Efeitos do beta caroteno e do urucum sobre a expressão de ...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS E BIOLÓGICAS

NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

LORENA SOUZA E SILVA

Efeitos do beta caroteno e do urucum sobre a

expressão de genes hepáticos do metabolismo

do colesterol em ratas hipercolesterolêmicas

Ouro Preto

2013

LORENA SOUZA E SILVA

Efeitos do beta caroteno e do urucum sobre a

expressão de genes hepáticos do metabolismo

do colesterol em ratas hipercolesterolêmicas

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Ouro Preto como

parte integrante dos requisitos para a obtenção

do título de Doutor em Ciências Biológicas,

área de Concentração: Bioquímica Estrutural e

Fisiológica

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva

Ouro Preto

2013

Catalogação: [email protected]

S586e Silva, Lorena Souza e.

Efeitos do beta caroteno e do urucum sobre a expressão de genes hepáticos

do metabolismo do colesterol em ratas hipercolesterolêmicas [manuscrito] /

Lorena Souza e Silva - 2013.

xv, 97f.: il. color.; graf., tab.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto.

Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas.

Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.

1. Colesterol - Teses. 2. Expressão gênica - Teses. 3. Hipercolesterolemia -

Teses. 4. Rato como animal de laboratório - Teses. I. Silva, Marcelo Eustáquio.

II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.

CDU: 612.397:633.863

mailto:[email protected]

SILVA, L.S. Dedicatória

ii

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Zilda e

Geraldo, e à minha irmã

Renata, com muito amor.

SILVA, L.S. Agradecimento Especial

iii

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Agradeço ao Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva, a orientação e os

ensinamentos imprescindíveis para a realização deste trabalho. Agradeço a confiança

creditada a mim e principalmente a oportunidade de aprender com você durante todos

esses anos.

MUITO OBRIGADA!

SILVA, L.S. Agradecimentos

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus pelo dom da vida e pela dádiva do saber, por estar sempre comigo guiando

meus passos e me iluminando.

Aos meus pais e minha irmã, POR TUDO. Por acreditarem junto comigo nos meus

sonhos e não medirem esforços para que eu os realizasse. Pelo amor incondicional e

pelo apoio em todas as minhas decisões.

A minha família, que mesmo a distância torceu por mim.

Ao André, pelo tão dedicado amor e por fazer parte de todos os momentos dessa

trajetória. Obrigada pela paciência e serenidade com que me ouvia e principalmente por

nunca duvidar de que tudo iria dar certo!

As professoras Maria Lúcia Pedrosa e Daniela Caldeira Costa, pela parceria,

ensinamentos e oportunidades oferecidas para a realização deste trabalho. Muito

obrigada!

Ao Professor Rinaldo Cardoso dos Santos, pelo exemplo como mestre e profissional.

Agradeço por sempre me auxiliar tão prontamente, e por todas as sugestões dadas no

aprimoramento da escrita da tese e dos artigos.

A Professora Cíntia Lopes de Brito Magalhães, que de uma maneira tão solícita e

paciente me ensinou e ajudou com a técnica de qPCR. A sua ajuda foi extremamente

importante para a realização deste trabalho.

Aos colegas dos Laboratórios de Nutrição Experimental (LABNEX) e Bioquímica

Metabólica (LBM), Aline Mayrink de Miranda, Ana Flávia Santos Sampaio,

Bárbara Moreira Quirino, Bianca Figueiredo, Bruno da Cruz Pádua, Carolina

Morais Araújo, Danielle de Lima Ávila, Emerson Cruz de Oliveira, Fabiano Kenji

SILVA, L.S. Agradecimentos

v

Haraguchi, Fernanda Camini, Glaucy Rodrigues de Araújo, Isabel Emerich,

Joamyr Victor Rossoni Júnior, Joyce Ferreira Guerra, Kely Raspante, Maísa

Silva, Natália Nogueira do Nascimento, Pedro Henrique Amorim Miranda, Poliane

Maciel, Rogério Tadeu Ferreira, Sandra Camilo, Simone de Fátima Viana Cunha,

Waleska Claudia Dornas Amaral, a minha gratidão e reconhecimento de que a ajuda

de todos vocês foi fundamental para a realização deste trabalho.

Aos amigos que se tornaram irmãos. Obrigada Aline, Bruno, Carolina, Glaucy,

Joamyr, Melina, Natália, Pedro e Simone pela amizade, cumplicidade, sorrisos e

abraços. Como foi bom e divertido cada dia com vocês! A vocês eu dedico todo o meu

carinho!

Aos colegas da Pós Graduação e aos secretários e secretárias do NUPEB. Em especial à

Maria Aparecida Trópia pelo atendimento e auxilio sempre prestados com muita

simpatia e boa vontade.

Aos técnicos do Laboratório de Nutrição Experimental e Bioquímica Metabólica, Jair

Pastor Mota, Clodoaldo e Renata Rebeca, pela disponibilidade com que sempre me

atenderam.

Aos Laboratórios pertencentes ao Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, em

especial ao Laboratório de Biologia Molecular e Celular, Laboratório de Doença de

Chagas, Laboratório de Microbiologia e Laboratório de Imunoparasitologia pelo suporte

necessário a realização deste trabalho.

A querida e eterna República Tchu Tchu Tchu, que tanto amo! Obrigada á todas por

fazerem parte da minha história e por dividirem comigo os momentos mais incríveis que

passei em Ouro Preto. Vocês são parte de mim!

SILVA, L.S. Resumo

vi

RESUMO

Diversas pesquisas indicam que os carotenóides podem modificar o metabolismo

de lipídios e neste contexto, o beta caroteno e o urucum, um corante natural rico em

carotenóides, foram descritos em apresentar efeitos hipolidêmicos em diversos modelos

experimentais. Uma vez que evidências científicas sobre os mecanismos associados aos

efeitos hipolipidêmicos do beta caroteno e urucum ainda não estão bem estabelecidas, o

objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos destes compostos sobre a

expressão de genes hepáticos do metabolismo do colesterol em um modelo de rato com

hipercolesterolemia induzida por dieta. Quarenta ratas albinas da linhagem Fisher,

foram divididas em cinco grupos de 8 animais de acordo com o tratamento recebido. O

grupo C recebeu dieta padrão AIN-93M (4% óleo de soja), o grupo H recebeu dieta

hipercolesterolemiante (25% de óleo de soja e 1% de colesterol), o grupo HBC recebeu

a dieta hipercolesterolemiante suplementada com 0,2% beta caroteno, o grupo HU 0,1%

recebeu a dieta hipercolesterolemiante suplementada com 0,1% de semente de urucum

em pó e o grupo HU 0,2% recebeu a dieta hipercolesterolemiante suplementada com

0,2% de semente de urucum em pó. Após oito semanas de experimentação, os animais

foram anestesiados e eutanasiados. O sangue foi coletado para a determinação do perfil

lipídico e o fígado foi removido para determinação da expressão de genes envolvidos no

metabolismo do colesterol. Para melhor entendimento dos resultados, os grupos foram

divididos como experimento 1 (grupos C, H e HBC) e experimento 2 (grupos C, H, HU

0,1% e HU 0,2%), onde foram avaliados os efeitos do beta caroteno e do urucum

separadamente e respectivamente. A suplementação do beta caroteno à dieta

hipercolesterolemiante melhorou significativamente o perfil lipídico sérico dos animais,

promovendo reduções no colesterol total, nas lipoproteínas aterogênicas, nos

triglicérides e no índice aterogênico. Além disso, o beta caroteno reduziu o conteúdo de

gordura e colesterol no fígado, bem como aumentou a excreção de gordura e colesterol

nas fezes. Nenhuma alteração na expressão dos genes SREBP-2, HMG-CoA R, LDLR,

PPARα, CYP7A1, ABCG5 ou ABCG8 foi obtida pela suplementação com beta

caroteno, sugerindo que seu efeito hipocolesterolemiante possa estar relacionado à

diminuição da absorção intestinal do colesterol. A suplementação do urucum à dieta

SILVA, L.S. Resumo

vii

hipercolesterolemiante promoveu melhoras no perfil lipídico sérico dos animais, como a

redução do colesterol total, das lipoproteínas aterogênicas e do índice aterogênico, bem

como promoveu alterações na expressão de genes do metabolismo de colesterol. A

suplementação do urucum em ambas as concentrações elevou as expressões de

CYP7A1, SHP e ABCB11. Estes resultados sugerem que o efeito hipocolesterolemiante

do urucum estaria relacionado à via de catabolismo do colesterol através da up

regulation da CYP7A1, a enzima responsável pela conversão de colesterol á ácidos

biliares. A partir desses resultados observamos que embora por mecanismos diferentes,

tanto o beta caroteno quanto urucum exerceram efeitos hipolipidêmicos importantes.

Palavras-chaves: Beta caroteno, urucum, metabolismo do colesterol, expressão gênica,

hipercolesterolemia, ratos.

SILVA, L.S. Abstract

viii

ABSTRACT

Several studies indicate that carotenoids may modify lipid metabolism and in

this context, beta-carotene and annatto, a natural colorant rich in carotenoids, have been

reported to present hypolipidemics effects in various experimental models. Since

scientific evidence on the mechanisms associated with hypolipidemic effects of beta-

carotene and annatto are not well established, the objective of this study was to

investigate the effects of these compounds on the expression of liver genes of

cholesterol metabolism in a rat model with diet-induced hypercholesterolemia. Forty

albino rats of Fisher strain were divided into five groups of 8 animals according to the

received treatment. The C group received the standard AIN-93M diet (4% soybean oil),

the H group received a hypercholesterolemic diet (25% of soybean oil and 1%

cholesterol), the HBC group received the hypercholesterolemic diet supplemented with

0.2% beta-carotene, the HU 0.1% group received the hypercholesterolemic diet

supplemented with 0.1% annatto seed powder and the HU 0.2% group received the

hypercholesterolemic diet supplemented with 0.2% annatto seed powder. After eight

weeks of experiment, animals were anesthetized and euthanized. Blood was collected

for determination of the lipid profile and the liver was removed for determination of the

expression of genes involved in cholesterol metabolism. To better understand the

results, groups were divided as experiment 1 (C, H and HBC groups) and experiment 2

(C, H, HU 0.1% and HU 0.2 % groups), to evaluate the effects of beta-carotene and

annato separately and respectively. The supplementation of beta-carotene of the

hypercholesterolemic diet significantly improved the serum lipid profile of the animals,

promoting reductions in total cholesterol, atherogenic lipoproteins, triglycerides and in

the atherogenic index. In addition, beta-carotene reduced the fat and cholesterol content

in the liver, as well as increased fat and cholesterol excretion in the feces. No changes in

the expression of genes SREBP-2, HMG-CoA R, LDLR, PPARα, CYP7A1, ABCG5 or

ABCG8 were obtained by supplementation with beta-carotene, suggesting that its

hypocholesterolemic effect may be related to decreased intestinal absorption of

cholesterol. The supplementation of annatto in the hypercholesterolemic diet promoted

improvements in serum lipid profile of the animals, such as reduction in total

cholesterol, atherogenic lipoproteins and atherogenic index, and promoted changes in

SILVA, L.S. Abstract

ix

the expression of genes of cholesterol metabolism.The addition of annatto in both

concentrations increased the expression of CYP7A1, SHP and ABCB11. These results

suggest that the cholesterol lowering effect of annatto is related to the route of

catabolism of cholesterol by up regulation of CYP7A1, the enzyme responsible for

conversion of cholesterol to bile acids. From these results we observe that although by

different mechanisms, both beta-carotene as annatto exerted important hypolipidemic

effects.

Keywords: Beta-carotene, annatto, cholesterol metabolism, gene expression,

hypercholesterolemia, rats.

SILVA, L.S. Sumário

x

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... xii LISTA DE TABELAS ................................................................................................... xiv

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... xv CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO ..................................................................................... 2 CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 5

2.1 - Dislipidemias e Mecanismos de Regulação do Metabolismo do Colesterol ........ 5 2.2 - Carotenóides e sua Importância na Dieta ........................................................... 14 2.3 - Beta Caroteno ..................................................................................................... 19 2.4 - Urucum (Bixa orellana L.) e Urucum ................................................................ 22

CAPÍTULO 3 – OBJETIVOS ........................................................................................ 29 3.1 – Objetivo Geral .................................................................................................... 29 3.2 – Objetivos Específicos ........................................................................................ 29

CAPÍTULO 4 – MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 31

4.1 - Animais ............................................................................................................... 31 4.2 - Delineamento Experimental ............................................................................... 31

4.3 - Dietas .................................................................................................................. 32

4.4 - Eutanásia ............................................................................................................. 33

4.5 - Dosagens dos Parâmetros Bioquímicos .............................................................. 33 4.6 - Extração e Dosagem da Gordura Hepática ......................................................... 34

4.6.1 - DOSAGEM DE COLESTEROL TOTAL NA GORDURA HEPÁTICA ....................... 34 4.7 - Extração e Dosagem da Gordura Fecal .............................................................. 35

4.7.1 - DOSAGEM DE COLESTEROL TOTAL NA GORDURA FECAL ............................. 35

4.8 - Ensaio de RT-PCR Quantitativa em Tempo Real .............................................. 36 4.8.1 - EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL ......................................................................... 36

4.8.2 - SÍNTESE DO CDNA ....................................................................................... 37

4.7.3 - DESENHO DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES ...................................... 37 4.8.4 - CURVA DE EFICIÊNCIA DO OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES.................... 39

4.8.5 - RT-PCR QUANTITAIVA EM TEMPO REAL..................................................... 39

4.9 - Análise Estatística .............................................................................................. 40

CAPÍTULO 5 – RESULTADOS .................................................................................... 42 5.1 - Experimento 1 .................................................................................................... 42

5.1.1 - INGESTÃO ALIMENTAR, GANHO DE PESO E EFICIÊNCIA ALIMENTAR ........... 42

5.1.2 - PERFIL LIPÍDICO E ÍNDICE ATEROGÊNICO ..................................................... 43 5.1.3 - PESO RELATIVO DO FÍGADO E QUANTIDADES DE GORDURA E COLESTEROL

TOTAL HEPÁTICO..................................................................................................... 44 5.1.4 - EXCREÇÃO FECAL E QUANTIDADES DE GORDURA E COLESTERL TOTAL

FECAL ...................................................................................................................... 45

5.1.5 - EXPRESSÃO DE GENES DO METABOLISMO HEPÁTICO DO COLESTEROL ...... 46 5.2 - Experimento 2 .................................................................................................... 48

5.2.1 - INGESTÃO ALIMENTAR, GANHO DE PESO E EFICIÊNCIA ALIMENTAR ........... 48 5.2.2 - PERFIL LIPÍDICO E ÍNDICE ATEROGÊNICO ..................................................... 49

SILVA, L.S. Sumário

xi

5.2.3 - PESO RELATIVO DO FÍGADO E QUANTIDADES DE GORDURA E COLESTEROL

TOTAL HEPÁTICO..................................................................................................... 50

5.2.4 - EXCREÇÃO FECAL E QUANTIDADES DE GORDURA E COLESTERL TOTAL

FECAL ...................................................................................................................... 51 5.2.5 - EXPRESSÃO DE GENES DO METABOLISMO HEPÁTICO DO COLESTEROL ........ 52

CAPÍTULO 6 – DISCUSSÃO ....................................................................................... 57 6.1- Experimento 1 ..................................................................................................... 57

6.2 - Experimento 2 .................................................................................................... 65 CAPÍTULO 7 – CONCLUSÕES ................................................................................... 72 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 74

ANEXOS.........................................................................................................................92

SILVA, L.S. Lista de Abreviaturas

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

ABCGs - do inglês, ATP-binding cassette subfamily G transporters

ACAT - Acil-CoA- colesterol aciltransferase

AIN - do inglês- American Institute of Nutrition

ANOVA - Análise de variância

apoA1 - Apolipoproteína AI

apoAII - Apolipoproteína AII

ApoAV - Apolipoproteína AV

apoCIII - Apolipoproteína CIII

BARE - Elemento de resposta á ácidos biliares

C - Grupo controle

CT - do inglês, threshold cycle

CYP7A1 - Colesterol-7α -hidroxilase

DCV - Doenças Cardiovasculares

FXR - Receptor X farnesóide

FXRE - Elemento de resposta a FXR

GAPDH - Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

H - Grupo que recebeu dieta hipercolesterolemiante

HBC - Grupo que recebeu dieta hipercolesterolemiante suplementada com beta

caroteno

HDL - Lipoproteína de alta densidade

HMG-CoA R - 3-hidróxi-3-metil-glutaril CoA redutase

HU 0,1% - Grupo que recebeu dieta hipercolesterolemiante suplementada com urucum

à 0,1%

HU 0,2% - Grupo que recebeu dieta hipercolesterolemiante suplementada com urucum

à 0,2%

INSIG -1 - Gene 1 induzido por insulina

JNK - c-Jun N-terminal quinase

LDL - Lipoproteína de baixa densidade

LDLR - Receptor de LDL

SILVA, L.S. Lista de Abreviaturas

xiii

LRH-1 - do inglês, liver receptor homolog-1

LXR - Receptor X hepático

LXRE - Elemento de resposta á LXR

PPAR - Receptores ativados por proliferadores de peroxisomos

qPCR- Reacão em cadeia da polimerase quantitativa

RXR - Receptor X retinóide

SCAP - Proteína ativadora da clivagem de SREBP

SHP - do inglês, small heterodimer partner

SRE - Elemento de resposta á esterol

SREBP-2 - Proteína ligadora aos elementos de resposta a esterol - 2

VLDL - Lipoproteína de densidade muito baixa

SILVA, L.S. Lista de Tabelas

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela I - Carotenóides de Bixa orellana.......................................................................26

Tabela II - Composição das dietas experimentais (g/Kg de dieta).................................32

TABELA III - Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a análise qRT-PCR........38

Tabela IV - Ingestão alimentar diária, ganho de peso corporal, e eficiência alimentar

em ratas tratadas com dieta padrão, dieta hipercolesterolemiante e dieta

hipercolesterolemiante suplementada com e beta caroteno.............................................42

Tabela V - Perfil lipídico sérico e índice aterogênico de ratas tratadas com dieta padrão,

dieta hipercolesterolemiante e dieta hipercolesterolemiante suplementada com e beta

caroteno...........................................................................................................................44

Tabela VI – Peso relativo do fígado e conteúdos totais de gordura e colesterol hepático


hipercolesterolemiante suplementada com e beta caroteno.............................................45

Tabela VII – Excreção fecal diária e conteúdos totais de gordura e colesterol fecal em

ratas tratadas com dieta padrão, dieta hipercolesterolemiante e dieta

hipercolesterolemiante suplementada com beta caroteno...............................................46

Tabela VIII - Ingestão alimentar diária, ganho de peso corporal, e eficiência alimentar


hipercolesterolemiante suplementada com urucum.........................................................48

Tabela IX - Perfil lipídico sérico e índice aterogênico de ratas tratadas com dieta

padrão, dieta hipercolesterolemiante e dieta hipercolesterolemiante suplementada com

urucum............................................................................................................................50

Tabela X – Peso relativo do fígado e conteúdos totais de gordura e colesterol hepático



Tabela XI – Excreção fecal diária e conteúdos totais de gordura e colesterol fecal em



SILVA, L.S. Lista de Figuras

xv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Ativação de SREBP por clivagem proteolítica................................................8

Figura 2- Modelo simplificado da regulação do metabolismo de colesterol e ácidos

biliares por LXR e FXR...................................................................................................10

Figura 3 - Modelo de regulação da expressão de CYP7A1 por sinalização em cascata através de

FXR e JNK...................................................................................................................................12

Figura 4 - Efeitos biológicos do PPARα........................................................................14

Figura 5 - Estruturas da -ionona e dos principais carotenóides dietéticos...................16

Figura 6- Papel dos carotenóides na prevenção de doenças crônicas............................18

Figura 7 - Fotos de urucum............................................................................................22

Figura 8- Estruturas moleculares da cis e trans bixina e cis e trans norbixina..............24

Figura 9 – Curva de crescimento semanal dos grupos de animais do experimento 1....43

Figura 10- Expressão do mRNA de genes hepáticos relacionados ao metabolismo de

lipídios (SREBP-2, HMG CoA R, LDLR, PPAR α, CYP7A1, ABCG5 e ABCG8)......47

Figura 11 - Curva de crescimento semanal dos grupos de animais do experimento 2...49

Figura 12 - Expressão do mRNA de genes hepáticos relacionados ao metabolismo de

lipídios (SREBP-2, HMG CoA R, LDLR, PPAR α).......................................................53

Figura 13 - Expressão do mRNA de genes hepáticos relacionados ao metabolismo de

lipídios (CYP7A1, LXR, FXR, ABCG5, ABCG8, SHP, ABCG11)..............................55

Figura 14 - Resumo dos principais efeitos do beta caroteno no soro,

nas fezes e no fígado.....................................................................................................................64

Figura 15 – Proposta do efeito hipocolesterolêmico do urucum.................................................70

SILVA, L.S. Capítulo 1 - Introdução

2

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO

As doenças cardiovasculares (DCV) são as principais causas de morte em países

economicamente desenvolvidos, bem como em países de economia emergente (Leifert e

Abeywardena, 2008). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), todo

ano mais de 17 milhões de pessoas morrem vítimas de DCVs, as quais estão entre as

principais responsáveis pelo aumento da morbi-mortalidade dentre as afecções não

transmissíveis.

