EFEITOS DO DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) SOBRE OS PREJUÍZOS …

UNIVERSIDADE POSITIVO

VALTER MALAGUIDO CLÍMACO

EFEITOS DO DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) SOBRE OS PREJUÍZOS DE MEMÓRIA INDUZIDOS PELA ESTREPTOZOTOCINA EM RATOS WISTAR

CURITIBA

2019

VALTER MALAGUIDO CLÍMACO

EFEITOS DO DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) SOBRE OS PREJUÍZOS DE MEMÓRIA INDUZIDOS PELA ESTREPTOZOTOCINA EM RATOS WISTAR

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Profissional em Biotecnologia Industrial da Universidade Positivo como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia Industrial. Orientador: Prof. Dr. Ilton Santos da Silva Co-orientadora: Prof. Dra.Marcia Regina Pincerati

CURITIBA

2019

Ficha Catalográfica

Climaco, Valter Malaguido. Efeitos do dimetilsulfóxido (DMSO) sobre os prejuízos de

memória induzidos pela estreptozotocina em ratos wistar / Valter Malaguido Climaco. – –Curitiba, 2019.

XVI, 107f. :14 il. ; 29 cm. Dissertação ( Mestrado ) – Universidade Positivo, Campus

Curitiba, Curitiba-PR, 2019. Orientador: Prof. Dr. Ilton Santos da Silva.

Co-orientadora : Prof. Dra. Marcia Regina Pincerati

1. Efeitos do dimetilsulfóxido (DMSO) sobre os prejuízos de memória induzidos pela estreptozotocina em ratos wistar

Comissão Julgadora:

________________________ Prof. Dr. Marcelo de Paula Loureiro

________________________ Prof. Dr. Luiz Fernando Pereira

________________________ Profa. Dra. Eliane Carvalho de

Vasconcelos

________________________ Profa. Dra. Márcia Regina Pincerati

Co-orientadora

________________________ Prof.Dr. Ilton Santos da Silva

Orientador

À minha família:

Valter e Palmira;

Ariadne, Samuel e Davi.

AGRADECIMENTOS

Eu agradeço a Deus de todo o coração... Que grandiosas são as obras do

Senhor... O Temor do Senhor é o começo da Sabedoria (Sl 110 - 111). Celebrar a

vida, a diversidade, os desafios e sua superação. Assim consolidamos projetos,

enriquecemos nosso verdadeiro capital, o intelectual. A Ciência e a Sabedoria são

dons do Espírito de Deus, e devemos, para sua contemplação, focar em um plano

além do mundo atual através de outro dom: o Temor de Deus. Superamos

transformações desde a vida uterina, partilhamos o tempo vivido na Terra como um

Gerador que nos alimenta e esperamos sempre por novas transformações. Estamos

sempre, e necessitamos de mudanças.

Como disse Albert Einstein: “O mais belo que podemos vivenciar, é o

mistério. Ele é fonte de verdadeira arte e ciência”. Graças a pessoas que se

esvaziam no compartilhamento de conhecimentos, expandem-se, de forma

incomensurável, Graças e Dons que se tornam plenos no conhecimento que liberta

o Homem. A Universidade compõe, etimologicamente, o Universo em um só lugar e

o; “Saber, Ética, Trabalho e Progresso” consolidam-se através de Equipes de

trabalho fantásticas e fascinantes, personificadas em grupos que tivemos contato ao

longo desse tempo. O carinho, atenção, disponibilidade dessas pessoas não

contempla uma moeda de pagamento, e, indiscutivelmente, profissionais que se

desprendem de suas vidas privadas por um bem maior coletivo, como nominamos o

Prof Dr Ilton Santos da Silva, Profa Dra Marcia Regina Pincerati são exemplos de

honra, amizade e agradecimentos incontáveis. A disciplina e a opção pelo correto,

traduzidos na Profa Dra Leila Maranho, toda equipe docente e de apoio, nos mostra

o caminho de precisão e valor.

Somos todos muito preciosos, e temos a gratidão e o presente de poder

trabalhar com o maior produto da criação... o ser humano, auxiliando e buscando

recursos para capacitações. Em suas enfermidades, vemos muito comprometidos os

prejuízos de habilidades em um período da vida em que se poderia dividir

conhecimentos e experiências, e, a opção pela neurdegeneração e seu potencial

terapêutico, vem da simplicidade do compartilhamento molecular. Somos gratos pelo

conhecimento.

Agradecemos a nossas famílias, co-criadoras, enraizadas fortemente na

árvore da vida, cuidadoras de bens preciosos, e produzindo com carinho, respeito e

amor, frutos abençoados. Inicialmente a nossos pais, Valter e Palmira, exemplos de

força, sabedoria, condução e doação. À nossa esposa Ariadne, sua paciência,

cumplicidade, maternidade santificadora, revestida na vida de nossos filhos, Samuel

e Davi, fontes inspiradoras do poder do amor alimentador da vida. A nossos amigos,

Luis Fernando Silva, Jhonatan Domingues Basso, as acadêmicas Rebecca Marty

Pimentel e Athyna França Silva, pela alegria de compartilhar o crescimento e força

de trabalho. Incontáveis agradecimentos. Somos gratos pela vida e os presentes

dela constituídos, e... aprendendo a aprender.

“Eu Te louvo Pai Celeste, Rei do Céu e da Terra, porque quisestes revelar coisas

grandes aos pequeninos e escondestes dos sábios e entendidos. Sim Senhor, pois

assim foi do Teu agrado”. Mt – 11; 25

“O primeiro passo para a cura, é ir ao encontro da enfermidade.” Provérbio latino

RESUMO

As doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, comprometem

diversos aspectos comportamentais, metabólicos e celulares sem tratamento

curativo. O Dimetilsulfóxido (DMSO) possui uma ampla versatilidade molecular, com

diversas ações bioquímicas e terapêuticas como base molecular ainda não

explorada. O objetivo do presente trabalho é investigar o potencial efeito

neuroprotetor do Dimetilsulfóxido (DMSO) sobre os prejuízos de memória espacial

induzidos pela estreptozotocina (STZ) em ratos. Foram utilizados 42 ratos wistar

machos divididos em 4 grupos distintos, sendo grupo controle (veículo tampão

citrato via intracereboventricular, (icv) e salina 0,9% intraperitoneal (ip) (n=11), grupo

STZ 3mg/kg via icv e salina ip (n=10), grupo STZ icv+ DMSO 0,75 g/kg a 40%

diluído em solução salina 0,9%ip (n=11) e grupo STZ icv+ DMSO 1,5 g/kg a 40%

diluído em solução salina 0,9%ip (n=10). Foram 5 dias de tratamentos com início 24

hs após a administração icv de STZ e/ou veículos. Também vinte e quatro horas

após o último tratamento, os animais foram submetidos aos testes de memória

espacial no labirinto aquático de Morris, onde foram avaliadas memória de referência

e memória operacional, ambas espaciais. Ao fim dos testes, os animais foram

eutanasiados e os encéfalos dissecados bilateralmente para retirada do hipocampo.

Análises moleculares por meio de qPCR foram realizadas para investigar o perfil de

expressão de genes relacionados à inflamação, interleucina 1-beta (IL-1β), fator de

necrose tumoral α (TNFα), espécies reativas de estresse oxidativo mitocondrial

(catalase; CAT), e ativador da neurogênese adulta (fator neurotrófico derivado do

cérebro; BDNF). Os resultados comportamentais de memória de referência e

operacional, não mostraram melhora significativa de estratégias e aprendizagem

espacial dos grupos tratados com DMSO, o que pode ter relação com o tempo curto

de tratamento e, em virtude de lesão direta em hipocampo pela STZ. As análises

moleculares de expressão dos genes envolvidos na neuroinflamação (IL -1β, TNF-

α), e estresse oxidativo mitocondrial (CAT) não mostraram diferenças estatísticas

entre os grupos experimentais. No entanto, nota-se tendências de queda na

expressão de IL1-β, TNFα, CAT, e elevação de BDNF em grupo tratado com DMSO

à 1,5 g/ kg, sugerem o ambiente celular mais favorável em nível molecular contra a

neurodegeneração e facilitação da neuroproteção via BDNF em vias de

sobrevivência celular, plasticidade sináptica e brotamento axonal.

Palavras-chave: Dimetilsulfóxido. Estreptozotocina. Memória. Neurodegeneração.

Doença de Alzheimer. Labirinto aquatico de Morris.

ABSTRACT

Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease, irreversibly impair cell

dynamics without curative treatment. Dimethylsulfoxide (DMSO) has a wide molecular

versatility, with several neurochemical and therapeutic actions not exploited. The aim

of the present paper is to investigate the potential neuroprotective effect of Dimethyl

sulfoxide (DMSO) on Streptozotocin (STZ) induced spatial memory impairment in rats.

We used fourty-two male wistar rats divided into four groups: Control Group (icv)

vehicle and intraperitoneal saline (ip) (n = 11); STZ 3mg/kg group, via icv and ip saline

= 10); SZT group, icv + DMSO 0.75 g/kg to 40% diluted in saline solution 0.9% ip (n =

11); and STZ group, icv + DMSO 1.5 g / kg to 40% diluted in saline 0 , 9% ip (n = 10).

It took five days of treatment starting 24 hours after vehicle or STZ administration. Also

twenty-four hours after the last treatment, the animals were submitted to spatial

memory tests in the Morris water maze, in which spatial memory and reference

memory were evaluated. At the end of the tests, the animals were euthanized and the

brains dissected bilaterally for the hippocampus removal. Molecular analyzes were

performed by means of qPCR to investigate the expression profile of genes related to

inflammation (interleukin 1-beta, IL-1β, tumor necrosis factor α, TNF-α), reactive

species of mitochondrial oxidative stress (catalase; CAT) and activator of adult

neurogenesis (brain-derived neurotrophic factor; BDNF). Behavioral results of

reference and working memory, there was no significant improvement of spatial

learning strategies in the treatment groups with DMSO, which included the acute injury

time induced directly on the hippocampal target and a short treatment of 5 days

following literature models. Molecular analyzes of expression of genes involved in

neuroinflammation (IL-1β, TNF-α) and oxidative stress (CAT) did not show statistical

differences between the experimental groups, however reduction trends in IL1-β,

TNFα, CAT expression and BDNF elevation in the DMSO treated group, at a dose of

1,5 g/kg suggest the most favorable cellular environment at the molecular level against

neurodegeneration and the facilitation of neuroprotection throught BDNF in the

pathways of cellular survival, synaptic plasticity and axonal budding.

Key words: Dimethylsulfoxide. Streptozotocin. Memory. Neurodegeneration.

Alzheimer’s disease. Morris water Maze

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Representação esquemática do labirinto aquático de Morris. .................. 43

Figura 2 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, em função

da sessão (valor médio das duas tentativas), respectivas ao experimento de

memória de referência (latência, trajeto e velocidade). ............................................. 48


da sessão (valor médio das duas tentativas), respectivas ao experimento de

memória de referência (entrada e tempo no quadrante de plataforma, entrada e

tempo no contador da plataforma, entrada e tempo no anel externo). ...................... 49

Figura 4 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo e fase e

tentativa, respectivas ao Probe Test. ......................................................................... 53


da tentativa (valor médio das 5 sessões) e fase, respectivas ao experimento de

Memória Operacional. ................................................................................................ 57


da tentativa (valor médio das 5 sessões) e fase, respectivas ao experimento de

Memória Operacional. ................................................................................................ 58

Figura 7 – Boxplots da variável de interesse IL1β, por grupo. .................................. 64

Figura 8 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da variável de interesse IL1-β,

por grupo. ................................................................................................................... 64

Figura 9 – Boxplots da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular

TNF ............................................................................................................................ 67

Figura 10 – Gráfico de barras da média ( e erro padrão ) da quantificação relativa,

por grupo, para a análise molecular TNF ................................................................... 67


CAT ............................................................................................................................ 70


por grupo, para a análise molecular CAT ................................................................... 70


BDNF .......................................................................................................................... 73


por grupo, para a análise molecular BDNF ................................................................ 73

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Eventos históricos de aplicações biológicas e farmacológicas do

DMSO ......................................................................................................................... 26

Tabela 2 – Resultados da ANOVA para as quatro variáveis de interesse em

memória de referência ............................................................................................... 50

Tabela 3 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre

os grupos (memória de referência) ............................................................................ 52

Tabela 4 – Medidas descritivas das variáveis de interesse, por grupo, respectivas

ao experimento Probe Test ....................................................................................... 54

Tabela 5 – Resultados da ANOVA – F (valor p) - para as variáveis de interesse,

respectivas ao experimento Probe Test ..................................................................... 55


os grupos, respectivas ao experimento Probe Test ................................................... 56

Tabela 7 – Medidas descritivas das variáveis de interesse, por grupo, respectivas ao

experimento de Memória Operacional ....................................................................... 59

Tabela 8 – Resultados da ANOVA – F (valor p) - para as variáveis de interesse,

respectivas ao experimento de Memória Operacional ............................................... 61


os grupos, respectivas ao experimento de Memória Operacional ............................. 62

Tabela 10 – Medidas descritivas da variável de interesse IL1-β ............................... 63

Tabela 11 – Resultados da ANOVA para a variável de interesse IL1-β .................... 65


os grupos IL1-β .......................................................................................................... 65

Tabela 13 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise

molecular TNFα .......................................................................................................... 66

Tabela 14 – Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise

molecular TNFα .......................................................................................................... 68

Tabela 15 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre

os grupos para análise molecular TNFα .................................................................... 68


molecular CAT ............................................................................................................ 69


molecular CAT ............................................................................................................ 71


os grupos para análise molecular CAT ...................................................................... 71


molecular de BDNF .................................................................................................... 72


molecular BDNF ......................................................................................................... 74


os grupos para análise molecular BDNF .................................................................... 74

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Aβ Proteína Amilóide Beta (Aβ-42)

AGE Produtos de Glicação Avançada

ANOVA Análise de Variância e Medidas Repetidas

APOE Apolipoproteina E

APP Proteína Precursora Amiloide

BACE Beta secretase-1

BDNF Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro

BHE Barreira Hematoencefálica

CA1 Camada Hipocampal CA1

CA3 Camada Hipocampal CA3

CAT Catalase

C-MYC Gene de Mielocitomatose

CREB Elementos de ligação ao AMP ciclico

CYS Cisteina

DA Doença de Alzheimer

DMSO Dimetilsulfóxido

GLU Glutamina

GLUT Receptor de Transporte de Glicose (1/2/3)

GSH-PX Glutationa Peroxidase

GSK-3β Glicogênio Sintase Kinase 3β

ICV Intracerebroventricular

IGE Genes de resposta imediata

IL-1β Interleucina 1-Beta

LTP Potenciais de Longa Duração

LYS Lisina

MAPT Proteína Tau associada à microtúbulos

MET Metionina

MHC II Complexo maior de histocompatibilidade tipo II

miRNA Micro RNA

NADH - Adenina Dinucleotídeo Nicotinamida (reduzido)

NFKB Fator Nuclear Kappa Beta

NMDA N Metil D-Aspartato

NRF2 Fator Nuclear eritroide 2

OH Hidroxila

PAMPs Padrões moleculares de patógenos

PEPS Potencial Excitatório Pós Sináptico

PHE Fenilalanina

PSEN1 Presenilina-1

PSEN2 Presenilina-2

RNA Ácido ribonucleico

SOD Superóxido Dismutase

STZ Estreptozotocina

SVZ Zona Subventricular

TAU Proteína TAU

Thr 231 Treonina 231

TNF α Fator de Necrose Tumoral α

TYR Tirosina

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 16

2 CAPÍTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA ............................................................ 18

RESUMO ............................................................................................................... 18

Doença de Alzheimer ............................................................................................. 18 Sinalização metabólica .......................................................................................... 20

Dobramento proteico disfuncional ......................................................................... 21

Neuroinflamação .................................................................................................... 21

Sistema energético mitocondrial ............................................................................ 22

Sinalização neurotrófica ......................................................................................... 22

Neurobiologia dos sistemas de memória e Doença de Alzheimer ......................... 22

Bases moleculares e estruturais – o papel hipocampal ......................................... 23

Estreptozotocina como modelo indutor de neurodegeneração em roedores ......... 24

Potêncial efeito neuroprotetor do Dimetilsulfóxido (DMSO) ................................... 25

CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 28

REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 29

3 CAPÍTULO 2: ARTIGO EXPERIMENTAL ............................................................... 38

RESUMO ............................................................................................................... 38

INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 39

MATERIAL E MÉTODO ......................................................................................... 40

Animais - Acondicionamento ................................................................................. 40 Cirurgia estereotáxica para administração de STZ e tratamento com o DMSO 41

Labirinto aquático de Morris e Testes de Memória espacial ................................. 42

Procedimentos e testes ......................................................................................... 43

Testes de memória de referência .......................................................................... 44

Probetest – extinção da resposta adquirida .......................................................... 44

Testes de memória operacional ............................................................................ 45

Extração de RNA e análise de expressão de genes interleucina 1β (IL-1β), fator

de necrose tumoral α (TNF-α), catalase (CAT) e fator neurotrófico derivado

cerebral (BDNF) ..................................................................................................... 45

Análise de dados .................................................................................................... 46

Resultados ............................................................................................................. 47

Memória de referência .......................................................................................... 47

Análise descritiva da memória de referência ......................................................... 47

Comparações da memória de referência ............................................................... 50

Avaliação de extinção da memória adquirida (Probe Test) ................................... 53

Análise descritiva do Probe Test ............................................................................ 53

Comparações do Probe Test ................................................................................. 55

Memória operacional .............................................................................................. 57

Análise descritiva da memória operacional ............................................................ 57

Comparações da memória operacional ................................................................. 60

Avaliação de expressão gênica ............................................................................. 63

Analise descritiva da expressão da IL-1β ............................................................... 63

Comparações na expressão da IL-1β .................................................................... 65

Avaliação da expressão gênica do fator de necrose tumoral α ( TNFα) ................ 66

Análise descritiva do TNFα .................................................................................... 66

Comparações da expressão do TNFα ................................................................... 68

Avaliação da expressão gênica da Catalase ( CAT ) ............................................. 69

Análise descritiva da expressão da Catalase ( CAT ) ............................................ 69

Comparações da expressão da Catalase ( CAT ) ................................................. 71

Avaliação da expressão do Fator neurotrófico derivado cerebral (BDNF) ............. 72

Análise descritiva do BDNF ................................................................................... 72

Comparações da expressão do BDNF .................................................................. 74

Discussões ............................................................................................................. 75

Conclusões ............................................................................................................ 79

REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 81

Conclusões Gerais ................................................................................................. 86

REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 87

ARTIGO PARA SUBMISSÃO ................................................................................ 98

PREPARAÇÃO DE MANUSCRITOS ................................................................... 126

ANEXOS .............................................................................................................. 133

16

1 INTRODUÇÃO

A neurodegeneração afeta progressivamente populações celulares com

características clínicas e patológicas relacionados à perda tecidual [1] e atualmente

sem tratamentos neuroprotetores efetivos, como no caso da doença de Alzheimer

[2]. Diversas alterações compõem o quadro fisipatológico e molecular da doença

como no metabolismo neuronal da glicose [3], o processamento do RNA [4],

dobramento anormal de proteínas celulares [5,6], e os prejuízos sinápticos e

lisossomais [7]. Os fenômenos que ocorrem com maior destaque são a ativação pró-

inflamatória com permeabilização de barreira hemato-encefálica, que contribui para

a manutenção do estresse energético mitocondrial e a produção de espécies

reativas de oxigênio, além do bloqueio neurotrófico e a renovação celular [8,9].

