UNIVERSIDADE DE SO PAULOFaculdade de Zootecnia e Engenharia de AlimentosDepartamento de Cincias Bsicas

BIOQUMICA FUNDAMENTALPROF. DR. MARCELO DE CERQUEIRA CESARENGENHARIA DE ALIMENTOS XIV - DIURNO

DETERMINAO DE PESOS MOLECULARES DAS PROTENAS DOS PESCADOS SARDINHA E ARUAN POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

CAROLINE OLIVEIRA AGOSTINI 9006913

Pirassununga 2015

SUMRIO

RESUMO31.INTRODUO42.OBJETIVO93.MTODO104.RESULTADOS E DISCUSSO125.CONCLUSO156.BIBLIOGRAFIA16

RESUMO

Para analisar propriedades de protenas necessrio purifica-las primeiro. Existem diversos mtodos descritos na literatura para se fazer a purificao. Um deles chamado de eletroforese, mtodo pelo qual as protenas de uma determinada amostra a ser analisada so separadas, no experimento desse relatrio elas sero separadas de acordo com o seu peso molecular. Para a realizao da corrida eletrofortica h a preparao de dois gis, o gel de separao e o gel de empilhamento, no gel de empilhamento sero colocadas as amostras e no gel de separao, como o prprio nome diz, onde as protenas sero separadas. A separao s possvel pois o gel de separao poroso, fazendo com que protenas mais leves caminhem por ele mais rapidamente e portanto, a uma distncia maior. necessrio tambm uma fonte de tenso para que as protenas caminhem. Ao final da corrida, o gel corado e pode-se verificar os pesos moleculares das protenas contidas nas amostras. essencial que junto com as amostras tenha uma amostra padro de pesos moleculares conhecida, para que, assim, a partir de uma curva padro, calcule-se os pesos moleculares das outras amostras.No experimento desse relatrio, verificou-se os pesos moleculares das protenas dos pescados Sardinha e Aruan e pode-se identificar, alm de outras, as protenas actina e miosina. Palavras chave: protena, purificao, eletroforese, gel de poliacrilamida, SDS-PAGE, peso molecular, sardinha, Aruan, actina, miosina

1. INTRODUOProtenas esto presentes em praticamente toda nutrio humana e animal e tambm nas clulas que os compe, torna-se interessante ento analisar as propriedades e atividades das mesmas. Para determinao dessas caractersticas necessria a purificao das protenas. Sendo assim vrios mtodos para separao de protenas esto descritos na literatura, podendo classificar a separao em tamanho, carga, propriedades de ligao, entre outros (LEHNINGER, 2006). Um dos mtodos de separao de protenas e outras macromolculas a eletroforese, fenmeno no qual uma molcula com carga eltrica move-se em um campo eltrico (BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2008). Apesar de possuir uma grande vantagem, ao possibilitar uma boa visualizao das protenas separadas e permitir ao pesquisador estimar rapidamente os diferentes tipos de protenas presentes na mistura bem como seu peso molecular aproximado, a eletroforese no utilizada, geralmente, para purificar grandes quantidades de protena, j que existem mtodos mais simples e que no afetam a estrutura e funo das protenas (LEHNINGER, 2006).Para a realizao da eletroforese necessrio um aparelho eletrofortico (Figura 1) constitudo de uma fonte de tenso e uma unidade de eletroforese, nesse aparelho so colocadas duas placas de corrida contendo, cada uma, um gel de separao e um gel de empilhamento, ou gis de poliacrilamida, que so formados pela copolimerizao de acrilamida e bisacrilamida, constituindo uma rede porosa, cujo dimetro dos poros inversamente proporcional a concentrao de acrilamida.

Figura 1 Aparelho eletroforticoFonte: http://www.prolab.com.br/produtos/equipamentos-para-laboratorio/cubas-de-eletroforese

O gel formado entre duas placas de vidro que so mantidas juntas por uma pina, porm separadas por um espaador (WILSON; WALKER, 2005), como mostra a Figura 2. Primeiramente colocado o gel de separao (gel de corrida) e aps sua solidificao colocado o gel de empilhamento (gel de concentrao) junto a um pente, para formar cavidades onde sero colocadas as amostras.

