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i Efeitos do licopeno in vitro e in vivo sobre o desequilíbrio redox e a inflamação pulmonar induzida pela exposição à fumaça de cigarro KEILA KARINE DUARTE CAMPOS RODRIGUES OURO PRETO, 2018 MINAS GERAIS - BRASIL UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
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Efeitos do licopeno in vitro e in vivo sobre o desequilíbrio
redox e a inflamação pulmonar induzida pela exposição
à fumaça de cigarro
KEILA KARINE DUARTE CAMPOS RODRIGUES
OURO PRETO, 2018
MINAS GERAIS - BRASIL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
i
KEILA KARINE DUARTE CAMPOS RODRIGUES
Efeitos do licopeno in vitro e in vivo sobre o desequilíbrio
redox e a inflamação pulmonar induzida pela exposição
à fumaça de cigarro
Orientador: Prof. Dr. Frank Silva Bezerra
Co-orientadora: Prof. Drª Daniela Caldeira Costa
OURO PRETO, 2018
MINAS GERAIS - BRASIL
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro
Preto, como parte integrante dos requisitos para
a obtenção do título de Doutor em Ciências
Biológicas, área de concentração: Bioquímica
Metabólica e Fisiológica.
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“Os obstáculos jamais terão o tamanho dos nossos sonhos”.
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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Fisiopatologia
Experimental e no Laboratório de Bioquímica Metabólica do
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro
Preto, na vigência de auxílio concedido pela Coordenação de
aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Dedicatória
CAMPOS, K.K.D.
3
A todas as pessoas que ajudaram e que se dedicaram para a realização deste trabalho.
Agradecimentos
CAMPOS, K.K.D.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter tornado tudo isso possível.
Aos meus pais Anael Cardoso Campos e Helena Duarte campos e meu irmão Helnatã
Duarte Campos pelo apoio e pelo amor incondicional.
Ao meu marido Wanderson Rodrigues Pereira, pelo apoio, amor, incentivo e
companheirismo.
Ao meu orientador Dr. Frank Silva Bezerra, por abrir as portas da sua “sala” para
mim sem se quer me conhecer. Tenho muita admiração pelo seu empenho em buscar um
espaço descente e por ter conseguido nosso laboratório para que pudéssemos com muita
dificuldade, mas perseverando sempre seguir pesquisando. Sou IMENSAMENTE grata pelo
apoio e consideração.
A minha co-orintadora Drª Daniela Caldeira Costa, pela confiança demonstrada e
pela parceria que foram fundamentais para o desenvolvimento desta pesquisa. Muito
obrigada por me fazer amar a BIOQUÍMICA.
Aos Professores Doutores Laser Antonio Machado Oliveira, André Talvane, Camila
Carrião Machado Garcia, pela dedicação e disponibilidade com que sempre me atenderam.
A toda equipe do LAFEx, LBM e LABNEX que sem exceção, foram extremamente
amigáveis e sempre me apoiaram e me auxiliaram na realização deste trabalho. O meu
reconhecimento e carinho.
Não posso deixar de fazer um agradadecimento especial a Camila Oliveira, Dafne,
Machado, Glaucy Rodrigues Araújo, Josielda, Mônica Campos, Natália Araújo, Nícia
Soares, Thaís Lourenço Martins, Talhes Freitas de Castro, que foram muito mais que colegas
de laboratório mas amigos que levarei pra vida toda.
A Drª Carolina Nogueira por toda ajuda na tão sofrida análise da imunofluorescência.
Por ter tornado essa análise possível com muita diversão.
Ao Profª Drª Silvia Dantas Cangussú, pela essencial ajuda com as análises
histológicas.
Aos doutores Ana Carla Balthar Bandeira e Guilherme de Paula Costa pela essencial
ajuda com as análises.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, obrigada
pelos importantes ensinamentos.
Aos membros dos laboratórios LBM, LABNEX, LBBM, LABIIN e LIP, obrigada
por ceder espaço e equipamentos para a realização dos experimentos.
Agradecimentos
CAMPOS, K.K.D.
5
Ao Jair Pastor Mota e Clodoaldo Pereira dos Santos, muito obrigada pela
disponibilidade.
Apoio financeiro
CAMPOS, K.K.D.
6
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Fisiopatologia Experimental (LAFEx),
Laboratório de Bioquímica Metabólica (LBM), Laboratório de Nutrição Experimental
(LABNEX) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Ouro Preto com o auxílio financeiro da CNPq Nº 461495/2014-7, CAPES, FAPEMIG e
UFOP.
Sumário
CAMPOS, K.K.D.
7
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... 10
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ 12
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ 13
LISTA DE ABREVIATURAS .......................................................................................... 15
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 23
2.1. Pulmões e Fumaça de Cigarro (FC) .............................................................................................23
2.2. Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) ............................................................................27
2.3. Licopeno .......................................................................................................................................31
2.4. Desequilíbrio Redox ......................................................................................................................38
3. OBJETIVOS ................................................................................................................... 45
3.1. Objetivo geral .....................................................................................................................................45
3.2. Objetivos específicos ...........................................................................................................................45
4. METODOLOGIA .......................................................................................................... 47
4.1. Estudo 1- In vitro ................................................................................................................................47 4.1.1. Cultivo celular .................................................................................................................................. 47
4.1.2. Preparação do extrato da fumaça de cigarro ........................................................................................ 48 4.1.3. Ensaio de viabilidade celular (MTT) ................................................................................................. 48 4.1.5. Análise da produção de Espécies Reativas de Oxigênio .................................................................. 50
4.2. Estudo 2 e 3 - In vivo ..........................................................................................................................52
4.2.3. Exposição à fumaça de cigarro em curto e longo prazo ...................................................................54
4.2.4. Coleta do sangue..............................................................................................................................55
4.2.5. Parâmetros hematológicos ...............................................................................................................56
4.2.6. Esfregaço sanguíneo........................................................................................................................56
Sumário
CAMPOS, K.K.D.
8
4.2.7. Coleta do lavado broncoalveolar (LBA) ...........................................................................................56
4.2.8. Contagem total e diferencial de leucócitos do LBA ..........................................................................57
4.2.9. Processamento tecidual....................................................................................................................57
4.2.10. Análise histopatológica – Estereologia ...........................................................................................58
4.2.11. Medida do Intercepto Linear Médio – Lm ......................................................................................58
4.2.12. Homogeneizado tecidual ................................................................................................................59
4.2.13. Biomarcadores do dano oxidativo e defesas antioxidantes no parênquima pulmonar ....................60 4.2.13.1. Níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) ................................................. 60 4.2.13.2. Estudo de fragmentação do DNA (Ensaio cometa) ...................................................................... 60 4.2.13.3. Proteínas totais.............................................................................................................................. 62 4.2.13.4. Atividade da Superóxido dismutase (SOD) .................................................................................. 63 4.2.13.5. Atividade da Catalase (CAT) ........................................................................................................ 64 4.2.13.6. Atividade da Glutationa peroxidase (GPx) .................................................................................. 65 4.2.13.7. Análise do Sistema Glutationa (GSH total, GSSG, GSH e relação GSH/GSSG) ......................... 66 4.2.13.8. Mieloperoxidase (MPO) ............................................................................................................... 67 4.2.13.9. Determinação dos níveis de Nitrito .............................................................................................. 68 4.2.13.10. Ensaios Imunoenzimáticos para marcadores inflamatórios TNF, IFN-γ e IL-10 ....................... 68 4.2.13.11. Imunofluorescência indireta ....................................................................................................... 69 4.2.13.12. Análises estatísticas .................................................................................................................... 70
5. RESULTADOS .............................................................................................................. 71
5.1. Avaliação da Viabilidade Celular pelo Teste de MTT .........................................................................71 5.1.1. Incubação com o licopeno ................................................................................................................. 71 5.1.2. Incubação com o Extrato da fumaça de cigarro ............................................................................... 72 5.1.3. Análise quantitativa da produção das ERO ...................................................................................... 73 5.1.4. Influência da via de sinalização de PKC e da NADPH oxidase na produção das ERO em células
J774 ............................................................................................................................................................. 74
5.2. Análise da administração do licopeno sobre o influxo celular no lavado broncoalveolar (LBA) .........75
5.3. Análise histopatológica do parênquima pulmonar ..............................................................................76
5.4. Avaliação da translocação de Nfr2 .....................................................................................................79
5.5. Análise de TBARS, DNA cometa e das Defesas Antioxidantes no parênquima pulmonar ..................81
5. 6. Avaliação dos níveis de citocinas inflamatórias nos pulmões .............................................................84
6. ESTUDO 3- IN VIVO (ADMINISTRAÇÃO COM LICOPENO E EXPOSIÇÃO Á
FC A LONGO PRAZO) .................................................................................................... 85
6.1. Dados Biométricos ..............................................................................................................................85
6.2. Dados hematológicos ..........................................................................................................................86
6.3. Análise da administração com licopeno sobre o influxo celular no lavado broncoalveolar (LBA) ....87
Sumário
CAMPOS, K.K.D.
9
6.4. Análise histopatológica do parênquima pulmonar ..............................................................................88
6.5. Análise de TBARS, DNA cometa, MPO, Nitrito e das Defesas Antioxidantes .....................................93
6.6. Avaliação da translocação do Nfr2 .....................................................................................................95
6.7. Avaliação dos níveis de citocinas inflamatórias no LBA .....................................................................97
7. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 98
7.1. 1ª Parte: Estudo 1- In vitro ................................................................................................................98
7.2. 2ª Parte: Estudo 2- In vivo (Administração com licopeno e Exposição à FC a curto prazo) ............. 100
7.3. 3ª Parte: Estudo 3- In vivo (Administração com licopeno e Exposição á FC a longo prazo) ............ 107
8. CONCLUSÕES E SUMÁRIO .................................................................................... 120
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 124
ANEXO 1- BULA LICOPENO ...................................................................................... 139
ANEXO 2 - PROTOCOLO APROVADO PELA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO
DE ANIMAIS DA UFOP ................................................................................................ 141
ANEXO 3 – ARTIGOS PUBLICADOS DURANTE O DOUTORADO .................... 142
Lista de tabelas
CAMPOS, K.K.D.
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Quantidade de licopeno em produtos derivados do tomate. .................................32
Tabela 2. Efeitos da administração com licopeno sobre o influxo celular no lavado
broncoalveolar (LBA).......................................................................................................... 75
Tabela 3. Efeitos do tratamento com licopeno sobre as atividades das enzimas antioxidante
(SOD, CAT e GPx), razão GSH/GSSG, TBARS, Dano ao DNA e nitrito em amostras de
pulmão do grupos experimentais.......................................................................................... 82
Tabela 4. Parâmetros hematológicos dos grupos experimentais.........................................86
Tabela 5. Efeitos da administração com o licopeno sobre o influxo celular no lavado
broncoalveolar(LBA)...........................................................................................................87
Tabela 6. Análises morfométricas do parênquima pulmonar dos animais dos grupos GC,
GO, GFC, Li25+FC e Li50+FC...........................................................................................89
Tabela 7. Efeitos da administração com licopeno sobre TBARS, Dano ao DNA, as
atividades das enzimas antioxidante (SOD e CAT), razão GSH/GSSG, nitrito e MPO em
amostras de pulmão e LBA do grupos experimentais.........................................................94
Lista de quadros
CAMPOS, K.K.D.
11
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Principais espécies reativas de oxigênio (radicais e não radicais) e de
nitrogênio..............................................................................................................................39
Quadro 2. Imagens e pontuações de cada classe de cometas observados.............................61
Quadro 3. Curva padrão de albumina...................................................................................63
Quadro 4. Quadro comparativo dos efeitos do licopeno nos experimentos 2 e 3.............122
Lista de figuras
CAMPOS, K.K.D.
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema da estrutura alveolar..............................................................................25
Figura 2. Estrutura da enzima NADPH Oxidase não fagocítica. NOX1, NADPH oxidase;
NOXO1, NADPH oxidase organizador; NOXA1, ativador de NADPH oxidase................27
Figura 3. Esquema anatômico representativo de um alvéolo no enfisema e um alvéolo
normal e bronquite crônica...................................................................................................28
Figura 4. Células inflamatórias e imunes envolvidas na DPOC..........................................30
Figura 5. Conteúdo de licopeno nos alimentos....................................................................31
Figura 6. Fórmula estrutural representando as configurações all-trans e 5-cis-licopeno......32
Figura 7. Transportado do licopeno via receptor scavenger classe B tipo 1 (SR-B1) através
do epitélio do intestino delgado........................................................................................... 34
Figura 8. Possível mecanismo de regulação Nrf2 pelo licopeno..........................................36
Figura 9. Ligações entre oxidantes inalatórios e / ou celulares e inflamação......................36
Figura10. Efeito fisiológico da produção de ERO..............................................................40
Figura 11. Fontes endógenas de geração de ERO pela Mitocondrial, NADPH oxidase e
Xantina oxidase.................................................................................................................... 41
Figura 12. Relação entre Nrf2 e NF-κB.....,,,,.......................................................................42
Figura 13. Esquema da integração dos sistemas de defesa enzimáticos..............................44
Figura 14. Delineamento experimental dos diferentes tratamentos ..................................52
Figura 15. Desenho experimental representando os experimentos in vivo.........................53
Figura 16. Esquema da Câmara de inalação.......................................................................55
Figura 17. Fotomicrografia do Retículo de Wibel, Retículo de Weibel sobreposto a uma
lâmina de parênquima pulmonar de camundongo................................................................ 59
Lista de figuras
CAMPOS, K.K.D.
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 18. Viabilidade na linhagem celular J774A.1 incubada com licopeno....................71
Figura 19. Viabilidade na linhagem celular J774A.1 incubada com o extrato da fumaça de
cigarro. .................................................................................................................................72
Figura 20. Produção de ERO em células J774A.1 tratadas com licopeno e expostas ao
extrato da fumaça de cigarro (0.5%).....................................................................................73
Figura 21. Influência da via de sinalização de PKC e da NADPH oxidase na produção de
ERO em células J774A.1......................................................................................................74
Figura 22. Vva alvéolo; Vvsa septo alveolar.......................................................................76
Figura 23. Fotomicrografias de cortes de pulmão coratos com Hematoxilina e
eosina....................................................................................................................................77
Figura 24 e 25. Avaliação da translocação de Nfr2 do citoplasma para o
núcleo..............................................................................................................................79-80
Figura 26. Imagens representativas de dano ao DNA induzido por FC nos pulmões,
atenuado pela administração com licopeno...............................................................................83
Figura 27. Possíveis efeitos da administração com licopeno sobre os níveis de IFN-gama,
TNF e IL-10.........................................................................................................................84
Figura 28. Dados Biométricos............................................................................................85
Figura 29. Fotomicrográficas de cortes de pulmão corados com hematoxilina e eosina.
Análise da densidade de volume de espaço aéreo alveolar e densidade de volume de septos
alveolares.............................................................................................................................90
Figura 30. Fotomicrográficas de cortes de pulmão corados com Tricrômio de massom...92
Figura 31. Avaliação da translocação do Nfr2 do citoplasma para o núcleo......................95
Figura 32. Imunofluorescência do Nrf2..............................................................................96
Lista de figuras
CAMPOS, K.K.D.
14
Figura 33. Possíveis efeitos do tratamento com licopeno sobre os níveis de IFN-gama, TNF
e IL-10 a longo prazo no LBA.............................................................................................97
Lista de abreviaturas
CAMPOS, K.K.D.
15
LISTA DE ABREVIATURAS
1O2 – Oxigênio singleto
ARE – Elemento de resposta antioxidante
BCO1 – β-caroteno 15,15 oxigenase
BCO2 – β-caroteno 9,10 oxigenase
BHT – Hidroxitolueno butilado
C – Grupo controle
CAT – Catalase
CCL-2 – Quimiocina ligante 2 (motivo C-C)
CEUA - Comitê de ética em pesquisa no uso de animais
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DNPH – 2,4-Dinitrofenilhidrazina
DNTB – Ácido 5,5´-Ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
ERO – Espécies reativas de oxigênio
GC– Grupo Controle
GO – Grupo Oléo
GFC – Grupo exposto a fumaça de cigarro
GPx – Glutationa peroxidase
GSH – Glutationa reduzida
GSSG – Glutationa oxidada
GR- Glutationa redutase
H2O – Água
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
HE – Hematoxilina e eosina
HO-1 – Heme oxigenase-1
INCA- Instituto nacional do câncer
IL-10 – Interleucina 10
IL-1β – Interleucina 1-beta
IL-6 – Interleucina 6
IL-8 – Interleucina 8
INFγ – Interferon gamma
LBA- Lavado broncoalveolar
IκB – Inibidor do kappa B MAPK – Proteína quinase ativada por mitógenos
Li25+ FC – Grupo administrado com licopeno 25 mg/Kg e exposto a fumaça
de cigarro
Li25+ FC – Grupo administrado com licopeno 50 mg/Kg e exposto a fumaça
de cigarro
MTT – Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio]
NFκB – Fator nuclear kappa B
Lista de abreviaturas
CAMPOS, K.K.D.
16
OMS- Organização mundial de saúde
O2 – Oxigênio molecular
O2˙ˉ – Radical superóxido
O3 – Ozônio
OH˙– Radical hidroxila
ONOOˉ – Peroxinitrito
ONOOH˙ – Ácido peroxinitroso
PBS – Tampão fosfato salino
SOD – Superóxido dismutase
SR-B1 – Receptor scavenger classe B tipo 1
TBA – Ácido tiobarbitúrico
TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA – Ácido tricloroacético
TEA – Trietanolamida
TNB – 5-tio-2-nitrobenzóico
TNF-α – Fator de necrose tumoral - alfa
UI – Unidades internacionais
Resumo
CAMPOS, K.K.D.
17
RESUMO
O licopeno é um carotenóide com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Neste
estudo, objetivou-se avaliar os efeitos in vitro e in vivo do licopeno na redução do
desequilíbrio redox e na inflamação induzida pela exposição à fumaça do cigarro (FC). Para
o estudo in vitro, as células J774A.1 (macrófagos) foram incubadas durante 3, 6 e 24 hs na
presença de 0,5, 1,0 ou 2,0 μM de licopeno juntamente com um extrato de FC a 0,5% (EFC)
e a geração de ERO intracelular foi mensurado. Para o estudo in vivo, 40 animais foram
divididos em cinco grupos: um grupo de controle, exposto ao ar ambiente (GC), um grupo
veículo que recebeu 200 μL de óleo de girassol por gavagem orogástrica (GO), um grupo
exposto a FC, e dois grupos administrados com licopeno (diluído em óleo de girassol) nas
doses de 25 ou 50 mg / kg / dia antes da exposição a FC (Li25 + FC e Li50 + FC). O tempo
total dos experimentos foram de 5 e 60 dias. As concentrações de licopeno e o extrato da
fumaça de cigarro (EFC) foram avaliados quanto á citotoxicidade, sendo que as
concentrações de 8, 10 e 25 μM de licopeno nos tempos de 3, 6 e 24 horas apresentaram
citotoxicidade, e as concentrações do EFC a partir de 0,63% até 10% também foram
consideradas citotóxicas nos 3 tempos avaliados. Foi observado que as células tratadas com
licopeno (1 μM ou 2 μM) e estimuladas com o EFC (0,5%) apresentaram uma diminuição
da produção de ERO. No tempo de 3 horas o licopeno mimetizou o efeito do calfostin e DPI
reduzindo a produção de ERO, desta forma sugere-se que o licopeno possa ter inibido uma
ou ambas as vias relacionadas à produção de ERO, ou seja, PKC e/ou NADPH oxidase,
respectivamente. Já em 24 horas, o licopeno não apresentou efeito modulatório sobre estas
vias, uma vez que a produção de ERO foi igual as dos controles. O ensaios in vivo foram
divididos em experimento a curto prazo (5 dias) e a longo prazo (60 dias), onde os
camundongos foram administrados com licopeno e expostos à FC. No experimento a curto
prazo, observamos um aumento no número de leucócitos totais, bem como da peroxidação
lipídica, do dano ao DNA, do Vva, da translocação do Nrf2, da atividade de CAT, da razão
GSH / GSSG e dos níveis de TNF-α, IFN-γ e IL-10 e a administração com licopeno foi capaz
de suprimir este aumento. Em relação a Vvsa, o licopeno foi capaz de melhorar esse
parâmetro, elevando a Vvsa. Em contraste, a atividade de SOD diminuiu no GFC em
comparação com CG e administração com licopeno não alterou esse parâmetro. Já no
experimento a longo prazo, o licopeno promoveu uma redução do número de leucócitos
totais e dos parâmetros hematológicos, melhorou o quadro de enfisema pulmonar bem como
o padrão histológico do parênquima pulmonar. O licopeno foi capaz de melhorar o
desequilíbrio redox, diminuindo a peroxidação lipídica, o dano ao DNA e aumentou as
atividades da SOD, CAT e o conteúdo de GSH, mas não apresentou diferença significativa
em relação ao fator de transcrição Nrf2.
Resumo
CAMPOS, K.K.D.
18
Também foi observado uma diminuição dos níveis de TNF-α, IFN-γ e IL-10, bem como a
atividade de MPO e o conteúdo de nitrito. Tomados em conjunto, nossos dados elucidam o
papel do licopeno como um agente antioxidante e anti-inflamatório nos nossos modelos
experimentais de exposição à FC.
PALAVRAS-CHAVE: Licopeno; Fumaça de cigarro; Desequilíbrio redox; Inflamação;
Camundongos.
Abstract
CAMPOS, K.K.D.
19
ABSTRACT
Lycopene is a carotenoid with known antioxidant and anti-inflammatory properties. In this
study, we aimed to evaluate the in vitro and in vivo effects of lycopene on reducing the redox
imbalance and inflammation induced by cigarette smoke (CS). For the in vitro study,
J774A.1 (macrophages) cells were incubated for either 3, 6 and 24 hours in the presence of
0.5, 1.0 or 2.0 µM lycopene along with a 0.5% CS extract (CSE) and the generation of
intracellular ROS was measured. For the in vivo study, 40 mice were divided into five
groups: a control group exposed to ambient air (CG), a vehicle-control group that received
200 µL of sunflower oil by orogastric gavage (OG), a group exposed to CS, and two groups
administered lycopene (diluted in sunflower oil) at doses of either 25 or 50 mg/kg/day prior
to exposure to CS (LY25+CS and LY50+CS). The total treatment time lasted 5 and 60 days.
The concentrations of lycopene and cigarette smoke extract (CSE) were evaluated for
cytotoxicity with concentrations of 8, 10 and 25 μM lycopene at 3, 6 and 24 hours time
cytotoxicity, and concentrations of CSE from 0.63% to 10% were also considered cytotoxic
in the three times evaluated. It was observed that cells treated with lycopene (1 μM or 2
μM) and stimulated with CSE (0.5%) showed a decrease in ROS production. At the time 3
hours lycopene mimicked the effect of calfostin and DPI reducing the production of ROS,
thus it is suggested that lycopene may have inhibited one or both routes related to the
production of ROS, PKC and/or NADPH Oxidase, respectively. At 24 hours, lycopene had
no modulatory effect on these pathways, since the ROS production was the same as the
controls. The in vivo assays were divided into short and long-term (5 days and 60 days)
experiments, where the mice were given lycopene and exposed to CS. In the short-term
experiment, we observed an increase in the number of total leukocytes, as well as lipid
peroxidation, DNA damage, VVA, Nrf2 translocation, CAT activity, GSH / GSSG ratio,
TNF- Α, IFN-γ, IL-10 and administration with lycopene was able to suppress this increase.
In relation to Vvsa, lycopene was able to improve this parameter, raising the Vvsa. In
contrast, SOD activity decreased in CSG compared to CG and administration with lycopene
did not change this parameter. In the long-term experiment, lycopene promoted a reduction
in the number of total leukocytes and haematological parameters improved pulmonary
emphysema as well as the histological pattern of the pulmonary parenchyma. Lycopene was
able to improve redox imbalance by decreasing lipid peroxidation, DNA damage and
increase in the activities of SOD, CAT and GSH content, but did not present a significant
difference in relation to the transcription factor Nrf2. Furthermore, it decreased levels of
TNF-α, IFN-γ and IL-10. In addition, it was able to decrease MPO activity and nitrite
content. In conclusion, our data elucidated the role of lycopene as an antioxidant and anti-
inflammatory agent in mice exposed to CS.
KEYWORDS: Lycopene; Cigarette Smoke; Redox Imbalance; Inflammation; Mice
Introdução
CAMPOS, K.K.D.
20
1. INTRODUÇÃO
A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é uma doença com repercussões
sistêmicas, prevenível e tratável, caracterizada por limitação do fluxo aéreo pulmonar,
parcialmente reversível e geralmente progressiva. Essa limitação é causada por uma
associação entre doença de pequenos brônquios (bronquite crônica obstrutiva) e destruição
de parênquima (enfisema). A bronquite crônica é definida clinicamente pela presença de
tosse e expectoração na maioria dos dias, por no mínimo três meses/ano durante dois anos
consecutivos. O enfisema pulmonar é definido anatomicamente como aumento dos espaços
aéreos distais ao bronquíolo terminal, com destruição das paredes alveolares. O diagnóstico
da DPOC é clínico e deveria ser considerado para todas as pessoas expostas ao tabagismo
ou poluição ocupacional que apresentam dispneia, tosse crônica e expectoração. Os critérios
clínicos são suficientes para estabelecer o diagnóstico da DPOC, porém, se possível,
recomenda-se a confirmação espirométrica, radiografia de tórax e/ou cultura de escarro
(Saúde, 2010).
A fumaça de cigarro (FC) é uma mistura complexa de mais de 7000 produtos
químicos (Dalrymple et al., 2015) (Westra et al., 2013). A exposição à FC pode levar à
produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) via NADPH oxidase, que catalisa a
redução de oxigênio para um ânion superóxido (O2•–) (Asano et al., 2012),(Wu et al., 2014),
levando à ativação da cascata inflamatória no epitélio das vias aéreas superior e inferior
(Rueff-Barroso et al., 2010). As espécies oxidantes interagem diretamente com membranas
celulares e tecidos, alterando a integridade das membranas celulares e conduz ao rearranjo
de estrutura da membrana. (Lee e Yang, 2012). O desequilíbrio entre oxidantes e
antioxidantes a favor dos oxidantes leva a uma interrupção da sinalização redox e / ou danos
moleculares (Sies, 2015). O aumento do desequilíbrio redox pode ser devido a oxidantes
presentes na FC e poluentes no ar ambiente, mas também podem ser gerados por células
inflamatórias ativadas, como macrófagos e neutrófilos (Boutten et al., 2010; Lanzetti, Da
Costa, Nesi, Barroso, Martins, Victoni, Lagente, Pires, E Silva, et al., 2012; Campos et al.,
2013; De Oliveira et al., 2015). No entanto, o aumento intracelular de ERO pode ativar várias
vias de sinalização redox sensíveis (Wu et al., 2014).
Introdução
CAMPOS, K.K.D.
