).
Para o côndilo medial, nos animais do mesmo grupo, foi observada média da espessura de
7,16 (±0,67) na zona superficial, 122,71 (±48,85) na média e 62,76 (±8,21) na profunda,
com uma espessura total média de 192,63 (±50,75), (Tabela 4).
As médias totais das espessuras dos côndilos lateral e medial, para este grupo, foram 7,15
(±0,72) na zona superficial, 113,29 (±32,66) para a média e 63,59 (±10,19) para a profunda,
com uma espessura total média de 184,03 (±34,79), (Tabela 5).
No GOT, os animais apresentaram média da espessura de 6,35 (±0,50) para zona
superficial, 94,70 (±10,30) para a média e 65,57 (±8,79) para a profunda, com uma
espessura total média de 166,62 (±14,43) no côndilo lateral, (Tabela 3).
51
Em relação ao côndilo medial, nos animais do mesmo grupo, os valores das médias
foram 6,36 (±0,29) para zona superficial, 116,16 (±36,99) para a média e 58,79 (±14,91) para
a profunda, com uma espessura total média de 181,30 (±45,89), (Tabela 4).
As médias totais das espessuras dos côndilos lateral e medial, para este grupo, foram
6,36 (±0,21) na zona superficial, 105,43 (±22,20) para a média e 62,18 (±9,90) para a
profunda, com uma espessura total média de 173,96 (±31,85), (Tabela 5).
A comparação estatística dos valores das médias da espessura da zona superficial no
côndilo lateral, para o GC, GOS e GOT não mostrou significância (P>0,05), (Tabela 3). Para
o côndilo medial houve significância (P<0,01). As médias da espessura da zona superficial no
côndilo medial dos grupos GOS e GOT foram significativamente maiores que do GC, (Tabela
4). Em relação aos valores bicondilares houve diferença significante (P<0,01). O GC teve
média significativamente menor que o GOS, (Tabela 5).
A comparação estatística dos valores das médias da espessura da zona media tanto no
côndilo lateral quanto no medial, para os três grupos, não mostrou significância (P>0,05),
(Tabelas 3 e 4). O mesmo ocorreu para a zona profunda (P>0,05). O mesmo resultado foi
obtido em relação aos valores bicondilares (P>0,05), (Tabela 5).
A comparação estatística dos valores das médias das espessuras totais tanto no côndilo
lateral quanto no medial, para os três grupos, não mostrou significância (P>0,05), (Tabelas 3 e
4). O mesmo ocorreu para a comparação bicondilar (P>0,05), (Tabela 5).
52
Tabela 3 - Demonstrativo das médias das espessuras das zonas da cartilagem articular do côndilo lateral da tíbia nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo – 2007
Espessura - Côndilo Lateral
Animal Grupo Zona 1 2 3 4 5 Média
Controle Superficial 5,36 7,15 7,26 5,24 5,65 6,13 (±0,99) Média 83,79 79,80 80,12 125,82 109,94 95,89 (±20,90) Profunda 53,84 51,00 51,33 61,83 74,78 58,56 (±10,07) Total 142,99 137,95 138,71 192,89 190,37 160,58 (±28,42)
GOS Superficial 7,42 7,09 8,58 6,14 6,47 7,14 (±0,95) Média 102,15 88,11 57,17 107,63 164,32 103,88 (±39,05) Profunda 58,71 80,77 48,22 74,54 59,86 64,42 (±13,09) Total 168,28 175,97 113,97 188,31 230,65 175,44 (±41,96)
GOT Superficial 6,39 5,86 5,85 6,97 6,68 6,35 (±0,50) Média 99,91 96,12 79,04 106,60 91,83 94,70 (±10,30) Profunda 72,48 51,23 64,56 66,75 72,85 65,57 (±8,79) Total 178,78 153,21 149,45 180,32 171,36 166,62 (±14,43)
Tabela 4 - Demonstrativo das médias das espessuras das zonas da cartilagem articular do côndilo medial da tíbia nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo – 2007
Espessura - Côndilo Medial
Animal Grupo Zona 1 2 3 4 5 Média
Controle Superficial 5,19 5,15 5,36 6,39 4,41 5,30* (±0,71) Média 162,08 134,00 135,61 97,40 135,10 132,84 (±23,05) Profunda 60,22 61,00 62,00 62,95 62,00 61,63 (±1,05) Total 227,49 200,15 202,97 166,74 201,51 199,77 (±21,64)
GOS Superficial 7,47 6,29 8,00 7,34 6,68 7,16** (±0,67) Média 152,72 81,74 89,97 194,26 94,84 122,71 (±48,85) Profunda 64,43 74,42 56,16 65,10 53,71 62,76 (±8,21) Total 224,62 162,45 154,13 266,70 155,23 192,63 (±50,75)
GOT Superficial 6,02 6,72 6,51 6,43 6,12 6,36 (±0,29) Média 136,71 72,77 96,82 168,11 106,38 116,16 (±36,99) Profunda 65,43 45,83 53,09 81,72 47,86 58,79 (±14,91) Total 208,16 125,32 156,42 256,26 160,36 181,30 (±45,89)
*Significante em relação ao GOT na zona superficial (P<0,05); ** Significante em relação ao GC na zona superficial (P<0,001);
53
Tabela 5 - Demonstrativo das médias das espessuras das zonas da cartilagem articular da epífise proximal da tíbia nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo – 2007
Espessura - Bicondilar
Animal Grupo Zona 1 2 3 4 5 Média
Controle Superficial 5,28 6,15 6,31 5,82 5,03 5,72* (±0,55) Média 122,94 106,90 107,86 111,61 122,52 114,37 (±7,84) Profunda 57,03 56,00 56,67 62,39 68,39 60,10 (±5,29) Total 185,24 169,05 170,84 179,82 195,94 180,18 (±11,01)
GOS Superficial 7,45 6,69 8,29 6,74 6,58 7,15 (±0,72) Média 127,44 84,93 73,57 150,95 129,58 113,29 (±32,66) Profunda 61,57 77,60 52,19 69,82 56,79 63,59 (±10,19) Total 196,45 169,21 134,05 227,51 192,94 184,03 (±34,79)
GOT Superficial 6,21 6,29 6,18 6,70 6,40 6,36 (±0,21) Média 118,31 84,44 87,93 137,35 99,11 105,43 (±22,20) Profunda 68,96 48,53 58,82 74,23 60,36 62,18 (±9,90) Total 193,48 139,26 152,93 218,28 165,87 173,96 (±31,85)
* Significante me relação ao GOS na zona superficial (P<0,01).
5.3.2 Análise da Densidade Numérica de Condrócitos
As tabelas 6, 7 e 8 mostram os resultados da análise do número de condrócitos por
campo das zonas superficial, média e profunda da cartilagem articular, bem como o número
total médio de condrócitos da cartilagem nos côndilos lateral e medial no GC, GOS e GOT.
Em relação ao GC, os animais apresentaram número médio de condrócitos de 2,63
(±0,57) para zona superficial, 22,63 (±4,90) para a média e 5,38 (±0,48) para a profunda,
com um número total médio 30,64 de (±5,59) no côndilo lateral (Tabela 6).
Para o côndilo medial, nos animais do mesmo grupo, foi observado número médio de
condrócitos de 2,15 (±10,74) para zona superficial, 25,83 (±2,30) para a média e 5,72 (±1,21)
para a profunda, com um número total médio de 33,69 (±2,23) (Tabela 7).
As médias totais do número de condrócitos dos côndilos lateral e medial, para este
grupo, foram 2,39 (±0,77) para zona superficial, 24,23 (±1,83) para a média e 5,55 (±0,77)
para a profunda, com um número total médio de 32,17 (±2,82) (Tabela 8).
54
No GOS, os valores das médias foram 3,25 (±1,33) para zona superficial, 23,28
(±4,88) para a média e 6,73 (±0,75) para a profunda, com um número total médio de 33,26
(±4,35) no côndilo lateral (Tabela 6).
Para o côndilo medial, nos animais do mesmo grupo, foi observado número médio de
condrócitos de 2,55 (±0,30) para zona superficial, 29,38 (±4,51) para a média e 7,68 (±0,73)
para a profunda, com um número total médio de 39,61 (±4,86), (Tabela 7).
As médias totais do número de condrócitos dos côndilos lateral e medial, para este
grupo, foram 2,90 (±0,67) para zona superficial, 26,33 (±4,32) para a média e 7,21 (±0,66)
para a profunda, com um número total médio de 36,43 (±3,99) (Tabela 8).
No GOT, os animais apresentaram número médio de condrócitos de 2,86 (±0,36) para a
zona superficial, 24,06 (±2,15) para a média e 6,91 (±1,88) para a profunda, com um número
total médio de 33,84 (±4,10) no côndilo lateral (Tabela 6).
Em relação ao côndilo medial, nos animais do mesmo grupo, os valores das médias
foram 2,78 (±0,69) para zona superficial, 24,93 (±4,98) para a média e 7,06 (±1,24) para a
profunda, com um número total médio de 34,77 (±5,38) (Tabela 7).
As médias totais do número de condrócitos dos côndilos lateral e medial, para este
grupo, foram 2,82 (±0,24) para zona superficial, 24,50 (±3,56) para a média e 6,99 (±1,53)
para a profunda, com um número total médio de 34,31 (±4,73) (Tabela 8).