Figura 2 Montagem dos gis de poliacrilamidaFonte: http://e-escola.tecnico.ulisboa.pt/topico.asp?id=246&ordem=2

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) o mtodo mais utilizado para anlises qualitativas de protenas. Sendo um mtodo em que protenas so separadas segundo o tamanho, a anlise de protenas por SDS-PAGE tambm til para a determinao da massa molecular relativa da protena (WILSON; WALKER, 2005). O SDS um detergente aninico forte, que se liga aos resduos positivamente carregados das protenas, conferindo s mesmas uma carga final negativa e ocasionando a desnaturao. Desta forma, todas as protenas da amostra possuiro carga negativa, estaro linearizadas, e migraro em direo ao eletrodo positivamente carregado. A velocidade de migrao depender somente da massa molecular, sendo que protenas com menor tamanho passaro mais facilmente atravs da malha do gel e, portanto, migraro a uma distncia maior, molculas muito maiores que os poros so quase imveis e molculas de tamanho intermedirio movem-se atravs do gel com graus variveis de facilidade (BERG; TYMOCZO; STRYER, 2008). A ao do SDS pode ser vista na Figura 3 e uma amostra de como ocorre a eletroforese pode ser visualizada na Figura 4.

Figura 3 Ao do detergente aninico SDSFonte: http://biologia.ifsc.usp.br/biomolcel1/roteiros/roteiro08.pdf

Figura 4 (A) Aparelho de eletroforese em gel; (B) A ao de peneiramento de um gel poroso de poliacrilamida separa protenas de acordo com o tamanho.Fonte: http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp?id=810

Sendo assim, para realizar uma corrida eletrofortica as placas contendo os gis so colocadas no aparelho eletrofortico, as amostras so pipetadas, com uma pipeta de vidro, nas cavidades, o aparelho tampado e ligado. Aps a corrida, os gis so retirados da placa e transferidos para um corante (Coomassie Blue) que se liga s protenas mas no ao gel.Junto com as amostras colocadas no gel, colocada uma amostra padro onde so conhecidas as protenas contidas e seus respectivos pesos moleculares, para que, aps a corrida eletrofortica seja possvel comparar as protenas das amostras com o padro e saber, aproximadamente, seu peso molecular, medido em kiloDalton (kD).

A figura abaixo mostra um gel aps a colorao:

Figura 5 Gel aps ser tratado com coranteFonte: http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp?id=810

2. OBJETIVOEsse experimento teve como objetivo identificar os pesos moleculares das protenas presentes nos pescados Sardinha e Aruan.

3. MTODOPrimeiramente, adicionou-se 250 L de tampo de amostra Laemmli para um microtubo sem rosca rotulado com o nome do pescado (sardinha). Um pedao de cerca de 0,25 x 0,25 x 0,25 cm3 do msculo do pescado foi cortado com uma tesoura e colocado junto ao tampo no micro tubo. Agitou-se o microtubo intensamente por mais ou menos 15 vezes e aps, ele foi incubado por 5 minutos a temperatura ambiente.Feito isso, apenas o tampo homogeneizado do msculo foi transferido para outro microtubo com tampa e rotulado, ento o microtubo foi incubado durante 5 minutos a 95C.A seguir, utilizando luvas, foi preparado o gel de separao (2 mini gis) 0,375M Tris, pH 8,8 de acordo com as medidas (receita) indicadas na tabela a seguir:12%*

gua deionizada3,35 mL

1,5M Tris-HCl, pH 8,82,5 mL

SDS 10% - estoque100 L

Acrilamida/Bis (estoque 30%)4,0 mL

Persulfato de amnio 10%50 L

TEMED5 L

* Para protenas tratadas com SDS de peso molecular de aproximadamente 10-100KdAps preparar o gel, ele foi transferido rapidamente para a placa de corrida com o auxlio de uma pipeta, aguardou-se alguns instantes e vedou-o com lcool Butanol 80%, aguardou-se a solidificao e retirou-se a gua com papel filtro.