21
Durante a evolução humana, as defesas endógenas foram gradualmente
desenvolvidas para manter o equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes. A defesa
antioxidante primária compreende três enzimas importantes que impedem a formação e
promovem a neutralização dos radicais livres: a glutationa peroxidase (GPx) catalisa a
conversão de peróxido de hidrogênio (H2O2) e peróxidos orgânicos em H2O, ao mesmo
tempo que converte a glutationa reduzida (GSH) em glutationa oxidada (GSSG) (Murta et
al., 2016) (De Oliveira et al., 2015). GSH é o tiol não protéico predominante nas células e é
importante na manutenção do estado redox celular. GSH existe principalmente em duas
formas redox, isto é, glutationa reduzida (GSH, a forma reduzida) e glutationa dissulfeto
(GSSG, a forma oxidada). O último representa cerca de 1% do conjunto GSH total (Biswas
e Rahman, 2009). A relação GSH/GSSG pode servir como um bom indicador do estado
redox celular (Park et al., 1998). Outras duas enzimas antioxidantes são a catalase (CAT),
que converte peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular e a superóxido dismutase
(SOD), que converte o ânion superóxido em peróxido de hidrogênio (De Oliveira et al.,
2015). Além disso, as defesas antioxidantes exógenas, como vitaminas e alguns minerais,
também desempenham papéis fundamentais (Rahman, 2007; Carocho e Ferreira, 2013).
NF-E2 p45-relacionado fator 2 (Nrf2) é um fator de transcrição que desempenha um
papel importante nos processos de oxidação endógena. O Nrf2 regula a expressão de genes
antioxidantes em condições de estresse fisiológico e oxidativo. A indução de Nrf2 ocorre na
célula durante o desequilíbrio redox causado por vários fatores ambientais, como a exposição
a FC (Itoh et al., 2010) (Koo et al., 2016). Estes estímulos externos induzem a geração das
ERO, que por sua vez, desencadeiam a ativação do Nrf2 e sua translocação para o núcleo
celular (Verma et al., 2015). Após translocação no núcleo e ligação a um elemento de
resposta antioxidante (ARE), Nrf2 regula a expressão de proteínas antioxidantes (Koo et al.,
2016).
O licopeno é um carotenóide natural encontrado nos tomates e seus produtos, exibe
uma potente atividade de neutralização de radicais livres. Estruturalmente, ele possui uma
cadeia aberta de hidrocarbonetos altamente insaturada, composta por 11 ligações duplas
linearmente conjugadas e duas ligações duplas não conjugadas e é responsável pela cor
vermelha de muitas frutas e vegetais, como os tomates (Palozza et al., 2012) (Palozza et al.,
2010). O licopeno é encontrado na natureza na forma totalmente trans, no entanto, o
processamento térmico, bem como a digestão intestinal, de produtos de tomate em bruto,
Introdução
CAMPOS, K.K.D.
22
facilita a sua isomerização para a forma cis. Estudos sugerem que uma dieta rica em licopeno
pode reduzir o risco de doenças graves, como câncer (Singh et al., 2006) e doenças
cardiovasculares, porque esse composto atua por suprimir o oxigênio singleto, sendo duas
vezes mais eficaz do que o β-caroteno e 10 vezes mais potente do que o -tocoferol (Palozza
et al., 2010) (Rao, 2002). Os efeitos anti-inflamatórios do licopeno observados na maioria
dos estudos podem ser atribuídos principalmente à sua capacidade de modular as vias de
sinalização responsáveis pela indução de mediadores inflamatórios, bem como ativar a
expressão de genes antioxidantes (Hazewindus et al., 2014). Neste último aspecto, o
licopeno induz a translocação nuclear do Nrf2 por um mecanismo que envolve a interação
direta do licopeno com resíduos de cisteína da proteína Keap1, o que desencadeia a liberação
de Nrf2 do complexo (Trejo-Solis et al., 2013).
Sabendo que o licopeno possui as características antioxidantes e que pode ser útil em
prevenir muitas doenças através dos seus efeitos sobre a inflamação e o desequilíbrio redox
(Simone et al., 2011; Hazewindus et al., 2014), neste estudo, nós investigamos os efeitos
antioxidantes e anti-inflamatórios do licopeno nos pulmões de camundongos induzidos pela
FC. Para tal, utilizamos um modelo in vitro (linhagem de células de macrófagos J774.A)
para examinar os efeitos do licopeno e um extrato de FC (EFC) sobre a citotoxicidade
celular, bem como a produção intracelular das ERO. Além disso, utilizamos um modelo
murino de exposição a FC em curto e longo prazo para avaliar os efeitos inibitórios do
licopeno no desequilíbrio redox e a inflamação.
Revisão bibliográfica
CAMPOS, K.K.D.
23
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Pulmões e Fumaça de Cigarro (FC)
Os pulmões são órgãos respiratórios situados no tórax e separados um do outro pelo
espaço interpleural ou mediastino. No nascimento, o pulmão é róseo, e no adulto, cinza-
escuro, com manchas escurecidas (Souza, 2010). Esta coloração é devido à deposição de
partículas de carbono próximo à superfície do órgão e será tanto mais enegrecida quanto
mais poluído o ambiente. Cada pulmão pesa 550 a 650 gramas, com um volume em repouso
entre 2,5 a 3,5 litros. Os pulmões humanos são revestidos externamente por uma membrana
chamada pleura e são divididos em segmentos denominados lobos. O pulmão esquerdo
possui dois lobos (superior e inferior) e o direito possui três (superior, médio e inferior). O
parênquima do pulmão é leve e esponjoso, crepitando quando manipulado pela presença de
ar nos alvéolos. O parênquima também é muito elástico, daí a retração quando o pulmão é
removido da caixa torácica. Internamente os pulmões são compostos de brônquios (principal,
secundário e terciário) que se ramificam em bronquíolos e terminam em alvéolos
pulmonares. Os brônquios e bronquíolos podem sofrer dilatação ou redução de calibre. Os
lobos pulmonares muitas vezes sofrem alterações de tamanho, pois a formação de fibrose
diminui o volume pulmonar, ao passo que as áreas de enfisema podem comprometer o
volume do pulmão (Souza, 2010).
Os pulmões são órgãos alvos de exposição aos patógenos e antígenos ambientais. A
proteção contra o material estranho que atinge o alvéolo do pulmão envolve as respostas
imunes inata e adaptativa. Os macrófagos alveolares e outros monócitos são as células mais
importantes da resposta inata do sistema imune nos pulmões. (Sopori, 2002). Em mamíferos,
os pulmões são órgãos cuja função primária, descrita na literatura, é captar o O2 para o
organismo e eliminar o CO2 do organismo. Para fazer esta troca de gases em seres humanos,
os pulmões apresentam uma área em torno de 90 m2 distribuída por aproximadamente 300
milhões de alvéolos (Stevens e J.S., 1995).
O sistema respiratório é subdividido em dois maiores componentes: a porção
condutora e a porção respiratória (Figura 1). A porção condutora é composta de cavidade
nasal, cavidade oral, nasofaringe, faringe, laringe, traquéia, brônquios primários, brônquios
secundários brônquios secundários (brônquios lobares), brônquios terciários (brônquios
segmentares), bronquíolos e bronquíolos terminais. Essas estruturas transportam, filtram,
Revisão bibliográfica
CAMPOS, K.K.D.
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umedecem e aquecem o ar inspirado antes de alcançar a porção respiratória dos pulmões. A
porção respiratória é composta de bronquíolos respiratórios, ductos alveolares, sacos
alveolares e alvéolos. Conforme ocorre a ramificação dos bronquíolos respiratórios, o
diâmetro do lúmen diminui e o número de alvéolos aumenta. Subsequentemente às
ramificações, cada bronquíolo respiratório termina em um ducto alveolar (Gartner e Hiatt,
2009). O epitélio respiratório, um epitélio pseudo-estratificado cilíndrico ciliado, é composto
por seis tipos celulares: células caliciformes, células cilíndricas ciliadas, células basais
células em escova, células serosas e células do sistema neuroendócrino difuso. Todas estão
em contato com a lâmina basal, mas nem todas alcançam o lúmen (Gartner e Hiatt, 2009).
Os alvéolos têm forma de saco, com aproximadamente 200 μm de diâmetro,
localizados nos bronquíolos respiratórios, ductos alveolares e sacos alveolares. Os alvéolos
representam a unidade funcional e estrutural primária do sistema respiratório, porque suas
delgadas paredes permitem a troca de CO2 por O2 entre o ar contido em seus espaços e o
sangue nos capilares adjacentes. As regiões entre alvéolos adjacentes são os septos
interalveolares, ocupados por um extenso leito capilar composto por capilares contínuos. O
tecido conjuntivo do septo interalveolar é rico em fibras elásticas e fibras de colágeno tipo
III. As paredes dos alvéolos são compostas por dois tipos celulares: pneumócitos tipo I e
pneumócitos tipo II (Gartner e Hiatt, 2009). Os pneumócitos do tipo I revestem cerca de
90% da superfície alveolar e constituem 40% da população das células totais das vias aéreas
superiores. Por essa razão, a principal função atribuída a essas células é estrutural. Os
pneumócitos tipo II junto com as células do tipo I constituem cerca de 60% da população
alveolar, recobrindo de 5 a 10% da superfície dos alvéolos. A principal função descrita para
o pneumócito do tipo II é a produção do surfactante pulmonar, uma mistura lipoproteica com
propriedades tensoativas com participação no reparo do epitélio alveolar após a destruição
dos pneumócitos do tipo I. Além disso, os pneumócitos tipo II são capazes de reconhecer e
responder à presença de lipopolissacarídeo (LPS), sugerindo que essas células podem
desempenhar um papel na resposta pulmonar a agentes patogênicos (Corvol et al., 2009).
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CAMPOS, K.K.D.
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Figura 1. Esquema da estrutura alveolar. https://pt.dreamstime.com/imagem-de- stock-alv%C3%A9olos-em-
doen%C3%A7as-de-pulm%C3%A3o-image18730071.
O consumo de tabaco é atualmente a principal causa isolada e evitável de doença e
morte no mundo, incluindo o câncer de pulmão, enfisema pulmonar, bronquite crônica e
doenças cardíacas (Dalrymple et al., 2015). O tabaco mata cerca de 6 milhões de pessoas
por ano (mais da metade de seus usuários) e o números de mortes anual pode aumentar para
mais de oito milhões até em 2030 (Wang et al., 2015).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) metade dos usuários de
tabaco eventualmente morrerão em consequência das doenças causadas pelo fumo.
Aproximadamente seis milhões de mortes são atribuídas anualmente ao tabaco e metade
dessas mortes ocorre em idade produtiva entre 45-54 anos. Até 2030, essas cifras podem
duplicar, principalmente em países de baixa renda e menor escolaridade. Atualmente, em
todo o mundo, cerca de 1 bilhão de homens e 300 milhões de mulheres fumam regularmente.
Ou seja, um terço da população adulta é fumante, em média 48% dos homens e 10% das
mulheres, com uma preocupante tendência de aumento de consumo entre as mulheres. No
Brasil, a prevalência de fumantes na população adulta é em torno de 16%. O Instituto
Nacional do Câncer (INCA) calcula que no País, 200.000 mortes por ano poderiam ser
evitadas se as pessoas não fumassem. Além disso, quem inala à FC também corre o risco de
adoecimento e morte principalmente por exposições prolongadas no local de trabalho,
ambientes de lazer de uso coletivo ou mesmo em casa, onde as crianças são as principais
vítimas do fumo involuntário. Esse fato ainda é pouco conhecido, porém não menos grave.
Revisão bibliográfica
CAMPOS, K.K.D.
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O tabagismo é a principal causa de poluição em ambientes fechados e ainda não existe
sistema de ventilação que elimine as substâncias tóxicas da fumaça ambiental e, portanto, de
seus riscos à saúde humana. Como a saúde das pessoas que não fumam também é afetada
pela FC nos ambientes, é necessário criação de ambientes 100% livres de fumaça, para todos,
em todos os locais de uso comum (Saúde, 2010). Várias abordagens para o tratamento
farmacológico e não farmacológico para DPOC são recomendadas. Neste contexto,
pacientes com uma longa história de tabagismo, seus sintomas não cessam mesmo depois de
parar de fumar, indicando uma progressão da doença por inflamação e mecanismos de
desequilíbrio redox (Pinho-Ribeiro et al., 2017).
A FC pode ser dividida em duas fases; a fase de alcatrão e de partículas e de gases.
Cada uma dessas fases é uma fonte significativa de radicais livres. Na fase gasosa, a cada
volume exalado da FC contém aproximadamente 1015 radicais livres e um grama de alcatrão
tem 1017 radicais livres. Moléculas estáveis presentes na fase de alcatrão podem gerar
radicais livres, ao longo de um período de tempo prolongado. A fase gasosa da FC contém
mais intermediários de oxidação estáveis, que têm o potencial de induzir o desequilíbrio
redox endógeno e inflamação, incluindo aldeídos tais como acetaldeído, acroleína e
crotonaldeído (Cantin e Richter, 2012). Estima-se que o volume médio de aspiração em uma
inalação de FC seja de 35 mL. O número médio de aspirações por cigarro é de 15, o que
indica que um fumante inala 525 mL de fumaça por cigarro, 13L por dia para um maço/dia
ou 5.000 L por ano (Cantin e Richter, 2012). O material particulado da fumaça de cigarro
se deposita nas vias aéreas e nas superfícies das células epiteliais alveolares onde estimulam
a NADPH oxidase, o recrutamento de macrófagos alveolares e de células
polimorfonucleares, resultando na liberação de ânion superóxido extracelular e H2O2 (Cantin
e Richter, 2012). A NADPH-oxidase é um complexo de enzima ligada à membrana que pode
transportar elétrons ao longo da membrana plasmática, que reduz oxigênio molecular em
ânion superóxido o qual reage com outras espécies gerando outras ERO (Figura 2).
Subsequentemente, esse aumento intracelular das ERO pode ativar várias vias de sinalização
ERO-sensíveis, tais como, as proteínas-cinase ativadas por mitógenos (MAPKs), fatores de
transcrição, tais como o fator nuclear-kB (NF-kB) e promover a expressão gênica de
mediadores inflamatórios (Wu et al., 2014). Devido ao envolvimento das vias de sinalização
ERO-sensíveis, terapias antioxidantes destinadas a amenizar o desequilíbrio redox podem
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CAMPOS, K.K.D.
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ser benéficas, auxiliando na melhora da inflamação pulmonar induzida por FC (Liu et al.,
2014).
Figura 2. Estrutura da enzima NADPH Oxidase não fagocítica. NOX1, NADPH oxidase; NOXO1, NADPH
oxidase organizador; NOXA1, ativador de NADPH oxidase (Adaptado de McCann e Roulston, 2014).
2.2. Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC)
A Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica (DPOC) vem ocupando importante posição
entre as doenças que mais geram mortalidade e morbidade em todo mundo (Phillips et al.,
2015; Tabata et al., 2015). A DPOC é uma doença inflamatória do pulmão caracterizada por
uma limitação do fluxo aéreo que não é totalmente reversível que compreende a bronquite
crônica (hipersecreção de muco) e o enfisema pulmonar (destruição da parede alveolar)
sendo ambas induzidas pela exposição à FC (Figura 3) (Friedrichs et al., 2014).
Revisão bibliográfica
CAMPOS, K.K.D.
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Figura 3. Esquema anatômico representativo de um alvéolo no enfisema e um alvéolo normal e de enfisema e
bronquite crônica. Adaptado de A.D.A.M Image. http://adamimages.com/Emphysema-Illustration/PI7850/F3.
https://www.123rf.com/photo_11387384_smoking-and-emphysema.html.
A bronquite crônica e o enfisema pulmonar estão associados com uma resposta
inflamatória anormal dos pulmões (Lee e Yang, 2012; Lee, 2012; Shaykhiev e Crystal, 2013;
Phillips et al., 2015) e com a inflamação crônica do trato respiratório que é mediada pela
expressão aumentada de proteínas inflamatórias, tais como citocinas, quimiocinas,
moléculas de adesão e enzimas inflamatórias (Barnes, J., 2008). O enfisema
pulmonar é caracterizado pela dilatação excessiva dos alvéolos pulmonares, o que causa a
perda de capacidade ventilatória e uma oxigenação insuficiente. A bronquite crônica ocorre
a inflamação dos brônquios, onde as vias aéreas se encontram estreitas, tensas e muitas vezes
cheias de muco, resultando na redução da passagem do ar (Phillips et al., 2015).
A DPOC afeta mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo e deverá se tornar
a terceira principal causa de morte em todo o mundo até 2020 (Pinho-Ribeiro et al., 2017).
A DPOC caracteriza-se pela deterioração das pequenas vias aéreas e pela obstrução
associada à inflamação celular e à remodelação estrutural. Duas teorias estão diretamente
associadas à patogênese do enfisema: desequilíbrio de oxidantes e antioxidantes e
desequilíbrio de proteases e antiproteases (Valenca et al., 2011). O principal fator de risco
para a DPOC é o consumo de tabaco (Machado et al., 2018). Embora seja bem estabelecido
que os fatores genéticos e ambientais contribuem para o desenvolvimento da DPOC (Wood
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CAMPOS, K.K.D.
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e Stockley, 2006), a doença é encontrada predominantemente em fumantes (Eisner et al.,
2005; Kearley et al., 2015; Tabata et al., 2015).
A superfície do epitélio das vias aéreas e dos espaços aéreos é a primeira linha de
defesa dos pulmões contra inalantes tóxicos. Os eventos que ocorrem nesses compartimentos
do trato respiratório são relevantes para a patogênese de doenças respiratórias provocadas
pelo tabagismo, em particular, a DPOC (Friedrichs et al., 2014). A inflamação persistente
das vias aéreas em pacientes com DPOC é caracterizada por um elevado número de
neutrófilos, bem como pela presença de macrófagos ativados e linfócitos T, particularmente
CD8+. Essas células efetoras imunitárias liberam uma variedade de mediadores, incluindo a
interleucina-8 (IL-8) e fator de necrose tumoral-α (TNF-α), os quais são capazes de sustentar
a inflamação neutrofílica que caracteriza a doença. Os neutrófilos são necessários no pulmão
saudável, onde representam um importante componente da imunidade inata, protegendo
indivíduos saudáveis contra a infecção (Silva e Correia-Neves, 2012). No entanto, em
pacientes com DPOC, os neutrófilos causam danos quando se acumulam nos locais de
inflamação. O acúmulo de neutrófilos é um processo que consiste de recrutamento da
corrente sanguínea para os pulmões, como resultado de fagocitose de células apoptóticas
(Quint e Wedzicha, 2007). O recrutamento e a ativação de neutrófilos leva à produção de
grandes quantidades de radicais livres e a liberação de enzimas granulares, tais como as
metaloproteinases de matriz (MMP). Assim, o aumento da carga oxidativa nos pulmões dos
fumantes induzida pela inalação à FC é reforçada pela liberação de radicais de livres a partir
de leucócitos inflamatórios ativados, em particular os neutrófilos (Friedrichs et al., 2014).
A FC inalada ativa células epiteliais e macrófagos, as quais liberam vários fatores
quimiotáticos que atraem células inflamatórias para os pulmões (Figura 4), incluindo a
quimiocina ligante 2 de (CCL2), que atua no receptor de quimiocina CCR2 para atrair
monócitos, a quimiocina ligante CXC-1 (CXCL1) e CXCL8, que atuam sobre CCR2 para
atrair neutrófilos e monócitos (que se diferenciam em macrófagos nos pulmões) e CXCL9,
CXCL10 e CXCL11, que atuam sobre CXCR3 para atrair células T helper 1 (TH1) e células
T citotóxicas tipo 1 (TC1). Essas células inflamatórias juntamente com macrófagos e células
epiteliais liberam proteases, como a metaloproteinase 9 da matriz (MMP9), que causam
degradação de elastina e enfisema pulmonar. A elastase de neutrófilos também causa
hipersecreção de muco. As células epiteliais e os macrófagos também liberam o fator de
crescimento transformante-β (TGFβ), o qual estimula a proliferação de fibroblastos,
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resultando em fibrose nas vias aéreas inferiores (Barnes, P. J., 2008). Um aumento no
consumo de cigarros e da poluição ambiental nos países em desenvolvimento são as razões
mais importantes para o aumento no números de pacientes com DPOC. Devido à gravidade
da doença e crescentes custos à saúde, existe interesse em entender os mecanismos celulares
e moleculares da DPOC, o que pode levar a novas abordagens terapêuticas (Boutten et al.,
2010).
Figura 4. Células inflamatórias e imunes envolvidas na DPOC. A FC inalada ativa células epiteliais e
macrófagos, as quais liberam vários fatores quimiotáticos que atraem células inflamatórias para os pulmões
(Figura 4), incluindo a quimiocina ligante 2 de (CCL2), que atua no receptor de quimiocina CCR2 para atrair
monócitos, a quimiocina ligante CXC-1 (CXCL1) e CXCL8, que atuam sobre CCR2 para atrair neutrófilos e
monócitos (que se diferenciam em macrófagos nos pulmões) e CXCL9, CXCL10 e CXCL11, que atuam sobre
CXCR3 para atrair células T helper 1 (TH1) e células T citotóxicas tipo 1 (TC1). Essas células inflamatórias
juntamente com macrófagos e células epiteliais liberam proteases, como a metaloproteinase 9 da matriz
(MMP9), que causam degradação de elastina e enfisema pulmonar. A elastase de neutrófilos também causa
hipersecreção de muco. As células epiteliais e os macrófagos também liberam o fator de crescimento
transformante-β (TGFβ), o qual estimula a proliferação de fibroblastos, resultando em fibrose nas vias aéreas
inferiores (Barnes, P. J., 2008).
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2.3. Licopeno
Os carotenóides são pigmentos fotossintéticos encontrados no tecido dos vegetais
podendo ser adquiridos pelos humanos através da dieta, principalmente pela ingestão de
frutas e verduras. Esses compostos têm sido apontados como agentes protetores em
neoplasias, além de outras doenças crônicas como catarata e cardiopatias. A disponibilidade
dos carotenóides das matrizes dos alimentos, sua solubilização no intestino que requer a
presença de gorduras e ácidos conjugados da bile, e sua absorção nas mucosas intestinais
são processos biológicos importantes (Zadak et al., 2009). Uma dieta mediterrânea é
amplamente aceita como saudável e um de seus componentes é o tomate (Lycopersicum
esculentum), uma fonte dietética abundante de licopeno (Li et al., 2015). O licopeno é um
composto pertencente à família dos carotenóides com propriedades antioxidantes e
características lipossolúveis e responsável pela cor vermelha de muitas frutas e vegetais
(Figura 5).
Figura 5. Conteúdo de licopeno nos alimentos (Adaptado de (Rao, 2002).
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Tabela 1. Quantidade de licopeno em produtos derivados do tomate
Quantidade de licopeno
(mg/100g) ± Desvio padrão Origem
9,27 ± 1,02 Tomates crus
17,23 ± 2,18 Ketchup
15,99 ± 0,90 Molho de espaguete
55,45 ± 4,33 Extrato de tomate
16,67 Purê de tomate
17,98 ± 1,47 Molho de tomate
Fonte: (Rao, 2002)
O licopeno é um hidrocarboneto altamente insaturado de cadeia aberta, constituído
por onze ligações duplas conjugadas linearmente e duas ligações duplas não conjugadas
(Palozza et al., 2012; Zhao et al., 2017). Apresenta um peso molecular de 536,9 g/mol e uma
absorção máxima de 470 nm. As duplas ligações podem existir na configuração trans e cis.
All-trans, 5-cis, 9-cis, 13-cis e 15-cis são as formas isoméricas mais comumente
identificadas (Figura 6) (Rao et al., 2006).
Figura 6. Fórmula estrutural representando as configurações all-trans e 5-cis-licopeno (Adaptado de
Friedman, 2013).
A configuração all-trans é encontrada no tomate in natura, porém a molécula é
susceptível a isomerização durante processamentos (exposição ao calor, luz, ácidos e
oxigênio) o que leva a liberação do licopeno da matriz da estrutura celular, aumentando sua
bioacessibilidade. A geometria do isômero cis permite uma eficiente incorporação do
licopeno em micelas no lúmen do intestino delgado, em quilomícrons nos enterócitos e em
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lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL) pelo fígado. A gordura dietética também
aumenta a biodisponibilidade do licopeno fornecendo estímulos para a secreção da bile para
a formação das micelas e incorporação de lipídios, licopeno e outros componentes
lipofílicos. A biodisponibilidade dietética do licopeno é portanto, maior depois de cozinhar
ou processar tomates e quando os produtos do tomate são consumidos com óleo (Burton-
Freeman e Sesso, 2014). A digestão do licopeno começa no lúmen gastrointestinal onde as
enzimas digestivas podem modular sua bioacessibilidade, facilitando a sua liberação da
matriz dos alimentos para as micelas (Borel et al., 2015). A absorção do licopeno pela
mucosa intestinal é auxiliada pela formação de micelas lipídicas e de ácidos biliares.
Acreditava-se que o licopeno fosse absorvido nas células da mucosa intestinal por difusão
passiva (Boileau et al., 2002), porém, estudos recentes indicam a participação de um
processo ativo via receptor scavenger classe B tipo 1 (SR-B1) (Figura 7) (Petyaev, 2016).
Esse receptor é encontrado no intestino delgado de humanos, bem como no fígado, pulmões,
glândulas supra-renais, ovários, placenta, rins, próstata e cérebro. Portanto, SR-B1 pode ser
parcialmente responsável pelo transporte de carotenóides a partir de lipoproteínas para os
tecidos e dos tecidos para lipoproteínas (Wang, 2012). Os enterócitos possuem duas enzimas
com o potencial de clivar o licopeno após sua absorção. O licopeno é clivado principalmente
pela enzima β-caroteno 9,10 oxigenase (BCO2), e em menor ou quase nenhuma atividade
pela enzima a β- caroteno 15, 15 oxigenasse-1 (BCO1). A fração de licopeno que permanece
no enterócito é transportada dentro da célula para o local onde é incorporado em
quilomícrons, que são secretados no sistema linfático e transportados para o fígado. O
licopeno é então transportado por lipoproteínas no plasma para ser distribuído a outros
órgãos (Boileau et al., 2002). A distribuição de licopeno entre os tecidos é muito seletiva.
Os testículos, supra-renais, fígado e a próstata tem a maior concentração de licopeno,
enquanto outros órgãos apresentam uma menor concentração deste carotenoide. Portanto, é
provável que as diferenças nos níveis teciduais de licopeno estejam relacionadas à variação
na expressão de receptores de lipoproteínas e transportadores de colesterol (Petyaev, 2016).
Em humanos, a absorção do licopeno é em torno de 10 a 30% do que foi ingerido, sendo o
restante excretado pelas fezes e urina. Muitos fatores biológicos e do estilo de vida do
indivíduo afetam a absorção do licopeno incluindo idade, sexo, status hormonal, massa
corporal, níveis lipídicos sanguíneos, tabagismo, etilismo e a presença de outros
carotenóides no alimento consumido (Rao et al.,2000).
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CAMPOS, K.K.D.
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Figura 7. A porção ingerida de licopeno liberada da matriz da estrutura celular torna-se solubilizada e
emulsionado dentro do lúmen intestinal e é transportado via receptor scavenger classe B tipo 1 (SR-B1)
através do epitélio do intestino delgado (Adaptado de Petyaev, 2016).
O licopeno é um composto bioativo não nutriente mais predominantemente
encontrado no plasma humano, com um tempo de meia vida de 2 a 3 dias segundo estudos
de Stahl e Sies (Stahl e Sies, 1992). Porém, sabe-se que o tempo de meia vida varia de acordo
com a forma isomérica presente. No plasma humano, o licopeno encontra-se como uma
mistura de formas isoméricas, sendo encontrados 50% na forma cis (Rao et al.,2000).