A comparação estatística das médias do número de condrócitos da zona superficial tanto
no côndilo lateral como no medial, para o GC, GOS e GOT não mostrou significância
(P>0,05). O mesmo ocorreu para os valores bicondilares (P>0,05) (Tabelas 6,7 e 8).
A comparação estatística das médias do número de condrócitos da zona media tanto no
côndilo lateral quanto no medial, para os três grupos, não mostrou significância (P>0,05). O
mesmo ocorreu para os valores bicondilares (P>0,05) (Tabelas 6,7 e 8).
A comparação estatística das médias do número de condrócitos da zona profunda no
côndilo lateral, para os três grupos, não mostrou significância (P>0,05) (Tabela 6). Já no
côndilo medial houve significância (P<0,05). A média do número de condrócitos da zona
profunda no côndilo medial foi significativamente maior no GOS que no GC (Tabela 7). Em
relação aos valores bicondilares não houve significância estatística (P>0,05) (Tabela 8).
55
A comparação estatística das médias do número total de condrócitos tanto no côndilo
lateral quanto no medial, para os três grupos, não mostrou significância (P>0,05). O mesmo
ocorreu para os valores bicondilares (P>0,05). (Tabelas 6, 7 e 8).
Tabela 6 - Demonstrativo das médias do número de condrócitos das
zonas da cartilagem articular do côndilo lateral da tíbia nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo – 2007
Número de Condrócitos - Côndilo Lateral
Animal Grupo Zona 1 2 3 4 5 Média
Controle Superficial 2,66 2,00 2,16 3,41 2,91 2,63 (±0,57) Média 18,91 19,00 19,33 28,83 27,08 22,63 (±4,90) Profunda 4,83 5,00 6,00 5,66 5,41 5,38 (±0,48) Total 26,40 26,00 27,49 37,90 35,40 30,64 (±5,59)
GOS Superficial 3,16 2,83 5,50 2,75 2,00 3,25 (±1,33) Média 26,25 19,33 17,41 22,41 31,00 23,28 (±4,88) Profunda 6,75 8,16 6,00 6,41 6,33 6,73 (±0,75) Total 36,16 30,32 28,91 31,57 39,33 33,26 (±4,35)
GOT Superficial 3,25 2,58 2,41 3,16 2,91 2,86 (±0,36) Média 26,83 21,25 23,75 25,41 23,08 24,06 (±2,15) Profunda 10,16 5,41 6,75 6,25 6,00 6,91 (±1,88) Total 40,24 29,24 32,91 34,82 31,99 33,84 (±4,10)
56
Tabela 7 - Demonstrativo das médias do número de condrócitos das zonas da cartilagem articular do côndilo medial da tíbia nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo – 2007
Número de Condrócitos - Côndilo Medial
Animal Grupo Zona 1 2 3 4 5 Média
Controle Superficial 1,83 1,00 2,00 3,75 2,16 2,15 (±1,00) Média 26,91 25,00 29,00 22,83 25,41 25,83 (±2,30) Profunda 3,66 6,35 6,41 5,58 6,58 5,72* (±1,21) Total 32,40 32,35 37,41 32,16 34,15 33,69 (±2,23)
GOS Superficial 2,33 2,58 2,91 2,16 2,75 2,55 (±0,30) Média 34,16 27,00 23,50 33,58 28,66 29,38 (±4,51) Profunda 8,25 7,83 6,41 8,00 7,91 7,68 (±0,73) Total 44,74 37,41 32,82 43,74 39,32 39,61 (±4,86)
GOT Superficial 2,16 3,66 2,91 2,00 3,16 2,78 (±0,69) Média 31,33 19,08 24,25 28,42 21,58 24,93 (±4,98) Profunda 8,91 5,50 7,33 6,66 6,91 7,06 (±1,24) Total 42,40 28,24 34,49 37,08 31,65 34,77 (±5,38)
*Significante em relação ao GOS na zona profunda (P<0,05).
Tabela 8 - Demonstrativo das médias do número de condrócitos das zonas da articular da epífise proximal da tíbia nos diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo - 2007
Número de Condrócitos - Bicondilar
Animal Grupo Zona 1 2 3 4 5 Média
Controle Superficial 2,25 1,50 2,08 3,58 2,54 2,39 (±0,77) Média 22,91 22,00 24,16 25,83 26,25 24,23 (±1,83) Profunda 4,25 5,68 6,21 5,62 6,00 5,55 (±0,77) Total 29,41 29,18 32,45 35,03 34,79 32,17 (±2,82)
GOS Superficial 2,75 2,71 4,21 2,46 2,38 2,90 (±0,74) Média 30,21 23,17 20,46 28,00 29,83 26,33 (±4,32) Profunda 7,50 8,00 6,21 7,21 7,12 7,21 (±0,66) Total 40,45 33,87 30,87 37,66 39,33 36,43 (±3,99)
GOT Superficial 2,70 3,12 2,66 2,58 3,04 2,82 (±0,24) Média 29,08 20,16 24,00 26,91 22,33 24,50 (±3,56) Profunda 9,54 5,46 7,04 6,46 6,46 6,99 (±1,53) Total 41,32 28,74 33,70 35,95 31,83 34,31 (±4,73)
57
5.3.3 Determinação do Volume dos Núcleos dos Condrócitos
As tabelas 9, 10 e 11 mostram os resultados da análise do volume dos núcleos dos
condrócitos das zonas superficial, média e profunda da cartilagem articular, bem como o
volume nuclear total médio dos condrócitos da cartilagem nos côndilos lateral e medial no
GC, GOS e GOT, em função da ooforectomia e exercício.
Para o GC, os valores do volume nuclear médio dos condrócitos foram de 22,90
(±3,78) para zona superficial, 60,93 (±6,39) para a média e 16,96 (±5,56) para a profunda,
com um volume total médio de 100,79 (±8,62) no côndilo lateral (Tabela 9).
Referente ao côndilo medial, nos animais do mesmo grupo, foi observado volume
nuclear médio de condrócitos de 27,10 (±9,68) para zona superficial, 63,72 (±6,18) para a
média e 14,25 (±2,76) para a profunda, com um volume total médio de 105,07 (±8,49)
(Tabela 10).
As médias totais do volume nuclear dos condrócitos dos côndilos lateral e medial, para
este grupo, foram 25,00 (±3,58) para zona superficial, 62,33 (±5,02) para a média e 15,61
(±1,99) para a profunda, com um volume total médio de 102,94 (±7,38) (Tabela 11).
No GOS, os valores das médias foram 13,77 (±9,46) para zona superficial, 39,64
(±9,28) para a média e 15,59 (±3,45) para a profunda, com um volume total médio de
69,00 (±15,74) no côndilo lateral (Tabela 9).
Para o côndilo medial, nos animais do mesmo grupo, foi observado volume nuclear
médio dos condrócitos de 12,02 (±8,18) para zona superficial, 46,63 (±9,61) para a média e
11,58 (±3,30) para a profunda, com um volume total médio de 70,22 (±15,46) (Tabela 10).
As médias totais do volume nuclear dos condrócitos dos côndilos lateral e medial, para
este grupo, foram 12,90 (±8,01) para zona superficial, 43,13 (±8,24) para a média e 13,58
(±2,55) para a profunda, com um volume total médio de 69,61 (±13,77) (Tabela 11).
No GOT, os animais apresentaram volume nuclear médio dos condrócitos de 15,38
(±6,79) para zona superficial, 45,95 (±16,69) para a média e 9,39 (±4,27) para a profunda,
com um volume total médio de 70,72 (±17,14) no côndilo lateral (Tabela 9).
58
Em relação ao côndilo medial, nos animais do mesmo grupo, os valores das médias do
volume nuclear foram 16,88 (±11,23) para zona superficial, 50,96 (±6,63) para a média e
13,81 (±4,11) para a profunda, com um volume total médio de 81,64 (±13,32) (Tabela 10).
As médias totais do volume nuclear dos condrócitos dos côndilos lateral e medial, para
o seguinte grupo, foram 16,13 (±7,00) para zona superficial, 48,45 (±7,20) para a média e
11,60 (±3,62) para a profunda, com um volume total médio de 76,18 (±8,75) (Tabela 11).
A comparação estatística dos valores das médias do volume nuclear dos condrócitos
da zona superficial tanto no côndilo lateral quanto no medial, para o GC, GOS e GOT não
mostrou significância (P>0,05) (Tabelas 9 e 10). Porém em relação aos valores bicondilares
houve significância (P<0,05). Os valores das médias do volume nuclear dos condrócitos da
zona superficial do GC foram significativamente maiores que no GOS (Tabela 11).
A comparação estatística dos valores das médias do volume nuclear dos condrócitos
da zona media tanto no côndilo lateral quanto no medial, para os três grupos, mostrou
significância (P<0,05). As médias do volume nuclear dos condrócitos da zona média do GC
foram significativamente maiores que do GOS nos dois côndilos (Tabelas 9 e 10). Em relação
aos valores bicondilares houve significância (P<0,01). As médias do volume nuclear dos
condrócitos dos dois côndilos, lateral e medial, do GC foram significativamente maiores que
os do GOS e do GOT (Tabela 11).
