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Eliciadores de fitoalexinas de paredes celulares de Alibertia myrcifolia eRudgeajasminoides (Rubiaceae) obtidos por autoclavagem

Eldemar de Souza Xavier', Claudia Alves da Silva I, Fabio Moraes' e Marcia Regina Braga 1,2

Recebido: 23.06.2003: aceito: 10.02.2004

ABSTRACT - (Phytoalexin elicitors from cell walls ofAlibertia myrcifolia and Rudgea jasminoides (Rubiaceae) obtainedby autoclaving). Phytoalexin elicitors were obtained from leaf cell walls of Alibertia myrcifolia and Rudgeajasminoides,two tropical Rubiaceae species with different behavior toward phytoalexin production, by autoclaving. Fragments active onsoybean cotyledons were found in both species, indicating that their presence in cell walls is not related to the plantcapacity of synthesizing these defensive compounds. Anion exchange chromatography revealed distinct profile of the twospecies, the eliciting activity being much higher in R. jasminoides. Hydrolysis with endopolygalacturonase resulted inreduction of less than 30% in the eliciting activity for both species. These results suggest that pectin fragments previouslydescribed as the main eliciting molecules in other plant species, contributed as a small part of the total activity detected inthese two Rubiaceae. Neutral fragments seem to be responsible for most of the eliciting activity detected in the extracts,although the role and the mechanism of their production during induction of plant defensive responses in vivo remainunknown.Key words: elicitor, phytoalexin, carbohydrates, oligosaccharins

RESUMO - (Eliciadores de fitoalexinas de paredes celulares de Alibertia myrcifolia e Rudgea jasminoides (Rubiaceae)obtidos por autoclavagem). Eliciadores da sfntese de fitoalexinas foram obtidos a partir de autoclavagem das paredescelulares de folhas de Alibertia myrcifolia e Rudgeajasminoides, duas rubiaceas nativas tropicais que diferem quanta acapacidade de produzir substancias de defesa (fitoalexinas). Carboidratos que possuem atividade indutora de fitoalexinasem soja foram encontrados nos autoclavados das paredes celulares de ambas as especies, indicando que a presenc;:a dosmesmos nao esta relacionada acapacidade da planta em responder ou nao com a produc;:ao de fitoalexinas. 0 fracionamentodos autoclavados em coluna de troca ionica revelou a existencia de perfis distintos para as duas especies, sendo a atividadeeliciadora bastante superior em R. jasminoides, especie que responde com a produc;:ao de fitoalexinas quando inoculadacom fungos. A hidr61ise com endopoligalacturonase resultou em perda de menos do que 30% da atividade eliciadora paraambas as especies. Esses dados sugerem que fragmentos de pectina da parede celular, descritos como os principaiseliciadores derivados de plantas, contribuem apenas em parte para a atividade indutora observada nos autoclavados dasduas especies estudadas e que fragmentos neutros derivados da parede celular podem exercer essa atividade, embora osmecanismos relativos a sua liberac;:ao e papel durante a induc;:ao de respostas de defesa in vivo ainda sejam desconhecidos.Palavras-chave: eliciador, fitoalexinas, carboidratos, oligossacarinas

Introdu~ao

Muitas especies vegetais respondem it invasaomicrobiana atraves da sintese localizada de substanciasde defesa, denominadas fitoalexinas. Essassubstancias, ausentes nos tecidos da planta sadia,passam a ser sintetizadas e acumuladas junto ao sitiode infecc;:ao apos 0 contato com microorganismos ouprodutos deles derivados, conhecidos como eliciadores(Smith 1996, Harborne 1999).

Estudos realizados com 0 objetivo de identificare caracterizar moleculas indutoras de fitoalexinaslevaram it descoberta que paredes celulares das

proprias plantas tambem possuelll eliciadores em suaestrutura (Hargreaves & Bailey 1978, Hahn ef al.

1981). Esses eliciadores, derivados de polissacarideospecticos da parede celular, sao formados por 12 oumais residuos de acido galacturonico unidos pOI'ligac;:6es a-l,4 (oligogalacturonideos) (Nothnagel ef af.1983, Cote & Hahn 1994). A liberac;:ao deoligogalacturonideos telll sido relacionada it atividadede hidrolases Illicrobianas vegetais, especialmentepectinases (endopoligalacturonases e pectina- epectato-liases), secretadas ou liberadas durante ainterac;:ao entre a planta e 0 patogeno (Davis ef al.

1984, Cervone ef al. 1987, 1989, Hahn ef al. 1989,

I. Sec,:ao de Fisiologia e Bioquillliea de Plantas. Instituto de Botiiniea. Caixa Postal 4005. 0 I061-970 Sao Paulo. SP. Brasil.2. Autor para eorrespondeneia: bragalllr@eanalvip.eolll.br

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Alghisi & Favaron, 1995).

