Doutoranda: Viviane Acunha BarbosaOrientador: Prof.Dr.Cláudio T de Souza

Criciúma-SCCriciúma-SC20092009

EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM

AORTA DE RATOS WISTAR COM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.

Projeto de doutorado apresentado ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde – PPGCS –

UNESC para o exame de qualificação.

AKT AMPKeNOS

DEFINIÇÃODEFINIÇÃO

“ “ INSUFICIÊNCIA CARDÍACA (IC): INSUFICIÊNCIA CARDÍACA (IC): Síndrome clínicaSíndrome clínica complexa e complexa e progressivaprogressiva, que pode resultar de , que pode resultar de qualquerqualquer distúrbio funcional ou distúrbio funcional ou estrutural do coração que altere sua estrutural do coração que altere sua capacidade de capacidade de enchimentoenchimento e/ou e/ou ejeçãoejeção. . Caracterizada clinicamente por Caracterizada clinicamente por dispnéia, fadiga, edema e redução da dispnéia, fadiga, edema e redução da sobrevidasobrevida.”.”

(Jessup & Brozena, 2003; Neto Rossi, 2004).

Doença CardiovascularDoença CardiovascularPRINCIPAL CAUSA DE MORTE NO PRINCIPAL CAUSA DE MORTE NO

MUNDOMUNDO

The World Health Report 2001. Geneva: WHO; 2001.The World Health Report 2001. Geneva: WHO; 2001.

Insuficiência Cardíaca

Congênitas(CIV, Fallot, etc)

Valvares(IMi, EAo, etc)

Miocárdicas(IAM, entre outras)

Hipertensão Arterial

Tóxicas(álcool, anti-blásticos )Pericárdio

(pericardite constritiva)

ETIOPATOGENIAETIOPATOGENIA

(Albanesi Filho, 2005; Hagen, 2006).

Insuficiência CardíacaInsuficiência CardíacaEtiopatogeniaEtiopatogenia

Principais causas de insuficiência cardíaca dos pacientes internados no INCOR - 1995

1,6622,1

32,6

25,8

6,97

7,41

3,4

Mioc. RestritivaValvopatiaMioc. IsquêmicaMioc. DilatadaHipertensçãoCard. CongênitaOutros

Arq Bras Cardiol vol 71, (nº 1), 1998Arq Bras Cardiol vol 71, (nº 1), 1998

EPIDEMIOLOGIAEPIDEMIOLOGIA

Nettto Rossi, 2004. Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo.

EPIDEMIOLOGIAEPIDEMIOLOGIA

Relação entre hospitalizações e Relação entre hospitalizações e sobrevida anualsobrevida anual

World Health Statistics, World Health Organization, 1999.World Health Statistics, World Health Organization, 1999. American Heart Association, 2002 Heart and Stroke Statistical UpdateAmerican Heart Association, 2002 Heart and Stroke Statistical Update..

SOBREVIDA

HOSPITALIZAÇÕES

IMPORTÂNCIA DO EXERCICIO IMPORTÂNCIA DO EXERCICIO FISICO NA ICFISICO NA IC

IMPORTÂNCIA DO EXERCICIO IMPORTÂNCIA DO EXERCICIO FISICO NA ICFISICO NA IC

LIMITAÇÕES DA CAPACIDADE FISICA

Dispneia, fadiga e descondicionamento

Fraqueza muscular

Alterações endoteliaisentre outras

AKT

AMPK

?Disfunção muscularPORQUE?

AKT

AMPK

CapacidadeOxidativa

Sintetisa

eNOS

L-Citrulina

CL-Miosina

Célula de Músculo Liso Vascular

Membrana Basal

Endotelio

Matriz Extracelular

Função endotelial

Condutância vascular

L-Arginina

BENEFICIOSDO

EXERCÍCIO FÍSICO

Oxido nítrico (NO .): Oxido nítrico (NO .):

Anti-inflamatoria

Anti-apoptosis Pro-fibrinolítica

Anti-plaquetaria

Proliferação e migração CML

NO.

• pesquisas? quais são os fatores ? Disfunções do IAM-IC

Dentre essas investigações

Um mediador na funcionabilidade vascularUm mediador na funcionabilidade vascular+ potente vasodilatador endogeno+ potente vasodilatador endogeno

Atualmente ON: prevenção e na redução dos Sintomas clinicos e hemodinamicos IC

Porem a relevância do ON no endotelio e na vasculatura do Musculo liso

Depende de uma enzima importante

eNOS

Ativação da eNOS por diversos Ativação da eNOS por diversos fatores…fatores…

?