Análises da quantidade de licopeno sérico e tecidual mostraram a presença do isômero cis
em modelos experimentais alimentados predominantemente com a forma all-trans do
licopeno, mostrando que a conversão também ocorre após a ingestão do alimento (Jiang et
al., 2015). Relatos da literatura sugerem que o licopeno tem ação antioxidante devido a sua
habilidade de sequestrar o oxigênio singleto (1O2) e capturar radicais livres. A desativação
do (1O2) envolve a transferência de energia do (1O2) para o carotenóide, gerando O2 no estado
fundamental e carotenóide no estado tripleto excitado (Di Mascio et al., 1989). A energia
absorvida pelo carotenóide é dissipada por vibrações e rotações e as interações destas com o
meio circundante. O carotenóide permanece intacto no final do processo, estando apto para
novas desativações. A capacidade desativante do carotenóide depende do número de duplas
ligações conjugadas e dos grupos terminais do carotenóide. Desta forma, o licopeno pode
p.roteger in vivo contra a oxidação de lipídios, proteínas e ácido desoxirribonucleico (DNA)
(Gajowik e Dobrzynska, 2014). Um dos mecanismos de ação do licopeno é a atividade
antioxidante, sendo dentre os 50 tipos de carotenóides, o que apresenta maior efeito protetor
Revisão bibliográfica
CAMPOS, K.K.D.
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contra reações de oxidação. Outros mecanismos de proteção do licopeno foram relatados por
Di Mascio et al., 1989 e Solis et al., 2013, como a diminuição da proliferação celular, efeito
hipercolesterolêmico, modulação das vias das ciclo-oxigenases, além de também estar
envolvido nos processos inflamatórios (Di Mascio et al., 1989; Trejo-Solis et al., 2013).
As respostas antioxidantes relacionadas a exposição à FC são extremamente
importantes para manter a homeostase protéica, garantir a integridade do parênquima
pulmonar e muitas dessas respostas adaptativas dependem da via do fator nuclear eritróide
2 relacionada com o fator 2 (Nrf2) (Cantin e Richter, 2012). Em resposta ao desequilíbrio
redox, o Nrf2 se dissocia da proteína Keap1 e segue em direção ao núcleo induzindo a
expressão de genes para enzimas antioxidantes. O Nrf2 possui um papel importante na
indução da expressão das enzimas de defesa celulares (Suzuki e Yamamoto, 2015). Assim,
Nrf2 ativa uma variedade de processos de defesa celular, aumentando assim a capacidade
total das células para desintoxicar e eliminar as substâncias nocivas (Boutten et al., 2010).
Embora o mecanismo molecular pelo qual o licopeno induz a translocação nuclear
do Nrf2 seja desconhecido, Lian e Wang (Lian e Wang, 2008) propuseram que os grupos
aldeídos altamente reativos presentes em metabolitos derivados de licopeno formam bases
de schiff com o grupo N-terminal da proteína Keap1, essa reação modifica os resíduos de
cisteína de Keap1 impedindo assim, a ubiquitinação e subsequente degradação do complexo.
Ocorre a dissociação de Keap1, permitindo a translocação do Nrf2 do citoplasma para o
núcleo (Figura 8). O licopeno também pode ativar outras vias de sinalização que levam a
dissociação do complexo (Lian e Wang, 2008).
Revisão bibliográfica
CAMPOS, K.K.D.
36
Figura 8. Um possível mecanismo de regulação Nrf2 pelo licopeno. Sob condições normais, o Nrf2 é retido
no citoplasma associado a proteína Keap1. Após a ativação de proteínas cinases (MAPKs, PI3K, PKC, e ERK)
e/ou os efeitos diretos sobre Keap1, Nrf2 é dissociado da Keap1 e translocado para o núcleo, onde o Nrf2 se
associa com proteínas Maf ligando-se ao AREs. O licopeno induz a translocação nuclear de Nrf2. Um
mecanismo possível envolve a interação direta de licopeno com os resíduos de cisteína de Keap1, que
desencadeia a liberação de Nrf2 do complexo (Trejo-Solis et al., 2013; Liu et al., 2014).
Os efeitos anti-inflamatórios do licopeno encontrados na maioria dos estudos, pode
ser atribuído principalmente à sua capacidade de modular vias responsáveis pela indução de
mediadores inflamatórios, bem como a via de sinalização do NF-kB (Hazewindus et al.,
2014). O NF-kB é um heterodímero constituído de duas subunidades: p65 (também chamada
RelA) e p50. Além dessas, outras subunidades foram descritas, tais como a c-Rel, RelB, e
p52, sendo provável que diferentes tipos de combinações sejam capazes de ativar diferentes
genes ou ainda bloquear a transcrição do p50/RelA (Wu et al., 2014). Quando não
estimulado, o fator NF-kB encontra-se no citoplasma ligado a uma proteína inibitória, a IkB.
Esse complexo impede a translocação do NF-kB para o núcleo. A fosforilação e a
degradação do IkB são necessárias para que ocorra a translocação (Trejo-Solis et al., 2013).
Vários estímulos levam à fosforilação do IkB, que é fundamental para sua degradação. A
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proteína IkB fosforilada recebe a adição de ubiquitina, pela ação da ubiquitina ligase, sendo
em seguida degradada pelo complexo proteossoma 26S. Isso resulta na liberação do NF-kB.
O desmembramento do complexo IkB/NF-kB permite o transporte do NF-kB para o núcleo
e sua ligação nos genes que apresentam a sequência regulatória GGGACTTTCC junto à
região promotora, levando a um aumento na expressão do gene alvo envolvidos na resposta
inflamatória, o que agrava o quadro de enfisema e DPOC (Trejo-Solis et al., 2013). Estudos
já demonstraram que o licopeno possui atividade anti-inflamatória, ao se ligar a proteína
IkB, o licopeno impede sua dissociação o que mantém a mesma ligada ao NFkB, dessa forma
não ocorre sua translocação do citoplasma para o núcleo (Figura 9) (Trejo-Solis et al., 2013;
Liu et al., 2014).
Figura 9. Ligações entre oxidantes inalatórios e / ou celulares e inflamação. O fator NF-kB encontra-se no
citoplasma ligado a uma proteína inibitória, a IkB. A fosforilação e a degradação do IkB são necessárias para
que ocorra a translocação. A proteína IkB fosforilada recebe a adição de ubiquitina, pela ação da ubiquitina
ligase, sendo em seguida degradada pelo complexo proteossoma 26S. Isso resulta na liberação do NF-kB. O
desmembramento do complexo IkB/NF-kB permite o transporte do NF-kB para o núcleo e sua ligação nos
ARE levando a um aumento na expressão do gene alvo envolvidos na resposta inflamatória, o que agrava o
quadro de enfisema e DPOC.
Devido aos efeitos benéficos do licopeno, foram realizados inúmeros estudos em
diferentes órgãos com o objetivo de esclarecer os processos fisiopatológicos que envolvem
determinadas patologias e sua relação com a produção de radicais livres, tais como: o
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envelhecimento, o câncer, a aterosclerose e a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)
(Rao e Shen, 2002). De acordo com Rao e Shen, um consumo entre 5mg e 10 mg de licopeno
por dia é suficiente para obter os benefícios deste nutriente (Rao e Shen, 2002). Para Rao e
Agarwal, o consumo médio deste antioxidante deve ser de 35mg / dia. Deve notar-se que
essas dosagens são sugeridas para a população saudável (Av e . 2000). Li et al. relataram
que a suplementação diária por 8 semanas com suco de tomate contendo 32,5 mg de licopeno
em jovens saudáveis mostrou efeitos antiobesidade, antioxidação e anti-inflamatórios (Li et
al., 2015). Neste contexto, ainda não existem relatos na literatura sobre os possíveis efeitos
antioxidantes e anti-inflamatórios do licopeno no modelo de inflamação pulmonar em curto
e longo período induzida pela exposição à FC.
2.4. Desequilíbrio Redox
As ERO são encontradas em todos sistemas biológicos e tem origem no metabolismo
do oxigênio molecular (O2). Em condições fisiológicas o O2 sofre redução com aceitação de
4 elétrons, resultando na formação de água, durante esse processo são formados
intermediários reativos, tais como, os radicais superóxido, peróxido de hidrogênio e radical
hidroxila. As espécies reativas de oxigênio desempenham um papel importante na
sinalização e proliferação celular, homeostase, indução de apoptose e senescência (Luu et
al., 2015). Em condições fisiológicas normais, as ERO (isto é, O2-, H2O2 e OH.) são
produzidas em células aeróbicas durante várias reações metabólicas endógenas através de
um mecanismo conhecido como cadeia respiratória mitocondrial. Uma das principais causas
de superprodução de ERO é a inflamação crônica, que por sua vez, é causada por vários
fatores biológicos, químicos e físicos, incluindo infecção viral e microbiana, exposição a
radiações e produtos químicos, doenças auto-imunes e crônicas, consumo de álcool, fumaça
de cigarro e a baixa ingestão de antioxidantes alimentares.
As ERO podem ser divididas em dois grupos: os radicais livres e não-radicais
(Quadro 1). As moléculas contendo um ou mais elétrons desemparelhados são chamadas
radicais livres. Quando dois radicais livres compartilham seus elétrons desemparelhados, as
formas não radicalares são formadas (Birben et al., 2012; Bindoli e Rigobello, 2013). Um
radical livre é definido como uma espécie que apresenta um ou mais elétrons
desemparelhados (Birben et al., 2012; Bindoli e Rigobello, 2013).
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Quadro 1- Principais espécies reativas de oxigênio (radicais e não radicais) e de nitrogênio
Fonte: (Birben et al., 2012) e (Halliwel e Gutteridge, 2007).
O desequilíbrio entre oxidante/antioxidante em favor dos oxidantes é denominado
"desequilíbrio redox". Porém, atualmente tem-se uma definição mais abrangente para o
termo "desequilíbrio redox", o qual se estabelece quando ocorre um aumento transitório ou
persistente nos níveis de ERO, capaz de causar um distúrbio em vias de sinalização e levar
a modificações oxidativas de constituintes celulares que, se não contrabalançadas, pode
culminar na morte celular através de necrose ou apoptose (Lushchak, 2015). O aumento do
desequilíbrio redox pode resultar dos oxidantes presentes na FC e de poluentes presentes no
ar ambiente, mas também pode ser gerado por células inflamatórias ativadas, tais como
neutrófilos e macrófagos (Boutten et al., 2010). Espécies reativas são fundamentais para a
sinalização de moléculas, reações de biossíntese, defesas químicas e reações de
desintoxicação (Jones, 2006). Quando produzidas em condições fisiológicas desempenham
papéis importantes em funções regulatórias e em processos celulares, como na defesa contra
agentes infecciosos (Figura 10). Em concentrações baixas a moderadas funcionam em
processos celulares fisiológicos, mas em concentrações mais elevadas, produzem
modificações adversas aos componentes celulares, tais como lipídios, proteínas e o ácido
desoxirribonucleico (DNA) (Bindoli e Rigobello, 2013).
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Figura 10. Efeito fisiológico e patológico da produção de ERO. Quando produzidas em condições fisiológicas
desempenham papéis importantes em funções regulatórias e em processos celulares, como na defesa contra
agentes infecciosos. Em concentrações baixas a moderadas funcionam em processos celulares fisiológicos,
mas em concentrações mais elevadas, produzem modificações adversas aos componentes celulares, tais como
lipídios, proteínas e o ácido desoxirribonucleico (DNA). Adaptado de Bindoli et al.,2013.
Sabe-se que o oxigênio é um aceptor final de elétrons ideal, pois possui uma alta
afinidade por elétrons. Em particular, a transferência de um único elétron ao O2 forma o
ânion superóxido (O2•-), enquanto a transferência de dois elétrons origina o peróxido de
hidrogênio (H2O2) (Buonocore et al., 2010). As ERO as quais são formadas endogenamente,
tal como o radical hidroxila -OH• que é gerada durante a respiração oxidativa, pode levar a
alterações químicas nas bases púricas e pirimídicas que, por sua vez, afetam a integridade
do gene. No entanto, é improvável que -OH• gerado no compartimento celular possa
difundir-se para o núcleo da célula, devido à sua extrema reatividade, desta forma tem sido
proposto que o H2O2 sirva como uma forma difusível latente de -OH• que reage com um íon
metal de uma molécula de DNA para gerar as espécies oxidantes (Birben et al., 2012).
Embora as ERO possam ter como fonte vários compartimentos citoplasmáticos, a
mitocôndria é considerada a principal fonte intracelular de geração de ERO (Turrens, 2003).
O principal local de geração do radical superóxido ocorre na Coenzima Q na cadeia de
transporte de elétrons e através das enzimas que possuem metais (citocromo P450, xantina-
oxidase e NADPH-oxidase) (Steinbrenner e Sies, 2009) (Figura 11). Os metais pesados
como ferro, cobre, mercúrio, níquel dentre outros são capazes de induzir a geração de
espécies reativas e causar danos via a depleção a atividade de algumas enzimas por meio da
peroxidação lipídica e reação com proteínas e DNA. Um dos mais importantes mecanismos
de geração de espécies reativas mediado pelos metais é pela reação de Fenton/Haber-Weiss.
O superóxido e o peróxido de hidrogênio podem interagir com metais em transição como
ferro e cobre para formar o radical hidroxila (Birben et al., 2012).
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CAMPOS, K.K.D.
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Metal3+ + O2- Metal2+ + O2 + OH- + •OH Haber-Wiess
Metal2+ + H2O2 Metal3+ OH- + •OH Reação de Fenton
Figura 11. Fontes endógenas de geração de ERO pela Mitocondrial, NADPH oxidase e Xantina oxidase
(Adaptado de Saban-Ruiz et al., 2013).
Tanto o desequilíbrio redox derivado da fumaça de cigarro inalada quanto o celular
levam a uma resposta inflamatória amplificada na DPOC (Geismann et al., 2014; Jia et al.,
2017). As ERO ativam vias centrais de sinalização tais como, MAPK quinases (ERK, JNK
e p38) levando à dissociação NF-kB-IkB. O NF-kB transloca para o núcleo e se liga aos
elementos de resposta específicos que levam à ativação de múltiplos genes inflamatórios
envolvidos na resposta inflamatória de pacientes com DPOC. Neste contexto, pode-se
afirmar que existe um “cross-talk” entre as vias do Nrf2 e do NF-kB (Figura 12). O Nrf2
protege as células contra o desequilíbrio redox e a inflamação, enquanto que o NF-κB
estimula a produção de mediadores inflamatórios e induz o desequilíbrio redox (Geismann
et al., 2014). O NF-κB ativa a ciclooxigenase-2 (COX-2), que suprime a fosfatidilinositol 3-
quinase e assim inibe a fosforilação do Nrf2 e sua liberação de Keap1 (Healy et al., 2005).
Revisão bibliográfica
CAMPOS, K.K.D.
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Em contrapartida, a enzima heme oxigenase-1 (HO-1) ativada por Nrf2 pode bloquear a
translocação do NF-κB para o núcleo inibindo a degradação da proteína IκB. No entanto,
esta informação é um pouco contraditória, uma vez que já se sabe que o NF-κB também tem
um efeito protetor contra as ERO e isso pode ser percebido pelo aumento da expressão de
genes antioxidantes como HO-1 (Ambrozova et al., 2017). O retorno das ERO à homeostase
devido aos genes antioxidantes ativados pela Nrf2, não só provoca uma inibição por
feedback que leva a uma redução na ativação deste fator de transcrição, mas também
indiretamente inibe a via do NF-κB. No entanto, essas duas vias também podem ser ativadas
reciprocamente: desequilíbrio redox desencadeado por NF-κB, retroativa o NF-κ B e
também facilita a translocação do Nrf2 para o núcleo para proteger as células contra a
inflamação e dano oxidativo (Ambrozova et al., 2017). Além disso, o Nrf2 pode auxiliar na
liberação do NF-κB da IκB por aumentar a atividade do proteasoma e, assim, potencializar
a degradação desta proteína inibitória.
Figura 12. A relação entre Nrf2 e NF-κB. Proteína de ligação CBP - CREB; COX-2 - ciclooxigenase-2; Gai2
- proteína G inibitória; HO-1-Heme oxigenase-1; IκB - proteína inibidora de NF-κB; IL-8 - interleucina 8;
Keap1 - Proteína 1-like associada a ECH. Kelch-like; NF-κB - fator nuclear-κB; Nrf2 - fator nuclear eritróide;
P - fosforilação; PI3K - fosfatidilinositol 3-quinase; ERO- espécies reativas de oxigênio. (Ambrozova et al.,
2017).
Revisão bibliográfica
CAMPOS, K.K.D.
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Existem mecanismos de proteção na célula para evitar o estresse oxidativo através
da redução dos distúrbios pro-oxidativos pelos antioxidantes (Uçar e Pandir, 2017). Durante
a evolução humana, as defesas endógenas foram gradualmente desenvolvidas, a fim de
manter o equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes. As enzimas antioxidantes convertem
muitos oxidantes a moléculas menos reativas, sem que sejam consumidas ou inativadas pelos
oxidantes (Cantin e Richter, 2012). Para evitar a formação excessiva, há dois sistemas
responsáveis pela neutralização das ERO: enzimático e não enzimático. Os sistemas
antioxidantes não-enzimáticos são compostos por moléculas estáveis o bastante para doar
um elétron a um radical livre e neutralizá-lo, reduzindo sua capacidade de dano.
Os antioxidantes não-enzimáticos, em sua maioria são exógenos, ou seja, necessitam
ser obtidos por diferentes fontes dietéticas. Os principais podem ser divididos em: Vitaminas
lipossolúveis (vitamina A e vitamina E), Vitaminas hidrossolúveis (vitamina C e vitaminas
do complexo B), os Oligoelementos (zinco, cobre, selênio, magnésio, etc) e os Flavonóides
(derivados das plantas) e carotenóides (licopeno e beta-caroteno) (Kaliora et al., 2006).
Alguns minerais podem exercer ação indireta contra a oxidação de lipídios atuando como
cofatores das enzimas antioxidantes superóxido dismutase cobre-zinco dependente (SOD-
Cu/Zn), superóxido dismutase manganês dependente (SOD-Mn) e glutationa peroxidase
(GPx) (Channon e Guzik, 2002). A defesa antioxidante primária é constituída por três
enzimas (Figura 13) importantes que impedem a formação e promovem a neutralização de
espécies reativas: glutationa peroxidase, que promove a redução de peróxidos, a catalase,
que converte o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular e a superóxido
dismutase, que converte o ânion superóxido em peróxido de hidrogênio (De Oliveira et al.,
2015).
Revisão bibliográfica
CAMPOS, K.K.D.
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Figura 13. Esquema da integração dos sistemas de defesa enzimáticos. (De Oliveira et al., 2015).
Em resumo, sabendo-se das características do licopeno como um antioxidante, o qual
atua de forma benéfica na prevenção de muitas doenças por exercer efeitos moduladores
sobre a inflamação e o desequilíbrio redox através da interação com um amplo espectro de
alvos moleculares (Simone et al., 2011; Hazewindus et al., 2014), os objetivos deste estudo
foram investigar os efeitos antioxidantes e anti-inflamatórias do licopeno na inflamação
pulmonar induzida pela exposição à FC. Utilizou-se um modelo in vitro da linhagem celular
J774 para determinar os efeitos do licopeno e do extrato da FC na citotoxicidade celular e
produção das EROs intracelular. Além disso, também utilizamos um modelo murino de
exposição em curto e longo período à FC para avaliar os efeitos do licopeno sobre o
desequilíbrio redox e a inflamação pulmonar.
Objetivos
CAMPOS, K.K.D.
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Avaliar in vitro e in vivo os efeitos do licopeno sobre o desequilíbrio redox e a
inflamação pulmonar induzida pela exposição à fumaça de cigarro.
3.2. Objetivos específicos
Estudo 1- In vitro
Avaliar a viabilidade celular da linhagem celular J774A.1 tratada com diferentes
concentrações de licopeno e exposta ao extrato de fumaça de cigarro;
Avaliar a produção basal das ERO em células administradas com licopeno e extrato
de fumaça de cigarro;
Investigar a influência da via de sinalização da PKC e da enzima NADPH oxidase
na produção das ERO na linhagem celular J774 administradas com o licopeno.
Estudo 2- In vivo (Administração com licopeno e Exposição à FC a Curto prazo)
Analisar e comparar os efeitos do licopeno sobre o influxo de células inflamatórias
para o parênquima pulmonar;
Avaliar os níveis dos marcadores inflamatórios;
Avaliar o efeito do licopeno sobre o padrão histológico do parênquima pulmonar;
Avaliar a atividade das enzimas antioxidantes;
Analisar o dano oxidativo, sob a forma de peroxidação lipídica e dano ao DNA no
parênquima pulmonar;
Investigar o efeito do licopeno sobre a expressão do Nrf2 no parênquima pulmonar;
Determinar os níveis de nitrito no parênquima pulmonar.
Estudo 3 – In vivo (Administração com licopeno e Exposição à FC a longo prazo)
Avaliar os parâmetros biométricos;
Avaliar os parâmetros hematológicos;
Objetivos
CAMPOS, K.K.D.
46
Analisar e comparar os efeitos do licopeno sobre o influxo de células inflamatórias
para o parênquima pulmonar;
Avaliar os níveis dos marcadores inflamatórios;
Avaliar o efeito do licopeno sobre o padrão histológico do parênquima pulmonar,
analisando a deposição de fibras colágenas;
Avaliar o efeito do licopeno sobre o desenvolvimento do enfisema no parênquima
pulmonar;
Avaliar a atividade das enzimas antioxidantes;
Analisar o dano oxidativo (peroxidação lipídica e dano ao DNA) no parênquima
pulmonar;
Investigar o efeito do licopeno sobre a expressão do Nrf2 no parênquima pulmonar;
Avaliar a atividade da mieloperoxidase (MPO) no lavado broncoalveolar (LBA);
Determinar os níveis de nitrito no parênquima pulmonar.
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
47
4. METODOLOGIA
4.1. Estudo 1- In vitro
4.1.1. Cultivo celular
As células J774 (macrófagos) foram gentilmente doadas pelo alunos de pós-
doutorado Carlos Henrique de Souza e Silva do Laboratório de Cultivo celular da Escola de
Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). As células J774 foram cultivadas
em frascos estéreis de crescimento de 75cm2 (SARDEST) contendo meio de cultura
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM - Sigma) e 10% (v/v) de soro fetal de bovino
(Invitrogen Co Ltd, Carlsbad, CA, EUA), 1% (v/v) de penicilina, 3,7% (v/v) de bicarbonato
de sódio, 1% (v/v) de glutamina (200 mM) e 2,5 mL de HEPES (1 M) (200 ng/mL). Os
frascos foram incubados em estufa umidificada a 37 °C com 5% de dióxido de carbono
(CO2). O meio foi substituído a cada dois ou três dias, de acordo com a confluência da
monocamada celular, que era diariamente observada em microscópio invertido. Os
subcultivos foram realizados quando as células apresentavam 100% de confluência para a
manutenção da linhagem. As células eram utilizadas para os ensaios quando a confluência
atingia em torno de 80%, assim o meio era aspirado e um raspador de células foi utilizado
para separar as monocamadas. Após o descolamento da monocamada, as células foram
retiradas do frasco, colocadas em tubos Falcon estéreis, completando-se o volume para 10
mL com meio DMEM. O tubo contendo as células foram centrifigados e após a
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet de células foi ressuspenso em 1 mL
de meio DMEM. Em seguida, foi realizada a contagem das células com Azul de Trypan
0,3% em Câmara de Neubauer. Para manter as células em estoque, periodicamente era
realizado um congelamento. As células (1,0 x 106 células/mL) foram armazenadas em
criotubos de 2 mL contendo 950 μL de Soro Fetal Bovino e 50 μL de DMSO.
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
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Esses criotubos foram identificados e armazenados no freezer a -80 °C por 24 horas.
Após as 24 horas, os criotubos foram transferidos para nitrogênio líquido. Para o
descongelamento, retirou-se o criotubo do nitrogênio líquido e transferiu-se todo o conteúdo
do criotubo para uma garrafa de 75 cm2, contendo meio de cultura suplementado com 10%
de Soro Fetal Bovino.
4.1.2. Preparação do extrato da fumaça de cigarro
O extrato da fumaça de cigarro (EFC) foi preparado a partir do cigarro filtrado
Virginia Marlboro (10 mg de alcatrão, 0,9 mg de nicotina e 10 mg de monóxido de carbono
por cigarro) como previamente descrito (Simone et al., 2011). Resumidamente, o cigarro foi
acoplado a uma seringa de 60 mL, com a qual dentro de uma capela de exaustão se injetou
a fumaça para o interior de um tubo falcon contendo 10 mL de DMEM suplementado com
1% de soro fetal bovino (SFB). O pH da suspensão resultante foi ajustado para 7,4 e em
seguida, filtrada através de um filtro Millipore de 0,22 µm. O EFC foi preparado no momento
de cada experimento e diluído com meio de cultura suplementado com 1% de SFB,
imediatamente antes da utilização. O meio controle contendo as células e 1% de SFB foi
preparado fazendo borbulhar ar através da seringa para o interior de um tubo falcon. O pH
foi ajustado para 7,4 e filtrado em condições estéreis, tal como descrito acima.
4.1.3. Ensaio de viabilidade celular (MTT)
O teste MTT (3-(4,5 dimethyazol-2yi)-2,5 diphenyltetrazolium bromide) constitui-se
em um modelo para avaliar a viabilidade celular, de forma rápida e objetiva, com base em
uma reação colorimétrica (Mosmann, 1983). A mitocôndria é a maior fonte das ERO através
da cadeia transportadora de elétrons, e o MTT reage com desidrogenases mitocondriais
indicando a atividade da cadeia transportadora de elétrons e consequentemente, a viabilidade
das células. O MTT quando incubado com células vivas, é reduzido por enzimas
mitocondriais como a succinato-desidrogenase, transformando um composto amarelo em um
composto violeta (Formazan). A quantidade de cristais de Formazan formados é diretamente
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
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proporcional aos números de células viáveis. Assim, quanto mais escura a coloração, ao final
da reação, maior a viabilidade celular e a atividade da cadeia respiratória. As células foram
colocadas em placas de cultura celular de 96 poços na concentração de 5x104 células em
cada poço em presença meio de cultura DMEM e 10% (v/v) de soro fetal de bovino, 1%
(v/v) de penicilina, 3,7% (v/v) de bicarbonato de sódio, 1% (v/v) de glutamina (200 mM) e
2,5 mL de HEPES (1 M) (200 ng/mL) perfazendo um volume final de 200 μL. As placas
foram então incubadas em estufa umidificada à 37ºC e 5% de CO2 por 24 horas para a
aderência das células, e formação da monocamada celular. Depois de decorrido este tempo,
o sobrenadante foi retirado e adicionou-se 180 μL de meio DMEM e 20 μL do licopeno
(Sigma L9879) nas concentrações 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 10.0 e 25.0 μM. Da mesma forma,
adicionou-se 180 μL de meio DMEM e 20 μL do extrato da fumaça de cigarro nas
concentrações 0.1%, 0.25%, 0.5%, 0.625%, 1.25%, 2.25%, 5% e 10%. As placas foram
então incubadas novamente em estufa umidificada à 37ºC e 5% de CO2 por 3, 6 e 24 horas.
Decorrido o tempo de incubação, o sobrenadante foi retirado e os poços lavados com PBS.