Braga el al. (1998), estudando as paredescelulares de duas rubiaceas nativas tropicais quediferem quanta acapacidade de produzir fitoalexinas,observaram diferenryas nos teo res e composiryao daspectinas entre as duas especies. Diferenryas tambemforam encontradas na atividade e estabilidade doseliciadores liberados pOl' autoclavagem e pOl' hidr61iseenzimatica das paredes celulares de folhas dessasrubiaceas (Braga & Dietrich 1998). A analise desseseliciadores, atraves de cromatografia Iiquida de altaeficiencia, revelou a presenrya de oligogalacturonideosapenas em autoclavados obtidos de Rudgeajasminoides, e pecie que produz fitoalexinas (Braga& Dietrich 1998). lsso levou a sugestao de queeliciadores liberados a partir de paredes celulares deAliberlia myrcifolia (especie que nao produzfitoalexinas quando inoculada com fungos) pudessemtel' composiryao distinta daqueles derivados deR. jasminoides, 0 que poderia refletir 0 compor­tamento diferencial observado com relaryao aproduryaode fitoalexinas para essas duas especies.

Moleculas eliciadoras obtidas de plantas exibematividade indutora em concentraryoes extremamentebaixas, 0 que dificulta seu isolamento e consequen­temente sua caracterizaryao estrutural. Neste trabalho,eliciadores obtidos pOl' autoclavagem das paredescelulares da duas especies de Rubiaceae queapresentam resposta fitoalexinica distinta foramcomparados atraves da analise de algumas de suaspropriedades quimicas.

Material e metodos

Material vegetal- folhasjovens e sem lesoes visiveisde Alibertia myrcifolia (Spruce ex Schum.) Schum.(SP28307) e de Rudgeajasminoides (Cham.) Mull.Arg. (SP 161348) foram coletadas na mata daReserva Biol6gica do Parque Estadual das Fontes doIpiranga, Instituto de Botanica de Sao Paulo.Cotiledones de soja (Glycine max L. Merr. IAC-8)foram obtido a partir de plantulas crescidas pOl' oitodias em casa de vegetaryao, sob fotoperiodo de 14horas.

Extraryao do eliciador de paredes celulares de folhas­paredes celulares foram extraidas a partir de folhasfrescas conti nne descrito pOl' Braga et al. (1998).Cerca de 0,5 g das paredes celulares foram suspensasem 50 ml de agua destilada e submetidas aautoclavagem a 121 DC, 1,5 atm, pOl' 50 minutos. 0

residuo insoilivel foi removido atraves de filtraryao empapel de fibra de vidro (GF/A Whatman) e os filtradosarmazenados a -20 DC, ate serem analisados quantaao conteudo de aryucares totais, acidos ur6nicos eensaiados quanta a sua atividade indutora defitoalexinas em cotiledones de soja.

Cromatografia de troca i6nica - aliquotas dosautoclavados de paredes celulares foram reduzidas a1/10 do seu volume inicial pOl' liofilizaryao e aplicadasem coluna de QAE-Sephadex (1,3 x 22,0 cm),equilibrada com tampao imidazol 125 mM, pH 7,0. Aeluiryao foi efetuada em gradiente, utilizando tampaoimidazol 125, 550, 750 mM elM (Nothnagel el al.1983), sendo coletadas fraryoes de 2 ml. Essas fraryoesforam reunidas de acordo com 0 seu conteudo dearyucares neutros e de acidos ur6nicos e 0 sal eliminadoatraves de dialise (limite de exclusao 1 kDa) em aguadeionizada. As fraryoes reunidas foram ensaiadas emcotil6dones de soja para avaliaryao da atividadeindutora de fitoalexinas. Em uma segunda analise,aliquotas dos autoclavados foram submetidas acromatografia de troca i6nica nas mesmas condiryoesacima, porem, utilizando-se a eluiryao apenas comtampao imidazol125 mM elM.

Bioensaio em cotiledones de soja - a atividade indutorade fitoalexinas foi avaliada em cotiledones de soja, deacordo com procedimento descrito pOI' Ayers el ar(1976), uma vez que as rubiaceas nativas apresentamresposta fitoalexinica sazonal (Braga el ar 1991), 0

que dificulta seu uso em bioensaios. Desse modo,grupos de cinco cotiledones de soja, em triplicatas,foram utilizados para cada determinaryao. 0 eliciadorde esporos do fungo Mucor ramosissimus, extraidoconforme descrito pOI' Cordeiro Neto & Dietrich(1992), foi utilizado como controle positivo de induryao.A presenrya de gliceolina, fitoalexina produzida pOI'cotiledones de soja, foi avaliada atraves de medida daabsorbancia a 286 nm dos exsudados de cotiledonesincubados pOl' 20 horas, no escuro (Ayers et al. 1976).A quanti dade de gliceolina foi calculada com base emcurva padrao com gliceolina purificada. Como aintensidade da resposta dos cotiledones varia entrediferentes ensaios adotou-se, para fins de compararyao,a atividade dos difusatos de M ramosissimus comomaxima (Amax.) e os resultados, em alguns casos,foram tambem expressos dividindo-se a atividade dasamostras (A) pOl' Amax.