Idade, sexo, predisposição genética, estilo de vida e dieta são reconhecidos como

os principais fatores de risco modificáveis para DCV. Os efeitos negativos da ingestão

excessiva de gorduras saturadas e colesterol, por exemplo, já estão bem estabelecidos

no desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Leifert e Abeywardena, 2008).

Para reduzir as DCV por meio da redução das concentrações de colesterol

circulante, muita atenção tem sido focada na pesquisa por intervenções dietéticas para a

hipercolesterolemia (Park et al, 2009). Tem sido demonstrado que alguns fitoquímicos

de plantas medicinais tradicionais têm efeitos hipolipidêmicos, por modularem a

expressão de genes envolvidos no metabolismo de lipídios e lipoproteínas (Chung et al.,

2007, 2008). Também tem sido demonstrado que os suplementos antioxidantes podem

efetivamente reduzir o perfil lipoproteico aterogênico em doentes com hiperlipidemia e

aterosclerose (Diaz et al., 1997). Estas observações sugerem que a atividade

antioxidante e os efeitos de redução do colesterol de vários extratos vegetais podem

reduzir o desenvolvimento e/ou progressão da aterosclerose e doenças cardiovasculares

(Chung et al., 2007; Chung et al., 2008).

Os carotenóides são um grande grupo de pigmentos presentes na natureza,

identificados em plantas superiores, algas, fungos, bactérias e em alguns animais. Eles

são responsáveis pelas cores do amarelo ao vermelho de frutas, vegetais, fungos e

flores, e são utilizados comercialmente como corantes alimentícios e em suplementos

nutricionais. A produção mundial de carotenóides é calculada em 100 milhões de

toneladas por ano e seu mercado global em 2005 foi estimado em US$ 935 milhões com

projeções de elevação para US$ 1 bilhão até antes do ano de 2009 (Guzman, 2005;

Uenojo et al., 2007). Estes compostos, além do poder corante, possuem importante

função nutricional na dieta humana. São precursores de vitamina A, além de outras

SILVA, L.S. Capítulo 1 - Introdução

3

ações benéficas como proteção contra certos tipos de câncer, doenças cardiovasculares,

cataratas, degeneração macular e fortalecimento do sistema imunológico (Krinsky,

1994; Olson, 1999).

Por muitos anos, o representante mais proeminente dos carotenóides, o beta

caroteno, foi usado como corante de alimentos. O beta caroteno é provavelmente o mais

estudado, e um dos principais presentes na dieta, sangue e tecidos (Krinsky e Johnson,

2005). Evidências experimentais indicam que a ingestão deste carotenóide está

associada à diminuição do risco para doença arterial coronariana (Gaziano e Hennekens,

1993) e sua administração foi responsável por efeitos hipolipidêmicos em ratos e

coelhos hipercolesterolêmicos (Amen e Lachance 1974; Erdman e Lachance, 1974; Tsai

e Mazeedi, 1988; Tsai et al., 1992; Shaish et al., 1995).

O urucuzeiro (Bixa orellana L.) é uma planta nativa da Floresta Tropical da

América Central e do Sul, suas sementes são uma rica fonte de pigmentos vermelhos

alaranjados que têm sido amplamente usados pela indústria de corantes de alimentos, os

quais se constituem numa mistura de muitos carotenóides, tais como bixina, norbixina,

fitoenos e δ-carotenos (Mercadante et al., 1996; Fernandes et al., 2002; Felicissimo et

al, 2004). Esta planta é conhecida por estar associada ao tratamento de várias doenças

na medicina popular e o consumo dos extratos do urucum tem mostrado várias

propriedades bioativas, incluindo propriedades antioxidantes, através da modulação da

produção de espécies reativas de oxigênio, propriedades antitumorais (Junior et al.,

2005; Agner et al., 2005; Rossoni Jr. et al., 2011), bem como efeitos hipolipidêmicos

em ratos, camundongos e coelhos (Lima et al., 2001; Lima et al, 2003; de Paula et al.,

2009; Ferreira et al., 2012).

Muitas linhas de pesquisa tem sugerido que os carotenóides podem modificar o

metabolismo de lipídios (Shih et al., 2008). Entretanto, ainda faltam informações de

como o beta caroteno e o urucum exercem seus efeitos hipolipidêmicos, e se os fatores

que regulam o metabolismo do colesterol podem ser influenciados pelo seu consumo.

Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos do urucum e do beta

caroteno sobre a expressão de genes hepáticos do metabolismo do colesterol em um

modelo de rato com hipercolesterolemia induzida por dieta.

SILVA, L.S. Capítulo 2 - Revisão Bibliográfica

5

CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 - DISLIPIDEMIAS E MECANISMOS DE REGULAÇÃO DO METABOLISMO

DO COLESTEROL

O colesterol é um componente estrutural essencial da membrana celular e um

importante precursor dos hormônios esteróides, oxisteróis e ácidos biliares (Rezen et al,

2011). Apesar de sua importância, quantidades excessivas de colesterol nas células

podem ocasionar patologias, incluindo a perda da função da membrana, a precipitação

na forma de cristais, ou resultar em danos ateroscleróticos (Weber et al, 2004; Oram,

2002).

Existe um delicado equilíbrio no organismo para cobrir as necessidades de

lipídios das células e, ao mesmo tempo, evitar seu acúmulo excessivo. Por razões não

muito claras, esse equilíbrio pode romper-se, elevando o nível de um ou mais

componentes lipídicos na corrente sanguínea, ao que se denomina dislipidemia

(Gonçalves et al., 2006).

A apresentação laboratorial das dislipidemias compreende quatro situações bem

definidas: hipercolesterolemia isolada (valores de aumentados de colesterol total);

hipertrigliceridemia isolada (valores aumentados de triglicérides); hiperlipidemia mista

(valores aumentados do colesterol total e dos triglicérides) e diminuição isolada do

colesterol HDL ou em associação com aumento do colesterol LDL e/ou dos triglicérides

(Sociedade Brasileira de Cardiologia, 2001).

A hipercolesterolemia é um fator de risco dominante que contribui para o

desenvolvimento e progressão da aterosclerose e subsequente doença cardiovascular,

uma das doenças mais sérias em humanos (Deppa e Varalakshmi, 2005).

As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade global, sendo

responsável por quase 17 milhões de mortes anualmente; a aterosclerose em particular,

é a principal contribuinte para a patogênese de infarto cerebral e do miocárdio. Por

muitos anos, tem sido mostrado que o excesso do colesterol LDL é o principal fator de


6

risco para a aterosclerose. As lipoproteínas de baixa densidade (LDLs) são as principais

carreadoras do colesterol no plasma e aparecem envolvidas no desenvolvimento de

várias doenças degenerativas tais como aterosclerose, carcinogênese, envelhecimento e

diabetes mellitus. Muitos estudos têm sugerido que modificações peroxidativas da LDL

é um importante fator nas mudanças ateroscleróticas (Nader et al., 2010).

Os ácidos graxos poliinsaturados nas lipoproteínas são quimicamente

vulneráveis ás espécies reativas de oxigênio. No caso da LDL, elas são atacadas pelos

radicais livres e então modificadas oxidativamente. A LDL oxidada (ox-LDL) é

responsável pela liberação de fatores que iniciam o recrutamento de monócitos e

promovem sua diferenciação em macrófagos. Ox-LDLs são reconhecidas por receptores

scavengers e internalizadas em macrófagos, células endoteliais e células musculares

lisas, levando á formação de células espumosas, o marcador do início das lesões

ateroscleróticas (Kaliora et al., 2009 ; Nader et al., 2010).

A manutenção da homeostase do colesterol é muito complexa e hermeticamente

controlada por mudanças nas concentrações do mRNA de múltiplas enzimas envolvidas

nas vias de biossíntese, captação e efluxo do colesterol. A 3-Hidróxi-3-metilglutaril

CoA redutase (HMG-CoA redutase) é a enzima limitante na biossíntese do colesterol. A

oxidação do colesterol pela colesterol-7α-hidroxilase (CYP7A1), a enzima limitante da

síntese de ácidos biliares, é a principal via de eliminação do colesterol do corpo e os

receptores de LDL (LDLR) desempenham um papel vital na captação e remoção do

colesterol plasmático (Reena et al., 2011).

Para que a homeostase do colesterol seja alcançada, o organismo deve integrar a

síntese de novo de colesterol, a captação do colesterol da circulação mediada por

receptores, a deposição de colesterol nas membranas e a secreção de lipoproteínas, bem

como o armazenamento intracelular de ésteres de colesterol e o metabolismo de

oxisteróis, ácidos biliares e hormônios esteróides. Estes processos são regulados por

vários fatores endógenos e exógenos e são dependentes do tipo de tecido. Proteínas

envolvidas na homeostase do colesterol são reguladas á níveis transcricionais e

traducionais e pós-transcricionalmente por modificações e degradação de proteínas

(Rezen et al, 2011).

A rápida regulação dos teores de colesterol livre na célula é conseguida por meio

modificação covalente de enzimas. Estudos mostram que a fosforilação inativa a HMG-


7

CoA redutase e ativa a CYP7A1 e a ACAT (Acil-CoA- colesterol aciltransferase),

enzima presente no fígado que catalisa a formação de ésteres de colesterol a partir de

colesterol (Scallen e Sanghvi, 1983). Como uma ação rápida, um aumento da

concentração de colesterol, leva a fosforilação que diminui a biossíntese e aumenta a

esterificação do colesterol e o metabolismo de ácidos biliares. Se esta regulação não é

suficiente, segue a regulação ao nível transcricional. Se o conteúdo de colesterol no

fígado é baixo, a expressão gênica é modulada, resultando em maior captação de

colesterol do plasma e menor efluxo, maior biossíntese de colesterol, menor síntese de

ácidos biliares e maior liberação do armazenamento de colesterol esterificado. Quando o

colesterol é abundante, há uma diminuição na biossíntese de colesterol, um aumento do

efluxo de colesterol para o plasma e para a bile e um aumento da síntese de ácidos

biliares e esterificação. Estes processos são regulados principalmente por dois fatores de

transcrição, que funcionam como sensores de esteróis celulares, o SREBP-2 (proteína

ligadora de elementos de resposta a esteróis) e o LXR (receptor X hepático) (Rezen et

al., 2011).

SREBP-2 é um fator de transcrição que reside no retículo endoplasmático. Na

presença de colesterol, SREBP-2 está ligado a duas outras proteínas: SCAP (proteína

ativadora da clivagem de SREBP) e INSIG-1 (gene 1 induzido por insulina). Quando o

nível de colesterol da membrana do retículo endoplasmático diminui, SCAP altera a sua

conformação e facilita a dissociação de INSIG-1 do complexo SREBP-2-SCAP,

permitindo o complexo de migrar para o Complexo de Golgi, onde SREBP-2 é clivado

pelas proteases S1P e S2P (proteases site-1 e site 2 respectivamente). O SREBP clivado

migra então para o núcleo, onde se liga ao elemento de resposta á esterol (SRE) e altera

a transcrição de mais de trinta genes envolvidos na síntese de colesterol e lipídios,

incluindo o receptor de LDL e a HMG-CoA redutase (Horton et al, 2002; Redinger,

2003; Gent e Braakman, 2004; Weber et al., 2004) (Figura 1). Quando os níveis de

colesterol intracelular estão elevados, SCAP interage fortemente com INSIG, o

transporte de SREBP do retículo endoplasmático é inibido e não há síntese de colesterol

e nem de receptores de LDL (Gent e Braakman, 2004; Weber et al., 2004; Eberlé et al,

2004).


8

Figura 1 - Ativação de SREBP por clivagem proteolítica. SREBP: Proteína ligadora aos

elementos de resposta a esterol, SCAP: Proteína ativadora de clivagem, INSIG: Gene 1 induzido

por insulina, S1P: Protease site-1, S2P: Protease site-2, RE: Retículo endoplasmático. Fonte:

Adaptado de Eberlé et al., 2004.

O catabolismo do colesterol em ácidos biliares e sua subsequente excreção nas

fezes é principal meio de eliminação do colesterol do corpo. A síntese dos ácidos

biliares é limitada aos hepatócitos e ocorre através de duas vias distintas: a via clássica

ou neutra, e a via alternativa ou ácida. Uma vez sintetizados, os ácidos biliares são

conjugados a aminoácidos (glicina ou taurina) antes de serem secretados nos canalículos

biliares. Os ácidos biliares, colesterol, fosfolipídios, pequenas quantidades de pigmentos

biliares e proteínas constituem a bile, que é armazenada na vesícula biliar até que seja

segregada para o intestino delgado em resposta a gorduras da dieta. A bile está

envolvida na emulsificação e absorção de lipídios dietéticos e vitaminas lipossolúveis

do intestino delgado. Como os ácidos biliares atravessam o intestino delgado até

atingirem o íleo terminal, aproximadamente 95% são reabsorvidos e transportados de

volta para o fígado através da circulação enterohepática. Devido á aproximadamente 5%

dos ácidos biliares serem eliminados em cada ciclo enterohepático, o fígado deve


9

sintetizar uma quantidade equivalente para manter um pool constante de ácidos biliares.

Assim, o metabolismo de ácidos biliares é um processo hermeticamente regulado, e a

sua perturbação afeta toda a homeostase do colesterol no corpo (Lee et al., 2006).

A CYP7A1 é uma enzima específica do fígado, que cataliza a primeira e

limitante etapa da via clássica da síntese de ácidos biliares. A enzima converte

colesterol em 7α-hidroxicolesterol, e etapas enzimáticas subsequentes levam

principalmente a conversão de 7 α- hidroxicolesterol a ácido cólico. Devido ao fato de a

síntese de ácidos biliares ser a principal via responsável pela manutenção da homeostase

do colesterol no corpo, a regulação da atividade CYP7A1 se demonstra importante

(Ando et al., 2005).

Tem sido demonstrado que a expressão do gene da CYP7A1 é controlada por

fatores transcricionais da superfamília dos receptores nucleares. O LXR, cujos ligantes

endógenos são os oxisteróis, regula positivamente a transcrição da CYP7A1, enquanto o

FXR, (receptor X farnesóide), cujos ligantes são o ácidos biliares, regula negativamente

a CYP7A1 (Ando et al., 2005).

O LXR, originalmente encontrado no fígado, é dimerizado a outro receptor

nuclear, o receptor X retinóide (RXR), formando o heterodímero LXR/RXR. Uma vez

sinalizado pelos oxisteróis, o complexo LXR/RXR se liga ao elemento de resposta a

LXR (LXRE) na região promotora de genes alvo como a CYP7A1, promovendo a

regulação positiva da enzima e diminuindo os níveis de colesterol intracelular

(Redinger, 2003; Wójcicka et al, 2007; Rezen et al 2011).

Estudos usando genéticos e agonistas sintéticos tem definido outros importantes

papéis para o LXR no controle do metabolismo de colesterol. O tratamento de animais

com agonistas de LXR resulta em mudanças na expressão de genes, promovendo o

efluxo de colesterol de células periféricas tais como os macrófagos, a excreção de

colesterol do fígado e a inibição da absorção do colesterol no intestino (Calkin e

Tontonoz, 2010).

No nível molecular, o LXR controla o efluxo de colesterol por regular a

expressão de genes que codificam os transportadores ABCA1 e ABCG1

(transportadores cassete de ligação a ATP) (Figura 2). Upregulation de ABCA1 e

ABCG1 resulta em aumentada transferência de colesterol intracelular para as partículas

de HDL. O acúmulo de colesterol oxidado e outras formas modificadas de colesterol por


10

macrófagos presentes nas paredes dos vasos sanguíneos é um evento crítico na

patogênese da aterosclerose, e a capacidade dos agonistas de LXR em aumentar o

efluxo de colesterol nos macrófagos, estimulou um grande interesse no potencial

terapêutico destes compostos (Schulman e Heyman , 2006).

A ativação de LXR também regula a expressão dos transportadores ABCG5 e

ABCG8 (Figura 2). A expressão desses transportadores é bastante restrita ao fígado e

ao intestino, onde estas proteínas funcionam para promover a excreção do colesterol

(fígado) e limitar a absorção do colesterol (intestino) (Berge et al., 2000; Repa et al.,

2002; Yu et al., 2003).

Assim, pela mobilização do colesterol em células periféricas, promoção da

excreção hepática do colesterol e limitação da sua absorção no intestino, a ativação do

LXR resulta em uma perda líquida de colesterol. Este processo de tráfico de colesterol

para HDL e, finalmente, para fora do corpo tem sido denominado transporte reverso de

colesterol. É importante notar que os agonistas de LXR diminuem a aterosclerose em

modelos animais, e tem sido sugerido que o aumento do transporte reverso de colesterol

desempenha um papel importante nesta atividade (Levin et al., 2005).