Foi adicionado 200 μL/poço de uma solução contendo 5,0 mg/mL de MTT em DMEM e
incubadas por 4 h a 37 °C. A solução de MTT foi então removida e 100 μL de
Dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados a cada poço. A leitura ocorreu na absorbância
de 570 nm. O cálculo utilizado para avaliar a porcentagem de viabilidade celular foi:
absorbância das células tratadas/ absorbância do controle x 100. Para cada tempo de
incubação foi realizado um controle (células não tratadas). A viabilidade das células foi
avaliada em relação ao controle (células sem qualquer tratamento- apenas com o meio). Ao
controle foi atribuído 100% de viabilidade. O licopeno foi dissolvido em tetra-hidrofurano
(THF). Para evitar a formação de peróxidos, o solvente continha 0,025% hidroxitolueno
butilado (BHT). As soluções estoques de licopeno foram preparadas imediatamente antes de
cada experimento. A partir das soluções estoques, alíquotas de licopeno foram rapidamente
adicionadas ao meio de cultura para se obter as concentrações finais indicadas. As culturas
controles foram tratadas com THF + BHT. A quantidade de THF adicionada às células não
foi superior a 0,5% (v/v) e foi a mesma em células controle, bem como células tratadas.
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
50
4.1.4. Tratamento
Após a confirmação de que o locopeno e os extratos da fumaça de cigarro nas
concentrações avaliadas não foram citotóxicos para células J774 (macrófagos) em 3 e 24
horas de incubação, foram realizados os tratamentos para as análises subseqüentes. As
células J774 foram pré-incubadas a 37°C 5% CO2 durante dois tempos distintos (3 e 24
horas), utilizando três concentrações diferentes de licopeno (0,5, 1 e 2 μM). Após a pré-
incubação, as células não estimuladas foram lavadas e utilizadas para os ensaios. Para a
análise da influência da PKC na modulação de ERO, após a lavagem, as células foram
incubadas durantes 45 minutos com PMA (50 nM), um análogo de diacilglicerol e potente
ativador da PKC, e ionomicina (100 nM), que é responsável pelo aumento da liberação de
cálcio. Subsequentemente, as células foram lavadas em solução de Hanks e usadas nos
ensaios.
4.1.5. Análise da produção de Espécies Reativas de Oxigênio
Para avaliação da produção das ERO em células da linhagem J44A.1 foi utilizado o
Kit Image-iT™ LIVE Green Reactive Oxygen Species (Invitrogen®) que permite a detecção
das ERO intracelulares pelo Leitor Automatizado Modelo VICTOR3®. A técnica utiliza um
marcador fluorogênico não fluorescente (5-ou-6)-carboxy-2′,7′ diclorodihidro fluorescein
diacetate (carboxy-H2DCFDA), que quando quebrado por esterases intracelulares não
específicas, gera a molécula carboxy-DCFH que reage com as ERO tornando-se
fluorescente. Os ensaios foram feitos após o descolamento das células nas garrafas. O
delineamento experimental foi realizado conforme ilustrado na figura 14. As células J774
(2,5 x 104 células/poço) foram colocadas em placas de cultura de 96 poços (Opaque 96-well
Microplate from PerkinElmer) com DMEM e 10% de SFB durante 45 minutos para
aderência da monocamada. Decorrido este tempo, o meio foi aspirado e as células foram
tratadas com o licopeno. Para avaliar o efeito do licopeno na formação das ERO em células
expostas ao extrato de fumaça de cigarro, as células foram pré incubadas com 0,5, 1,0 e 2,0
µM de licopeno (dissolvido em THF) durante 6 horas em estufa umidificada à 37ºC e 5% de
CO2, sob o abrigo de luz. Após 6 horas, o sobrenadante foi retirado e as células foram lavadas
com solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) e expostas por 3 e 24 horas a uma
concentração de 0,5% de extrato de fumaça de cigarro, neste momento foi adicionado além
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
51
do extrato de fumaça o marcador carboxi-H2DCFDA (25 μM) para avaliar a produção de
ERO. As células foram incubadas em estufa umidificada à 37ºC e 5% de CO2, sob o abrigo
de luz. Após incubação (3 e 24 horas), as células foram lavadas com HBSS e adicionou-se
o meio sem vermelho de fenol.
Afim de avaliar a Influência do licopeno sobre a produção de ERO através da via de
sinalização de PKC e da NADPH oxidase, as células (2,5 x 104//poço) foram ressuspensas
em meio DMEM e incubadas com licopeno 0,5, 1,0 e 2,0 µM (dissolvido em THF), com
Diphenyleneiodonium chloride (DPI) (20 μM), um inibidor da NADPH oxidase (controle
negativo) e com CALF (120 mM), um inibidor da PKC (controle negativo), durante 3 e 24
horas. De acordo com o tratamento das amostras, estas foram estimuladas ou não com PMA
e ionomicina, e todas foram incubadas com o marcador carboxi-H2DCFDA (25 μM) para
avaliar a produção de ERO. Estas amostras foram incubadas a 37°C, 5% CO2 durante 45
minutos, sob o abrigo de luz. Após a incubação, as células foram lavadas com HBSS e
adicionou-se o meio sem vermelho de fenol. A intensidade de fluorescência foi determinada
a 485 nm de excitação e 535 nm de emissão, utilizando um leitor de placas automatizado
modelo VICTOR X3®, software PerkinElmer 2030 workstation and workout 2.5. A média
de intensidade de fluorescência foi relatado como aumento porcentagem (%) em relação ao
controle.
TRATAMENTO COM LICOPENO (0,5, 1 e 2 μM) e EFC (0,5%)
A
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
52
TRATAMENTO SEM ESTÍMULO
TRATAMENTO COM ESTÍMULO
Figura 14. Delineamento experimental dos diferentes tratamentos. (A) Tratamento com licopeno
0,5, 1 e 2 μM + EFC0,5%. (B) Tratamento sem estímulo para avaliação basal de ERO. (C)
Tratamento com estímulo (PMA/ionomicina) para avaliação da via da PKC na modulação de ERO.
DPI: inibidor da NADPH oxidase, CALF: um inibidor da PKC, LICOPENO (0,5, 1, 2 μM), PMA:
ester de forbol.
4.2. Estudo 2 e 3 - In vivo
4.2.1. Animais
Camundongos C57BL/6 machos (Figura 15), com 8 semanas de idade, massa
corporal de aproximadamente 25 g foram obtidos do laboratório de Nutrição Experimental
da Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Os animais foram
acondicionados em caixas de polipropileno, com seis animais por caixa, mantidos em
ambiente com condições de temperatura, luz, umidade controladas, e receberam ração e água
ad libitum. Os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comissão de Ética no Uso
B
C
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
53
de Animais de Experimentação (CEUA) da UFOP (Protocolo n º 2014/05, que consta no
anexo I deste trabalho).
Grupos experimentais:
Os animais foram divididos em cinco grupos conforme descrição abaixo:
1. Grupo controle (GC): 8 camundongos machos manipulados sob condições iguais aos
grupos expostos à fumaça de cigarro, em ar ambiente;
2. Grupo exposto à fumaça de cigarro (GFC) — 8 camundongos machos expostos à
fumaça de cigarro durante 5 e 60 dias consecutivos; com um total de 12 cigarros;
3. Grupo que recebeu óleo via gavagem orogástrica (GO)— 8 camundongos machos;
receberam óleo durante 5 e 60 dias consecutivos; O óleo administrado foi de semente
de girassol (Sigma 88921).
4. Grupo administrado com licopeno 25 mg/kg/dia e exposto à fumaça de cigarro
(Li25+FC): 8 camundongos machos; administrados com licopeno e expostos à fumaça
de cigarro durante 5 e 60 dias consecutivos;
5. Grupo administrado com licopeno 50 mg/kg/dia e exposto à fumaça de cigarro
(Li50+FC): 8 camundongos machos; administrados com licopeno e expostos à fumaça
de cigarro durante 5 e 60 dias consecutivos.
Figura 15. Desenho experimental representando os experimentos in vivo.
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
54
4.2.2. Administração com licopeno
Os animais que foram administrados com licopeno receberam o licopeno via
gavagem orogátrica. De acordo com a literatura o tempo de meia vida do licopeno varia de
28 a 62 horas dependendo da dose (10-120mg) (Venkateswaran et al., 2009; Polívková et
al., 2010), nesse sentindo nós padronizamos para o nosso experimento o tempo de
administração 12 horas antes de cada exposição à fumaça de cigarro em duas concentrações
distintas (25 e 50 mg/kg/dia) para ambos os experimentos em animais. O licopeno
juntamento com o óleo de girassol foram alicotados uma vez por semana no escuro em tubos
falcons previamentes enrolados em papel alumínio e estocado na geladeira a 12ºC. Sempre
antes de cada administração, cada tubo falcon foi agitado em vórtex por 1 minuto. Os animais
dos grupos Li25+FC e Li50+FC receberam um volume final de 200 microlítrons de licopeno
+ óleo de girassol (7 ul licopeno+ 193 óleo de girassol por animal) via gavagem orogátrica
e o GO recebeu 200 microlítrons de óleo de semente de girassol (Sigma 88921) uma vez ao
dia ao final de cada exposição.
4.2.3. Exposição à fumaça de cigarro em curto e longo prazo
Camundongos C57BL/6 (n=40) foram expostos a um total de 12 cigarros comerciais
por dia, cigarros filtrados Virginia (10 mg de alcatrão, 0,9 mg de nicotina e 10 mg de
monóxido de carbono por cigarro) divididos em três vezes ao dia (manhã, tarde e noite,
quatro por inalação) em dois experimentos distintos durante cinco e sessenta dias
consecutivos. Já está descrito na literatura que o número total de 12 cigarros causa o enfisema
pulmonar em uma exposição à fumaça de cigarro em longo prazo (Bezerra et al., 2011). Os
camundongos expostos à fumaça de cigarro foram colocados na câmara de inalação (40-cm
comprimento, 30 cm- largura e 25 cm- altura), dentro de uma capela de exaustão (Figura
15). Cada cigarro foi acoplado a uma seringa plástica de 60 ml, com a qual se injetou fumaça
no interior da câmara de inalação. O procedimento de insuflar e desinsuflar a seringa
terminou com a queima do cigarro até o seu terço final, que durou em média 3 minutos. Um
cigarro gerou aproximadamente 01L de fumaça que foi diluído em 30 L (capacidade da
câmara). A concentração de fumaça no interior da câmara foi de 3% durante 6 minutos por
cigarro (que produziu concentrações de CO que varia de 250 para 350 ppm no interior da
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
55
câmara). Após este período, a câmara foi aberta para total exaustão da fumaça e, por um
minuto, os animais tiveram contato com o ar ambiente, quando então, o procedimento foi
repetido com os demais cigarros (Valenca et al., 2004); (Campos et al., 2017). Os animais
ventilados em ar ambiente nas mesmas condições foram considerados grupo controle (Figura
16). Após 24 horas da última exposição, os animais foram eutanasiados por deslocamento
cervical. O sangue, o lavado broncoalveolar e os pulmões foram coletados para posteriores
análises.
Figura 16. Esquema da Câmara de Inalação (40 cm de comprimento, 30 cm de largura e 25 cm de altura).
(Valenca et al., 2004).
4.2.4. Coleta do sangue
As alíquotas sanguíneas de cada animal foram coletadas por meio da punção cardíaca
em tubos de polipropileno com 15 µL de anticoagulantes. As alíquotas de sangue foram
encaminhadas ao Laboratório de Imunopatologia (LIMP) da UFOP para a realização das
análises hematológicas.
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
56
4.2.5. Parâmetros hematológicos
Para realização do hemograma, o sangue foi homogeneizado e os parâmetros
hematológicos avaliados no aparelho Bc2800vet auto Hematology Analyzer. Os parâmetros
determinados foram eritrócito, hematócrito e hemoglobina (Moreira et al., 2016).
4.2.6. Esfregaço sanguíneo
Para a realização do esfregaço sanguíneo, 2µL de sangue foi pipetado (pipeta
automática) em uma das extremidades de uma lâmina histológica estéril, com uma lâmina
extensora posicionada à 45º foi realizado um movimento firme e uniforme, deslizando-a
sobre a lâmina histológica formando uma fina camada de sangue sobre a lâmina. As mesmas,
foram coradas com o Kit Panóptico Rápido (Laborclin, Pinhais, Paraná, Brasil). Foram
contados um total de 100 leucócitos por lâminas, os quais foram diferenciados em
monócitos, neutrófilos e linfócitos (adaptado de Bezerra et al., 2006).
4.2.7. Coleta do lavado broncoalveolar (LBA)
Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. Imediatamente após a
eutanásia, o tórax de cada animal foi aberto para a realização do lavado broncoalveolar. O
pulmão esquerdo foi clampeado, a traqueia canulada e o pulmão direito foi lavado com 1,5
ml de solução salina (3 x 500 μL). As amostras foram mantidas em gelo até o final do
procedimento, a fim de evitar lise celular. Após o término de todos os grupos, as amostras
foram centrifugadas (Centrifuga Micro FANEM mod. 243M, São Paulo, Brasil) a 1500 x g
(4.700 RPM) por 10 minutos e o sobrenadante coletado e estocado em freezer (-80ºC).
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
57
4.2.8. Contagem total e diferencial de leucócitos do LBA
Para a contagem total de leucócitos no LBA, foi utilizada a câmara de Neubauer.
Nesta foi colocado 10 µl do LBA e 30 µL de corante azul de tripano 0,2%, obtendo assim
uma diluição 1:3. Logo após, os leucócitos foram contados nos quatro quadrados
encontrados nos extremos da câmara. Para a contagem diferencial de células no LBA, 250
μL das amostras foram pipetas e cito-centrifugadas em uma centrífuga cytospin (1000
rpm/min) (Shandon, Waltham, MA, EUA). Após obtenção das lâminas, estas foram coradas
com o kit Panóptico Rápido, através de um banho de imersão em três soluções distintas:
metanol, eosina e azul de metileno. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em água
corrente para a retirada do excesso de corantes e secadas em temperatura ambiente. Um total
de 100 células por lâmina foram contadas utilizando os critérios morfológicos padrão
(adaptado de Bezerra et al., 2006).
4.2.9. Processamento tecidual
Após a realização do lavado broncoalveolar, o ventrículo direito foi perfundido com
solução salina para remoção do sangue nos pulmões. O pulmão direito foi clampeado para
que fosse instilada, apenas no pulmão esquerdo, via traqueia, formalina tamponada 4% (pH
7,2) a uma pressão de 25 cm H2O por 2 minutos. O pulmão esquerdo então foi removido e
imerso em solução fixadora por 48 horas. Em seguida, o material foi processado da seguinte
forma: banho em água corrente por 30 minutos; banho em álcool a 70% e 90% por 1 h cada
etapa; 2 banhos em álcool a 100% por 1 h cada; 2 banhos de xilol de 1 h cada; 2 banhos em
parafina de 1 h cada e inclusão em parafina. Após processamento de rotina e inclusão em
parafina, foram feitos cortes seriados a quatro micrômetros de espessura, os quais foram
corados em Hematoxilina-eosina (HE), Trichrome de Masson e Corante Weigert,
respectivamente, para a análises morfométricas (Campos et al., 2015).
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
58
4.2.10. Análise histopatológica – Estereologia
A análise da densidade de volume do septo alveolar Vv [sa] foi realizada em um sistema-
teste composto por 16 pontos e em uma área-teste conhecida (Starcher, 2000) onde a linha
proibida foi considerada como delimitação, a fim de evitar uma superestimação no número
de estruturas. O sistema teste foi acoplado a um monitor ligado a um microscópio. O
números de pontos (PP) que atingiram os septos alveolares (Vv [sa]) e os espaços alveolares
(Vv[a]) foram avaliados de acordo com o números total de pontos de um sistema teste (Pt).
Então temos que Vv = . Para se obter amostras uniformes e proporcionais do pulmão,
foram analisados aleatoriamente 18 campos e um sistema ciclóide de ensaio sobreposto
sobre a tela do monitor. O volume de referência foi estimado pela contagem de pontos de
utilização dos sistemas de ponto de teste (PT). Uma área total de 1,94 mm2 foi analisada para
determinar as densidades de volumes dos septos alveolares (Vv[sa]) e dos espaços alveolares
(Vv[a]) em cortes corados em HE e densidade de volume de fibras colágenas em cortes
corados com Trichrome de Masson (Campos et al., 2015).
4.2.11. Medida do Intercepto Linear Médio – Lm
Para avaliar a extensão da lesão pulmonar (enfisema), realizou-se a análise
morfométrica das seções coradas com hematoxilina-eosina. Calculou-se a Medida do
Intercepto Linear Médio (Lm), um indicador do tamanho do espaço aéreo. Para se obter
amostras uniformes e proporcionais do pulmão, foram analisados aleatoriamente 16 campos
e um sistema de ensaio sobreposto sobre a tela do monitor. Esta técnica morfométrica
consiste na determinação do número de vezes que estruturas do parênquima de troca gasosa,
coradas com Hematoxilina-eosina, interceptam um conjunto de retas coerentes, por meio de
um retículo junto à ocular do microscópio com um sistema de 21 linhas e 42 pontos (Churg
et al., 2004) (Weibel, 1963). Portanto, se houver degeneração do tecido dos animais dos
grupos expostos à FC, o número de interceptos das estruturas alveolares será menor com
T
P
PP
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
59
relação ao dos animas controle, por conseguinte, o Lm será maior. As figuras 17A e 17B
apresentam fotomicrografias do retículo de Weibel.
(A) (B)
Figura 17. (A). Fotomicrografia do Retículo de Weibel, (B) Retículo de Weibel sobreposto a uma lâmina de
parênquima pulmonar de camundongo. (20x)
A partir das contagens de número de interceptos em cada laminas histológica determinou-se
o valor de LM a partir da equação:
Onde:
Ltot- comprimento total das retas do retículo, considerando-se o aumento (20X – 1250 nm)
Li- o número de interceptos de estruturas alveolares com as retas do retículo.
4.2.12. Homogeneizado tecidual
Em seguida à retirada do pulmão esquerdo para histologia, o pulmão direito foi
imediatamente removido e armazenado em gelo picado em tubos devidamente etiquetados.
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
60
Depois, o órgão foi homogeneizado (Homogeneizador Novatécnica mod. NT136,
Piracicaba, Brasil) em 1 ml de tampão fosfato de potássio pH 7,5 e centrifugado a 1500 g
(4.700 RPM) por 10 minutos. O sobrenadante foi coletado e o volume final de todas as
amostras ajustado para 1,5 ml com tampão fosfato. Essas amostras foram armazenadas em
freezer (-80ºC) para posteriores análises bioquímicas.
4.2.13. Biomarcadores do dano oxidativo e defesas antioxidantes no parênquima pulmonar
4.2.13.1. Níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
A peroxidação lipídica foi determinada através do ensaio de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitírico utilizando o método de Draper (Draper et al., 1993b). A determinação
da concentração de TBARS se baseia na capacidade do ácido tiobarbitúrico (TBA) em se
ligar a lipídeos oxidados. Resumidamente, 100 mg do parênquima pulmonar foram
homogeneizados com 1 mL de tampão Tris HCL 20mM (pH 7,4) e em seguida centrifugados
por 10 minutos a 4º C. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica. 200 μL
do sobrenadante do homogenato foram diluído em 300 μL de tampão Tris HCL e misturados
com ácido tricloroacético (TCA) (28% p/v em HCL 0,25N), TBA (1% em ácido acético
0,25M) e BHT (125 mM em etanol), aquecido por 15 min a 95º e em seguida colocado em
banho de gelo. O precipitado foi removido por centrifugação a 1000 xg por 15 minutos a 4º
C, e a absorbância do sobrenadante foi determinada a 532 nm. A água destilada foi utilizada
como branco. Os níveis de TBARS foram calculada utilizando o coeficiente de extinção
molar do MDA (15400 M-1 cm-1). Os resultados foram expressos em nM/mg proteína.
4.2.13.2. Estudo de fragmentação do DNA (Ensaio cometa)
Para a análise de danos ao DNA, aproximadamente 50 mg dos pulmões foram
homogeneizados após a eutanásia dos animais. Uma alíquota (100 µL) desta suspensão foi
misturada em 0,5% de agarose de baixo ponto de fusão (aquecida a 37 °C). Depositou- se a
mistura sobre uma lâmina de microscópio com uma camada de 1,5% de agarose de ponto de
fusão normal em PBS. As lâminas foram imersas numa solução gelada de lise (NaCl 2,5 M,
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
61
EDTA 100 mM, TrisHCl 10 mM, 10% de DMSO, 1% de Triton X-100, Sigma-Aldrich)
durante a noite a 4 °C. Ao fim da incubação, as lâminas foram retiradas da solução de lise
(no escuro) e transferidas para cuba de eletroforese (imersa em gelo), onde ficaram
descansando durante 20 min mergulhadas no tampão gelado para eletroforese (NaOH 30
mM e EDTA 1 mM, pH 13,0). A eletroforese foi então realizada a 300Ma, a 25 V durante
20 minutos. As lâminas foram neutralizadas com 0,4 M de tampão Tris-HCl (pH 7,4), fixada
em 100% de etanol e coradas com brometo de etidio (20 ug mL-1, Sigma-Aldrich). Os
cometas foram analisados utilizando um microscópio Axioplan de fluorescência (Carl Zeiss,
Alemanha), objetiva de 20x com filtro de 510-560 nm e barreira de 590 nm (Cortat et al.,
2013) (Campos et al., 2017). Uma célula cujo DNA sofreu muitas quebras tem a aparência
de um cometa vista ao miscroscópio, ou seja, apresenta uma cauda de DNA fragmentado
(desenovelado), com migração mais rápida do que o DNA intacto (superenovelado). As
células com DNA intacto apresentam forma circular no microscópio. O índice de dano ao
DNA foi determinado pela contagem e classificação de 100 cometas observados em uma
lâmina, sendo que cada amostra foi montada em duplicata. Os cometas foram classificados
em uma escala de 1 a 4 (como mostrado no quadro 2).
O índice do dano foi calculado de acordo com a equação abaixo:
Quadro 2: Imagens e pontuações de cada classe de cometas observados (Cortat et al., 2013)
Índice de dano ao DNA= [(nº de cometas classe 1 x 0) + (nº de cometas classe 2 x 1)
+ (nº de cometas classe 3 x 2) + (nº de cometas classe 4 x 3)].
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
62
Soluções:
Soluções de lise (estoque): 800 mL de água destilada, 146,1 g de NaCl, 37,2 g de EDTA, 1,2
g Tris, pH 10,0.
Soluções de lise: 89 mL de solução de estoque de lise, 10 mL de DMSO e 1mL de Triton X-
100.
Tampão para eletroforese pH 13,0 (estoque): A= NaOH 10 M (200g/500 mL H2O).
B= EDTA 200 mM (14,89 g/200 mL H2O), pH 10,0. Guardar ao abrigo da luz em
temperatura ambiente.
Tampão para eletroforese pH 13,0: 30 mL de solução A e 5 mL de solução B. Volume final
1 litro.
Tampão neutralizador: Tris 0,4 M – 48,5 g de Tris em 900 mL de água destilada (pH 7,5).
Volume final 1 litro.
Agarose NMP 1,5%: 300 mg de agarose de ponto de fusão normal em 20 mL de PBS-A.
Manter a 60º C.
Agarose LMP 0,5%: 100 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 20 mL de PBS-A.
Manter a 37ºC.
4.2.13.3. Proteínas totais
A dosagem de proteínas foi realizada nas amostras do homogeneizado tecidual pelo
Método de Bradford (Bradford, 1976). O reagente de Bradford contém como principal
componente o corante Coomasie brilhante azul, que em solução ácida se liga as proteínas da
amostra, alterando sua absorbância de 465 nm para 595 nm, medida através do leitor de
ELISA (Bio-Rad mod. 550, Hercules, EUA). Uma curva padrão foi produzida através de
concentrações crescentes da proteína albumina (0,5-10 μl) em triplicata.
As soluções utilizadas foram preparadas conforme descrito abaixo:
Reagente A: Foi dissolvido 0,01 g de albumina em 1 mL de água Mili-Q. A partir desta
solução, dilui-se para 0,5 mg/mL (200 uL da solução inicial em 3,8 mL H2O mili-Q= 4 mL
de albumina); Reagente B: A curva padrão de albumina conforme os volumes indicados na
segunda coluna do quadro 3.
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
63
Curva de diluição
Albumina
Albumina 0,01 g/mL Água Mili-Q
0,5 mg/mL 1000 µL _______
0,4 mg/mL 800 µL 200 µL
0,3 mg/mL 600 µL 400 µL
0,2 mg/mL 400 uL 600 µL
0,1 mg/mL 200 µL 800 µL
0,05 mg/mL 100 µL 900 µL
Para realização do ensaio, pipetamos 10 µL de albumina em cada ponto da curva (0,5; 0,4;
0,3; 0,2; 0,1; 0,05 mg/mL) e 190 µL de Corante Comassie Blue Diluído. Em seguida,
pipetamos na placa 10 µL de amostra diluída (2 µL amostra + 8 µL de água mili-Q) e 190
µL de Corante Comassie Blue Diluído. Incubamos a placa em temperatura ambiente por 30
minutos. Após esse período, a leitura foi realizada em leitor de ELISA utilizando-se o
comprimento de onda de 595 nm. Diluições seriadas de uma solução de concentração
conhecida de albumina bovina sérica foram utilizadas para a construção da curva de
calibração. Após análise de regressão linear, foram determinadas as equações da reta
utilizadas para determinação da concentração de proteínas totais no homogenato pulmonar.
4.2.13.4. Atividade da Superóxido dismutase (SOD)
A técnica para medir a atividade da enzima SOD, baseia-se na sua capacidade de
inibir a auto-oxidação do pirogalol, de acordo com (Marklund e Marklund, 1974). Portanto,
quanto maior a concentração de SOD na amostra, menor é a auto-oxidação do pirogalol.
SOD compete com o O2- formado pela auto-oxidação do pirogalol, que é responsável pela
redução do MTT em cristais de formazana. No ensaio, fragmentos de 100 mg do tecido
foram homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato (50mM, pH 7,0) e em seguida,
centrifugados por 10 minutos a 12.000 xg a 4°C. O sobrenadante foi retirado e usado como
amostra biológica. Foi pipetado na placa, 30 µL de amostra, 99 µL de tampão fosfato (50
mM, pH 7,0), 6 µL de MTT(1,25mM) e 15 µL de pirogalol (100 µM). Para o branco foi
pipetado 144 µL de tampão fosfato (50 mM) e 6 µL de MTT (1,25 mM) e para o padrão 129
µL de tampão fosfato (pH 7, 50 mM, 6 µL de MTT - 1,25 mM) e 15 µL de pirogalol (100
µM). Em seguida, a placa foi incubada por 5 minutos em estufa a 37°C. Logo após, 150 μL
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
64
de DMSO foram adicionados às mesmas para parar a reação. As absorbâncias foram lidas
no leitor de Elisa em um comprimento de onda de 570 nm, em leitor de Elisa. Os resultados
foram expressos em U de SOD/mg de proteína, onde uma unidade de SOD é definida como
a quantidade de enzima necessária para inibir 50% da redução do MTT.
4.2.13.5. Atividade da Catalase (CAT)
A atividade da CAT foi mensurada a partir da taxa de decréscimo de peróxido de
hidrogênio a uma absorbância de 240 nm, representada por U/mg de proteína (Aebi, 1984).