Determinaryoes quantitativas de aryucares - 0 conteudode aryllcares neutros nos autoclavados e nas fraryoes

E.S. Xavier, CA. Silva, F. Moraes & M.R. Braga: Elieiadores de fitoalexinas elll Rubiaceae 25

provenientes da coluna de troca ionica foi determinadopelo metodo do fenol-sulfllrico (Dubois et al. 1956) eo de acidos uronicos utilizando-se m-hidroxibifenil(Filizetti-Cozzi & Carpita 1991). Glucose e acidogalacturonico (100 f..lg/ml) foram utilizados comopadroes. 0 conteudo de carboidrato total foi estimadosomando-se as quantidades obtidas dos ensaios deaVllcares neutros e acidos uronicos. Embora seja umpouco superestimada, a quantificavao de carboidratototal por essa soma pode ser utilizada, uma vez queno ensaio colorimetrico utilizado para medir avucaresneutros, os acidos uronicos presentes na amostracontribuem com apenas 8% da cor resultante(Nothnagel et al. 1983).

Hidr61ises acida e enzimatica - aliquotas das fravoesreunidas a partir da col una de QAE-Sephadex foramhidrolisadas com I ml de acido trifluoroacetico(TFA) 2 M em ampolas seladas, a 120°C, por I hora(Fry 1988). Os hidrolisados foram centrifugados a2000 g por 15 minutos e 0 acido presente nossobrenadantes eliminado por evaporavao sob vacuo elavagens sucessivas com metano!' Os sobrenadantessecos foram dissolvidos em I ml de agua deionizadae mantidos a -20°C ate serem analisados quanta asua composivao em monossacarfdeos neutros porcromatografia Iiquida de alta eficiencia.

Aliquotas das fravoes provenientes da segundaanalise por coIuna de troca ionica e eluivao com125 mM elM de imidazol foram incubadas comendopoligalacturonase (Endo-PG) Megazyme poroito horas, a 30 DC, em tampao acetato de s6dio50 mM, pH 5,0. Como controles foram utilizadasincubavoes das fravoes sem a presenva da enzima ede 20 mg de paredes celulares de R. jasminoidescom Endo-PG, sob as mesmas condivoes descritasacima. As reavoes foram interrompidas por fervuraa 100 DC, por 5 minutos. Os hidrolisados foramcentrifugados a 1.000 g durante 10 minutos e ossobrenadantes submetidos a filtravao em papelWhatman GF/A. Os filtrados resultantes foramsubmetidos aquantificavao de acidos uronicos e aobioensaio em cotiledones de soja para avaliavao daatividade indutora de fitoalexinas.

Cromatografia liquida de alta eficiencia - osmonossacarideos neutros obtidos por hidr61ise acidadas fravoes da primeira col una de troca i6nica foramanalisados por cromatografia de troca ani6nica de altaeficiencia com detector de pulso amperometrico(HPAEC/PAO) em sistema Oionex OX-500. A

analise foi efetuada em coluna CarboPac PA-1 0 tendoNaOH 20 mM isocratico como eluente e os avucaresidentificados por comparavao com os tempos deeluivao de padroes puros de monossacarideos,analisados nas mesmas condivoes.

Fragmentos de pectina (oligogalacturonideos)presentes nas fravoes da coluna enos hidrolisadosenzimaticos obtidos por incubavao com Endo-PGforam tambem analisados por HPAEC/PAD, emcoluna Carbo-Pac PA-I, utilizando urn gradiente linearde 400 a 900 mM de acetato de s6dio em 100 mM deNaOH, de 2 a 50 minutos (Spiro et af. 1993). Foiutilizada p6s-coluna contendo 500 mM de NaOH eotempo de retenvao dos oligogalacturonfdeos foicomparado com aqueles obtidos para 0lig6merospadrao com grau de polimerizavao de 5 a 22, obtidosa partir de pectina de Citrus, gentilmente cedidos peloDr. Stephan Ebehard (University of Georgia - EUA).

Resultados e Discussao

Atraves da tabela 1, pode-se observar que asquantidades de carboidratos diferem nos autoclavadosde paredes celulares de folhas nas duas rubiaceasanalisadas. 0 autoclavado de A. myrcifolia apresentamaior quantidade de avucares neutros, porem menorteor de acidos uronicos quando comparado aR. jasminoides. Braga et af. (1998) relataram maiorconteudo de pectinas em paredes celulares deR.jasminoides, 0 que explica a maior liberavao deacidos uronicos nos autoclavados dessa especie. Emrelavao aatividade eliciadora da sfntese de fitoalexinasem soja, quando os resultados foram expressos emtermos de quantidade de avucares neutros aplicadospor cotiledone, tambem foram observadas diferenvasentre as especies, sendo a mesma maior paraR. jasminoides, conforme anteriormente relatado porBraga & Dietrich (1998). Quando 0 calculo foi feitopela soma dos valores de avucares neutros + acidosur6nicos, a atividade indutora foi um pouco superiorpara A. myrcifolia, como resultado das diferenvasentre as proporvoes de avucares neutros e acidosur6nicos nos autoclavados das paredes celulares dasespecies em questao.