A comparação estatística dos valores das médias do volume nuclear dos condrócitos
da zona profunda no côndilo lateral, para os três grupos, mostrou significância (P<0,05). Os
valores das médias do volume nuclear dos condrocitos da zona profunda GC e GOS foram
maiores que do GOT (Tabela 9). No entanto, no côndilo medial e nos valores bicondilares,
não houve significância (P>0,05) (Tabelas 10 e 11).
A comparação estatística dos valores das médias do volume total médio dos núcleos
dos condrócitos tanto no côndilo lateral como no medial, para os três grupos, mostrou
significância (P<0,01). Os valores bicondilares também mostraram significância (P<0,001) As
médias do volume total médio dos núcleos dos condrócitos do GC foram significativamente
maiores que do GOS e do GOT (Tabelas 9,10 e 11).
59
Tabela 9 - Demonstrativo das médias do volume nuclear dos condrócitos das zonas da cartilagem articular do côndilo lateral da tíbia entre os diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo – 2007
Volume dos Condrócitos - Côndilo Lateral
Animal Grupo Zona 1 2 3 4 5 Média
Controle Superficial 29,63 20,54 21,48 21,33 21,51 22,90 (±3,78) Média 50,59 65,26 66,86 59,82 62,13 60,93* (±6,39) Profunda 15,00 17,09 26,03 10,94 15,76 16,96a (±5,56) Total 95,22 102,89 114,37 92,09 99,40 100,79** (±8,62)
GOS Superficial 4,74 13,26 23,67 23,04 4,15 13,77 (±9,46) Média 30,47 32,23 38,12 53,13 44,23 39,64 (±9,28) Profunda 17,40 17,44 9,81 18,27 15,03 15,59a (±3,45) Total 52,61 62,93 71,60 94,44 63,41 69,00 (±15,74)
GOT Superficial 7,53 13,77 14,29 26,29 15,02 15,38 (±6,79) Média 40,20 74,06 29,43 43,68 42,38 45,95 (±16,69) Profunda 11,97 5,96 11,01 14,08 3,91 9,39b (±4,27) Total 59,70 93,79 54,73 84,05 61,31 70,72*** (±17,14)
*Significante em relação ao GOS na zona média (P<0,05); **Significante em relação ao GOS no total (P<0,05); *** Significante em relação ao GC no total (P<0,05); Letras diferentes em uma mesma coluna mostram diferença significante (P<0,05). Tabela 10 - Demonstrativo das médias do volume nuclear dos condrócitos das zonas da
cartilagem articular do côndilo medial da tíbia entre os diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo – 2007
Volume dos Condrócitos - Côndilo Medial
Animal Grupo Zona 1 2 3 4 5 Média
Controle Superficial 13,05 26,53 27,86 27,70 40,38 27,10 (±9,68) Média 65,22 68,96 68,12 53,58 62,72 63,72* (±6,18) Profunda 15,19 12,97 12,13 18,67 12,28 14,25 (±2,76) Total 93,46 108,46 108,11 99,95 115,39 105,07** (±8,49)
GOS Superficial 9,65 0,61 20,66 19,28 9,90 12,02 (±8,18) Média 51,56 33,30 48,38 58,38 41,51 46,63 (±9,61) Profunda 14,16 15,46 11,62 8,82 7,80 11,58 (±3,30) Total 75,38 49,38 80,66 86,48 59,21 70,22 (±15,46)
GOT Superficial 0,00 22,48 27,88 11,21 22,82 16,88 (±11,23) Média 51,43 42,00 47,19 55,37 58,81 50,96 (±6,63) Profunda 13,73 6,79 16,18 17,01 15,32 13,81 (±4,11) Total 65,16 71,27 91,25 83,60 96,95 81,64*** (±13,32)
*Significante em relação ao GOS na zona média (P<0,05); **Significante em relação ao GOS no total (P<0,01); *** Significante em relação ao GC no total (P<0,05).
60
Tabela 11 - Demonstrativo das médias volume nuclear do condrócitos das zonas da cartilagem articular da epífise proximal da tíbia entre os diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo - 2007
Volume dos Condrócitos – Bicondilar
Animal Grupo Zona 1 2 3 4 5 Média
Controle Superficial 21,34 23,54 24,67 24,52 30,95 25,00* (±3,58) Média 57,91 67,11 67,49 56,70 62,43 62,33 (±5,02) Profunda 15,09 15,03 19,08 14,81 14,03 15,61 (±1,99) Total 94,34 105,68 111,24 96,03 107,40 102,94 (±7,38)
GOS Superficial 7,20 6,94 22,17 21,17 7,03 12,90 (±8,01) Média 41,02 32,77 43,25 55,76 42,87 43,13** (±8,24) Profunda 15,79 16,45 10,72 13,55 11,42 13,58 (±2,55) Total 63,99 56,15 76,13 90,46 61,31 69,61# (±13,77)
GOT Superficial 3,77 18,13 21,09 18,75 18,92 16,13 (±7,00) Média 45,81 58,03 38,31 49,52 50,59 48,45*** (±7,20) Profunda 12,85 6,38 13,60 15,55 9,62 11,60 (±3,62) Total 62,43 82,53 73,00 83,82 79,13 76,18## (±8,75)
*Significante em relação ao GOS na zona superficial (P<0,05); ** Significante em relação ao GOS na zona média (P<0,01); *** Significante em relação ao GOS na zona média (P<0,05); # Significante e relação ao GC no total (P<0,001); ## Significante em relação ao GC no total (P<0,01).
5.3.4 Determinação da Densidade de Volume do Colágeno
A figura 8 mostra o aspecto das fibras colágenas nos cortes histológicos da cartilagem
articular da tíbia, corados pelo Picrossirius e examinados à luz polarizada, nos três grupos
estudados.
61
Figura 8 – Cortes histológicos da cartilagem articular da tíbia mostrando a distribuição das fibras colágenas nas
zonas da cartilagem nos três grupos estudados (GC, GOS e GOT); Picrosirius; aumento = 400X.
62
Através da avaliação dos cortes corados pela técnica de Picrosirius, examinados à luz
polarizada, obtivemos o resultados referentes à densidade de volume do colágeno da
cartilagem articular nos côndilos lateral e medial do GC, GOS e GOT.
Para o GC, A média total da densidade de volume do colágeno dos côndilos lateral e
medial, para este grupo, foi 0,36 (±0,05) (Tabela 14). Os valores das médias da densidade de
volume do colágeno foram de 0,39 (± 0,06), no côndilo lateral (Tabela 12) e 0,34 (± 0,04)
no côndilo medial (Tabela 13).
No GOS, a média total da densidade de volume do colágeno dos côndilos lateral e
medial foi de 0,49 (±0,02) (Tabela 14). Os animais apresentaram valores das médias da
densidade de volume do colágeno de 0,49 (±0,02) no côndilo lateral (Tabela 12) e 0,48
(±0,05) no côndilo medial (Tabela 13),
No GOT, a média total da densidade de volume do colágeno dos côndilos lateral e
medial, para este grupo, foi de 0,56 (±0,03) (Tabela 14). Os valores das médias da densidade
de volume do colágeno foram de 0,57 (±0,04) no côndilo lateral (Tabela 12) e 0,55 (±0,02)
no côndilo medial (Tabela 13).
A comparação estatística dos valores das médias da densidade de volume do colágeno
nos côndilo lateral e medial, em conjunto, mostrou significância (P< 0.0001). Os valores
foram maiores para o GOT em relação ao GOS e GC e para o GOS em relação ao GC (Tabela
14).
A comparação estatística dos valores das médias da densidade de volume do colágeno
em cada côndilo mostrou que no côndilo lateral, para o GC, GOS e GOT houve significância
(P<0,001). Os valores foram maiores para o GOS e GOT em relação ao GC (Tabela 12).
A comparação estatística dos valores das médias da densidade de volume do colágeno
no côndilo medial, para os três grupos mostrou significância (P< 0.0001). Os valores foram
maiores para o GOT em relação ao GOS e GC e para o GOS em relação ao GC (Tabela 13).
63
Tabela 12 - Demonstrativo das médias da densidade de volume do colágeno no côndilo lateral
da tíbia entre os diferentes grupos avaliados , seguidas pelo desvio padrão e
significância estatística - São Paulo - 2007
Densidade de volume do Colágeno - Côndilo Lateral Animal
Grupo 1 2 3 4 5 Média Controle 0,28 0,41 0,41 0,43 0,43 0,39* (±0,06)
GOS 0,49 0,45 0,50 0,51 0,52 0,49 (±0,02)
GOT 0,50 0,60 0,62 0,54 0,58 0,57** (±0,04)
* Significante em relação ao GOS (P<0,05); ** Significante em relação ao GC (P<0,001).
Tabela 13 - Demonstrativo das médias da densidade de volume do colágeno no côndilo medial da tíbia entre os diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo - 2007
Densidade de volume do Colágeno - Côndilo Medial
Animal Grupo 1 2 3 4 5 Média
Controle 0,26 0,36 0,38 0,33 0,36 0,34* (±0,04)
GOS 0,45 0,47 0,57 0,46 0,44 0,48** (±0,05)
GOT 0,51 0,58 0,57 0,55 0,55 0,55*** (±0,02)* Significante em relação ao GOS (P<0.001); ** Significante em relação ao GOT (P<0.05); Significante em relação ao GC (P<0.001).