Esse método baseia-se na decomposição do H2O2 pela enzima observada durante 1 minuto
por espectrofotometria a 240 nm. Resumidamente, 100 mg do pulmão foram
homogeneizados em 1 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,2) e em seguida foram
centrifugados por 10 minutos a 10.000 rpm a 4 °C. O sobrenadante retirado foi utilizado
como amostra biológica. Em um becker, foi preparado uma solução Mix a qual era composta
de 25 mL de tampão fosfoto para 40 μL de peróxido de hidrogênio (30%), iniciando então a
reação. As absorbâncias foram determinadas exatamente a cada 10 segundos, durante um
minuto a 240 nm em espectrofotômetro com luz UV. O tampão fosfato foi utilizada como
branco para zerar o aparelho. A atividade da catalase foi determinada pela diminuição da
absorbância em 240 nm causada pelo desaparecimento o H2O2, de acordo com a Lei de
Lambert Beer, onde 1 U equivale a 1µmol de hidrólise de H2O2 por minuto, por mL:
Onde:
Abs = absorbância;
Ɛ = coeficiente de extinção molar em unidades de 39.4 M-1 cm-1;
VA = volume da amostra;
C = concentração do peróxido de hidrogênio expressa em mol L-1.
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
65
A absorbância utilizada corresponde ao delta de absorbância por minuto. Os resultados
foram expressos em unidade por miligrama de proteína. Uma unidade de catalase é
equivalente a decomposição de 1 μmol de H2O2 por minuto.
4.2.13.6. Atividade da Glutationa peroxidase (GPx)
A atividade da glutationa oxidada foi mensurada de acordo o método proposto por
(Paglia e Valentine, 1967) com adaptações. O método se baseia na oxidação da glutationa
reduzida (GSH), catalisada pela glutationa peroxidase, acoplada a reciclagem da GSSG
através da reação catalisada pela enzima glutationa redutase que utiliza o NADPH como
cofator. O decréscimo na absorbância medida a 340nm durante a oxidação do NADPH é
indicativo de atividade da glutationa peroxidase. Uma alíquota de 100 mg do parênquima
pulmonar foi homogeneizado em 1 mL de tampão Tris HCL 50 mM, pH 7,0 (tampão de
ensaio). Após centrifugação a 10.000 xg por 15 minutos a 4º C, o sobrenadante foi removido
e utilizado no ensaio. Foram adicionados em microplaca de 96 poços, 60 µL de tampão de
ensaio, 50 µL de amostra e 80 µL do mix (0,25 mM NADPH, 2,1 mM de GSH, 0,5 U/mL
de glutationa redutase e 1 mM de azida sódica). A azida sódica foi adicionada ao meio, para
inibir a catalase que também utiliza o peróxido de hidrogênio como substrato. A reação foi
iniciada pela adição de 10 µL de peróxido de hidrogênio (H2O2) 0,2 mM, utilizado como
substrato da reação. A decomposição do NADPH foi monitorado em leitor de placas a 340
nm. Foram realizadas seis leituras, com intervalo de dez ente elas. A atividade de GPx foi
calculada utilizando a formula descrita abaixo.
Onde;
ΔA340 é o delta da absorbância por minuto,
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
66
3,73 é o coeficiente de extinção molar do NADPH. O valor real do coeficiente de extinção
molar do NADPH em unidades de µmol-1 cm-1 é de 6,22; no entanto este valor foi ajustado
para o caminho ótico da solução em microplaca de 0,6 cm.
VR é o volume de reação em mL,
VA é o volume de amostra em mL.
Uma unidade de enzima é definida como a quantidade de enzima que causa a
oxidação de 1 µmol de NADPH por minuto a 25º C. A atividade específica foi expressa em
unidades por mg de proteína.
4.2.13.7. Análise do Sistema Glutationa (GSH total, GSSG, GSH e relação GSH/GSSG)
O conteúdo de glutationa total (GSH) e oxidada (GSSG) foi determinado no
homogenato pulmonar utilizando o método de reciclagem com o ácido 5,5´-Ditio-bis-[2-
nitrobenzóico], DTNB – GSSG (Griffith, 1980). Essa dosagem utiliza o método cinético
para mensurar os níveis de glutationa total (GSH+GSSG) em amostras biológicas, através
da redução do ácido 5,5´-Ditio-bis-[2-nitrobenzóico], DTNB à ácido 5-tio-2-nitrobenzóico,
TNB que pode ser detectado espectrofotometricamente a 412 nm. Para realizar a dosagem,
100 mg de pulmão foi homogeneizado com 1 mL de ácido sulfosalicílico 5% (SSA), e em
seguida centrifugado a 10.000 xg por 10 minutos à 4 ºC. O sobrenadante foi retirado e usado
como amostra biológica. A dosagem foi realizada em microplaca de 96 poços. Inicialmente
foram adicionados aos poços 150 μl da mistura de trabalho que contém glutationa redutase,
DTNB e 100 mM tampão fosfato de potássio. Em seguida, adicionou-se 10 μl de amostra
para os testes e 10 μl de 100 mM tampão fosfato de potássio para o branco. As amostras
foram incubadas por 5 minutos e em seguida a reação foi iniciada com a adição de 50 μl de
solução de NADPH. Com o início da reação, a absorbância foi imediatamente medida a 405
nm utilizando um leitor de placa de ELISA (Biotek ELx808). Foram realizadas 6 leituras
com intervalo de 1 minuto entre cada leitura. A concentração de GSSG foi determinada
através da derivatização da GSH presente na amostra com 2-vinilpiridina. Para isso, o
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
67
sobrenadante do homogenato pulmonar (100 μl) foi adicionado de 2 μl de 2-vinilpiridina. O
pH da solução foi ajustado para valores entre 6 e 7 utilizando 5 μl de trietanolamina (TEA)
e incubou-se por uma hora. Após este período, as amostras derivatizadas foram utilizadas no
ensaio de acordo com o mesmo procedimento descrito acima. As concentrações de glutationa
total e oxidada foram obtidas através de uma curva padrão realizada para cada uma das
dosagens. As absorbâncias de diluições seriadas de soluções padrão de glutationa reduzida
e oxidada foram determinadas separadamente para obtenção das curvas de calibração. Após
análise de regressão linear, foi determinado a equação da reta. Esta equação foi utilizada
para determinar as concentrações em nmoles de glutationa total e oxidada por mL de
amostra. A subtração da concentração de glutationa oxidada do valor da concentração da
glutationa total fornece o valor da concentração da glutationa reduzida e a relação
GSH/GSSG obteve-se através da divisão dos resultados de concentração de GSH pelos
resultados de GSSG.
4.2.13.8. Mieloperoxidase (MPO)
Alíquotas do LBA foram ultilizadas para dosar os níveis de MPO, uma enzima pró-
oxidante liberada por neutrófilos (Schmekel et al., 1990). Os níveis de MPO foram medidos
através do uso de 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB), brometo de hexadeciltrimetilamônio
(HTAB), peróxido de hidrogênio (H2O2) e tampão de acetato de sódio (NaOAc).
Inicialmente, 100 µl de LBA foram centrifugados com 900 µl de HTAB em 14,000 g durante
15 min. 75 µl do sobrenadante foi incubado com 5 µl de TMB por 5 min em 37 ºC. A mistura
foi incubada com 50 µl de H2O2 em 10 min a 37 C, depois disto, foi adicionado 125 µl de
tampão de acetato de sódio. A reação foi lida num leitor de microplaca em 630 nm. A
atividade enzimática foi expressa em mU/mg proteína total.
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
68
4.2.13.9. Determinação dos níveis de Nitrito
Os níveis indiretos de óxido nítrico (NO) foram mensurados pelos níveis de nitrito
(NO-2), que é um subproduto do metabolismo de NO. O procedimento foi realizado através
da reação de Griess (Green et al., 1982). Cada uma das amostras do homogeneizado de
pulmão (100 µL) reagiu com 50 µL de solução de 0,1% de naftiletilenodiamina e com 50
µL de solução de 1% de sulfanilamida. No procedimento, ocorre a formação de um composto
azo estável de coloração púrpura em que a sua absorbância foi mensurada
espectrofotometricamente em 540 nm. Os níveis de nitrito foram expressos em µMol/ mg
proteína.
4.2.13.10. Ensaios Imunoenzimáticos para marcadores inflamatórios TNF, IFN-γ e IL-10
Foram realizadas avaliações dos marcadores biológicos TNF, IFN-gama e IL-10 no
homogenato pulmonar (experimento em curto prazo) e no LBA (experimento em longo
prazo). Os ensaios imunoenzimáticos foram realizados em placas de 96 poços onde foram
adicionados 100 µL de anticorpo monoclonal (anticorpo de captura) contra a proteína (ou
peptídeo) de interesse, diluídos em PBS contendo 0.1% de albumina de soro bovino - BSA
(SIGMA). Após incubação por 12 horas à temperatura ambiente, os anticorpos não
adsorvidos foram descartados e as placas bloqueadas com 300 µl/poço de uma solução de
bloqueio contendo PBS-BSA 1%, durante 1 hora a 37o C. As amostras de sobrenadante,
previamente padronizadas por nosso grupo, foram aplicadas em um volume de 100 µl para
cada poço. Paralelamente, a proteína investigada foi diluída em várias concentrações para o
estabelecimento da curva padrão e, a seguir, realizada incubação por 12 horas à temperatura
ambiente. Posteriormente, os anticorpos secundários (anticorpo de detecção) foram diluídos
em PBS-BSA 0.1% e incubados por 2 horas à temperatura ambiente. Finalmente, 100 µl de
estreptoavidina ligada à peroxidase na diluição de 1:4000 em PBS-BSA 0.1% foram
adicionados à placa e a mesma mantida sob agitação por 30 minutos. O cromógeno escolhido
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
69
para revelação foi o OPD (θ-phenylenediamine-SIGMA) ou tetrametilbenzidina (TMB),
diluído em tampão citrato de acordo com recomendação do fabricante. No momento da
aplicação de 100 µl desta solução nos poços, foi ainda adicionado 2 µl/placa de H2O2 30
volumes como catalisador da reação. Após 20 minutos de incubação em ausência de luz, a
reação sofreu bloqueio adicionando-se 50µl de H2SO4 3 M por poço. A leitura da intensidade
de marcação foi realizada em leitor de ELISA utilizando-se o comprimento de onda de 490
nM (Lula et al., 2009); (Silva et al., 2012). O ensaios imunoenzimáticos, realizados segundo
o procedimento descrito acima, foram aplicados para detecção dos níveis das citocinas
citadas de acordo com as recomendações propostas pelo fabricante (R&D Systems,
Minneapolis, USA).
4.2.13.11. Imunofluorescência indireta
Os pulmões foram coletados, lavados em PBS e criofixados numa solução de 80%
de metanol e 20% de dimetilsulfóxido a -80 °C. Após 5-7 dias de substituição no freezer, as
amostras foram incluídas em paraplast. Foram feitos cortes seriados a cinco micrômetros de
espessura e as lâminas foram montadas, desparafinadas, reidratadas e depois incubadas em
solução de bloqueio (BSA a 1% e Tween-20 a 0,1% em PBS) em temperatura ambiente
durante 1 h (Gava et al., 2012). As lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com
rabbit anti-human Nrf2 (1:100, Abcam, Cambridge, MA). Após 4-5 lavagens em PBS,
adicionou-se donkey anti-rabbit IgG conjugado com AlexaFluor 488 (1: 500, Jackson
Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) durante 1 hora no escuro à temperatura
ambiente. Após lavagens com PBS, as secções foram montadas e vistas com um microscópio
confocal de varredura a laser (Zeiss LSM780, Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas,
NUPEB / UFOP). As configurações confocais ideais (abertura, ganho e potência do laser)
foram determinadas no início de cada sessão de imagem e depois mantidas constantes
durante a análise da amostra. Os núcleos foram marcados com dicloridrato de 4'6-diamidino-
2-fenilindole (DAPI) (Molecular Probes, Carlsbad, CA). Determinou-se então o número de
núcleos Nrf2 positivos no parênquima pulmonar. Para cada análise, foram analisados quinze
Metodologia
CAMPOS, K.K.D.
70
campos microscópicos aleatórios (área: 65.536 μm2 cada) e o número de núcleos Nrf2-
positivos (expressos como Nrf2/μm2) foram contados usando o software Zen 2011 (edição
azul). O número de núcleos Nrf2-positivos (Nrf2 / μm2) foram contados usando Software
Zen 2011 blue edition.
4.2.13.12. Análises estatísticas
Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média e mediana (valor mínimo
máximo/valor máximo). Para os dados com distribuição normal foi utilizada a análise de
variância univariada (ANOVA one- way) ou a análise de variância bivariada (ANOVA two-
way) seguido pelo pós-teste de Bonferroni. Para os dados discretos, o teste Kruskal-Wallis
seguido do pós-teste de Dunns. Em ambos os casos, a diferença significativa foi considerada
quando o valor de p<0,05. Todas as análises foram realizadas utilizando o software
GraphPad Prism versão 5.00 para Windows 7, GraphPad Software (San Diego, CA, USA).
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
71
5. RESULTADOS
Estudo 1 e 2- In vitro e In vivo (Administração com o licopeno e Exposição à FC a curto
prazo)
5.1. Avaliação da Viabilidade Celular pelo Teste de MTT
5.1.1. Incubação com o licopeno
Para avaliar qual seria a melhor concentração a ser utilizada em nosso estudo, incubamos
as células com diferentes concentrações de licopeno em 3 tempos distintos. Na figura 18
podemos observar no gráfico 18A, B e C uma diminuição significativa na viabilidade celular
nas concentrações de 10 e 25 µM de licopeno quando comparado com as células controle (GC)
nos tempos de 3, 6 e 24 horas.
Figura 18. Viabilidade na linhagem celular J774A.1 incubada com licopeno. Células foram incubadas por 3, 6 e
24 horas com 7 concentrações de licopeno (0,5; 1; 2; 4; 8; 10; 25 µM); GC: grupo controle, GC+THF: grupo
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
72
controle + tetrahidrofurano. Os ensaios foram realizados em sextuplicata, sendo que para cada tempo de
incubação foi realizado um controle -C- (células não tratadas) e para este consideramos 100% de viabilidade
celular. Foi realizado o Teste de Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunns (*) p<0.05.
5.1.2. Incubação com o Extrato da fumaça de cigarro
Da mesma forma, afim de avaliar qual seria a melhor concentração a ser utilizada em
nosso estudo, incubamos as células com diferentes concentrações de extrato de FC em 3 tempos
distintos. A figura 19 representa o teste de viabilidade celular realizado com o extrato da FC,
em que podemos observar no gráfico 19A, uma diminuição significativa na viabilidade celular
na concentração do extrato da FC de 10% quando comparados com as células GC no tempo de
3 horas. No gráfico 19B, observamos uma diminuição significativa na viabilidade dessas células
nas concentrações de 2.5; 5; 10% no tempo de 6 horas. No gráfico 19C, observamos uma
diminuição na viabilidade nas concentrações de 0.63; 1.25; 2.5; 5; 10% no tempo de 24 horas.
Figura 19. Viabilidade na linhagem celular J774A.1 incubada com o extrato da fumaça de cigarro. Células foram
incubadas por 3, 6 e 24 horas com 8 concentrações de extrato da fumaça de cigarro (0.10; 0.25; 0.50; 0.63; 1.25;
2.50; 5; 10%), GC: grupo controle. Os ensaios foram realizados em sextuplicata, sendo que para cada tempo de
incubação foi realizado um controle -C- (células não tratadas) e para este consideramos 100% de viabilidade
celular. Foi realizado o Teste de Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunns (*) p<0.05.
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
73
5.1.3. Análise quantitativa da produção das ERO
A partir dos resultados descritos acima, nós escolhemos incubar as células com 3
concentrações distintas de licopeno (0,5,1 e 2 µM), com o extrato de FC a 0,5% durante 3 e 24
horas. A figura 20 mostra os resultados obtidos com as células tratadas com o licopeno por 6
horas e expostas ao extrato da fumaça de cigarro (EFC) durante 3 e 24 horas. Não observamos
diferenças significativas na produção das ERO durante 3 horas de exposição ao EFC (Figura
20). No entanto, no tempo de 24 horas, quando as células foram expostas ao EFC 0,5%,
verificamos um aumento da produção das ERO no grupo EFC em relação ao GC (Figura 20).
Todavia, observamos uma diminuição da produção das ERO nas células adminstradas com o
licopeno nas concentrações de 0,5, 1 e 2 µM e expostas ao EFC 0,5% no tempo de 24 horas
quando comparado ao grupo EFC, sendo ainda menor nas concentrações de 1 e 2 µM em relação
ao EFC e 0,5 μM+EFC (Figura 20).
3 HORAS
24 H
ORAS
0.0
200000.0
400000.0
600000.0
800000.0
GC
EFC
Li0,5uM+EFC
Li1uM+EFC
Li2uM+EFC
b
c
d,ed,e
a a a a aa
ER
O (
IMF
)
Figura 20. Produção de ERO em células J774A.1 tratadas com licopeno (0.5; 1; 2μM) e expostas ao extrato da
fumaça de cigarro (0.5%). GC: grupo controle, EFC: grupo exposto ao extrato da fumaça de cigarro, Li0,5μM
+EFC: grupo tratado com licopeno 0,5 μM e exposto á fumaça de cigarro, Li1μM +EFC: grupo tratado com
licopeno 1 μM e exposto á fumaça de cigarro, Li2 μM +EFC: grupo tratado com licopeno 2 μM e exposto á fumaça
de cigarro. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão. Para a análise estatística foi realizado o
teste ANOVA Two-way, seguido do pós-teste de Bonferroni, p<0.0001. Este experimento foi realizado em
duplicata em três experimentos independentes. As barras com letra sobrescrita comum não diferem. Barras sem
letra sobrescrita comum diferem.
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
74
5.1.4. Influência da via de sinalização de PKC e da NADPH oxidase na produção das ERO
em células J774
Para avaliarmos a influência da via de sinalização da PKC e da enzima NADPH oxidase
na produção das ERO em células da linhagem J774, as mesmas foram pré-incubadas com
Calfostim C (120 mM), um inibidor da PKC e com DPI (20 μM), um inibidor da NADPH
oxidase, durante 3 ou 24 horas e posteriormente incubadas, por 45 minutos com os ativadores
da PKC, PMA (50 nM), um análogo ao diacilglicerol e potente ativador da PKC e ionomicina
(100 nM), o qual é responsável pelo aumento da liberação de cálcio do retículo endoplasmático.
Em relação ao tempo de 3 horas, os resultados mostraram que as células incubadas com
PMA e ionomicina apresentaram um aumento significativo na produção das ERO quando
comparadas às células controle (células não estimuladas), com os grupos tradados com os
respectivos inibidores e com o licopeno (Figura 21). No tempo de 24 horas, não observamos
diferença entre o grupo PMA e ionomicina em relação ao grupo GC. Observamos uma
diminuição da produção das ERO no C-(DPI) quando comparado a todos os grupos avaliados,
o que sugere o envolvimento da NADPH oxidase na regulação da produção das ERO (Figura
21).
3 HORAS
24 H
ORAS
0
50000
100000
150000
200000GC
C+(PMA + ION)
C- (DPI)
C- (CALF)
Li0,5uM
Li1uM
Li2uM
a
b b b bb b
a a aa
b
a a
ER
O (
IMF
)
Figura 21. Influência da via de sinalização de PKC e da NADPH oxidase na produção de ERO em células J774A.1
tratadas com PMA (50nM), Ionomicina (100nM), DPI (20μM), um inibidor da NADPH oxidase, CALF (120 mM),
um inibidor da PKC e licopeno (0.5; 1; 2μM). Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Para a
análise estatística foi realizado o teste ANOVA Two-way, seguido do pós-teste de Tukey, p<0.0001. Este
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
75
experimento foi realizado em duplicata em três experimentos independentes. As barras com letra sobrescrita
comum não diferem. Barras sem letra sobrescrita comum diferem.
5.2. Análise da administração do licopeno sobre o influxo celular no lavado broncoalveolar
(LBA)
Sabendo do possível efeito antioxidante do licopeno no estudo in vitro, nós avaliamos
se a administração com licopeno in vivo seria capaz de diminuir o influxo de células
inflamatórias durante os cinco dias de exposição à FC.
Nós determinamos a quantidade de leucócitos presentes no LBA dos grupos analisados
(Tabela 2). No LBA, os leucócitos totais aumentaram no GFC relação ao GC e GO. Houve uma
diminuição no Li50+FC em relação ao GFC. O número de macrófagos aumentou no GFC
relação ao GC e GO; e diminuiu em Li25+FC em relação ao GFC. Houve uma diminuição no
Li50+FC em comparação com todos os grupos. O número de neutrófilos diminuiu em Li25+FC
em comparação com GO e GFC. O número de linfócitos aumentou no GFC e Li25+FC quando
comparado ao GC e GO. Houve um aumento no Li50 + FC em relação a todos os outros grupos
(Tabela 2).
Tabela 2: Efeitos da administração com licopeno sobre o influxo celular no lavado
broncoalveolar (LBA).
GC GO
GFC
Li25+FC
Li50+FC
Leucócitos totais,
X 103/ml
122,3 ± 4,3 a
134,0± 5,0 a
177,4 ± 10,0 b
154,4 ± 11,5 a,b
130,0 ± 5,5 a
Macrófagos,
X 103/mL
93,4 ± 2,8 a 100,5 ± 9,0 a 137,5 ± 4,0 b 114,0 ± 12,0 a 64,5 ± 3,0 c
Neutrófilos,
X 103/mL
7,0 ± 0,7 ª,b 9,9 ± 1,5 a 9,8 ± 1,8 a 5,0 ± 0,2 b 6,9 ± 0,5 a,b
Linfócitos,
X 103/mL
21,9 ± 1,1 a 23,6 ± 0,5 a,b 30,1 ± 2,0 b,c 35,3 ± 4,3 c 58,5 ± 2,8 d
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
76
Valores com letras sobrescrita diferem. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Para a
análise estatística foi realizado o teste ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni, p<0,05.
GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo
administrado com 25 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com
50 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro.
5.3. Análise histopatológica do parênquima pulmonar
Nós realizamos análises morfométricas do parênquima pulmonar para avaliar se a
administração com licopeno seria capaz de reduzir os danos causados por oxidantes presentes
na fumaça de cigarro. As Figuras 22 e 23 mostram que os animais expostos a um total de 12
cigarros diários, apresentaram mudanças nas análises morfométricas do parênquima pulmonar.
Observamos um aumento na Vva no GFC em relação ao GC e GO (Figuras 22 e 23). No entanto,
houve uma diminuição na Vva no Li25+FC e Li50+FC em relação ao GFC. Observamos uma
diminuição da Vvsa no GFC em relação ao GC e GO. O tratamento com 25 mg de licopeno +
FC foi capaz de aumentar o Vvsa quando comparado com o GFC (Figuras 22 e 23).
Figura 22. Vva alvéolo; Vvsa septo alveolar. GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto á fumaça
de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno exposto á fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo
administrado com 50 mg de licopeno exposto á fumaça de cigarro. Os resultados são expressos como mediana
(valor máximo/ valor mínimo). Para a análise estatística foi realizado o Teste de Kruskal-Wallis seguido pelo pós-
teste de Dunns, p<0.05. As barras com letra sobrescrita comum não diferem. Barras sem letra sobrescrita comum
diferem.
77
78
Figura 23. Fotomicrográficas de cortes de pulmão corados com hematoxilina e eosina. Análise da densidade de volume de espaço aéreo alveolar e densidade de volume de septos
alveolares. Barra= 50µm. GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto á fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno exposto á fumaça
de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto á fumaça de cigarro. A seta indica aumento no Vva no GFC e Li25 em relação ao GC e GO e a estrela
indica diminuição da Vva no Li50, Li25+FC e Li50+FC em relação ao GFC. A seta fina indica diminuição da Vsa no GFC em relação ao GC e GO. E o asterisco indica aumento
do Vsa no Li25+FC quando comparado ao GFC
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
79
5.4. Avaliação da translocação de Nfr2
Estudos utilizando imunofluorescência e outros métodos, mostraram que a ativação da
transcrição de genes contendo um ARE por vários agentes é precedida pela translocação do
fator nuclear de transcrição Nrf2 (Huang et al., 2000). Assim, através da técnica de
imunofluorescência, investigamos se a administração com licopeno resultaria na translocação
do Nrf2 do citosol para o núcleo no parênquima pulmonar. A translocação do Nrf2 do
citoplasma para o núcleo foi predominante no grupo GFC comparado aos grupos GC, GO,
Li25+FC e Li50+FC (Figuras 24 e 25). A administração das duas doses de licopeno associado
a exposição à FC levou a uma diminuição da translocação do Nrf2 do citoplasma para o núcleo
em relação ao GFC. Não observamos nenhuma marcação não específica no controle negativo
(Figuras 24 e 25).
GC
GO
GFC
Li25+
FC
Li50+
FC
0
50
100
150
200
b
a
a
a
a
% N
fr2/
m2
Figura 24. Avaliação da translocação de Nfr2 do citoplasma para o núcleo. GC: grupo controle, GO: grupo óleo,
GFC: grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno exposto à fumaça
de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro. Os dados foram
expressos como média ± erro padrão da média. Para a análise estatística foi realizado o teste ANOVA one-way
seguido do pós-teste de Bonferroni, p <0,05. As barras com letra sobrescrita comum não diferem. Barras sem
letra sobrescrita comum diferem.
80
Figura 25. Imunofluorescência do Nrf2. GN: grupo controle negativo, GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto á fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo
administrado com 25 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro. No controle negativo, não
observamos nenhuma marcação inespecífica. (Figura 25A). A imagem combinada mostrou a localização nuclear da proteína Nrf2 (bar = 50 μm). A localização do Nrf2 foi
visualizada utilizando um anticorpo anti-Nrf2 e anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488. As setas indicam a presença do Nfr2 no núcleo celular (Fig. 25 B, C, D, E, F).
A translocação do Nfr2 do citoplasma para o núcleo foi predominante no núcleo da célula do grupo GFC quando comparado com GC, GO, Li25 + FC e Li50 + FC. A administração
das duas doses de licopeno associado a exposição á FC levou a uma diminuição da translocação do Nfr2 do citoplasma para o núcleo em relação ao GFC.
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
81
5.5. Análise de TBARS, DNA cometa e das Defesas Antioxidantes no parênquima
pulmonar
Em nosso estudo anterior, demonstramos que a exposição em curto período à FC
associada com o influxo de células inflamatórias levou ao desequilíbrio entre
oxidante/antioxidante (Campos et al., 2013). Neste contexto, determinamos se a administração
com licopeno poderia diminuir esse desequilíbrio em animais expostos à FC. Para isto,
avaliamos o dano através da formação de TBARS como índice de peroxidação lipídica e o dano
ao DNA, mensuramos também as atividades das enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e a
razão GSH/GSSG no homogeneizado pulmonar. Os dados estão apresentados na Tabela 3.
Houve aumento da concentração de TBARS no GFC quando comparado com o GC. Em
contraste, a administração com licopeno contribuiu para a redução dessas concentrações no
grupo Li50 + FC em relação ao GFC (Tabela 3). A análise do ensaio de DNA cometa mostrou
um aumento do dano ao DNA no GFC em comparação com GC. Observamos uma diminuição
do dano no Li50 + FC em relação ao GFC (Figura 26). A atividade da SOD diminuiu no GFC
em relação ao GC. Entretanto, não observamos diferenças estatísticas na atividade de SOD nos
grupos tratados com licopeno e expostos à FC. A atividade da CAT foi elevada no GFC quando
comparado ao GC e GO. Em contrapartida, os animais que receberam tratamento com licopeno
e expostos à FC (Li25 + FC e Li50 + FC) demonstraram uma menor atividade desta enzima em
relação ao GFC. A atividade de GPx aumentou no GFC em comparação ao GC e GO. A
atividade de GPx aumentou Li25 + FC em relação ao GC, GO e GFC. Houve uma diminuição
da atividade de GPx no Li50 + FC em comparação com Li25+FC (Tabela 3). A razão GSH /
GSSG foi menor no GFC quando comparado com o GC. A administração com licopeno
aumentou a razão de GSH/ GSSG em Li50 + FC quando comparado com o GFC. Não houve
diferenças significativas em relação ao conteúdo de nitrito nos grupos estudados para este
modelo experimental (Tabela 3).