Apesar dessas diferenvas, os resultadosdemonstram que nos extratos brutos obtidos dasparedes celulares de ambas as especies existemcarboidratos que possuem atividade indutora defitoalexinas em soja, e que, a presenva dos mesmosnao esta relacionada a capacidade da planta em

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Tabela I. Conteudo de ac;:ucares nelltros, acidos lIronicos c atividade indutora de fitoalexinas cm cotiledones de soja dos autoclavados deparedes celulares de Aliber/ia l11yrcifolia c Rudgeajasl11inoides.

Espccie/Amostra Atividade indutora de fitoalexinas

Ac;:ucarcs neutros Acidos uronicos UlIlloles gliceolina/ cotiledone) A/Alllax.(mg/g de parede autoclavada) (Illg/g de parede autoclavada)

Aliber/ia myrcifoha 141.5Rudgeajasl11inoides 105.0Alucor ramosissil11us (eliciador)Controle (agua)

14.3 74,1* 43.7** 0.5425.2 82.1 * 40.0** 0.50

80,6 1.0015,0 0.19

* valores expressos em 50,0 Ilg equivalentes em aC;:llcares neutros ou ** de carboidrato total (ac;ucarcs neutros + aeidos ur6nieos) aplieados porcotilcdone, - nao quantifieado.

___~~:_~~ Y- :?-~_~~ .'{ ?:_~~~ __T ~~ _

150

150

IV V VI VII

" " " ,-----,

III IVr----l r----l

100

100

Frac;:ao

IIIr----l

IIr----l

50

50

I II

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o_.~Jc,.4~~~~~£j>tU~o

Figura I. Perfil de eluic;:ao de alltoclavados dc paredes cclulares defolhas dc Aliber/ia l11yrcifolia (A) e Rudgeajasl11inoides (B) aposcromatografia cm coluna de troca ionica QAE-Sephadcx em gra­diente nao lincar dc tampao imidazol (125 mM a 1M). Aliqllotasdc cada frac;:ao foram cnsaiadas para aC;:llcares ncutros (e) e paraacidos uronicos (0) c as Illeslllas reunidas con forme indicadopelos aigarislllos rOlllanos.

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a matriz do gel (125 mM) e aquelas liberadas pelo usode I M de imidazol. Resultados simi lares foramencontrados em hidrolisados de paredes celulares desoja, onde tambem foi detectada atividade eliciadorada sintese de fitoalexinas nas frac;6es eluidasjuntamente com aC;llcares neutros com 125 mM deimidazol (Nothnagel et al. 1983). Para as duas

responder ou nao com a produc;ao de fitoalexinas, umavez que varios trabalhos mencionam a incapacidadede A. myrcifolia produzir esses metabolitos de defesaquando suas folhas sao inoculadas com fungos (Bragaet al. 1986, 1991, Cordeiro Neto & Dietrich 1992).

o fracionamento dos autoclavados das paredescelulares pOI' cromatografia de troca ionica em col unaQAE-Sephadex, que retem moleculas com cargasnegativas, revelou perfis distintos para as duas especies(figura 1). Para A. myrcifolia (figura IA), a maiorquantidade de carboidratos foi eluida comconcentrac;6es de 125 e 550 mM de imidazol e deacidos uronicos tambem em 550 mM. Para 0

autoclavado de R. jasminoides, pequena quantidadede ac;ucares nao foi retida pela matriz do gel ou foieluida com tampao de baixa forc;a ionica (imidazol125 mM) (figura IB). Os acidos uronicos forameluidos principalmente nas concentrac;6es de 750 mMelM de imidazol. Considerando-se as quantidadesde carboidratos recuperadas apos aplicac;ao na colunade troca ionica, os resultados obtidos sugerem que aeluic;ao com imidazol I M foi suficiente para a retiradadas moleculas presas mais fortemente amatriz do gel,nao sendo necessaria a uti Iizac;ao de maior forc;a ionica.

As frac;6es da col una de troca ionica quecontinham maiores teores de carboidratos e acidosuronicos foram reunidas conforme indicado na figura I,dialisadas para a eliminac;ao do sal e ensaiadas emcotiledones de soja para avaliac;ao da ativid.adeindutora de fitoalexinas (tabela 2). Para A. myrcifolia,a atividade indutora foi estatisticamente diferente docontrole apenas nas frac;6es III e IV eluidas com750 mM elM de imidazol, respectivamente. ParaR. jasminoides, a atividade indutora de fitoalexinasficou distribuida entre as frac;6es eluidas da coluna,sendo as mais ativas aquelas com fraca interac;ao com

E.S. Xavier, c.A. Silva, F. Moraes & M.R. Braga: Eliciadores de fitoalexillas em Rubiaeeae 27

Tabela 2, Atividade indutora de fitoalexinas em soja dosautoclavados de paredes celularcs de Alibertia lIIyrcifolia eRudgeajasl1Iinoides, ap6s fracionamento em col una de trocaianica.

