SYLENE COUTINHO RAMPCHE DE CARVALHO

Avaliação de polimorfismos no gene do

fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)

e da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)

em pacientes com carcinoma hepatocelular e

infecção pelo vírus da hepatite C

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Doutor em Ciências

Programa de Ciências em Gastroenterologia

Orientador: Prof. Dr. Flair José Carrilho

São Paulo

2018

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

©reprodução autorizada pelo autor

Responsável: Erinalva da Conceição Batista, CRB-8 6755

Carvalho, Sylene Coutinho Rampche de Avaliação de polimorfismos no gene do fator decrescimento endotelial vascular (VEGF) e dametilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) empacientes com carcinoma hepatocelular e infecçãopelo vírus da hepatite C / Sylene Coutinho Rampchede Carvalho. -- São Paulo, 2018. Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina daUniversidade de São Paulo. Programa de Ciências em Gastroenterologia. Orientador: Flair José Carrilho.

Descritores: 1.Carcinoma hepatocelular 2.Fator Ado crescimento do endotélio 3.Polimorfismo genético4.Hepatite C 5.Fígado 6.Cirrose hepática

USP/FM/DBD-495/18

DEDICATÓRIA

Aos meus três filhos: Karina, Pedro e Antonio

AGRADECIMENTOS

“Gratidão é o ato de reconhecimento de uma pessoa por alguém que lhe

prestou um auxílio...em um sentido mais amplo abrange situações e dávidas que

a vida lhe proporcionou e ainda proporciona.” (Wikipédia)

É chegada a hora de agradecer! Agradecer a todos que de alguma forma

estiveram ligados a esta missão.

Agradeço a Deus, Pai de todas as Dávidas desta vida. Foi a Fé que

sempre me impulsionou até aqui.

Agradeço aos meus pais e irmãos, base de minha educação, de minha

personalidade e exemplos profissional.

Agradeço a Aldo Cezar companheiro de minha jornada e aos meus

filhos, pelo incentivo, compreensão, amor e atenção aos detalhes que fazem a

diferença.

Agradeço a meu orientador Dr Flair Carrilho e a minha co-orientadora

Dra. Claúdia Oliveira. Pela confiança depositada e serem o meu ponto de apoio

nesta missão.

Agradeço ao grupo de nódulos do IFP nas pessoas de Dra. Leila Beltrão e

Dra. Dayse, por acima de tudo compartilhar e incentivar.

Agradeço a todos os colegas de trabalho por estarem juntos a mim neste

processo, do início ao fim. Um agradecimento especial aos diretores do Hospital

Universitário Oswaldo Cruz, Professora Doutora Izabel Avelar e do Hospital da

Restauração de Pernambuco, Professor Doutor Miguel Arcanjo, pelo estímulo

para o crescimento profissional.

Agradeço ao grupo de trabalho do laboratório de cirurgia Experimental

LIM-37- setor de biologia molecular da FMUSP pelo cuidado e atenção em

realizar o trabalho.

Agradeço a Vilma Libério secretária de pós-graduação em Ciências em

gastroenterologia/ FMUSP, por toda atenção e responsabilidade com seu

trabalho, e todo carinho dedicado.

E por último, de forma especial, agradeço aos amigos queridos, Luydson

Vasconcelos, Fábio Moura, Clarissa Rocha e Gabriela Foinquinos que estiveram

ao meu lado, incentivando, escutando, compartilhando, colaborando. Este

grupo define amor.

Obrigada a todos sem exceção...

NORMALIZAÇÃO

Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta

publicação.

Referências: adaptado de International Committee of Medical Jornal Editors

(Vancouver).

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e

Documentação. Guia de Apresentação de dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha; Maria Júlia de A. L. Freddi; Maria F.

Crestana; Marinalva de Souza Aragão; Suely Campos Cardoso; Valéria Vilhena. 3.

ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.

Abreviatura dos títulos de periódicos de acordo com List of Journals Indexed in

Index Medicus.

SUMÁRIO

Lista de abreviaturas e siglas

Lista de figuras

Lista de tabelas

Resumo

Abstract

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1

2 MARCO TEÓRICO ................................................................................................. 4

2.1 Vírus da hepatite C ............................................................................................ 5

2.2 Carcinoma hepatocelular ................................................................................. 12

2.2.1 Epidemiologia, prevenção e vigilância do CHC ............................... 12

2.2.2 Diagnóstico do CHC ......................................................................... 14

2.2.3 Estadiamento do CHC ...................................................................... 16

2.2.4 Tratamento do CHC .......................................................................... 18

2.3 Fator de crescimento endotelial vascular (VEGE) .......................................... 21

2.4 VEGE e CHC .................................................................................................. 26

2.5 Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) .................................................. 27

2.6 MTHER e CHC ............................................................................................... 29

3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 32

3.1 Objetivo geral .................................................................................................. 33

3.2 Objetivos específicos ...................................................................................... 33

4 METODOLOGIA .................................................................................................. 34

4.1 Casuística e delineamento do estudo .............................................................. 35

4.. Coleta de dados clínicos e laboratoriais .......................................................... 36

4.3 Avaliação por imagem .................................................................................... 37

4.4 Coleta de Sangue e extração de DNA ............................................................. 37

4.5 Seleção dos SNPs (single nucleotide polimorphisms) ..................................... 39

4.6 Genotipagem por TaqMan ® SNP Genotyping Assays ................................... 40

4.7 Análise estatística ............................................................................................. 41

5 RESULTADOS ...................................................................................................... 43

5.1 Características clínicas e laboratoriais ............................................................ 44

5.2 Análise da frequência dos genótipos e distribuição dos SNPs (single

nucleotide polimorphisms) nos genes, MTHFR e VEGF em pacientes

com CHC e VHC, e indivíduos controles. ...................................................... 47

5.3 Análise de associação com os genes MTHFR e VEGF e características

do tumor em pacientes com CHC e VHC. ...................................................... 49

5.4 Análise da frequência alélica dos genes MTHFR e VEGF nas

populações de Recife, Europeia e Africana .................................................... 57

5.5 Análise de sobrevida dos pacientes com CHC e VHC, estratificados

pelos genótipos dos genes MTHFR (rs1801131), MTHFR (rs1801133) e

VEGF (rs2010963). ......................................................................................... 58

6 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 62

7 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 69

8 ANEXOS ............................................................................................................... 71

Anexo A- Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa. ........................................ 72

Anexo B- Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. ..................................... 73

9 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 76

LISTAS

ABREVIATURAS E SIGLAS

A Adenina

ACR Colégio Americano de Radiologia

AFP Alfa 1 fetoproteína

AFR Africana

ALT Alanina aminotransferase

Ang Angiopoetina

AST Aspartato aminotransferase

BA Bahia

BCLC Clinica de câncer de fígado de Barcelona

BT Bilirrubina total

C Citosina

CE Células endoteliais

CHC Carcinoma hepatocelular

cm centímetro

CRH cromossomo

dbSNP Banco de dados de polimorfismos de necleotídeo único

DHC Doença Hepatica Crônica

DHGNA Doença hepática gordurosa não alcoólica

DM Diabetes mellitus

DNA Ácido desoxirribonucléico

DP Desvio padrão

dUMP Desoxiuridina monofosfato

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

EGF Fator de crescimento endotelial

E(HET) Frequência relativa esperada nos heterozigóticos

EHW Equilíbrio de Hardy-Weinberg

EUR Europeia

FA Fosfatase alcalina

FGF Fator de crescimento do fibroblasto

GGT Gama glutamil-transferase

HIF-1 Fator induzido por hipóxia

HIV Vírus da imunodeficiência humana

HTLV Vírus T-linfotrópico humano

IC Intervalo de confiança

IL Interleucina

IMC Índice de massa corpórea

KG Kilogramas

M2 Metro quadrado

MAF Frequência do alelo menor

MELD Modelo de estágio final de doença hepástica

mm milímetro

MTHFR Metilenotetrahidrofolato redutase

nm nanometro

NCBI Centro nacional de informação biotecnológica

O(HET) Frequência relativa observada nos heterozigóticos

OR Razão de chances

PCR Reação de cadeia de polimerase

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

PE Pernambuco

REC Recife

RM Ressonância Magnética

RNA Ácido ribonucleico

RNAm Ácido ribonucleico mensageiro

SAM S adenosilmetionina

SNP Nucleotídeo de polimorfismo simples

T Timina

TC Tomografia Computadorizada

TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido

THF Tetrahidrofolato

TMP Timidina monofosfato

TNF Fator de necrose tumoral

TNM Tumor-nódulo-metástase

US Ultrassonografia

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

VEGFR Receptor do fator de crescimento endotelial vascular

VHB Vírus da hepatite B

VHC Vírus da hepatite C

% Por cento

≤ Menor ou igual

> Maior que

≥ Maior ou igual

< Menor que

FIGURAS

Figura 1 - Eletromicrografia do vírus da hepatite C ............................................. 6