82
Tabela 3. Efeitos do tratamento com licopeno sobre as atividades das enzimas antioxidantes (SOD, CAT e GPx), razão GSH/GSSG, TBARS, Dano
ao DNA e nitrito em amostras de pulmão do grupos experimentais.
GC GO
GFC
Li25+FC
Li50+FC
TBARS (nM/mg ptn)
4,95 ± 0,50a
5,90 ± 0,90 a,b
8,00 ± 0,01 b
5,45 ± 0,40 a,b
4,90 ± 0,40 a
Fragmentação do DNA (índice de
dano)
cometa)
1,30(1,8/0,7) a
1,60(1,9/1,0) a,b
1,83(2,6/1,4) b
1,40(1,6/1,0) a,b
1,08(1,5/1,0) a
SOD (U/mg ptn)
32,0 ± 3,00a
26,50 ± 4,00a
17,00± 2,00 b
22,0 ± 1,60 a,b
22,0 ± 1,50 a,b
CAT (U/mg ptn)
0,45 ± 0,06a
0,40 ± 0,05a
1,60 ± 0,03 b
0,70 ± 0,10 a
0,55 ± 0,07 a
GPx (U/mg ptn)
0,06 ± 0,01a
0,06 ± 0,01a
0,14 ± 0,01 b
0,20±0,01 c
0,09 ± 0,01 a,b
GSH/GSSG ratio
0,50 ± 0,08a
0,40 ± 0,06 a,b
0,30 ± 0,07 b
0,45 ± 0,01a,b
1,00 ± 0,20 a
Nitrito (μmol NO-2)
25,80 ± 1,90a
26,00 ± 2,30 a
32,00 ± 2,10 a
31,00 ± 2,40 a
30,00 ± 3,00 a
Valores com letras sobrescrita diferem. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão e mediana (valor máximo/ valor mínimo). Para a análise
estatística foi realizado o teste ANOVA one way seguido do pós-teste de Bonferroni e Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste Dunns, p <0,05. GC: grupo controle,
GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo
administrado com 50 mg de licopeno exposto á fumaça de cigarro.
83
Figura 26. Imagens representativas de dano ao DNA induzido por FC nos pulmões, atenuado pelo tratamento com licopeno. Ensaio cometa (electroforese em gel de célula única-
20X. GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto á fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno e exposto à fumaça de cigarro,
Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno e exposto á fumaça de cigarro.
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
84
5. 6. Avaliação dos níveis de citocinas inflamatórias nos pulmões
A figura 27 representa os possíveis efeitos da administração de licopeno sobre os
níveis de IFN-gama, TNF e IL-10. No painel A, B e C podemos observar um aumento nos
níveis destas citocinas no grupo GFC em relação ao de GC e GO. Em contraste, o licopeno
levou a uma diminuição dos níveis dessas citocinas nos grupos Li25 + FC e Li50+ FC,
quando comparados com GFC.
Figura 27. Os resultados foram expressos como média ± erro. Para a análise estatística foi realizado o teste
ANOVA one way seguido do pós-teste de Bonferroni, p <0,05. GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC:
grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno exposto à fumaça
de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto á fumaça de cigarro. As barras com
letra sobrescrita comum não diferem. Barras sem letra sobrescrita comum diferem.
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
85
6. Estudo 3- In vivo (Administração com licopeno e Exposição á FC a Longo prazo)
6.1. Dados Biométricos
Uma vez que observamos o potencial protetor do licopeno, tanto no estudo in vitro
quanto na exposição a curto prazo à fumaça de cigarro, nosso próximo passo foi avaliar os
efeitos do licopeno no quadro de enfisema pulmonar. Na figura 28, podemos observar as
análises dos parâmetros biométricos os quais foram mensurados por meio dos dados de
massa corporal. Para a análise da massa corporal, os animais foram pesados no início e no
final do experimento. Houve uma diminuição na massa corporal dos animais nos grupos
pesados no final do experimento, GFCf, Li25+FCf, Li50+FCf quando comparados aos seus
respectivos grupos pesados no início do experimento GFCi, Li25+FCi, Li50+FCi. Ademais,
os dados mostram que a administração de licopeno não foi capaz de reveter a perda da massa
corporal nos animais estudados.
GCi
CGf
GOi
GOf
GFC
i
GFC
f
Li25+
FCi
Li25+
FCf
Li50+
FCi
Li50+
FCf
0
10
20
30
40
a aa a a
b
a
b b
a
Massa c
orp
ora
l (g
)
Figura 28. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão. Para a análise estatística foi realizado
o ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni, p<0.05. GCi: grupo controle pesado no início do
experimento, GOi: grupo óleo pesado no início do experimento, GFCi: grupo exposto à FC e pesado no início
do experimento, Li25+FCi: grupo administrado com 25 mg licopeno e exposto à FC no início do experimento,
Li50+FCi: grupo administrado com 50 mg licopeno e exposto à FC no início do experimento, GCf: grupo
controle pesado no final do experimento, GOf: grupo óleo pesado no final do experimento, GFCf: grupo
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
86
exposto à FC e pesado no final do experimento, Li25+FCf: grupo administrado com 25 mg licopeno e exposto
à FC e pesado no final do experimento, Li50+FCf: grupo administrado com 50 mg licopeno e exposto à FC
e pesado no final do experimento. As barras com letra sobrescrita comum não diferem. Barras sem letra
sobrescrita comum diferem.
6.2. Dados hematológicos
Os parâmetros hematológicos foram mensurados por meio dos dados de hemograma.
A tabela 4 mostra os valores de eritrócitos, hematócrito e hemoglobina dos grupos
experimentais. Podemos observar que a FC promoveu um aumento de eritrócitos,
hematócrito e hemoglobina quando comparado ao GC e GO; o grupo Li25+FC e Li50+FC
mostrou uma redução desses parâmetros quando comparado ao GC, GO e GFC (Tabela 4).
Tabela 4. Parâmetros hematológicos dos grupos experimentais.
GC GO
GFC
Li25+FC
Li50+FC
Eritrócito (x106/mm3)
7,0 ± 0,2 a
8,0 ± 0,0 a
10,0 ± 0,2 b
9,0 ± 0,1 a
8,0 ± 0,2 a
Hematócrito (%) 33,0 ± 0,9 a 34,0± 0,4a 44,0 ± 0,1 b 38,0 ± 0,4 a 39,00 ± 1,2 a
Hemogloblina (g/dL) 11,0 ± 0,9 a 11,0 ± 0,1a 15,0 ± 0,3 b 12,0 ± 0,1 a 12,0± 0,4 a
Valores com letras sobrescrita diferem. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Para a análise
estatística foi realizado o teste ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni, p<0,05. GC: grupo
controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25
mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto
à fumaça de cigarro.
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
87
6.3. Análise da administração com licopeno sobre o influxo celular no lavado
broncoalveolar (LBA)
Nós avaliamos se a administração com licopeno associado a uma exposição em longo
prazo à FC seria capaz de diminuir o influxo de células inflamatórias durante sessenta dias.
Nós determinamos a quantidade de leucócitos presentes no LBA dos grupos analisados
(Tabela 5). No LBA, o GFC exibiu níveis elevados de leucócitos totais quando comparado
com o número de leucócitos no GC. Os leucócitos no LBA de animais expostos à FC e
administrados com licopeno (Li25+FC e Li50+FC) foram reduzidos quando comparados
com o número de leucócitos totais no GFC. Em relação aos macrófagos e neutrófilos, o
grupo GFC exibiu um elevado número dessas células quando comparado ao GC e a
administração com licopeno nas duas concentrações diminuiu esses parâmetros em relação
ao GFC. O número de linfócitos aumentou no GFC quando comparado ao GC. A
administração com licopeno na concentração de 25 mg não alterou o número de linfócitos
em relação ao GFC todavia, a administração com 50 mg diminuiu o número de linfócitos em
relação ao GFC (Tabela 5).
Tabela 5. Efeitos da administração com o licopeno sobre o influxo celular no lavado
broncoalveolar (LBA).
GC GO
GFC
Li25+FC
Li50+FC
Leucócitos
totais,
X 103/mL
160,0 ± 3,0a
171,0± 6,0a
416,0 ± 14,0 b
240,0 ± 13,0 a
192,0 ± 8,0 a
Macrófagos,
X 103/mL
116,0 ±10,0a 128,0 ± 4,0a 290,0 ± 20,0 b 153,0 ± 6,0 a 140,0 ± 16,0 a
Neutrófilos,
X 103/mL
15,0 ± 2,0a 15,0 ± 1,0a 48,0 ± 15,0 b 5,0 ± 0,9 a 6,0 ± 1,0 a
Linfócitos,
X 103/mL
29,0 ± 3,0a 28,0 ± 3,0a 78,0 ± 5,0 b 82,0 ± 6,0 b 46,0 ± 6,0 a
Valores com letras sobrescrita diferem. Os resultados são expressos como média ± erro padrão. Para a análise
estatística foi realizado o teste ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni, p<0.05. GC: grupo
controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto á fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
88
mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto
à fumaça de cigarro.
6.4. Análise histopatológica do parênquima pulmonar
As mudanças histológicas estão ilustradas na Tabela 6, Figuras 29 e 30. Os pulmões
do CG apresentam um aspecto histológico compatível com a normalidade, com parênquima
consistindo de alvéolos conectados a ductos alveolares, separados um do outro apenas por
septos alveolares finos (Tabela 6, Figura 29). Os pulmões dos camundongos do GFC
apresentaram áreas de ruptura de septos alveolares e espaço aéreo aumentado (Tabela 6,
Figura, 29). Os pulmões dos grupos Li25+ FC e Li50+FC tiveram um padrão histológico
semelhante ao grupo controle (Tabela 6, Figura 29). As fibras colágenas se apresentam
fragmentadas e irregulares no GFC em relação ao GC (Tabela 6, Figura 30). Não foram
observadas diferenças significativas em relação as fibras colágenas dos grupos
administrados com licopeno em comparação com o GFC (Tabela 6, Figura 30). Os dados da
morfometria e da estereologia confirmaram a alterações histológicas. A Tabela 6 mostra que
os animais expostos à FC em longo prazo, apresentaram mudanças nas análises
morfométricas do parênquima pulmonar e que a administração com licopeno foi capaz de
melhorar esse parâmetro. Observamos um aumento no Vva no GFC em relação ao GC e GO
(Tabela 6). No entanto, houve uma diminuição no Vva no Li25+FC e Li50+FC em relação
ao GFC. Observamos uma diminuição da Vsa no GFC e Li25+FC em relação ao GC. O
tratamento com 50 mg de licopeno foi capaz de aumentar o Vvsa quando comparado ao GFC
(Tabela 6). A fim de certificar a extensão da lesão pulmonar (enfisema) causada pela
exposição em longo prazo a FC, nós realizamos a análise morfométrica da Medida do
Intercepto Linear Médio (Lm) e verificamos que o Lm foi elevado no GFC quando comparado
ao GC e GO, enquanto que a administração com licopeno nas duas concentrações foi capaz
de melhorar os efeitos da exposição a FC em longo prazo, diminuindo o Lm em relação ao
GFC (Tabela 6). Foi observado uma diminuição da densidade de volume (%) de fibras
colágenas (Vvcol) no GFC em relação ao CG. A diminuição do Vvcol correspondeu
inversamente ao aumento do Lm no GFC (Tabela 6).
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
89
Tabela 6. Análises morfométricas do parênquima pulmonar dos animais dos grupos GC,
GO, GFC, Li25+FC e Li50+FC.
GC GO
GFC
Li25+FC
Li50+FC
Vva (%)
22 (16/25) a
19 (18/22) a
37 (22/52) b
14 (12/22) a
19 (6/25) a
Vvsa (%)
56 (38/66) a
50 (31/53) a
31 (25/47) b
37 (28/44) b
47 (34/59) a
Lm (µm)
70,0 ± 2,0 a
83,0 ± 5,0 a
123,0 ± 9,0 b
89,0 ± 5,0 a
85,0 ± 5,0 a
Vvcol (Fibras
colágenas (%)
35,0 (20/40) a
28,0 (10/30) a
20,0 (15/25) b
30,0 (20/35) a
28,0 (20/35) a
Valores com letras sobrescrita diferem. Vva alvéolo (%); Vvsa (%) septo alveolar; Fibras colágenas (%) e Lm
(µm). GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo
administrado com 25 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg
de licopeno exposto à fumaça de cigarro. Os resultados foram expressos como mediana (valor mínimo/
máximo). Para a análise estatística foi realizado o Teste de Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunns,
p<0.05. Os resultados também foram expressos como média ± erro padrão. Para a análise estatística foi
realizado o teste ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni.
90
91
Figura 29. Fotomicrográficas de cortes de pulmão corados com hematoxilina e eosina. Análise da densidade de volume de espaço aéreo alveolar e densidade de volume
de septos alveolares. Barra= 50µm. GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno
exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro. A seta indica aumento no Vva no GFC em relação ao GC
e GO e diminuição da Vva no Li25+FC e Li50+FC em relação ao GFC. A seta indica diminuição da Vsa no GFC em relação ao GC e aumento do Vsa no Li50+FC quando
comparado ao GFC.
92
Figura 30. Fotomicrográficas de cortes de pulmão corados com Tricrômio de massom. Barra= 50µm. GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto á fumaça
de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto à fumaça
de cigarro.
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
93
6.5. Análise de TBARS, DNA cometa, MPO, Nitrito e das Defesas Antioxidantes
Em relação ao dano a membrana lipídica e ao DNA, houve aumento da concentração
de TBARS e aumento do dano ao DNA no GFC quando comparado com o GC. Em contraste,
o tratamento com licopeno contribuiu para a redução da concentração de TBARS e do dano
ao DNA nos grupos Li25+ FC e Li50 + FC em relação ao GFC (Tabela 7). Avaliamos
também o dano a proteínas, onde observamos uma maior carbonilação de proteínas no GFC
em relação ao GC e GO e uma diminuição nos grupos administrados com licopeno e
expostos à FC em relação ao GFC. A atividade da SOD diminuiu no GFC em relação ao
GC e GO. No entanto, houve um aumento da atividade dessa enzima nos grupos Li25+FC e
Li50+FC em relação ao GFC. A atividade da CAT diminuiu no GFC quando comparado ao
GC. Em contrapartida, os animais que foram administrados com o licopeno e expostos à FC
(Li25 + FC e Li50 + FC) demonstraram uma maior atividade desta em relação ao GC, GO e
GFC. A razão GSH / GSSG foi menor no GFC quando comparado com o GC e GO. A
administração com licopeno aumentou a razão de GSH/ GSSG em Li25 + FC e Li50 + FC
quando comparado com o GFC. A atividade de MPO se mostrou elevada no GFC quando
comparado ao GC e GO. Observamos um aumento de sua atividade no Li25+FC em relação
ao GC e GO e uma diminuição quando comparado ao GFC. Houve uma queda da atividade
de MPO no Li50+FC em relação ao GFC e Li25+FC. O conteúdo de nitrito aumentou no
GFC em relação ao GC e GO e a administração com licopeno nas duas concentrações (Li25
+ FC e Li50 + FC) foi capaz de reduzir o conteúdo de nitrito quando comparado ao GFC
(Tabela 7).
94
Tabela 7. Efeitos da administração com licopeno sobre TBARS, Dano ao DNA, as atividades das enzimas antioxidantes (SOD e CAT), razão
GSH/GSSG, nitrito e MPO em amostras de pulmão e LBA do grupos experimentais.
GC GO
GFC
Li25+FC
Li50+FC
TBARS (nM/mg prot)
1,50 ± 0,30 a
2,30 ± 0,40 a
4,40 ± 0,60 b
1,40 ± 0,10 a
1,00 ± 0,09 a
Fragmentação do DNA
(Índice de dano)
1,00 ± 0,30 a
0,60 ± 0,40 a
2,50 ± 0,70 b
0,30 ± 0,30 a
0,50 ± 0,20 a
SOD (U/mg prot)
33,0 ± 3,0 a
38,0 ± 0,40 a
15,0 ± 1,0 b
29,0 ± 3,0 a
26,0 ± 2,0 a
CAT (U/mg prot)
0,60 ± 0,01 a
0,40 ± 0,02 a
0,30 ± 0,02 b
1,25 ± 0,10 c
1,40 ± 0,10 c
GSH/GSSG razão
0,40 ± 0,02 a
0,40 ± 0,04 a
0,30 ± 0,01 b
0,45 ± 0,01a
0,45 ± 0,03 a
MPO (mU/mg prot)
0,40 ± 0,00 a
0,50 ± 0,01 a
2,00 ± 0,20 b
1,00± 0,20 c
0,50 ± 0,00 a,d
Nitrito (µmol NO-2)
1,35 ± 0,20 a
0,80 ± 0,20 a
3,50 ± 0,10 b
1,50 ± 0,10 a
1,10 ± 0,15 a
Valores com letras sobrescrita diferem. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão e mediana (valor máximo/ valor mínimo). Para a análise estatística foi
realizado o teste ANOVA one way seguido do pós-teste de Bonferroni e Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste Dunns, p <0,05. GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC:
grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de
licopeno exposto à fumaça de cigarro.
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
95
6.6. Avaliação da translocação do Nfr2
Através da técnica de imunofluorescência, investigamos se a administração de
licopeno associado a exposição em longo prazo à FC resulta na translocação do Nrf2 do
citosol para o núcleo da célula no parênquima pulmonar (Figuras 31 e 32). Não houve
diferenças significativas em relação ao Nfr2 nos grupos estudados para este modelo
experimental.
GC
GO
GFC
Li25+
FC
Li50+
FC
0.00
0.05
0.10
0.15
a
aaa a
a
% N
fr2/
m2
Figura 31. Avaliação da translocação do Nfr2 do citoplasma para o núcleo. GC: grupo controle, GO: grupo
óleo, GFC: grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado com 25 mg de licopeno exposto
à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro. Os
dados foram expressos como média ± erro padrão da média. Para a análise estatística foi realizado o teste
ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni (p = 0,6).
96
Figura 32. Imunofluorescência do Nrf2. No controle negativo, não observamos nenhuma marcação inespecífica. A imagem combinada mostrou a localização nuclear da
proteína Nrf2 (bar = 50 μm). GN: grupo controle negativo, GC: grupo controle, GO: grupo óleo, GFC: grupo exposto à fumaça de cigarro, Li25+FC: grupo administrado
com 25 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro, Li50+FC: grupo administrado com 50 mg de licopeno exposto à fumaça de cigarro. A localização do Nrf2 foi
visualizada utilizando um anticorpo anti-Nrf2 e anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488.
Resultados
CAMPOS, K.K.D.
97
6.7. Avaliação dos níveis de citocinas inflamatórias no LBA
A figura 33 (painel A, B, C) representa os possíveis efeitos do tratamento com
licopeno sobre os níveis de IFN-gama, TNF e IL-10 a longo prazo no LBA. No painel 33A
podemos observar um aumento nos níveis de IFN-gama no grupo GFC em relação ao GC.
No painel 33B e C podemos observar um aumento nos níveis TNF e IL-10 no grupo GFC
em relação ao GC e GO. Todavia, a administração com licopeno levou a uma diminuição
dos níveis destas citocinas nos grupos Li25 + FC e Li50+ FC quando comparados com GFC.
Figura 33. Os resultados foram expressos como média ± erro. Para a análise estatística foi realizado o teste
ANOVA one way seguido do pós-teste de Bonferroni, p <0,05. As barras com letra sobrescrita comum não
diferem.
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
98
7. DISCUSSÃO
7.1. 1ª Parte: Estudo 1- In vitro
Os dados obtidos confirmaram que o licopeno é um potente agente antioxidante tanto
no modelo in vitro como in vivo. No estudo in vitro observou-se uma diminuição da produção
de ERO. Nos dois modelos in vivo, o licopeno promoveu um aumento das atividades das
enzimas antioxidantes e diminuição do desequilíbrio redox e inflamação pulmonar.
Neste estudo, observou-se uma diminuição na viabilidade celular nos tempos de 3, 6
e 24 h em células adminsistradas com diferentes concentrações de licopeno ou extrato da FC
em relação as células controle. Concentrações diminuídas de licopeno (0,5, 1 e 2 μM) não
afetaram a viabilidade celular. Em relação à produção das ERO, foi observado que as
concentrações de licopeno (0,5, 1 e 2 μM) foram capazes de reduzir a produção das ERO em
células expostas ao extrato da FC (0,5%) no tempo de 24 h. Nossos dados corroboram com
os resultados de um estudo prévio de Palozza et al. (Palozza et al., 2011) que mensuraram a
produção das ERO como forma de quantificar o nível de desequilíbrio redox celular gerado
pelos oxiesteróis. Além disso, neste estudo, o licopeno em uma concentração de 2 μM
reduziu a produção das ERO induzida pelo oxisterol. Em outro estudo, Lian e colaboradores
(Lian e Wang, 2008) observaram que o tratamento com ácido apo-10 '-licopenóico a uma
concentração de 3 μM durante 24 h diminuiu os níveis celulares das ERO em cerca de 40%
(Lian e Wang, 2008).
A família PKC é formada por serina-treonina cinases, muitas das quais são ativadas
por co-fatores como fosfatidilserina e diacilglicerol (DAG). Quando ativada, a PKC fosforila
uma grande quantidade de alvos intracelulares levando a regulação de muitas vias de
sinalização celular (Li et al., 2012). Sabe-se que a PKC induz a produção das ERO e que sua
ativação é dependente de NADPH oxidase, a qual é responsável, em parte, pelo aumento do
desequilíbrio redox (Bandeira et al., 2017). O complexo NADPH oxidase pode ser ativado
por uma grande variedade de estímulos, entre os quais pode-se citar a ativação da via da
PKC. Várias isoenzimas da PKC são capazes de fosforilar os resíduos de serina da
subunidade p47phox, um passo importante na ativação da NADPH oxidase. A fosforilação
da p47phox permite sua ligação à fosfolipídeos de membrana e sua interação com a p22phox
e ainda atrai a p67phox para formar um complexo. A p67phox, por sua vez, propicia a ligação
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
99
e estabilização do complexo com a GTPase Rac, completando a formação do complexo
NADPH oxidase capaz de gerar radicais superóxido (SIOW et al., 2006). Essa capacidade
das isoenzimas de PKC de fosforilarem a p47phox, bem como a p67phox, fazem delas as
principais cinases responsáveis pela ativação da NADPH oxidase e esta, por sua vez, é a
maior fonte de produção das ERO em uma grande variedade de condições, tais como fibrose,
arteriosclerose, e vários tipos de câncer (Bandeira et al., 2017).
Neste contexto, observamos que no tempo de 3 horas, o licopeno mimetizou o efeito
do calfostin e DPI, desta forma sugere-se que o licopeno possa ter inibido uma ou ambas as
vias relacionadas à produção das ERO, ou seja, PKC e/ou NADPH oxidase, respectivamente.
Já em 24 horas, o licopeno não apresentou efeito modulatório sobre essas vias, uma vez que
a produção das ERO foi semelhante ao observado nos grupos controles. Além disso, não
houve diminuição da produção de ERO via PKC, o que nos leva a inferir que em 24 horas,
ocorreu apenas o envolvimento da via de NADPH oxidase visto pela inibição com DPI.
Acreditamos que a via de NADPH oxidase possa estar sendo ativada por outra via que não
seja a via de PKC. Todavia, mais estudos são necessários com intuito de elucidar o
envolvimento de PKC nesse modelo experimental. Um estudo recente publicado por nosso
grupo de pesquisa avaliou a influência do licopeno na produção das ERO mediada pela via
PKC em células SK-Hep-1. Neste trabalho, Bandeira et al mostraram que quando as células
que foram estimuladas com PMA e ionomicina (ativadores de PKC) houve um aumento da
produção das ERO quando comparado as células não estimuladas. Além disso, a produção
das ERO diminuiu quando o DPI foi adicionado confirmando a importância da NADPH
oxidase para a estimulação da produção das ERO. No que diz respeito ao efeito do licopeno
nas células SK-Hep-1 foi demonstrado que a produção das EROs diminuiu
significativamente nas células estimuladas que foram pré-tratadas com licopeno (0,5 mM)
no tempo de 30 min e a produção das ERO diminuiu quando as células foram tradadas com
licopeno (0,5 e 10 mM) durante 6 horas quando comparado com o controle (células
estimuladas) (Bandeira et al., 2017). Asano et al.relataram um aumento das ERO via
NADPH oxidase em Células C6 de glioma de ratos expostas ao extrato de FC (3%). Neste
estudo, os autores verificaram que a exposição à FC induziu a ativação de PKC que foi
translocada para a membrana plasmática, sendo esta ativação dependente do aumento da
Ca2+intracelular intracelular. O aumento da [Ca2+]i ativou PKC, que uma vez ativada
fosforila a subunidade p47phox que então fosforilada é translocada para a membrana onde
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
100
ativa as subunidades catalíticas da NADPH oxidase, levando ao aumento da produção das
ERO (Asano et al., 2012).
7.2. 2ª Parte: Estudo 2- In vivo (Administração com licopeno e Exposição à FC a curto
prazo)
No modelo in vivo, observou-se vários efeitos benéficos do licopeno no que se refere
ao desequilíbrio redox e à inflamação em animais que foram expostos à FC durante um
período de 5 dias consecutivos. As principais consequências da inalação da FC estão
relacionadas ao dano ao sistema respiratório e o tabagismo é o principal fator de risco para
o desenvolvimento da DPOC, doença caracterizada por um processo inflamatório crônico
que resulta em lesão pulmonar (Wouters et al., 2002) (Domej et al., 2014). A FC é uma
mistura complexa que contém altas concentrações de radicais livres e outros oxidantes que
podem levar a um dano oxidativo nos pulmões (Sun et al., 2014). Esses oxidantes também
podem alterar as funções imunológicas, afetando tanto a resposta imune humoral como a
mediada por células, levando a um aumento do número de leucócitos e de linfócitos
circulantes e um perfil anormal de células T (Campos et al., 2013).
A inflamação pulmonar induzida por FC é bem conhecida por ser um evento que
envolve vários tipos de células e mediadores inflamatórios (Wu et al., 2014). Vários estudos
têm relatado que a exposição repetida à FC pode induzir inflamação prolongada das vias
aéreas associada à infiltração celular de macrófagos e neutrófilos (Castro et al., 2004;
Campos et al., 2013). A contagem diferencial das células no LBA têm sido utilizada como
suporte para o diagnóstico de doenças pulmonares (Campos et al., 2015). As concentrações
de licopeno administradas nos animais durante os experimentos são consideradas
fisiológicas, uma vez que o consumo de uma dieta humana rica em alimentos que contenham
licopeno, tais como os tomates é capaz de aumentar a concentração deste carotenoide e
diferente tecidos e órgãos (Rao, 2002). Para avaliar se a administração com licopeno poderia
diminuir o influxo celular no parênquima pulmonar, determinou-se a quantidade de células
presentes em LBA em animais pré-administrados com licopeno antes da exposição à FC
durante um curto período de tempo. Nossos achados sobre leucócitos totais no LBA
corroboram com os resultados de um estudo prévio de Campos et al. (Campos et al., 2013)
que relataram um aumento gradual no número de células inflamatórias no parênquima
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
101
pulmonar a partir do segundo dia de exposição, persistindo até o último dia de exposição a
FC. Bao et al. (Bao et al., 2013) relataram um aumento no número de células inflamatórias
no parênquima pulmonar de camundongos expostos à FC durante 4 dias.