O dimetilsulfóxido (DMSO) possui diversas aplicações por sua versatilidade

molecular, oriunda de sua estrutura compacta, capacidade elevada de penetração e

transporte através da barreira hemato-encefálica [10]. Além disso, possui funções

imunomoduladoras no bloqueio de citocinas pró-inflamatórias [11] e renovação

mitocondrial na captura de radicais livres [12]. Facilita o processo autofágico no

dobramento proteico conformacional [13]. Pela associação com a molécula de água,

forma um complexo de compartilhamento água-DMSO, onde modifica pontes de

hidrogênio das proteínas amiloidogênicas [14,15] que têm papel importante na

etiologia da doença de Alzheimer.

Dentre os modelos neurodegenerativos experimentais, a estreptozotocina

(STZ) administrada intracerebroventricular (ICV) mimetiza características clínicas

agudas comportamentais, relacionados com a memória espacial e aprendizagem da

formação hipocampal [16]. A STZ é tóxica para receptores de insulina via sinalização

da enzima glicogênio-sintase-kinase 3β (GSK 3β) [17], regulando tráfego da proteína

precursora amilóide (APP) e fosforilação de proteína TAU, além de modular

negativamente vias de sobrevivência celular [18,19,20,21] e formação e fusão de

vesículas sinápticas [22].

O presente trabalho está dividido em 2 capítulos, ambos redigidos de acordo

com as normas da revista Journal of Alzheimer’s Disease. O primeiro capítulo traz

uma revisão sobre os eventos patológicos associados à neurodegeneção na doença

de Alzheimer. O capítulo 2 trata do artigo experimental descrevendo os

experimentos envolvendo o tratamento com DMSO em ratos expostos aos prejuízos

17

de memória induzidos pela administração intracerebroventricular de estreptozotocina

(STZ).

18

CAPíTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA

Neurodegeneração induzida pela estreptozotocina (STZ) em modelo animal e

viabilidade terapêutica neuroprotetora com o Dimetilsulfóxido (DMSO). Valter Malaguido Climaco; Marcia Regina Pincerati; Ilton Santos da Silva

Universidade Positivo: Rua Professor Pedro Viriato Parigot de Souza, 5300 – Campo Comprido,

Curitiba - Paraná, Brasil CEP 81280-330 Telefone +55 (41) 33173000 Email: [email protected]

RESUMO

A neurodegeneração induzida pela estreptozotocina via

intracérebroventricular (STZ-icv) em roedores possui similaridades com a doença de

Alzheimer do tipo esporádica. Entre as similaridades, é possível observar prejuízos

metabólicos no transporte de glicose neuronal, e a ativação de cascatas de

proteínas amiloidogênicas neurotóxicas. Adicionalmente, a STZ promove a

neuroinflamação com a permeabilização da barreira hemato-encefálica, ativação

microglial e astrocitária, e estresse oxidativo mitocondrial. O substrato anatômico e

funcional da lesão induzida corresponde à formação hipocampal, estrutura

fundamental no processo cognitivo de aprendizagem e memória. A ação do DMSO

em etapas metabólicas e inflamatórias, na captura de espécies reativas de oxigênio,

e associação molecular com a água, modifica pontes de hidrogênio no dobramento

conformacional neurotóxico amilóide, e facilita o processo autofágico como

chaperona química. Desta forma, o presente artigo discute a utilização do DMSO

como elemento neuroprotetor, por suas características versáteis e modulatórias na

degeneração induzida.

Palavras chave: Estreptozotocina. Dimetilsulfóxido. Doença de Alzheimer

Doença de Alzheimer

O envelhecimento populacional é o maior fator de risco para o

desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.

Dados da Word Alzheimer Report projetam 46 milhões de afetados

mundialmente e comprometem 6% das pessoas com 65 anos ou mais, chegando a

19

25% das pessoas acima de 80 anos, sendo 480.000 mortes por ano e gastos anuais

da ordem de U$$ 1 trilhão [23]. No Brasil, é estimada a população de 25 milhões de

idosos em 2025 (IBGE-2015).

Desde sua descrição inicial em 1907 por Alois Alzheimer, a principal

característica clínica da doença é o comprometimento da memória explícita,

dependente de estruturas do lobo temporal medial, além dos córtices póstero-

mediais e cíngulo. Os prejuízos cognitivos se estendem no campo semântico,

executivo, associativo e comportamental [24,25].

O substrato neuropatológico molecular corresponde à deposição de proteína

β-amilóide extracelular e hiperfosforilação da proteína Tau neurofibrilar [26]. A

maioria dos casos, cerca de 75%, são do tipo Alzheimer esporádico. O polimorfismo

no gene APP, codificador da proteína precursora amilóide resulta na formação da

proteína β-amilóide neurotóxica de 42 aminoácidos. Além disso, outros genes

possuem papel importante no desencadeamento da doença: gene apo E

(apolipoproteína E) (alelo apoE4); genes PSEN (presenilina) 1 e 2, formando

proteína precursora amiloide (APP) via β e γ secretases; e o gene MAPT,

relacionado à hiperfosforilação da proteína Tau [27].

No envelhecimento e na neurodegeneração da doença de Alzheimer, os

tecidos (líquor, sangue, substância cinzenta e branca) são desiguais em

concentrações de água [28].

Estudos de Dawe RJ e colaboradores de 2014 [28], demonstram relação

linear de prejuízo cognitivo na doença de Alzheimer e imagens ponderadas de

ressonância magnética nuclear em áreas hipocampais e temporais, relacionados ao

conteúdo de água livre tecidual e sua homeostase, prejudicada através de canais de

aquaporina (1 e 4) dos astrócitos por precipitação de proteínas em conformação β-

amilóide na neurodegeneração [29].

Recentemente, foi demonstrado um sistema de recolhimento do líquido

intersticial e liquórico sinalizado via receptores de aquaporina 4 nos espaços

perivasculares (sistema glia-linfa). Disfunções nesse sistema podem dar início ao

processo neurodegenerativo com acúmulo neurotóxico de solutos β-amilóide

segundo revisão de Verheggen ICM e colaboradores em 2018 [30].

Elos fisiopatológicos reverberantes incluem o comprometimento metabólico

neuronal no transporte de glicose e internalização insulínica [31,32,33], em ações

pró-inflamatórias de abertura da barreira hematoencefálica, na ativação mitocondrial,

20

com aumento da predução de espécies reativas de oxigênio, e no processamento de

RNA [34][35], projetando acúmulos tóxicos amilóides.

As mudanças no dobramento de proteínas celulares em relação à massa de

água superficial (capa de hidratação) [36], impedem a autofagia assim como a

formação espinhas dendríticas e plasticidade sináptica com insuficiente sinalização

neurotrófica via BDNF e circuitos neuroquímicos colinérgicos. [37,38].

Os tratamentos clínicos recomendados pelas agências reguladoras: nacional

e internacionais, contemplam drogas isoladas ou combinadas. Estas atuam no

sistema colinérgico por meio da inibição enzimática da colinesterase (e.g:

rivastigmina, donepezila, galantamina) ou pela inibição de receptores NMDA (e.g:

memantina) [39] com resultados clínicos limitados, mesmo com o desenvolvimento

de anticorpos monoclonais contra a proteína amilóide neurotóxica ou proteína Tau

hiperfosforilada que também se mostraram ineficazes [40,41].

Recentes revisões [42,43] utilizam moléculas com ligantes multifuncionais,

abrindo caminho para estratégias terapêuticas inovadoras.

Sinalização metabólica

Atualmente, diversos estudos têm mostrado a importância do metabolismo

da glicose no sistema nervoso como componente das alterações neuroquímicas

envolvidas na doença de Alzheimer. Existe a denominação do distúrbio metabólico

tipo “diabético” do neurônio em degeneração quanto à sinalização insulínica [44],

sendo a relação conhecida como Diabetes tipo III [45]. A resistência à ação da

insulina e sua não internalização celular via receptor, ativa a enzima GSK-3β,

comprometendo síntese de glicogênio e regulação glicêmica de transportadores

GLUT (1-2-3). Consequentemente, elevam-se níveis de produtos de glicação

avançada (AGE) não se expressando vias de sobrevivência neuronais (PI3K/AKT)

com hiperfosfolilação Tau e acúmulos de proteína amilóide Aβ-42 neurotóxicas [46].

Promovem-se alterações em nível transcricional e proteico em paralelo a processos

neuroinflamatórios [31]. O conjunto dessas alterações amplifica os processos

neuropatológicos e resultam em perdas cognitivas progressivas [47].

O comprometimento energético neuronal ativa a enzima beta-secretase-1

(BACE 1) e a proteína precursora amilóide (APP) [48], asism como vias gliais-

linfáticas perivasculares, o que facilita a rotura da barreira hematoencefálica por

21

hiperexpressão de aquaporina 4, como elo fisiopatológico adicional na

neurodegeneração específica [49].

Dobramento proteico disfuncional

O papel biológico de proteínas celulares depende da estrutura de

dobramento funcional com o auxílo de moléculas auxiliadoras – chaperonas [3].

Estados intermediários no processo promovem agregação e relativa insolubilidade

protéica [50]. Na doença de Alzheimer, a transição conformacional de α-hélice para

β-pregueada recruta depósitos amilóides progressivamente, com consequente

disfunção pró-inflamatória, do sistema de transporte celular e autofágico [36].

Perde-se estabilidade estrutural comprometendo dobramento e arranjo

intermolecular, onde se modificam relações de solubilidade com a água [51].

A dinâmica da massa de água envolvida na estrutura superficial proteica

principalmente nos resíduos de aminoácidos específicos (Met, Lys, Cys, Glu),

instabiliza pontes de hidrogênio, e indisponibiliza energia livre [52], sendo o acúmulo

progressivo neurotóxico, fator de perda tecidual e apoptose [53].

Neuroinflamação

Depósitos amilóides e o estado hiperfosforilado de proteína Tau são fatores

que desencadeiam a neuroinflamação na neurodegeneração da doença de

Alzheimer [54]. Disfunções combinadas de permeabilização da integridade da

barreira hematoencefálica, ativação microglial e astrocitária, promovem a secreção

de citocinas pró-inflamatórias do tipo IL- 1β, TNFα, IL-6, Infγ, metaloproteases de

membrana, e do fator transcricional nuclear NFK-β contribuindo no processo de

recrutamento de linfócitos sistêmicos via complexo de histocompatibilidade tipo II

(MHC II) assim como o processamento anormal de micro-RNAs (mir155; mir 204)

[55,56].

A ativação inflamatória evolui sobre os constituintes imunológicos com o

bloqueio de enzimas glicolíticas, comprometimento mitocondrial, sobre a sinalização

de vias de sobrevivência celular onde perde-se adensamento axonal em sinapses

químicas e imunológicas [56,57,58].

22

Sistema energético mitocondrial

As alterações neurotóxicas, metabólicas e inflamatórias convergem para a

permeabilização de membranas mitocondriais, associados ao influxo de cálcio

intracelular, com comprometimento da fosforilação oxidativa na cadeia respiratória e

superexpressão de espécies reativas do oxigênio e nitrogênio [59].

Esses elementos favorecem que o fluxo de elétrons do NADH ao oxigênio

molecular na produção de ATP, reduzam elementos antioxidantes e neuroprotetores

como glutationa peroxidase (GSH-PX), catalase (CAT), e superóxido dismutase

(SOD) [60] e consome-se a reserva energética celular com insuficiente transdução

de vias em plasticidade, polarização e imunomodulação.

Sinalização neurotrófica O Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é um importante membro

da família de neurotrofinas (fatores de crescimento) ativadas via receptores

específicos, tropomiosinaquinase (TrkB) e p75.

A redução da sinalização do BDNF compromete a memória espacial,

plasticidade e maturação sináptica hipocampal, neurogênese, e potenciação de

longo prazo (LTP) na formação de espinhas dendríticas [61], fatores essenciais para

a consolidação da memória explícita.

Os oligômeros amilóides agregados na doença de Alzheimer, modulam

negativamente receptores p75 e TrkB, onde reduz-se vias de sinalização PI3K-

GSK3β-AKT de sobrevivência neuronal, ruptura de microtúbulos com

hiperfosforilação da proteína Tau (Thr 231) e comprometem a expressão proteica

em plasticidade sináptica [62,63,64]

Neurobiologia dos sistemas de memória e Doença de Alzheimer

Memória e aprendizado são componentes essenciais da existência humana:

fornecem subsídio para atividades do cotidiano e dão significado dos eventos ao

longo da vida, formando a personalidade do indivíduo e compondo sua história [65].

A memória consiste em capacidades multimodais de aquisição,

armazenamento e evocação de informações, habilidades ou experiências [66]. Os

23

processos de formação e consolidação são dinâmicos e complexos, necessitando

estabilização e reconsolidação de conteúdos [67]. Distúrbios de memória podem

afetar todas essas capacidades cognitivas como ocorre na doença de Alzheimer

[68.69]

Bases moleculares e anatômicas – o papel hipocampal.

A formação hipocampal tem sido associada a uma ampla variedade de

funções, incluindo navegação, planejamento espacial, codificação e recuperação de

memória, processamento relacional e detecção de novidades. Essas funções são

diferentes em relação à modalidades comportamentais e sua representação

topográfica [70].

Scoville e Milner em 1957 [71], descreveram a função do hipocampo em

relação à memória no caso do paciente amnéstico (Henry Molaison – “HM”) após

remoção cirúrgica da porção do lobo temporal medial para o tratamento de epilepsia.

Desde então, o papel hipocampal foi considerado como conversor de memórias;

uma estrutura chave para a formação de novas memórias de longo prazo.

A memória pode ser dividida em categorias funcionais: memória “elétrica” e

sensorial, memória de curto prazo (memória operacional) e memória de longo prazo.

A memória de longo prazo, por sua vez, pode ser dividida em explícita (declarativa)

do tipo episódica (eventos), semântica (fatos) Esse tipo de memória envolve o

hipocampo e áreas corticais adjacentes. A memória do tipo implícita/não declarativa

(de referência) é necessária para habilidades perceptivas e motoras

desempenhadas sem o pensamento consciente [72] envolvendo o cerebelo e

gânglios basais.

O recrutamento sensorial de entrada envolve informações de construção

cognitiva, sistemas temporais com apoio atencional, alça fonológica e codificação de

dimensões espaciais [73]. O processamento de memória operacional compreende

um sistema multicomponente de aferências hipocampais, principalmente em região

CA1 - piramidal, núcleos talâmicos ventrais de linha média (romboides e reunens),

em sincronia de conectividade ao córtex pré-frontal medial e sensorial posterior [74].

Esse processamento permite a transferência de informações no processo cognitivo

de aprendizagem [75]. Como o hipocampo é uma das primeiras estruturas a sofrer

com os eventos neurodegenerativos, o processo de informações é intensamente

24

prejudicado na doença de Alzheimer. A memória de referência integra informações

recentes e remotas obtidas por experiências prévias, sem a necessidade cognitiva

de aprendizado na execução [76].

Distintas estruturas encefálicas participam da integração das memórias,

sendo o lobo temporal medial – (incluíndo hipocampo e córtex entorrinal) - córtex

pré-frontal e sensorial posterior, importantes na memória explicita/declarativa. Já os

gânglios basais e cerebelo são as estruturas participantes na memória implícita/não

declarativa [75,77]. Vias moleculares e bioquímicas RAS-MAPK-PKA ativam a

fixação de conteúdos [78] e, genes de resposta imediata (IGE) e proteínas CREB,

transformam potenciais excitatórios de curto para longo prazo (STM/LTM). Além

disso, a consolidação permanente de informações requer a expressão

glutamatérgica, remodelação e facilitação sináptica com síntese de neurotrofinas

(BDNF), e ativação dopaminérgica [79].

O papel hipocampal relaciona ainda interações inconscientes e conscientes

na consolidação da memória [80]. Compreende aferências de potenciais pós-

sinápticos excitatórios (PEPS) para células granulares do giro dentado em um

sistema de codificação associativa a neurônios do tipo multipolares do córtex

entorrinal denominada via perfurante. Projeta-se para células piramidais do Corno de

Amon (CA) (fibras musgosas -CA3 -CA1 - complexo subicular) na chamada Via

colateral de Shaffer, formando um sistema de seleção de contextos e conclusão de

padrões de informações/tarefas.

O hipocampo é importante na construção de memórias espaciais. Nessa

estrutura se forma o chamado mapa cognitivo proposto por O`keefe e Nadel (1978)

[81] inicialmente, e reforçadas por técnicas de ressonância funcional magnética [82].

No hipocampo, estão localizadas as chamadas “Placecells”, que são células

que disparam em padrões em padrões contínuos conforme o indivíduo explora o

ambiente, formando um mapa neural da sua localização [65,83,84].

Estreptozotocina (STZ) como modelo indutor de neurodegeneração em roedores

A estreptozotocina (STZ) é uma droga do grupo nitrosamida isolada pela

primeira vez em 1950 de bactérias do solo do gênero Streptomyces sp. Possui

propriedades quimioterápicas metilando bases nitrogenadas na síntese de DNA [85].

25

Atua ainda na permeabilidade mitocondrial e formação de espécies reativas do

oxigênio, [86] efeito diabetogênico se injetada por via sistêmica em roedores [87].

O mecanismo é tóxico por ação em células beta pancreáticas, anti-neoplásico em

tumores pancreáticos neuroendócrinos. O bloqueio de sinalização da insulina afeta

receptores no tráfego da proteína precursora amilóide (APP), regulando estado de

fosforilação da proteína Tau através da ação sobre enzima Glicogênio- sintase-

kinase-3β (GSK-3β) [88]. Normalmente a insulina internalizada via receptor, ativa

PI3K, AKT, MAPK, inibindo GSK3-β, e modulando receptores GLUT do tipo 1, 2 e 3

[89].

A adminstração da droga intracerebroventricular (icv) inicialmente utilizada

por Sigfield Hoyer em 1994, ocasiona efeitos patológicos da sinalização insulínica

cerebral, sendo considerada modelo equivalente à doença de Alzheimer do tipo

esporádica [17].