Figura 2 - Modelo simplificado da regulação do metabolismo de colesterol e ácidos biliares

por LXR e FXR. Oxisteróis aumentam a transcrição de ABCA1, ABCG5/G8, e CYP7A1

através da ativação de LXR. Ácidos biliares aumentam a transcrição de SHP e ABCB11 através

da ativação de FXR. SHP inibe a transcrição de CYP7A1 através de um mecanismo indireto.

Fonte: Adaptado de Shibata et al., 2007.

Os ácidos biliares são detergentes biológicos com uma série de funções

importantes incluindo a geração do fluxo biliar hepático, a excreção biliar de colesterol,


11

a emulsificação de lipídios no intestino e a captação de vitaminas solúveis em lipídios.

Entretanto, eles são altamente citotóxicos e o desequilíbrio de sua síntese e excreção

resulta em vários processos patológicos. Ácidos biliares têm sido designados como

reguladores cruciais, como ligantes de receptores nucleares importantes na homeostase

de ácidos biliares e colesterol e como iniciadores de cascatas de sinalização importantes

na regulação metabólica e função hepática (Eloranta e Kullak-Ublick, 2005).

Os ácidos biliares hidrofóbicos, ácido quenodesoxicólico, litólico e deoxicólico,

são os ligantes ativadores de FXR mais potentes. Estudos forneceram evidências de que

a repressão da CYP7A1 mediada por FXR ocorre através de um mecanismo indireto

envolvendo dois receptores nucleares adicionais, o LRH-1 (liver receptor homolog-1),

também chamado de CPF, FTF ou NR5A2, e o SHP (small heterodimer partner). O

LRH-1 é um fator de transcrição positivo requerido para a transcrição máxima da

CYP7A1 e também para a expressão do SHP (Gupta et al., 2001; Gupta et al., 2002).

Os ácidos biliares ativam a transcrição de SHP através da ligação do

heterodímero FXR/RXR ao elemento de resposta a FXR (IR1-motif) na região

promotora de SHP. Elevados níveis da proteína SHP inibem a transcrição da CYP7A

através da inibição da atividade de LRH-1, o qual se liga a BARE (elemento de resposta

á ácidos biliares) na região promotora de CYP7A1 (Figura 3). Dessa maneira, o FXR

não se liga diretamente a região promotora da CYP7A1, mas regula a transcrição dessa

enzima indiretamente pela ativação do SHP, o qual interage com LRH-1, que é fator de

transcrição de CYP7A1 (Gupta et al., 2001; Gupta et al., 2002, Xu et al., 2004).

Além desse mecanismo, outro mecanismo adicional para a repressão da

CYP7A1 mediada pelos ácidos biliares envolve a ativação da via da c-Jun N-terminal

quinase (JNK). Foi demonstrado, em culturas primárias de hepatócitos de ratos, que os

ácidos biliares ativam a via da JNK, que por sua vez, ativa o fator de transcrição c-Jun.

c-Jun ativado liga-se então ao elemento AP1 no promotor de SHP e up regulates sua

atividade transcricional (Gupta et al., 2002). Gupta et al., 2001 também sugeriu que c-

Jun possa também interagir diretamente com LRH-1 para reprimir a transcrição da

CYP7A1 (Figura 3).


12

Figura 3 - Modelo de regulação da expressão de CYP7A1 por sinalização em cascata

através de FXR e JNK. Este modelo prediz que os ácidos biliares presentes nos hepatócitos,

ativam tanto o FXR quanto a cascata de sinalização da JNK. FXR e c-Jun ativados, aumentam a

transcrição de SHP-1 através da ligação aos elementos IR-1 e AP-1 no promotor de SHP-1,

respectivamente. Elevados níveis de SHP-1, reprimem a transcrição de CYP7A1 por interação

com LRH-1, um fator de transcrição positivo que se liga à região BARE-II no promotor da

CYP7A1. Sugere-se que c-Jun também possa interagir diretamente com LRH-1 para reprimir

transcrição de CYP7A1. Fonte: Adaptado de Gupta et al., 2001.

Os ácidos biliares, através da ativação do FXR, não só aumentam a transcrição

de SHP, mas também aumentam a transcrição de ABCB11, o principal transportador de

efluxo biliar dos ácidos biliares, dessa forma o pool de ácidos biliares é garantido

(Shibata et al., 2007; Li et al, 2011). (Figura 2).

Os receptores ativados por proliferadores de peroxisomos (PPARs) são proteínas

transdutoras pertencentes à superfamília de receptores nucleares. Estes fatores de

transcrição ativados por ligantes catalisam e coordenam diferentes eventos bioquímicos

a fim de se obter a homeostase celular de lipídios e açúcares, além de orquestrarem

respostas inflamatórias a estímulos (Chinetti-Gbaguidi et al., 2005; Kota et al., 2005;

Perrone et al., 2005).

Depois da ativação pelos ligantes, os PPARs formam heterodímeros com o

RXR; esses heterodímeros tornam-se ativados, e se ligam aos elementos de resposta a

proliferadores de peroxisomos (PPRE) localizados nas regiões promotoras dos genes


13

alvo, causando aumento ou diminuição da transcrição de muitos genes envolvidos

nestes processos biológicos (Figura 4) (Chinetti-Gbaguidi et al., 2005; Kota et al.,

2005; Perrone et al., 2005).

Entre os PPARs três isotipos tem sido identificados: PPAR, PPAR, e PPAR,

sendo o primeiro, o principal receptor envolvido no metabolismo de lipídios Chinetti-

Gbaguidi et al., 2005; Kota et al., 2005; Perrone et al., 2005).

O PPARα é um receptor nuclear controlador do metabolismo lipídico (Cornwell

et al., 2004; Chinetti-Gbaguidi et al., 2005; Kota et al., 2005; Perrone et al., 2005). É

expresso em numerosos tecidos de roedores e humanos incluindo fígado, rins, coração,

músculo esquelético e tecido adiposo marrom e também em uma série de células

vasculares tais como as células endoteliais, monócitos e macrófagos (Cornwell et al.,

2004; Kota et al., 2005). Além disso, é ativado por ligantes naturais endógenos

(agonistas), incluindo ácidos graxos, eicosanóides, fosfolípides oxidados e produtos

lipolíticos derivados de lipoproteínas, bem como por drogas como os fibratos (Cornwell

et al., 2004;Chinetti-Gbaguidi et al., 2005; Kota et al., 2005; Perrone et al., 2005).

O papel crítico dos agonistas de PPARα na -oxidação de ácidos graxos tem

sido bem documentado; em adição eles também estimulam a absorção de ácidos graxos,

por aumentar a expressão de proteínas transportadoras de ácidos graxos e translocases

de ácidos graxos (Kota et al., 2005).

A ativação de PPAR α, por seus ligantes, resulta em aumento da lipólise e do

clearance de lipoproteínas aterogênicas ricas em triglicérides a partir da ativação da

lipase lipoproteica e da apolipoproteína AV (apoAV) e redução da produção do inibidor

da lipase lipoproteica: a apolipoproteína CIII (apoCIII) (Chapman, 2006).

A terapia com ativadores de PPAR α também promove a β-oxidação de ácidos

graxos, reduzindo a biodisponibilidade destes para a síntese de triglicérides, inibe a

síntese de novo de ácidos graxos a partir da redução da atividade da acetil-CoA

carboxilase e da ácido graxo sintase e aumenta a síntese das apolipoproteínas AI e AII

(apoAI e apoAII) (Schoonjans et al., 1996).

Em particular, as vias de metabolismo de lipídios têm revelado o mecanismo de

ação de muitas drogas naturais e sintéticas que têm sido vitais no tratamento de várias

desordens metabólicas (Kota et al., 2005). PPARs apresentam-se como bons alvos de


14

drogas para a correção do perfil global de riscos que predispõem um indivíduo a

doenças cardiovasculares (Chinetti-Gbaguidi et al., 2005).

Figura 4 - Efeitos biológicos do PPARα. FA: ácído graxo, FFA: ácido graxo livre, LPL:

lipoproteína lipase; TG: triglicérides; ABCA1: transportador cassete de ligação a ATP.Fonte:

Adaptado de Kota et al., 2005.

2.2 - CAROTENÓIDES E SUA IMPORTÂNCIA NA DIETA

Os carotenóides são uma família de compostos pigmentados que são sintetizados

por plantas e microorganismos, mas não em animais. Nas plantas, eles contribuem para

a maquinaria fotossintética e as protegem contra os danos da luz. Frutas e vegetais

constituem as principais fontes de carotenóides na dieta humana (Mangels et al.,1993;

Agarwal e Rao, 2000; Johnson, 2002).

Os carotenóides estão presentes como micronutrientes em frutas e vegetais e são

os responsáveis por suas cores amarelo, laranja e vermelha. As propriedades

antioxidantes dos carotenóides tem sido foco de inúmeras pesquisas, eles são os

responsáveis pelas propriedades benéficas de frutas e vegetais na prevenção de doenças

humanas, incluindo doenças cardiovasculares, câncer e outras doenças crônicas, além de


15

serem importantes fontes dietéticas de vitamina A. (Astrog et al., 1997; Paiva e Russell,

1999).

Mais de 600 carotenóides têm sido até agora identificados na natureza.

Entretanto, somente cerca de 40 estão presentes em uma dieta humana típica. Destes 40,

cerca de 20 foram identificados no sangue e tecidos humanos. Cerca de 90% dos

carotenóides no corpo e dieta humana são representados por beta caroteno, α-caroteno,

licopeno, luteína e criptoxantina (Gerster, 1997).

Todos os carotenóides possuem estrutura poliisoprenóide e uma longa cadeia de

duplas ligações conjugadas (Britton, 1995). Eles são divididos em duas classes:

carotenos não polares (ex. beta caroteno e licopeno) contendo somente carbono e

hidrogênio e xantofilas polares (ex. cantaxantina e zeaxantina) que possuem pelo menos

um átomo de oxigênio (Shih et al., 2008).

A sequencia de biossíntese dos carotenóides nas plantas é a seguinte: fitoeno

fitoflueno ζ -caroteno neurosporeno licopeno - caroteno beta caroteno.

Cada etapa enzimática de fitoeno para licopeno adiciona uma dupla ligação á molécula,

resultando em licopeno, o qual é uma molécula simétrica contendo 13 duplas ligações.

A etapa biossintética após o licopeno envolve ciclização enzimática dos grupos finais,

que resulta em - caroteno (uma anel -ionona) e beta caroteno (dois anéis -ionona). A

adição de oxigênio á molécula leva á formação de xantofilas (Goodwin, 1980).

A concentração de cada carotenóide na fruta ou no vegetal sugere que uma

enzima ou um conjunto de enzimas possam ser a etapa limitante na cascata

biossintética. Por exemplo: uma alta concentração de licopeno em tomates vermelhos

sugere uma falta de atividade enzimática suficiente para converter licopeno a -

caroteno (ou seja, atividade insuficiente da ciclase) (Beecher, 1998).

Os diferentes carotenóides são derivados essencialmente por modificações na

base estrutural por ciclização dos grupos finais e por introdução de oxigênio, resultando

assim nas suas cores e propriedades antioxidantes características (Rao e Rao 2007). A

representação das estruturas da -ionona e dos principais carotenóides dietéticos são

mostradas na Figura 5.


16

Figura 5 - Estruturas da -ionona e dos principais carotenóides dietéticos. Fonte: Adaptado

de Uenojo et al., 2007 e Rao e Rao, 2007.

A biodisponibilidade dos carotenóides parece ser dependente de vários fatores

(Parker et al., 1999). Em geral, a absorção dos carotenóides depende da sua

biodisponibilidade na matriz alimentar e da sua solubilidade em micelas (Krinsky,

1993; Boileau et al, 2002). Muitos carotenóides são absorvidos melhor na presença de

gorduras na dieta e a partir de alimentos processados do que a partir de fontes não

transformadas (Stahl et al., 1992; Bohm e Bitsch, 1999). A natureza das isoformas dos

carotenóides também afeta a sua biodisponibilidade e absorção, (isto é, trans-isômeros

de licopeno são menos absorvidos que os isômeros cis) (Bohm e Bitsch, 1999). Outros

fatores que influenciam a absorção dos carotenóides incluem a presença de fibra

dietética, o estado de saúde do indivíduo, e a forma física do carotenóide (van het Hof et

al., 2000).


17

Os carotenóides são absorvidos nas células da mucosa gastrointestinal e

aparecem inalterados na circulação e tecidos (Erdman et al., 1993; Parker, 1996). No

intestino os carotenóides são absorvidos por difusão passiva após serem incorporados

nas micelas, que são formadas por gordura dietética e ácidos biliares. Os carotenóides

micelares são então incorporados nos quilomícrons e lançados no sistema linfático. Eles

são, então, incorporados em lipoproteínas no fígado e liberados para a corrente

sanguínea. Os carotenóides são absorvidos diferencialmente por diferentes tecidos.

Pouco se sabe sobre os mecanismos de absorção dos carotenóides nos tecidos até o

momento. O principal local de armazenamento de carotenóides é o tecido adiposo

(Parker,1988; Erdman et al., 1993).

Com base em estudos epidemiológicos uma relação positiva é sugerida entre a

maior ingestão alimentar e concentrações teciduais de carotenóides e menor risco de

doenças crônicas (Agarwal e Rao, 2000, Johnson 2002; Elliott, 2005). Beta caroteno e

licopeno têm mostrado estar inversamente relacionados ao risco de doenças

cardiovasculares e certos tipos de câncer (Johnson 2002; Ribaya-Mercado et al., 2004).

As propriedades antioxidantes dos carotenóides têm sido sugeridas como o principal

mecanismo pelo qual eles proporcionam seus efeitos benéficos. Estudos recentes têm

mostrando também que os carotenóides podem mediar seus efeitos através de outros

mecanismos, tais como comunicação por junções do tipo gap, regulação do crescimento

celular, modulação da expressão gênica e resposta imune e como moduladores de

enzimas metabolizadoras de fármacos (Astrog, 1997; Paiva e Russell, 1999; Jewell e

O’Brien, 1999; Bertram, 1999). No entanto, os carotenóides tais como e α e beta

caroteno e a -criptoxantina têm a vantagem adicional de serem capazes de ser

convertidos em vitamina A e estarem relacionados ao papel de prevenção e

desenvolvimento de doenças crônicas (Rao e Rao, 2007). O papel dos carotenóides na

prevenção de doenças crônicas e suas ações biológicas encontram-se resumidas na

Figura 6.


18

Figura 6 - Papel dos carotenóides na prevenção de doenças crônicas. Fonte: Adaptado de

Rao e Rao, 2007.

As ações antioxidantes dos carotenóides são baseadas em suas propriedades de

quelar o oxigênio singleto e de interceptar radicais peroxila (Stahl e Sies, 1996), sendo a

habilidade em quelar o oxigênio singleto, a melhor ação antioxidante documentada

pelos carotenóides (Paiva e Russell, 1999). O mecanismo de desativação do oxigênio

singleto pode ocorrer pela transferência física da energia de excitação deste para o

carotenóide ou pela reação química do carotenóide com ele. Em condições normais no

organismo, 95% da desativação do oxigênio singleto é física, restando somente 5% para

reagir quimicamente (Barreiros e David, 2006).

Em adição à capacidade de quelar o oxigênio singleto, tem sido muito

demonstrada a habilidade de vários carotenóides em interferir nas reações em cadeia

iniciadas por radicais, particularmente com aquelas que resultam em peroxidação

lipídica. Os carotenóides sequestram os radicais peroxila formados na peroxidação


19

lipídica, interrompendo, assim, a sucessão de reações que podem danificar

compartimentos lipofílicos (Krinsy, 1998).

Tudo indica que as propriedades e funções dos carotenóides são diretamente

dependentes de sua conformação estrutural básica (Britton, 1995) e modulada pelos

diferentes grupos funcionais, peculiares a cada grupo de carotenóides (Di Mascio et al.,

1990). A atividade quelante dos carotenóides depende principalmente do número de

duplas ligações conjugadas da molécula e é influenciada em uma menor extensão pelos

grupos finais dos carotenóides (cíclicos ou acíclicos) ou a natureza dos substituintes nos

carotenóides contendo grupos finais cíclicos. O licopeno (onze duplas ligações

conjugadas e duas duplas ligações não conjugadas) está entre os mais eficientes

queladores de oxigênio singleto dos carotenóides naturais (Krinsky, 1998).

2.3 - BETA CAROTENO

Dentre os carotenóides, o beta caroteno é provavelmente o mais estudado, e um

dos principais presentes em nossa dieta, sangue e tecidos. As principais fontes dietéticas

de beta caroteno incluem folhas e vegetais verdes bem como frutas e vegetais laranja e

amarelo. Dos 50 diferentes carotenóides que podem ser metabolizados em vitamina A, o

beta caroteno é o que possui a maior atividade pró-vitamina A (Krinsky e Johnson, 2005).

As funções biológicas do beta caroteno incluem transferência de energia na

fotossíntese; transferência de energia para fotoproteção, e conversão metabólica a

retinóides, em animais com ingestão inadequada de vitamina A pré-formada (Krinsky,

1994). Esta última constitui até o momento a única função biológica comprovada do

carotenóide em humanos (Olson, 1996).

A conversão metabólica do beta caroteno à vitamina A é quimicamente possível

devido á sua estrutura molecular que contém anéis -ionona não substituídos, ligados à

cadeia lateral poliênica. Sendo assim, o carotenóide pode, teoricamente, gerar duas

moléculas de vitamina A (Rodriguez-Amaya, 1997).

A maior parte do beta caroteno absorvido pela mucosa duodenal é convertida a

retinol (60 a 70%) que em seguida é metabolizado a ésteres de retinila no enterócito.

Estes, juntamente com a molécula intacta do carotenóide, atingem o fígado através da

linfa, veiculados por quilomicrons remanescentes. No fígado, os ésteres de retinila são


20

convertidos a retinol e se ligam à proteína ligante do retinol, os quais circulam no

plasma associados à outra proteína transportadora, a transtiretina, que direciona o retinol

para os tecidos, onde o retinol pode ser oxidado à retinal e, posteriormente em ácido

retinóico. O beta caroteno é transportado no plasma por lipoproteínas e estocado

principalmente no tecido adiposo. Os carotenóides também podem ser transportados por

outras lipoproteínas como a HDL, LDL e VLDL e a conversão metabólica do

carotenóide a retinóides pode ocorrer também em tecidos de diferentes órgãos, tais

como o pulmão e os rins (Olson, 1994; Wang, 1994; Van Vliet, 1996, Parker et al.,

1996, Ross, 2003).

O beta caroteno é principal fonte de vitamina A na dieta dos Estados Unidos.

Esta pró-vitamina e a vitamina A e seus derivados, os retinóides, tem sido considerados

como protetores e terapêuticos nos processos de carcinogênese (Blakely et al, 1998).

Inicialmente, existiam dúvidas sobre o poder quimiopreventivo do beta caroteno,

se este estaria, realmente, associado exclusivamente ao beta caroteno, ou se deveria ser

atribuído à sua conversão em vitamina A que, por sua vez, promoveria a ação.