Neste último estudo, os animais expostos à FC e administrado com polifenóis da
maçã (APP) mostraram uma diminuição no influxo de leucócitos totais. Os macrófagos
desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra substâncias nocivas e
estão envolvidos em vários processos patológicos, incluindo doenças auto-imunes, infecções
e distúrbios inflamatórios (Hadad e Levy, 2012). Observou-se que a exposição à FC levou a
um elevado influxo de macrófagos para BALF, enquanto que a pré-administração com o
licopeno diminuiu a quantidade de infiltração de macrófagos em resposta à FC. A pré-
administração de licopeno também diminuiu a quantidade de infiltração de neutrófilos em
resposta a exposição à FC. Bao et al. (Bao et al., 2013) relataram um resultado semelhante
em animais expostos à FC e administrados com polifenóis da maçã, onde eles observaram
uma diminuição da quantidade de macrófagos e neutrófilos em LBA nesse grupo em relação
ao grupo exposto à FC. No que se refere às subpopulações de linfócitos, observou-se um
aumento do número de linfócitos no GFC e a administração com o licopeno nas duas
concentrações amplificou ainda mais o influxo de linfócitos. Em um estudo publicado
anteriormente por nosso grupo, nós observamos que os linfócitos T CD4+ e CD8+ estão
presentes no LBA de camundongos expostos por um curto período de tempo à FC e um
aumento no recrutamento de células T foi observado após o terceiro dia de exposição
(Campos et al., 2013). A infiltração de células inflamatórias, especialmente macrófagos e
linfócitos, no pulmão tem sido diretamente associada ao desenvolvimento subsequente de
DPOC em modelos experimentais. O recrutamento de linfócitos em resposta à FC foi
possivelmente um resultado da agressão pulmonar causada por compostos tóxicos presentes
na FC (Hodge et al., 2011),(Campos et al., 2013). Nós hipotetizamos que a elevação do
número de linfócitos observados nos animais pré-administrados com licopeno antes da
exposição à FC (ou seja, o grupo Li50 + FC) em comparação com o GFC pode ser devido à
habilidade do licopeno em ativar a resposta imune adaptativa, uma vez que essa resposta é
importante para manter uma defesa adequada contra os micro-organismos (Lederer et al.,
1999).
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
102
As doenças inflamatórias das vias aéreas e do pulmão são caracterizadas por
inflamação crônica e um desequilíbrio oxidante/antioxidante, uma das principais causas de
danos celulares (Lee e Yang, 2012). Uma importante citocina pró-inflamatória é o TNF-α, o
qual desencadeia um ciclo de feedback positivo durante a inflamação através da ativação do
NF-kB. Como consequência disso, ocorre o aumento da transcrição do TNF-α e sua
subsequente liberação amplifica o processo inflamatório (Hazewindus et al., 2014). Em
contraste, algumas citocinas exibem atividade anti-inflamatória (por exemplo, IL-4, IL-10 e
IL-13). Os monócitos/macrófagos são, em parte, super-estimulados pelo IFN-γ e se tornam
as fontes mais importantes para a liberação de outros mediadores inflamatórios (Martins et
al., 2013). Conforme mencionado anteriormente, observamos um aumento no número de
macrófagos no LBA, o que explicaria os aumentos nos níveis de IFN-γ e TNF-α. A redução
dos macrófagos observados em camundongos administrados com licopeno que tinham sido
expostos a FC pode ser devido as reduções semelhantes nos níveis de TNF-α, IFN-γ e IL-
10. Acreditamos que o licopeno promoveu uma regulação negativa dessas citocinas. Esta
hipótese foi sugerida por Palozza et al. (Palozza et al., 2011) que relataram uma inibição na
produção de citocinas pelo licopeno operando através de um mecanismo redox. Esta hipótese
é corroborada por observações anteriores de que o licopeno possui propriedades redox in
vitro e in vivo em muitos sistemas biológicos (Rousseau et al., 1992; Sies e Stahl, 1995).
Além disso, foi descrito que o licopeno ou os produtos do tomate promoveram uma
regulação negativa da produção de citocinas em estudos que utilizaram culturas de células
bem como em seres humanos (Radhakrishnan et al., 2008). Verificou-se também que o
licopeno diminuiu a expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias por inibição da
ativação da via de sinalização do NF-κB pelo TNF-α tanto in vitro como in vivo (Gouranton
et al., 2011; Luvizotto Rde et al., 2013). Palozza at al. (Palozza et al., 2011) mostraram que
em macrófagos THP-1 expostos a oxiesteróis, sozinhos e em combinação com licopeno (2
μM) durante 24 horas, a concentração de 4 μM de oxiesteróis foi mais potente na estimulação
da produção de TNF-α e a administração com licopeno inibiu significativamente a secreção
basal de TNF-α. Hazewindus et al. (Hazewindus et al., 2014) relataram que compostos
bioativos e/ou nutrientes presentes no ketchup, produto alimentício derivado do tomate foi
capaz de atenuar as fases iniciais da inflamação através de dois mecanismos distintos, isto é,
inibindo o circuito de reação positiva pró-inflamatória e estimulando o circuito de reação
anti-inflamatória (Hazewindus et al., 2014). Palozza et al. (Palozza et al., 2011) sugerem
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
103
que a capacidade potencial do licopeno de influenciar os níveis de citocinas pode ser, pelo
menos em parte, explicada pelo fato de se tratar de um composto lipofílico capaz de associar-
se ou integrar-se na membrana celular , onde as moléculas de superfície regulam a resposta
imune primária e onde o carotenóide pode modular a produção de espécies reativas, a
atividade de quinases redox sensíveis e a atividade de fatores de transcrição, como NF-κB.
Proteases e as ERO são subprodutos de leucócitos ativados e contribuem para a
resposta inflamatória e destruição do parênquima pulmonar (Rahman e Adcock, 2006). Os
resultados do nosso estudo mostraram pela primeira vez que a exposição em curto prazo à
FC pode causar alterações morfológicas no parênquima pulmonar e que a administração com
licopeno foi eficaz na reversão dessas alterações. Propomos que esse resultado seja devido
à ação antioxidante do licopeno, possivelmente atuando diretamente contra os oxidantes
presentes na FC, reduzindo assim o dano oxidativo no parênquima pulmonar, prevenindo
desta forma o início do processo inflamatório. Murta et al. (Murta et al., 2016) relataram em
ratos Fischer expostos a 5% de formaldeído, a redução da Vv de septos alveolares no
parênquima pulmonar em comparação com os animais controles.
A via de sinalização do Nrf2 é considerada um mecanismo molecular protetor em
vários processos patológicos, especialmente em desequilíbrio redox (Kennedy-Feitosa et al.,
2014). A ativação dessa via de sinalização pode induzir a expressão de genes protetores
endógenos em vários tecidos e células, incluindo a transcrição de genes alvo envolvidos na
homeostase redox (Teasdale et al., 2016; Barroso et al., 2017). Em geral, os resultados do
presente estudo mostraram que o licopeno não induziu a translocação do Nrf2 para o núcleo.
Em nosso modelo experimental, o licopeno atuou como um potente antioxidante,
neutralizando as espécies reativas, diminuindo assim seus níveis. A ativação de genes
antioxidantes através da translocação nuclear do Nrf2 não parece ser necessária para os seus
efeitos antioxidantes no nosso modelo experimental. Esta hipótese é suportada pela
observação de que a exposição à FC leva a translocação do Nrf2 para o núcleo e que esta
translocação foi diminuída em camundongos administrados com licopeno antes da exposição
à FC. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na expressão de Nrf2
juntamente com uma redução concomitante nas atividades das enzimas CAT e GPx em
camundongos administrados com licopeno e expostos à FC, reforçando os dados que
mostraram uma translocação diminuída do Nrf2 em camundongos administrados com
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
104
licopeno antes de exposição à FC. No caso da atividade de SOD, embora a FC tenha
diminuído os níveis de SOD, não observamos quaisquer diferenças significativas entre
camundongos administrados com licopeno e expostos à FC. Nossos dados corroboram com
os dados de um estudo prévio de Teasdale et al. (Teasdale et al., 2016), que estudaram o
efeito do extrato da FC em genes responsivos a Nrf2 em células endoteliais da artéria
coronária humana. Os autores observaram que as células endoteliais da artéria coronária
humana responderam aos componentes nocivos do extrato da FC ativando a via do Nrf2.
Feitosa et al. (Kennedy-Feitosa et al., 2014) relataram que em camundongos do tipo
selvagem, ou camundongos knockout para 5-lipoxigenase, expostos a FC durante 60 dias, a
expressão da proteína Nrf2 foi reduzida no grupo knockout em comparação com
camundongos do tipo selvagem e que a expressão da proteína Nrf2 aumentou em
camundongos do tipo selvagem expostos a FC em comparação com os camundongos
controles.
O presente estudo foi o primeiro a descrever os efeitos da administração de licopeno
e FC na expressão do Nrf2 em camundongos. Poucos estudos descreveram o efeito do
licopeno na via Nrf2, entretanto, existem vários estudos, conduzidos em diferentes tipos de
células que examinaram o efeito de outros compostos antioxidantes na translocação nuclear
do Nrf2. Ben-Dor et al. (Ben-Dor et al., 2005) relataram que, numa linhagem de células
epiteliais brônquicas humanas imortalizadas (células BEAS-2B), o tratamento com 10 μM
de ácido apo-10 '-licopenóico durante 3 h aumentou os níveis nucleares de Nrf2 em 50% em
relação aos controles e que esses níveis aumentaram para 1,6 vezes em relação aos controles
após 6 h de tratamento (Lian e Wang, 2008). Shie et al. (Shie et al., 2015) também
investigaram o efeito da Spiranthes sinensis (SSE) na translocação nuclear de Nrf2 em
células RAW 264.7 na presença de LPS. Os autores mostraram que o Nrf2 foi transcolado
para o núcleo de células tratadas com SSE (250 μg / mL) em comparação com as células
controles ou tratadas com LPS.
O desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes a favor dos oxidantes, pode alterar e
ou controlar a sinalização redox, os danos moleculares, o aumento das atividades de catalase
(CAT), superóxido dismutase (SOD) e depleção da glutationa reduzida GSH) (Valenca et
al., 2009) (Ferreira et al., 2014). O ânion superóxido é rapidamente eliminado, enquanto que
o peróxido de hidrogênio é muito mais estável e pode atravessar a membrana celular. De
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
105
acordo com Lushchak et al. (Lushchak, 2015) os níveis elevados de espécies reativas podem
inibir a atividade de enzimas antioxidantes (Lushchak, 2015). Acreditamos que a falta de
efeito do licopeno sobre os níveis de SOD em camundongos expostos à FC pode ser
explicada como se segue; O licopeno reduziu diretamente a produção de ânion superóxido
produzido pela via da NADPH oxidase (Asano et al., 2012), e na presença de níveis
diminuídos de ânion superóxido, o licopeno pode agora neutralizar as espécies reativas
presentes sem a necessidade de ativação da SOD. Hadad et al. relataram que macrófagos
expostos a lipopolissacarídeo (LPS) e tratados com licopeno (1μM) houve uma inibição
significativa de p47phox e consequrntemente, houve uma diminuição na produção de ânion
superóxido (Hadad e Levy, 2012). Trabalhos anteriores de nosso grupo também relataram
uma diminuição na atividade de SOD em homogenatos pulmonares nos grupos expostos à
FC no terceiro e quinto dias de exposição, em comparação com o GC (Campos et al., 2013).
A catalase atua na conversão de H2O2 em H2O (De Oliveira et al., 2015). Essa
enzima apresentou elevada atividade em camundongos expostos á FC e a administração com
o licopeno reduziu sua atividade. Em relação à CAT e GPx, nosso grupo de pesquisa
(Campos et al., 2013) apresentou em um trabalho anterior um aumento de suas atividades
após a exposição à FC, presumivelmente atuando com um papel protetor. Sugerimos que a
redução das atividades de catalase e GPx observadas nesse trabalho, pode ser devido a
propriedade do licopeno de neutralizar diretamente as espécies reativas, atuando como um
antioxidante inibindo assim os efeitos das espécies reativas (Srinivasan et al., 2009). Nós
acreditamos que o aumento da atividade de GPx observado nos animais que foram
administrados com licopeno (25 mg) antes da exposição à FC (isto é, o grupo Li25+FC) foi
devido ao efeito da exposição à FC. Neste caso, a concentração de licopeno pode não ter
sido suficientemente elevada para conseguir um efeito compensatório como foi observado
nos camundongos administrados com uma dose mais elevada de licopeno (isto é, o grupo
Li50+FC). Nossos dados corroboram com um estudo prévio de Sadek et al. (Sadek et al.,
2016) que mostraram uma redução nas atividades tanto de SOD como de CAT nos cérebros
de camundongos administrados com licopeno e glutamato monossódico. Ferreira et al.
(Ferreira et al., 2014) também relataram um aumento na atividade de CAT após a exposição
à FC, bem como uma redução na atividade de CAT após o tratamento com sinvastatina.
Srinivasan et al. (Srinivasan et al., 2009) relataram que as atividades de SOD, CAT e GPx
decresceram significativamente em linfócitos irradiados com radiação-γ e que o pré-
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
106
tratamento com licopeno resultou na elevação das atividades dessas enzimas (Srinivasan et
al., 2009).
A razão GSH/GSSG pode ser um importante indicador do estado redox (Park et al.,
1998). Nossos dados de razão GSH/GSSG em homogenados de pulmão sugerem que o
licopeno preveniu a redução de GSH ou a produção de GSSG. Um estudo recente indicou
que há um aumento na razão GSH/GSSG em todos os grupos administrados com estatinas e
expostos à FC em relação ao GFC nos pulmões de ratos (Ferreira et al., 2014). Srinivasan et
al mostraram que linfócitos irradiados com radiação-γ apresentaram uma diminuição
significativa dos níveis de GSH em comparação com os linfócitos normais (Srinivasan et al.,
2009), e o pré-tratamento com licopeno nesses linfócitos irradiados causou um aumento
significativo nos níveis de GSH em comparação com os linfócitos irradiados. Os níveis
reduzidos de GSH em linfócitos irradiados com radiação-y podem ser devidos a uma
produção exarcebada de ERO (Prasad et al., 2005). Srinivasan et al. relataram que o pré e
pós-tratamento com licopeno aumentou significativamente o nível de GSH em ratos tratados
com cisplatina. Esses resultados sugerem que o licopeno atua como um agente antioxidante,
protegendo deste modo os níveis de GSH celular (Srinivasan et al., 2009). Quando o H2O2
ou ONOO- estão elevados, pode ocorrer uma elevação da GSSG, proporcionando um
possível mecanismo de sinalização por meio da troca de tiol-dissulfeto. Os níveis
aumentados de GSSG no escarro podem servir como marcador de desequilíbrio redox em
doenças pulmonares (Biswas e Rahman, 2009).
O aumento da carga oxidativa produzida pela liberação de espécies reativas de
neutrófilos e macrófagos contribui para o estabelecimento do desequilíbrio redox (Lanzetti,
Da Costa, Nesi, Barroso, Martins, Victoni, Lagente, Pires, Silva, et al., 2012). A geração
excessiva de espécies reativas leva à oxidação de vários tipos de biomoléculas, incluindo
carboidratos, proteínas, lipídios e ao DNA (Trejo-Solis et al., 2013). Verificou-se que o
licopeno inativou vários tipos de radicais livres, incluindo peróxido de hidrogênio, dióxido
de azoto, bem como os radicais sulfonila e tiol (Palozza et al., 2011). Nossos dados
corroboram com outros dados relatados em que o a exposição á FC a curto prazo demonstrou
estar associada a inflamação pulmonar aguda e dano gerado por radicais livres (Campos et
al., 2013) (Lanzetti et al., 2008). Além disso, relatou-se que o licopeno e os produtos do
tomate inibem a oxidação de lípideos e do DNA (Palozza et al., 2011). A exposição à FC
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
107
está associada a um aumento do nível de malondialdeído, um produto da oxidação dos
lipídios que pode ser medido em fluídos corporais usando o método TBARS (Draper et al.,
1993a). Nossos dados corroboram com outros dados relatados em que a exposição à FC por
um curto prazo podem estar associado à inflamação pulmonar aguda e aos danos oxidativos
(Campos et al., 2013) (Lanzetti et al., 2008).
Além disso, quando os animais foram administrados com licopeno e expostos à FC
(Li50 + FC), houve uma diminuição nos níveis de malondialdeído. Outros pesquisadores
relataram que in vitro, o licopeno protegeu as células de mamíferos contra a peroxidação
lipídica induzida por um nitrilotriacetato férrico (Fe-NTA) (Matos et al., 2000; Trejo-Solis
et al., 2013). No que diz respeito ao dano ao DNA, nossos dados estão de acordo com os de
Muzandu et al. que demonstraram em um estudo com fibroblastos de pulmão de hamster
chinês, onde o licopeno foi capaz de inibir os danos ao DNA induzidos por peroxinitrito
(Muzandu et al., 2006). Resultados semelhantes foram obtidos por Srinivasan et al. que
relataram que o pré-tratamento com licopeno em linfócitos irradiados também inibiu os
danos induzidos pela radiação γ inibindo assim a peroxidação de lípideos de membrana e a
quebra da cadeia de DNA (Srinivasan et al., 2009).
O óxido nítrico desempenha um papel crítico na inflamação pulmonar após a síntese
de óxido nítrico induzível, a regulação positiva por células inflamatórias e a ativação de vias
ligadas à lesão pulmonar (Zhao et al., 2009). A exposição à FC também está associada ao
aumento da expressão da óxido nítrico sintase induzível, o que, consequentemente, aumenta
os níveis de óxido nítrico (NO). O NO pode então reagir com o ânion superóxido para formar
o peroxinitrito, uma espécie reativa tóxica (Bar-Shai et al., 2006; Ferreira et al., 2014). Em
nosso estudo, os níveis de nitrito, que são uma medida indireta dos níveis de NO, não foram
alterados significativamente pela administração de licopeno ou pela exposição à FC.
7.3. 3ª Parte: Estudo 3- In vivo (Administração com licopeno e Exposição á FC a longo
prazo)
No modelo in vivo de exposição a longo prazo, também observamos vários efeitos
benéficos do licopeno no que se refere ao desequilíbrio redox e à inflamação em animais que
foram expostos à FC durante um período de 60 dias consecutivos. Nesse estudo, focamos
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
108
em um modelo de enfisema em camundongos induzido pela exposição em longo prazo à FC
e uma reversão da doença pulmonar através da administração com licopeno. O enfisema é
um componente típico da DPOC, uma doença inflamatória e progressiva das vias aéreas. No
entanto, não existe atualmente um tratamento eficaz para essa doença (Gao et al., 2017).
Nosso trabalho anterior de inflamação pulmonar aguda causada pela exposição em curto
prazo à FC apresentou resultados encorajadores com a administração com licopeno. O
objetivo do estudo a longo prazo foi verificar o papel do licopeno no enfisema em
camundongos expostos à FC durante 60 dias consecutivos.
A maioria dos relatos na literatura sobre tratamentos farmacológicos para o enfisema
em camundongos concentra-se na exposição aguda à FC ou exposição em longo prazo à FC
associada a administração de fármacos. Essas abordagens são fundamentais para
compreender os mecanismos farmacológicos de ação em pulmões de camundongos. No
entanto, os seres humanos normalmente não fumam durante o tratamento para evitar ou
prevenir a doença pulmonar. As pessoas normalmente fumam durante anos até que
desenvolvam sintomas de DPOC e, finalmente, o enfisema. Os doentes procuram tratamento
para a DPOC quando os sintomas aparecem, mas tratamentos totalmente eficazes que
possam reverter a doença pulmonar ainda não estão disponíveis (Pinho-Ribeiro et al., 2017).
No nosso modelo experimental, a exposição em longo prazo à FC levou a uma perda
de peso significativa e a administração com licopeno não foi capaz de restaurar esse
parâmetro. De acordo com esses achados, Selim at al. relataram em ratos Wistar albinos
expostos à FC durante 30 semanas e administrados com 4 doses de survanta (surfactante
exógeno- 6,5 mg em 1 ml de PBS / rato) uma redução da massa corporal em relação ao grupo
controle e semelhante aos nossos achados, a administração com survanta não reverteu esse
parâmetro (Selim et al., 2017). Zhang et al. em um modelo de DPOC em ratos Sprague-
Dawley estabelecido pela exposição à FC, combinada com administração intratraqueal de
LPS, foi observado uma redução da massa corporal nos animais expostos, porém o
tratamento com curcumina via gavagem orgástrica (100 mg / kg) uma vez por dia, durante
30 dias, foi capaz de reverter esse parâmetro (Zhang et al., 2016).
Sun et al também relataram uma diminuição da massa corporal em ratos Sprague-
Dawley expostos à fumaça de cigarro durante 4 meses em relação ao grupo controle e assim
como em nosso modelo, a sinvastatina (5 mg/ kg/dia) também não conseguiu evitar a perda
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
109
de peso induzida pela exposição à FC (Sun et al., 2017). Estudos demonstraram que a
diminuição do ganho de peso está relacionada com a inflamação e subsequente secreção de
TNF, que é um mediador catabólico (Bazzoni e Beutler, 1996). Em camundongos, a nicotina
aumenta a saciedade e reduz a ingestão de alimentos (Mineur et al., 2011). Observações
recentes revelaram que ratos expostos à FC tiveram uma alteração da regulação do apetite
hipotalâmico através da elevação aguda de neurotransmissores. Além disso, a FC tem um
efeito direto sobre o tecido adiposo, causando maior oxidação lipídica (Magnani et al.,
2015).
As células vermelhas do sangue desempenham um papel importante na integração
metabólica e na suplementação de oxigênio e nutrientes para os tecidos (He et al., 2008).
Devido a sua função de transportadores de oxigênio e de óxido nítrico, os eritrócitos estão
em constante contato com espécies reativas resultando no desequilíbrio redox (He et al.,
2008; Balansky et al., 2012). A maior fonte das ERO nos eritrócitos é a hemoglobina, a qual
sofre uma auto-oxidação para produzir O2- (He et al., 2008). Como consequência dessa
exposição exarcebada, os eritrócitos possuem um amplo mecanismo de defesa antioxidante
composto pelas enzimas SOD, CAT, GPx e glutationa redutase. Possui também um sistema
enzimático metahemoglobina redutase/NADH/glicólise, que atua mantendo a hemoglobina
na sua forma ativa, ou seja, capaz de transportar oxigênio para os tecidos (He et al., 2008;
Balansky et al., 2012). Acreditamos que o aumento observado nos níveis de eritrócitos no
grupo exposto, pode estar associado à tentativa do organismo em combater os efeitos
deletérios da FC e também em aumentar a oferta de oxigênio, por outro lado, a redução
desses níveis no Li25+FC e Li50+FC pode estar associado a um possível efeito protetor do
licopeno nos eritrócitos com objetivo de prevenir os danos oxidativos.
Sabe-se que a FC é capaz de aumentar os níveis de hematócrito e hemoglobina
mediada pela exposição ao monóxido de carbono. Dessa forma, o monóxido de carbono liga-
se a hemoglobina para formar a carboxihemoglobina, forma inativa da hemoglobina que é
incapaz de transportar oxigênio para os tecidos. Para compensar a redução no transporte de
oxigênio, o organismo de fumantes mantém uma alta concentração de hemoglobina quando
comparados com não fumantes (Pryor e Stone, 1993). Outra alteração química que pode
ocorrer na hemoglobina resultante da ação da FC é a formação da metahemoglobina (MetHb)
na qual o ferro da hemoglobina está no estado férrico (Fe3+) e não no estado ferroso (Fe2+)
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
110
(Zhao et al., 2009; Balansky et al., 2012). Com o ferro oxidado, a hemoglobina torna-se
incapaz de transportar oxigênio (O2), uma vez que o O2 só se liga à hemoglobina no estado
ferroso, sendo assim, a formação de MetHb reduz a capacidade de transportar O2 para os
tecidos (Zhao et al., 2009).
Observamos um aumento dos níveis de hemoglobina no grupo exposto à FC e uma
redução nos grupos administrados com licopeno. Pacientes com DPOC são mais propensos
a desenvolver um maior grau de inflamação em suas vias aéreas devido a infecções
bacterianas ou virais e poluentes presentes no ar (Gao et al., 2017). A inflamação,
particularmente das pequenas vias aéreas, é caracterizada por um acúmulo de células
inflamatórias, tais como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas (Barnes, 2004). Essas
células, juntamente com as células epiteliais das vias aéreas, liberam espécies reativas de
oxigênio, citocinas, quimiocinas e metaloproteinases de matriz (MMPs) responsáveis pela
patogênese da DPOC. Embora a terapia farmacológica tenha como objetivo controlar estes
sintomas, existe uma necessidade em desenvolver novas abordagens a fim de prevenir a
progressão das limitações do fluxo de ar e/ou enfisema (Gao et al., 2017).
O desequilíbrio redox está envolvido na progressão da lesão pulmonar induzida pela
FC e altera a função do epitélio das vias aéreas/espaço aéreo. O dano pulmonar parece ser
uma consequência de uma lesão inflamatória primária caracterizada pelo acúmulo de
macrófagos alveolares e neutrófilos nas vias respiratórias inferiores (Domagala-Kulawik,
2008). As células inflamatórias ativadas, que se acumulam nas vias aéreas inferiores, liberam
quantidades nocivas das ERO que resultam em uma lesão no parênquima pulmonar e em
lesões intersticiais e alveolares (Nesi et al., 2016) A inflamação pulmonar e sistêmica está
correlacionada com DPOC (Zhang et al., 2016), portanto, avaliamos o efeito do licopeno
sobre a resposta inflamatória em um modelo de DPOC em camundongos. Nós demonstramos
que à exposição em longo prazo à FC levou a um aumento do número de células
inflamatórias circulantes, assim como dos níveis de citocinas inflamatórias e em
contrapartida, a administração com licopeno reduziu a inflamação pulmonar como
determinada pelo número de macrófagos, neutrófilos e linfócitos bem como das citocinas
inflamatórias. Nossos resultados são consistentes com o estudo de Ribeiro et al. que
relataram um aumento no influxo de células inflamatórias no LBA de camundongos
C57BL/6 (12 cigarros durante 60 dias) e uma diminuição nos grupos que foram tratados com
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
111
atorvastatina por via inalatória (15 min com 1 mg / mL uma vez ao dia) e expostos à FC mas
não no grupo tratado sinvastatina e exposto à FC. O mesmo padrão de número total de células
foi observado nos macrófagos, mas não nos neutrófilos, sendo maior no GFC quando
comparado ao grupo controle, enquanto a atorvastatina e a sinvastatina foram associadas
com a diminuição do número de neutrófilos quando comparado com GFC (Pinho-Ribeiro et
al., 2017). Sun et al. observaram em ratos Sprague-Dawley expostos a FC (2x ao dia, 5 dias
por semana durante 16 semanas) que o número de leucócitos totais estavam aumentados no
LBA do GFC e reduzido nos ratos tratados com sinvastatina. Além disso, a contagem
diferencial de neutrófilos, macrófagos e linfócitos mostrou que a FC resultou em um
acúmulo de neutrófilos e macrófagos, mas com uma diminuição dos linfócitos. A
sinvastatina reduziu os neutrófilos, mas não teve efeito nos macrófagos ou nos linfócitos. Os
animais do grupo FC+ sinvastatina foram administrados por gavagem orogástrica (5 mg / kg
/ dia) (Sun et al., 2017). Em um outro trabalho, He et al. relataram que camundongos
C57BL/6 quando expostos a FC (10 cigarros/dia durante 12 semanas) apresentaram aumento
no número de leucócitos totais, neutrófilos e macrófagos no LBA em relação aos grupos
controle (He et al., 2015). Resultados semelhantes também foram relatados por nosso grupo
de pesquisa em 2011, onde camundongos C57BL/6 foram expostos a um total 12 de cigarros
durante 60 dias. Neste estudo, Bezerra et al. mostraram que a quantidade de macrófagos e
neutrófilos no LBA de animais expostos a FC foram maiores do que os valores do GC
(Bezerra et al., 2011). Lanzetti et al. observaram em um modelo de enfisema onde os
camundongos C57BL/6 foram expostos a um total de 12 cigarros durante 60 dias que o
número de células inflamatórias (macrófagos e neutrófilos) estavam aumentadas no GFC em
comparação com GC. Em contraste, os animais que foram expostos a FC e tratados com
Mate (500 mg / kg / dia, Leão Junior AS -Curitiba, PR, Brazil) apresentaram uma redução
significativa no número de neutrófilos em comparação com GFC, porém não foi observado
diferença em relação ao número de macrófagos no grupo FC + Mate em relação ao GFC
(Lanzetti et al., 2011).