A injeção de 3 mg/kg em dose isolada da STZ-icv induz a formação da

proteína beta-amilóide e hiperfosforilação da proteína Tau em preparos histológicos

de córtex e hipocampo de roedores [90]. Os efeitos clínicos são imediatos e duram

por tempo indeterminado [87].

Demonstrando os efeitos da STZ, Chen [91] demonstra a expressão

aumentada de genes APP, redução de acetilcolinesterase hipocampal e receptores

de glicose em modelos transgênicos para Alzheimer sob a ação indutora da STZ –

icv [91].

Roedores que recebem STZ-icv desenvolvem alterações cognitivas de curto

e longo prazo sobre memória e comportamento. Há ainda maior vulnerabilidade de

perda celular celular hipocampal grave e aguda segundo Zappa e colaboradores

[92].

Kamat e colaboradores [93] propuseram a dessensibilização de receptores

insulínicos em roedores que receberam STZ-icv, colocando como eventual proposta

terapêutica, intervenções de ações metabólicas na doença degenerativa [93].

Potencial efeito neuroprotetor do Dimetilsulfóxido (DMSO)

O Dimetilsulfóxido (DMSO) é um produto ligno-celulósico sintetizado na

Alemanha em 1867, pelo químico russo Alexander Saytzeff, possuíndo propriedades

biológicas e terapêuticas diversas [94] conforme sumarizado na Tabela 1.

26

Tabela 1 - Eventos históricos de aplicações biológicas e farmacológicas

Penetração de membranas Brayton, 1986; Rose e Hodgson, 1993

Interação molecular versátil Sojkaetal, 1990

Compartilhamento de prótons Szmant HH, 1971

Anti – inflamatória/imunomodulação Brayton, 1986; Soyka, 1990

Analgesia Stone, 1993; Brayton, 1986

Hipertensão intracraniana Soyka, 1990; Rose e Hodgson, 1993

Diferenciação celular Ross DW, 1985

Vasodilatação Brayton, 1986; Stone, 1993

Antiagreganteplaquetário Deutch, 1966; Goroc e Kovacs, 1968

Remoção de radicais livres Ardenetal, 1989; Speirs, 1994

Amiloidose Senior, 2001; Grant; Forrester, 2008

Radioproteção/ Crioproteção Brayton, 1986

Chaperona química Caputo, 1989; Pruisner SB, 1996:

Chaudhuri, Paul, 2006

Cistite intersticial Biggers RD, 1986

Doenças reumatológicas Swanson BN, 1985

Metabolismo lipídico – processamento

anormal de LDL

Mackie JB, 1989

Ciclo celular – Inibe c –myc (genes

reguladores de fatores transcricionais)

Darling D, 1989

Apoptose Liu J et al, 2001

Inibidor de proteína priônicascrapie Shaked GM, (2003)

Anticolinesterásico central Kumar A, Darreh-Shori T, 2017

Modulador de funções do SNC em

ensaio de Alzheimer pré- clínico

LorènePenazzi et al, 2016

Proteção neuronal em modelo de

oclusão vascular

Bardulzky J et al, 2005

Proteção cardíaca e neuronal Jacob, S, de la Torre JC, 2009

Sendo uma molécula compacta relativamente polar, o DMSO possui

propriedades de interconversão e hibridização na transformação do composto em

equilíbrio com a água [95]. Constitui-se como receptor de prótons em ligações com

27

hidrogênio devido a elétrons disponíveis nos terminais S e O [96] interagindo na

capa de hidratação de moléculas proteicas [97], onde modula o arranjo molecular

das pontes de hidrogênio, ângulos de hidrofobicidade e restaura o dobramento

proteico conformacional para ação de chaperonas e sistema autofágico [98].

Sirotikin e Kushierskaya [99], demonstraram que a capacidade de aceitação

da ligação de hidrogênio, e o nível de hidratação de proteína, constituem fatores–

chave na estabilidade de sistema de solventes orgânicos (Água-DMSO).

Nandi e colaboradores [100] também demonstraram o papel estabilizador de

proteínas pela associação Água-DMSO quanto a ações dos componentes do

sistema binário.

Suas ações farmacológicas primárias são imunomoduladoras e anti-

inflamatórias, inibindo quimiotaxia de polimorfonucleares e de citocinas pró-

inflamatórias, além de remover espécies reativas do oxigênio, principalmente

radicais hidroxila (OH). [101,102].

Promove disponibilidade de energia celular, termoestabilidade e redução de

insolubilidade, [103,13] facilitando recrutamento em nichos germinativos

regenerativos [104]. As doses em ensaios terapêuticos em roedores variam

conforme o tipo lesional temporal.

Jacob e de la Torre [105], propuseram o uso do DMSO em doses de 1-2

g/kg sob infusão salina venosa à concentração de 28%-40% por 7 dias em casos de

lesão traumática espinhal e oclusão vascular carotídea agudas. Lorène Penazzi e

colaboradores [15] administraram baixas doses de DMSO em roedores transgênicos

para o modelo de Alzheimer. Os resultados mostraram que o DMSO atua

modulando positivamente a densidade de espinhas dendríticas hipocampais

piramidais (CA1-CA3) em doses orais de 1% misturadas à água (v/v). Kumar [106]

demonstrou a inibição competitiva in vitro da enzima acetilcolinesterase sob

concentrações de 1-4%, com eficácia de 37 a 80%, sendo importante como agente

neuroprotetor em potencial.

Lu e Mark [107] mostraram o papel supressor do influxo de cálcio neuronal

hipocampal via NMDA e resposta neuroprotetora na condição excitatória

degenerativa. Desta forma, os estudos mencionados sugerem que o DMSO pode

ser utilizado como uma potencial fonte de terapia neuroprotetora devido às suas

características moleculares.

28

Considerações finais

As doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer esporádica,

possuem fisiopatogenia ampla e sem propostas terapêuticas curativas. Intensas

alterações celulares amplificam o processo neuropatológico na forma de expressão

gênica, alterações metabólicas, proteicas conformacionais, pró-inflamatórios,

geração mitocondrial de radicais livres, e diminuição de plasticidade sináptica.

Clinicamente apresenta-se com declínio progressivo em diversas funções cognitivas,

principalmente na formação e evocação de memórias do tipo explícita.

O DMSO possui mecanismos moleculares que podem envolver o

compartilhamento em sistema líquido com a água, atuando na capa de hidratação

superficial de proteínas, no resgate do dobramento conformacional e a autofagia.

Além disso, o DMSO bloqueia a sinalização metabólica de resistência insulínica, a

ativação pró-inflamatória, promovendo captura de radicais livres de espécies

reativas de oxigênio, e ativação vias de sobrevivência celular. Tais características

podem contribuir como elemento terapêutico no processo neurodegenerativo

induzido pela estreptozotocina.

29

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38

3 CAPÍTULO 2: ARTIGO EXPERIMENTAL

Efeitos do Dimetilsulfóxido (DMSO) sobre os prejuízos de memória induzidos pela

Estreptozotocina (STZ) em ratos Wistar. Valter Malaguido Climaco; Rebecca Marty Pimentel Machado; Marcia Regina Pincerati; Ilton

Santos da Silva. Universidade Positivo: Rua Professor Pedro Viriato Parigot de Souza, 5300 – Campo Comprido –

Curitiba - Paraná – Brasil CEP 81280-330 Telefone +55 (41)33173000 Email: [email protected]

RESUMO

A doença de Alzheimer atinge parcela atual de 6% da população idosa

mundial, havendo mais de 46 milhões de afetados mundialmente. Desta forma é

importante a busca por propostas terapêuticas que minimizem ou mesmo

interrompam os processos neurodegenerativos comuns da doença. O

dimetilsulfóxido (DMSO) possui grande versatilidade molecular por isso, um

potencial efeito neuroprotetor. A neurodegeneração induzida pela estreptozotocina

intracerebroventricular (STZ-icv) em roedores conduz a fenótipo neuropatológico

semelhante à doença de Alzheimer esporádica. O objetivo do presente estudo é

investigar o potencial efeito neuroprotetor do DMSO sobre os prejuízos de memória

induzidos pela STZ em ratos. Foram utilizados 42 ratos Wistar machos, divididos em

4 grupos, com grupo controle recebendo veículo de volume (tampão citrato) via

intracérebroventricular (icv) e salina 0,9% intraperitoneal (ip) (n=11), grupo STZ 3

mg/kg icv e salina ip (n=10), grupo STZ 3mg/kg icv e DMSO 0,75 g/kg a 40% ip,

diluído em salina a 0.9% (n=11), e grupo STZ 3 mg/kg icv e DMSO 1,5 g/kg a 40% ip

diluído em salina 0,9% (n=10). Foram 5 dias consecutivos de tratamento com inínio

24h após a administração icv de STZ e/ou veículo. Também vinte e quatro horas

após o último tratamento, os animais foram submentidos aos testes de memória

espacial no labitrinto aquático de Morris, onde foram avaliados memória de

referência e memória operacional, ambas espaciais. Ao fim dos testes, os animais

foram eutanasiados e os encéfalos dissecados bilateralmente para a retirada do

hipocampo. Análises moleculares realizadas por meio de qPCR investigando-se

perfil de expressão de genes relacionados à neuroinflamação (interleucina 1β; IL 1-

β), fator de necrose tumoral α (TNF-α), espécies reativas do estresse oxidativo

39

mitocondrial (catalase; CAT), e ativador da neurogênse adulta (fator neurotrófico

derivado do cérebro; BDNF). Os resultados comportamentais, de memória de

referência e operacional não mostraram melhora significativa de estratégias e

aprendizagem espacial dos grupos tratados com o DMSO, o que pode ter relação

com o tempo curto de tratamento e em virtude da lesão direta no hipocampo

induzida pela STZ. As análises moleculares na expressão gênica neuroinflamatória e

oxidativa mitocondrial não mostraram diferenças estatísticas nos grupos

experimentais, havendo porém, tendências de redução da neuroinflamação através

da minimização da expressão de IL1-β, TNFα, do estresse oxidativo mitocondrial

com consumo da CAT na captura de espécies reativas de oxigênio, e incremento na

expressão de BDNF à dosagem de 1,5 g/kg no grupo tratamento com DMSO,

demonstrando ambiente celular mais favorável à neuroproteção e sobrevivência

celulares frente a indução neurodegenerativa.

Palavras-chave: Doença de Alzheimer. Dimetilsulfóxido. Estreptozocina. Labirinto

aquático de Morris.

INTRODUÇÃO

A doença de Alzheimer é o mais frequente e prevalente processo

neurodegenerativo comum ao envelhecimento, acomentendo 6% da população

acima de 65 anos e não possui tratamento curativo [1]. Clinicamente, compromete

funções de memória explícita dependente da formação hipocampal, além de outros

prejuízos cognitivos [2]. Estende-se ao córtex temporal medial, pré-frontal e parietal com a deposição

de proteína amilóide neurotóxica citoplasmática em beta-conformação (Aβ 42), e

acúmulo intracelular neuronal de proteína associada a microtúbulos (Tau) em estado

hiperfosforilado [3,4,5]. Existe o comprometimento no metabolismo da glicose e

sinalização da insulina, onde ativa a enzima GSK-3β, aumento na produção de

citocinas pró-inflamatórias, abertura da barreira hemato-encefálica e estresse

oxidativo mitocondrial [6]. A irregularidade da conformação proteica promove

insolubilidade e agregação, com consequente perda de sinalização do sistema

autofágico, de proteínas auxiliadoras de dobramento proteico, as chaperonas [7] e

expressão de neurotrofinas [8].

40

A estreptozotocina (STZ) intracerebroventricular (icv) induz a um estado

neuronal equivalente à doença de Alzheimer. Seu mecanismo de ação envolve o

bloqueio metabólico insulínico e transporte de glicose via receptores GLUT 1 2 3.

Além disso, facilita bioquimicamente a formação amilóide (Aβ 42) e hiperfosforilação

da proteína TAU [9] o que contribui para a reprodução das características

anatomopatológicas da doença. Experimentalmente, é possível observar prejuízos

de memória em animais que receberam STZ-icv em tarefas do labirinto aquático de

Morris, pois para cumprir tarefas de memórias de referência e operacional, é

necessário a integridade da formação hipocampal [10]. Análises moleculares da expressão de genes dos ciclos ativadores

patológicos de neuroinflamação (Il-1β, TNF-α), estresse oxidativo mitocondrial

(CAT), fator neurotrófico derivado do encéfálo (BDNF) [11,5] são importantes para se

entender os processos desencadeadores da doença. A terapia com o DMSO

demonstra versatilidade em interação ao compartilhamento molecular com a água

[12] e interconversão do composto (Água-DMSO) em equilíbrio [7]. Atua na

hidratação superficial de proteínas, modificando pontes de H+, e facilita ação de

proteínas auxiliadoras de dobramento, as chaperonas. Além disso, reduz a ativação

inflamatória e promove a captura de espécies reativas do ciclo mitocondrial

possuíndo ação antioxidante [13][14].

Estudos em roedores de Jacob e de la Torre demonstraram eficácia do uso

venoso do DMSO à concentração de 40% em lesão traumática medular e oclusão

vascular carotídea aguda, asism como Penazzi e colaboradores, em estudo com o

uso crônico e oral a 1% do DMSO, modulando positivamente brotamento de

espinhas dendríticas hipocampais piramidais. Outro estudo retrata a inibição

competitiva da enzima colinesterase in vitro por Kumar com resultados satisfatórios.

O objetivo do presente estudo foi investigar o potencial efeito neuroprotetor do

DMSO sobre prejuízos de memória induzidos pela STZ em ratos wistar. MATERIAL E MÉTODOS

Animais – acondicionamento

A metodologia experimental foi aprovada previamente pelo Comitê de Ética

em Pesquisa de Uso de Animais da instituição (CEUA), de protocolo número 399, no

41

dia 15/04/2017. Também houve aprovação ao adendo para adequação de doses

terapêuticas em 17/08/2017. Foram utilizados 42 ratos machos da linhagem Wistar

com 90 dias de idade, provenientes do biotério da Universidade Positivo. Os animais

tiveram livre acesso à comida e água. As condições ambientais incluem um ciclo

claro/escuro de 12h cada e temperatura de 21°C.

Cirurgia estereotáxica para administração de STZ e tratamento com o DMSO

Para a administração ICV bilateral de 3mg/kg de STZ, os animais são

submetidos à cirurgia estereotáxica. Anestesia-se com uma combinação de

ketamina (90 mg/kg de peso corporal) e xilazina (12 mg/kg de peso corporal) e

posiciona-se ao aparelho estereotáxico com realização de tricotomia local e pequena

incisão sagital feita na pele sobre o crânio para exposição do escalpo.

Dois pequenos orifícios, um em cada hemisfério foram realizados com a

ajuda de uma broca odontológica esférica, suficiente para a entrada de uma

micropipeta de vidro estirado, com diâmetro externo entre 10 e 30 μm, acoplada a

uma microseringa preenchida com a STZ dissolvida em solução tamponada, numa

região a partir do bregma, estabelecida com base em coordenadas estereotáxicas

específicas para atingir os ventrículos laterais: -0,96 mm no eixo ântero-posterior,

1,8 mm no eixo médio-lateral e 3,6 mm no eixo dorso-ventral. Todas estas

coordenadas foram obtidas de acordo com Paxinos e Watson [15]. Logo após a

administração da droga (3 mg/kg de peso corporal em cada hemisfério), sutura-se a

pele sobre o crânio com fio cirúrgico mononylon e acondiciona-se individualmente os

animais em suas gaiolas para recuperação. Na analgesia pós-cirúrgica, os animais

recebem tramadol via subcutânea (5mg/Kg) de 12 em 12 horas durante 3 dias. Para

o grupo 1 (controle), os animais passam para o mesmo procedimento, porém ao

invés de administrar a STZ, injeta-se solução tamponada no mesmo volume utilizado

para administração da STZ.

Após a administração da STZ (24h), os animais dos grupos 3 e 4 recebem

doses do DMSO por via intraperitoneal durante 5 dias consecutivos. O grupo

controle recebe as mesmas doses e volumes de solução de salina a 0,9% via i.p.

Vinte e quatro horas após fim do tratamento com o DMSO, iniciaram-se os testes de

memória espacial no labirinto aquático de Morris. Assim, formaram- se quatro grupos

distintos:

42

- Grupo (1) controle salina: Animais que receberam a solução tampão citrato (a

mesma utilizada para diluir a STZ) via icv e solução salina 0,9% por via

intraperitoneal;

- Grupo (2) STZ: animais que receberam STZ via icv e salina 0,9% i.p;

- Grupo (3) STZ + DMSO 0,75g/Kg: grupo que recebeu STZ via icv e DMSO via i.p.

na concentração de 0,75g/Kg a 40%, diluído em salina 0.9%;

- Grupo (4) STZ + DMSO 1,5g/Kg: grupo que recebeu STZ via icv e DMSO via i.p. na

concentração de 1,5g/Kg a 40%, diluído em salina 0.9%.

A escolha das doses e procedimentos foram baseados na descrição de

Bardutzky J et al (2005) e Jacob SW, dela Torre JC (2009).

Labirinto aquático de Morris e Testes de Memória espacial

O labirinto aquático é um teste comportamental para avaliação de memória e

aprendizagem motivacional descrito em 1981 por Morris e utilizado por diversos

pesquisadores desde então. A tarefa permite através de manipulações relativamente

simples, avaliação de diferentes sistemas de memória, com desempenho baseado

na construção de um mapa cognitivo do ambiente [16]. Os ratos são bons nadadores e o procedimento não exige restrições hídrica

e/ou alimentar. Adicionalmente, animais saudáveis aprendem tarefas em navegação

espacial, encontrando a plataforma praticamente em linha reta quando liberados de

qualquer ponto da piscina dentro de cerca de quatro dias de treino [17,18]. Além

disso, o labirinto aquático fornece parâmetros que possibilitam análises robustas

sobre as estratégias que os animais utilizam para completar a tarefa [19]. O

equipamento consiste de uma piscina circular, com diâmetro de 180 cm e altura de

40 cm, construída em fibra de vidro. Para o experimento, a piscina é preenchida com

água até 25,5 cm e uma plataforma de acrílico com 9 cm de diâmetro e 24 cm de

altura é posicionada a 1,5 cm abaixo do nível da água servindo como ponto de

escape para os animais. A temperatura da água é mantida em 26º C por sistema de

aquecimento.

No registro do comportamento dos animais, uma câmera de vídeo conectada

a um computador é posicionada acima da piscina e as informações são enviadas ao

computador e processadas por um software que registra e calcula parâmetros

relacionados ao deslocamento dos animais na arena, dividida em quadrantes a partir

43

de pontos cardeais, e 3 “contadores” em cada quadrante com 27 cm de diâmetro,

auxiliando como possíveis locais para a plataforma móvel nos testes de memória

operacional, definindo-se parâmetros como velocidade de deslocamento, trajeto

percorrido e latência até encontrar a plataforma (Figura 1).