Figura 2 - Organização genômica do VHC ........................................................... 7

Figura 3 - Organização do genoma do VHC ......................................................... 7

Figura 4 - Ciclo da replicação do VHC ................................................................ 8

Figura 5 - Árvore filogenética representativa de 129 sequências completas ........ 9

Figura 6 - Algoritmo de diagnóstico de nódulo em paciente cirrótico ............... 16

Figura 7 - Algoritmo de estadiamento BCLC e estratégia de tratamento ........... 18

Figura 8 - Mecanismo da Angiogênese .............................................................. 24

Figura 9 - Metabolismo da Homocisteína ........................................................... 28

Figura 10 - Metabolismo do ácido fólico e função da MTHFR ........................... 30

Figura 11 - Análise de sobrevida de 92 pacientes com CHC infectados pelo

vírus da hepatite C estratificados pelos genótipos do gene

MTHFR (rs181133) ............................................................................ 59

Figura 12 - Análise de sobrevida de 92 pacientes com CHC infectados pelo

vírus da hepatite C estratificados pelos genótipos do gene

MTHFR (rs181131) ............................................................................ 60

Figura 13 - Análise de sobrevida de 92 pacientes com CHC infectados pelo

vírus da hepatite C estratificados pelos genótipos do gene VEGF

(rs2010963) ........................................................................................ 61

TABELAS

Tabela 1 - Características clínicas e laboratoriais relacionadas aos pacientes

com CHC e VHC com a classificação do BCLC (Barcelona

Clinic Liver Cancer) ........................................................................... 46

Tabela 2 - Distribuição dos SNPs em pacientes com CHC e VHC, grupo

controle e verificação do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) ....... 48

Tabela 3 - Análise dos SNPs dos genes MTHFR e VEGF em pacientes com

CHC e VHC divididos de acordo com a classificação BCLC ............ 49

Tabela 4 - Análise dos SNPs dos genes MTHFR e VEGF em pacientes com

CHC e VHC divididos de acordo com o número de tumores ............. 51

Tabela 5 - Análise dos modelos de associação genética dos genes MTHFR

e VEGF em pacientes com CHC e VHC divididos de acordo

com o número de tumores ................................................................... 53

Tabela 6 - Características laboratoriais e do tumor de pacientes com CHC e

VHC em relação aos genótipos dos genes MTHFR (rs18011131

e rs1801133) e VEGF (rs2010963 ) .................................................... 55

Tabela 7 - Análise de regressão logística para predizer ocorrência de

tumores multinodulares em 117 pacientes com CHC e VHC ............. 56

Tabela 8 - Frequência alélica dos genes MTHFR e VEGF nas populações

de Recife (REC) estudada, Europeia (EUR) e Africana (AFR) ......... 57

RESUMO

Carvalho SCR. Avaliação de polimorfismos no gene do fator de crescimento

endotelial vascular (VEGF) e da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) em

pacientes com carcinoma hepatocelular e infecção pelo vírus da hepatite C [tese].

São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2018.

INTRODUÇÃO: A cirrose hepática é fator de risco para o Carcinoma hepatocelular

(CHC) e no Brasil, a etiologia de doença hepática crônica mais frequente associada

ao CHC é a infecção crônica pelo vírus da hepatite C (VHC). Angiogênese e

deficiência de folato podem estar associados ao risco de CHC. Deste modo, os

polimorfismos de genes relacionados com esses processos o VEGF e MTHFR em

doentes com hepatite C crónica e CHC podem conduzir a marcadores genéticos para

CHC na infecção por HCV.OBJETIVOS: Avaliar os polimorfismos G634C

(rs2010963), C460T (rs833061), C936T (rs3025039) do gene do VEGF e

polimorfismos C677T (rs1801133) e C1298A (1801131) da MTHFR, em pacientes

brasileiros com CHC e infecção crônica pelo VHC . PACIENTES E MÉTODOS:

Foram incluídos 119 pacientes com seguimento de CHC e VHC na clínica de

hepatologia do HUOC / UPE e do IFP-PE, Brasil. Este estudo teve aprovação do

comitê de ética e os pacientes assinaram o formulário de consentimento. Todos os

pacientes tiveram diagnóstico de VHC por PCR e CHC por ressonância magnética e /

ou tomografia.RESULTADOS: Dentre os indivíduos com CHC, 70,59% foram

homens. A média de idade dos participantes foi de 62,3 anos. De acordo com a

classificação de Child-Pugh, ficaram assim distribuídos: A 60,9%; B 36,5%; C 2,6%.

O tamanho do tumor médio foi de 4,4 cm. Sendo que 52,10% foi multinodular. Foi

feita uma análise de associação com os genes MTHFR e VEGF e características do

tumor nos pacientes com CHC infectados cronicamente com VHC. Os alelos C da

MTHFR (rs1801131) e da VEGF (rs2010963) foram associados com a proteção para

o desenvolvimento da forma multinodular, e o alelo T da MTHFR (rs1801133) foi

associado a fator de risco para desenvolvimento da forma multinodular p=0,04 OR

1,835 IC (1,0223,297). Foram realizadas análises multivariadas, incluindo-se no

modelo o sexo masculino e a idade como potenciais fatores de confusão, o gene

VEGF genótipo CC (rs2010963) foi um fator independente associado à proteção ao

desenvolvimento de tumores multinodulares. Foi também realizada uma análise de

sobrevivência estratificada pelos genótipos MTHFR (rs1801131), MTHFR

(rs1801133) e VEGF (rs2010963), mas não foram observados resultados

significativos. CONCLUSÕES: Foi observado que os genes MTHFR e VEGF tem

influência na forma de apresentação uni ou multinodular do tumor.

Descritores: carcinoma hepatocelular; fator A do crescimento do endotélio;

polimorfismo genético; hepatite C; fígado; cirrose hepática.

ABSTRACT

Carvalho SCR. Polymorphisms in the vascular endothelial growth factor (VEGF)

and methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene in patients with

hepatocellular carcinoma and hepatitis C virus infection [thesis]. São Paulo:

“Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2018.

BACKGROUND: Hepatic cirrhosis is a risk factor for hepatocellular carcinoma

(HCC) and in Brazil, the most frequent chronic liver disease associated with HCC is

chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Angiogenesis and folate deficiency may

be associated with the risk of HCC. Thus, gene polymorphisms related to such

processes VEGF and MTHFR in patients with chronic hepatitis C and HCC may lead

to genetic markers for HCC in HCV infection. OBJECTIVES: To evaluate the

polymorphisms G634C (rs2010963), C460T (rs833061), C936T (rs3025039) of the

VEGF gene and polymorphisms C677T (rs1801133) and C1298A (1801131) of

MTHFR, in Brazilian patients with HCC and chronic HCV infection. PATIENTS

AND METHODS: A total of 119 patients with HCC and HCV follow-up were

included in the HUOC / UPE and IFP-PE hepatology clinic in Brazil. This study was

approved by the ethics committee and the patients signed the consent form. All

patients had a diagnosis of HCV by PCR and HCC by magnetic resonance and / or

tomography. RESULTS: Among the individuals with HCC, 70.59% were men. The

mean age of participants was 62.3 years. According to the Child-Pugh classification,

the following were distributed: At 60.9%; B 36.5%; C 2.6%. The mean tumor size

was 4.4 cm. Being that 52.10% was multinodular. An association analysis was made

with the MTHFR and VEGF genes and tumor characteristics in HCC patients

chronically infected with HCV. The C alleles of MTHFR (rs1801131) and VEGF

(rs2010963) were associated with developmental protection of the multinodular

form, and the MTHFR T allele (rs1801133) was associated with a risk factor for

development of the multinodular form p = 0, 04 OR 1,835 IC (1,0223,297).