A inflamação crônica na DPOC está associada ao aumento da produção de vários
mediadores e proteínas pró-inflamatórias, incluindo citocinas, quimiocinas, receptores e
moléculas de adesão, que são reguladas por fatores de transcrição. Dentre os mediadores,
destacam-se aqueles que exercem atividade quimiotática para células inflamatórias,
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
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notadamente o leucotrieno B4 e IL-8, assim como as citocinas pró-inflamatórias, tais como
TNF, IL-1β e IL-6 (Queiroz, 2015).
Os componentes da FC ativam e estimulam as células inflamatórias a liberarem
citocinas inflamatórias, que por sua vez liberadas levam ao recrutamento e ativação de mais
células inflamatórias ocasionando assim as lesões nas vias aéreas (Sun et al., 2017). Zhang
et al. em um modelo de DPOC em ratos Sprague-Dawley, observaram que no LBA os níveis
de TNF foi maior que nos animais expostos à FC, porém o tratamento com curcumina via
gavagem orogástrica (100 mg/ kg) diminuiu significativamente os níveis de TNF (Zhang et
al., 2016). O TNF contribui para a indução da inflamação e para a patogênese do enfisema.
Além disso, o TNF está envolvido no recrutamento de células inflamatórias no pulmão de
fumantes (D'hulst et al., 2005). Nossos dados corroboram com o trabalho publicado por
Ribeiro et al. que relataram um nível elevado de TNF no GFC em relação ao GC. Todavia,
o tratamento com atorvastatina reduziu os níveis de TNF quando comparado ao GFC,
atingindo o mesmo valor do grupo controle (Pinho-Ribeiro et al., 2017). Tabata et al.
relataram os efeitos in vivo com talidomida sobre a expressão de RNAm para as citocinas
inflamatórias nos pulmões de ratos. Os níveis de RNAm para IL-1β, IL-6 e TNF foram
significativamente elevados nos pulmões dos animais que foram injetados
intraperitonealmente com 10 % do extrato da FC do que no CG e foram significativamente
diminuídos pelo tratamento com talidomida (4 mg/kg) (Tabata et al., 2015). Li et al. em um
modelo de enfisema induzido pela exposição a FC (10 cigarros, 2x ao dia durante 24
semanas) mostraram níveis elevados de IFN no LBA do grupo exposto à FC em comparação
com o GC (Li et al., 2015).
Estudos em linhas de pesquisas distintas têm relatado que a administração com
licopeno em culturas de tecido adiposo resultou na diminuição da expressão TNF, IL-6,
proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1) e IL-1beta, o que demonstra pelo menos
em parte, a capacidade do licopeno em alterar o perfil de citocinas inflamatórias. Tanto o
desequilíbrio redox derivado da exposição a FC quanto o celular levam a uma resposta
inflamatória amplificada na DPOC. As ERO ativam vias de sinalização tais como MAPK
(ERK, JNK e p38 quinases) levando à dissociação NFkB - IkB. O NF-kB transloca-se para
o núcleo e se liga aos elementos de resposta específicos que levam à ativação de múltiplos
genes inflamatórios envolvidos na resposta inflamatória de pacientes com DPOC (Boutten
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
113
et al., 2010). A atividade anti-inflamatória do licopeno foi relatada em células endoteliais,
onde o licopeno foi capaz de inibir sinalização NF-kB, o que pode explicar a diminuição
observada nos níveis das citocinas avaliadas em nosso estudo, uma vez que uma
downregulation da via do NF-kB promovida pelo licopeno leva a uma diminuição da
expressão de genes inflamatórios (Gostner et al., 2013).
Acredita-se que a inflamação crônica das vias aéreas desempenha um papel
importante no desenvolvimento da DPOC. Sob o efeito de citocinas inflamatórias,
neutrófilos e macrófagos migram para o local da lesão e resultam em lesão e remodelação
tecidual (Sun et al., 2017). De acordo com este conceito, nosso estudo demonstrou que a
exposição à FC nos animais resultou no acúmulo de neutrófilos e macrófagos, além de danos
significativos da estrutura alveolar (aumento de Lm, Vva e diminuição da Vvsa) e que quando
os animais foram administrados com o licopeno, observamos uma melhora desses
parâmetros. Em nosso estudo, o objetivo principal foi induzir um modelo de enfisema
causado por FC e avaliar uma potencial reversão da DPOC. Nosso modelo de enfisema
pulmonar utilizado induziu mudanças estruturais, inflamatórias e oxidativas semelhantes às
observadas em enfisema humano (Kim et al., 2016). As mudanças estruturais incluíram um
aumento do Lm, dos espaços aéreos alveolares, destruição dos septos alveolares e redução
das fibras colágenas por área de tecido. Os grupos administrados com licopeno mostraram
uma melhora significativa em quase todos os parâmetros descritos acima. Nossos dados vão
de encontro ao trabalho de Valença et al. que demonstraram em um modelo de exposição à
FC em longo prazo (6 cigarros por dia durante 60 dias) um aumento do Lm no GFC em
relação ao GC, enquanto que o tratamento com N-acetilcisteína (FC + NAC- 200 mg/kg/dia)
mostrou uma diminuição em relação ao GFC. Nesse trabalho também foi observado uma
diminuição da Vvsa no GFC em comparação com o GC. Por outro lado, o tratamento com
N-acetilcisteína (FC + NAC) levou ao aumento do Vvsa quando comparado ao GFC
(Valenca et al., 2011). Zhang et al. relataram que o enfisema foi atenuado com a
administração de curcumina em ratos expostos à FC. Os autores verificaram um aumento do
Lm no GFC, bem como uma diminuição no grupo administrado com curcumina e exposto à
FC (Zhang et al., 2016). De acordo com esses achados, Selim at al. relataram que o grupo
enfisematoso exibiu um aumento do diâmetro dos alvéolos conforme avaliado pela análise
morfométrica de Lm. No grupo tratado com Survanta, os valores de Lm foram maiores do
que do controle (Selim et al., 2017). Em um outro trabalho, Sun et al. observaram em ratos
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
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Sprague-Dawley expostos a FC que o Lm foi significativamente aumentado no GFC em
comparação com o GC, a administração com a simvastatina não bloqueou significativamente
a alteração do Lm (Sun et al., 2017). O achados de Lanzett et al, corroboram com nossos
dados, onde eles observaram um aumento do Lm no GFC em comparação com o controle,
enquanto que no FC + Mate houve uma redução do Lm em comparação com o GFC. O grupo
FC também apresentou aumento na Vva quando comparado com os grupos controles. Assim
como no nosso trabalho, a administração com o antioxidante (mate) restaurou a Vva
(Lanzetti et al., 2011). Nossos resultados são consistentes com o estudo de Ribeiro et al. que
relataram em camundongos C57BL/6 um aumento do Lm no GFC quando comparado ao
GC, enquanto que o Lm nos grupos FC + A e FC + S foi menor do que no GFC. Ainda neste
estudo foi observado uma menor distribuição de fibras colágenas no parênquima pulmonar
no grupos GFC e FC + A quando comparados ao grupo controle. O Vv das fibras colágenas
no grupo FC + S foi semelhante ao GC (Pinho-Ribeiro et al., 2017). Em um estudo realizado
por Wright et al. (Wright et al., 2011) em porcos-da-índia que foram expostas à FC durante
6 meses e tratadas com Simvastatina por 3 meses após a exposição, os autores observaram
que simvastatina foi capaz de prevenir o enfisema pulmonar; No entanto, a simvastatina foi
incapaz de demonstrar qualquer efeito na recuperação de fibras colágenas. Sugerimos que a
administração com licopeno nas duas doses utilizados no nosso modelo experimental para o
enfisema podem ter sido insuficientes na restauração das fibras colágenas e que a
administração com doses mais elevadas pode ser mais promissor em relação à recuperação
de tais fibras.
Nós avaliamos a extensão do dano oxidativo pela peroxidação lipídica e dano ao
DNA em homogeneizados pulmonares. O GFC apresentou maior peroxidação lipídica e
dano ao DNA. Em contrapartida, os grupos administrados com licopeno apresentaram
melhora significativa nos dois parâmetros citados. Um estudo recente mostrou elevados
níveis de MDA no GFC quando comparados aos níveis no grupo controle. O tratamento com
atorvastatina ou sinvastatina foi capaz de reduzir os níveis de MDA quando comparado ao
GFC. O grupo FC + S apresentou níveis menores de MDA quando comparado ao grupo FC
+ A (Pinho-Ribeiro et al., 2017). Nesi et al. publicaram um estudo que demonstrou aumento
nos níveis de TBARS e no conteúdo de carbonilas em homogeneizado pulmonar no GFC
quando comparado ao GC e esses valores foram reduzidos com treinamento físico
preventivo (Nesi et al., 2016). O dano ao DNA é o principal iniciador do câncer e
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
115
desempenha um papel fundamental na patogênese do envelhecimento, doenças
neurodegenerativas, pulmonares e cardiovasculares (Ganapathy et al., 2017). Dalrymple et
al demosntaram que os mecanismos de reparo do DNA são rapidamente ativados no pulmão
após exposição à FC (Dalrymple et al., 2015). Dalrymple et al. relataram um aumento do
dano ao DNA em um modelo de exposição à FC em que células alveolares do tipo II foram
isoladas de ratos Sprague-Dawley após 3 e 6 semanas de exposição a FC (Dalrymple et al.,
2016). Curiosamente, quando os dados de dano ao DNA de 3 semanas foram comparados
com os dados de 6 semanas, observou-se diferença significativa, sugerindo que o reparo ao
DNA ocorreu no pulmão do rato após a exposição a FC, mas o dano ao DNA permaneceu e
irá se acumular no pulmão se a exposição FC continuar (Dalrymple et al., 2016). Ensaios
que medem a capacidade de reparo do DNA sugerem que pode variar muito entre indivíduos.
Pesquisas anteriores relataram uma menor capacidade de reparo do DNA em pacientes com
DPOC. O achado apoia a hipótese de que as variantes nos genes de reparo do DNA poderia
afetar a suscetibilidade à DPOC (Da Silva et al., 2013).
Os carotenóides agem como desativadores do oxigênio singleto ou como
sequestradores dos radicais peroxila, reduzindo a oxidação do DNA e lipídios que está
associada a doenças degenerativas, como câncer e doenças cardíacas. Outro aspecto da
atividade do licopeno diz respeito à sua apolaridade, o que lhe permite ser mais regenerador,
combatendo os radicais formados com mais eficiência no interior da membrana (Woodall,
Lee, et al., 1997) (Woodall, Britton, et al., 1997). Acreditamos que em nosso modelo
experimental a redução dos danos foi promovida pela capacidade antioxidante do licopeno
devido às numerosas insaturações conjugadas presentes na sua estrutura química, o que
permitiu maior habilidade para neutralizar os radicais livres (Rao e Agarwal, 1998) (Trejo-
Solis et al., 2013). Células em condições de estresse, produzem enzimas antioxidantes como
mecanismo de defesa. Muitas dessas enzimas são reguladas pelo elemento de resposta
antioxidante (ARE). O regulador central do ARE é o fator de transcrição Nrf2, que é retido
no citoplasma em uma forma inativa ligada a um proteína rica em cisteínas Keap-1. Keap-1
dirige para ubiquitinação e para degradação no proteassoma (Sun et al., 2015).
Durante o desequilíbrio redox, Keap-1 dissocia-se do Nrf2, e o último se transloca
para o núcleo promovendo a ativação de genes. Diferentemente do nosso modelo de
exposição em curto prazo a FC, no modelo de exposição em longo prazo, a FC bem como o
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
116
licopeno não induziram a translocação do Nrf2 para o núcleo em nenhum dos grupos
experimentais. Desta forma, podemos inferir que como não houve translocação do Nfr2 para
o núcleo, como consequência não ocorreu alteração da transcrição do RNAm, bem como da
expressão protéica das enzimas antioxidantes. Nós acreditamos que o licopeno não foi capaz
de alterar a expressão gênica e proteica das enzimas, todavia pode estar atuando de forma
pós-traducional estimulando co-fatores que podem levar a ativação das enzimas
antioxidantes, o que explicaria o aumento da atividade destas enzimas nos grupos
administrados com licopeno independentemente da ativação da via do Nfr2. Entretanto, para
a comprovação desta hipótese mais estudos serão necessários. Diferentemente do nosso
resultado, observações recentes revelaram que através da mensuração da expressão de Keap-
1 como indicador indireto da translocação do Nrf2 para o núcleo, observou-se que o tratado
com sinvastatina (FC+S) apresentou uma redução significativa na expressão de Keap-1
comparado ao GFC, sugerindo que uma quantidade maior de Nrf2 foi translocada,
corroborando com os resultados de imuno-histoquímica para Nrf2 em que o grupo FC + S
mostraram macrófagos positivos para a expressão de Nrf2 (Pinho-Ribeiro et al., 2017). A
exposição à FC demonstrou anteriormente suprimir as defesas antioxidantes celulares e
provocou danos significativos ao DNA (Campos et al., 2017) (Ganapathy et al., 2017). Aqui,
mostramos que a exposição a longo prazo a FC aumentou significativamente a concentração
das EROs evidenciado pela ativação e recrutamento de células inflamatórias, o que culminou
com a diminuição da capacidade antioxidante celular. SOD é a primeira linha de defesa
antioxidante e catalisa a dismutação de O2- em O2 e H2O2 (Rahman e Macnee, 1999)
(Campos et al., 2017). Nossos resultados indicaram que a FC reduziu as atividades das
enzimas SOD e CAT bem como da razão GSH/GSSG. O licopeno por sua vez, foi capaz de
restaurar as atividades dessas enzimas assim como da razão GSH/GSSG. O sistema
glutationa desempenha um papel importante no mecanismo de defesa pulmonar contra
ataques de radicais livres diminuindo os níveis de H2O2 (Rahman e Macnee, 1999). Podemos
sugerir que o licopeno melhorou a capacidade de manter o estado redox da glutationa no
tecido por um longo período de tempo. Além disso, as ERO presentes no cigarro tem o
potencial de ativar o fator nuclear (κB) (NF-kB) através de diversos mecanismos distintos
(Valenca et al., 2006). Esse processo inicia uma cascata de eventos, como a geração das
ERO, ativação de citocinas e fatores de transcrição que ativam vias MAPKs. Em
compensação, a administração com licopeno pode alterar a composição e a atividade da via
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
117
IκBα/ NF-kB e reduzir a expressão de NF-κB por células inflamatórias nos compartimentos
do parênquima alveolar do pulmão e isso provavelmente está associado, entre outros fatores,
ao aumento da expressão e atividade das enzimas antioxidantes e consequente redução do
desequilíbrio redox (Trejo-Solis et al., 2013; Nesi et al., 2016). Portanto, o aumento do
sistema antioxidante e consequente redução do desequilíbrio redox induzido pela
administração com licopeno observado no presente estudo pode ser um fator principal para
a proteção do pulmão contra a lesão pulmonar provocada pela exposição a FC. Em um
trabalho anterior do nosso grupo de pesquisa também foi relatado a redução das atividades
de SOD e CAT em homogeneizados pulmonares de animais FC em relação ao GC (Bezerra
et al., 2011).
Pires et al. utilizando o mesmo protocolo de exposição à FC em longo prazo que o
nosso, também relataram atividades reduzidas de SOD de CAT em homogeneizado
pulmonar. Porém, nenhum dos antioxidantes administrados durante o mesmo período em
que o protocolo de exposição reverteu o desequilíbrio redox observado no GFC (Pires et al.,
2011). Em outro trabalho publicado por Selim et al. o grupo enfisematoso também
apresentou uma diminuição significativa nas atividades de SOD e CAT em relação ao GC e
assim como no nosso trabalho, o grupo tratado com Survanta teve as atividades de SOD e
CAT aumentadas (Selim et al., 2017). Em ratos, Rinaldi et al. referiu estas alterações ao
desequilíbrio redox da inalação da fumaça (Rinaldi et al., 2012). Lanzetti et al. também
relataram uma redução das atividades de SOD e CAT no GFC e o tratamento com mate
promoveu um aumento das atividades CAT e SOD quando comparado ao GFC (Lanzetti et
al., 2011).
Em relação a razão GSH/GSSG, nós verificamos que a exposição a FC aumentou
essa razão e que o licopeno promoveu um aumento da razão GSH/GSSG. Nossos dados estão
de acordo com o trabalho de Lanzetti et al. que demonstraram uma redução dessa razão no
GFC em comparação com o GC e o tratamento com mate foi capaz de restaurar a razão
GSH/GSSG (Lanzetti et al., 2011). Valenca et al. também verificaram que o GFC apresentou
menor razão GSH / GSSG do que no grupo controle e uma proporção maior no grupo FC +
NAC do que no GFC (Valenca et al., 2011). A administração com licopeno (2,5 mg / kg)
aumentou os níveis de antioxidantes vitamina C, vitamina E e da glutationa reduzida (GSH)
assim como a atividade de enzimas circulantes GSH-dependentes, como a glutationa
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
118
peroxidase (GPx), glutationa redutase e glutationa-S transferase (GST) (Trejo-Solis et al.,
2013).
A mieloperoxidade (MPO) catalisa a oxidação do ânion cloreto em ácido
hipocloroso, o qual pode reagir com o H2O2 formando o 1O2 e com o O2- dando origem ao -
OH•. O oxidante gerado pela MPO também é capaz de combater vários compostos da FC e
induzir lesões vasculares pulmonares em fumantes que sofrem de doença pulmonar
obstrutiva crônica (Selim et al., 2017). Como H2O2 é mais reativo com MPO do que com a
CAT, isso explicaria o aumento da atividade MPO no GFC, concomitante com a redução da
atividade CAT neste grupo no nosso modelo experimental. Além disso, o aumento da
atividade MPO neste grupo também se correlaciona com o aumento do número de
neutrófilos em LBA. O licopeno por sua vez, confirmou novamente seu papel antioxidante
diminuindo a atividade de MPO. A atividade MPO, também se mostrou aumentada no GFC
em comparação com o GC em um estudo publicado por Lanzetti et al. Ainda neste trabalho,
atividade MPO no FC + Mate foi reduzida em comparação com a do GFC e foi semelhante
à do GC (Lanzetti et al., 2011). Nossos dados corroboram com trabalho de Ribeiro et al
também relataram uma atividade aumentada de MPO no GFC quando comparada ao GC. Os
grupos FC + A e FC + S mostraram uma redução na atividade MPO quando comparada ao
GFC (Pinho-Ribeiro et al., 2017).
Embora o óxido nítrico seja um radical livre, não é altamente reativo. O nitrito
aumenta as funções endoteliais e capilares e o excesso de NO pode reagir com superóxido
para formar peroxinitrito, um potente pro-oxidante (Peluffo et al., 2009). Fumar altera a
concentração de óxido nítrico exalado de maneira dependente do tempo. Um minuto após a
cessação do tabagismo, os níveis de óxido nítrico expirado aumentam em fumantes. Duas
horas após fumar, no entanto, os níveis de óxido nítrico expirado são menores em fumantes
em relação a não fumantes (Kanazawa et al., 1996) (Pinho-Ribeiro et al., 2017). Essa
redução sustentada do óxido nítrico expirado em fumantes pode resultar de processos
inflamatórios e de conversão dependentes do superóxido e do peroxinitrito (Pinho-Ribeiro
et al., 2017). Em nosso modelo, verificamos um aumento dos níveis de nitrito no GFC e a
administração com licopeno reduziu os níveis de nitrito. Assim como no nosso modelo,
Valenca et tal. também relataram aumento dos níveis de nitrito nos grupos GFC, FC+ LA e
Discussão
CAMPOS, K.K.D.
119
FC + NAC e grupo FC + LN apresentou o menor nível de formação de nitrito em comparação
com GFC (Valenca et al., 2011).
Conclusões
CAMPOS, K.K.D.
120
8. CONCLUSÕES E SUMÁRIO
Os resultados apresentados nesse estudo concluem que:
No experimento 1, in vitro, as células tratadas com licopeno (1 μM ou 2 μM) e
estimuladas com o EFC (0,5%) apresentaram uma diminuição da produção das ERO e o
licopeno mimetizou o efeito do calfostin e DPI reduzindo a produção das ERO, desta
forma sugere-se que o licopeno possa ter inibido uma ou ambas as vias relacionadas à
produção das ERO, ou seja, PKC e/ou NADPH oxidase, respectivamente.
No experimento 2, in vivo, em curto prazo:
A exposição à FC levou a um aumento no número de leucócitos totais, bem como da
peroxidação lipídica, do dano ao DNA, da Vva, da translocação do Nrf2, da atividade de
CAT, da razão GSH / GSSG e dos níveis de TNF-α, IFN-γ e IL-10 e a administração com
licopeno foi capaz de suprimir todos os parâmetros. Esses resultados confirmam a eficácia
do modelo experimental. Em relação a Vvsa, o licopeno foi capaz de melhorar esse
parâmetro, elevando a Vvsa. Em contraste, a atividade de SOD diminuiu no GFC em
comparação com (CG) e administração com licopeno não alterou esse parâmetro.
Conclusões
CAMPOS, K.K.D.
121
No experimento 3, in vivo, a longo prazo:
O licopeno promoveu uma redução do número de leucócitos totais e dos parâmetros
hematológicos, melhorou o quadro de enfisema pulmonar bem como o padrão histológico
do parênquima pulmonar. O licopeno foi capaz de melhorar o desequilíbrio redox,
diminuindo a peroxidação lipídica e o dano ao DNA, aumentou as atividades das enzimas
SOD, CAT e o conteúdo de GSH, mas não apresentou diferença significativa em relação
ao fator de transcrição Nrf2. Ainda, diminuiu os níveis de TNF-α, IFN-γ e IL-10. Também
foi capaz de diminuir a atividade da MPO e o conteúdo de nitrito.
Tomados em conjunto, nossos dados elucidam o papel do licopeno como um agente
antioxidante e anti-inflamatório nos nossos modelos experimentais de exposição à FC.
Conclusões
CAMPOS, K.K.D.
122
Quadro 4. Quadro comparativo dos efeitos do licopeno nos experimentos 2 e 3.
EXPERIMENTO 1- IN VITRO PRODUÇÃO DE ERRO
GC EFC Li0,5μM + 0,5% EFC Li1μM + 0,5% EFC Li2μM + 0,5% EFC
3 horas ─ ─ ─ ─ ─
24 horas ─ ↑ ↓ ↓ ↓
GC C+ (PMA+ION) C- (DPI) C- (CALF) 0,5 1 2
3 horas ─ ↑ ─ ─ ─ ─ ─
24 horas ─ ─ ↓ ─ ─ ─ ─
EXPERIMENTO 2- IN VIVO (CURTO PRAZO)
GC GO GFC Li25+FC Li50+FC
Leucócitos totais ─ ─ ↑ ─ ↓
Macrófago ─ ─ ↑ ↓ ↓
Neutrófilo ─ ─ ─ ↓ ─
Linfócito ─ ─ ↑ ↑ ↑
Vva ─ ─ ↑ ↓ ↓
Vvsa ─ ─ ↓ ↑ ─
Nfr2 ─ ─ ↑ ↓ ↓
TBARS ─ ─ ↑ ─ ↓
Dano ao DNA ─ ─ ↑ ─ ↓
SOD ─ ─ ↓ ─ ─
CAT ─ ─ ↑ ↓ ↓
GPx ─ ─ ↑ ↑ ↓
GSH/GSSG ─ ─ ↓ ─ ↑
Nitrito ─ ─ ─ ─ ─
INF- gama ─ ─ ↑ ↓ ↓
TNF ─ ─ ↑ ↓ ↓
IL-10 ─ ─ ↑ ↓ ↓
Legenda : - sem efeito; ↑: aumento; ↓: diminuição
Conclusões
CAMPOS, K.K.D.
123
EXPERIMENTO 3- IN VIVO (LONGO PRAZO)
GC GO GFC Li25+FC Li50+FC
Eritrócito ─ ─ ↑ ↓ ↓
Hematócrito ─ ─ ↑ ↓ ↓
Hemoglobina ─ ─ ↑ ↓ ↓
Leucócitos totais ─ ─ ↑ ↓ ↓
Macrófago ─ ─ ↑ ↓ ↓
Neutrófilo ─ ↓ ↑ ↓ ↓
Linfócito ─ ─ ↑ ─ ↓
Vva ─ ─ ↑ ↓ ↓
Vvsa ─ ─ ↓ ─ ↑
Vvcol% ─ ─ ↓ ─ ─
Lm ─ ─ ↑ ↓ ↓
Nfr2 ─ ─ ─ ─ ─
TBARS ─ ─ ↑ ↓ ↓
Dano ao DNA ─ ─ ↑ ↓ ↓
SOD ─ ─ ↓ ↑ ↑
CAT ─ ─ ↓ ↑ ↑
GSH/GSSG ─ ─ ↓ ↑ ↑
MPO ─ ─ ↑ ↓ ↓
Nitrito ─ ─ ↑ ↓ ↓
INF- gama ─ ─ ↑ ↓ ↓
TNF ─ ─ ↑ ↓ ↓
IL-10 ─ ─ ↑ ↓ ↓
Referências bibliográficas
CAMPOS, K.K.D.
124
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Anexos
CAMPOS, K.K.D.
139
ANEXO 1- BULA LICOPENO
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
140
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
141
ANEXO 2 - PROTOCOLO APROVADO PELA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO
DE ANIMAIS DA UFOP
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
142
ANEXO 3 – ARTIGOS PUBLICADOS DURANTE O DOUTORADO
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
143
ANEXO 4
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
144
ANEXO 5
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
145
ANEXO 6
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
146
ANEXO 7
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
147
ANEXO 8
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
148
ANEXO 9
Anexos
CAMPOS, K.K.D.
149
ANEXO 10