Posteriormente, os estudos revelaram que o beta caroteno não só possuía uma ação

exclusiva, como esta era mais potente que a promovida pela vitamina A (Willis e

Wians, 2003).

A pressão de oxigênio (pO2) nos tecidos é um dos interferentes da atuação

antioxidante do beta caroteno. Inicialmente foi atribuída ao beta caroteno uma atividade

pró-oxidante, ou seja, de promoção da oxidação, ao invés de proteção contra essa

oxidação, quando esse atuava em tecidos sob tensões de oxigênio muito elevadas

(Palozza, 1998), entretanto, investigações posteriores, mais detalhadas, observaram que

ocorre apenas um decréscimo da ação antioxidante, pelo processo de auto-oxidação do

beta caroteno (Krinsky, 2001). A partir dessas observações, inclusive, pôde ser

concluído que seria importante, nesses casos, utilizar a vitamina E em associação, uma

vez que essa atua eficazmente em tecidos sob altas tensões de oxigênio (Zhang e

Omaye, 2000).

A concentração de beta caroteno também influencia sua ação antioxidante, de

modo que concentrações que superam os 4-5 μM prejudicam sua habilidade protetora

e/ou a revertem em pró-oxidativa (Lowe et al., 1999; Krinsky, 2001), neste último caso

podendo, inclusive, promover uma lesão de material genético (Woods et al., 1999). A


21

demonstração desse efeito reverso por diversos estudos (Paolini et al., 1999; Lowe et

al., 1999), indica que suplementações com altas doses de micronutrientes devem ser

atentamente acompanhadas pelos estudos, como em qualquer intervenção farmacológica

(Goodman et al., 2003).

Por outro lado, sob condições fisiológicas de pO2 e adequadas concentrações

plasmáticas (1 a 4-5 μM) (Lowe et al., 1999; Zhang e Omaye, 2000, Krinsky, 2001), o

beta caroteno é capaz de prevenir danos celulares (Lowe et al., 1999); diminuir os níveis

de espécies reativas de oxigênio no meio intracelular (Bestwick e Milne, 200),

reduzindo os riscos de lesão de material genético; e promover ação antioxidante em

células pulmonares expostas a nitrosaminas específicas do tabaco (Weitberg e Corvese,

1997).

Estudos em ratos e camundongos indicaram uma supressão ou redução da

peroxidação de lipídios com a administração do beta carotene e uma melhora no status

antioxidante (Iyama et al, 1996; Whittaker et al,1996; Kraus et al, 1997 e Riondel et al,

2002).

A estrutura em duplas ligações conjugadas é primariamente a responsável pela

excelente habilidade do beta caroteno em quelar fisicamente o oxigênio singleto sem

degradação e pela reatividade química do beta caroteno com radicais livres tais como o

radical peroxil (ROO•), radical hidroxil (•OH), e radical superóxido (O2-•). Em geral,

quanto maior a cadeia poliênica, maior a habilidade de estabilização do radical peroxil.

Foi demonstrado que o radical peroxil foi cerca de 100-1000 vezes mais reativo com

carotenóides do que com o hidrogênio alílico em ácidos graxos poliinsaturados. Portanto,

nas concentrações suficientes, os carotenóides podem proteger lipídios de danos

peroxidativos (Valko et al., 2004).

O beta caroteno tem sido relatado em diminuir significativamente lesões

ateroscleróticas em coelhos hipercolesterolêmicos, assim como o α-tocoferol. Beta

caroteno é mais efetivo quelante do oxigênio singleto em baixas pressões de oxigênio

enquanto a vitamina E é mais efetiva em altas pressões de oxigênio. Em resumo,

antioxidantes dietéticos, como o beta caroteno, podem proteger o colesterol LDL contra a

oxidação e ajudar a prevenir a aterosclerose experimental. Evidências epidemiológicas

sugerem que os antioxidantes também podem ajudar a prevenir manifestações clínicas de

doenças artérias coronárias (Sulli et al., 1998).


22

2.4 - URUCUM (BIXA ORELLANA L.) E URUCUM

O urucuzeiro (Bixa orellana L.) é uma planta nativa da Floresta Tropical da

América Central e do Sul (Felicissimo et al, 2004) é um arbusto que pode alcançar de 2

a 9 m de altura, sendo uma planta ornamental, pela beleza e colorido de suas flores e

frutos (Barbosa-Filho, 2006). Suas flores possuem cor rosa claro e surgem nas

extremidades dos ramos, formando fascículos onde nascem cápsulas ovoides com dois

carpelos cobertos de espinhos flexíveis de coloração variável entre o verde, vermelho-

pálido e roxo. No interior destes fascículos são encontradas, em média, 40 sementes. As

sementes são grosseiramente arredondadas, revestidas por uma polpa mole de coloração

avermelhada, as quais se tornam secas, duras e de coloração escura com o

amadurecimento (Franco et al., 2006). (Figura 7).

Figura 7 - Fotos de urucum. A: Urucuzeiro, B: Floração e frutificação, C: Folhas (posições

dorsal e ventral), D: Raiz, E: Fruto, F: Fruto aberto com sementes expostas. Fonte: Barbosa-

Filho, J.M. (2006).

A B C

D E F


23

Do urucum são fabricados os corantes naturais mais difundidos na indústria de

alimentos, ou seja, os produtos de urucum representam aproximadamente 70% (em

quantidade) de todos os corantes naturais e 50% de todos os ingredientes naturais que

têm função corante nos alimentos (Ghiraldini, 1994).

De suas sementes podem se obter corantes com grande variação de tons, que vão

desde o amarelo-laranja ao vermelho (Nielsen, 1990; Ghiraldini, 1994). Na indústria de

alimentos são utilizadas para dar cor em manteiga, margarina, maionese, molhos,

mostarda, salsichas, sopa, sucos, sorvetes, produtos de panificação, macarrão e queijo,

sendo também bastante empregado na indústria da impressão e na tintura (Franco et al.,

2006).

Hoje, o urucum é cultivado em muitos países tropicais como: Bolívia, Brasil, Sri

Lanka, República Dominicana, Equador, Guiana, índia, Jamaica, México, Peru e

Suriname e em menor escala na África, como por exemplo, na Angola, Quênia, Nigéria,

Tanzânia e no Pacífico como as Filipinas e Hawaii (Preston e Richard, 1980).

Estimativas de 2006 mostravam que o Peru era o maior produtor mundial de urucum,

seguido do Brasil e do Quênia (Balaswamy et al., 2006).

No Brasil, cerca de 70% dos grãos produzidos destinam-se ao processamento de

colorau (corante doméstico), 20% são utilizados na produção do corante e 10% são

exportados (Batista, 1994). Em 2000, foi estimado em 1.200 t o consumo de colorífico

no Brasil. Para o segmento de condimentos, especiarias e temperos, o colorífico

representa 44,6%, seguido da pimenta-do-reino com 35,4%, a canela 4,1%, o cominho

4,0% e 11,9% para a pimenta com cominho, bicarbonato, orégano, louro, erva doce,

cravo, camomila e outros. (Franco et al., 2006).

O urucum é uma mistura de muitos carotenóides, tais como bixina, norbixina,

fitoenos e δ-carotenos (Mercadante et al., 1996), sendo a bixina e a norbixina os dois

principais produtos processados do urucum, representando 90% do total de pigmentos

encontrados em suas sementes (Preston e Richard, 1980).

Dos carotenóides presentes nas sementes do urucum, 80% consistem do

apocarotenóide bixina, o qual tem sido encontrado até o momento somente em Bixa

orellana (Mercadante et al., 1996).

A bixina (C25H30O4) é um carotenóide que não possui atividade pró-vitamina A,

contendo dois grupos carboxílicos, sendo que um é um éster monometílico (De Oliveira


24

et al., 2003). Embora menor que os carotenóides usuais, a bixina é também formada por

uma cadeia de duplas ligações conjugadas alternadas, os quais permitem algumas

características especiais. Este pigmento ocorre na forma não estável cis (metil-

hidrogênio 9’-cis-6,6’diapocaroteno 6,6’dioato) na fruta da planta, tornando-se logo na

forma estável trans sobre a extração por organosolventes e/ou calor (Lyng et al, 2005).

A norbixina, forma desmetilada da bixina, (C24H27O4), tem forte poder de

coloração, é um apocarotenóide hidrossolúvel, extraído via saponificação da polpa da

semente e posterior acidificação para precipitar um pó contendo 30-40% de norbixina

(Giuliano et al., 2003).

A conversão de bixina em norbixina é feita pela diluição da bixina em meio

alcalino, a bixina perde um grupo metil produzindo a norbixina, pigmento de cor

vermelho intenso que após a separação e secagem é comercializada na forma de pó ou

pasta (Carvalho e Hein, 1989). (Figura 8).

Figura 8 - Estruturas moleculares da cis e trans bixina e cis e trans norbixina. Fonte:

Adaptado: Scotter, M. J. (1995).

O teor de bixina presente nas sementes de urucum varia de acordo com a

variedade da cultura, do solo, do clima e dos tratos culturais, podendo encontrar

sementes com menos de 1% e até com mais de 4% de bixina. Na semente bruta sua

concentração pode chegar até 5,0%. Contudo, diferentes variedades de sementes

apresentam teores às vezes inferiores a 2,0%. O valor comercial da semente é baseado


25

no percentual de bixina. Teores mínimos de 2,5% são normalmente exigidos para

exportação (Franco et al, 2002).

Como a demanda de urucum e outros corantes naturais aumentaram,

especificações mais rigorosas são impostas e melhores entendimentos de sua química e

bioquímica são garantidos (Ghiraldini, 1994).

Prévias investigações fitoquímicas têm revelado a presença de muitos

carotenóides derivados, alguns terpenóides, tocotrienóis, arenos e flavonóides

(incluindo luteonina e apigenina) nas sementes do urucum. Investigações sobre suas

folhas têm revelado a presença de flavonóides bisulfatos e nas raízes foi encontrado o

triterpeno ácido tomentósico (Shilpi et al., 2006).

Outros carotenóides, em quantidades muito pequenas, foram isolados das

sementes de urucum e suas estruturas foram elucidadas através de técnicas

espectroscópicas como espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear. Estes

novos carotenóides puderam ser divididos em três grupos: ésteres metílicos de

apocarotenóides (C30 e C32) (Mercadante et al.,1996, Mercadante et al.,1997a),

diapocarotenóides com grupos terminais éster metílico, cetona e aldeído (C19, C22,

C24 e C25) (Jondiko e Pattenden, 1989; Mercadante et al.,1997b) e ácidos de

diapocarotenóides (C22 e C24) esterificados com grupos metil e geranilgeraniol

(Mercadante et al.,1999). Além desses carotenóides, um carotenóide derivativo com 14

carbonos foi isolado (Mercadante et al.,1997b) e a presença de fitoeno, fitoflueno, ζ-

caroteno e neurosporeno, todos com 40 carbonos, foi confirmada (Mercadante et

al.,1996).

Muitas outras informações referentes à composição química da semente, raiz e

folhas do urucum, são encontradas na literatura. Contudo, talvez pelas diferentes

procedências das plantas, métodos analíticos empregados, ou ainda a custa da própria

instabilidade apresentada por alguns de seus componentes, os percentuais variam

bastante (Oliveira, 2005).

Atualmente mais de duas dezenas de substâncias foram isoladas das sementes de

Bixa orellana. A Tabela I mostra os principais carotenóides encontrados nas sementes

desta planta.


26

Tabela I - Carotenóides de Bixa orellana.

Fonte: Adaptado de Barbosa-Filho, J.M. (2006). SE: semente, PF: ponto de fusão.

O urucum é anestésico, é útil nas dores de cabeça, desordens sanguíneas, pode

ser utilizado como antiemético e para aliviar a sede. As sementes são adstringentes,

febrífugas e um bom remédio para a gonorreia. A casca da raiz é útil também na

gonorreia para febres intermitentes e funciona como antipirético. A infusão das folhas e

raízes é útil na epilepsia, desinteira febre e icterícia (Shilpi et al., 2006).

Estudos farmacológicos têm revelado que extrato de Bixa orellana possui

atividades antiprotozoários, anti-helmínticas e antienvelhecimento. Extrato de folhas e

galhos tem mostrado ser efetivo em neutralizar os efeitos de venenos de cobras. Extratos

de diferentes partes (folhas e sementes em particular) têm mostrado atividade

antimicrobiana in vitro. O extrato das sementes tem sido relatado em exibir atividade

quimiopreventiva e antioxidante (Shilpi et al., 2006).


27

Entre os carotenóides naturais, bixina é um dos mais efetivos supressores

biológicos de moléculas de oxigênio singleto e pode contribuir para a proteção das

células e tecidos contra os efeitos deletérios dos radicais livres, tendo também um

efetivo inibidor da peroxidação de lipídios (Di Mascio et al., 1990; Zhang et al., 1991;

Silva et al., 2001).

Existem trabalhos relacionando a atuação da bixina sobre a hipercolesterolemia

e estresse oxidativo (Zhang et al., 1991; Silva et al., 2001, Lima et al., 2001; Lima et al,

2003) e estudos toxicológicos têm demonstrado que ela não apresenta efeitos tóxicos

significativos em ratos e camundongos (Fernandes et al.,2002; Bautista et al., 2004).

Neste contexto, o urucum, por suas propriedades e peculiaridades, se torna um atrativo

alvo de pesquisa, e a investigação de suas atuações sobre o metabolismo lipídico

justifica a necessidade novos experimentos.

SILVA, L.S. Capítulo 3 - Objetivos

29

CAPÍTULO 3 – OBJETIVOS

3.1 – OBJETIVO GERAL

Investigar o efeito do beta caroteno e da semente do urucum sobre a expressão

de genes do metabolismo hepático do colesterol em ratos com hipercolesterolemia

induzida por dieta.

3.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar os efeitos da dieta hipercolesterolemiante, do beta caroteno e do urucum

sobre:

I - Parâmetros biométricos dos animais;

II - Perfil lipídico sérico;

III – Armazenamento de gorduras e colesterol total no fígado;

IV – Excreção de gorduras e colesterol total nas fezes;

V- Expressão do mRNA dos principais receptores, enzimas e transportadores

envolvidos no metabolismo hepático do colesterol.

SILVA, L.S. Capítulo 4 - Material e Métodos

31

CAPÍTULO 4 – MATERIAL E MÉTODOS

4.1 - ANIMAIS

Foram utilizadas ratas albinas da linhagem Fisher, com idade de 80 a 95 dias e

peso médio de 195 g, provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental da Escola

de Nutrição (ENUT) da Universidade Federal de Ouro Preto. Todos os animais foram

mantidos em gaiolas individuais dispostas em ambiente com temperatura, luminosidade

e umidade controladas e receberam água “ad libitum”. O protocolo experimental

relativo ao uso dos animais foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da

Universidade Federal de Ouro Preto (CEUA-UFOP, certificado n° 2009/13).

4.2 - DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Quarenta ratas Fisher albinas, foram divididas em 5 grupos de oito animais:

Grupo 1- Grupo controle (C), que recebia dieta padrão seguindo recomendações do

American Institute of Nutrition - AIN-93 (Reeves et al., 1993) ;

Grupo 2- Grupo hipercolesterolêmico (H) que recebia dieta hipercolesterolemiante

composta por 25% de óleo de soja e 1% de colesterol (Matos et al, 2005) ;

Grupo 3- Grupo hipercolesterolêmico e beta caroteno 0,2% (HBC) (dieta

hipercolesterolemiante acrescida de beta caroteno em pó na concentração de 0,2%);

Grupo 4- Grupo hipercolesterolêmico e urucum 0,1% (HU 0,1%) (dieta

hipercolesterolemiante acrescida de semente de urucum em pó na concentração de

0,1%);

Grupo 5- Grupo hipercolesterolêmico e urucum 0,2% (HU 0,2%) (dieta

hipercolesterolemiante acrescida de semente de urucum em pó na concentração de

0,2%).

Antes do início do experimento, os animais passaram por um período de 2

semanas para adaptação às dietas, onde os animais do grupo C receberam dieta controle

e os animais dos demais grupos receberam a dieta hiperlipídica. Após este período, os


32

animais passaram a receber as suas respectivas dietas por 6 semanas. Semanalmente

foram realizadas medidas de peso, ingestão alimentar, desperdício e quantidade de

fezes. Para realizar o experimento 1 foram utilizados os animais dos grupos 1,2 e 3 e

para realizar o experimento 2 foram utilizados os animais doas grupo 1, 2,4 e 5.

4.3 - DIETAS

Os animais foram alimentados com dieta padrão ou dieta hiperlipídica

suplementadas ou não com beta caroteno (0,2%) ou urucum (0,1 ou 0,2%) conforme

Tabela I. As dietas foram preparadas no Laboratório de Nutrição Experimental

(LABNEX), da Escola de Nutrição/UFOP, acondicionadas em sacos plásticos

devidamente identificados e armazenadas em freezer durante o período experimental. O

beta caroteno utilizado neste trabalho foi adquirido através da empresa Mapric (São

Paulo, Brasil) e consistia em um pó contendo 10% m/m de beta caroteno e o urucum foi

adquirido através da empresa Corantec - Corantes Naturais Ltda. (São Paulo, Brasil),

constituindo-se de um pó obtido por maceração mecânica das sementes do urucum

(Produto P.A3 Colorífico). (Anexos I e II).

Tabela II - Composição das dietas experimentais (g/Kg de dieta).

C H

HBC

0,2% HU 0,1%

HU 0,2%

Caseína 140,0 140,0 140,0 140,0 140,0

Amido Milho 622,5 402,5 382,5 401,5 400,5

Óleo 40,0 250,0 250,0 250,0 250,0

Colesterol 0,0 10,0 10,0 10,0 10,0

Colina 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

Mist. Minerais1 35,0 35,0 35,0 35,0 35,0

Mist. Vitaminas2 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0

Celulose 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0

Sacarose 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Beta Caroteno3 0,0 0,0 20,0 0,0 0,0

Urucum4 0,0 0,0 0,0 1,0 2,0

Valor calórico (Kcal) 3810 4820 4740 4816 4812

Mistura de minerais (g/Kg de mistura): NaCl – 139,3 / KI – 0,79 / MgSO4. 7H2O – 57,3 / CaCO3 – 381,4 / MnSO4.H2O – 4,01 / FeSO4.7H2O – 27,0 / ZnSO4.7H2O - 0,548 / CuSO4.5H2O – 0,477 / CoCl2.6H2O – 0.023 / KH2PO4 – 389,0. 2Mistura de vitaminas

(g/Kg de mistura): Acetato de retinol – 2.000.000IU / Colecalciferol – 200.000IU / Ácido p-aminobenzóico – 10,00 / I-Inositol –

10,00 / Niacina – 4,00 / Pantotenato de cálcio – 4,00 / Riboflavina – 0,80/ Tiamina HCL – 0,50 / Piridoxina HCL – 0,50 / Ácido

fólico – 0,20 / Biotina – 0,04 / Vitamina B12 – 0,003 / Sacarose – q.s.p. 1000. / Colina – 200,0 / -Tocoferol – 10.000IU. 3Beta

caroteno em pó 10%m/m 4 Sementes de urucum em pó, - Corantec Corantes Naturais Ltda.