Enquanto o gel de separao era solidificado, foi tambm preparado o gel de empilhamento (2 mini gis) 0,125M Tris, pH 6,8 de acordo com as medidas indicadas na tabela abaixo:4%

gua deionizada3,04 mL

0,5M Tris-HCl, pH 6,81,25 mL

SDS 10% - estoque50 L

Acrilamida/Bis (estoque 30%)664 L

Persulfato de amnio 10%25 L

TEMED5 L

Aps a solidificao do gel de separao, adicionou-se, com uma pipeta, o gel de empilhamento at o final da placa e introduziu-se o pente, aguardou-se 45 minutos at sua solidificao e retirou-se o pente para aplicar as amostras.Em cada cavidade formada pelo pente no gel foram aplicada as amostras de protenas musculares dos pescados, reservando duas cavidades para os padres de peso molecular: 5 L Padro de Peso Molecular Kaleidoscope 250 KD a 10 KD 10 L Amostra muscular de peixe Aruan 10 L Amostra muscular de peixe Sardinha 10 L Tampo padro de Actina e MiosinaImediatamente aps a adio das amostras realizada a corrida no aparelho eletrofortico com a voltagem constante (200 V) por 45 minutos temperatura ambiente. Em seguida, transferiu-se o gel para 25 mL do corante Coomassie Blue por 15 minutos, aps a colorao descartou-se o corante e colocou-se o gel em tampo descorante por mais 30 minutos.

4. RESULTADOS E DISCUSSORealizada a eletroforese, foi obtido o gel da Figura 6, na quarta coluna est o padro que foi adicionado, nas outras cavidades esto amostras dos pescados Aruan e Sardinha intercalados, comeando (esquerda) por Aruan.

Figura 6 Gel aps a corrida eletrofortica

Ao analisar a coluna do padro, que contm pesos moleculares conhecidos, foi medida a distncia do topo at a protena, verificando a mobilidade da protena, esse valores esto mostrados na tabela 1.

Tabela 1 Mobilidade e peso molecular das protenas na amostra padroMobilidade (mm)Peso Molecular (KD)

6250

10160

15100

1875

2750

3537

4125

4720

5215

Sabendo que a mobilidade proporcional ao log do peso molecular, foi construdo um grfico padro, que se encontra anexado ao final do relatrio. Para determinar o peso molecular das protenas dos pescados foi medida a sua mobilidade e, a partir do grfico padro, encontrou-se o peso molecular. As tabelas 2 e 3 mostram esses dados, alguns pesos no puderam ser medidos pois a escala do grfico no permitia.

Tabela 2 Mobilidade e peso molecular das protenas do pescado SardinhaMobilidade (mm)Peso Molecular (KD)

9-

12-

1875

1970

2164

2358

2750

3142

3339

3438

3635

3928,5

4125

4521

4819

5016,5

54-

Tabela 3 Mobilidade e peso molecular das protenas do pescado AruanMobilidade (mm)Peso Molecular (KD)

5-

7-

11-

14-

1875

2164

2358

2553

3044

3241

3342

3635

3732

3831,5

4918

5215

Pode-se identificar nos pescados miosina de cadeia leve (21kD, 19kD e 16kD) e actina (42kD).

5. CONCLUSOPode-se concluir que a eletroforese um mtodo bastante eficiente de separao proteica, conseguindo identificar protenas que se diferenciam por apenas 1kD.As protenas miosina e actina puderam ser identificadas em ambos pescados, apesar de eles possurem constituies proteicas diferentes.

6. BIBLIOGRAFIA

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2008). Bioqumica (6 ed.). Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.(2014). ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA SDS (SDS-PAGE). Universidade de So Paulo, Instituto de Fsica de So Carlos, So Carlos.Lehninger, D., & Cox, M. (2006). Princpios de Bioqumica (4 ed.). So Paulo: Sarvier.Wilson, K., & Walker, J. (2010). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology (7 ed.). New York: Cambridge University Press.

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