Tabela 14 - Demonstrativo das médias da densidade de volume do colágeno cartilagem articular da epífise proximal da tíbia entre os diferentes grupos avaliados, seguidas pelo desvio padrão e significância estatística - São Paulo - 2007
Densidade de volume do Colágeno - Bicondilar
Animal Grupo 1 2 3 4 5 Média
Controle 0,27 0,38 0,40 0,38 0,40 0,36* (±0,05)
GOS 0,47 0,46 0,53 0,49 0,48 0,49** (±0,02)
GOT 0,50 0,59 0,60 0,55 0,56 0,56*** (±0,03)* Significante em relação ao GOS (P <0.01); ** Significante em relação ao GOT (P<0.05); *** Significante em relação ao GC (P<0.001)
64
5.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
A análise ultraestrutural da superfície da cartilagem articular foi realizada de forma
qualitativa, utilizando-se para isso a microscopia eletrônica de varredura, no qual três animais
de cada grupo foram estudados, nos aumentos de 1.000 e 10.000 vezes.
Através da análise das eletromicrografias observamos que os três animais do GC,
apresentaram superfícies irregulares com sinais de processos degenerativos na superfície da
cartilagem articular, como pequenas lascas e fissuras. Porém não foram encontradas crateras,
nem exposição de osso subcondral (Figuras 9 e 12).
No grupo GOS, notamos que dois animais apresentaram superfícies irregulares com a
presença de alterações degenerativas na superfície da cartilagem articular, como pequenas
lascas e fissuras. Em um único animal, foram encontradas crateras profundas com exposição
do osso subcondral em uma delas (Figuras 10 e 13).
Nos três animais do grupo GOT, encontramos superfícies irregulares com a presença
de grandes alterações degenerativas na superfície da cartilagem articular, formando grandes
lascas, fissuras e crateras. Porém, nenhumas dessas alterações degenerativas levaram a
exposição do osso subcondral (Figuras 11 e 14).
65
Figura 9 – Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GC demonstrando superfície irregular com a presença de algumas lascas (seta branca) e fissuras (seta preta). Aumento: 1.000X
Figura 10 – Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GOS
demonstrando área de degeneração da cartilagem articular com exposição de osso subcondral (estrela); a seta indica a cartilagem articular nas margens da região degenerada. Aumento: 1.000X
Figura 11 – Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GOT demonstrando área degenerada com a presença de condrócitos (interior da elipse), lascas (seta negra) e fissuras profundas (seta branca). Aumento: 1.000X
66
Figura 12 – Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GC evidenciando superfície irregular com rede colágena. Aumento: 10.000X
Figura 13 – Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GOS
evidenciando condrócitos (seta) da cartilagem articular nas margens de região degenerada. Aumento: 10.000X
Figura 14 – Eletromicrografia da superfície articular da epífise proximal da tíbia esquerda de ratas do GOT
evidenciando fissura profunda (indicada na figura 11 com uma seta branca). Fibras colágenas (setas brancas); condrócitos (seta negra). Aumento: 10.000X
DISCUSSÃO
68
6 DISCUSSÃO
Nos últimos anos, tem-se observado uma valorização da prática de atividade física como
meio de manutenção da saúde, especialmente em mulheres após a menopausa. Na literatura
são encontrados numerosos trabalhos mostrando os efeitos benéficos da prática de exercícios
sobre os componentes do aparelho músculo-esquelético (PAP et al., 1998; EGRI et al., 1999;
CULAV et al., 1999; FITZGERALD et al., 2002). Na prática diária, tanto em Fisioterapia
quanto em Educação Física, são conhecidos os benefícios da atividade física sobre aqueles
componentes. Entretanto, são poucas as referências sobre efeitos combinados da atividade
física e deprivação de hormônios nas cartilagens articulares. O presente trabalho teve como
objetivo estudar as alterações da cartilagem articular da tíbia em função da deprivação de
estrógenos e desse fator acrescido da realização de exercícios físicos. Para tanto, utilizamos
como modelo animal, o rato Wistar. Os dados obtidos visam dar subsídios para a melhor
compreensão de processos patológicos, como a osteoartrose, prevalente após a menopausa. A
osteoartrose é doença na qual ocorre a degradação da cartilagem articular, representando um
dos mais importantes problemas de saúde da população em geral (MOURITZEN et al., 2003).
É uma das causas mais comuns de dor, incapacidade e diminuição da qualidade de vida em
indivíduos de meia idade e idosos. Esta doença não está relacionada apenas ao
envelhecimento (NEWTON et al., 1997), mas pode também ocorrer devido a vários fatores
(NEWTON et al., 1997; PARKER et al., 2003), incluindo a pós-menopausa (CHRISTGAU
et al., 2004; HOEG-ANDERSEN et al., 2004). É mais comum em mulheres do que em
homens e, naquelas, mais comum após a menopausa. Antes dos cinqüenta anos de idade, a
incidência desta doença é baixa em homens, tendo uma pequena prevalência em mulheres.
Porém, depois do cinqüenta anos, torna-se mais freqüente em mulheres com grande
prevalência no sexo feminino (DING et al., 2003; PARKER et al., 2003). A razão para esta
diferença ainda é desconhecida, porém diferenças no volume da cartilagem articular parece
influenciar (DING et al., 2003). O estudo da osteoartrose em humanos é difícil devido à
variação genética, a variedade nutricional, as diferenças bioquímicas e também, pela
dificuldade em identificar claramente os estágios iniciais da doença (PRITZKER, 1994).
Além disso, é difícil a elucidação dos eventos primários da osteoartrose, pois os pacientes
geralmente não procuram atenção médica até que a patologia esteja avançada (THORNDIKE;
TURNER, 1998). Todas estas dificuldades justificam que os estudos sobre a osteoartrose
utilizem modelos como o rato Wistar, tal como fizemos.
69
Para facilidade de compreensão, os resultados da discussão serão apresentados segundo
os mesmos itens, utilizados no capítulo de resultados: variação do peso dos animais,
desempenho físico, análise morfométrica e estereológica e microscopia eletrônica de
varredura.
6.1 VARIAÇÃO DO PESO DOS ANIMAIS
Os efeitos da ooforectomia no peso dos animais pelos dados que obtivemos demonstram
que as ratas do GOS e do GOT ganharam peso após a ooforectomia. O ganho de peso do GOS
foi de 19% e do GOT de 15%. Não houve diferença entre estes dois últimos grupos quanto a
este aspecto. O ganho de peso dos animais de ambos os grupos pode ser explicado pela
deficiência do estrógeno. Christgau et al. (2004) também demonstraram aumento de peso em
ratas após a ooforectomia. Um estudo recente avaliou os efeitos do climatério no peso
corporal e na distribuição de gordura, comparando mulheres na pré-menopausa, na peri-
menopausa e na pós-menopausa. O peso corporal e a massa corpórea foram
significativamente maiores na peri-menopausa e na pós-menopausa do que na pré-menopausa.
A média total de gordura corporal dos tecidos moles foi significativamente maior na peri-
menopausa e na pós-menopausa do que na pré-menopausa (GENAZZANI; GAMBACCIANI,
2006).
O valor um pouco menor do ganho de peso dos animais do GOT pode ser atribuído à
atividade física. O treinamento adequado é fator reconhecido para preservar o peso corpóreo
(ASIKAINEN; KUKKONEN-HARJULA; MIILUNPALO, 2004). Mesmo na menopausa, um
programa de exercícios de carga moderada, em sedentárias e com sobrepeso, mostrou ser
significante para a redução de peso corporal e gordura corporal total (IRWIN et al., 2003).
Nossos dados sugerem que a ooforectomia induziu a um aumento de peso e que o exercício
físico não interferiu de maneira significante nesses resultados. É possível que o tipo e a
intensidade do exercício não tenham sido suficientes para alterar os resultados.
70
6.2 DESEMPENHO FÍSICO
Segundo os dados que obtivemos, os resultados dos animais do GOT no 3TEM foram
significativamente maiores do que do GC (61%). Nesse 3TEM houve uma pequena queda no
rendimento do GOT, e, portanto, não houve significância em relação ao GOS. Os resultados
mostram uma diminuição no desempenho dos animais do GC ao final do 3TEM (39%),
enquanto que em relação ao 2TEM, o GOT obteve o seu melhor rendimento (68%),
confirmado quando realizada a comparação com os animais dos outros dois grupos, que
mostrou um melhor resultado para o GOT em relação ao GC e GOS (53% e 77%
respectivamente). Podemos dizer, então, que o treinamento produziu condicionamento no
GOT em relação ao GC e GOS. Estes resultados contradizem alguns autores quando sugerem
que a menopausa pode representar uma importante causa para a depreciação da capacidade de
realização de exercício (MERCURO et al., 2006).
6.3 ANÁLISES MORFOMÉTRICA E ESTEREOLÓGICA
6.3.1 Análise da Espessura das Zonas (camadas) da Cartilagem Articular
Os resultados sobre os efeitos da ooforectomia sobre a espessura da cartilagem
mostraram que a espessura da cartilagem como um todo, teve um aumento na zona superficial
no GOS (23%) em relação ao GC. Considerando apenas o côndilo medial da tíbia, na zona
superficial, observamos médias maiores para o GOS (35%) em relação ao GC. Assim sendo,
houve alteração da espessura da cartilagem apenas no côndilo medial, sugerindo que os
côndilos lateral e medial da cartilagem articular da tíbia respondem de modo diferente a
ooforectomia e ao exercício. A causa é desconhecida. A resposta da cartilagem frente a
diferentes fatores tem mostrado resultados discordantes. Karvonen et al. (1994), observaram
diminuição da espessura da cartilagem articular de ambos os côndilos femorais nos pontos de
maior descarga de peso com o envelhecimento e também como conseqüência de osteoartrose.