Figura 1 – Representacao esquemática do ambiente do labirinto aquático de Morris

Fonte: Methods of Behavior Analysis in Neuroscience - 2nd Edition – 2009.

Procedimentos

Neste estudo, os testes no labirinto aquático duraram 15 dias para avaliação

da memória de referência, 2 dias para avaliação da extinção da resposta aprendida

e 10 dias para avaliação da memória operacional. A cada dia, os animais foram

expostos a duas tentativas, com duração de 120 segundos cada. No início do

experimento, o pesquisador posiciona o animal na piscina, permitindo que ele a

explore livremente por 120 segundos. Caso o animal encontre a plataforma antes, a

tentativa é finalizada e o registro é interrompido. O animal então é retirado da

piscina, colocado em uma gaiola-espera sem maravalha e o experimentador o

enxuga com uma toalha. Após 10 minutos de intervalo, tempo para consolidação do

executado - intervalo intertentativas - “ITI” (intertrial interval), o animal é colocado

novamente na piscina para a segunda tentativa de encontrar a plataforma. Caso o

animal não encontre a plataforma dentro do tempo estabelecido, o experimentador o

44

conduz até a mesma, onde ele permanece durante 30 segundos para o

mapeamento espacial do ambiente. Ao fim das duas exposições e após os animais

estarem com a pelagem completamente enxuta, os animais são devolvidos à gaiola

moradia [19,16].

A utilização do labirinto aquático viabiliza informações a respeito de

mapeamento espacial via sequenciamento de repetições dos testes diários, e

envolve diretamente a formação hipocampal, que é uma estrutura de interesse do

presente estudo.

Testes de memória de referência Para o teste de memória de referência, a plataforma permanece fixa durante

todo período, sendo os animais liberados de pontos distintos de partida, com focinho

direcionado para a piscina, porém equidistantes à mesma, a fim de criar

deslocamento espacial sem estratégias fixas Os parâmetros analisados, são a

latência para encontro da plataforma submersa (tempo da liberação do animal na

piscina até o encontro da plataforma ou ao fim do tempo máximo de 120 segundos),

trajeto percorrido (distância navegada na tentativa em centímetros), tempo de

permanência em cada quadrante (tempo dispendido no quadrante imaginário da

plataforma quanto ao tempo total na piscina) e velocidade de nado (estado

motivacional e atividade motora em cm/s).

“Probe Test”- extinção da memória adquirida

No dia seguinte ao último treino do teste de memória de referência, os

animais foram submetidos ao ‘Probe Test”, que consiste duas exposições

consecutivas, sendo uma por dia, em uma prova única de 180 segundos em cada

dia, em avaliações divididas em 60 segundos (3 blocos de 60 segundos cada).

Nesse teste, a plataforma é retirada da piscina e avalia-se a quantidade de tempo

que os animais despendem procurando a plataforma em sua localização prévia, e o

número de cruzamentos no contador crítico (área circundante à plataforma

equivalente à três vezes o seu tamanho). Num primeiro momento, relacionam

medidas de precisão de busca da plataforma no seu local dos dias anteriores. Com

o tempo, os animais abandonam essa estratégia e buscam a plataforma nos outros

45

setores da piscina, caracterizando a extinção do comportamento adquirido

anteriormente.

Testes de memória operacional

Ao final do “Probe Test”, seguiu-se à avaliação de memória operacional, a

plataforma submersa é modificada diariamente de posição, exigindo a aquisição de

novas informações diárias ao animal experimentado. Em outras palavras, na

primeira tentativa de cada dia, há uma nova informação e o animal pode utilizar as

informações da primeira tentativa para cumprir a tarefa nas demais tentativas

somente daquele dia. Para isso, é necessária a integridade da formação

hipocampal.

Os parâmetros mensurados envolvem a latência para encontrar a

plataforma, trajeto percorrido, porcentagem de tempo e frequência de cruzamentos

na área do contador crítico da plataforma no dia em questão, e dia anterior onde

define-se um padrão de navegação dos animais quanto à busca e extinção de

resposta na memória operacional armazenada nas 24 horas.

O teste de memória operacional foi dividido em duas fases consecutivas,

cinco dias com o ITI (intertrialinterval) de 5 minutos e posteriormente, mais cinco dias

com o ITI de 15 minutos. A cada dia, foram realizadas três tentativas.

Extração de RNA e análise de expressão dos genes interleucina 1-β (IL -1β), catalase (CAT), fator de necrose tumoral alfa (TNFα) e fator neurotrófico derivado cerebral (BDNF)

Ao fim dos testes comportamentais, os animais foram eutanaziados por

inalação constante de isoflurano e os encéfalos dissecados para a retirada bilateral

do hipocampo. Logo após, as amostras foram armazenados em solução

conservante (RNA later – Thermo Scientific) em temperatura de -20º C. Para a

extração de RNA foi utilizado o kit extrator – SV total RNA Isolation Kit (Promega),

conforme instruções de fabricante. Após a extração, o RNA foi quantificado e sua

pureza avaliada por espectrofotometria.

A extração de 1 micrograma de RNA total foi utilizada para a síntese de

cDNA, com a enzima transcriptase reversa com Kit High Capacity cDNA Reverse

46

Transcription Kit (Applied biosystems). Logo após, o cDNA foi submetido à reação

em cadeia de polimerase quantitativa (RT-qPCR) para a avaliação do perfil de

expressão dos genes CAT, IL – 1β, TNFα e BDNF no hipocampo dos animais dos

diferentes grupos.

O sistema de fluorescência utilizado para a amplificação foi o fluoróforo

Power Up SYBR-Green qPCR Master mix (Thermofisher) segundo instruções do

fabricante. As reações no termociclador Step One Plus (Life Technologies), para

determinação dos níveis de expressão do mRNA nos distintos grupos.

Esquema representando a sequencia do desenho experimental.

Análise de dados

Os valores obtidos nos parâmetros comportamentais e na quantificação

relativa dos genes em estudo foram submetidos a testes de normalidade e, atingido

os requisitos de homogeneidade, empregados testes de Análise de Variância para

Medidas Repetidas (ANOVA). Os parâmetros moleculares e comportamentais foram

considerados como variáveis dependentes e os grupos experimentais como

variáveis independentes. Todos os testes foram realizados com auxílio do ambiente

estatístico R (R Development Core Team, 2016) com nível de significância fixado em

5% e, quando necessário, teste de comparações múltiplas post hoc de Tukey, para

identificação das origens das possíveis diferenças.

No teste de memória de referência, foi realizada uma ANOVA separada para

cada parâmetro (latência, trajeto, tempo no quadrante da plataforma e velocidade de

nado) considerando-se os grupos experimentais como fatores entre-sujeitos e

“Sessão” e “Tentativa” como fatores intra-sujeitos, sendo realizadas médias dos

Indução STZ-icv

Inícios de tratamento (D1-D5)

Testes de memória no labirinto aquático

Análise de expressão de genes (IL-1β, TNFα, CAT, BDNF)

47

escores por tentativas por sessão para a confecção gráfica temporal da

apresentação dos resultados.

No teste de avaliação e extinção da resposta adquirida, cada tentativa diária

de 180 segundos foi dividivda em Blocos de 60 segundos cada consecutivamente,

sendo fatores entre-sujeitos os grupos experimentais e fatores intra-sujeitos

“Sessão” e “Bloco” (3 de 60 segundos cada)

Quanto aos resultados de memória operacional, “Tentativa e Fase” são

considerados fatores intra-sujeitos e os grupos experimentais, como fatores entre-

sujeitos, e, para comparação de desempenho dos animais ao longo das tentativas,

dividiu-se 02 fases quanto ao ITI: 5 e 15 minutos em 3 tentativas.

Resultados Memória de referência Análise descritiva da memória de referência

Os resultados do teste de memória de referência foram expressos por meio

dos parâmetros: latência, trajeto percorrido e velocidade de nado (Figura 2).

48

Sessão ( dias )

Figura 2 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, em função da sessão (valor médio das duas tentativas), respectivas ao experimento de memória de referência. (G1- controle salina; tampão icv e salina 0,9% ip,/ G2-STZ-icv e salina 0,9% ip, / G3-STZ-icv e DMSO a 40% 0,75 g/kg ip, G4-STZ-icv e DMSO a 40% 1,5 g/kg ip) – Nota-se redução progressiva dos parâmetros de latência, trajeto e velocidade principalmente no grupo G1.

A Figura 2 apresenta graficamente as médias das variáveis de latência,

trajeto e velocidade por grupo, ao longo dos momentos avaliados, sendo

considerados os valores médios das duas tentativas realizadas em cada sessão.

Nota-se que independentemente do grupo, a média da latência para encontro da

plataforma tente a diminuir ao longo das sessões realizadas no experimento, o que

também acontece com o trajeto e a velocidade, sendo que a partir da segunda

sessão, as médias das três variáveis obtidas pelos ratos do grupo controle (G1) são

inferiores às observadas para os demais grupos, mostrando prejuízo de memória

espacial em todos os grupos em relação ao grupo Controle.

49

Sessão ( dias )

Figura 3 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, (Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma, Entrada e Tempo no Contador da Plataforma, Entrada e Tempo no Anel Externo) em função da sessão (valor médio das duas tentativas), respectivas ao experimento de memória de referência – Nota-se diferenças entre grupo G1 e grupos STZ (G2, G3, G4) predominantemente na Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma, assim como na Entrada e Tempo no Anel Externo.

Na Figura 3, observam-se as médias das variáveis de entrada e tempo por

grupo, ao longo dos momentos avaliados, sendo considerados os valores médios

das duas tentativas realizadas em cada sessão. É notável que os ratos do grupo

Controle (G1) tem menores médias na maior parte dos períodos, quando

consideradas as variáveis de número de entradas e tempo tanto no quadrante da

plataforma, quanto no anel externo, enquanto que o contrário ocorre com a variável

referente ao tempo no contador da plataforma, para o qual, as médias do grupo G1

são maiores em geral.

50

Ainda, é nítido que para os quatro grupos, o tempo no anel externo tende a

diminuir ao longo das sessões, assim como as entradas no anel externo e no

quadrante da plataforma, embora as tendências para essas duas últimas variáveis

sejam mais sutis, sobretudo para o grupo G4. Por outro lado, embora apresente

grande oscilação, tanto o número de entradas quanto o tempo no contador da

plataforma apresentam uma tendência suave de aumento ao longo das sessões

realizadas.

Comparações da memória de referência Na Tabela 2 são apresentados os resultados dos testes para comparação

das variáveis de interesse entre os grupos obtidos por meio da ANOVA. Foram

consideradas como variáveis dependentes: latência, a trajetória, a velocidade e as

variáveis de entrada e tempo, obtidas entre todas em relação às 30 tentativas

realizadas ao longo das 15 sessões do experimento, enquanto que as variáveis:

grupo, tentativa e sessão foram consideradas independentes. Tabela 2 – Resultados da ANOVA para as quatro variáveis de interesse.

Variável Grupo (3, 1243)

Tentativa (1, 1243)

Sessão (1, 1243)

Grupo x Tentativa (3, 1243)

Grupo x Sessão (3, 1243)

Tentativa x Sessão (1, 1243)

Grupo x Tentativa x Sessão (3, 1243)

Latência 23,221 (<0,001)

9,285 (0,002)

211,916 (<0,001)

0,035 (0,991)

3,947 (0,008)

0,809 (0,369)

1,283 (0,279)

Trajetória 13,753 (<0,001)

4,086 (0,043)

168,234 (<0,001)

0,265 (0,851)

4,263 (0,005)

0,013 (0,908)

0,927 (0,427)

Velocidade 7,31 (<0,001)

0,126 (0,723)

68,442 (<0,001)

0,815 (0,486)

7,182 (<0,001)

1,835 (0,176)

0,209 (0,890)

Entrada no Quadrante da Plataforma (n)

11,015 (<0,001)

1,593 (0,207)

51,71 (<0,001)

0,129 (0,943)

3,163 (0,024)

0,000 (0,983)

0,954 (0,414)

Tempo no Quadrante da Plataforma (s)

7,139 (<0,001)

6,577 (0,010)

19,014 (<0,001)

0,040 (0,989)

2,245 (0,081)

0,033 (0,856)

1,358 (0,254)

Entrada no Contador da Plataforma (n)

3,592 (0,013)

4,707 (0,030)

29,021 (<0,001)

0,258 (0,856)

2,388 (0,067)

0,132 (0,717)

0,173 (0,915)

Tempo no Contador da Plataforma (s)

3,669 (0,012)

1,075 (0,300)

58,045 (<0,001)

0,773 (0,509)

1,316 (0,268)

0,008 (0,930)

0,482 (0,695)

Entrada no Anel Externo (n)

12,953 (<0,001)

0,018 (0,892)

25,467 (<0,001)

0,388 (0,762)

8,329 (<0,001)

2,763 (0,097)

1,166 (0,322)

Tempo no Anel Externo (s)

17,399 (<0,001)

18,946 (<0,001)

372,901 (<0,001)

0,192 (0,902)

8,614 (<0,001)

0,203 (0,653)

1,325 (0,265)

GL n : Graus de liberdade dos numerados; GL d : Graus de liberdade do denominador; P < 0,05

51

De acordo com os resultados expostos na Tabela 2, vê-se que o efeito

principal dos grupos se mostrou significativo para todas as variáveis sob estudo ao

nível de 5% de significância, indicando que as médias dessas variáveis diferem

significativamente para ao menos um par de grupos (F3,1243 = 3,669 – 23,221, p <

0,001). Pode-se ver ainda que o efeito principal das sessões também foi significativo

em todos os casos, apresentando valores p inferiores a 0,001 para todas as

variáveis resposta, indicando assim que há um deslocamento na média das

variáveis ao passar das sessões (F1,1243 = 25,467 – 372,901, p < 0,001). É possível

perceber ainda que o efeito principal de tentativa foi significativo, a 5% de

significância, para as variáveis: latência, trajetória, entrada no contador da

plataforma, tempo no quadrante da plataforma e tempo no anel externo (F1,1243 =

4,086 – 18,946, p < 0,043).

Desta forma, há indicações de diferenças nas médias dessas variáveis

conforme a tentativa de observação, ao passo que não foram encontradas

evidências amostrais suficientes de que a velocidade, a entrada no quadrante da

plataforma, o tempo no contador da plataforma e a entrada no anel externo diferem

significativamente entre as tentativas (F1,1243 = 0,018 – 1,593, p > 0,207).

Considerando as interações, nota-se que a interação entre grupo e sessão foi a

única significativa em pelo menos algum caso. Destaca-se que essa interação se

demonstrou estatisticamente significante para as variáveis de latência, trajetória,

velocidade, entrada no quadrante da plataforma entrada no anel externo e tempo no

anel externo (F3,1243= 3,163 - 8,614, p< 0,024).

É importante frisar que os graus de liberdade de resíduos utilizados no

denominador da estatística F foram todos constantes e iguais a 1243. Avaliando em

quais grupos as variáveis de interesse diferem significativamente, o teste de

comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.

52

Tabela 3 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre os grupos.

Variável G1 G2 G3 G4 Latência 60,46 (c) 80,45 (b) 90,11 (a) 90,05 (a)

Trajetória 889,65 (c) 1662,79 (b) 1860,83 (b) 2150,96 (a)

Velocidade 14,98 (c) 19,14 (b) 19,68 (b) 22,63 (a) Entrada no Quadrante da Plataforma (n) 2,8 (c) 4,5 (b) 4,79 (b) 5,47 (a) Tempo no Quadrante da Plataforma (s) 16,45 (b) 20,45 (a) 21,27 (a) 21,47 (a) Entrada no Contador da Plataforma (n) 1,66 (a) 1,47 (ab) 1,35 (b) 1,34 (b) Tempo no Contador da Plataforma (s) 4,74 (a) 3,35 (b) 2,71 (bc) 2,53 (c)

Entrada no Anel Externo (n) 4,91 (b) 7,84 (a) 7,44 (a) 8,44 (a) Tempo no Anel Externo (s) 30,94 (c) 50,07 (b) 62,63 (a) 61,82 (a)

Vê-se na Tabela 3 que a latência média do grupo G1, de 60,46 s, difere

significativamente das médias dos grupos G2 (80,45 s), G3 (90,11 s) e G4 (90,05 s),

assim como a média da trajetória do grupo G1 (889,65 cm) difere de todos os

grupos, enquanto que a média dos grupos G2 (1662,79 cm) e G3 (1860,83 cm) não

diferem entre si, mas diferem da média do grupo G4 (2150,96 cm). Da mesma

forma, para a variável velocidade, a média do grupo G1, de 14,98 cm/s difere

significativamente das médias dos grupos G2 (19,14 cm/s), G3 (19,68 cm/s) e G4

(22,63 cm/s).

Similarmente à variável de trajetória, a média da variável entrada no

quadrante da plataforma do grupo G1 é significativamente diferente de todas (2,8),

enquanto que as médias dos grupos G2 (4,5) e G3 (4,79) não diferem entre si, mas

diferem do último grupo (5,47).

Em relação à variável entrada no anel externo, nota-se que apenas o grupo

G1 possui média destoante dos demais (4,91), enquanto que para a entrada no

contador da plataforma há divergência da média desse mesmo grupo (1,66) para a

média do grupo G3 (1,35) e G4 (1,34).

Quanto às médias da variável tempo no anel externo, nota-se novamente

uma diferença significativa entre o grupo G1 (30,94 s) em relação a todos os outros,

o que também aconteceu com as médias da variável tempo no quadrante da

plataforma, que só apresentou diferença significativa na média do grupo G1

comparado aos demais.

Por fim, em relação as médias do variável tempo no contador da plataforma,

nota-se que não houve diferença entre os grupos G4 e G3 (2,53 s versus 2,71 s), G3

e G2 (2,71 sversus 3,35 s), sendo a medida do grupo G1 (4,74 s) significativamente

53

maior do que as demais. Portanto, é possível concluir que o DMSO não gerou

efeitos significativos nos grupos tratados e os prejuízos de memória de referência

foram observados de forma similar em todos os grupos, exceto o Controle.

Avaliação de extinção da memória adquirida (Probe Test) Análise descritiva do Probe Test

Figura 4 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse (Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma, Entrada e Tempo no Contador da Plataforma), por grupo e fase e tentativa (Bloco de 3 tentativas de 60 segundos cada), respectivas ao experimento Probe Test – Nota-se maior permanência no lugar prévio da plataforma na primeira fase no G1 em Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma por habituação, mostrando-se tendência de extinção do aprendido na Fase 2, não havendo diferenças entre os grupos STZ (G2,G3,G4)

A partir da Figura 4 são expostos os perfis médios dos grupos do estudo

conforme as fases consideradas. Pode-se notar que para a variável entrada no

contador da plataforma há um comportamento diferente nas médias dos grupos

entre as fases, sendo que na primeira fase há uma disparidade entre os grupos em

54

todas as tentativas, enquanto que na segunda fase, os quatro grupos parecem

convergir para uma mesma média após a última tentativa.