33

4.4 - EUTANÁSIA

Ao fim de cada experimento os animais foram deixados oito horas em jejum e

após anestesia com isoflurano, foram eutanaziados. O sangue foi coletado através de

secção do plexo braquial, recolhido em tubos de polipropileno (com 2,0 mL de

capacidade), centrifugado a 1500 g por 15 minutos e o soro coletado. O soro foi

devidamente aliquotado e estocado a -80°C para a posterior realização das dosagens

bioquímicas.

Os fígados dos animais foram extraídos, lavados em solução salina, pesados,

imersos em nitrogênio líquido e imediatamente estocado a -80°C para posteriores

análises. O conteúdo fecal foi removido do ceco dos animais, seco em estufa ventilada a

60°C, macerado, pesado e utilizado para extração da gordura total.

4.5 - DOSAGENS DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS

As dosagens das concentrações séricas de colesterol total, colesterol HDL e

triglicérides foram realizadas de acordo com as orientações do fabricante dos kits

comerciais Labtest Diagnóstica S.A. Os princípios dos métodos e seus respectivos

protocolos estão descritos no Anexo III.

Para a determinação da concentração do colesterol não-HDL foi feita a subtração

da concentração do colesterol total pela concentração do colesterol HDL.

O colesterol não-HDL é usado para estimar a concentração de partículas

potencialmente aterogênicas no soro, tais como LDL, IDL e VLDL. Para obtenção do

índice aterogênico foi calculada a razão colesterol não-HDL /colesterol HDL.

Para a garantia do controle de qualidade das determinações bioquímicas foi

utilizado o soro Qualitrol 1H da Labtest Diagnóstica S.A.

Colesterol não-HDL (mmol/L) = Colesterol Total (mmol/L) – Colesterol HDL (mmol/L)


34

4.6 - EXTRAÇÃO E DOSAGEM DA GORDURA HEPÁTICA

A gordura hepática foi extraída usando uma mistura de clorofórmio e metanol

(2:1, v/v), conforme descrito por Folch et al. (1957). Posteriormente, foi quantificada

gravimetricamente e o colesterol total foi mensurado no extrato lipídico.

Procedimento de extração da gordura hepática:

Inicialmente, 400 mg de fígado foram homogeneizados com 8 mL da mistura

clorofórmio-metanol (2:1v/v) e o homogenato vertido em tubos de vidro pré-lavados

com éter de petróleo. Os tubos foram centrifugados a 1000 g por 10 minutos. O

sobrenadante foi retirado e colocado em outro tubo de vidro previamente pesado e

identificado. Foram acrescentados 2 mL da solução de NaCl 0,73%, nova centrifugação

foi realizada e a fase superior desprezada. Posteriormente, a parede interna do tubo de

vidro foi lavada com 3 mL da solução de Folch - clorofórmio/metanol/água (3: 48: 47).

A fase superior foi desprezada e os tubos com os extratos lipídicos foram secos em

estufa semiaberta a 40ºC para evaporação total do solvente. Após a evaporação, os

tubos foram resfriados no dessecador e pesados novamente.

Cálculo:

4.6.1 - DOSAGEM DE COLESTEROL TOTAL NA GORDURA HEPÁTICA

Anteriormente ao procedimento de dosagem do colesterol total, a gordura

hepática extraída foi diluída em isopropanol. Dessa forma, em um tubo de polipropileno

diluições de 1:50 foram preparadas a partir da homogeneização de 10 μL de gordura em

490 μL em isopropanol.

Em seguida, a concentração de colesterol total nessa amostra diluída foi

determinada, utilizando o kit para colesterol total da Labtest Diagnóstica S.A. (Lagoa

Quantidade de Gordura no Fígado (mg) = [peso do tubo final (g) – peso do tubo inicial (g)] x 1000


35

Santa, MG, Brasil) e os resultados foram expressos em mg de colesterol total/ grama de

fígado.

4.7 - EXTRAÇÃO E DOSAGEM DA GORDURA FECAL

A gordura fecal foi extraída usando uma mistura de clorofórmio e metanol (2:1,

v/v), conforme descrito por Folch et al. (1957). Posteriormente, foi quantificada

gravimetricamente e o colesterol total foi mensurado no extrato lipídico.

Procedimento de extração da gordura fecal:

Em tubos de vidro pré-lavados com éter de petróleo, 100 mg de fezes maceradas

foram homogeneizadas com 1,9 mL da mistura clorofórmio-metanol (2:1v/v) e 0,4 mL

de metanol. Os tubos foram centrifugados a 1000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi

retirado e colocado em outro tubo de vidro previamente pesado e identificado. Foram

acrescentados 0,8 mL de clorofórmio puro e 0,64 mL da solução de NaCl 0,73%, nova

centrifugação foi realizada e a fase superior desprezada. Posteriormente, a parede

interna do tubo de vidro foi lavada com 0,9 mL da solução de Folch -

clorofórmio/metanol/água (3: 48: 47). A fase superior foi desprezada e os tubos com os

extratos lipídicos foram colocados em estufa semiaberta a 40ºC para evaporação total do

solvente. Após a evaporação, os tubos foram resfriados no dessecador e pesados

novamente.

Cálculo:

4.7.1 - DOSAGEM DE COLESTEROL TOTAL NA GORDURA FECAL

Anteriormente ao procedimento de dosagem do colesterol total, a gordura fecal

extraída foi diluída em isopropanol. Dessa forma, em um tubo de polipropileno

Quantidade de Gordura nas Fezes (mg) = [peso do tubo final (g) – peso do tubo inicial (g)] x 1000


36

diluições de 1:50 foram preparadas a partir da homogeneização de 10 μL de gordura em

490 μL em isopropanol.

Em seguida, a concentração de colesterol total nessa amostra diluída foi

determinada, utilizando o kit para colesterol total da Labtest Diagnóstica S.A. (Lagoa

Santa, MG, Brasil) e os resultados foram expressos em mg de colesterol total/ grama de

fezes.

4.8 - ENSAIO DE RT-PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL

4.8.1 - EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL

O RNA total do tecido hepático de ratos foi isolado utilizando o sistema SV

Total RNA Isolation System (Promega Corporation, Madison, USA) de acordo com as

instruções do fabricante. Resumidamente, 60 mg do tecido hepático foram

homogeneizados com 350μL do tampão de lise (RNA Lysis Buffer). Uma alíquota de

175 μL do homogenato obtido foi transferida para um novo tubo, onde foram

adicionados 350 μL do tampão de diluição (RNA Diltion Buffer). A mistura foi

colocada em banho-maria por exatamente 3 minutos e centrifugada a 1500 g por 10

minutos. Ao sobrenadante, foram adicionados 200 μL de etanol 95% e o volume total

foi transferido para a membrana da coluna do Spin Basket Assembly e centrifugados á

1500 g por 1 minuto. À membrana dessa coluna foram adicionados 600μL de RNA

Wash Solution, seguida por centrifugação a 1500 g por 1 minuto. Posteriormente foram

adicionados 50 μL do mix de incubação de DNAse o qual foi incubado a temperatura

ambiente por 15 minutos. Após este período, 200μL de DNAse Stop Solution foram

adicionados a coluna e centrifugados a 1500 g por 1 minuto. Foram realizadas duas

lavagens com RNA Wash Solution, (600 μL a 1500 g por 1 minuto e 250 μL a 1500 g

por 2 minutos respectivamente). A coluna foi transferida para o tubo de eluição e sobre

sua membrana foram adicionados 100 μL de Nuclease Free Water, que foram

posteriormente centrifugados a 1500 g por 1 minuto. Por último, a concentração e

pureza do RNA total foram determinadas em espectrofotômetro NanoVue (GE

Healthcare, UK).


37

4.8.2 - SÍNTESE DO CDNA

O ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de

1µg de RNA total utilizando o kit Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription da

Applied Biosystems, (Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O

meio de reação continha 2 μL de tampão 10x (500 mM de KCl, 100 mM deTris-HCl, 25

mM de MgCl2, pH 8,3), 0,8 μL da mistura de desoxiribonucleotídeos trifosfato

(dNTPs) 100 mM, 2 μL de primers randômicos e 1 μL da enzima transcriptase reversa

MultiScribe (50 U/μL). A reação foi realizada nas seguintes condições, 10 minutos a

25°C, seguido de 120 minutos a 37°C e 5 minutos a 85°C no termociclador Biocycler

modelo MJ96+.

4.7.3 - DESENHO DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES

Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos transcritos

de interesse foram construídos de acordo com sequências de nucleotídeos publicadas na

literatura (tabela III).


38

TABELA III – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a análise qRT-PCR.

Gene Oligonucleotídeos Iniciadores

(sequência 5’ para 3’) Referência

SREBP-2 F - TGGGCTTCTTGGCTAGCTACTT

R - TTCGCTCCATGAAAAACTTCTG Reena et al. (2011)

HMG CoA F - AGATACTGGAGAGTGCCGAGAAA

R - TTTGTAGGCTGGGATGTGCTT Li et al. (2009)

LDLR F - CCAACCTGAAGAATGTGGTG

R - CAGGTCCTCACTGATGATGG Li et al. (2009)

PPAR α

F - TGTCGAATATGTGGGGACAA

R - AAACGGATTGCATTGTGTGA

Palou et al. (2008)

CYP7A1 F - TACTTCTGCGAAGGCATTTGG

R- GAACACAGAGCATCTCCCTGG Reena et al. (2011)

LXR F - GGCCCTGCATGCCTATGT

R- CATTAGCATCCGTGGGAACA Shibata et al. (2007)

FXR F - TGACAAAGAAGCCGCGAAT

R- CACACAGCTCATCCCCTTTTATT Shibata et al. (2007)

SHP F - GGAGCAGCCCTCGTCTCA

R- ACACTGTATGCAAACCGAGGAA Shibata et al. (2007)

ABCG5 F - AGGCTCAGTTACAGGCTCAGAG

R - GTCCCACTTCTGCTGGCATGAT

Scoogan et al. (2009)

ABCG8 F - CGTCAGATTTCCAATGACTTCCG

R - TCCGTCCTCCAGTTCATAGTACA Scoogan et al. (2009)

ABCB11 F - GCACCCTTGAGAGGACCTTTT

R - AGCGTTGCCGGATCGA

Shibata et al. (2007)

GAPDH F - ATGGAGAAGGCTGGGGCTCACCT

R - AGCCCTTCCACGATGCCAAAGTTGT Xiong et al. (2010)


39

4.8.4 - CURVA DE EFICIÊNCIA DO OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES

Para determinar a eficiência da amplificação dos genes alvo e do gene de

referência endógena foram construídas curvas padrões para cada amplificado, a partir de

diluições seriadas do cDNA de uma mesma amostra. A análise de regressão linear

dos valores de “Threshold Cycle” (CT) em função do logaritmo da respectiva diluição

forneceu o coeficiente angular da reta (a, em y = ax+b) que foi utilizado para o cálculo

da eficiência de amplificação do produto pelos iniciadores, conforme equação abaixo.

4.8.5 - RT-PCR QUANTITAIVA EM TEMPO REAL

A análise da expressão gênica foi realizada através da técnica de PCR em tempo

real (qPCR). A quantificação dos produtos formados durante os ciclos de amplificação

foi realizada com o reagente Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA). As reações foram realizadas em placas de 96

poços, sendo adicionados em cada poço 2 μL de cDNA (100 ng), 0,48 μL de cada

primer (forward e reverse, 10 μM), 6 μL Power de SYBR®

Green Master Mix e volume

final de água livre de DNAse para 12 μL. As reações foram realizadas nas seguintes

condições, 50°C por 2min, 95° C por 10 min e então 40 ciclos de 95°C por 15s

(desnaturação) e 60°C por 1min (anelamento dos iniciadores e extensão dos produtos)

no termociclador ABI 7300 (Applied Biosystems, CA, USA). O gerenciamento do

termociclador e a coleta dos dados gerados durante a amplificação foram realizados pelo

programa 7000 System SDS Software (Applied Biosystems). Todas as análises foram

realizadas em triplicata técnica. A especificidade dos produtos obtidos foi confirmada

pela análise das curvas de dissociação do produto amplificado ao final de cada reação.

Os dados obtidos foram analisados utilizando o método de quantificação relativa

da expressão gênica (CT comparativo ou ∆∆CT), que permite quantificar diferenças no

nível de expressão de um gene específico entre as diferentes amostras. A expressão dos

genes alvo foi determinada em função da expressão do gene de referência endógena


40

gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase (GAPDH) e uma amostra normalizadora (grupo C)

foi utilizada como base para os resultados de expressão comparativa. De posse dos

valores de CT, que corresponde ao número do ciclo na fase exponencial da PCR em que

a fluorescência ultrapassa o valor basal, foi calculado o ∆CT de cada amostra, na qual o

valor do CT do gene de referência endógena (GAPDH) foi subtraído do CT do gene alvo.

Em seguida foram calculados os valores de ∆∆CT, na qual o valor do ∆CT da

amostra normalizadora (grupo C) foi subtraído do ∆CT das amostras teste (demais

grupos experimentais).

Os valores do ∆∆CT obtidos foram utilizados em uma fórmula aritmética para o

cálculo final da diferença de expressão dos genes entre as amostras analisadas, dada por

2-∆∆CT

.

4.9 - ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todos os dados foram submetidos ao teste de normalidade Kolmogorov-

Smirnov. Os parâmetros avaliados apresentaram distribuição normal e foram analisados

pelo teste de análise de variância univariada (ANOVA-one way) seguido pelo teste de

Bonferroni para determinação das diferenças entre os grupos. Para as análises da

expressão gênica foi utilizado teste-t de Student.

Os dados foram expressos como média ± desvio padrão e as diferenças foram

consideradas significativas para p <0,05. Todas as análises foram realizadas utilizando o

software GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (San Diego, California, USA).

∆CT = CT do gene alvo - CT do gene de referência endógena

∆∆CT = ∆CT da amostra teste - ∆CT da amostra normalizadora

SILVA, L.S. Capítulo 5 - Resultados

42

CAPÍTULO 5 – RESULTADOS

5.1 - EXPERIMENTO 1

5.1.1 - INGESTÃO ALIMENTAR, GANHO DE PESO E EFICIÊNCIA ALIMENTAR

Os parâmetros ingestão alimentar diária, ganho de peso corporal e eficiência

alimentar foram avaliados nos grupos experimentais e estão apresentadas na tabela IV.

Os animais que receberam as dietas hipercolesterolemiantes (H e HBC)

apresentaram menor ingestão alimentar em relação ao controle, entretanto foram os que

apresentaram maior ganho de peso corporal e consequentemente aqueles com maior

eficiência alimentar.

Tabela IV - Ingestão alimentar diária, ganho de peso corporal, e eficiência alimentar


hipercolesterolemiante suplementada com e beta caroteno.

Grupos Experimentais

Variáveis C H HBC

Ingestão Alimentar (g/dia) 15,38 2,00a

12,14 1,79b 11,20 0,60

b

Ganho de peso corporal (g) 32,04 9,45b

69,31 13,22a

56,16 15,45a

Eficiência Alimentar (%)* 5,03 1,62

b 13,69 2,49

a 11,85 2,96

a

Os resultados estão apresentados como média desvio padrão (n=8). Letras sobrescritas diferentes na

mesma linha indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos. Os dados foram

analisados por análise de variância univariada (one way ANOVA) seguido pelo Teste de Bonferroni

(p ≤ 0,05). C: grupo controle; H: dieta hipercolesterolemiante; HBC: dieta hipercolesterolemiante + beta

caroteno 0,2%. * (Ganho de peso corporal)/ (ingestão alimentar) x 100.

A Figura 9 demonstra a evolução do ganho de peso dos animais ao longo do

período experimental. Durante todo o período foi observado que os animais do grupo H

obtiveram os maiores pesos e que os animais do grupo HBC se mantiveram com pesos

intermediários aos pesos obtidos pelos animais dos grupos C e H.


43

Figura 9 – Curva de crescimento semanal dos grupos de animais do experimento 1.

C: grupo controle; H: dieta hipercolesterolemiante; HBC: hipercolesterolemiante + beta

caroteno 0,2%.

5.1.2 - PERFIL LIPÍDICO E ÍNDICE ATEROGÊNICO

Para avaliar a eficácia da dieta hipercolesterolêmica e os efeitos do tratamento

com beta caroteno, o perfil lipídico sérico dos animais foi avaliado. Como esperado, os

animais do grupo H exibiram maiores concentrações de colesterol total e colesterol não-

HDL, maior índice aterogênico e menor concentração de colesterol HDL em relação ao

grupo controle. A suplementação do beta caroteno á dieta hipercolesterolemiante

promoveu efeitos hipolipidêmicos. O colesterol total sérico, o colesterol não-HDL, o

índice aterogênico e os triglicérides foram reduzidos em aproximadamente 19%, 25%,

28% e 27% respectivamente nos animais do grupo HBC em comparação ao grupo H

(Tabela V).


44

Tabela V - Perfil lipídico sérico e índice aterogênico de ratas tratadas com dieta padrão,

dieta hipercolesterolemiante e dieta hipercolesterolemiante suplementada com e beta

caroteno.


Variáveis C H HBC

Colesterol total (mmol/L) 2,50 0,23b

4,21 0,66a

3,41 1,02a,b

Colesterol HDL (mmol/L) 1,66 0,12a

0,36 0,08b

0,42 0,12b

Colesterol não-HDL (mmol/L) 0,84 0,15c

3,84 0,69a

2,86 0,90b

Índice aterogênico* 0,50 0,09

c 9,65 2,00

a 6,94 2,42

b

Triglicérides (mmol/L) 0,54 0,08a 0,41 0,06

b 0,30 0,05

c



analisados por análise de variância univariada (one way ANOVA) seguido pelo Teste de Bonferroni (p ≤

0,05). C: grupo controle; H: dieta hipercolesterolemiante; HBC: dieta hipercolesterolemiante + beta

caroteno 0,2%. *(Colesterol não - HDL) x (Colesterol HDL)-1

.


TOTAL HEPÁTICO

A dieta hipercolesterolemiante elevou em 68% o peso relativo do fígado, e

elevou em 6,5 e 25 vezes respectivamente a gordura e o colesterol total hepático dos

animais do grupo H em relação ao grupo controle. A suplementação do beta caroteno á

dieta hipercolesterolemiante reduziu todos estes parâmetros. Foram observadas

reduções de aproximadamente 15% no peso relativo, 42% na gordura total hepática e

22% no colesterol total hepático dos animais do grupo HBC em relação aos animais do

grupo H (Tabela VI).


45

Tabela VI – Peso relativo do fígado e conteúdos totais de gordura e colesterol hepático


hipercolesterolemiante suplementada com e beta caroteno.