* foram aplieados 25 ~g ern equivalentes em carboidrato (ayuearesneutros + aeidos ur6nieos) pOI' cotilcdolle; ** medias de 3 deter­millayoes e *** = atividade dividida pelo valor do eliciador deM. ramosissil1llls, con forme descrito em Material e metodos. Letrasiguais nilo difcrem significativamenle a Tukey J%.

especies de Rubiaceae aqui estudadas, maior atividadeindutora foi detectada no material fortemente retidopelo gel (fra<;oes IV e VII, para A, myrcifolia eR. jasminoides, respectivamente), constituidopossivelmente por 01 igogalacturonideos resultantes dahidr61ise de homogalacturonanos, polissacarideosconstituintes da fra<;ao pectica da parede celulaLEntretanto, essa atividade foi maior nas fra<;oes deR. jasminoides, rubiacea que responde com aprodu<;ao de fitoalexinas quando inoculada por fungos,quando comparada a A, myrcifolia, especie na qualeste tipo de res posta de defesa nao e observado(Braga et ar 1991, Cordeiro Neto & Dietrich 1992),

E importante ressaltar que na tabela 2 0 valormostrado para a fra<;ao VII de R. jasminoidesrepresenta a atividade calculada caso 25 !lg emequivalentes de a<;ucares neutros + acidos uronicostivessem sido aplicados em cada cotiledone, Essafra<;ao possuia quantidade muito menor decarboidratos e esse calculo nonnalizado foi feito parapossibilitar a compara<;ao de atividade eliciadora entreas diferentes fra<;oes, A atividade biol6gica obedecea Uma curva dose-resposta, que varia em funyao dolog da concentra<;ao do eliciador e que apresenta

Atividade indutora de fitoalexinas

(llmoles gliceolina AIArmix, ***Icotiledone) **

satura<;ao, Assim 0 valor em questao e potencial, poisa aplica<;ao de 25 ~Lg da fra<;ao VII de R, jasminoidescertamente nao levaria it produ<;ao de 1A57, 7 ~Lmoles

de gliceolina, considerando-se 0 limiar de satura<;aodo ensaio,

Nothnagel et ar (1983) demonstraram quehidrolisados de paredes celulares de hastes de soja(Glycine max L MerL) ou de pectina de Citruscontinham oligogalacturonideos que eram facilmenteisolados por coluna de troca ionica em gel de QAE­Sephadex. A elui<;ao com tampao de alta for<;a ionica(750 mM) resultou na libera<;ao de oligogalacturonideosde grau de polimeriza<;ao (GP) 212, Einteressantenotar que pelo perfil cromatografico apresentado nafigura J B, as fra<;oes que foram reunidas no pica I deR, jasminoides parecem nao possuir acidos uronicosou conte-los em quantidades nao detectadas pelometodo colorimetrico utilizado, Entretanto, este picoapresentou a segunda maior atividade indutora defitoalexinas, sugerindo que outras moleculas alem dosoligogalacturonideos podem exibir essa atividade.Alguns trabalhos registram que polimeroshemicelul6sicos da parede celular, que contemarabinose e/ou xilose, podem originar fragmentosindutores de respostas de defesa em plantas de arroz,milho e tomate (Bucheli et a/, 1990, Aldington & Fry1992).

Para A, myrcifolia, a maior atividade indutorade fitoalexinas foi detectada nas fra<;oes queapresentaram maior propor<;ao de acidos uronicos(tabela 3), Para R, jasminoides, esse fato nao foiobservado, uma vez que as fra<;oes mais ativas I, II eVII foram aquelas que apresentaram ausencia oubaixo conteudo de acidos uronicos, respectivamente.

A analise da composi<;ao das fra<;oes emmonossacarideos neutros por HPAEC/PAD naorevelou padrao que pudesse ser associado it atividadeindutora detectada (tabela 3). Para A. myrcifolia,arabinose foi 0 a<;ucar predominante nas fra<;oesativas, indicando hidr61ise da fra<;ao pectica da paredecelular pelo processo de autoclavagem. ParaR. jasminoides, a fra<;ao I eluida com 125 mM deimidazol mostrou alta propor<;ao de arabinose egalactose, denotando a quebra preferencial depolissacarideos pecticos neutros do tipo arabino­galactanos, A fra<;ao VII eluida com alta for<;a ionicarevelou a presen<;a de alta propor<;ao de glucose, xilosee galactose, sugerindo predominio de componentes depolissacarideos hemicelul6sicos. Braga & Dietrich(1998), ap6s fracionamento dos autoclavados em

1,000,26

OA50,350,610.82

4,783,450,840,530,770,77

12,07

54.2 ± 17,4 BC42.6 ± 4.0 BC73.5 ± 5,2 CD99,0 ± 15,9 ADE

120,8 ± 12,7 A31,8 ± 3,2 B

576,3 ± 63.9 F417,0± 112,8F101.7 ± 23,5 AD64,4 ± 11,8 BC93,1 ± 10,2 ADE93,0 ± 0,7 ADE

1,457.7 ± 264,3 G

Amostras

Eliciador de AI. ralllosissil1lUSControle (agua destilada)A. lIIyrcifolia*

Frac;;ao I (125 mM)Frac;;ao II (550 mM)Frac;;ao III (750 mM)Frac;;aoIV(1 M)