Porém, Bruyere et al. (2007), mostraram que o côndilo medial da tíbia é mais afetado do que
o lateral na diminuição da espessura da cartilagem articular com a osteoartrose. A assimetria
nos resultados parece, portanto, refletir fatores mecânicos.
71
Observamos que a atividade física também produziu médias maiores na espessura da
camada superficial do côndilo medial para o GOT (20%) em relação ao GC, mas não
diferente do GOS. Um trabalho recente demonstrou que a espessura da cartilagem aumentou
com grandes cargas de peso (ANDRIACCHI; MÜNDERMANN, 2006). Estudos recentes
mostram que grande adução do joelho durante a deambulação é freqüentemente relacionada
com a progressão de desgaste da cartilagem do côndilo medial da tíbia. O treino intenso
parece não promover este desgaste e, pelo menos em animais, pode causar aumento da
espessura da cartilagem articular (INGELMARK, 1957; KIVIRANTA et al., 1988). Herzog et
al. (1998), demonstraram aumento da espessura da cartilagem da articulação patelofemoral
em gatos após transecção do ligamento cruzado anterior, considerado como um modelo
experimental de osteoartrose. Por outro lado, foi demonstrada, uma diminuição da espessura
da zona superficial da cartilagem articular do côndilo lateral do fêmur e da patela, com um
concomitante aumento da zona profunda após osteoartrose induzida por uma osteotomia da
tíbia em cães (PANULA et al., 1998). Nossos resultados demonstram que parece haver
correlação entre depressão estrogênica e aumento da espessura da cartilagem.
6.3.2 Análise da Densidade Numérica de Condrócitos
Os resultados obtidos na análise da densidade numérica de condrócitos mostraram aumento
significativo na zona profunda da cartilagem articular do côndilo medial da tíbia em relação à
ooforectomia, sendo maior no GOS (34%) em relação ao GC. Isto pode ser explicado pela
discreta redução da espessura da camada profunda no GOS, o que concentra mais as células e
não por efeito da ooforectomia em si. Ao contrário, na camada superficial, embora tenha
ocorrido um aumento da espessura desta camada no GOS em relação ao GC, não houve
alteração significante na densidade de condrócitos em função da deprivação de estrógenos. É
possível que este resultado seja devido a um aumento da matriz extracelular, com conseqüente
aumento da espessura da camada. A densidade numérica dos condrócitos da cartilagem
articular parece estar relacionada com a estabilidade mecânica da matriz (Wu; HERZOG,
2002). Isto é facilmente compreensível, pois a matriz extracelular da cartilagem articular é
mantida pelos condrócitos, que controlam a produção e rotatividade dos componentes da
matrix (HARDINGHAM et al., 1994). Dados da literatura mostram associação dos níveis de
72
estrógeno com o número de condrócitos em cartilagens. Takano et al. (2007), mostram uma
diminuição do número de condrócitos da cartilagem do disco epifisário de coelhas
ooforectomizadas. Em outro trabalho, foi mostrado que a suplementação de estrógeno
diminuiu a espessura da cartilagem articular do côndilo da mandíbula de ratas através da
inibição da proliferação e aumento da maturação de condrócitos (TALWAR et al., 2006).
O exercício parece não ter influenciado este resultado, pois os dados relativos ao GOT
não diferiram dos GOS e do GC.
6.3.3 Determinação do Volume dos Núcleos dos Condrócitos
Os resultados da análise do volume nuclear demonstraram uma diminuição do volume
nuclear dos condrócitos da zona superficial da cartilagem articular da epífise proximal da tíbia
em função da deprivação de estrógeno, pois houve redução do volume nos animais do GOS
(94%) em relação ao GC. Na zona média, em relação aos valores bicondilares, notamos uma
diminuição do volume nuclear dos condrócitos nos animais do GOS (45%) quando
comparados com o GC. Ainda na zona média, observamos uma diminuição do volume dos
núcleos dos condrócitos da cartilagem articular tanto no côndilo lateral, quanto no medial nos
animais do GOS (54% e 37% respectivamente) em relação ao GC. A ooforectomia não
influenciou os volumes nuclear dos condrócitos da zona profunda da cartilagem articular do
côndilo lateral da tíbia, pois não houve significância entre os valores do GC e GOS.
O exercício não impediu a s alterações no volume dos núcleos da cartilagem, pois
ocorreu também uma diminuição do volume nuclear dos condrócitos nos animais do GOT
(29%), em relação ao GC. Esta ação foi maior ainda na camada profunda pois a ooforectomia
associada a atividade física produziu uma diminuição importante do volume nuclear dos
condrócitos nesta camada em relação ao GC e GOS (81% e 81% respectivamente). É possível
que o tipo e/ou duração do exercício não tenham sido suficientes para estimular os
condrócitos e produzir aumento do volume nuclear, com conseqüente aumento da síntese de
matriz. Entretanto, o estresse mecânico acima de níveis fisiológicos pode influenciar
profundamente a cartilagem articular causando danos a matriz, alterações no metabolismo dos
73
condrócitos e morte celular. Ele também tem sido implicado como um fator de risco no
desenvolvimento da osteoartrose (BUSH et al. 2005).
6.3.4 Determinação da Densidade de Volume do Colágeno
A rede colágena é a estrutura chave que suporta a arquitetura tridimensional da
cartilagem articular (MOLLENHAER et al., 1984; PANULA et al., 1998). As propriedades
físicas, bioquímicas, biomecânicas e fisiológicas do colágeno são modificadas pelo exercício
(SOMMER, 1987).
A análise da densidade de colágeno mostrou um aumento na densidade do volume do
colágeno nos animais ooforectomizados, pois houve aumento no GOS (27%) em relação ao
GC no côndilo lateral. Também observamos um aumento nos valores do GOS (41%) em
relação ao GC no côndilo medial.
O exercício influenciou significativamente as alterações produzidas pela ooforectomia,
pois houve aumento de colágeno no GOT (45%) em relação ao GC no côndilo lateral.
Também observamos um aumento nos valores do GOT em relação ao GOS (16%) e GC
(63%) em relação ao GC no côndilo medial.
Em relação aos efeitos do exercício sobre a densidade de colágeno na cartilagem
articular, os resultados são discrepantes. Arokoski et al. (1996), demonstraram não haver
diminuição da concentração de colágeno da cartilagem articular do joelho de cães após 15
semanas de 40Km/h de corrida diária. Porém Saamamen et al. (1994), mostraram uma
diminuição da concentração de colágeno da cartilagem articular do côndilo lateral do fêmur
de cães após 15 semanas de 20Km/h de corrida diária, concluindo que um programa de
corrida extenuante, induziu a mudanças locais semelhantes aos estágios iniciais de
degeneração da cartilagem articular.
Ghristgau et al. (2004), mostraram um aumento significante nos níveis de marcadores de
degradação dos colágenos tipo I e II em ratas ooforectomizadas, mostrando alta remodelação
do colágeno. Os níveis elevados do marcador de colágeno I, não correspondiam a erosão da
cartilagem articular do joelho. Porem níveis elevados do marcador de colágeno II estavam
74
altamente associados com danos da cartilagem articular. Mouritzen et al. (2003), também
encontraram um aumento dos níveis do marcador de colágeno II na urina de mulheres na pós-
menopausa.
A presença do estrógeno parece ser fundamental para o equilíbrio na produção de
quantidades adequadas dos componentes da matriz extracelular. Portanto, quando há
diminuição deste hormônio, ocorre maior produção do colágeno, o que torna a cartilagem
mais endurecida e menos resistente mecanicamente. É possível que estas alterações possam
servir de base para ulteriores processos deletérios, levando à degradação da cartilagem, tal
como observado em fases mais adiantadas por Tesche e Miosge (2005).
6.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
A análise dos resultados sobre a superfície da cartilagem articular demonstram
alterações degenerativas progressivas como conseqüência da deprivação de estrógenos.
Diversos tipos de irregularidades da superfície articular, incluindo depressões e
elevações têm sidos descritos em estudos de microscopia eletrônica de varredura
(GARDNER; MCGILLIVRAY, 1971). Estudos descrevem uma superfície articular normal
como sendo lisa (TAN et al., 2004). Em estudos da superfície articular em diversas condições
como condromalácia da patela, osteoartrose e artrite reumatóide, características semelhantes
com fissuras, lascas e crateras foram observadas em doenças da cartilagem (REDLER et al.,
1970; GULISANO et al., 1993).
Os animais que realizaram atividade física (no GOT) mostraram as mesmas
irregularidades, que os do GOS, o que nos permite supor que o exercício não modificou os
efeitos da ooforectomia. Essas alterações podem decorrer do ganho de peso durante o
experimento, associado à ooforectomia no GOS e pela deficiência do estrógeno e realização
do exercício no GOT, pois segundo alguns autores, dentre os fatores que podem influenciar a
incidência de osteoartrose são citados o excesso de peso e a obesidade (WLUKA et al., 2004)
e pós-menopausa (CHRISTGAU et al., 2004; HOEG-ANDERSEN et al., 2004).