Variáveis C H HBC

Peso relativo do fígado (%)* 2,59 0,10

c 4,37 0,15

a 3,69 0,30

b

Gordura total hepática

(mg de gordura/g de fígado) 57,56

6,78

c 377,30

20,77

a 216,00 42,03

b

Colesterol total hepático

(mg de colesterol/g de fígado) 3,87

0,49

c 99,13

8,58

a 77,42 12,17

b





caroteno 0,2%. *(Peso do fígado) / (Peso corporal) x 100.

5.1.4 - EXCREÇÃO FECAL E QUANTIDADES DE GORDURA E COLESTERL TOTAL FECAL

A tabela VII indica que os animais do grupo H apresentaram elevações nos

conteúdos totais de gordura e colesterol fecal em relação aos animais controle. A

suplementação do beta caroteno á dieta hipercolesterolemiante promoveu uma elevação

de 52% e 46% respectivamente na gordura e colesterol total fecal no grupo HBC

comparado ao grupo H. A excreção fecal diária não foi afetada nem pela dieta

hipercolesterolemiante e nem pelo beta caroteno


46

Tabela VII – Excreção fecal diária e conteúdos totais de gordura e colesterol fecal em


hipercolesterolemiante suplementada com beta caroteno.


Variáveis C H HBC

Excreção fecal (g/dia) 0,93 0,09

0,90 0,03

0,93 0,07

Gordura total fecal (mg de

gordura/g de fezes) 44,71 12,03

c 129,90 27,79

b 197,50 20,78

a

Colesterol total fecal (mg

de colesterol/ g de fezes) 2,34 0,53

c 80,41 7,17

b 117,30 22,36

a





caroteno 0,2%.

5.1.5 - EXPRESSÃO DE GENES DO METABOLISMO HEPÁTICO DO COLESTEROL

Para investigar os mecanismos moleculares envolvidos no efeito

hipocolesterolêmico do beta caroteno, a expressão de importantes genes relacionados ao

metabolismo do colesterol foi avaliada por qRT-PCR, incluindo o SREBP-2, HMG

CoA-R, LDLR, PPAR α, ABCG5, ABCG8 e CYP7A1. Assim, o efeito da dieta

hipercolesterolemiante foi avaliado comparando-se o grupo C com o grupo H e o efeito

do beta caroteno foi avaliado comparando-se o grupo H com o grupo HBC.

A Figura 10 mostra que os animais do grupo H apresentaram reduções na

expressão dos genes SREBP-2, HMG CoA-R e LDLR e aumentos nas expressões de

PPAR α e CYP7A1 ( 0,5 e 7,3 vezes respectivamente) quando comparados aos animais

do grupo C. A suplementação de beta caroteno á dieta hipercolesterolemiante não afetou

a expressão de nenhum destes genes, sendo os animais dos grupos H e HBC

estatisticamente iguais. A expressão dos transportadores ABCG5 e ABCG8 entre os

grupos C e H e entre os grupos H e HBC foram também estatisticamente iguais.


47

Figura 10- Expressão do mRNA de genes hepáticos relacionados ao metabolismo de lipídios.

C: grupo controle; H: dieta hipercolesterolemiante; HBC: dieta hipercolesterolemiante + beta caroteno

0,2%.(A) SREBP-2: Proteínas ligadoras de elementos de resposta a esterol - 2; (B) HMG CoA R: 3-

Hydróxi-3-metilglutaril CoA redutase; (C) LDLR: Receptor da lipoproteína de baixa densidade; (D)

PPAR α: Receptores ativados por proliferadores de peroxisomos; (E) CYP7A1: colesterol 7α-hidroxilase

(F) ABCG5and (G) ABCG8, Transportadores cassete de ligação a ATP da subfamília G. Os dados estão

apresentados como média ± desvio padrão;( n=6 por grupo). Dados foram testados por teste-t de

Student’s. *p < 0.05 comparado ao grupo C, **p < 0.01 comparado ao grupo C, *** p < 0.001 comparado

ao C.


48

5.2 - EXPERIMENTO 2

5.2.1 - INGESTÃO ALIMENTAR, GANHO DE PESO E EFICIÊNCIA ALIMENTAR

Pela análise da Tabela VIII, podemos observar que os animais que receberam

suplementação de urucum á dieta (grupos HU 0,1% e HU 0,2%) apresentaram menor

ingestão alimentar diária quando comparados aos animais do grupo controle. Os

animais que receberam as dietas hipercolesterolemiantes (grupos H, HU 0,1% e HU

0,2%) apresentaram os maiores ganhos de peso corporal e eficiências alimentar.

Tabela VIII - Ingestão alimentar diária, ganho de peso corporal, e eficiência alimentar


hipercolesterolemiante suplementada com urucum.


Variáveis C H HU 0,1% HU 0,2%

Ingestão

alimentar

(g/dia)

15,382,00a

12,141,79a,b

11,510,62b 11,711,23

b

Ganho de peso

corporal(g) 32,049,45

b 69,3113,22

a 59,19 10,97

a 57,4610,78

a

Eficiência

alimentar (%)* 5,03 1,62

b 13,69 2,49

a 12,20 1,87

a 11,631,39

a



analisados por análise de variância univariada (one way ANOVA) seguido pelo Teste de Bonferroni

(p ≤ 0,05). C: grupo controle; H: dieta hipercolesterolemiante; HU 0,1%: dieta hipercolesterolemiante +

semente de urucum em pó na concentração de 0,1%; HU 0,2%: dieta hipercolesterolemiante + semente de

urucum em pó na concentração de 0,2%.

*(Ganho de peso corporal) / (ingestão alimentar) x 100.

A Figura 11 demonstra a evolução do ganho de peso dos animais ao longo do

período experimental. Durante todo o período foi observado que os animais do grupo H

obtiveram os maiores pesos e que os animais que receberam a suplementação do


49

urucum ás dietas se mantiveram com pesos intermediários aos pesos obtidos pelos

animais dos grupos C e H, independentemente das concentrações de urucum utilizadas.

Figura 11 - Curva de crescimento semanal dos grupos de animais do experimento 2. C: grupo controle; H: dieta hipercolesterolemiante; HU 0,1%: dieta hipercolesterolemiante +

semente de urucum em pó na concentração de 0,1%; HU 0,2%:dieta hipercolesterolemiante +

semente de urucum em pó na concentração de 0,2%.

5.2.2 - PERFIL LIPÍDICO E ÍNDICE ATEROGÊNICO

Para avaliar a eficácia da dieta hipercolesterolêmica e os efeitos do tratamento

com o urucum, o perfil lipídico sérico dos animais foi avaliado. Como esperado, os

animais do grupo H exibiram maiores concentrações de colesterol total e colesterol não-

HDL, maior índice aterogênico e menor concentração de colesterol HDL em relação ao

grupo controle. A suplementação do ururcum em ambas as concentrações á dieta

hipercolesterolemiante promoveu efeitos hipolipidêmicos. Os animais tratados com

0,1% e 0,2% de urucum demonstraram respectivamente, reduções de 28% e 44% nas

concentrações de colesterol total quando comparados aos animais hipercolesterolêmicos

não tratados (grupo H). Estas reduções tornaram os grupos HU 0,1% e HU 0,2%

estatisticamente iguais aos animais do grupo controle. Embora a suplementação com o

urucum não tenha elevado as concentrações do colesterol HDL, nem reduzido os

triglicérides, uma redução significante no colesterol não-HDL foi observada, As


50

concentrações do colesterol não-HDL nos grupos HU 0,1% e HU 0,2% foram

reduzidas em 31% e 49% respectivamente comparadas com o grupo H. Da mesma

forma, o índice aterogênico nos grupos HU 0,1% e HU 0,2% foram reduzidas em

aproximadamente em 29% e 43%, respectivamente (Tabela IX).

Tabela IX - Perfil lipídico sérico e índice aterogênico de ratas tratadas com dieta

padrão, dieta hipercolesterolemiante e dieta hipercolesterolemiante suplementada com

urucum.



Colesterol total

(mmol/L) 2,50 0,23

b 4,21 0,66

a 3,04 0,68

b 2,34 0,61b

Colesterol HDL

(mmol/L) 1,66 0,12

a 0,36 0,08

b 0,41 0,10

b 0,36 0,05

b

Colesterol não-HDL

(mmol/L) 0,84 0,15

c 3,84 0,69

a 2,63 0,71

b 1,97 0,63

b

Índice aterogênico* 0,50 0,09

c 9,65 2,00

a 6,85 2,31

b 5,48 1,83

b

Triglicérides (mmol/L) 0,54 0,08a 0,41 0,06

b 0,35 0,06

b 0,32 0,07

b




0,05). C: grupo controle; H: dieta hipercolesterolemiante; HU 0,1%: dieta hipercolesterolemiante +

semente de urucum em pó na concentração de 0,1%; HU 0,2%: dieta hipercolesterolemiante + semente

de urucum em pó na concentração de 0,2%. *(Colesterol não - HDL) x (Colesterol HDL)-1

.


TOTAL HEPÁTICO

A dieta hipercolesterolemiante elevou o peso relativo do fígado, a gordura e o

colesterol total hepático dos animais do grupo H em relação ao grupo controle. A

suplementação do urucum á dieta hipercolesterolemiante não alterou estes parâmetros

(Tabela X).


51

Tabela X – Peso relativo do fígado e conteúdos totais de gordura e colesterol hepático





Peso relativo do fígado

(%)*

2,590,10 b

4,370,15a

4,080,35a

4,26 0,49a

Gordura hepática

(mg de gordura/g de

fígado)

57,566,78b

377,3020,77a

291,1084,84a

341,5081,53a

Colesterol total

hepático (mg de

colesterol/ g de fígado)

3,87 0,49

b 99,13

8,58

a 82,75 13,70

a 94,17 9,61

a






de urucum em pó na concentração de 0,2%.

*(Peso do fígado) / (Peso corporal) x 100.

5.2.4 - EXCREÇÃO FECAL E QUANTIDADES DE GORDURA E COLESTERL TOTAL FECAL

A excreção fecal diária não foi afetada nem pela dieta hipercolesterolemiante e

nem pela suplementação com o urucum. Os animais do grupo H apresentaram elevações

nos conteúdos totais de gordura e colesterol fecal em relação aos animais controle. A

suplementação do urucum á dieta hipercolesterolemiante não alterou estes parâmetros

(Tabela XI).


52

Tabela XI – Excreção fecal diária e conteúdos totais de gordura e colesterol fecal em





Excreção fecal (g/dia) 0,93 0,09

0,90 0,03 1,01 0,06 0,98 0,10

Gordura total fecal

(mg de gordura/g de

fezes)

44,7112,03b 129,9027,79

a 130,0035,86

a 137,3016,62

a

Colesterol total fecal

(mg de colesterol/g

de fezes)

2,34 0,53b 80,41 7,17

a 69,34 9,80

a 82,1521,11

a






de urucum em pó na concentração de 0,2%.

5.2.5 - EXPRESSÃO DE GENES DO METABOLISMO HEPÁTICO DO COLESTEROL

A Figura 12 mostra que os animais do grupo H apresentaram reduções na

expressão dos genes SREBP-2, HMG CoA-R e LDLR e aumento na expressão de

PPAR α quando comparados aos animais do grupo C. A suplementação do urucum á

dieta hipercolesterolemiante não afetou a expressão de nenhum destes genes em

nenhuma das concentrações.


53

.

Figura 12- Expressão do mRNA de genes hepáticos relacionados ao metabolismo de lipídios.

C: grupo controle; H: dieta hipercolesterolemiante; HU 0,1%: dieta hipercolesterolemiante + semente de

urucum em pó na concentração de 0,1%; HU 0,2%: dieta hipercolesterolemiante + semente de urucum

em pó na concentração de 0,2%. (A) SREBP-2: Proteínas ligadoras de elementos de resposta a esterol -

2; (B) HMG CoA R: 3-Hydróxi-3-metilglutaril CoA redutase; (C) LDLR: Receptor da lipoproteína de

baixa densidade; (D) PPAR α: Receptores ativados por proliferadores de peroxisomos. Os dados estão

apresentados como média ± desvio padrão;( n=6 por grupo). Dados foram testados por teste-t de

Student’s. *p < 0.05 comparado ao grupo C, **p < 0.01 comparado ao grupo C, *** p < 0.001 comparado

ao C.


54

Os níveis de mRNA da CYP7A1 foram elevados em 7,3 vezes no grupo H em

comparação ao grupo C. A suplementação com urucum elevou significativamente os

níveis de mRNA dessa enzima. O aumento na expressão da CYP7A1 no grupo HU

0,1% foi de 1,6 vezes e no grupo HU 0,2 foi de 1,5 vezes, ambos em relação ao grupo

H.

A expressão dos receptores LXR e FXR, bem como a expressão dos

transportadores ABCG5 e ABCG8 não foram alteradas nem pela dieta

hipercolesterolemiante e nem pela suplementação com urucum. Assim, não houveram

diferenças nas comparações (C x H ), ( H x HU 0,1%) e (H x HU 0,2%).

A dieta hipercolesterolemiante não afetou a expressão de SHP e ABCB11, mas a

suplementação do urucum a esta dieta promoveu elevações nos níveis de mRNA para

SHP e ABCB11. O aumento na expressão de SHP nos grupos HU 0,1% e HU 0,2% foi

de aproximadamente 1,8 e 1,9 vezes respectivamente relação ao grupo H e o aumento

na expressão de ABCB11 nos grupos HU 0,1% e HU 0,2% foi de aproximadamente 2,0

e 1,8 vezes respectivamente (Figura 13).


55

Figura 13- Expressão do mRNA de genes hepáticos relacionados ao metabolismo de lipídios. C: grupo controle; H: dieta hipercolesterolemiante; HU 0,1%: dieta hipercolesterolemiante + semente de

urucum em pó na concentração de 0,1%; HU 0,2%: dieta hipercolesterolemiante + semente de urucum

em pó na concentração de 0,2%. (A) CYP7A1: colesterol 7α-hidroxilase; (B) LXR: Receptor X hepático;

(C) FXR: receptor X farnesóide; (D) ABCG5and (E) ABCG8, Transportadores cassete de ligação a ATP

da subfamília G; (G) SHP: small heterodimer partner; (H) ABCB11: Transportadores cassete de ligação a

ATP da subfamília B. Os dados estão apresentados como média ± desvio padrão;( n= 6 por grupo). Dados

foram testados por teste-t de Student’s. *** p < 0.001 comparado ao C. # p < 0.05comparado ao H, ## p <

0.01 comparado ao H.

SILVA, L.S Capítulo 6 - Discussão

57

CAPÍTULO 6 – DISCUSSÃO

6.1- EXPERIMENTO 1

A hiperlipidemia, comum na população mundial, é considerada como um fator

de risco altamente modificável para as doenças cardiovasculares, tais como a doença

coronária cardíaca e doenças arteriais periféricas. Níveis elevados de lipídios no sangue,

especialmente aumentados níveis séricos de LDL, podem acelerar a aterosclerose e a

redução dos níveis lipídicos, portanto, tem sido considerada uma abordagem importante

para prevenir ou retardar a progressão da aterosclerose (Durrington, 2003; Arsenault et

al, 2009).

Dado o interesse público na prevenção e/ou tratamento das DCV e outras

doenças metabólicas, estudos têm sido realizados para identificar produtos naturais que

possam regular a dislipidemia (Yeon et al., 2012) e nessa perspectiva, estudos

epidemiológicos têm encontrado associações inversas entre os níveis de beta caroteno

no soro ou tecido adiposo e as doenças cardiovasculares (Kritchevsky, 1999).

O beta caroteno demonstrou diminuir o colesterol sérico e as lesões

ateroscleróticas aórticas em ratos e coelhos hipercolesterolêmicos respectivamente

(Amen e Lachance, 1974; Erdman e Lachance, 1974; Shaish et al., 1995). A alta

ingestão de beta caroteno e a suplementação dietética de vitamina E foram associados a

uma diminuição do risco de doença coronariana arterial (Gey et al., 1991; Gaziano e

Hennekens, 1993; Stampfer et al., 1993). O beta caroteno mostrou efeitos anti-

hiperlipidêmicos em ratos espontaneamente hipertensos (Tsai e Mazeedi, 1988; Tsai et

al., 1992), e estudos em ratos e camundongos indicaram a supressão ou a redução da

peroxidação lipídica e uma melhora no status antioxidante após a administração de beta

caroteno (Iyama et al., 1996; Whittaker et al., 1996; Kraus et al., 1997; Riondel et al.,

2002).

O experimento 1 do nosso trabalho, avaliou os efeitos do beta caroteno na

concentração de 0,2%, sobre parâmetros relacionados ao metabolismo do colesterol

utilizando ratos com hiepercolesterolemia como modelo animal.


58

Sabe-se que a concentração de beta caroteno tem influência na sua ação

antioxidante, podendo prejudicar sua habilidade protetora e/ou a reverter em pró-

oxidativa. Além disso, sabe-se que o colesterol dietético exerce efeito pró-oxidativo

sobre a peroxidação de lipídios e oxidação de lipoproteínas. A escolha da dose utilizada

neste estudo, foi baseada no trabalho de Shih et al. (2008), no qual a suplementação de

beta caroteno na dose de 0,2%, á dieta hipercolesterolemiante proporcionou em ratos,

efeitos hipocolesterolemiantes sem comprometimento da suas capacidade antioxidante.

Os resultados da Tabela IV indicam que apesar de os animais tratados com as

dietas hipercolesterolemiantes (grupos H e HBC) apresentarem menor ingestão

alimentar em relação ao controle eles foram os que apresentaram maior ganho de peso

corporal e maior eficiência alimentar.

Os ratos ajustam sua ingestão alimentar em função de seus requerimentos

energéticos (Baker et al., 1979), sendo assim, quanto mais calorias por grama uma dieta

apresentar, menor será a quantidade ingerida pelos animais para cobrir suas

necessidades calóricas. As dietas oferecidas aos animais dos grupos H e HBC

acondicionavam maior valor calórico, justificando assim, a menor ingestão apresentada

pelos animais destes grupos (Valor energético: C = 3810 Kcal; H= 4820 Kcal e HBC =

4740 Kcal).

Os nossos resultados de perfil lipídico sérico, demonstraram que a

suplementação de beta caroteno à dieta hipercolesterolêmica foi efetiva em promover

efeitos hipolipidêmicos, sendo capaz de reduzir as concentrações séricas de colesterol

total e colesterol não-HDL, bem como o índice aterogênico dos animais do grupo HBC

em 19%, 25% e 28%, respectivamente. (Tabela V).