Considerando a variável entrada no quadrante da plataforma, pode-se

destacar que a medida média do grupo G4 foi superior em todos os casos, sendo a

maior diferença aparente na primeira fase. Além disso, nota-se que na segunda

fase, a média desse grupo foi constante nas três tentativas, enquanto que as médias

dos outros grupos diminuíram conforme o passar das tentativas.

Ao se olhar para o tempo no contador da plataforma, nota-se uma

superioridade na média do grupo G1 em todas as tentativas e em ambas as fases,

caracterizando um comportamento diferente dos demais grupos para essa variável.

Por fim, vê-se na primeira fase que o comportamento médio dos grupos para

a variável tempo no contador da plataforma se demonstrou próximo, o que não

aconteceu na segunda fase do experimento, com uma média muito superior do

grupo G1 nas duas primeiras tentativas e um comportamento de decaimento muito

mais acentuado conforme o passar das tentativas para esse mesmo grupo.

Tabela 4 – Medidas descritivas das variáveis de interesse, por grupo, respectivas ao experimento Probe Test.

Variável Grupo Média DP CV Mínimo Máximo


G1 3,42 1,62 47,25% 0,00 6,00 G2 3,68 1,50 40,76% 1,00 7,00 G3 3,50 1,35 38,48% 1,00 6,00 G4 4,08 1,22 29,91% 1,00 7,00


G1 19,97 10,36 51,86% 0,00 60,00 G2 16,60 8,08 48,65% 2,00 42,00 G3 15,60 6,85 43,93% 2,00 34,00 G4 17,45 5,68 32,57% 5,00 31,00


G1 2,67 1,60 60,05% 0,00 8,00 G2 1,80 1,36 75,72% 0,00 6,00 G3 2,10 2,55 121,39% 0,00 12,00 G4 1,30 1,23 94,20% 0,00 4,00


G1 4,02 3,61 89,90% 0,00 21,00 G2 2,23 2,04 91,19% 0,00 9,00 G3 2,22 2,91 131,09% 0,00 11,00 G4 1,47 1,88 128,11% 0,00 8,00

DP: desvio padrão; CV: coeficiente de variação.

Na Tabela 4 são apresentadas as medidas descritivas das variáveis do

experimento, considerando as observações de ambas as fases e todas as tentativas

55

realizadas. O grupo G1 apresenta as maiores médias gerais para as variáveis

entrada no contador da plataforma (2,67), tempo no contador da plataforma (4,02 s),

e tempo no contador da plataforma (19,97 s), enquanto que teve a menor medida

média para entrada no quadrante da plataforma, sendo igual a 3,42. Apesar da

maior média para entrada no contador da plataforma pertencer ao primeiro grupo, o

maior valor observado (12) é referente a um rato do grupo G3, grupo esse que

apresentou maior variação entre os valores observados em torno da média dessa

variável (CV = 121%).

Pode-se ver também que o grupo G4 apresentou a maior média observada

para entrada no quadrante da plataforma (4,08) e as menores médias para entrada

no contador da plataforma (1,30) e tempo no contador da plataforma (1,47 s). Além

disso, vê-se que o grupo G3 apresentou a menor média geral de tempo no contador

da plataforma, sendo essa medida igual a 3,50 s.

Comparações do Probe Test

Nos testes de comparação entre os grupos por meio da ANOVA, considera-

se como variáveis dependentes, a entrada e tempo no quadrante e contador da

plataforma, em relação às 3 tentativas realizadas ao longo das 2 fases do

experimento, enquanto que as variáveis grupo, tentativa e fase foram consideradas

como independentes.

Tabela 5 – Resultados da ANOVA – F (valor p) - para as variáveis de interesse, respectivas ao experimento Probe Test.


Bloco (1, 235)

Sessão (1, 235)

Grupo x Bloco

(3, 235)

Grupo x Sessão (3, 235)

Bloco x Sessão (1, 235)

Grupo x Bloco x Sessão (3, 235)


2,076 (0,104)

1,964 (0,162)

0,031 (0,860)

0,148 (0,931)

0,697 (0,555)

0,105 (0,747)

0,475 (0,700)


3,381 (0,019)*

1,678 (0,196)

2,478 (0,117)

2,376 (0,071)

3,262 (0,022)*

6,052 (0,015)*

0,719 (0,541)

Entrada no Contador da

Plataforma (n)

2,648 (0,049)*

3,938 (0,048)*

4,562 (0,034)*

1,961 (0,121)

2,411 (0,068)

0,033 (0,857)

0,608 (0,610)

Tempo no Contador da

Plataforma (s)

2,753 (0,043)*

1,328 (0,250)

0,232 (0,630)

0,845 (0,470)

0,517 (0,671)

0,096 (0,757)

0,113 (0,952)

* Valor p < 0,05.

56


principal dos grupos se mostrou significativo, com exceção a variável entrada no

quadrante da plataforma, para todas as variáveis sob estudo ao nível de 5% de

significância, indicando que as médias dessas variáveis diferem significativamente

para ao menos um par de grupos (F3,235 = 2,648 – 3,381, p < 0,049).

Pode-se ver ainda que os efeitos principais das tentativas e das fases só

foram significativos para a variável entrada no contador da plataforma (F1,235 = 3,938

– 4,562, p < 0,048). Desta forma, há indicações de diferenças significantes nas

médias de entrada no contador da plataforma conforme as tentativas e fases. É

possível perceber ainda que a interação entre grupo e fase foi significante apenas

para a variável tempo no quadrante da plataforma (F3,235= 3,262, p = 0,022),

indicando que dependendo da fase, há diferenças nas médias de tempo no

quadrante da plataforma (F3,235= 3,262, p = 0,022), indicando que dependendo da

fase, há diferenças nas médias de tempo no quadrante da plataforma entre os

grupos. Por outro lado, vê-se que essa variável também foi exclusiva quanto a

significância da interação entre tentativa e fase (F1,235 = 6,052, p = 0,015), levando a

entender que as médias de tempo no quadrante da plataforma têm comportamento

dependente da relação entre tentativa e fase.

Para avaliar entre quais grupos as variáveis de interesse diferem

significativamente, o teste de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.

Tabela 6 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre os grupos, respectivas ao experimento Probe Test.

Variável G1 G2 G3 G4 Entrada no Quadrante da Plataforma (n) 3,42 (a) 3,68 (a) 3,50 (a) 4,08 (a) Tempo no Quadrante da Plataforma (s) 19,97 (a) 16,60 (ab) 15,60 (b) 17,45 (ab) Entrada no Contador da Plataforma (n) 2,67 (a) 1,80 (bc) 2,10 (ab) 1,30 (c) Tempo no Contador da Plataforma (s) 4,02 (a) 2,23 (b) 2,22 (b) 1,47 (b)

Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas entre os grupos.

Concordante com a ANOVA, os resultados do teste de Tukey pela Tabela 6

indicam que não há diferença nas médias de entrada no quadrante da plataforma

entre os grupos estudados. No entanto, percebe-se significância na diferença entre

as médias de entrada no contador da plataforma dos grupos G1 (2,67) com G2

(1,80) e G4 (1,30).

57

Em relação à variável tempo no contador da plataforma, nota-se que apenas

o grupo G1 possui média destoante dos demais (4,02 s), enquanto que para tempo

no quadrante da plataforma há divergência da média desse mesmo grupo (19,97 s)

apenas para a média do grupo G3 (15,60 s). Portanto, confirmando os resultados

obtidos no teste de memória de referência, o Probe Test mostrou prejuízos de

memória e extinção da resposta adquirida em todos os grupos, exceto o grupo

Controle (G1).

Memória operacional

Análise descritiva da memória operacional

Figura 5 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, em função da tentativa (valor médio das 5 sessões) e fase, respectivas ao experimento de memória operacional. – Nota-se redução progressiva de parâmetros de latência, trajeto e velocidade principalmente no G1, e manutenção de velocidade de nado elevada em grupos STZ (G2.G3,G4)

A Figura 5 apresenta graficamente as médias das variáveis de latência,

trajeto e velocidade por grupo, ao longo dos momentos avaliados, sendo

58

considerados os valores médios das três tentativas realizadas em cada fase. Pode-

se ver a diferença clara nas médias do grupo G1 nas duas fases para as variáveis

de trajeto e velocidade, tendo médias inferiores às demais em todas tentativas,

inclusive.

Percebe-se que, independentemente do grupo, a média da latência para

encontro da plataforma tende a diminuir ao longo das tentativas, sendo esse

comportamento acentuado na segunda fase, o que também acontece com o trajeto.

Já para a velocidade, nota-se esse comportamento geral de médias decrescentes ao

passar das tentativas apenas na segunda fase.

Figura 6 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse (Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma, Entrada e Tempo no Contador da Plataforma, Entrada e Tempo no Anel Externo), por grupo, em função da tentativa (valor médio das 5 sessões) e fase, respectivas ao experimento de memória operacional. – Nota-se quantitativamente menor: Entrada e Tempo no Quadrante da

59

Plataforma, asism como em Entrada e Tempo no Anel Externo no grupo G1 comparativamente aos grupos STZ (G2, G3, G4).

Pela Figura 6, observam-se as médias das variáveis de entrada e tempo por

grupo, ao longo dos momentos avaliados, sendo considerados os valores médios

dentre cada fase proposta. Os ratos do grupo Controle têm menores medidas

médias na maior parte das fases quando consideradas as variáveis de entrada e

tempo no quadrante da plataforma e no anel externo, não sendo a menor média

apenas na primeira tentativa da fase 1 para as entradas no anel externo e tempo no

quadrante da plataforma e no anel externo. Por outro lado, as médias do grupo G4

parecem superiores, no geral, para a entrada no quadrante e tempo no anel externo,

sendo essa superioridade numérica acentuada na segunda fase do experimento.

Ainda nos quatro grupos, a entrada e tempo no quadrante da plataforma,

além da entrada e tempo no anel externo tendem a diminuir ao longo das tentativas,

embora as tendências sejam mais sutis na primeira fase e mais acentuadas na

segunda fase. Por outro lado, embora apresente grande oscilação, tanto o número

de entradas quanto o tempo no contador da plataforma apresentam uma tendência

de aumento ao longo das tentativas realizadas.

Complementando as figuras 4 e 5, a Tabela 7 apresenta medidas

considerando as três tentativas nas duas fases do processo experimental. O grupo

G1 apresentou a maior média geral apenas para a variável de tempo no contador da

plataforma (4,49 s), no entanto teve as menores medidas médias para todas as

outras variáveis do estudo.

Em contraste, vê-se que o grupo G4 apresentou as maiores médias na

trajetória (1684,74 cm), velocidade (21,45 cm/s), tempo no quadrante da plataforma

(18,59 s) e no anel externo (36,46 s), além da entrada no contador da plataforma,

que teve média 1,73 e a entrada no quadrante da plataforma, cuja média foi igual a

4,83. Por outro lado, pode-se ver também que o grupo G3 apresentou a maior

latência média, sendo essa quantia igual a 74 s.

60

Tabela 7 – Medidas descritivas das variáveis de interesse, por grupo, respectivas ao experimento operacional.

Variável Grupo Média DP CV Mínimo Máximo

Latência (s)

G1 64,82 28,62 0,44 17,80 120,00

G2 66,77 23,54 0,35 18,00 109,40

G3 74,00 26,05 0,35 18,60 120,00

G4 73,40 26,12 0,36 15,00 120,00

Trajetória (cm)

G1 858,82 453,05 0,53 136,80 1945,40

G2 1332,95 587,58 0,44 193,00 2814,80

G3 1481,78 680,66 0,46 199,60 3248,80 G4 1684,74 708,41 0,42 230,40 3368,80

Velocidade (cm/s)

G1 13,26 4,26 0,32 1,30 19,28 G2 18,39 3,54 0,19 10,52 25,68 G3 19,03 4,83 0,25 10,32 29,20

G4 21,45 4,44 0,21 11,68 30,84


G1 2,69 1,12 0,42 0,40 5,00

G2 4,06 1,39 0,34 1,20 7,00

G3 4,25 1,60 0,38 1,40 8,60

G4 4,83 1,81 0,37 1,60 8,60


G1 15,23 5,01 0,33 4,40 24,80

G2 17,94 6,17 0,34 7,00 36,00

G3 17,85 4,66 0,26 10,00 30,80 G4 18,59 5,33 0,29 6,80 31,80


G1 1,64 0,67 0,41 0,20 3,00 G2 1,67 0,51 0,31 0,80 3,00 G3 1,67 0,62 0,37 0,40 3,60

G4 1,73 0,67 0,39 0,00 3,20


G1 4,49 1,60 0,36 1,00 9,80

G2 4,23 1,52 0,36 2,20 8,60

G3 3,75 1,69 0,45 0,00 8,20

G4 3,69 1,51 0,41 0,00 10,00


G1 4,92 2,44 0,50 1,28 12,00

G2 6,60 2,92 0,44 1,00 14,20

G3 7,96 3,31 0,42 1,40 15,80 G4 7,52 2,99 0,40 1,20 14,60

Tempo no Anel Externo (s)

G1 23,41 15,55 0,66 2,00 72,40 G2 27,58 18,12 0,66 2,40 82,20 G3 32,36 18,36 0,57 3,00 78,80

G4 36,46 21,43 0,59 4,00 110,20 DP: desvio padrão; CV: coeficiente de variação.

.

61

Comparações da memória operacional

A comparação das variáveis entre os grupos por meio da ANOVA,

consideram como variáveis dependentes: resposta a latência, trajetória e velocidade,

além das variáveis de entrada e tempo no quadrante, anel externo e contador da

plataforma, sendo todas relativas às 3 tentativas realizadas ao longo das 2 fases do

experimento. Enquanto isso, as variáveis: grupo, tentativa e fase foram consideradas

como independentes. Tabela 8 – Resultados da ANOVA – F (valor p) - para as variáveis de interesse, respectivas ao experimento de memória operacional.


Tentativa (1, 235)

Fase (1, 235)

Grupo x Tentativa (3, 235)

Grupo x Fase

(3, 235)

Tentativa x Fase

(1, 235)

Grupo x Tentativa

x Fase (3, 235)

Latência (s) 3,565

(0,015)* 46,014

(<0,001)* 4,163

(0,042)* 2,243

(0,084) 2,42

(0,067) 1,312

(0,253) 0,028

(0,994)

Trajetória (cm) 5,094

(0,002)* 20,672

(<0,001)* 0,614

(0,434) 0,453

(0,716) 0,705

(0,550) 2,015

(0,157) 0,098

(0,961)

Velocidade (cm/s) 5,673

(0,001)* 1,392

(0,239) 0,503

(0,479) 0,057

(0,982) 1,238

(0,297) 0,835

(0,362) 0,067

(0,978)


5,609 (0,001)*

10,97 (0,001)*

0,226 (0,635)

0,248 (0,863)

0,289 (0,833)

1,149 (0,285)

0,071 (0,976)


2,039 (0,109)

7,935 (0,005)*

0,546 (0,461)

0,276 (0,843)

0,276 (0,843)

0,294 (0,588)

0,156 (0,926)


0,747 (0,525)

2,463 (0,118)

0,845 (0,359)

0,409 (0,747)

1,695 (0,169)

0,063 (0,802)

1,322 (0,268)


1,287 (0,280)

19,192 (<0,001)*

0,001 (0,984)

1,044 (0,374)

5,171 (0,002)*

4,956 (0,027)*

0,767 (0,514)


4,872 (0,003)*

20,374 (<0,001)*

3,69 (0,056)

1,083 (0,357)

0,973 (0,406)

0,512 (0,475)

0,153 (0,928)

Tempo no Anel Externo (s) 2,245

(0,084) 16,327

(<0,001)* 5,059

(0,025)* 0,462

(0,709) 1,471

(0,223) 0,923

(0,338) 0,259

(0,855) * Valor p < 0,05.

A partir da Tabela 8, o efeito principal dos grupos se mostrou significativo, ao

nível de 5% de significância, para as variáveis relativas à latência, trajetória,

velocidade, entrada no quadrante da plataforma e entrada no anel externo,

indicando que as médias dessas variáveis diferem significativamente para ao menos

um par de grupos (F3,235 = 3,565 – 5,673, p < 0,015).

Os efeitos principais das tentativas só não foram significativos para as

variáveis de velocidade e entrada no contador da plataforma (F1,235 = 1,392 – 2,463,

62

p > 0,118), havendo indicações de diferenças significantes nas médias conforme as

tentativas para todas as outras variáveis em estudo.

Observando o efeito principal da fase, houve significância estatística para as

variáveis de latência e tempo no anel externo (F1,235 = 4,163 – 5,059, p < 0,042),

havendo diferenças significativas nas médias dessas variáveis quando as fases são

contrastadas.

É possível perceber que a interação entre grupo e fase foi significante

apenas para a variável de tempo no contador da plataforma (F3,235 = 5,171, p =

0,002), indicando que dependendo da fase, há diferenças nas médias de tempo no

contador da plataforma entre os grupos. Além disso, nota-se a exclusividade dessa

mesma variável quanto a significância da interação entre tentativa e fase (F1,235 =

4,956, p = 0,027), levando a entender que as médias de tempo no contador da

plataforma têm comportamento dependente da relação entre tentativa e fase.

Na definição de quais grupos as variáveis de interesse diferem

significativamente, o teste de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.

Tabela 9 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre os grupos, respectivas ao experimento de memória operacional.

Variável G1 G2 G3 G4 Latência (s) 64,82 (a) 66,77 (a) 74 (a) 73,4 (a)

Trajetória (cm) 858,82 (c) 1332,95 (b) 1481,78 (ab) 1684,74 (a) Velocidade (cm/s) 13,26 (c) 18,39 (b) 19,03 (b) 21,45 (a)

Entrada no Quadrante da Plataforma (n) 2,69 (c) 4,06 (b) 4,25 (ab) 4,83 (a) Tempo no Quadrante da Plataforma (s) 15,23 (b) 17,94 (a) 17,85 (a) 18,59 (a) Entrada no Contador da Plataforma (n) 1,64 (a) 1,67 (a) 1,67 (a) 1,73 (a) Tempo no Contador da Plataforma (s) 4,49 (a) 4,23 (ab) 3,75 (b) 3,69 (b)

Entrada no Anel Externo (n) 4,92 (c) 6,6 (b) 7,96 (a) 7,52 (ab) Tempo no Anel Externo (s) 23,41 (c) 27,58 (bc) 32,36 (ab) 36,46 (a)

É possível observar na Tabela 9 que, apesar do resultado da ANOVA

apresentado anteriormente, não houve evidência de diferenças entre os grupos em

relação à latência média pelo teste de Tukey. No entanto, a trajetória média do

grupo G1, igual a 858,82 cm, difere significativamente de todos os outros grupos,

enquanto que a média do grupo G2 (1332,95 cm) difere também da média do grupo

G4 (1684,74 cm).