CONCLUSÕES
76
7 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, podemos concluir que:
• A ooforectomia contribui para um aumento de peso em ratas de laboratório
mesmo com um treinamento físico com intensidade submáxima de 60%, com
duração de 3 meses.
• O treinamento físico com intensidade submáxima de 60%, com duração de 3
meses é capaz de melhorar o desempenho físico de ratas ooforectomizadas.
• A cartilagem articular dos côndilos medial e lateral da tíbia respondem de maneira
diferente à ooforectomia e à atividade física.
• A deprivação de estrógenos provocou um aumento da espessura da zona
superficial da cartilagem articular do côndilo medial da tíbia, também observada
com o treinamento, porém em menor grau.
• A ooforectomia produziu um aumento relativo da densidade numérica dos
condrócitos na zona profunda da cartilagem articular do côndilo medial da tíbia. O
exercício associado com a ooforectomia não produziu este efeito.
• A deprivação de estrógenos produziu uma diminuição do volume dos núcleos dos
condrócitos das zonas superficial e média da cartilagem articular dos côndilos
lateral e medial. O exercício também não influenciou este dado.
• A ooforectomia não produziu efeito no volume nuclear dos condrócitos da
cartilagem. Porém o exercício provocou uma diminuição do volume nuclear dos
condrócitos da zona profunda da cartilagem articular do côndilo lateral da tíbia.
• Tanto a ooforectomia isoladamente como em conjunto com a atividade física
provocaram um aumento da produção de colágeno na matriz da cartilagem.
• Tanto a ooforectomia isoladamente, quanto a ooforectomia associada à atividade
física, causam lesões semelhantes na cartilagem articular da epífise proximal da
tíbia.
REFERÊNCIAS
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REFERÊNCIAS
ANDERSON, C. E. The structure and function of cartilage. Journal of Bone and Joint Surgery, v. 44A, p. 77-786, 1962.
ANDRIACCHI, T. P.; MÜNDERMANN, A. The role of ambulatory mechanics in the initiation and progression of knee osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol, v. 18, n. 5, p. 514-518, 2006.
AROKOSKI, J.; KIVIRANTA, L.; JURVELIN, J.; TAMMI, M. E.; HELMINEN, H. J. Long-distance running causes site-dependent decrease of cartilage glycosaminoglycan content in the knee joints of beagles dogs. Arthritis Rheum, v. 36, n. 10, p. 1451-1459, 1993.
AROKOSKI, J.; HYTTINEN, M.; LAPVETELAINEN, T.; TAKACS, P.; KOSZTACZKY, B; MOIS, L.; KOVANEN, V.; HELMINEN, H. Decrease birefringence of the superficial zone collagen network in the canine knee (stifle) articular cartilage after long distance running training, detected by quantitative polarized light microscopy. Ann Rheum Dis., v. 55, n. 4, p. 253-264 1996.
ASIKAINEN, T. M.; KUKKONEN-HARJULA, K.; MIILUNPALO, S. Exercise for health for early postmenopausal women: a systematic review of randomised controlled trials. Sports Med., v. 34, n.11, p. 753-778, 2004.
ATRA, E. Artrose, reumatologia prática. Rio de Janeiro: Eleá CiênciaEditorial: 1995, p.58-63.
BIHARI-VARGA, M.; FRAKAS, T.; BIRÓ, T. Changes in the cartilage proteoglycans in relation to age and osteoarthrosis. Acta Biol Hung., v. 35, p. 325-331, 1984.
BLOEBAUM , W. The morphology of the surface of artcular cartilage in adult rats. J Anat, v. 131, p. 333-346, 1980. (Supplement, 2).
BOGOSLAVSKY, A. Alterações da cartilagem hialina da cabeça do fêmur de ratos Wistar corredores, em função do envelhecimento. 2006. 96 f. – Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
BRANDAN, E. Proteoglycans in skeletal muscle. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.27, p.109-16, 1994.
BRÜEL, A.; OXLUND, H. Growth hormone influences the conten and composition of collagen in the aorta from old rats. Meach Ageing Dev., v. 123, n. 6, p. 627-635, 2002.
79
BRUYERE, O.; GENANT, H.; KOTHARI, M.; ZAIM, S.; WHITE, D. Longitudinal study of magnetic resonance imaging and standard X-rays to assess disease progression in osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage, v. 5 n. 1, p. 98-103, 2007.
BUCKWALTER, J. A. Osteoarthritis and articular cartilage use, disuse, and abuse: experimental studies. J Rheumv., v. 22, p. 13-15, 1995. (Supplement, 43).
BUCKWALTER, J. A.; MANKIN, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instr Course Lect., v. 47, p. 477-486, 1998.
BURSTEIN D.; BASHIR, A.E.; GRAY, M.L. MRI techniques in early stages of cartilage disease. Investigative Radiology, v.35, n.10, p.622-638, 2000.
BUSH, P.G.; HODKINSON, P.D.; HAMILTON, G.L.; HALL, A.C. Viability and volume of in situ bovine articular chondrocytes-changes following a single impact and effects of medium osmolarity. Osteoarthritis Cartilage, v. 13, n.1, p.54-65, 2005.
CHRISTGAU, S.; GARNERO, P.; FLEDELIUS, C.; MONIZ, C.; ENSIG, M. Collagen type II C-telopeptide fragments as an index of cartilage degradation. Bon, v. 29, p. 209-215, 2001.
CHRISTGAU, S.; TANKÓ, L.; CLOOS, P. A. C.; MOURITZEN, U.; CHRISTIANSEN, C. M. D.; DELAISSÉ, J. M.; HOEGH-ANDERSON, P. Suppression of elevated cartilage turnover in postmenopausal women and ovariectomized rats by estrogen and selective estrogen receptor modulator (SERM). Menopause, v. 11, n. 5, p. 508-518, 2004.
CORVOL, M. T. The chondrocyte: from cell aging to osteoarthritis. Joint Bone Spine, v. 67, p. 557-560, 2000.
CULAV, E. M.; CLARK, C. H.; MERRILEES, M. J. Connective Tissues: Matrix composition and its relevance to physical therapy. Physical Therapy, v. 79, n. 3, p. 308-319, 1999.
DEGROOT, J.; VERZIJ, N.; BANK R.A.; LAFEBER, F.P.J.G.; BIJLMSA, J.W.J.; TEKOPPELE, J.M. Age-related decrease in proteoglycan synthesis of human articular chondrocytes. Arthr. Rheum, v.19, n.1, p.87-93, 1999.
DING, C.; CICUTTINI, F.; SCOTT, F.; GLISSON, M.; JONES, G. Sex differences in knee cartilage volume in adults: role of body and bone size, age and physical activity. Rheumatology, v. 42, p.1317-1323, 2003.
ECKSTEIN, F.; HUDELMAIER, M.; PUTZ, R. The effects of exercise on human articular cartilage. J.Anat., v. 208, p.491-512, 2006.
ECKSTEIN, F.; TIESCHKY, M.; FABER, S.; ENGLMEIER, K. H.; REISER, M. Functional analysis of articular cartilage deformation, recovery, and fluid flow following dynamic exercise in vivo. Anat Embryol., v. 200, p. 419-424, 1999.
80
EGRI, D.; BATTISTELLA, L.R.; YOSHIARI, N.H. Envelhecimento da cartilagem articular. Revista Brasileira de Reumatologia, v.39, n.1, p.45-48, 1999.
FETTER, N. L.; LEDDY, H. A.; GUILAK, F.; NUNLEY, J. A. Composition and transport properties of human ankle and knee cartilage. J Orthop Res, v. 24, n. 2, p. 211-219, 2006.
FITZGERALD, G.K.; CHILDS, J.D.; RIDGE, T.M.; IRRGANG, J.J.Agility and perturbation training for a physically active individual with knee osteoarthritis.Phys Ther, v.82, p.4, p.372-82, 2002.
FLECKNELL, P. Pain - assessment, alleviation and avoidance in laboratory animals. ANZCCART News, v.12, n. 4, p. 1-10,1999.
GARDNER, D. L.; MCGILLIVRAY, D. C. Surface structure of articular cartilage. Annals of Rheumatic Disease, v. 30, p. 10-14, 1971.
GARNERO, P.; PIPERNO, M.; GINEYTS, E.; CHRISTGAU, S.; DELMAS, P. D.; VIGNON, E.Cross sectional evaluation of biochemical markers of bone, cartilage, and synovial tissue metabolism in patients with knee osteoarthritis: relations with disease activity and joint damage. Ann Rheum Dis., v. 60, p. 619-626, 2001.
GENAZZANI, A. R.; GAMBACCIANI, M. Effect of climacteric transition and hormone replacement therapy on body weight and body fat distribution. Gynecol Endocrinol., v. 22, n. 3, p. 145-150, 2006.
GRODZINSKY, A.J.; Eletromechanical and physiochemical properties of connective tissue. CRC Critical Reviews in Biomedical Engineering, v.9, n.2, p.133-9, 1983.
GULISANO, M.; DELRIO, A.N.; FADDA, M.; MARCED, D.U.S. Human articular cartilage during osteoarthrosis: a study under the scanning electron microscope.Ital J Anat Embryol, v.98, n.3, p.175-85, 1993.