As funções fisiológicas e os efeitos colaterais do colesterol têm sido amplamente

documentados. Ratos alimentados com um nível elevado de colesterol geralmente

apresentam fígado gorduroso caracterizado por um maior peso de tecido hepático e uma

aparência macroscópica anormal (Yuan et al., 1998; Yuan e Kitts, 2002). O presente

estudo mostrou que de fato, a administração da dieta hipercolesterolemiante promoveu

uma elevação no peso do fígado dos animais do grupo H, bem como um maior estoque

de gorduras totais, o qual pode ser atribuído ao maior acúmulo de colesterol encontrado

no fígado (Tabela VI). A suplementação de beta caroteno reduziu o peso do fígado, a

quantidade de gordura e o colesterol total hepático, demonstrando que a suplementação


59

de beta caroteno pode melhorar os níveis de lipídios tanto no soro quanto no fígado dos

animais. Semelhantes aos resultados encontrados neste estudo, Shih et al., (2008),

relataram que o colesterol dietético elevou significativamente as concentrações do

colesterol plasmático e hepático em ratos, e que a suplementação de beta caroteno

também a 0,2% melhoraram estas elevações de concentração induzidas pelo colesterol.

Quanto aos triglicérides, observamos que os animais que receberam dieta

hipercolesterolemiante apresentaram menores concentrações se comparados aos animais

que receberam a dieta controle e que o tratamento com beta caroteno reduziu as

concentrações séricas deste lipídio (Tabela V). Uma redução similar dos triglicérides

séricos em animais alimentados com dietas ricas em colesterol e gordura insaturada

também foram observadas por Turbino-Ribeiro et al., (2003), Thomas-Moyá et al.,

(2006) e Souza et al., (2010). Estes resultados podem ser explicados pela alta

quantidade de gorduras insaturadas usadas nessas dietas. É bem conhecido que ácidos

graxos insaturados inibem importantes enzimas relacionadas ao metabolismo da VLDL

resultando assim, em menores níveis de triglicérides no plasma (Connor et al., 1993).

O consumo de beta caroteno está associado com diversos efeitos benéficos á

saúde, entretanto os mecanismos adjacentes á sua atividade hipocolesterolemiante ainda

não estão claros. O presente estudo examinou também os efeitos do beta caroteno sobre

a excreção fecal de colesterol e caracterizou seus efeitos sobre a expressão hepática dos

genes SREBP-2, HMG-CoA redutase, LDLR , CYP7A1, PPARα, ABCG5 e ABCG 8.

A homeostase hepática do colesterol é mantida pelo balanço da síntese de novo,

captação e eliminação do colesterol (Li et al., 2011). A biossíntese e a captação do

colesterol são altamente reguladas ao nível transcricional através de mecanismos de

feedback negativo, os quais são controlados pelo SREBP-2 (Sato,2010).

SREBP-2 é um fator de transcrição que regula a homeostase do colesterol em

virtude da sua capacidade para se ligar e ativar os promotores de genes que codificam a

HMG-CoA redutase e o LDLR (Miserez et al., 2002). Tanto a HMG-CoA redutase

quanto o LDLR têm um elemento de regulação de esterol nas suas regiões promotoras e

são, portanto, geralmente regulados por SREBP-2 (Sato et al., 1999).

A análise de qRT-PCR para este experimento, revelou que os animais do grupo

de H apresentaram expressão de SREBP-2 significativamente menor em relação ao

grupo controle, e que a expressão dos genes HMG CoA-R e LDLR seguiu o mesmo


60

padrão de expressão do SREBP-2 (Figura 10). Tem sido sugerido que uma dieta

hipercolesterolêmica pode levar a um estado de saturação de colesterol nos hepatócitos,

o que resulta na diminuição da regulação da síntese de novo de colesterol e na menor

absorção de LDL através de receptor, com a diminuição da expressão de SREBP- 2.

Os nossos resultados sugerem que a saturação dos hepatócitos pelo colesterol foi

a responsável pela redução da expressão do SREBP-2, isto por sua vez refletiu em

menores expressões de HMG-CoA redutase e LDLR. Resultados de outros estudos

indicam que a expressão hepática dos genes HMG-CoA-R e LDLR em ratos

alimentados com dietas ricas em lipídios são reguladas negativamente em comparação

com a expressão obtida em ratos controle, corroborando então com os resultados

obtidos neste estudo (Rudling et al., 1992; Dhingra e Bansal 2006; Shibata et al., 2007;

Yiu et al., 2011; Gao et al., 2013). A suplementação de beta caroteno á dieta

hipercolesterolemiante não afetou a expressão hepática dos genes SREBP-2, HMG-

CoA-R e LDL-R.

A suplementação com beta caroteno também não afetou a expressão dos genes

PPARα e CYP7A1. Sendo as expressões destes genes aumentadas no grupo H em

comparação com o controle (Figura 10).

Os PPARs são fatores de transcrição pertencentes à superfamília dos receptores

nucleares. Os PPARs, com três isoformas (α, e ), estão envolvidos na regulação a

longo prazo do metabolismo lipídico, e suas atividades são moduladas por ligantes

derivados de lipídios endógenos. O PPARα é expresso no fígado e regula o catabolismo

dos ácidos graxos. Ele desempenha um papel importante na regulação da homeostase de

ácidos graxos através da regulação dos genes alvo que codificam enzimas da oxidação e

transporte de ácidos graxos (Ferré, 2004; Evans et al., 2009). Quando o PPARα é

ativado, ele promove a oxidação dos ácidos graxos, a síntese de corpos cetônicos, e

poupam glicose (Park et al., 2009).

O experimento 1, demonstra que a expressão do PPARα foi aumentada pela

dieta hipercolesterolêmica.Com base em estudos moleculares, é aceitável que a

sinalização do PPARα in vivo depende da disponibilidade de ligantes e da expressão do

receptor. Uma dieta rica em gorduras, presumivelmente, fornece mais ácidos graxos

como ligantes de PPARα e, portanto, pode ser capaz de up-regulate genes alvo do

PPARα e melhorar o metabolismo dos ácidos graxos através da via de sinalização do


61

PPARα. Isto, por sua vez, pode reduzir a acúmulo de gordura corporal (Hsu e Huanga,

2007).

Bonila et al., (2000) observaram que ratos Wistar alimentados com dietas ricas

em gordura (250 g de óleo vegetal / kg de dieta), exibiram aumentadas expressões

hepáticas de PPARα e acil-CoA oxidase, além de uma maior ativação de PPARα.

Vários autores (Gottlicher et al., 2002; Forman et al., 1997; Krey et al., 1997; Kliewer

et al., 1997; Murakami et al., 1999; Lin et al., 1999) demonstraram em estudos in vitro,

que ácidos graxos de cadeia longa não apenas se ligam como também ativam o PPARα.

Banner et al., (1993) identificaram o ácido palmítico, ácido linoleico, ácido oleico e o

ácido araquidônico como ativadores endógenos PPARα. A potência relativa de cada

ácido graxo varia com o tipo de medição e tipo de PPAR avaliado. Em experimentos

avaliando o PPARα de camundongos, ratos e humanos, a potência de ligação e de

ativação do ácido oleico foram comparáveis à do ácido linoleico (Gottlicher et al., 1992;

Murakami et al., 1999; Lin et al., 1999).

O fígado é o principal órgão envolvido na regulação do metabolismo do

colesterol, sendo a conversão do colesterol a ácidos biliares o caminho principal do

catabolismo deste esterol. A CYP7A1 é a enzima limitante na via biossintética hepática

dos ácidos biliares, e deste modo controla a homeostase do colesterol e ácidos biliares

(Li et al., 2011)

A deficiência de CYP7A1 em seres humanos está associada à

hipercolesterolemia e aterosclerose prematura (Pullinger et al., 2002). Miyake et al.,

(2002) relataram que a expressão transgênica de CYP7A1 no fígado de camundongos

preveniu a aterosclerose induzida por dieta litogênica e posteriormente, Li et al., (2010)

relataram que camundongos overexpressing CYP7A1 se mostraram protegidos contra a

hipercolesterolemia, obesidade e resistência à insulina induzidas por dietas ricas em

lipídios. O efeito de redução do colesterol pelo estímulo da síntese de ácidos biliares

tem sido atribuído ao aumento da conversão de colesterol em ácidos biliares e ao

estímulo de captação de colesterol hepático mediado por LDLR.

Em nosso experimento, os animais do grupo H exibiram um aumento

significativo de 7,3 vezes na expressão de CYP7A em comparação com o grupo

controle, corroborando com outros estudos que têm demonstrado que a atividade e a

expressão do mRNA da enzima CYP7A1 são aumentadas pela presença de colesterol


62

dietético (Guo et al., 2011; Yiu et al., 2011; Boone et al., 2011). A expressão hepática

da CYP7A1 não foi afetada pela suplementação do beta caroteno.

Ao avaliar as vias de biossíntese, captação e catabolismo do colesterol pôde-se

observar que a expressão de importantes genes dessas vias não foi afetada pela

administração do beta caroteno. Assim, foi investigado se os efeitos hipolipidêmicos

obtidos pelo beta caroteno estariam relacionados a alterações nas vias de efluxo do

colesterol como por exemplo: o transporte do colesterol do fígado para a bile, mediado

por transportadores, ou a eliminação direta do colesterol nas fezes.

A administração de beta caroteno aumentou significativamente a excreção de

gorduras e colesterol total nas fezes (Tabela VII). A diminuição dos níveis de

colesterol sérico e a elevação do colesterol fecal obtido pela administração do beta

caroteno sugerem que ele pode diminuir a absorção do colesterol no intestino e

aumentar sua excreção nas fezes, ou ainda apresentar alterações metabólicas nas células

intestinais.

A absorção do colesterol desempenha um papel importante na regulação de sua

homeostase no corpo inteiro (Grundy, 1983; Wilson e Rudel, 1994) e vários

transportadores têm sido sugeridos em afetar direta ou indiretamente a absorção do

colesterol intestinal. Neste contexto, os transportadores ABCG5 ABCG8, desempenham

papéis significativos na excreção direta do colesterol via bie (Rudel, 1994) e a sua

expressão foi avaliada.

O colesterol hepático é secretado para a bile através dos transportadores de

efluxo de colesterol ABCCG5 e ABCG8, presentes na membrana canalicular dos

hepatócitos (Graf et al., 2003; Yu et al., 2005). No intestino, ABCG5/G8 promove o

efluxo de esteróis vegetais e de colesterol para o lúmen, prevenindo a absorção de

esteróis vegetais e limitando a absorção do colesterol dietético. Mutações nos genes

ABCG5 e / ou ABCG8 causam sitosterolemia em seres humanos (Berge et al., 2000) e

camundongos knockout para os genes ABCG5/G8 exibem uma secreção biliar de

colesterol acentuadamente diminuída e um aumento na absorção intestinal do colesterol

fracionado (Yu et al., 2002).

Yu et al., (2002) mostraram que camundongos com aumento na expressão

desses transportadores no fígado e no intestino delgado apresentaram alterações

importantes no metabolismo do colesterol como, aumento na concentração de colesterol


63

na bile, redução na absorção do colesterol e aumento na síntese hepática deste esterol.

Nishimoto et al., (2009) demonstraram que a suplementação dietética com óleo de

peixe, rico em ácidos graxos poliinsaturados, aumentou significativamente a expressão

hepática dos transportadores ABCG5 e ABCG8 e a quantidade de colesterol excretada

nas fezes em camundongos.

As análises de qRT-PCR revelaram que nem a dieta hipercolesterolemiante e

nem o beta caroteno afetaram a expressão de genes ABCG5 e ABCG8 (Figura 10).

Embora não possamos excluir a possibilidade de uma regulação pós-transcricional na

expressão desses genes, estes resultados sugerem que a elevação da excreção fecal do

colesterol promovida pelo beta caroteno está mais relacionada com a diminuição da

absorção intestinal do colesterol do que com o aumento da sua eliminação na bile pelos

transportadores ABCG5 e ABCG8.

Rasmussen et al., (2009), avaliaram em camundongos C57BL/6J o efeito

hipocolesterolêmico da alga comestível Nostoc comune e observaram que sua

administração, reduziu o colesterol total sérico, reduziu a absorção intestinal e elevou a

excreção fecal de esteróis, sem afetar a expressão intestinal de ABCG5.

Uma vez que o beta caroteno não exerceu um efeito direto sobre a expressão dos

transportadores de colesterol, a redução da absorção do colesterol parece estar atribuída

ao seu efeito no interior do lúmen intestinal. Os passos principais na absorção de

colesterol são a emulsificação no estômago, a hidrólise da ligação éster com uma

esterase pancreática específica, a solubilização micelar, a absorção no intestino delgado

e o transporte para o sistema linfático (Ros, 2000). Devido à insolubilidade do colesterol

em água, a solubilização do colesterol em micelas mistas é um requisito para a

eficiência da sua absorção. O colesterol solubilizado é então transferido das micelas

para a membrana das células da borda em escova intestinal.

Park et al., (2009), observaram em ratos hipercolesterolêmicos tratados com

extratos de milho uma redução do colesterol sérico e uma elevação na excreção fecal de

colesterol, e propuseram, que os componentes ativos do milho poderiam estar

interferindo tanto na afinidade das micelas com a membrana intestinal quanto na

afinidade do colesterol com as micelas. Além disso, os mesmos autores relataram que

essas alterações no lúmen intestinal afetariam o metabolismo hepático do colesterol e

poderiam afetar a síntese e o catabolismo das lipoproteínas.


64

De maneira semelhante ao observado por Park et al.,(2009), podemos sugerir

que o beta caroteno possa estar agindo de maneira semelhante, uma vez que o aumento

da excreção fecal do colesterol não pode ser atribuído ao maior efluxo de colesterol do

fígado para a bile mediado pelos transportadores ABCG5 e ABCG8.

Em conclusão o beta caroteno não afetou a expressão hepática dos principais

genes envolvidos na homeostase do colesterol e os nossos resultados sugerem que a

diminuição da absorção intestinal do colesterol e o subsequente aumento da sua

excreção nas fezes foram os fatores primários para o efeito hipocolesterolemiante obtido

pelo beta caroteno (Figura 14).

Figura14: Resumo dos principais efeitos do beta caroteno no soro, nas fezes e no fígado.


65

6.2 - EXPERIMENTO 2

As sementes do urucum são uma importante fonte de corante natural usada na

indústria de alimentos, encontrando aplicações em produtos têxteis, cosméticos e

farmacêuticos. O urucum é conhecido por estar associado ao tratamento de várias

doenças na medicina popular e alguns estudos têm demonstrado efeitos antioxidantes e

hipocolesterolêmicos dos extratos de urucum.

O consumo do extrato de urucum demonstrou exibir várias propriedades

bioativas, incluindo propriedades antioxidantes e antitumorais (Júnior et al., 2005;

Agner et al., 2005). A suplementação de 0,09% de extrato de urucum modulou a

produção de espécies reativas de oxigênio e de óxido nítrico em neutrófilos de ratos

diabéticos (Rossoni Jr. et al., 2011). O tratamento com bixina e norbixina, os

componentes principais das sementes de urucum, promoveram efeitos positivos na

síndrome metabólica, melhorando a sensibilidade à insulina em adipócitos, através da

activação de PPAR (Takahashi et al.,2009). Em camundongos, o extrato aquoso das

sementes de urucun foi capaz de reverter a hipertrigliceridemia induzida por Triton,

frutose e etanol, demonstrando um efeito hipolipemiante (Ferreira et al., 2012), e em

ratos que foram alimentados com uma dieta rica em gorduras, o tratamento com extrato

aquoso de urucum reduziu o e colesterol total e LDL e elevou o colesterol HDL ( de

Paula et al., 2009).

O segundo experimento foi realizado para investigar a atividade hipolipemiante

do urucum utilizando ratos hipercolesterolêmicos induzidos por dieta como modelo

experimental.

Os nossos resultados mostraram que a suplementação de urucum a dieta

hipercolesterolemiante reduziu os níveis de colesterol total e colesterol não-HDL, bem

como o índice aterogênico (Tabela IX), demonstrando que o consumo de urucum

melhora o perfil de lipídios no soro e pode exercer um efeito ateroprotetor.

Tem sido demonstrado que fitoquímicos de algumas plantas medicinais

tradicionais têm efeitos hipolipidêmicos através da modulação de genes envolvidos no

metabolismo de lipídios e lipoproteínas (Chung et al., 2007; Chung et al., 2008). Assim,


66

nós focamos na caracterização dos efeitos do urucum sobre a transcrição de genes

hepáticos envolvidos no metabolismo do colesterol.

A Figura 12 demonstra que a suplementação de urucum a dieta

hipercolesterolêmica não alterou a expressão de SREBP-2 HMG-CoA-R, LDLR e

PPARα. Dessa forma, avaliamos se o efeito hipocolesterolemiante promovido pelo

urucum poderia estar relacionado á via de catabolismo do colesterol ou relacionado ás

vias de efluxo do colesterol como a sua eliminação através da bile mediada pelos

receptores ABCG5 e ABCG8, ou sua eliminação direta nas fezes.

Nossos resultados mostraram que a suplementação com urucum não alterou a

expressão de ABCG5 e ABCG8 (Figura 13), nem as quantidades de gordura e

colesterol total no fígado e nas fezes (Tabela X e XI), e dessa forma podemos assumir

que a secreção hepática do colesterol na bile mediada por estes transportadores não foi

estimulada e nem o efluxo de colesterol diretamente nas fezes.

A secreção biliar de colesterol quer sob a forma de colesterol livre ou ácido

biliar, é a única rota significativa na eliminação do colesterol em mamíferos. CYP7A1 é

a enzima limitante na via de biossíntese hepática dos ácidos biliares e deste modo

controla a homeostase do colesterol e ácido biliar (Li et al., 2011). Em algumas

espécies, o consumo de colesterol, em quantidades que excedem as exigências

nutricionais resulta em uma resposta homeostática que inclui a indução da expressão de

CYP7A1 e o aumento da síntese de ácidos biliares (Kern, 1991; Dueland et al., 1993)

Por outro lado, hamsters (Horton et al, 1995) e camundongos knockout para o receptor

LXR (Peet et al., 1998) exibem uma incapacidade em induzir a CYP7A1 em resposta

ao colesterol dietético e uma marcante susceptibilidade em acumular colesterol em

lipoproteínas no plasma e no fígado. Estes resultados sugerem que a modulação das vias

sintéticas de colesterol/ácidos biliares contribui para a manutenção da homeostase do

colesterol.

A estimulação gênica da expressão de CYP7A1, por dietas ricas em colesterol,

varia entre as espécies. Ratos e camundongos exibem uma marcante up-regulation

enquanto hamsters, humanos, macacos, cobaias e coelhos não estimulam ou até mesmo

reprimem a expressão de CYP7A1. Os ratos são, portanto, capazes de se adaptarem a

grandes flutuações de entrada de esteróis e são resistentes a hipercolesterolemia

induzida por dieta, enquanto que os coelhos e hamsters desenvolvem


67

hipercolesterolemia em uma dieta rica colesterol (Dueland et al., 1993; Rudel et al.,

1994; Horton et al., 1995; Nguyen et al., 1999).

Estudos de Horton et al.,(1995) mostraram que as diferenças de sensibilidade ao

colesterol dietético no rato e no hamster são principalmente devidas a diferenças na

regulação da CYP7A1. Um baixo nível basal de expressão da CYP7A1, acoplado a uma

incapacidade na indução da expressão e atividade da enzima, torna o hamster mais

sensível ao colesterol dietético do que o rato.