Quanto a velocidade média, para o grupo G1 foi significantemente menor

que os demais grupos, com média de 13,26 cm/s, enquanto que o grupo G4 foi o

63

mais veloz, tendo uma velocidade média de 21,45 cm/s e diferindo dos demais

grupos.

O número médio de entrada na plataforma do grupo G1 foi diferente de

todos (2,69), sendo que o grupo G2 (4,06) também diferiu do G4 (4,83) para essa

variável, enquanto que para a variável relativa ao tempo no quadrante da plataforma,

vê-se que o grupo G1 foi o único que obteve uma medida média diferente dos

demais (15,23 s).

No tempo no contador da plataforma, observa-se que não houve diferença

significativa entre as médias dos grupos G1 e G2, iguais a 4,49 s e 4,23 s,

respectivamente. Porém, há evidências de diferença nas médias entre o primeiro

grupo e os grupos G3 (3,75 s) e G4 (3,69 s). O tempo no anel externo médio do

grupo G1 (23,41 s) foi significativamente menor que as médias dos grupos G3 e G4,

sendo essas últimas iguais a 32,36 s e 36,46 s, respectivamente.

Já em relação as médias da variável entrada no anel externo, vê-se que não

houve diferença entre os grupos G4 e G3 (7,52 versus 7,96), G4 e G2 (7,52 versus

6,6), sendo a medida do grupo G1 (4,92) significativamente maior do que as demais.

Portanto, é possível concluir que o DMSO não exerceu efeito neuroprotetor

me relação aos prejuízos de memória operacional observados em todos os grupos,

exceto o grupo Controle (G1).

Avaliação de expressâo gênica. Análise descritiva da expressão de IL-1β

Descreve-se o comportamento da variável de interesse com os resultados

da análise molecular de interleucina 1 beta (IL-1β).

Tabela 10 – Medidas descritivas da variável de interesse, por grupo.

Grupo Média DP EPM CV Mínimo Máximo Controle 0,70 0,35 0,15 49,36% 0,28 1,11

STZ 1,14 0,54 0,24 47,31% 0,50 1,66 STZ + DMSO 0,75 g/kg 1,27 0,32 0,14 25,07% 0,75 1,55 STZ + DMSO 1,5 g/kg 0,97 0,28 0,13 29,19% 0,57 1,31

DP: desvio padrão; EPM: erro padrão da média; CV: coeficiente de variação.

64

Pela Tabela 10, nota-se que para a Quantificação Relativa, obtida por meio

da análise molecular de IL-1β, os animais do grupo controle apresentaram a menor

média geral (0,70), assim como a maior dispersão em torno da média, com

coeficiente de variação de 49,36%. O grupo STZ + DMSO 1,5 g/kg apresentou a

segunda menor média de 0,97,ao passo que os grupos STZ e STZ + DMSO 0,75

g/kg apresentaram as maiores médias entre os demais grupos, de 1,14 e 1,27,

respectivamente, sendo que a dispersão entre as observações foi maior para o

grupo STZ (coeficiente de variação de 47,31%), em relação ao grupo STZ + DMSO

0,75 g/kg (coeficiente de variação de 25,07%, menor entre todos os grupos).

Figura 7 – Boxplots das da variável de interesse IL1-β, por grupo. – Nota-se tendência de redução na expressão de IL1-β no grupo G4 quantitativa e relativamente comparado aos grupos STZ (G2, G3, e G4)

A Figura 7 apresenta graficamente os resultados das médias das variáveis

de interesse para cada grupo em relação às análises moleculares de IL1-β. Como já

descrito anteriormente, os animais do grupo controle e STZ + DMSO 1,5 g/kg

apresentam, em geral, menores valores da quantificação relativa em relação aos

outros grupos avaliados, enquanto que os grupos STZ e STZ + DMSO 0,75 g/kg

apresentam os maiores valores, sendo que para esse último grupo, os valores

encontram-se menos dispersos.

65

Figura 8 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da variável de interesse IL1-β, por grupo. – Nota-se tendência de redução da expressão gênica da IL1-β em G4.

A Figura 8 apresenta graficamente as médias da variável de interesse por

grupo, e respectivos erros padrões, relatadas na Tabela.

Comparação da expressão de IL1-β

A seguir, são apresentados os resultados dos testes para comparação das

variáveis de interesse entre os grupos, por meio na ANOVA. A quantificação relativa

e o grupo foram considerados como variáveis resposta e independente,

respectivamente. Tabela 11 – Resultados da ANOVA para a variável de interesse.

GLn GLd F Valor p 3 16 2,039 0,149*

GLn: Graus de liberdade do numerados; GLd: Graus de liberdade do numerador; * Valor es

significativos quando p <= 0,05.


principal dos grupos não se mostrou significativo para RQ (F3,16 = 2,039, p = 0,149),

66

ao nível de 5% de significância, indicando que as médias da variável não diferem

significativamente entre os grupos.

Para avaliar entre quais grupos a variável difere significativamente, o teste

de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado, cujos resultados são apresentados

a seguir.

Tabela 12 – Médias (das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre os grupos.

Controle STZ STZ + DMSO 0,75

g/kg STZ + DMSO 1,5

g/kg 0,70 a 1,14ª 1,27 a 0,97 a

Como descrito anteriormente, o efeito principal do grupo não foi significativo

para a variável quantificação relativa, sendo que os resultados do teste de Tukey

apresentados na Tabela 3 corroboram esta informação, uma vez que a média de

nenhum dos grupos difere significativamente em relação aos demais. Portanto, não

houve diferenças na expressão do gene IL1-β no hipocampo dos diferentes grupos

experimentais.

Avaliação da expressão gênica do fator de necrose tumoral α (TNFα) Análise descritiva do TNFα

Tabela 13 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular TNF.




Pela Tabela 13, nota-se que para a quantificação relativa obtida por meio da

análise molecular do TNF, os animais do grupo controle apresentaram a menor

média geral (0,66), enquanto que os animais do grupo STZ apresentaram a maior

dispersão em torno da média, com coeficiente de variação de 39,90%. O grupo STZ

67

+ DMSO 1,5 g/kg apresentou a segunda menor média de RQ, de 1,10, ao passo que

os grupos STZ e STZ + DMSO 0,75 g/kg apresentaram as maiores médias entre os

demais grupos, sendo ambas próximas (1,22 e 1,23, respectivamente).

Figura 9 – Boxplotsda quantificação relativa,por grupo, para a análise molecular TNFα. – Nota-se tendência de redução da expressão de TNFα no G4 comparativo aos grupos STZ (G2, G3, G4).

A Figura 9 apresenta graficamente os resultados da quantificação relativa

para cada grupo em relação às análises moleculares de TNF. Os animais do grupo

controle apresentam, em geral, menores valores de quantificação relativa em

relação aos outros grupos avaliados, enquanto que os grupos STZ e STZ + DMSO

0,75 g/kg apresentam os maiores valores, sendo que para esse último grupo, os

valores encontram-se menos dispersos.

68

Figura 10 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular TNFα.- Nota-se tendência de redução comparativa aos grupos STZ na expressão de TNFα no G4.

A Figura 10 apresenta graficamente as médias da variável de interesse por

grupo, e respectivos erros padrões, relatadas na Tabela 13.

Comparações da expressão do TNFα

Os resultados dos testes para comparação da quantificação relativa

(variáveis resposta) entre os grupos (variável independente) foi executado por meio

da ANOVA.

Tabela 14 - Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise molecular TNF.

GLn GLd F Valor p 3 16 2,366 0,109

GLn: Graus de liberdade do numerados; GLd: Graus de liberdade do numerador; * Valor p < 0,05.


principal dos grupos não se mostrou significativo para a variável RQ (F3,16 = 2,366, p

= 0,109), ao nível de 5% de significância, indicando que as médias da quantificação

relativa não diferem significativamente entre os grupos.

69


de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.

Tabela 15 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre os grupos para a análise molecular TNF.

Controle STZ STZ + DMSO 0,75 g/kg

STZ + DMSO 1,5 g/kg

0,66ª 1,22ª 1,23 a 1,10 a

Como descrito anteriormente, o efeito principal do grupo não foi significativo

para a quantificação relativa da variával TNFα, sendo que os resultados do teste de

Tukey apresentados na Tabela 15 corroboram esta informação, uma vez que a

média de nenhum dos grupos difere significativamente em relação aos demais.

Portanto, não houve diferença na expressão de TNFα entre os grupos

experimentais.

Avaliação da expressão gênica da Catalase (CAT)

Análise descritiva da expressão da Catalase (CAT)

O comportamento da variável de interesse, por grupo, é descrito de acordo com os

resultados da análise molecular de catálise (CAT).

Tabela 16 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular CAT.




A Tabela 16 para a variável quantificação relativa, obtida por meio da análise

molecular de CAT, os animais do grupo controle apresentaram a segunda maior

média geral (1,18), enquanto que os animais do grupo STZ apresentaram a maior

média (1,36) além da maior dispersão em torno da média, com coeficiente de

variação de 26,45%. O grupo STZ + DMSO 0,75 g/kg apresentou a segunda menor

70

média de 1,13, enquanto que o STZ + DMSO 1,5 g/kg apresentou a menor média

entre os demais grupos, sendo esta quantia igual a 1,06.

Figura 11 – Boxplots da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular CAT. – Nota-se tendência de redução da expressão gênica da CAT nos grupos tratamento com DMSO (G3 e G4).

A Figura 11 demonstra graficamente os resultados da quantificação relativa

para cada grupo em relação às análises moleculares de CAT. Como já descrito

anteriormente, os animais do grupo STZ + DMSO 1,5 g/kg apresentam, em geral,

menores valores em relação aos outros grupos avaliados, seguidos dos animais do

grupo STZ + DMSO 0,75 g/kg. Por outro lado, confirma-se visualmente que os

grupos STZ e controle apresentam os maiores valores, sendo que para esses

grupos, os valores se encontram de forma mais dispersa.

71

Figura 12 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular CAT.- Nota-se tendência de redução da expressão gênica da CAT nos grupos tratamento com DMSO (G3 e G4).

As médias da variável de interesse, separadas por grupo, são apresentadas

graficamente pela Figura 12 , além dos seus respectivos erros padrões, relatados na

Tabela .

Comparações da expressão da catalase (CAT)

A seguir, são apresentados os resultados dos testes para comparação da

quantificação relativa (variáveis resposta) entre os grupos (variável independente),

por meio na ANOVA.

Tabela 17 – Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise molecular CAT.

GLn GLd F Valor p 3 15 1,361 0,293


A partir do que é exposto na Tabela 8, vê-se que o efeito principal dos

grupos não se mostrou significativo para a variável RQ (𝐹3,15 = 1,361, p = 0,293), ao

nível de 5% de significância, indicando que as médias da quantificação relativa não

diferem significativamente entre os grupos.

72

Para avaliar entre quais grupos difere significativamente, o teste de

comparações múltiplas de Tukey foi aplicado

Tabela 18 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre os grupos para a análise molecular CAT.


STZ + DMSO 1,5 g/kg

1,18 a 1,36 a 1,13 a 1,06 a

Concordando com o resultado da ANOVA visto anteriormente, vê-se na

Tabela 18 que na quantificação relativa, a média de nenhum dos grupos difere

significativamente em relação aos demais, considerando um nível de 5% de

significância. Portanto, não hove diferença na expressão de CAT nos grupos

experimeitais.

Avaliação da expressão do Fator neurotrófico derivado cerebral (BDNF)

Análise descritiva do BDNF

O comportamento da variável de interesse, por grupo, é descrito de acordo

com os resultados da análise molecular do fator neurotrófico derivado do cérebro

(BDNF).

Tabela 19 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular de BDNF.




Nota-se que para a quantificação relativa, obtida por meio da análise

molecular de BDNF na Tabela 19 , os animais do grupo controle apresentaram a

maior média geral (1,11), enquanto que os animais do grupo STZ + DMSO 0,75

g/kg apresentaram a menor média geral (0,64) além da maior dispersão em torno da

73

média, com coeficiente de variação de aproximadamente 63,73%. O grupo STZ +

DMSO 1,5 g/kg apresentou a segunda maior média de 0,93, ao passo que s grupo

STZ teve a segunda menor medida média (0,67), tendo o menor coeficiente de

variação entre os grupos (13%).

Figura 13 – Boxplots da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular BDNF. – Nota-se tendência de aumento da expressão de BDNF em grupo tratamento com DMSO (G4)

A Figura 13 apresenta graficamente os resultados da quantificação relativa

para cada grupo em relação às análises moleculares de BDNF. De forma análoga ao

que foi visto anteriormente, os animais do grupo controle apresentam, em geral,

maiores valores em relação aos outros grupos avaliados, enquanto que os grupos

STZ e STZ + DMSO 0,75 g/kg apresentam os menores valores, sendo que para

esse último grupo, os valores encontram-se mais dispersos.

74

Figura 14 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular BDNF. – Nota-se tendência de aumento na expressão gênica de BDNF no grupo tratamento com DMSO (G4).

As médias da variável de interesse, por grupo, são apresentadas

graficamente na Figura 14 , além dos seus respectivos erros padrões.

Comparações da expressão do BDNF

Apresentamos os resultados dos testes para comparação da quantificação

relativa (variáveis resposta) entre os grupos (variável independente), por meio na

ANOVA.

Tabela 20 – Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise molecular BDNF.

GLn GLd F Valor p 3 16 3,477 0,041*


De acordo com o que é exposto por meio da Tabela 20, vê-se que o efeito

principal dos grupos se mostrou significativo para a variável RQ (F3,16 = 3,477, p =

0,041), ao nível de 5% de significância, indicando que as médias da quantificação

relativa diferem significativamente entre ao menos um par de grupos.

75


de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.

Tabela 21 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre os grupos para a análise molecular BDNF.


STZ + DMSO 1,5 g/kg

1,11 a 0,67 ab 0,64 b 0,93 ab

A partir da Tabela 21 são expostos os resultados do teste de Tukey para as

médias da quantificação relativa considerando os grupos do estudo. Vê-se que a

média da quantificação relativa do grupo controle, de 1,11, difere significativamente

da média do grupo STZ + DMSO 0,75 g/kg (0,64), enquanto não há evidências

amostrais de diferenças significativas entre os demais grupos. Portanto, as análises

de expressão de BDNF mostraram diferença significativa para o grupo STZ-icv +

DMSO 0,75 g/kg isoladamente, e sem diferenças nos demais grupos experimentais.

Discussão

Nos experimentos do estudo em questão, buscou-se avaliar um tratamento

direcionado ao modelo animal representativo da doença de Alzheimer do tipo

esporádica. Apesar da complexidade da doença, motiva-se um tratamento eficaz

que possa minimizar efeitos da degeneração hipocampal.

A análise de memória de referência em ratos que receberam STZ-icv

refletem o funcionamento de habilidades perceptivas e motoras sem o pensamento

consciente e dependente de áreas motoras (cerebelo e gânglios basais), discutindo-

se real envolvimento do hipocampo nessa tarefa.

A caracterização da memória operacional (de curto prazo), sua conversão

em longo prazo como explícita (não declarativa na espécie animal) tem papel nas

respostas de navegação espacial, e dependente da formação hipocampal e

conexões corticais adjacentes.

Morris em 2013 [20] demostra a codificação conjunta de informações onde

se integra o objeto visual (piscina) ao ambiente espacial para criar uma memória de

representação espacial total e separação de contextos em padrões: semelhantes ou

76

distintos, assim como a conclusão do mesmo padrão associado ao estímulo inicial.

Tal informação segue via específica no hipocampo, iniciada no giro dentado, CA1-

CA3 - place cells, e retornando à CA3.

A capacidade de aprender a antecipar eventos em tarefas repetitivas é

chamada de aprendizagem associativa permitindo flexibilizar estratégias e

sugestões executivas [21]. Dessa forma, os métodos de pesquisa em análise

comportamental experimental apoiam que suas variáveis são buscadas no ambiente

em que o indivíduo se comporta (por exemplo, na busca da plataforma submersa)

[22] modificando o ambiente ou estímulo sobre o comportamento, (por exemplo, na

mudança de pontos de saída do animal testado, ou a mudança do local da

plataforma submersa) e com isso definir o Padrão de Procedimento Operante Livre,

onde o sujeito pode responder livremente sem restrições do experimentador [23].

Os animais de estudo não possuem experiências externas. Estudos de

perspectiva de tempo para comportamento coletivo, segundo Biro e colaboradores

[24] demonstram a tendência coletiva comportamental, com padrões em nível de

grupo, onde pode se definir capacidades adaptativas e cumulativas em inúmeras

espécies vivas, desde microorganismos, plantas, invertebrados e vertebrados

sociais. Denomina-se inteligência de enxame – swarm intelligence, sugerindo redes

de conectividade funcional intrínsecas.

Knezovic e colaboradores [25] estudaram marcadores temporais estruturais

e neuropatológicos do modelo da STZ-icv em roedores por 9 meses. Os resultados

mostraram prejuízo cognitivo predominante no domínio da memória, caracterizados

por perda de neurônios hipocampais CA1-CA3 e, alterações neurofibrilares,

afilamento cortical parietal e de corpo caloso, mais evidentes aos 3 meses da

exposição, com extensão progressiva.

De forma semelhante, em pacientes com demência tipo Alzheimer

prodômica, o comprometimento de redes em conectividade modificam

processamento de funções específicas como atenção e memória episódica.

Também são observados tardiamente o comprometimento motor e memória espacial

segundo Koch e colaboradores [26].

Os resultados dos experimentos do labirinto aquático de Morris para as

avaliações de tarefas de memória de referência, extinção da memória aprendida e

operacional não demonstraram desempenhos mais robustos com a proposta

terapêutica do DMSO. Possivelmente esse resultado seja devido ao período de

77

tempo de tratamento, dose e intervalo de evolução da administração da STZ-icv e

início dos testes comportamentais.

Vale lembrar que roedores podem se deslocar em labirintos de diversas

formas, sem utilizar a memória para o cumprimento das tarefas [27], ou seja,

processos não cognitivos, sendo igualmente importante destacar a janela de tempo

entre a administração da STZ, tratamento com DMSO, e início dos testes

comportamentais.

Nos resultados da memória de referência, os efeitos de interações de grupo,

sessões e tentativas expressam a precisão espacial ao longo do tempo, uma vez

que os animais podem aprender a tarefa mesmo com extensas lesões hipocampais,

porém em uma taxa relativamente menor que animais Controle.

Foi possível observar prejuízos de memória nos grupos STZ, ao passo que o

Controle obteve os melhores desempenhos. Além disso, a STZ induziu

comportamentos relacionados à ansiedade, como a maior velocidade de nado,

sugerindo hiperatividade motora. O DMSO não exerceu nenhum efeito positivo sobre

tais prejuizos.