R.jaslllinoides*Frac;;ao I (125 mM)Frac;;ao II (125 mM)Frac;;ao III (550 mM)Frac;;ao IV (750 mM)Frac;;ao V (750 mM)Frac;;ao VI (I M)Frac;;ao VII (I M)

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Figura 2. Perfil de eluiyao de oligogalacturonideos por HPAEC/PAD de padrao de oligomeros com grau de polimerizayao 7 a 22(A), das frayoes III (B) e IV (C) de A/ibertia lIIyrcifo/ia e dasfrayoes I (D), III (E) e VII (F) de Rudgeajasminoides reunidas deacordo com perfilmostrado em coluna de QAE-Sephadex (figuraI). Os nllllleros mostrados sobre alguns picos nos eromatogramasinc\icam 0 grau de polimerizayao dos oligogalacturonic\eos. Osperfis das frayoes I e II c\e A. lIIyrclfolia foram simi lares aquelesmostrac\os em C e B, respectivamente; para R. jasminoides asfrayoes IV e V foram similares ao perfilmostrado em E e as II e VIao perfil de F, motivo pelos quais esses perfis nao sao mostrac\osna figura.

foi possivel correlacionar a presenya de oligogalactu­ronideos com a atividade indutora de fitoalexinasobservada nos cotiledones de soja. Isso sugere que ouoligogalacturonideos ativos estao presentes emquantidades pequenas nessas frayoes, abaixo do limitede detecyao do metodo cromatografico utilizado, ouque fragmentos diferentes sao responsaveis pelaatividade indutora de fitoalexinas observada.Recentemente, foi demonstrado que oligogalactu­ronideos de pequeno grau de polimerizayao inibemrespostas de resistencia a pat6genos em plantas detrigo (Moerschbacher et at. 1999) e que essesoligameros parecem suprimir a atividade indutora dasintese de fitoalexinas em cotiledones de soja promo­vida por oligalacturonideos com GP> I2 (dados naopubl icados). Isso poderia explicar 0 fato de se detectara presenya de oligogalacturonideos nas frayoes II deA. myrcifolia e IV e V de R. jasminoides da colunade QAE-Sephadex, mas a atividade indutora dasmesmas estar ausente ou nao ser tao pronunciada.

Com 0 objetivo de verificar se a atividade indutorade fitoalexinas estaria relacionada it presenya deoligogalacturonideos, os autoclavados foramnovamente aplicados it coluna de troca ianica, sendoa eluiyao do material da coluna feita apenas com

502550°Tempo de elui~ao (min)