Outra particularidade observada em ratos e camundongos é que estes animais

possuem o ácido muricólico, um ácido biliar natural trihidroxilado, como seu principal

ácido biliar. Em humanos, este ácido biliar não ocorre em quantidades substanciais e

também não pode ser metabolizado á partir do ácido quenodesoxicólico como ocorre

em fígados de ratos (Denk et al., 2002).

Elevados níveis de ácidos biliares hidrofóbicos no fígado e outros

compartimentos do corpo são encontrados em doenças colestáticas primárias mais

comuns, como a cirrose biliar primária e a colangite esclerosante primaria. O ácido

muricólico, devido à presença de um grupo hidroxila adicional na posição 6 do anel

esteróide, é mais hidrofílico que o ácido ursodeoxicólico, o qual é utilizado como

tratamento médico para cirrose biliar primária (Maillette et al., 2010).

Tem sido demosntrado, a efetividade do ácido muricólico na dissolução de

cálculos biliares de colesterol in vitro (Montet et al., 1987), e em um recente estudo, o

ácido muricólico mostrou ser mais efetivo que o ácido ursodeoxicóclico em prevenir e

dissolver cálculos biliares em camundongos (Wang e Tazuma, 2002) . Adicionalmente,

o ácido muricólico promoveu efeitos benéficos tanto na colestase induzida por ácido

taurolitocólico em hepatócitos primários de ratos (Milkiewicz et al., 2002) quanto em

colestase induzida por ácido taurocólico em fígados perfundidos de ratos tratados com

colchicina (Katagiri et al., 1992).

A Figura 13 demonstra que a dieta hipercolesterolemiante promoveu um

aumento na expressão de CYP7A1 em 7,3 vezes no grupo H em comparação com o

grupo controle, e que a suplementação de urucum a esta dieta, promoveu elevações

significativas na expressão de CYP7A1 nos grupos HU 0,1% e HU 0,2%, em

comparação com o grupo H. Assim, estes resultados sugerem, que o urucum possa estar

interferindo na modulação hepática da síntese de ácidos biliares e que seu efeito


68

hipocolesterelemiante pode ser principalmente atribuído ao aumento do catabolismo do

colesterol pela up-regulation da CYP7A1.

Nós reconhecemos a limitação de se considerar apenas os níveis de expressão de

RNAm como uma medida da via de fluxo, bem como consideramos a importância de se

confirmar se alterações na expressão dos genes encontram-se refletidas nos níveis de

proteínas. Entretanto como suporte da nossa hipótese, os estudos de Buhman et al.,

2000; Yang et al., 2003 e Shibata et al., 2007a, demonstraram uma relação linear entre o

aumento da expressão gênica de CYP7A1, a maior atividade da enzima e a redução do

colesterol sérico.

A transcrição da CYP7A1 é regulada positivamente pelo LXR, que tem como

ligantes os oxisteróis, e negativamente pelo FXR, que tem como ligantes os ácidos

biliares.

Os oxisteróis aumentam a transcrição de ABCA1, ABCG5/G8, e CYP7A1

através da ativação de LXR e os ácidos biliares aumentam a transcrição de SHP e

ABCB11 através da ativação de FXR (Shibata et al., 2007). Com base em tais

informações, as alterações na expressão de CYP7A1 e ABCG5/G8, genes alvos de

LXR, foram verificadas para indicar se houve ativação do LXR, assim como as

alterações na expressão de SHP e ABCB11, genes alvo de FXR, foram verificadas para

indicar se houve ativação do FXR.

A Figura 13 demonstra que as expressões de LXR, FXR, ABCG5/G8, SHP e

ABCB11 não foram alteradas pela dieta hipercolesterolemiante e que as expressões de

SHP e ABCB11 foram elevadas pela suplementação do urucum á essa dieta.

Corroborando com os nossos resultados, Xu et al., (2004) observaram que a

expressão e a atividade da CYP7A1 de ratos Sprague-Dawley alimentados com 2% de

colesterol foram elevadas, e que as expressões de LXR, FXR, SHP e ABCB11 não

foram alteradas pelo colesterol dietético.

Além dos efeitos do colesterol dietético, os autores avaliaram também os efeitos

do ácido cólico sobre a expressão destes genes e os resultados indicaram que os animais

tratados com ácido cólico apresentaram maiores expressões de SHP e ABCB11 em

comparação aos animais não tratados. Segundo os autores, esta elevação foi devida á

ativação do FXR, uma vez que o pool dos ácidos biliares, os quais são ligantes de FXR,

foi expandido.


69

Os nossos resultados demonstram que os animais tratados com urucum

apresentaram maiores expressões de CYP7A1, SHP e ABCB11. A partir daí podemos

sugerir que a maior expressão da CYP7A1, promovida pelo urucum, estaria levando a

uma maior conversão do colesterol á ácidos biliares, e que assim como os resultados

obtidos por Xu et al., (2004) a expansão do pool de ácidos biliares estaria

proporcionando uma maior ativação do FXR e consequentemente uma maior

transcrição de SHP e ABCB11, explicando assim, as elevações de suas expressões nos

grupos HU 0,1% e HU 0,2%.

Apesar de SHP, ter sua expressão aumentada e ser um fator inibidor da

expressão da CYP7A1, os animais dos grupos HU 0,1% e HU 0,2%, apresentaram

mesmo assim, elevações na expressão da CYP7A1. A explicação para este fato é que, a

nível molecular, embora a CYP7A1 seja up-regated por LRX e down-regulated por

FXR, o mecanismo estimulatório de LXR predomina sobre o mecanismo inibitório de

FXR, quando ratos são expostos a uma dieta rica em colesterol (Wójcicka et al., 2007).

Kerr et al., (2002) ralataram que a expressão de CYP7A1 em camundongos

knockout para SHP foi apenas 1,3 vezes mais abundante que em camundongos

selvagens.

Gupta et al., (2002) observaram que ratos alimentados com colesterol 2%

exibiram aumentos nas expressões de SHP e CYP7A1 e que a expressão de FXR não

foi alterada. Ao suplementar a dieta de colesterol com ácido cólico a 1%, os autores

observaram uma marcante elevação do SHP e uma concomitante redução da CYP7A1.

Entretanto, foi observado também, que mesmo com a presença do ácido cólico na dieta,

o nível do RNAm da CYP7A1 ainda foi 300% maior do que o obtido nos animais

controle.

Os autores concluíram então, que sob condições onde, tanto o SHP (via

estimulação de FXR), quanto o LXR são ativados, o efeito estimulatório de LXR

substitui o efeito inibitório de FXR, o que resulta na indução da expressão de CYP7A1

em ratos. Além disso, os autores sugeriram que os ácidos biliares não são reguladores

transcricionais de FXR e que eles apenas ativam este receptor através de uma maneira

ligante dependente.

Os nossos resultados indicam que mesmo não havendo aumento na transcrição

de LXR e FXR, estes receptores nucleares foram ativados, o que pôde ser verificado


70

pela maior transcrição da CYP7A1 e de SHP e ABCB11 respectivamente. Além disso,

foi observado que mesmo com a ativação simultânea de LXR e FXR, a expressão da

CYP7A1 foi estimulada, o que corrobora com os resultados descritos anteriormente, que

demonstram a predominância do efeito estimulatório de LXR sobre o efeito inibitório

de FXR na indução da expressão da CYP7A1.

Em resumo, nossos resultados demonstraram que a suplementação com urucum

não afetou a expressão dos genes hepáticos envolvidos na síntese e captação do

colesterol, mas aumentou significativamente a expressão da CYP7A1, a principal

enzima envolvida no catabolismo do colesterol. Diante destes resultados, podemos

concluir que o efeito hipocolesterolemiante do urucum envolve a up-regulation da

CYP7A1 que aumenta a conversão do colesterol á ácidos biliares, os quais foram os

responsáveis pela elevação da expressão de SHP e ABCB11 via ativação do FXR.

A Figura 15 demonstra uma possível hipótese dos mecanismos associados ao

efeito hipocolesterolemiante do urucum em ratos com hipercolesterolemia induzida por

dieta.

Figura 15 – Proposta do efeito hipocolesterolêmico do urucum. Animais tratados com urucum

apresentaram menor concentração sérica de colesterol total, e maior expressão hepática dos genes

CYP7A1, SHP e ABCB11. O mecanismo sugerido é que talvez o urucum possa ter agido como um

ativador de LXR e este receptor, uma vez ativado estimulou a transcrição da CYP7A1. A elevação da

CYP7A1 levou a uma maior conversão de colesterol á ácidos biliares, o que resultou em: 1) redução da

concentração do colesterol total sérico e 2) aumento dos ácidos biliares. Com o maior pool de ácidos

biliares, o FXR tornou-se ativado e promoveu uma maior transcrição de SHP e ABCB11.

SILVA, L.S. Capítulo 7 - Conclusões

72

CAPÍTULO 7 – CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos e sob as condições experimentais

empregadas no presente estudo, podemos concluir que a suplementação tanto do beta

caroteno quanto do urucum á dieta hipercolesterolemiante contribuiu para a melhora no

perfil lipídico.

Os animais que receberam dieta hipercolesterolemiante e beta caroteno

apresentaram:

- redução do colesterol total sérico, colesterol não HDL, triglicérides e índice

aterogênico;

- redução da gordura e colesterol total hepático;

- aumento na excreção de gordura e de colesterol nas fezes.

Os animais que receberam dieta hipercolesterolemiante e urucum apresentaram:

- redução do colesterol total sérico, colesterol não HDL e índice aterogênico;

- aumento na expressão da CYP7A1;

- aumento na expressão de SHP e ABCB11

A partir desses resultados podemos observar que o beta caroteno e o urucum

apresentaram efeitos hipocolesterolemiantes. Entretanto, seus mecanismos de atuação

foram diferentes:

O mecanismo associado ao efeito hipocolesterolêmico do beta caroteno não

envolve alterações na expressão de genes hepáticos do metabolismo do

colesterol e pode estar relacionado á menor absorção intestinal de colesterol, que

foi evidenciada pelas maiores concentrações de colesterol nas fezes ou á

alterações do metabolismo do colesterol nas células intestinais.

O mecanismo associado ao efeito hipocolesterolêmico do urucum está

relacionado à conversão do colesterol á ácidos biliares, através da up regulation

da CYP7A1, que por sua vez foi responsável pelo desencadeamento uma série

de eventos que culminaram em maiores expressões de SHP e ABCB11.

SILVA, L.S. Referências Bibliográficas

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Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol

secretion. J Biol Chem. 280: 8742-8747.


90

Yu, L.; York, J.; von Bergmann, K.; Lutjohann, D.; Cohen, J. C.; Hobbs, H. H. (2003).

Stimulation of cholesterol excretion by the liver X receptor agonist requires ATP-

binding cassette transporters G5 and G8. J Biol Chem. 278(18): 15565-15570.

Yuan, Y V.; Kitts, D. D. (2002). Dietary source and cholesterol interactions alter plasma

lipids and tissue susceptibility to oxidation in spontaneously hypertensive (SHR) and

normotensive Wistar Kyoto (WKY) rats. Mol Cell Biochem. 232: 33-47.

Yuan, Y. V.; Kitts, D. D.; Godin, D. V. (1998.) Variations in dietary fat and cholesterol

intakes modify antioxidant status of SHR and WKY rats. J Nutr 128: 1620-1630.

Zhang, L. X.; Cooney, R. V.; Bertram, J. S. (1991). Carotenoids enhance gap junctional

communication and inhibit lipid peroxidation in C3H/10T1/2 cells: relationship to their

cancer chemopreventive action. Carcinogenesis. 12: 2109-2114.

Zhang, P.; Omaye, S. T. (2000). Beta-carotene and protein oxidation: effects of ascorbic

acid and alpha- tocopherol. Toxicology. 146(1): 37-47.

Zhang, Y.; Breevoort, S. R.; Angdisen, J.; Fu, M.;. Schmidt, D. R; Holmstrom, S. R.;

Kliewer, S. A. Mangelsdorf, D. J.; Schulman, I. G. (2012). Liver LXRα expression is

crucial for whole body cholesterol homeostasis and reverse cholesterol transport in

mice. J Clin Invest. 122(5): 1688-1699.

SILVA, L.S. Anexos

92

ANEXO I – Certificado de Análise – Beta Caroteno 10%

SILVA, L.S. Anexos

93

ANEXO II – Fluxograma de Produção – Produto PA3 Colorífico

SILVA, L.S. Anexos

94

ANEXO III – Protocolo das Dosagens Bioquímicas

Colesterol HDL

Princípio

As lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL) e as lipoproteínas de baixa

densidade (LDL) são quantitativamente precipitadas e, após centrifugação, o colesterol

ligado às lipoproteínas de alta densidade (Colesterol HDL) é determinado no

sobrenadante.

Amostra

O jejum não é imprescindível para a dosagem de colesterol HDL. Usar soro. O analito é

estável por 3 dias entre 2 – 8ºC.

Produto Utilizado

Colesterol HDL, Catálogo 13 - ANVISA – 10009010026

Labtest Diagnóstica: Av. Paulo Ferreira da Costa, 600. Lagoa Santa, MG, 33400-000

Precipitante: Armazenar entre 2 – 8°C. Contém ácido fosfotúngstico 1,5 mmol/L e

cloreto de magnésio 54 mmol/L.

Padrão - 20 mg/dL: Armazenar entre 2 – 8°C. Armazenar bem vedado para evitar

evaporação.

Equipamentos

1. Centrífuga para tubos.

2. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 500 nm ou filtro verde

(490 a 510 nm).

3. Banho-maria mantido à temperatura constante (37 ºC).

4. Pipetas para medir amostras e reagentes.

5. Cronômetro.

Procedimento

Precipitação das VLDL e LDL

Em um tubo 12 x 75 colocar 0,25mL de soro e 0,25mL de precipitante. Agitar

vigorosamente durante 30 segundos. A agitação sugerida é fundamental para obtenção

de resultados consistentes. Centrifugar a 3.500 rpm por pelo menos 15 minutos para

obter um sobrenadante límpido. Pipetar o sobrenadante límpido imediatamente após a

centrifugação, tomando o cuidado para não ressuspender o precipitado, a fim de evitar

resultados falsamente elevados.

Utilizar com o Reagente 1 - Colesterol Liquiform Labtest Cat. 76. Tomar 3 tubos de

ensaio e proceder como a seguir:

SILVA, L.S. Anexos

95

Branco Teste Padrão

Sobrenadante ----- 0,1 mL -----

Padrão (nº 2) ----- ----- 0,1 mL

Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Misturar e colocar no banho-maria a 37 ºC durante 10 minutos. O nível da água no

banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de ensaio. Determinar as

absorbâncias do teste e padrão em 500 nm ou filtro verde (490 a 540 nm) acertando o

zero com o branco. A cor é estável por 60 minutos.

Cálculos

HDL mg/dL =

Conversão de mg/dL para Unidade SI: mmol/L = mg/dL x 0,026

Colesterol Total

Princípio

O colesterol total é determinado de acordo com as seguintes reações:

Ésteres de colesterol Colesterol + Ácidos graxos

Colesterol + O2 Colest-4-en-ona + H2O2

2H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina Antipirilquinonimina + 4H2O

A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à concentração de

colesterol na amostra.

Amostra

O jejum não é imprescindível para a dosagem de colesterol total. Usar soro.

Anticoagulantes como citrato, oxalato ou EDTA produzem resultados falsamente

diminuídos. O analito é estável por 7 dias entre 2 – 8 ºC e vários meses a 10 ºC

negativos.

Produto Utilizado

Colesterol Liquiform, Catálogo 76-2/100 - ANVISA - 10009010068


Reagente 1: Armazenar entre 2 – 8°C. Contém tampão 50 mmol, pH 7,0, fenol 24,0

mmol/L, colato de sódio 500 µmol/L, azida sódica 15 mmol/L, 4 aminoantipirina 500

µmol/L, colesterol esterase ≥250 U/L, colesterol oxidase ≥250 U/L e peroxidase ≥1000

U/L.

SILVA, L.S. Anexos

96

Padrão 200 mg/dL: Armazenar entre 2 – 8°C. Após o manuseio armazenar bem vedado

para evitar evaporação. Contém azida sódica 15 mmol/L.

Equipamentos


(490 a 510 nm).

2. Banho-maria mantido à temperatura constante (37 ºC).


4. Cronômetro.

Procedimento

Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:


Amostra ----- 0,01 mL -----

Padrão (nº 2) ----- ----- 0,01 mL

Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Misturar e colocar em banho-maria 37 ºC 10 minutos. O nível de água no banho deve

ser superior ao nível de reagentes nos tubos de ensaio. Determinar as absorbâncias do

teste e padrão em 500 nm ou filtro verde (490 a 510 nm), acertando o zero com o

branco. A cor é estável por 60 minutos.

Cálculos

Colesterol mg/dL=


Triglicérides

Princípio

Os triglicérides são determinados de acordo com as seguintes reações:

Triglicérides Glicerol + Ácidos Graxos

Glicerol + ATP Glicerol-3-Fosfato + ADP

Glicerol-3-Fosfato + O2 Dihidroxiacetona + H2O2

2 H2O2 + 4 Aminoantipirina + 4-Clorofenol Quinoneimina + 4 H2O

SILVA, L.S. Anexos

97

A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à concentração de

triglicérides na amostra.

Amostra

Jejum de 12 a 14 horas. Usar soro ou plasma com EDTA. O analito é estável por dois

dias entre 2 – 8°C. Armazenamento prolongado da amostra não é recomendado, porque

várias substâncias podem ser hidrolizadas liberando glicerol, levando à obtenção de

resultados falsamente elevados. A heparina promove a ativação in vivo ou in vitro da

lipase da lipoproteína, fazendo com que a concentração dos triglicérides se reduza

gradativamente em amostras contendo heparina.

Produto Utilizado

Triglicérides Liquiform, Catálogo 87 - ANVISA - 10009010070


Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contem tampão 50 mmol/L, pH 6,9; acetato de

magnésio 4 mmol/L; 4-clorofenol 5 mmol/L; 4-aminoantipirina 300 mol/L ATP 1,0

mmol/L; lipase da lipoproteína 1400 U/L; glicerolquinase 1000 U/L e azida sódica 7

mmol/L.

Padrão - 200 mg/dL - Armazenar entre 2 - 30 ºC. Contém triglicérides 200 mg/dL e

azida sódica 7 mmol/L.Após o manuseio sugere-se armazenar bem vedado, para evitar

evaporação.

Equipamentos


(490 a 520nm).

2. Banho-maria mantido à temperatura constante (37°C).


4. Cronômetro.

Procedimento

Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:


Amostra ----- 0,01 mL -----

Padrão (nº 2) ----- ----- 0,01 mL

Reagente 1 (nº 1) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Misturar e colocar no banho-maria 37 ºC por 10 minutos. O nível da água no banho

deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de ensaio. Determinar as absorbâncias

do teste e padrão em 505 nm ou filtro verde (490 a 520 nm) acertando o zero com o

branco. A cor é estável por 60 minutos.

Cálculos

Triglicérides (mg/dL) =


Efeitos do beta caroteno e do urucum sobre a expressão de ...

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