Estudos de Singh, Kaur, e Sandhir [28] relacionam um novo paradigma na

avaliação da memória espacial e aprendizagem no labirinto aquático: a Dimensão

fractal do caminho aleatório seguido pelos animais, como parâmetro independente e

mais preciso na avaliação de déficits cognitivos em comparação à latência de

escape, trajeto e velocidade.

É possível ainda, relacionar o condicionamento clássico de reflexos

relacionados à estímulos e respostas. Ivan Pavlov, na “psicologia da aprendizagem”,

a define: “conforme o estado do meio ambiente, gerando adaptações do organismo

e exigindo modificações comportamentais” [29].

Davis e colaboradores relacionam que fatores estressantes nos protocolos

de treinamento do labirinto aquático (medo, procedimentos cirúrgico-terapêuticos)

que podem mascarar a verdadeira capacidade cognitiva dos animais [30].

Outro processo amplificado na doença de Alzheimer, a neuroinflamação, foi

caracterizada pela expressão gênica de IL1-β e TNFα como citocinas pró-

inflamatórias.

De Lucca e colaboradores [31] compartilham o papel de neurônios, células

gliais (astrócitos e micróglia) e matriz extra-celular na homeostase da unidade

neurovascular, implicando que, a rotura da barreira hematoencefálica projeta a

78

progressão neuropatológica [32,33]. Ainda assim, limita-se a produção de anticorpos

anti-Aβ na eliminação de oligômeros amilóides [34] e sustenta-se a neuroinflamação

crônica segundo Shaftel e colaboradores [35], associado a recente papel de canais

de aquaporina 4 no trafego glial-linfático comprometido [37,14].

A análise de expressão de genes inflamatórios IL1-β e TNFα no trabalho

presente não se mostraram diferenças estatísticas entre grupos experimentais, mas

nota-se tendências de redução na expressão gênica de IL1-β, TNFα, no grupo

tratamento com DMSO à dose de 1,5 g/kg, podendo se relacionar papel citoprotetor

no ambiente inflamatório induzido da STZ.

Estudos de Mao e colaboradores, [36] demonstram que o acúmulo anormal

de oligômeros amilóides foi reduzido pela ativação de enzimas antioxidantes

mitocondriais (catalase).

O modelo indutor da STZ-icv promove elevações significativas da atividade

específica da catalase (CAT) expressa no tecido hipocampal, conforme estudos de

Sofic [38]. A geração expansiva de peróxido de hidrogênio (H2O2) ativa a

neutralização pela CAT, com capacidade de degradação de até 42.000 moléculas do

substrato por segundo. Nossos resultados não demonstraram variação significativa

da expressão gênica da catalase nos grupos experimentais, observando-se

tendências de neutralização da atividade enzimática na captura de espécies reativas

do estresse oxidativo nos grupos tratamento com DMSO (G3 e G4) através da

menor expressão gênica da CAT.

Na doença de Alzheimer, ocorre também redução dos níveis de BDNF com

modificação de seus transcritos e expressão proteômica afetando plasticidade

sináptica, brotamento dendrítico-axonal e sobrevivência neuronal [39].

A expressão de BDNF em hipocampos de ratos induzidos quimicamente,

melhora o comprometimento cognitivo em aprendizagem e memória, envolvendo via

PI3K – AKT- GSK3β, destacando-se seu potencial efeito protetor na

neuroregeneração da doença de Alzheimer [40]. Sua regulação positiva melhora

plasticidade sináptica e colinérgica, facilitando amadurecimento de brotamento

neuronal, principalmente em estágios iniciais da neurodegeneração [39]. O presente

estudo demonstrou aumento na expressão gênica do BDNF em doses de 1,5 g/kg

(G4) relacionando-se papel neuroprotetor em potencial .

A expressão gênica envolvida com neuroinflamação, IL1-β e TNFα, estresse

oxidativo mitocondrial com CAT, e ativação neurotrófica com BDNF mostram que

79

não houve efeito estatístico no pareamento de grupos. Relacionam-se porém,

tendências de redução da neuroinflamação e neutralização de estresse oxidativo, o

que promove ambiente celular mais favorável em nível molecular, corroborando o

aumento da expressão comparativa do BDNF em animais tratados com o DMSO 1,5

g/kg, sendo estes, efeito parcial sobre a modulação pró-inflamatória, diminuição de

estresse oxidativo mitocondrial e ativação neurotrófica.

A biotecnologia contribui com a busca por moléculas biologicamente ativas,

como exemplo em novas aplicações de inibidores da enzima colinesterase central

[41], imunoterapia para peptídeo β-amilóide e proteína Tau [42], neuroinflamação

[43], aplicações nanotecnológicas [44], fatores neurotróficos [45] e modulação de

receptores de glicação avançada [46}. No entanto, os efeitos sobre a diminuição da

progressão neurodegenerativa ainda são pouco expressivos.

O presente estudo buscou avaliar o efeito do DMSO em nova base

molecular terapêutica no sistema nervoso central, uma vez que suas propriedades

químicas e moleculares podem resgatar funções celulares restritas pelo processo

neurodegenerativo.

Singh [47] define o termo farmacológico - híbrido - para ação compartilhada

molecular de funções, em alvos terapêuticos na doença de Alzheimer, corroborando

conteúdos de Weinreb e colaboradores [48], onde os efeitos neuroprotetores de

agentes híbridos em ações sobre mais de um alvo potencial terapêutico

neurodegenerativo. Farkas [49] propõe o DMSO com características moduladoras e

neuroprotetoras do sistema nervoso central e, em estudos da distribuição do DMSO

em animas de experimentação, Denko [50] demonstra a equivalente distribuição no

sistema nervoso central sem efeitos cumulativos e eliminação em 12 a 36 horas.

Ações na memória espacial, melhora de densidade e plasticidade sináptica

hipocampal, principalmente em estrato CA1 de células piramidais, são elementos da

relevância farmacológica do DMSO em estudos de Penazzi [51] assim como a

inibição da enzima GSK-3β e redução de acúmulos amilóides por Jiang [52].

Propriedades antioxidantes em estudos de Sanmartin-Suarez [53] demonstram a

versatilidade molecular do DMSO aplicada á neurodegeneração.

Dentre as doenças neurodegenerativas conformacionais do tipo

proteinopatias, é possível destacar estudo de Shaked e colaboradores [54],

demonstrando efeitos positivos no uso do DMSO em hamsters infectados com

proteína priônica scrapie (Prp sc) e atenuando os sintomas da doença nos animais

80

infectados [54], reforçando trabalhos de Pruisner [55], na modulação do

enovelamento proteico pelo DMSO.

O presente estudo demonstrou tendências de modulação pró-inflamtória e

do estresse oxidativo mitocondrial, modificando a ativação sequencial reverberativa

neurodegenerativa e promovendo tendências de resgate neurotrófico com o BDNF

através do tratamento com DMSO na dose 1,5 g/ kg.

Conclusões

A neurodegeneração representa um complexo de determinantes ativadores

em etapas de processo sustentado à morte celular irreversível.

O estudo da proposta terapêutica no uso do DMSO no modelo da STZ, não

revelou melhora significativa em testes comportamentais e de memória espacial.

A expressão gênica neuroinflamatória e oxidativa mitocondrial revelaram

tendências de elementos em neuroproteção com tratamento pelo DMSO à 1,5 g/ kg,

onde criou-se o ambiente celular favorável molecular e fisiologicamente,

corroborando com a expressão do BDNF por este mesmo grupo, sendo elemento

significativo na plasticidade sináptica hipocampal e sobrevivência neuronal.

São necessários estudos expandidos na corrente proposta neuroprotetora,

principalmente em doses, tempo e forma de administração, no uso extensivo do

produto, podendo-se assim, intensificar respostas terapêuticas mais robustas e

efetivas.

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CONCLUSÕES GERAIS

A neurodegeneração, representada na doença de Alzheimer, compromete

funções cognitivas principalmente relacionadas à memória explícita sem haver

tratamento curativo.

O modelo da estreptozotocina intracérebroventricular em roedores tem como

alvo direto, a formação hipocampal. Análises em parâmetros comportamentais e de

memória espacial, expressão gênica neuroinflamatória, oxidativa mitocondrial e

neurotrófica nos grupos submetidos a tratamento com o dimetilsulfóxido (DMSO)

desenham o experimento.

Através de características bioquímicas e moleculares versáteis, o DMSO

pode exercer papel neuroprotetor na neurodegeneração da doença de Alzheimer.

Os resultados do estudo não modificaram parâmetros comportamentais e de

memória espacial, e análises de expressão gênica demonstram tendências em

redução neuroinflamatória e de estresse oxidativo mitocondrial, com a minimização

de cascatas neurodegenerativas sustentadas, e proporcionando ambiente de

resgate neurotrófico potencial com o BDNF através do tratamento com DMSO (1,5

g/kg).

Novas inserções de dosagens, tempo e via de administração, podem

acrescentar em resultados favoráveis no tratamento da função neuroprotetora do

DMSO frente à doença progressiva e neurodegenerativa.

87

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MOLECULAR ANALYSIS OF GENE EXPRESSION IN WISTAR RATS

SUBMITTED TO STREPTZOTOCIN INTRACEREBROVENTRICULAR (STZ-ICV)

AND EXPERIMENTAL TREATMENT WITH DIMETHYLSULFOTOXIDE (DMSO)

Valter Malaguido Climaco; Rebecca Marty Pimentel Machado; Marcia Regina

Pincerati; Ilton Santos da Silva. Positivo University: 5300 Professor Pedro Viriato

Parigot de Souza Street – Campo Comprido – Curitiba - Paraná – Brazil zipcode

81280-330 Phone +55 (41)33173000 Email: [email protected]

ABSTRACT

Alzheimer's disease represents the most frequent and prevalent

neurodegenerative process in the adult population related to genetic and

environmental factors, without curative treatment even with current technological

innovations. In this way, it is important to search for therapeutic proposals that

minimize or even interrupt the common neurodegenerative processes of the disease.

Dimethylsulfoxide (DMSO) has great molecular versatility, therefore, a potential

neuroprotective effect. Intracerebroventricular streptozotocin (STZ-icv) induced

neurodegeneration in rodents leads to a neuropathological phenotype similar to

sporadic Alzheimer's disease. The objective of the present study is to investigate the

potential neuroprotective effect of DMSO on memory impairment induced by STZ in

Wistar rats, with molecular analyzes performed by hippocampal extraction through

qPCR investigating the expression profile of genes related to neuroinflammation

(interleukin 1β; IL 1-β, tumor necrosis factor α: TNF-α), reactive species of

mitochondrial oxidative stress (catalase; CAT), and activator of adult neurogenic

99

neurotrophic factor (BDNF), where reduction of neuroinflammation by minimizing the

expression of IL1-β, TNFα, of the mitochondrial oxidative stress with CAT

consumption in the capture of reactive oxygen species, and increased expression of

BDNF at the dose of 1.5 g / kg in the DMSO treatment group, related to cellular

environment favorable to cellular neuroprotection and survival against

neurodegenerative induction.

Keywords: Alzheimer's disease. Dimethylsulfoxide. Streptozocin.

INTRODUCTION

Alzheimer's disease is the most frequent and prevalent neurodegenerative

process common to aging, accounting for 6% of the population over 65 years and

has no curative treatment [1]. Clinically, it compromises explicit memory functions

dependent on hippocampal formation, in addition to other cognitive impairments [2].

It extends to the medial, prefrontal and parietal temporal cortex with the

deposition of cytoplasmic neurotoxic amyloid protein in beta-conformation (Aβ 42),

and neuronal accumulation of microtubule-associated protein (Tau) in the

hyperphosphorylated state [3-5]. There is impaired glucose metabolism and insulin

signaling, where it activates the enzyme GSK-3β, increased production of

proinflammatory cytokines, blood-brain barrier opening and mitochondrial oxidative

stress [6]. The irregularity of the protein conformation promotes insolubility and

aggregation, with consequent loss of signaling of the autophagic system, folding

proteins, chaperones [7] and expression of neurotrophins [8].

100

Intracerebroventricular (icv) streptozotocin (STZ) induces a neuronal state

equivalent to Alzheimer's disease. Its mechanism of action involves insulin metabolic

blockade and glucose transport via GLUT 1 2 3 receptors. In addition, biochemically

facilitates amyloid formation (Aβ 42) and hyperphosphorylation of the TAU protein [9],

which contributes to the reproduction of the anatomopathological characteristics of

the disease. Experimentally, it is possible to observe memory impairments in animals

that received STZ-icv in tasks of the Morris water maze, because to fulfill tasks of

spatial memory, the integrity of the hippocampal formation is necessary [10].

Molecular analyzes of the expression of genes of pathological activating

cycles of neuroinflammation (IL-1β, TNF-α), mitochondrial oxidative stress (CAT),

neurotrophic factor derived from encephalon (BDNF) [5,11] are elements of

reverberant and self-sustained processes of the disease. DMSO therapy

demonstrates versatility in interaction with molecular sharing with water [12] and

interconversion of the compound (Water-DMSO) in equilibrium [7]. It acts on the

surface hydration of proteins, modifying H + bridges, and facilitates action of folding

helper proteins, chaperones. In addition, it reduces inflammatory activation and

promotes the capture of reactive species of the mitochondrial cycle possessing

antioxidant action [13,14].

Studies in rodents of Jacob and de la Torre [15] have demonstrated efficacy

of venous DMSO use at 40% concentration in spinal cord injury and acute carotid

vascular occlusion, as well as Penazzi et al. [16], in a study with chronic and oral to

1% of DMSO, positively modulating budding of pyramidal hippocampal dendritic

spines. Another study depicts the competitive inhibition of the cholinesterase enzyme

in vitro by Kumar with satisfactory results [17].

101

The objective of the present study was to investigate the potential

neuroprotective effect of DMSO on memory impairment induced by STZ in wistar

rats.

MATERIAL AND METHODS

Animals

Thirty-two male Wistar rats aged 90 days old were used. The animals had free

access to food and water. Environmental conditions include a light/dark cycle of 12h

each and a temperature of 21° C (69,8° F).

Stereotactic surgery for administration of STZ and treatment with DMSO

STZ-icv (3 mg/kg) is administered through stereotactic surgery in coordinates

according to Paxinos and Watson [18]. For group 1 (control), buffered solution is

injected into the same volume used for STZ administration.

Following administration of STZ (24h), animals in groups 3 and 4 received

doses of DMSO intraperitoneally for 5 consecutive days. The control group received

the same doses and volumes of 0.9% saline solution via i.p. Thus, four distinct

groups were formed:

- Group (1) saline control: Animais that received a buffer solution citrate (at the same

time used to dilute to STZ) via icv e saline solution 0.9% by intraperitoneal route;

- Group (2) STZ: animals that receive STZ via icv and saline 0.9% i.p;

- Group (3) STZ + DMSO 0.75g/Kg: group that receives STZ via icv e DMSO via i.p.

Concentration from 0.75g/Kg to 40%, diluted in 0.9% saline;

102

- Group (4) STZ + DMSO 1,5g/Kg: group that receives STZ via icv e DMSO via i.p.

Concentration from 1.5g/Kg to 40%, diluted in 0.9% saline.

The choice of doses and procedures were based on the description of

Bardutzky J et al (2005) and Jacob SW, dela Torre JC (2009).

RNA extraction and expression analysis of interleukin 1-β (IL-1β), catalase

(CAT), tumor necrosis factor alpha (TNFα) and brain derived neurotrophic

factor (BDNF)

The animals were euthanized by constant inhalation of isoflurane and the

dissected brains for bilateral hippocampal withdrawal. Afterwards, the samples were

stored in a preservative solution (RNA later - Thermo Scientific) at a temperature of -

20º C (-4° F). For extraction of RNA the extractor kit - SV total RNA Isolation Kit

(Promega) was used, according to manufacturer's instructions. After extraction, the

RNA was quantified and its purity was evaluated by spectrophotometry.

The extraction of 1 microgram of total RNA was used for the cDNA synthesis,

with the enzyme reverse transcriptase with High Capacity cDNA Reverse

Transcription Kit (Applied biosystems). Subsequently, the cDNA was submitted to the

quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) to evaluate the expression profile

of the CAT, IL-1β, TNFα and BDNF genes in the hippocampus of the different

groups.

The fluorescence system used for the amplification was the Power Up

SYBR-Green qPCR Master mix (Thermofisher) fluorophore according to the

manufacturer's instructions and reactions in the Step One Plus thermocycler (Life

Technologies) to determine the levels of mRNA expression in the different groups.

103

Data analysis

The values obtained in the relative quantification of the genes under study

were submitted to normality tests and Variance Analysis for Repeated Measurements

(ANOVA) tests were used. The molecular parameters were considered as dependent

variables and the experimental groups as independent variables with a significance

level set at 5% and Tukey's post hoc multiple comparison test to identify the origins

of the differences.

RESULTS

Evaluation of gene expression by real-time PCR

Specific gene signatures establish a self-sustaining system of

neurodegeneration. Hyperexpressed proinflammatory activation and oxidative stress,

hypoexpressed neurotrophic transcripts mark the disease at the molecular level.

Neutralizing process-defining steps is critical in curative therapy.

Analysis of IL-1β gene expression

104

Figure 1 - Boxplots of the variable of interest IL1-β, by group. - There is a tendency of reduction in the expression of IL1-β in the quantitative G4 group and relatively compared to the STZ groups (G2, G3,

and G4).

The results of the variables averages of interest for each group in relation to

the molecular analyzes of IL1-β demonstrate the animals of the control group and

STZ + DMSO 1.5 g/kg, presenting, in general, lower relative quantification values to

the other groups evaluated; whereas the STZ and STZ + DMSO groups of 0.75 g/kg

had the highest values, and for the latter group, the values were less dispersed.

105

Figure 2 – Mean (and standard error) bar chart of the IL1-β interest variable, per group. - There is a tendency to reduce the gene expression of IL1-β in G4.

The main effect of the groups was not significant (F3,16 = 2,039, p = 0,149),

at the 5% level of significance, indicating that the means of the variable did not differ

significantly between the groups.

106

Analysis of gene expression of tumor necrosis factor α (TNFα)

Figure 3 – Boxplots of relative quantification, per group, for molecular TNFα analysis. - There is a tendency to reduce TNFα expression in G4 compared to STZ groups (G2, G3, G4).

The graphical presentation of the relative quantification results for each group

in relation to the molecular analyzes of TNF demonstrates the animals of the control

group with lower values in relation to the other groups evaluated, whereas the groups

STZ and STZ + DMSO 0.75 g/kg present the highest values, and for the latter group,

the values are less dispersed.

107

Figure 4 – Average (and standard error) bar chart of the relative quantification, per group, for

molecular analysis TNFα.- There is a trend of comparative reduction to STZ groups in expression of

TNFα in G4.

The results of the tests to compare the relative quantification (response

variables) between the groups (independent variable) show that the main effect of

the groups was not significant (F3,16 = 2,366, p = 0,109), at the 5% level of

significance, indicating that the means do not differ significantly between the

experimental groups.