25

._~-.l...JLJ\GIIJP,1 7-22 A l -~

~~~~

o

J

tr = trac;os; - = nao detectado

colunas de peneira molecular Sephadex G-25 e G-I 00,encontraram arabinose e glucose como monossaca­rideos predominantes nas frayoes com alta atividadeeliciadora, embora glucose tenha sido observada emproporyao relativa muito maior em R. jasminoides, 0

que esta de acordo com os resultados aqui mostradospara a frayao VII dessa especie (tabela 3). Embora aautoclavagem promova principalmente a solubilizayaode polissacarideos pecticos (Fry 1988), a presenya degrande quantidade de glucose nas frayoes indica quefragmentos de polissacarideos de outros dominios daparede celular tambem foram liberados por esseprocedimento.

A presenya de oligogalacturonideos nas frayoesreunidas da coluna de QAE-Sephadex (figura 1) foianalisada atraves de cromatografia Iiquida de altaeficiencia (figura 2). Para A. myrcifolia, 01 igogalactu­ronideos foram encontrados nas frayoes 1\ e 111, masnao na IV que apresentou maior atividade indutora dasintese de fitoalexinas (tabela 2). Para R. jasminoides,esses oligameros foram detectados nas frayoes 111 eIV e em menor quanti dade na frayao V, naocoincidindo com maior atividade indutora observada(frayoes I eVil), porem correspondendo a algumasdas frayoes com altos teores de acidos uranicosquantificados nos ensaios colorimetricos. Assim, nao

R.jasminoides

Frayao 1(125mM) 33,0 35,0 14,2 17,7Frayao II (125 mM) 21,6 25,5 32,5 8,6 11,6Frayao III (550 mM) 45,9 7,5 16,8 15,6 5,3 8,9Frayao IV (750 mM) 39,2 22,6 26,2 6,8 5,2Frayao V (750 mM )61,2 13,0 8,8 12,9 13,9Frayao VI (I M) 52,8 0,3 3,7 6,3 29,7 7,2Frayao VII (I M) 21,9 8,6 13,7 35,8 19,9

Especie/frayao % molar

Ac. Ram Ara Gal Glc XiI/Manuronicos

A. myrcifo/ia

Frac;:ao I (125 mM) 15,8 tr 34,2 17,6 17,3 14,9Frayao II (550 mM) 38,4 2,3 19,2 11,4 4,0 24,7Frayao III (750 mM) 58,3 2,9 13,2 10,2 7,4 8,0Frayao IV (I M) 51,7 1,6 13,6 8,6 12,6 11,7

Tabela 3. Proporyao de monossacarideos neutros obtida porHPAEC/PAD e de acidos uronicos nos picos das frayoes obtidasde autoclavados de paredes celulares de folhas de A/ibertiamyrcifo/ia e Rudgeajasminoides ap6s fracionamento em colunade troca ionica em gel de QAE-Sephadex. Ram = ramnose; Ara =

arabinose; Gal = galactose; Glc = glucose e Xii/Man = xilose/manose.

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Tabela 4. Atividade indutora de Iitoalexinas em cotiledones desoja de autoclavados de paredes celulares de Alibertia myrcifolia

e Rudgea jaslllinoides em fra,,5es da coluna de troca i6nica eluidasem gradiente nao linear de imidazol 125 mM elM antes (bruto)e ap6s tratamento com endopoligalacturonase (Endo-PG)Megazyme por oito horas.

* Foram aplicados ccrca dc 50 ~lg cm cquivalcntcs Clll carboidratos(avllcares neutros + acidos ur6nicos) por cotilcdone.**A1Amax = Atividade dividida pelo valor obtido com a elieiavaode autoclavados de Mucor ralllosissilllllS. *** Paredc celular deR. jaslllilloides utilizada como controle da hidr6lise. Valores entreparenteses representalll % de reduyao da atividade ap6s 0

tralalllento COIll Endo-PG. - nao avaliaclo.

Eliciador deM. rall10sissilllUS 119,0 1,00Controle (tampao) 51,4 0,43A. lIIyrcifolia*

Fra"ao 125mM 112,5 90,0 0,94 0,76(20%)

Fra"ao 1M 50,1 48,2 0,42 0.40(4%)

R.jasll1inoides*

Fra"ao 125mM 184,4 127,2 1.55 1,07(31%)

Fra"ao 1M 135,8 97,6 1.14 0,82(28%)

Paredc celular *** 51,3 89,6 0,43 0,75

essa ausencia de hidr61ise em A. myrcifolia ao altograu de metilesterificayao de sua pectina, 0 que impedea ayao da Endo-PG, conforme ja reportado pOI' outrosautores para outras especies vegetais (Sakai et al.1993, Willats el al. 200 I). Assim, a presenya defragmentos de pectina metilesterificados poderiaexplicar a pequena reduvao na atividade indutoraobservadas para A. l11yrcifolia na frayao J M(tabela 4) ap6s 0 tratamento com Endo-PG.

Para R. jasl11inoides, 0 tratamento da fravao125 mM em Endo-PG revelou a existencia de cercade 34% de acidos uronicos na mesma, os quais naotinham sido quantificados anteriormente pelo ensaiocolorimetrico utilizado, possivelmente pelo fato dosmesmos fazerem parte de estruturas maiores ondehavia predominio de avucares neutros. Essa s~gestao

e reforyada pela ausencia de interavao desse materialcom a matriz da coluna de QAE-Sephadex. A fravaoJ M dessa especie, com 54,3% de acidos uronicos,teve sua atividade reduzida em apenas 28% ap6s 0

tratamento com Endo-PG (tabela 4).

Atividade indutora de Iitoalexinas*

(Ilmoles gliceolina AIAmax. ***Icotiledone) **

bruto c/Endo-PG bruto c/Endo-PG

Amostras

125 mM e J M de imidazol, de modo a separar 0

material que nao interagiu com a matriz do gel dacol una daquele que, pOI' possuir carga negativa, ficouligado a ela. Esse material foi tratado exaustivamentecom endopoligalacturonase (Endo-PG), pectinasecapaz de hidrolisar polissacarfdeos e oligossacarfdeos

de homogalacturonanos, pOI' oito horas. Esse periodocorresponde ao dobra do tempo uti Iizado pOI' Nothnagelel al. (1983) para abolir completamente a atividadede oligogalacturonideos isolados de paredes celularesde soja e tambem fracionados em col una de QAE­Sephadex. Paredes celulares brutas deR. jasminoides foram utilizadas para garantir que aenzima apresentava a atividade hidrolitica esperada(Braga & Dietrich 1998) (tabela 4).