HAAPALA, J.; AROKOSKI, J.P.A. HYTTINEN, M.K.; LAMMI, M.; TAMMI, M.; KOVANEN, V.; HELMINEN, H.J.; KIVIRANTA, I. Remobilization does not fully restore immobilization induced articular cartilage atrophy. Clin. Otrthop. Rel. Res, v.362, p.218-229, 1999.
HALL, A. C.; URBAN, J. P. G.; GEHL, K. A. Effects of compression on the loss of newly synthetized proteoglycans and proteins from cartilage explants. Arch Biochem Biophys, v. 286, p. 20-29, 1991.
HARDINGHAM, T.; FOSANG, A. J. Proteoglycans: many forms and many functions. FASEB J, v. 6, n. 3. p. 861-870, 1992.
HARDINGHAM, T.; RAYAN, V.; LEWTHWAITE, J. C. Regulation of cartilage matrix synthesis by chondrocytes. Rev Rhum Ed Fr., v. 61, n. 9, p. 93-98, 1994(Supplement, 2).
81
HARDINGHAM, T.; TEW, S.; MURDOCH, A. Tissue engineering: chondrocytes and cartilage. Arthritis Res, v. 4, n. 3, p. 63-68, 2002.
HASCALL, V.C.; KIMURA, J.H.; Proteoglycans: isolation and characterization. Methods in Enzymology, 82,p.769-800 1982, Pt A.
HEISE, N.; TOLEDO, O.M.S. Age-related in glycosaminoglycan distribution in dfferent anatomical sites on the surface of knee-joint articular cartilage in young rabbits. Anals of Anaomy, v.175, n.1, p.35-40, 1993.
HERZOG, W.; DIEL, S.; SUTER, E.; MAYZUS, P. LEONARD T.; MULLER, C.; WU, J. Z. Material and functional properties of articular cartilage and patellofemoral contact mechanics in an experimental model of osteoarthritis. J Biomech., v. 31, n. 12, p. 1137-1175, 1998.
HOEG-ANDERSEN, P.; TANKO, L. B.; ANDERSEN, T. L.; LUNDBERG, C. V.; MO, J. A.; HEEGAARD, A. M.; DELAISSE, J. M.; CHRISTGAU, S. Ovariectomized rats as a model of postmenopausal osteoarthritis: validation and application. Arthritis Rest Her., v. 6, n. 2, p. 169-180, 2004.
HUBER, M.; TRATTNIG, S.; LINTNER, F. Anatomy, biochemistry and physiology of articular cartilage. Invest Radiol., v. 35, n. 10, p. 573-580, 2000.
HUDELMAIER, M.; GLASER, C.; ENGLMEIER, K.H.; REISER, M.; PUTZ, R.; ECKSTEIN, F. Age-related changes in the morphology on deformational behavior of knee joint cartilage. Arthritis and Rheumatism, v.44, n.11, p.2556-2561, 2001.
INGELMARK, B. E. Morpho-physyological aspects of gymnastic exercise. Federation Internationale de I’Education Phydique Bullettin, v. 27, p. 37-41, 1957.
IRWIN, M. L.; YASUI, Y.; ULRICH, C. M.; BOWEN, D.; RUDOLPH, R. E.; SCHWARTZ, R. S.; YUKAWA, M.; AIELLO, E.; POTTER, J. D.; MCTIERNAN, A. Effect of exercise on total and intra-abdominal body fat in postmenopausal women: a randomized controlled trial. JAMA, v. 289, n. 3, p. 323-330, 2003.
JONES, O.; GLISSON, M.; HYNES, K.; CICUTTINI, F. Sex and site diferences in cartilage development – a possible explanation for variations in knee osteoarthritis in later life. Arthritis Rheum., v. 43, n. 11, p. 2543-2549, 2000.
JUNQUEIRA, L. C. U.; BIGNOLAS, G.; BRENTANI, R. R. Picrossirius red staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J., v. 11, p. 447-455, 1979.
KAAB, M. J.; ITO, K.; CLARK, J. M.; NOTZLI, H. P. Deformation of articular cartilage collagen structure under static and cyclic loading. J Orthop Res., v. 16, n. 6, p. 743-751, 1998.
82
KARVONEN, R. L.; NEGENDANK, W. G.; TEIGE, R. A.; REED, R. A.; MILLER, P. R.; FERNANDEZ, F. Factors affecting articular cartilage thickness in osteoarthritis and aging. J Rheumatol., v. 21, n. 7, p. 1310-1318, 1994.
KIM, Y. J.; SAH, R. L.; GRODZINSKY, A. J.; PLAAS, A. H. K.; SAND, Y. J. D. Mechanical regulation of cartilage biosynthetíc behavior: Physical stimuli. Arch Biochem Biophys., v. 311, n. 1, p. 1-12, 1994.
KIM, H. A.; SUH, D.; SONG, Y. W. Relationship between chondrocyte apoptosis and matrix depletion in human articular cartilage. J Rheum., v. 28, n. 9, p. 2038-2045, 2001.
KIVIRANTA, I.; JURVELIN, J.; TAMMI, M.; SÄÄMÄNEN, A. M.; HELMINEN, J. H. Weight bearing controls glycosaminoglycan concentration and articular cartilage thickness in the knee joints of young beagle dogs. Arthritis Rheum, v. 7, n. 30, p. 801-809, 1987.
KIVIRANTA, I.; TAMMI, M.; JURVELIN, J.; SÄÄMÄNEN, A. M.; HEIMINEN, J. H. Moderate running exercise augments glycosaminoglycans and thickness of articular cartilage in the joint of young beagle dogs. J Orthop Res., v. 6, n. 2, p. 188-195, 1988.
KUETTNER, K. E.; AYDELOTTE, M. B.; THONAR, E. J. Articular cartilage matrix and structure: a minireview. J Rheumatol Suppl, v. 27, p. 46-48, 1991.
LANE, N. E.; BUCKWALTER, J.A. Exercise: a cause of osteoarthritis? Rheum Dis ClinNorth Am, v. 19, n. 3, p. 617-33, 1993.
LEANNE, S.; CAROLINE, F.; SHONA, B. Sports participation, sports injuries an osteoarthritis. Sports Med., v. 28, n. 2, p. 123-135, 1999.
LEVANON, D. STEIN.;H. The articular cartilage of the rabbit knee: A scanning electron microscopy study. Cells and Materials, v.1, p.219-229, 1991.
LOESER, R.F., Aging and the etiopathogenesis and treatment of osteoarthritis. Rheumatic Diseases Clinics of North America, v.26, n.3, p.547-567, 2000.
LOTHE, K.; SPYCHER, M. A.; RUTTNER, J. R. Human articular cartilage in relation to age, A morphometric study. Exp Cell Biol., v. 47, n. 1, p. 22-28, 1979.
MAFFULLI, N.; KING, J. B. Effects of physical activity on some components of skelectal system. Sports Medicine, v. 13, n. 6, p. 393-407, 1992.
MARCONDES, F. K.; BIANCHI, F. J.; TANNO, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Braz. J. Biol., v. 62. n. 4A, p. 609-614, 2002.
MAROUDAS, A. Balance between swelling pressure and collagen tension in normal and degenerative cartilage. Nature, v.260, n.5554, p.808-809, 1976.
83
MARTI, T.; KNOBLOCH, M.; TSCHOPP, A.; JUCKER, A.; HOWALD, H. Is excessive running predictive of degenerative hip disease? Controlled study of former elite athletes. Brsitish Medical Journal, v. 299, p. 91-93, 1989.
MARTINS, R. R.; PEREIRA, N. M. L. SILVA, T. M. A. Liquid-base cytology: a new method for estral cycle study in wistar's rats, Acta Cir. Brás., v. 20, n. 1, p. 46-49, 2005.
MCDEVITT, C.A.; MUIR, H. Biochemical changes in the cartilage of the knee in experimental and natural osteoarthritis in the dog. Journal of Anatomy,v.58, n.1, p,94-101, 1976.
MERCURO, G.; SAIU, F.; DEIDDA, M.; MERCURO, S.; VITALE, C.; ROSANO, G. M. Impairment of physical exercise capacity in healthy postmenopausal women. Am Heart J., v. 151, n. 4, p. 923-927, 2006.
MOLLENHAUER, J.; BEE, J. A.; LIZARBE, M. A. VON DER MARK, K. Role of anchorin CII, a 31,000-mol wt membrane protein, in the interaction of chondrocytes with type II collagen. J Cell Biol., v. 98, p. 1572-1579, 1984.
MOURITZEN, U.; CHRISTGAU, S.; LEHMANN, H. J.; TANKO, L. B.; CHRISTIANSEN, C. Cartilage turnover assessed with a newly developed assay measuring collagen type II degradation products: influence of age, sex, menopause, hormone replacent therapy and body mass index. Ann Rheum Dis., v. 62, p. 332-336, 2003.
NEWTON, P. M.; MOW, V. O.; GARDNER, T. R.; BUCWALTER, L. A.; ALBRIGHT, J. P. The effect of Iifelong exercise on canine articular cartilage. Am J Sports Méd., v. 25, n. 3, p. 282-287, 1997.
NISHIMURA, T.; HATTORI, A.; TAKAHASHI, H. Arrangement and identification of proteoglycans in basement membrane and intramuscular connective tissue of bovine semitendinosus muscle. Acta Anatomica, v.155, p.257-265, 1996.