PI3KPLC-γ

AC

PKC

CaMAkt CaMK PKA

oxigenasa CaM reductasa

β γαi

β γ αs

InsP3

DAG

Ca 2+

ATP

AMPc

S1177S635

S617

T497

S116

VEGF-REstrógeno-R Esfingosina-1-P Bradicinina shear stress

IGF-1 e insulina

eNOS

IL-8

integrinas

P

Comini et al., 1996, Viaro& Evora, 2000

NO NO

CÉLULA MUSCULAR VASCULAR LISA

CÉLULA ENDOTELIAL

αs

S-S RPK

ββ TYR

S-S

αα

p85 p110PPPP

IRS-1IRS-2IRS-3IRS-4

PI(4,5)-P2 PI(3,4,5)-P3 PI(4)-P PI(3,4)-P2

P P P

AKT3AKT2

AKT1

PPDK

NOeNOS P

Fosfoinositídeos

PI3K

VEGF, IGF-1 , insulina

shear stress,

(Bertrand et al., 2008;Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999; Zecchin, 2007).

A AKT será o mecanismo principal de ativação de eNOS?

P

AKT

Captaçãode glicose

Anti-lipólise

Síntese deglicogênio

Síntese dePTN

Antiapoptose

Dano oxidativo

Choque osmótico

Hipoxia

Privação de glicose

Estímulos patológicosEstímulos fisiológicos

Exercício

Contração do músculo

hormônios

leptina

(Hardie et al. 2003).

AMPK é um kinase e ativada por...

adiponectina

Proteina Kinase ativada por AMP

ATPADP

AMP

ExercícioAMPK sensor energético

P172

AMPK

CB

S

CBS

CB

S

CBSAMPK

GLUT4(Glucose transporter 4)

PFK(Phosphofructokinase}

IRS1(Insulin Receptor

substrate 1)

eNOS mTOR

ACC2(Acetyl-CoA carboxylase)

GPAT(Glicero-3-phosphate

acyltransferase)

PPARLeptin Adipo-

nectin

MCD(Malonyl-CoAcarboxylase)

Triglicerideos e Malonil CoA

Captação de glicose e metabolica

GS(Glycogen synthase)

PKC

CaMKK

TSC1/2

PGC-1(PPAR coactivator)

Geneexpressão

Rheb

AMPKK(LKB1)

Ativada pela redução do conteúdo energético celular

(aumento da relação AMP/ATP)

Inibe as vias metabólicas que

consuma ATP

estimula as vias metabólicas que produzam ATP exercício

PI3K

PI3K

eNOS

AktAMPK

P

VEGF, IGF-1 , insulina

EXERCICIOMODERADO

SHEAR ESTRESS

NOS III

NO NO

CÉLULA VASCULAR LISA

CÉLULA ENDOTELIAL NO

IC

?

Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999; Magata et al. 2003; Zechin et al, 2007; Zhang et al, 2009

Exercício físico regular

↑ fluxo sanguíneo

↑Akt↑

eNOS (Ser 1177)

NO.

NO.

↑Força de frição tangencial

célula endotelial

NO CML

AMPK

NO.

Exercício Fisico Tambem ativa

eNOS via ?

NO

IC

Problemática do estudoProblemática do estudo

P

OBJETIVO Geral:OBJETIVO Geral:

• Avaliar os efeitos do Avaliar os efeitos do exercício sobre a via exercício sobre a via

AKT/eNOS e AMPK/eNOS na AKT/eNOS e AMPK/eNOS na aorta de ratos wistar com IC.aorta de ratos wistar com IC.

Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos::• Avaliar se em quadro de IC ocorre redução da Avaliar se em quadro de IC ocorre redução da

atividade da Akt e AMPK;atividade da Akt e AMPK;• Avaliar se o exercício físico induz ativação da AKT e Avaliar se o exercício físico induz ativação da AKT e

AMPK e se essas levam o aumento da atividade da AMPK e se essas levam o aumento da atividade da eNOS em ratos com insuficiência cardíaca;eNOS em ratos com insuficiência cardíaca;

• Avaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e da Avaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados com tratados com ARA – adenina arabinofuranosida;

• Avaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e da Avaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados com LY294002.tratados com LY294002.

METODOLOGIA METODOLOGIA (Tipo de estudo e ética)(Tipo de estudo e ética)

• Estudo experimental.Estudo experimental.• Abordagem quantitativa, Abordagem quantitativa, • Comitê de Ética; UNESC e HCPA Comitê de Ética; UNESC e HCPA • Princípios éticos na experimentação Princípios éticos na experimentação

animal e pratica didático-científica; lei animal e pratica didático-científica; lei nº 6.638/ 08/05/ 1979 -COBEAnº 6.638/ 08/05/ 1979 -COBEA

• Após os experimentos procedimentos: Após os experimentos procedimentos: conforme RDC nº 306/2004 da ANVISA .conforme RDC nº 306/2004 da ANVISA .