As atividades indutoras das frayoes brutas eluidasda segunda coluna de QAE-Sephadex (tabela 4)mostram, ao contnirio dos dados da tabela 2, maioresvalores no material nao ligado a matriz (125 mM)quando comparados ao de J M, para ambas asespecies. [sso decorre possivelmente do fato de tel'havido diluiyao dessa atividade, pela reuniao, em umaunica frayao, de material com pouca atividade indutora.Alem disso, para A. myrcifolia a maior atividade nafrayao de 125 mM pode ser explicada pela inclusaode material eluido nessa concentrayao de tampaoimidazo[ que havia sido desconsiderado na analiseanterior (frayoes 25-50). Apesar dessas diferenyas,R. jasminoides continua apresentando atividadeeliciadora da sintese de fitoalexinas bastante superiora A. myrcifolia, 0 que esta de acordo com osresultados da tabela 2.

De modo geral, 0 tratamento desse material comEndo-PG resultou em perda de 4 a 31 % da atividadeindutora inicial, indicando que os oligomeras de pectinaparecem contribuir apenas em parte para a atividadebiol6gica detectada nos autoclavados das paredescelulares dessas especies (tabela 4). A frayao 125 mMde A. l11yrcifolia apresentou reduyao de atividadeexatamente correspondente ao seu teor em ayucaresacidos que foi calculado como 20,3% do total decarboidrato. A frayao 1 M de A. myrcifolia, emboracontenha cerca de 50% de seu contelldo em acidosuronicos, praticamente nao foi hidrolisada.Experimentos realizados pOI' Braga & Dietrich (1998)demonstraram que paredes celulares deR. jasl17inoides sao hidrolisadas pela Endo-PG,liberando oligomeros ativos em cotiledones de soja,fato nao observado para A. myrc[fo/ia. Recentemente,Silva & Braga (dados nao publicados) relacionaram

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A analise das frac;6es antes e apos a hidrolisecom Endo-PG por HPAEC/PAD nao reveloudiferenc;as marcantes nos perfis de oligogalactu­ronfdeos, os quais foram detectados nas frac;6eselufdas com 1 M de imidazol para ambas as especies(resultados nao mostrados).

Conforme demonstrado por varios autores,

procedimentos distintos tais como hidrolises acida(Hahn et al. 1981, Nothnagel et al. 1983) e enzimMica(Bucheli et al. J990) e autoclavagem (Braga & Dietrich1998) tem sido empregados para a obtenc;ao deoligossacarfde s com atividade biologica a partir deparedes celulares vegetais. A maioria dessasmoleculas ativas isoladas de paredes celulares deplantas superiores e de natureza pectica, sendosimilares em tamanho e estrutura. Entretanto, trabalhosde outros autores (Bucheli et al. 1990, Aldington &Fry 1992), os dados obtidos por Braga & Dietrich(1998) e os resultados aqui apresentados fortementesugerem a existencia de moleculas eliciadorasdiferentes de oligogalacturonfdeos com atividadebiologica similar a eles. Liskova et al. (1995)descreveram a presenc;a de atividade biologica emfragmentos de galactoglucomanano obtidos dePopulus monilifera.

No caso das rubiaceas em questao, emboraoligogalacturonfdeos estejam contribuindo para aatividade indutora de fitoalexinas observada, as duasespecies analisadas apresentam comportamentosdistintos com relac;ao a essa atividade, 0 que deve serconseqi.iencia das diferenc;as em estrutura ecomposic;ao de suas paredes ceJulares conformeanteriormente relatado por Braga & Dietrich (1998) eBraga et at. (1998).

Em conjunto, esses resultados sugerem quemoleculas indutoras da sfntese de fitoalexinas, porserem parte integrante de polissacarfdeos da paredecelular vegetal, estao presentes em A. myrcifolia eR. jasminoides e, provavelmente, na grande maioriadas especies vegetais, independente de sua capacidadede sintetizar esses compostos de defesa e comnatureza qufmica e atividade variaveis de acordo coma p1anta utiJizada em sua obtenc;ao. E importanteressaltar que metodos como autoclavagem e hidroliseacida sao condic;6es artificiais de obtenc;ao dessasmoleculas, sendo llteis para a analise da ocorrenciadesses fragmentos ativos e para comparac;ao de suascaracterfsticas quimicas, mas nao para a compreensaodos processos que ocon'em in vivo. A liberac;ao defragmentos de parede celular com atividade indutora

de respostas de defesa ocorre durante as interac;6esplanta-patogeno por ac;ao de hidrolases microbianase da propria planta, entre as quais estao inclufdas, alemdas pectinases, outras glicosidades responsaveis pelaquebra polissacarfdeos hemicelulosicos da paredecelular da planta hospedeira. A detecc;ao de outrosfragmentos indutores de fitoalexinas, alem dos

oligogalacturonfdeos, sugere que os mesmos devamparticipar das respostas de defesa desencadeadasdurante as interac;6es entre plantas e microor­ganismos, pOl'em os mecanismos responsaveis por sualiberac;ao e seu envolvimento nos eventos que ocorremin vivo ainda sao desconhecidos.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Ora Sonia Machado deCampos Dietrich pelas valiosas sugest6es durante aredac;ao do trabalho, ao CNPq pelas bolsas de Iniciac;aoCientffica-PIBIC a E.S. Xavier, de Aperfeic;oamentoa C.A. Silva e F. Moraes e de Produtividade emPesquisa a M.R. Braga e a FAPESP pelo auxfliofinanceiro dentro do Programa BIOTASP (processo98/05124-8).

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