Multivariate analyzes, including male gender and age as potential confounders, were

performed in the VEGF gene genotype CC (rs2010963), which was an independent

factor associated with the protection of the development of multinodular tumors. A

survival analysis stratified by the MTHFR (rs1801131), MTHFR (rs1801133) and

VEGF (rs2010963) genotypes was also performed, but no significant results were

observed. CONCLUSIONS: It was observed that the MTHFR and VEGF genes have

influence on the uni or multinodular presentation of the tumor.

Descriptors: carcinoma, hepatocellulr; vascular endothelial growth factor A;

polymorphism, genetic; hepatitis C; liver; liver cirrhosis.

1 Introdução

Introdução 2

1 INTRODUÇÃO

A infecção crônica pelo vírus da hepatite C (VHC) é uma das principais

causas de doença hepática crônica em todo o mundo (1, 2)

, Estima-se que 20% dos

pacientes cronicamente infectados progredirão para a cirrose hepática num período

que varia entre 13 a 23 anos e, desse percentual, de 1 a 4% ao ano, desenvolverão o

carcinoma hepatocelular (CHC) (1, 3)

.

Os locais mais frequentes de câncer no ser humano são pulmão, mama e

coloretal. Por outro lado, as causas mais frequentes identificadas de morte por câncer

são pulmão e fígado (4)

.

Os fatores mais frequentes associados ao CHC incluem as hepatites virais

crônicas (B e C), ingesta de álcool e exposição a aflatoxina. Na África e no leste da

Ásia, a causa mais frequente é devido a hepatite B (60%), enquanto no mundo

ocidental, apenas 20% dos casos são atribuídos a infecção pelo vírus da hepatite B

(VHB), sendo a hepatite C crônica o maior fator de risco (5)

. Todas as etiologias que

levam a cirrose podem complicar com a formação de tumor, mas o risco é maior em

pacientes com hepatite viral. Um terço dos pacientes cirróticos irão desenvolver o

CHC durante sua vida (2)

. Aproximadamente 1-8% ao ano dos pacientes com cirrose

desenvolvem CHC, sendo aproximadamente 2% em pacientes cirróticos infectados

pelo VHB e 3-8% em pacientes cirróticos infectados pelo VHC (6)

.

No Brasil, o CHC tem sido associado à cirrose hepática em 98% dos casos e a

etiologia da doença hepática crônica (DHC) associada ao CHC mais frequente é o

VHC presente em 54% dos casos. As demais etiologias de doença hepática associada

ao CHC são o VHB em 16% dos casos, em 14% o álcool é a única etiologia, 3%

Introdução 3

associada a doença hepática gordurosa não alcoólica, 3% criptogênica, 1%

hemocromatose e 4% associada a outras causas incluindo hepatite autoimune e

cirrose biliar primária (7, 8)

.

O Câncer é uma doença resultante da combinação de efeitos relacionados a

suscetibilidade genética e elementos externos tais quais estilo de vida e

inflamação (9)

.

O VHC, é na nossa população, uma importante etiologia para a cirrose

hepática culminando com o CHC. O mecanismo de carcinogênese no CHC, como em

outros tipos de câncer permanece ainda não muito claro. Embora o CHC ocorra em

fígados que são afetados pela doença de base como cirrose pela infecção crônica com

VHC, acredita-se que alterações genéticas sejam a base desta patologia. Alguns

estudos vêm sendo conduzidos para investigar a associação entre polimorfismos

genéticos e o risco de CHC, mas os resultados são controversos.

Alguns fatores como a angiogênese e a deficiência de folato, parecem estar

associados ao risco de CHC em alguns grupos étnicos. Porém o papel dos

polimorfismos da VEGF e da MTHFR em pacientes com VHC em nossa região são

desconhecidos.

2 Marco Teórico

Marco Teórico 5

2 MARCO TEÓRICO

2.1 Vírus da hepatite C

A infecção pelo VHC é considerada um problema de saúde de proporção

global. O VHC é responsável pela hepatite C crônica, uma das etiologias de cirrose

hepática que na sua evolução culmina com o surgimento do CHC. No mundo a

estimativa de pessoas infectadas com o VHC é de aproximadamente 200 milhões de

indivíduos, sendo estimado uma taxa de 3-4 milhões de novos casos por ano (10)

. O

VHC foi reconhecido em 1970 e chamado de vírus da hepatite não A e não B,

quando em 1989 foi finalmente identificado por Choo et al. (1989) (11)

. É um

membro da família Flaviviridae, do gênero Hepacivirus, possui RNA de fita simples

de polaridade positiva de 9,6 quilobases de extensão (12)

, e mede em torno de 50 a 60

nm de diâmetro e contém um envoltório lipídico de aproximadamente 7 nm de

espessura que envolve o nucleocapsídeo de morfologia esférica. Quando visualizado

pela microscopia eletrônica apresenta um tamanho em torno de 30 a 35 nm (13)

(Figura 1).

Marco Teórico 6

FONTE: Penin et al., 2004 (14)

.

Figura 1 - Eletromicrografia do vírus da hepatite C

O vírus codifica uma única poliproteína longa que é processada em 10

proteínas individuais: as proteínas denominadas estruturais, codificadas por genes

localizados próximo à região 5‟NCR, que são as proteínas do nucleocapsídeo,

glicoproteínas de envelope E1, E2 e a proteína p7, e as proteínas denominadas não

estruturais NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B (12)

, que são codificadas por

genes situados próximo a região 3‟NCR e estão envolvidas na replicação e

maturação do vírus (14, 15)

(Figuras 2 e 3).

Marco Teórico 7

FONTE: Penin et al., 2004 (14)

.

Figura 2 - Organização genômica do VHC.

I---------------------------------I------------------------------------------------------------------------I

FONTE: Adaptado de Jing et al., 2017

(15).

Figura 3 - Organização do genoma do VHC

A 5‟NCR é formada por 340 nucleotídeos, sendo esta a porção do genoma

escolhida para amplificação pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e

caracterização dos diversos genótipos do VHC (14)

.

Proteína

estrutural Proteína não estrutural

Marco Teórico 8

A NS5B é uma RNA polimerase RNA dependente que desempenha um papel

central na replicação do genoma viral (16)

(Figura 4). Já as proteínas do envelope do

VHC estão envolvidas na ligação com receptores, entrada e fusão do vírus. A função

da proteína p7 ainda não é conhecida (17)

e as proteínas do nucleocapsídeo interagem

com várias proteínas celulares e afetam algumas funções das células do hospedeiro

como a transcrição gênica, o metabolismo dos lipídeos, apoptose e várias vias de

sinalização celular (14)

.

FONTE: Adaptado de Jing et al., 2017 (15)

.

Figura 4 - Ciclo da replicação do VHC

acoplamento

HCV viron entrada

fusão

translação replicação

montagem

maturação

lançamento

Novo HCV viron

Marco Teórico 9

O VHC apresenta sete diferentes genótipos, numerados de 1 a 7, em

algarismo arábico e 67 subtipos confirmados, que são identificados por letras

minúsculas em ordem alfabética (Figura 5)(18)

.

FONTE: Smith et al., 2014(18)

.

Figura 5 - Árvore filogenética representativa de 129 sequências completas

Os genótipos 1, 2 e 4 são mais encontrados no centro-oeste da África e o

subtipo 4a, no Egito; o genótipo 5 é frequente no sul da África, e os genótipos 3 e 6,

na China, sudeste da Ásia e na Índia (19)

. No Brasil, o genótipo 1b é predominante na

Região Sudeste e no norte da Amazônia, sendo na Região Sul os mais frequentes o

genótipo 1 e 3. Na Região Nordeste, especialmente em Recife (PE), há uma

Marco Teórico 10

distribuição igual entre os genótipos 1 e 3; por outro lado, em Salvador (BA), essa

distribuição não é uniforme, prevalecendo o genótipo 1 (20)

.