Analysis of Gene Expression of Catalase (CAT)

108

Figure 5 – Boxplots of relative quantification, per group, for CAT molecular analysis. - There is a tendency to reduce CAT gene expression in the DMSO treatment groups (G3 and G4).

The graphic demonstration of the results of the relative quantification for each

group in relation to the molecular analyzes of CAT relates the animals of the STZ +

DMSO group 1.5 g/kg, which generally have lower values in relation to the other

groups evaluated, followed by the animals of the STZ + DMSO group 0.75 g/kg. On

the other hand, it is visually confirmed that the STZ and control groups present the

highest values, and for these groups, the values are more dispersed.

109

Figure 6 – Average (and standard error) bar graph of relative quantification per group for CAT analysis. There is a tendency for CAT gene expression reduction in the DMSO (G3 and G4) treatment

groups.

It is seen that the main effect of the groups was not significant (𝐹3,15 = 1,361,

p = 0,293), at the 5% level of significance, indicating that the means of relative

quantification did not differ significantly between the experimental groups.

Analysis of Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)

110

Figure 7 – Boxplots of relative quantification, per group, for molecular analysis BDNF. - There is a tendency for increased expression of BDNF in the treatment group with DMSO (G4)

The results of the relative quantification for each group in relation to the

molecular analyzes of BDNF graphically show, in the animals of the control group, in

general, higher values in relation to the other groups evaluated, whereas the groups

STZ and STZ + DMSO 0,75 g/kg had the lowest values, and for the latter group, the

values were more dispersed and the main effect of the groups was significant (F3,16 =

3,477, p = 0,041), at the 5% level of significance, indicating that the means differ

significantly in the STZ + DMSO group 0.75 g/kg (0.64), alone, and without

differences in the other experimental groups.

111

Figure 8 – Average (and standard error) bar graph of relative quantification, per group, for molecular BDNF analysis. - There is an upward trend in BDNF gene expression in the DMSO (G4) treatment

group.

It is noted that the experimental group DMSO 1.5 g/kg conducts gene

expression of BDNF equivalently to the control group, being thus an element of

interest in the therapeutic neuroprotective proposal.

DISCUSSION

Knezovic et al. [19] studied structural and neuropathological temporal

markers of the STZ-icv model in rodents for 9 months. The results showed a

predominant cognitive impairment in the memory domain, characterized by loss of

CA1-CA3 hippocampal neurons and neurofibrillary changes, parietal cortical and

corpus callosum, more evident at 3 months of exposure, with progressive extension.

Similarly, in patients with prodromal Alzheimer's dementia, compromised

connectivity networks modify processing of specific functions such as attention and

112

episodic memory. Motor impairment and spatial memory are also observed late

according to Koch and co-workers [20].

Neuroinflammation, as an amplified process in Alzheimer's disease, was

characterized by the gene expression of IL1-β and TNFα as proinflammatory

cytokines.

De Lucca et al. [21] share the role of neurons, glial cells (astrocytes and

microglia) and extracellular matrix in the homeostasis of the neurovascular unit,

implying that rupture of the blood-brain barrier projects neuropathological progression

[22] and [23]. Nevertheless, the production of anti-Aβ antibodies in the elimination of

amyloid oligomers [24] is limited, and chronic neuroinflammation is supported by

Shaftel et al. [25], associated with the recent role of aquaporin 4 channels in glial-

lymphatic traffic compromised [14,26].

Amyloid deposits and the hyperphosphorylated state of Tau protein are

factors of neuroinflammation in neurodegeneration [1] with microglial and astrocytic

activation, and promotion of secretion of proinflammatory cytokines type IL-1β, TNFα,

IL-6, Infγ, membrane metalloproteases, and NFK-β nuclear transcriptional factor

contributing to the systemic lymphocyte recruitment process via type II

histocompatibility complex (MHC II) as well as the abnormal processing of micro-

RNAs (mir155; mir 204) [1,27].

The inflammatory activation evolves over the immunological constituents with

glycolytic enzyme blockade, mitochondrial impairment, signaling of cell survival

pathways and loss of synaptic axonal accumulation [27-29].

Analysis of IL1-β and TNFα inflammatory gene expression in the present

study did not show statistical differences between experimental groups, but there

was a trend of reduction in the gene expression of IL1-β, TNFα, in the DMSO

113

treatment group at the dose of 1,5 g/kg, cytoprotective role may be related to the STZ

induced inflammatory environment..

Studies by Mao et al. [30] show that the abnormal accumulation of amyloid

oligomers was reduced by the activation of mitochondrial antioxidant enzymes

(catalase).

The inducer model of STZ-icv promotes significant elevations of specific

activity of catalase (CAT) expressed in hippocampal tissue, according to Sofic

studies [31]. The expansive generation of hydrogen peroxide (H2O2) activates the

neutralization by CAT, with the degradation capacity of up to 42,000 substrate

molecules per second.

Neurotoxic changes converge to the permeabilization of mitochondrial

membranes, associated with intracellular calcium influx, with involvement of oxidative

phosphorylation in the respiratory chain and overexpression of reactive oxygen and

nitrogen species [32].

These elements favor the flow of electrons from NADH to molecular oxygen in

the production of ATP, reducing antioxidant and neuroprotective elements such as

glutathione peroxidase (GSH-PX), catalase (CAT), and superoxide dismutase (SOD)

[33] and are consumed the cellular energy reserve with insufficient pathway

transduction in plasticity, polarization and immunomodulation.

Our results did not show significant variation of the catalase gene expression

in the experimental groups, and it was observed tendencies of neutralization of the

enzymatic activity in the capture of reactive species of oxidative stress in the DMSO

treatment groups (G3 and G4) through the lower CAT expression.

114

In Alzheimer's disease, there is also a reduction of BDNF levels with

modification of their transcripts and proteomic expression affecting synaptic plasticity,

dendritic-axonal budding and neuronal survival [34].

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is an important member of the family

of neurotrophins (growth factors) activated via specific receptors, tropomyosin kinase

(TrkB) and p75.

The reduction of BDNF signaling compromises spatial memory, plasticity and

hippocampal synaptic maturation, neurogenesis, and long-term potentiation (LTP) in

the formation of dendritic spines [35], essential factors for the consolidation of explicit

memory.

The aggregated amyloid oligomers in Alzheimer's disease negatively

modulate p75 and TrkB receptors, where PI3K-GSK3β-AKT signaling pathways of

neuronal survival, microtubule rupture with Tau (Thr 231) hyperphosphorylation, and

compromise protein expression are reduced plasticity [36-38].

BDNF expression in chemically induced rat hippocampus improves cognitive

impairment in learning and memory, involving PI3K-AKT-GSK3β pathway, with a

potential protective effect on the neurooregeneration of Alzheimer's disease [36]. Its

positive regulation improves synaptic and cholinergic plasticity, facilitating maturation

of neuronal budding, especially in the early stages of neurodegeneration [34]. The

present study demonstrated an increase in the gene expression of BDNF in doses of

1.5 g/kg (G4) in relation to potential neuroprotective role.

Gene expression involved with neuroinflammation, IL1-β and TNFα,

mitochondrial oxidative stress with CAT, and neurotrophic activation with BDNF show

that there was no statistical effect on group pairing. Neuroinflammation reduction

tendencies and neutralization of oxidative stress, however, promotes a more

115

favorable cellular environment at the molecular level, corroborating the increase in

the comparative expression of BDNF in animals treated with DMSO 1.5 g/kg, partial

effect on proinflammatory modulation, reduction of mitochondrial oxidative stress and

neurotrophic activation.

Biotechnology contributes to the search for biologically active molecules, as

an example in new applications of central cholinesterase inhibitors [39],

immunotherapy for β-amyloid peptide and Tau protein [40], neuroinflammation [41],

nanotechnological applications [42], neurotrophic factors [43] and modulation of

advanced glycation receptors [44]. However, the effects on decreased

neurodegenerative progression are still not very expressive.

The present study aimed to evaluate the effect of DMSO on a new molecular

therapeutic base in the central nervous system, since its chemical and molecular

properties can rescue restricted cellular functions by the neurodegenerative process.

Singh [45] defines the pharmacological-hybrid term for shared molecular

action functions in therapeutic targets in Alzheimer's disease, corroborating content

of Weinreb et al. [46], where the neuroprotective effects of hybrid agents on actions

on more than one target neurodegenerative therapeutic potential. Farkas [47]

proposes DMSO with modulatory and neuroprotective characteristics of the central

nervous system and, in studies of the distribution of DMSO in experimental animals,

Denko [48] demonstrates the equivalent distribution in the central nervous system

without cumulative effects and elimination in 12 to 36 hours.

Actions in spatial memory, hippocampal synaptic density enhancement and

synaptic plasticity, especially in the CA1 stratum of pyramidal cells, are elements of

the pharmacological relevance of DMSO in Penazzi studies [16] as well as the

inhibition of the GSK-3β enzyme and reduction of amyloid accumulations by Jiang

116

[49]. Antioxidant properties in studies of Sanmartin-Suarez [50] demonstrate the

molecular versatility of DMSO applied to neurodegeneration.

Among the conformational neurodegenerative diseases of the proteinopathic

type, it is possible to highlight a study by Shaked et al. [51] demonstrating positive

effects on the use of DMSO in hamsters infected with prion protein scrapie (Prp sc)

and attenuating disease symptoms in infected animals [51] , reinforcing Pruisner's

work [52] in the modulation of protein folding by DMSO.

The present study demonstrated trends in pro-inflammatory modulation and

mitochondrial oxidative stress, modifying sequential neurodegenerative reverberation

activation and promoting neurotrophic rescue tendencies with BDNF by treatment

with DMSO at the dose of 1.5 g/kg.

Conclusions

Neurodegeneration represents a complex of activating determinants in

process stages sustained at irreversible cell death.

The study of the therapeutic proposal in the use of DMSO in the STZ model

did not reveal a significant improvement in behavioral and spatial memory tests.

The neuroinflammatory and oxidative mitochondrial gene expression

revealed tendencies of elements in neuroprotection with treatment by DMSO at 1.5

g/kg, where the molecular environment was created favorable and physiologically,

corroborating with the expression of BDNF by this same group, being element

significant effect on hippocampal synaptic plasticity and neuronal survival.

Further studies are needed in the current neuroprotective proposal,

especially in doses, time and administration, in the extensive use of the product, thus

being able to intensify more robust and effective therapeutic responses.

117

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124

FIGURES

Figure 1 – Boxplots of the variable of interest IL1β, per group. ................................. 07

Figure 2 – Average (and standard error) bar chart of the IL1-β variable of interest,

per group. ................................................................................................................... 08

Figure 3 – Boxplots of relative quantification, per group, for molecular TNF analysis09

Figure 4 – Average (and standard error) bar graph of relative quantification, per

group, for TNF molecular analysis ............................................................................. 10

Figure 5 – Boxplots of relative quantification, per group, for CAT molecular analysis11

Figure 6 – Average (and standard error) bar graph of relative quantification, per

group, for CAT molecular analysis ............................................................................. 12

Figure 7 – Boxplots of the relative quantification, per group, for molecular analysis

BDNF .......................................................................................................................... 13

Figure 8 – Average (and standard error) bar graph of the relative quantification, by

group, for molecular analysis BDNF ........................................................................... 14

125

GENERAL CONCLUSIONS

Neurodegeneration, represented in Alzheimer's disease, compromises

cognitive functions mainly related to explicit memory without curative treatment.

The intracereventricular streptozotocin model in rodents has a direct target,

hippocampal formation. Analyzes in behavioral and spatial memory parameters,

neuroinflammatory gene expression, mitochondrial oxidative and neurotrophic gene

in the groups submitted to treatment with dimethylsulfoxide (DMSO) design the

experiment.

Through versatile biochemical and molecular characteristics, DMSO may

play a neuroprotective role in the neurodegeneration of Alzheimer's disease.

The results of the study did not modify behavioral and spatial memory

parameters, and analyzes of gene expression demonstrate trends in

neuroinflammatory reduction and mitochondrial oxidative stress, with the

minimization of sustained neurodegenerative cascades, and providing potential

neurotrophic rescue environment with BDNF through treatment with DMSO (1.5

g/kg).

New dosage insertions, time and route of administration may add to

favorable results in the treatment of DMSO's neuroprotective function against

progressive and neurodegenerative disease.

126

PREPARAÇÃO DE MANUSCRITOS

MANUSCRIPT INSTRUCTIONS

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127

When submitting the manuscript, the author listing and order should be final. If any addition, deletion, or rearrangement of author names in the authorship list does need to be made after submission, this can be done only before acceptance and with the Editor’s approval. To request such a change, the Editor must receive the following from the corresponding author: (1) the reason for the change in author list and (2) written confirmation from all authors, including the affected author, that they agree with the addition, removal, or rearrangement. Only in exceptional circumstances will the Editor consider the addition, deletion, or rearrangement of authors after the manuscript has been accepted. While the Editor considers the request, publication of the manuscript will be suspended. If the manuscript has already been published in an issue, any requests approved by the Editor will result in an Erratum. Please contact the Managing Editor ([email protected]) for more information. Abstract andKeywords • The abstract should be clear, descriptive, self-explanatory, and no longer than 250 words. • If a structured abstract is desired, the following must be included: Background, Objective, Methods, Results, and Conclusion. • Do not include references in the abstract. • Include a list of 4-10 keywords. These keywords should be terms from the MeSH database. • Note that ALL articles (except book reviews and letters to the editor) must include an abstract. Introduction Provide enough information to put your work into context. Be concise. Clearly address the following points:

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Results

This section should present the results and summarize the findings of your study. Do not provide any data in great detail. If you need to include additional detailed data, do so in supplementary files submitted with the paper. Consider providing a one-

128

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Discussion Begin this section with a brief summary of the main findings. Ensure that you answer all the questions posed in the Introduction. Mention both the strengths and the limitations for your study, as well as applications and implications of your findings. Compare these to other published findings.

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130

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Supplementary material should be included at the end of the main manuscript at the time of submission. In the case of sound/movie files, these can be submitted separately to the Managing Editor ([email protected]) at the time of submission. Supplementary tables and figures must have a separate numbering system from that used for tables and figures that appear in the print version of the paper (the first figure displayed should be labeled "Supplementary Figure 1", the first table "Supplementary Table 1", and so on). References should also be cited in supplements started with [1] and listed separately. Supplementary files are limited to 10MB, except videos which can be up to 25MB.

Supplementary material for Short Communications is limited to 500 words and 1 table or figure.

Reviews Reviews should be authoritative and topical and provide comprehensive and balanced coverage of a timely and/or controversial issue. Reviews should be prepared as detailed above for a Research Report, omitting Introduction through Discussion, and include a conclusion. An abstract must also be included. The length of the review article is at the discretion of the author but should be within reasonable limits. The Editor-in-Chief can be consulted regarding reviews of unusual length. Revisions Revisions should be returned within two months of receiving a decision. Authors needing more time should email the Editor-in-Chief for an extension. When submitting a revised manuscript, please indicate your revisions in the text (either in revision mode or by highlighting) and provide a point-by-point response to the reviews at the beginning of your manuscript. Also include your previous manuscript number in your cover letter.

If you choose not to resubmit to JAD after receiving a decision, please inform the editorial office ([email protected]) that you wish to withdrawn your manuscript from further consideration. Short Communications A short communication is an article of original scholarship of unusual interest of less than 2000 words (Introduction through Discussion). An abstract of 100 words or less should be included with no subdivison of the abstract into sections. References should be formatted as above. A total of three tables and/or

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figures are allowed. Submissions that exceed the word or figure/table limits will be considered a Research Report. Supplementary Material for Short Communications is limited to 500 words and 1 table or figure. Hypotheses A hypothesis article should be a balanced and insightful consideration of a topic with novel hypotheses well presented and supported. The article should be prepared as a Research Report but without Methods or Results sections. An abstract should also be included. Book Reviews Book reviews should be 750 words or less and without sections. While most reviews are commissioned, suggestions can be proposed to the Editor-in-Chief.

Letters to the Editor Authors can submit comments of 1000 words or less concerning prior articles published in JAD to the Editor-in-Chief through the Editorial Office ([email protected]) for possible inclusion at our online site as a Letter to the Editor. Letters will be shared with the authors of the original article for possible response prior to posting. Letters are not included in the published version of JAD nor are indexed in PubMed. Commentaries Commentaries are usually commissioned and of at least 1000 words with a short abstract and no other subdivisions.

Ethics Review The goal of an Ethics Review is to address ethical issues that alter progress in Alzheimer’s disease research, clinical practice, and policy. Ultimately the aim is to highlight and target unresolved issues where failure to act or resolve disagreements leads to bottlenecks in productivity in research, policy, and clinical services. Ethics Review is slightly different from a JAD typical review in that that the topics and presentation are balanced but controversial so that they would likely elicit Ethics Responses. Ethics Responses from multiple disciplines and perspectives are encouraged. Whereas addressing controversial topics is encouraged, reviews should focus on constructively moving debates forward to accelerate progress.

Features of an effective an Ethics Review are as follows:

1. Clearly identify points of disagreement and agreement in the field noting where empirical data are lacking or present that could resolve disagreements. 2. Highlight current empirical findings that are relevant to resolving controversial topics in novel ways with productive cross disciplinary applications. 3. Identify novel applications from fields not typically related to Alzheimer’s research and care which could enhance implementation and ethics. The manuscripts should be consistent with the current standards for the Journal of Alzheimer’s Disease and the Neuroscience Peer Review Consortium. As with other JAD reviews, submissions should be authoritative and topical and provide comprehensive and balanced coverage of a timely and/or controversial issue. Reviews should be prepared as detailed above for a Research Report, omitting

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Introduction through Discussion, and include a conclusion. An abstract must also be included. Ethics Response The purpose of the Ethics Response is to engage interdisciplinary constructive interaction between the author(s) of the Ethics Review and an author who wishes to provide balance and perspective. Authors of an Ethics Response should provide substantive elaboration and references. There should be a title and the number of words can range between 750 to 1500, with no more than 10 citations (reference limit will be less strictly enforced). An abstract should also be included.

The Ethics Review will be distributed and responses will be requested. Potential authors should give a brief synopsis of their response in no more than 4 sentences by the target proposal date. These proposals will be reviewed and if accepted they will be allowed to write an Ethics Response in time for that second deadline. Acceptance of a proposal is no guarantee that the Ethics Response is accepted. The format of the Ethics Responses will be the same as for a Commentary. Kudos Authors of published articles (non-prepress, final articles) will be contacted by Kudos. Kudos is a service that helps researchers maximize the impact and visibility of their research. It allows authors to enrich their articles with lay metadata, add links to related materials and promote their articles through the Kudos system to a wider public. Authors will receive no more than three emails: one invitation and a maximum of two reminders to register for the service and link the published article to their profile. Using and registering for Kudos remains entirely optional. For more information, please have a look at our authors section.

EFEITOS DO DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) SOBRE OS PREJUÍZOS …

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