(Schnaider & Souza, 2003).(Schnaider & Souza, 2003).

METODOLOGIAMETODOLOGIA

•51 ratos machos da linhagem 51 ratos machos da linhagem wistar (HCPA) cIAM-30 diaswistar (HCPA) cIAM-30 dias

Barbetta (2007).Barbetta (2007).

Avaliação / Ecocardiograma

•diâmetros do VE ao final da diástole (DDVE) / sístole (DSVE). A extensão do infarto (%IM),

porcentagem do perímetro total do contorno endocárdico (PE)

Modelos de Modelos de indução de indução de infarto agudo do infarto agudo do MiocárdioMiocárdio AC descente anterior esquerda

cateter periférico intravenoso (Gelko-16G)

reg torácica (4º espaço intercostal esquerdo) O pericárdio será rompido e o AE afastado Johns & Olson, 1954; Pfeffer et al.,1979.

METODOLOGIAMETODOLOGIA• Critérios de inclusão:Critérios de inclusão:- homogeneidade na proporção do peso (em media de 200g a homogeneidade na proporção do peso (em media de 200g a

350 g),350 g),- idade (60 dias- adultos jovens), idade (60 dias- adultos jovens), - gênero (machos), raça (wistar), gênero (machos), raça (wistar), - Todos/ protocolo de adaptação ao exercício de uma semana, Todos/ protocolo de adaptação ao exercício de uma semana,

sendo randomizados os com maior aptidão física,sendo randomizados os com maior aptidão física,- chegar ao final do experimento com bom estado de saúde.- chegar ao final do experimento com bom estado de saúde.

Barbetta (2007).Barbetta (2007).

METODOLOGIAMETODOLOGIACritérios de exclusão: Critérios de exclusão: - complicações como infecções, complicações como infecções, - necroses, necroses, - debilitação do estado geral;debilitação do estado geral;- problemas ou desconforto ao animal - problemas ou desconforto ao animal

durante o período do experimentodurante o período do experimento- morte dos mesmos, morte dos mesmos, - não conseguirem realizar a semana de não conseguirem realizar a semana de

adaptação na esteira. adaptação na esteira.

7 diasciclo 12 h claro/ciclo 12 h claro/escuro, 22,5ºCescuro, 22,5ºC

Adaptaçãobiotério

30 dias PO-IAMHCPA

de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;

Protocolo exercício físico em esteira

4m/min -10min> gradativamente

por dia

5dias

Adaptação Protocolo

(4º/5º+aptos)

1º semana

de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Brum et al., 2007;

5m/min - 10min> A cada 3’ até exaustão

Pré-treinamento5 semanas (Ajuste)

11 semanas (Aferição final)

TesteEsforçoMáximo

2º semana

de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006;Ferreira et al., 2007;

Grupos experimentais

Sedentário Exercício

Grupo Controle

N-6

Sham Treinado (ST)

N-6

IC Treinado (ICT)

N-9

IC Treinado LY200940(ICT-LY)

N-9

IC Treinado adenina arabinofuranosida

(ICT-ARA) N-9

Grupo Sham

N-6

Grupo ICN-6

semansemanaa temptempoo0202 10100303 15150404 20200505 25250606 30300707 35350808 40400909 45451010 50501111 50501212 5050

ProtocoloTreinamento

Físico

5m/min5m/min

60%-TEM

5 min 5 min-10 min a 50 min-2ª a 10ª

2º 12º semana

de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;

7 dias4m/min -10min

> gradativamente por dia

5dias

Adaptação Protocolo

Adaptaçãobiotério

30 dias PO-IAMHCPA

(4º/5º+aptos)

1º semana

5m/min - 10min> A cada 3’ até exaustão

Pré-treinamento5 semanas (Ajuste)

11 semanas (Aferição final)

TesteEsforçoMáximo

2º semana

ProtocoloTreinamento

Físico

5m/min5m/min

60%-TEM

5 min 5 min-10 min a 50 min-2ª a 10ª

semansemanaa temptempoo0202 10100303 15150404 20200505 25250606 30300707 35350808 40400909 45451010 50501111 50501212 5050

de Gava et al., 1995. Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;

2º 12º semana

Vel. treino (m.min) = Vel. max (m.min-1) . 60%

100%

HistologiaHistologia Tamanho do IAMTamanho do IAM

Hangen, 2006 (Hangen, 2006 (Mill el at., 1990)

Area de infarto= massa da região infartada x 100%(massa do VE + massa do VD

Verificar a deposição ou não de colageno

e análise da musculatura lisa

Area infartada e não infartada:

•PESADAS •DESENHADAS

(PAPEL MILIMETRADO)•Recortado e pesado

•(VE/VD)

YI

Eppendorf

YYYI

Western BlotWestern Blot

Macerada em nitrogenio

liquido

Homogeneizada em tampão especifico

Adicionado triton

Centrifugado 40 min

sobrenadante

Será processado e aplicado em gel SDS (apósCorrida)

TransferidasMemb de nitrocelulose

Incubadas com antocorpo primariosecundario

Tranf. Filme de raiox

Analises Moleculares via de sinalização da insulina

Imunoblot:

PI 3-KPI 3-K

AKTAKT

P172

AMPK

C

BS

CBS

CB

S

CBSAMPK

L-ARGL-ARG

eNOSeNOS

ON

Nagata et al., 2003; Reihill et al. 2007; Reihill, 2009

AVALIAR A EXPRESSÃO

E A FOSFORILAÇÃO DA

Analises Moleculares via de sinalização da insulina

Imunoblot:

PI 3-KPI 3-K

AKTAKT

LY200940

ARA – adenina arabinofuranosida

P172

AMPK

C

BS

CBS

CB

SCBS

AMPK

L-ARGL-ARG

eNOSeNOS

ON

AVALIAR A FOSFORILAÇÃO DA eNOS mediante o inibidor

A utilização dos inibidores e para mostrar a importância da AKT e AMPK neste processo

Analise estatisticaAnalise estatistica• A analise estatística será pelo teste A analise estatística será pelo teste

de Student (não pareados) e ANOVA de Student (não pareados) e ANOVA para comparar as múltiplas médias. para comparar as múltiplas médias. Será adotado o nível de significância Será adotado o nível de significância p<0,05.p<0,05.

no: 2009 J F M A M J J A S O N DElaboração do projeto x x x x x x x x x x xAvaliação pelo Comitê de ética x xelaboração e apresentaçãoQualificação x xQualificação x

no: 2010 J F M A M J J A S O N DInfarto dos animais-HCPA/Deslocamento UNESC x x xProtocolo de Exercício C/I aerobio X X XEutanásia UNESC/coleta de tecidos xAnalises molecularese histológicas x x x x x xAnalise dos dados e elaboração de artigo x x x

CRONOGRAMA

Ano: 2011 J F M A M J J A S O N D

Analises moleculares/bioquímicas e histológicas

x x x x x

Analise dos dados e elaboração de artigo x x x x x x x x x x x x

Ano: 2012 J F M A M J J A S O N D

Defesa da tese x x

CRONOGRAMA

Quantidade Material Valor (R$) Fonte

51 Ratos Wistar 1020,00 HCPA-UNESC

Diversos Reagentes para Western blot

4.000,00 CNPq

Diversos Anticorpos 15.000,00 UNICAMP e HCPA

Histologia 1.000,00 UNICAMP

Diversos Material de Consumo/condução

para animais/eventos

4.000,00 UNESC

TOTAL 25.020,00

ORÇAMENTO

O que busca-se :O que busca-se : • ........que esses resultados demonstrem um ........que esses resultados demonstrem um

novo mecanismo biológico pelo qual o exercício novo mecanismo biológico pelo qual o exercício físico possa induz relaxamento vascular e físico possa induz relaxamento vascular e proporcione importantes informações acerca da proporcione importantes informações acerca da modulação vascular na insuficiência cardíaca. modulação vascular na insuficiência cardíaca.

• OBs.: é importante ressaltar que existem OBs.: é importante ressaltar que existem fármacos já comercializados que aumentam a fármacos já comercializados que aumentam a atividade da AKT e da AMPK porem.....atividade da AKT e da AMPK porem.....

O não farmacologico?O não farmacologico?

Evitar.......Evitar.......

“Ter problemas na vida é inevitável, ser derrotado por eles e opcional”.

(Anonimo)

Valeu Gabi te adoro!!!

?

PI3K

PI3KAC

eNOS

CAAkt

AMPK

PKA

P

ATP

AMPc

CaM

insulina EXERCICIOMODERADO

SHEAR ESTRESS

NOS III

BH4

NO

PGIS

NO

CÉLULA VASCULAR LISA

CÉLULA ENDOTELIAL

αs

αS

β γ

PROSTAGLANDINAS

NO

1

3

4

2

1. Canal de sodio. 2. Canal L de calcio. 3. Inter Na+/Ca2+

4. Na+/K+ ATPasa.

5. SERCA-PLN. 6. RYR2

RS5

6

Sodio

Calcio

Potasio

Sitio de união dos gicosideos Cardiacos

4

7. Ca 2+ ATPasa

7

3 Na+

2 K+

Recaptura de Ca 2+

1 Ca2+

3 Na+

Ca2+