A exposição ao VHC pode ocorrer em várias ocasiões durante a vida. Os

principais fatores de risco relacionados à transmissão do VHC são hemotransfussões,

transplante de órgãos sólidos de doadores infectados, uso de drogas ilícitas injetáveis

e exposição ocupacional a sangue e derivados. Na evolução da hepatite C, 60%-80%

dos casos progridem para forma crônica, e mais de 20% progridem para cirrose

hepática. A forma aguda da infecção tem resolução espontânea em mais de 45% dos

casos (21)

. A progressão da doença é lenta, com alta percentagem de casos que

desenvolverão fibrose hepática progressiva, culminando em cirrose e/ou câncer de

fígado (22)

.

O diagnóstico da infecção crônica pelo VHC é baseado na presença do

anticorpo (anti-HCV) detectado por imunoensaio enzimático e o teste molecular de

detecção de ácido nucléico (HCV RNA) por reação em cadeia da polimerase

(PCR) (23)

.

Alguns fatores possuem um papel na progressão da doença, dentre estes

fatores podemos considerar aqueles relacionados ao vírus, ao hospedeiro e os

ambientais (22)

. Friedman (2008), Marcelin (2009) e Seef (2009) em seus trabalhos,

relatam que nem a carga viral nem o genótipo parecem influenciar na taxa de

progressão da doença (22, 24, 25)

. Por outro lado existem inúmeros fatores do

hospedeiro que podem influenciar na progressão da fibrose, como o sexo, idade e

raça (26)

. Ocorre uma maior prevalência de hepatite C no sexo masculino (22)

, Além

disso, 70% dos transplantes hepáticos ocorrem também no sexo masculino infectados

com VHC (27)

. Observou-se que nos pacientes infectados com idade superior a 40

Marco Teórico 11

anos ocorre uma maior taxa de progressão da doença (28)

, provavelmente devido ao

processo natural do envelhecimento atuando no sistema imunológico e sobre o

fígado (29)

. Os afro-americanos com hepatite C crônica apresentam uma elevada taxa

de evolução para o CHC bem como uma menor taxa de resposta à terapia quando

comparados com indivíduos brancos (22, 30)

. Foi observado em latinos residentes nos

Estados Unidos, uma progressão mais rápida para a cirrose, enquanto ocorre um

curso mais benigno da doença em populações aborígenes, estes fatos vem sendo

explicados pelas variações que ocorrem na resposta imune ao vírus e por influência

de polimorfismos genéticos (22, 27)

. Dentre os fatores ambientais, o consumo de álcool

está entre os principais associados à progressão da fibrose (25)

. O tabagismo também

tem sido implicado na elevação do risco para o CHC na hepatite C crônica (31-33)

. O

tabaco induz efeitos tóxicos, aumentando o processo necroinflamatório e fibrose,

imunológico com o aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias IL-1, IL-6 e

TNF-alfa, além de induzir efeito oncogênico sob o fígado (em virtude da presença de

produtos químicos com atividade citotóxica e genotóxica na fumaça do cigarro) (31)

.

As co-infecções constituem importantes fatores de progressão da hepatite C

crônica. A Co-infecção com o VHB resulta no desenvolvimento mais rápido de

fibrose e cirrose (27, 34)

. Adicionalmente, a prevalência do CHC é cerca de quatro

vezes maior nesses pacientes do que naqueles monoinfectados pelo VHC (35)

. Nos co-

infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), observa-se que as

alterações na resposta imune celular, o aumento das taxas de apoptose, leva a uma

progressão mais rápida da doença hepática e ao desenvolvimento do CHC quando

comparados com indivíduos sem a infecção pelo HIV (36)

.

Marco Teórico 12

O diagnóstico de diabetes Mellitus (DM), em pacientes com hepatite C

crônica e cirrose, aumenta o risco de desenvolvimento de CHC (37, 38)

. O estudo de

Davila et al (2005), sugere que o DM seja um fator de risco independente para o

CHC(39)

. A associação entre diabetes e CHC pode ser explicado pelo estresse

oxidativo e/ou a peroxidação dos lipídios que aumentam a possibilidade de injúria

hepática ocasionando inflamação hepática e fibrose evoluindo para a cirrose (40)

.

A infecção aguda pelo VHC é assintomática em 50 a 90% dos casos (41)

.

Excepcionalmente, ela se resolve espontaneamente. Na hepatite C crônica, a

progressão da doença que leva algumas décadas para ocorrer, pode ser acelerada pela

presença de cofatores como o consumo de álcool, DM, idade avançada no momento

do contágio, Co-infecção com outros vírus hepatotrópicos ou HIV. Na dependência

da presença desses cofatores os pacientes com hepatite C crônica, podem

desenvolver cirrose em 10 a 40% dos casos (42)

. A incidência estimada de surgimento

do CHC nesta população é de 1 a 5% ao ano (43)

.

2.2 Carcinoma hepatocelular

2.2.1 Epidemiologia, prevenção e vigilância do CHC

O CHC é a neoplasia hepática primária mais frequente. É a sexta neoplasia

mais frequente no mundo e a segunda causa de morte por câncer identificado (4)

. A

distribuição no mundo é muito heterogênea. Existem áreas com elevada incidência

como o leste da Ásia e o norte da África e outras de baixa incidência como as regiões

central, leste e norte da Europa (44)

esta heterogeneidade é devido ao fato de sua

prevalência estar relacionada aos diferentes fatores de risco para o desenvolvimento

Marco Teórico 13

do CHC. A cirrose é um importante fator de risco, e pode ser causada por hepatite

viral crônica, pelo consumo abusivo de álcool, doenças metabólicas como a

hemocromatose e a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e deficiência

de alfa 1 antitripsina (2)

. Na África e no leste da Ásia o maior fator de risco associado

com o surgimento do CHC é a hepatite B (60%), enquanto que no lado oeste do

mundo a hepatite C parece ser o maior fator de risco (45)

. No Brasil, a cirrose hepática

é o principal fator de risco para o surgimento do CHC. No estudo de Carrilho et al

(2010), a cirrose esteve presente em 98% dos casos, e apesar de sua epidemiologia

variar entre as diferentes regiões do Brasil, a etiologia mais frequente da cirrose

hepática nos pacientes com CHC foi a infecção pelo vírus C, estando presente em

58% dos casos (7, 8)

. O CHC é mais frequente no sexo masculino com uma relação

estimada de 2-2,5:1 (4)

. Alguns fatores estão associados ao aumento de risco do

surgimento do CHC, como a presença de DM (46, 47)

, obesidade e dislipidemia, fatores

estes associados a síndrome metabólica(48-50)

bem como o tabagismo (51)

. O consumo

de café diminui esse risco (52, 53)

.

A prevenção ao CHC se faz evitando os fatores de risco, como a vacina para

o VHB (54)

, o consumo abusivo de álcool e a síndrome metabólica. Uma vez

diagnosticado hepatite viral, o tratamento antiviral pode impedir a progressão da

doença hepática e reduzir o risco do desenvolvimento do CHC (55)

.

O CHC é uma das principais causas de morte nos pacientes cirróticos (2)

.

Sabe-se que o tratamento com intenção curativa só é possível no diagnóstico precoce

do tumor (56)

, portanto, é recomendado programa de vigilância com ultrassonografia

(US) abdominal a cada seis meses, realizado por profissional experiente na

população de alto risco (57, 58)

.