O’CONNOR, P.; ORFORD, C.E.; GARDNER, D.L. Differential response to compressive loads of zones of canine hyaline articular cartilage: micromechanical, light and electron microscopic studies. Annals of the Rheumatic Diseases, v. 47, n.5, p.414-420, 1988.
ODA, J. Y. Estudo Morfoquantitativo das alterações decorrentes do envelhecimento na cartilagem articular da epífise distal do fêmur de ratos. 2005. 77 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005.
OTTERNESS, I. G.; ESKRA, J. D.; BLIVEN, M. L.; SHAY, A. K.; PELLETIER, J. P.; MILICI, A. J. Exercise protects against articular cartilage degeneration in the hamster. Arthritis Rheum, v. 41, n. 11, p. 2068-2076, 1998.
PANULA, H. E.; HYTTINEN, M. M.; AROKOSKI, J. P. A.; LANGSJO, T. K.; PELTTARI, A.; KIVIRANTA, I.; HELMINEN, H. Articular cartilage superficial zone collagen
84
birefringence reduced and cartilage thickness increased before surface fibrillation in experimental ostoarthritis. Ann Rheum Dis., n. 57, p. 237-245 1998.
PALMOSKI, M.J.; COLYER, R.A.; BRANDT, K.D. Joint motion in the absence of normal loading does not maintain normal cartilage. Arthritis and Rheumatism, v.23, n.3, p.325-334, 1980.
PALMOSKI, M.J.; BRANDT, K.D. Running inhibits the reversal of atrophic changes in canine knee cartilage after removal of leg cast. Arthritis an Rheumatism, n.11, p.1329-37, 1981.
PAP, G.; EBERHARD, T. R.; STÜRMER, I.; MACHNER, A.; SCHWARTZBERG, H.; ROESSNER, A.; NEUMANN, W. Development of osteoarthritis in the knee joints of Wistar rats after strenous running exercise in a running wheel by intracranial self-stimulation. Path Res Pract., v. 194, p. 41-47, 1998.
PARKER, D.; HWA, S. Y.; SAMBROOK, P.; GHOSH, P. Estrogen replacement therapy mitigates the loss of joint cartilage proteoglycans and bone mineral density induced by ovariectomy and osteoarthritis. APLAR Journal of Rheumatology, v. 6, p. 116-127, 2003.
POOLE, A. R.; KOJIMA, T.; YASUDA, T.; MWALE, F.; KOBAYASHI, M.; LAVERTY, S. Composition and structure of articular cartilage: a template for tissue repair. Clin Orthop Relat Res., v. 391, p. 26-33, 2001.
PRITZKER, K. P. Animal models for osteoarthritis processes, problems and prospects. Ann Rheumatic Dis., v. 53, p. 406-420, 1994.
RASCH,.J. Cinesiologia e anatomia aplicada. In:___ RASCH, P.J. Cinesiologia, 7ª. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1991, p.12-21.
REDLER, I; ZIMNY, M.L. Scanning electron microscopy of normal and abnormal articular cartilage and synovium. J Bone Joint Surg Am, v. 52, n.7, p.1395-404, 1970.
ROUGHLEY, P..; WHITE, R. J. Age-related in the structure of proteoglycan subunits from human articular cartilage. The Journal of Biological hemistry, v.225, n.1, p. 217-224, 1980.
ROUGHLEY, P.J. Age-associated changes in cartilage matrix – implications for tissue repair. Clinical Orthopaedics and Related Research, v.391, s.153-160, 2001.
RUOSLAHTI, E.; YAMAGUCI, Y.C. Proteoglycans as modulators of growth factor activities. Cell, v.64, n.5, p.867-869, 1991.
SÄÄMÄMEN, A.; TAMMI, M.; KIVIRANTA, I.; JURVELIN, J.; HELMINEN, H.J. Running exercise as a modulator of proteoglycans matrix in the articular cartilage of young rabbits. International Journal of Sports Medicine, v.9, n.2, p.127-132, 1988.
85
SÄÄMÄMEN, A.; KIVIRANTA, I.; JURVELIN, J.; HELMINEN, H. J.; TAMMI, M. Proteoglycan and collagen alterations in canine knee articular cartilage following 20 km daily running exercise for 15 weeks. Conn Tis Res., v. 30, p. 191-201, 1994.
SALVATORE, C. A.; SCHREIDER, G. Pesquisas cariométricas no ciclo estral e gravídico. Mem Inst Butantã, v. 20, p. 39-78, 1947.
SCHMIDT, MB.; MOW, V.C.; CHUN, L.E.; EYRE, D.R. Effects of proteoglycan extraction on the tensile behavior of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research, v.8, n.3, p.353-363, 1990.
SILVA, G. J. J.; BRUM, P. C.; NEGRÃO, C. E.; KRIGER, E. M. Acute and Chronic Effects of Exercise on Baroreflexes in Spontaneoously Hypertensive Rats. Hipertesion, v. 30, p. 714-726, 1997.
SOMMER, H. M. The biochemical and metabolic effect os a running regime on the Achilles tendon in the rat. Orthopaedics, v.11, p. 71-75, 1987.
STEVENS, A.; LOWE, J. J. Tecido Conjuntivo In:____ STEVENS, A.; LOWE, J. Human Histology, 2ª.ed. USA: Morby, 1997, p.49-64.
STOCKWELL, R. A. Lipid content of human costal and articular cartilage. Ann Rheum Dis., v.26, n. 6, p. 481-486, 1967.
TAKANO, H.; AIZAWA, T.; IRIE, T.; KOKUBUN, S.; ITOI, E. Estrogen deficiency leads to decrease in chondrocyte numbers in the rabbit growth plate. J Orthop Sci., v. 2, n. 4, p. 366-374, 2007.
TALWAR, R. M.; WONG, B. S.; SVOBODA, K.; HARPER, R. P. Effects of estrogen on chondrocyte proliferation and collagen synthesis in skeletally mature articular cartilage. J Oral Maxillofac Surg., v. 64, n. 4, p. 600-609, 2006.
TAN, A.H.; MITRA, A.K.; CHANG, P.C.; TAY, B.K.; NAG, H.L.; SIM, C.S.Assessment of blood-induced cartilage damage in rabbit knees using scanning electron microscopy. J Orthop Surg, v.12, n.2, p.199-204, 2004.
TESCHE, F.; MIOSGE, N. New aspects of the pathogenesis of osteoarthritis: the role of fibroblast-like chondrocytes in late stages of the disease. Histol Histopathol., v. 20, n. 1,p. 329-337, 2005.
THORNDIKE, E. A.; TURNER, A. S. In search of an animal model for postmenopausal diseases. Front Biosci., v. 3c, p. 17-26, 1998.
TRATTNIG S. Overuse of hyaline cartilage and imaging. Euopean Journal of Radiology, v.25, n.3, p.88-198, 1997.
86
TUFFERY, A. A. Anaesthesia. In: _____Laboratory animals. An introduction for experiments. 2. ed. UK: John Wiley & Sons Ltd, 1995, p. 324.
VAN DEN HOOGEN, B.M.; VAN DE LEST, C.H.A.; VAN WEEREN, P.R.; LAFEBER, F.P.J.G.; LOPES-CARDOZO, M,; VAN GOLDE, L.M.G. Loading-induced changes in synovial joints affect cartilage metabolism. British Journal of Rheumatology, v.37, n.6, p.671-676, 1998.
VAN KUPPEVELT, H.M.S.M.; DOMEN, J.G.W.; CREMERS, F.P.M.; KUYPER, C.M.A. Staining of proteoglycans in mouse lung alveoli. Ultrastructural localization of anionic sites. The Histochemical Journal, v.16, n.6, p.657-669, 1984.
WALKER, J.M. Epidemiology and economics of arthritis. In:____WALKER, J>M.; HELEWA, R. Physical Therapy in Arthritis. USA: WB. Saunders Company, 1996.
WARD, D.J.; TIDSWELL, M.E. Osteoartrite. In:____ DOWNIE, P.; CASH, L. Fisioterapia em Ortopedia e Reumatologia, São Paulo: Panamericana, 1987; p.263-279.
WIGHT, T.N. HEINEGARD, D.K.; HASCALL,V.C. Proteoglycans :Structure and functions, In: ____HAY, E. Cell Biology of Extracellular Matrix. 2ª.ed. New York: Plenum Press, 1991.
WLUKA, A. E.; WOLFE, R.; DAVID, S. R.; STUCKEY, S.; CICUTTINI, F. M. Tibial cartilage volume change in healthy postmenopausal women: a longitunal study. Ann Rheum Dis, v. 63, p. 444-449, 2004.
WU, J. Z.; HERZOG, W. Elastic anisotropy of articular cartilage is associated with the microestrutures of collagen fibers and chondrocytes. J Biomech., v. 35, n. 7, p. 931-942, 2002.
WULFSOHN, D.; GUNDERSE, H. J.; VEDEL JENSE, E. B.; NYENGAARD, J. R. Volume estimation from projections. J Microsc., v. 215, p. 111-120, 2004. (Supplement, 2).
YANAGISHITA, M. Function of proteoglycans in the extracellular matrix. Acta Pathologica Japonica, v.43, n.6, p.283-93, 1993.
YASUNORI, S.; NORIYUKI, S.; EICHI, T.; KAZUHARU, I.; TOSHIHIKO, Y. Effects of running exercise on the mandible and tíbia of ovariectomized rats. J Bone Miner Metab., v. 19, p. 159-167, 2001.