Marco Teórico 14

2.2.2 Diagnóstico do CHC

Para diagnóstico de CHC, o exame de imagem do fígado é essencial. Um

nódulo acima de 10 mm detectado no US de um paciente cirrótico tem uma

probabilidade muito alta de ser um CHC(59)

. Quando diagnosticado nódulo acima de

10 mm, em paciente cirrótico, é necessário um exame de imagem dinâmico:

ressonância magnética (RM) ou tomografia computadorizada (TC) com contraste. O

CHC apresenta uma vascularização predominantemente arterial, diferenciando do

parênquima hepático que possui uma vascularização mista: arterial e portal (60)

, esta

forma de vascularização permite uma diferenciação para um padrão específico de

diagnóstico do CHC que é caracterizado por uma intensa captação do contraste na

fase arterial (wash in), seguido de uma lavagem rápida do contraste na fase venosa

portal ou tardia (wash out). Este padrão mostrou-se específico para o diagnóstico de

CHC quando foi comparado com histopatológico dos explantes, peças de ressecção

cirúrgica e biópsias percutâneas (59, 61-63)

. Se o nódulo não apresentar este padrão

vascular típico para diagnóstico por imagem de um CHC, será necessário exame

histopatológico para firmar ou afastar este diagnóstico (59)

. Nos nódulos menores do

que 10 mm, tanto pela dificuldade de sua caracterização adequada, bem como pela

baixa probabilidade de ser de natureza maligna, a recomendação é de segmento com

exame de US a cada 3-4 meses com a finalidade de avaliar um possível

crescimento (59)

(Figura 6). Outros achados de imagem na RM e na TC: sinal de

hiperintensidade no T2 na RM, hiperintensidade na difusão em RM, gordura intra

lesional, presença de capsula, arquitetura em mosaico e hemorragia intra-lesional;

ocorrem mais comumente em CHC do que nos nódulos regenerativos ou

displásicos (64)

. O Colégio Americano de Radiologia (American College of

Marco Teórico 15

Radiology- ACR) propôs um sistema de padronização de dados e interpretação dos

exames de RM e TC conhecido como Liver Imaging Reporting and Data System (LI-

RADS) que foi publicado em 2011 e sua última atualização em 2018 (65)

. O LI-

RADS categoriza os nódulos em: LR-1 (definitivamente benigno), LR-2

(provavelmente benigno), LR-3 (Probabilidade intermediária para CHC), LR-4

(Provavelmente CHC), LR-5 (definitivamente CHC) e outros tumores malignos

(OM-lesões com alta probabilidade de serem neoplasias malignas diferentes de

CHC) (66)

.

A US com contraste não é recomendada como técnica de imagem de primeira

linha. Ela pode ser utilizada quando a RM e a TC estão contra indicadas ou foram

inconclusivas para o diagnóstico de CHC (67)

.

Nos pacientes não cirróticos, as características do CHC na imagem são iguais

aos dos pacientes cirróticos sendo que os tumores tendem a ser diagnosticados em

tamanho maiores uma vez que os pacientes não estão em programa de vigilância.

Mesmo assim, para o diagnóstico de CHC em paciente não cirrótico, é necessário o

exame histopatológico uma vez que podem fazer parte do diagnóstico diferencial

com outras lesões hipervasculares como os adenomas e metástases

hipervasculares (58)

.

A alfa 1 fetoproteína (AFP) tem um rendimento diagnóstico muito

baixo (59, 68)

. Outras situações, como o colangiocarcinoma e metástases de origem

gastrointestinal podem apresentar elevação de AFP (68-70)

.

Marco Teórico 16

FONTE: adaptado do EASL Clinical Practice Guidelines, 2018 (71)

.

Figura 6 - Algoritmo de diagnóstico de nódulo em paciente cirrótico

2.2.3 Estadiamento do CHC

O prognóstico dos tumores sólidos depende do estágio da doença, sendo a

avaliação prognóstica uma importante etapa no tratamento do paciente com câncer.

Feito o diagnóstico, deve-se estudar a extensão do tumor para definir expectativa de

vida, tratamento adequado e avaliar a resposta ao tratamento. Como o CHC aparece

na maioria dos casos associado a cirrose, é imprescindível avaliar conjuntamente o

grau de disfunção hepática e a extensão do tumor. Para avaliar a disfunção hepática

podemos fazer uso de algumas classificações como a classificação de Child-Pugh

(que utiliza a bilirrubina, albumina, INR, presença de encefalopatia e ascite) (72)

, e o

Marco Teórico 17

MELD (Model for End stage Liver Disease) (73)

. A presença de sintomas associados

ao tumor pode ser avaliada pelo Easten Cooperative Oncology Group (ECOG)

performance status (74)

, e pelo índice de Karnofsky (75)

. Para estadiamento existem

alguns sistemas de estadiamento propostos.

O sistema de estadiamento BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer), que foi

publicado originalmente em 1999, sendo sua última atualização publicada em 2018,

leva em conta todas essas variáveis: extensão do tumor, grau de função hepática e

sintomas relacionados ao tumor (76)

(Figura 7). O prognóstico do paciente com CHC

depende dessas características clínicas (77)

. Existem ainda outras classificações

utilizadas, como a CLIP (The Cancer of the liver Italian Program) (78)

, CUPI (The

Chinese University Prognostic Index) (79)

, a HKLC (The Hong-Kong Liver

Cancer) (80)

e a bm-JIS (The biomarker-combined Japan Integrated Staging) (81)

.

Uma classificação considerada padrão em oncologia para definir o prognóstico e o

tratamento é a classificação TNM (Tumor-Nódulo-Metástases). Nos pacientes com

CHC, existem algumas limitações para o uso desta classificação. Uma limitação é

que para ser utilizada, necessita de informações cirúrgicas, onde apenas um

percentual dos pacientes pode ser submetido a cirurgia (ressecção ou transplante).

Outra limitação da classificação TNM é que não contempla os dados referentes a

função hepática.

Marco Teórico 18

FONTE: Adaptado do EASL Clinical Practice Guidelines, 2018(71)

.

Figura 7 - Algoritmo de estadiamento BCLC e estratégia de tratamento

2.2.4 Tratamento do CHC

Avaliada a extensão do tumor e a função hepática é possível realizar o

tratamento, que pode ser classificado em cirúrgico (ressecção e transplante) e não

cirúrgico. Os tratamentos cirúrgicos são utilizados no paciente em estágio inicial de

doença com intenção curativa. Os tratamentos não cirúrgicos podem ser programados

tanto para os estágios iniciais (terapia por ablação), estágio intermediário

(quimioembolização do tumor), estágio avançado (terapia sistêmica) e cuidados de

suporte clínico no estágio terminal (Figura 7).

A ressecção cirúrgica tem sua indicação nos tumores únicos que aparecem em

fígado não cirrótico. No paciente com cirrose existe uma limitação para o emprego

desta terapia. Nos pacientes com cirrose compensada é fundamental uma avaliação

Marco Teórico 19

cuidadosa da função hepática, pelo risco de o paciente apresentar insuficiência

hepática no pós-operatório. O paciente com cirrose descompensada a ressecção

hepática está formalmente contraindicada (82)

. Os melhores pacientes candidatos a

ressecção cirúrgica são os pacientes com tumores únicos, que apresentam bilirrubina

normal e ausência de hipertensão portal clinicamente relevante (83)

. A taxa de

recidiva do tumor na ressecção hepática pode chegar a 70% em 5 anos (84)

.

As indicações de transplante hepático incluem pacientes com nódulo único ≤

5 cm ou um máximo de 3 nódulos menores de 3 cm, sem invasão vascular ou

disseminação extra hepática (critério de Milão), obtendo uma sobrevida em 4 anos de

75% e uma taxa de recorrência de 8% (85)

. Atualmente, o CHC é a indicação de

transplante hepático que mais cresce no mundo, junto com a insuficiência hepática

pela doença hepática gordurosa não alcoólica (86)

.

A ablação percutânea é o tratamento de escolha para os pacientes com CHC

em que não é possível a ressecção hepática ou que o transplante hepático está

contraindicado. As técnicas de ablação podem ser por meio de substâncias químicas

(etanol ou ácido acético), ou mediante a modificação da temperatura intratumoral

(radiofrequência, crioablação, micoondas ou laser) (87)

. A ablação por

radiofrequência e a injeção percutânea de etanol constituem as técnicas de referência.

Devido a sua maior capacidade ablativa, a radiofrequência possui maior taxa de

resposta do que a injeção percutânea de álcool nos tumores >3 cm (88)

. Não é

recomendado a radioablação em tumores subcapsulados, próximos a vesícula biliar,

hilo hepático ou coração (pelo risco de complicações), e nem nos tumores que estão

em contato com vasos sanguíneos. A proximidade com os vasos sanguíneos dificulta

a completa ablação da lesão por apresentar um fenômeno de dissipação da energia

Marco Teórico 20

térmica (89)

. A taxa de recorrência do tumor que foram tratados com ablação é de

80% em 5 anos (90)

.

A quimioembolização consiste na cateterização seletiva da artéria hepática

seguindo pela cateterização supra seletiva das artérias que nutrem o tumor e posterior

injeção do agente quimioterápico junto com uma substancia embolizante ou com

microesferas sintéticas para oclusão do fluxo arterial. É o tratamento de primeira

linha para o estágio B da classificação BCLC (91)

. A quimioembolização está

contraindicada em pacientes com descompensação da cirrose (Child-Pugh B ≥8, com

icterícia, encefalopatia e ascite refratária), tumor extenso que ocupe ambos os lobos

hepáticos, redução do fluxo portal, fístulas arteriovenosas intratáveis, anastomose

bilioentérica, stent biliar e clearance de creatinina < 30 ml/min (91)

. A

quimioembolização, mesmo obedecendo a seleção adequada de pacientes, pode

evoluir com alguns efeitos adversos (febre, dor abdominal e íleo). Como principais

complicações do procedimento podemos citar insuficiência hepática, abscesso

hepático, colecistite isquêmica entre outros. Lencioni et al. (2016), em uma revisão

sistemática observou uma sobrevida de 70,3% em 1 ano, 51,8% em 2 anos, 40,4%

em 3 anos e 32,4% em 5 anos nos pacientes submetidos a quimioembolização (92)

. A

quimioembolização também pode ser empregada nos pacientes em estágios iniciais

do CHC que estão em fila de transplante para impedir que saiam de critério de

transplante enquanto aguardam ou nos pacientes em que o transplante hepático, a

ressecção hepática ou a ablação não sejam possíveis.

Um outro tratamento locorregional é a radioembolização com esferas de

Yttrium-90, que possui uma boa tolerância clínica e uma sobrevida comparável a dos

pacientes tratados com a quimioembolização (93)

.

Marco Teórico 21

A quimioterapia convencional com finalidade citotóxica não demonstra

benefício significativo na sobrevida dos pacientes cm CHC. Com o progressivo

conhecimento das alterações moleculares que condicionam a progressão do tumor, os

agentes que podem atuar de forma específica nas vias moleculares alteradas vem

sendo avaliados (94)

. Atualmente, três drogas sistêmica, em fase III de estudo, tem

mostrado benefícios na sobrevida de pacientes com CHC avançado. Estas drogas são

inibidoras multi-quinase. O Sorafenibe e o lenvatinibe como drogas de primeira linha

e o Regorafenibe como droga de segunda linha (95-97)

.

2.3 Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)

A angiogênese é uma cascata de etapas sequenciais que leva a

neovascularização dos tumores (98)

. É um processo complexo onde ocorre a formação

de novos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, sendo fundamental em

condições fisiológicas como na reação inflamatória, reação autoimune e cicatrização

tecidual, dentre outras. A patogênese das neoplasias e metástases, como exemplo, são

determinadas pela resposta angiogênica. A resposta angiogênica pode ser devido a

um aumento dos mediadores ou deficiência dos inibidores da angiogênese (99)

.

O Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), também chamado de

fator de permeabilidade vascular, foi inicialmente identificado em 1983 como uma

proteína secretada pelas células tumorais (100)

.

Como um potente fator de permeabilidade, o VEGF promove extravasamento

do fibrinogênio plasmático, levando a formação de escadas de fibrina que facilita a

migração celular durante invasão. Como um fator de crescimento endotelial, o VEGF

Marco Teórico 22

estimula a proliferação de células endoteliais, induzindo o brotamento de novos

vasos sanguíneos ao redor da massa de crescimento tumoral (101)

.

A formação de novos vasos sanguíneos é iniciada por condições de hipóxia

ou isquemia. Os baixos níveis de oxigênio levam ao acúmulo de Fatores Induzidos

por Hipóxia (HIF-1) que estimulam a expressão de fatores de crescimento

angiogênico (102)

. A família VEGF é composta de seis glicoproteínas; VEGF-A,

VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E e o fator de crescimento placentário. Dentro

destes subtipos há múltiplas isoformas. O melhor membro que caracteriza a família

VEGF é o VEGF-A (103)

. O VEGF-A é o fator chave na indução da angiogênese, que

pela ligação ao receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) leva

ao aumento da permeabilidade vascular (104)

. O efeito angiogênico da VEGF é

mediado por vários receptores diferentes. Os receptores da VEGF 1 e 2 (VEGFR)

foram descobertos originalmente nas células endoteliais, como um receptor tirosina

quinase. Os vários membros da família VEGF tem diferentes afinidades de ligação

com cada receptor. O VEGFR 1 tem um importante papel no desenvolvimento da

angiogênese bem como em outros processos, incluindo a migração de monócitos,

recrutando as células progenitoras do endotélio e aumentando as propriedades

adesivas das células “natural-Killer”. O VEGFR 2 medeia a maioria dos efeitos da

cascata abaixo da VEGF na angiogênese, incluindo a permeabilidade microvascular,

a proliferação de célula endotelial, a migração e a sobrevida da célula tumoral (105)

.

A vasodilatação é o primeiro passo na formação dos novos vasos sanguíneos.

A influência da Angiopoetina 2 (Ang-2) e do VEGF dá origem à ocorrência de

fenestrações, o que aumenta a permeabilidade vascular permitindo o extravasamento

de proteínas plasmáticas. Estas proteínas plasmáticas servirão como uma escada para

Marco Teórico 23

que as células endoteliais (CE) migrem (106)

. As Angiopoetinas descritas são de dois

tipos, a 1 e 2. A Ang-2 é um antagonista da Ang-1, causando a desestabilização do

vaso, deslocando as CE de um estado estável, preso ao crescimento, para um estado

proliferativo (107)

. Vários fatores angiogênicos como o VEGF, o fator de crescimento

do fibroblasto (FGF) e o fator de crescimento endotelial (EGF), induzem a

proliferação e migração das células endoteliais através da matriz. A VE-caderina e

integrinas coordenam a ligação das CE, enquanto o fator de necrose tumoral alfa

(TNF-α), FGF e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), induzem a

formação do tubo. As camadas de vasos circundantes compostas de pericitos

precisam ser recrutadas através de um processo mediado pelos PDGF e VEGF. As

células endoteliais se contraem, os pericitos são recrutados e uma nova membrana

basal é gerada. A Ang-1 é responsável pela estabilização dos vasos levando a vasos

sanguíneos duráveis e maduros (Figura 8) (106)

.

Marco Teórico 24

Fonte: Adaptado de Coulon et al. 2014 (106)

.

Figura 8 - Mecanismo da Angiogênese. 1. O primeiro passo é a desestabilização

através da Ang-2 e 2. hiperpermeabilidade da parede do vaso. 3.

Seguido pela proliferação e migração da CE. 4. O contato célula a

célula é estabelecido através da VE-caderina e das integrinas. 5. A

formação do tubo é completada via TNF-a, FGF e PDGF. 6. Após

proliferação e migração mesenquimal e 7. diferenciação de pericitos. 8.

A formação dos vasos é completada após a estabilização

Marco Teórico 25

O gene humano do VEGF está localizado no cromossomo 6p21.3 e contém 8

exóns separados por 7 íntrons (108)

. O splicing alternativo resulta em quatro isoformas

principais, contendo 121 (VEGF121), 165 (VEGF165), 189 (VEGF189) e 206

(VEGF206) aminoácidos (108, 109)

. Outras variantes têm sido observadas em menor

frequência, incluindo VEGF145, VEGF183, VEGF162 e VEGF165b. Esta última

variante teria um efeito inibitório na mitogênese induzida pelo VEGF (110)

. O

VEGF165 é a principal isoforma do VEGF-A, e é uma glicoproteína homodimérica

de 45 KDa (111)

.

Dentro de uma espécie pode haver variabilidade na sequência do DNA. Se a

variação é encontrada em uma frequência superior a 1% da população, denomina-se

polimorfismo (112)

. O polimorfismo C936T (rs3025039) é caracterizado por uma

troca na posição 936 do gene do VEGF de uma Citosina (C) em Timina (T). O VEGF

rs3025039 está localizado na região não traduzida 3‟. A troca do nucleotídeo C pelo

T na posição 936 do gene VEGF influencia na estabilidade da transcrição do RNAm

levando a uma diminuição dos níveis plasmáticos de VEGF quando comparados com

indivíduos homozigotos para o alelo C (113)

. No polimorfismo T460C (rs833061), o

SNP está na região promotora do gene VEGF. Polimorfismos do gene VEGF

localizado na região promotora pode aumentar a expressão e atividade da proteína.

Este polimorfismo aumenta em 71% a atividade proteica (114, 115)

. O VEGF G634C

(rs2010963) está localizado na região não traduzida 5‟. O polimorfismo nesta região,

parece estar associado com a baixa expressão da proteína VEGF (116)

.

Marco Teórico 26

2.4 VEGF e CHC

O crescimento do CHC depende da angiogênese, e tem sido demonstrado um

importante papel da VEFG na angiogênese do CHC (117)

. O papel da angiogênese na

progressão de lesões pré-malignas para cânceres invasivos levaram os pesquisadores

a estudar o papel do VEGF na história natural do CHC. A angiogênese é uma

importante etapa no desenvolvimento do câncer e é necessária para o crescimento do

tumor primário, invasão e metástase (103)

. As células do CHC apresentam crescimento

rápido e, consequentemente, precisam de um suprimento elevado de oxigênio e

nutrientes. Assim as células tumorais induzem a formação de novos vasos

sanguíneos. As lesões do CHC caracterizam-se pela hipervascularidade arterial para

fornecer ao tumor sangue altamente oxigenado (118)

. No entanto, estes novos vasos

são formados por vasos desorganizados, com vazamento hemorrágico e tortuosos. A

irregularidade dos vasos do tumor resulta em fluxo de sangue caótico com sangue

pouco oxigenado. Além disso, esses vasos sanguíneos com vazamento fornecem uma

passagem para as células do tumor na circulação sanguínea e, portanto, facilitam a

metástase (106)

. No CHC o aumento na expressão do VEGF e elevação dos níveis

séricos tem sido associado com pior prognóstico (119)

. Foi observado que os níveis de

VEGF aumentavam progressivamente a medida que os nódulos evoluíam de

displasia de baixo grau, displasia de alto grau e CHC precoce (120)

. Em um estudo de

análise quantitativa de 70 casos de CHC, a expressão do VEGF, demonstrada por

imunohistoquímica, foi observada em 63,9% dos CHC encapsulados, 78,3% dos não

capsulados e 90,9% dos CHC com metástases extra-hepáticas (121)

. O estudo de Deli

e cols. (2005) relatou uma expressão VEGF positiva, usando imunohistoquímica, em

Marco Teórico 27

72 dos 105 pacientes com CHC (68,6%) (122)

. A expressão do VEGF no tumor com

invasão venosa microscópica, está significativamente maior do que nos CHC sem

invasão venosa microscópica (123)

. Outros estudos, embora com um número pequeno

de pacientes, tem evidenciado que a expressão do VEGF no CHC esta correlacionada

com a probabilidade de recorrência do tumor depois da ressecção ou da

ablação (124, 125)

.

2.5 Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)

A MTHFR é a principal enzima no metabolismo do folato (126)

. Junto de

outras enzimas, a MTHFR participa no metabolismo do folato, pela conversão da

5,10-metilenotetrahidrofolato (5,10-metileno-THF) em 5-metiltetrahidrofolato (5-

metil-THF) (127)

. O folato na sua forma de 5-metil-THF participa na síntese de

nucleotídeos, na síntese de S-adenosil-metionina, na remetilação da homocisteína em

metionina, e na metilação de DNA, proteínas, neurotransmissores e fosfolípides. A

atividade normal da MTHFR pode ajudar a manter os níveis circulantes de folato e

metionina prevenindo um aumento nos níveis plasmáticos de homocisteína (128).

(Figura 9).

Marco Teórico 28

FONTE: Adaptado de Bydlowski et al., 1998 (129)

.

Figura 9 - Metabolismo da Homocisteína

O gene MTHFR localiza-se no cromossomo 1 (1p36.3) apresentando 11

exóns com tamanhos variando de 103 a 432 pb (130)

.

Polimorfismos no gene MTHFR são descritos, a maioria deles raros ou

distribuídos em populações isoladas (131)

.

O polimorfismo C677T é caracterizado por uma troca na posição 677 do gene

da MTHFR de uma citosina (C) em Timina (T) (128)

, determinando uma substituição

de alanina por valina na cadeia polipeptídica, sendo a mesma relacionada a uma

maior termolabilidade bem como diminuição da atividade catalítica da

enzima (126, 132)

, com perda de mais de 60% da atividade enzimática no homogenato

celular. A frequência de alelos varia com a população estudada (133)

.

Outro polimorfismo no gene MTHFR é o A1298C, onde ocorre uma troca no

nucleotídeo 1298, de uma adenina (A) em citosina (C), resultando em uma

Marco Teórico 29

substituição de um aminoácido do ácido glutâmico por alanina no códon 429

(Glu429Ala), o qual também pode induzir uma diminuição na atividade da

MTHFR (134)

.

2.6 MTHFR e CHC

Acredita-se que a deficiência de folato aumenta o risco de Câncer por

perturbar a metilação do DNA e diminuir a síntese de reparação do DNA,

conduzindo à ativação pronto-oncogênica (135)

. O ácido fólico na forma de

5‟metilenotetrahidrofolato (5‟-metil-THF), é essencial na conversão da metionina

para sua forma ativada de S-adenosilmetionina (SAM). A SAM é a mais importante

na maioria das reações bioquímicas, incluindo a metilação da citosina no DNA.

Alterações ou interrupções na metilação do DNA podem aumentar a transformação

maligna. Se os níveis de 5‟-metil-THF estão mais baixos, leva a uma redução da

metilação da citosina no DNA (136)

. Esta hipometilação pode resultar em um estímulo

da expressão de proto-oncogenes e induzir o câncer (Figura 10).

Na formação da molécula de DNA as pirimidinas (timina e citosina) se unem

as purinas (adenina e guanina) correspondente através de ligações de hidrogênio

denominadas emparelhamento de base. As pirimidinas são moléculas menores e

formadas por um único anel de carbono e nitrogênio. A timina é a única molécula

que só se encontra no DNA e é a principal estrutura que compõe esse ácido nucleico.

A citosina compõe tanto o DNA quanto o RNA e realiza três ligações de hidrogênio

com a base púrica guanina. Assim como as purinas, as pirimidinas também podem

ser produzidas por síntese orgânica. Através da hidrólise de nucleotídeos são

Marco Teórico 30

produzidos os nucleosídeos pirimídicos citidina, uridina e timidina. O folato também

é essencial para a síntese de purinas e de pirimidinas. O folato na forma de 5‟,10‟

metileno tetrahidrofolato, atua como um doador para a enzima timidilato sintase a

qual converte a desoxiuridina monofosfato (dUMP) em timidina monofosfato

(TMP). A deficiência de folato bloqueia a metilação da dUMP em TMP, desta forma

levando a um ciclo de reparação catastrófica (135, 137)

(Figura 10).

Vários estudos demostraram que o polimorfismo C677T está associado com

determinados canceres, como o câncer de próstata (138)

, de pulmão (139)

, coloretal (140)

,

estômago (141)

, bexiga (142)

, esôfago (143)

e leucemia (144)

. O esquema delineado na

Figura 10, demonstra a possível via alternativa do aproveitamento do folato no

metabolismo sob influência dos polimorfismos.

FONTE: Zanrosso et al., 2005 (145)

.

Figura 10 - Metabolismo do ácido fólico e função da MTHFR

Marco Teórico 31

Alguns estudos avaliaram a correlação do polimorfismo C677T do gene da

MTHFR com o CHC, mas os resultados foram controversos (146, 147)

. A meta análise

de Jin e cols (2009) conclui que o polimorfismo C677T do gene da MTHFR aumenta

o risco de CHC especialmente na população Europeia (148)

.

Outros estudos tentaram evidenciar a associação entre o polimorfismo

A1298C e o risco de desenvolvimento de CHC, mas a primeira meta análise

publicada avaliando esta associação, conseguiu selecionar apenas seis trabalhos e

conclui que este polimorfismo pode estar associado com a diminuição no risco de

CHC na população asiática, afirmando contudo que devem ser realizados mais

estudos com amostras maiores (149)

.

3 Objetivos

Objetivos 33

3 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliação dos polimorfismos do gene do Fator de crescimento endotelial

vascular (VEGF) rs2010963, rs3025039, rs833061 e polimorfismos do gene da

Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) rs1801131 e rs1801133 em pacientes

com Carcinoma hepatocelular e hepatite C, atendidos em centros de referência de

doenças do fígado em Recife, Pernambuco.

2.2 Objetivos específicos

- Estimar a frequência dos polimorfismos no gene do VEGF e da MTHFR em

pacientes com diagnóstico de carcinoma hepatocelular e infecção pelo vírus da

hepatite C.

- Correlacionar a presença dos polimorfismos no gene do VEGF e da MTHFR com

as características clínicas, bioquímicas e características dos nódulos hepáticos em

pacientes com diagnóstico de carcinoma hepatocelular e infecção pelo vírus da

hepatite C.

4 Metodologia

Metodologia 35

4 METODOLOGIA

4.1 Casuística e delineamento do estudo

Este é um estudo transversal de caráter analítico, onde foram incluídos, a

partir de janeiro de 2014 até dezembro de 2016, 119 pacientes ambulatoriais,

portadores de hepatite C crônica e Carcinoma hepatocelular que tinham sido ou ainda

estavam em acompanhamento no ambulatório de hepatologia do Hospital

Universitário Osvaldo Cruz da Universidade de Pernambuco e Instituto do Fígado e

Transplantes de Pernambuco. Foram selecionados para a pesquisa, todos os pacientes

acima de dezoito anos que tiveram diagnóstico de hepatite C crônica confirmados

por PCR (HCV RNA +) e diagnóstico de Carcinoma hepatocelular por método de

imagem através de exames de tomografia computadorizada do fígado e/ou

ressonância nuclear magnética do fígado, que definiram diagnóstico de CHC

utilizando como critério radiológico diagnóstico, a presença de realce intenso da

lesão na fase arterial do contraste e lavagem do contraste (washout) nas fases venosas

tardias estabelecidos de acordo com os critérios preconizados pela Associação

Americana para o estudo de doenças do fígado (AASLD) (150)

, o estadiamento dos

tumores foi feito através do BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer) (151)

. Foram

considerados critérios de exclusão pacientes com Co-infecção pelo HIV e/ou VHB, e

pacientes com cirrose de outra etiologia. O presente estudo tem aprovação do comitê

de ética (n. 349/14) e todos os pacientes assinaram termo de consentimento pós-

informado.

Metodologia 36

Para caracterizar a frequência dos genótipos na nossa população, foram

utilizados material de banco de sangue de 128 indivíduos, com enzimas hepáticas

(ALT, AST, Fosfatase Alcalina e GGT) normais, sorologias para hepatite C e B não

reagentes.

Após a obtenção do termo de consentimento pós-informado foram colhidos

10 ml de sangue periférico para o estudo genético dos pacientes incluídos na

pesquisa.

4.2 Coleta de dados clínicos e laboratoriais

Os dados foram coletados através do questionário padrão em consulta médica,

quando possível, com entrevista e exame clínico, e complementados com dados de

prontuário médico, agrupados em um banco de dados e tabulados em planilha Excel.

Foram registradas as características demográficas como idade, sexo, peso, altura e

cálculo do índice de massa corpórea (IMC). O IMC foi calculado, conforme critério

da OMS, dividindo-se o peso (kg) pela altura ao quadrado (m2), utilizando-se IMC >

25 kg/m2

para a definição de sobrepeso e > 30 kg/m2 para obesidade

(152). Foram

ainda coletados os dados relacionados ao VHC (genótipo), dosagem bioquímica

(transaminases, bilirrubinas, plaquetas, fosfatase alcalina, gama glutamil transferase

e alfa-1 fetoproteína), todos registrados em prontuário. Através dos dados

laboratoriais, exame físico e achados radiológicos, os pacientes foram classificados

segundo o sistema de estadiamento do BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer)(151)

.

Metodologia 37

4.3 Avaliação por imagem

A avaliação por imagem foi realizada por meio de consulta aos laudos de

exames de tomografia computadorizada do fígado e/ou ressonância nuclear

magnética do fígado, com contraste em quatro fases, que definiram diagnóstico de

CHC através de algoritmo diagnóstico validado em 2005 que utiliza como critério

radiológico diagnóstico, a presença de realce intenso da lesão na fase arterial do

contraste e lavagem do contraste (washout) nas fases venosas tardias (150)

. Todos os

laudos encontravam-se anexados ao prontuário médico. Foram analisados os

tamanhos e número dos nódulos hepáticos identificados por estes métodos dinâmicos

de imagem.

4.4 Coleta de Sangue e extração de DNA

Amostras de sangue periférico (10 ml) dos pacientes foram coletadas por

punção de veia periférica em tubo contendo anticoagulante EDTA (Ácido

etilenodiaminotetracético). O material coletado foi processado por centrifugação

refrigerada e o volume contendo as células nucleadas (creme leucocitário), foi

armazenado em tubo de micro centrífuga estéril de 1,5 ml a – 20 ºC para posterior

extração de DNA.

O DNA genômico foi isolado utilizando-se o kit de extração e purificação

PureLink™ Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, EUA)

de acordo com instruções do fabricante. listadas a seguir. Após o descongelamento

das amostras, foram transferidos 200 μL do creme leucocitário para um tubo de

Metodologia 38

micro centrífuga estéril e adicionados 20 μL de Proteinase K e 20 μL de RNaseA.

Essa solução foi agitada em vórtex e incubada a temperatura ambiente por 2 minutos.

Em seguida, foi adicionado 200 μL de PureLink™ Genomic Lysis/Binding Buffer.

Para se obter uma solução homogênea, foi efetuada agitação vigorosa em vórtex. A

mistura foi incubada por 10 minutos a 55 ºC para promover a digestão protéica. Ao

término da incubação, foram adicionados ao lisado 200 μL de etanol 96-100%,

seguido de agitação em vórtex. O lisado foi transferido para uma coluna de sílica,

acoplada a um tubo coletor de 2,0 mL, e centrifugado a 10.000 × g por 1 minuto à

temperatura ambiente. Em seguida, o tubo coletor foi descartado. A coluna contendo

o DNA genômico fixado foi transferida para um novo tubo coletor de 2,0 mL. Foram

adicionados à coluna 500 μl de Wash Buffer 1, preparado previamente com etanol. A

seguir, foi centrifugada a 10.000 × g por 1 minuto à temperatura ambiente.

Novamente, o tubo coletor foi descartado e substituído. Foram adicionados à coluna

500 μl de Wash Buffer 2, preparado previamente com etanol. A mistura foi

centrifugada à velocidade máxima por 3 minutos à temperatura ambiente. Ao

término do processamento, o tubo coletor foi descartado e substituído por um tubo de

micro centrífuga estéril de 1,5 mL. Para a eluição do DNA, a solução foi incubada à

temperatura ambiente por 1 minuto, acrescida de 100 a 200 μl de água ultrapura

estéril livre de DNase/RNase (Invitrogen) e por fim, centrifugada a velocidade

máxima por 1 minuto à temperatura ambiente. A coluna foi descartada e o tubo de

micro centrífuga conteve o DNA genômico purificado.

A concentração das amostras de DNA foi determinada por quantificação em

espectrofotômetro NanoDropTM

ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.

Wilmington, EUA) pela absorbância em luz ultravioleta a 260 nm, utilizando-se

Metodologia 39

como valor padrão 1 DO260= 50 µg/mL de DNA. O grau de pureza foi avaliado pela

razão 260/280 nm, utilizando-se apenas os DNAs cuja razão estejam entre 1,8 e 2,0.

A integridade das amostras foi verificada por eletroforese em gel de agarose

1% corado com brometo de etídio 3,0 µg/mL e visualizado em transluminador de luz

UV em comprimento de onda 203 nm.

O trabalho foi realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental - LIM 37

Setor de Biologia Molecular, Disciplina de Transplante de Fígado - Departamento de

Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

4.5 Seleção dos SNPs (single nucleotide polimorphisms)

Para este estudo foram selecionados os SNPs potencialmente funcionais por

ocorrerem próximos às regiões regulatórias dos genes e potencialmente

influenciarem a expressão gênica, alterando a quantidade final da proteína codificada

pelos genes.

Utilizou-se os bancos de dados dbSNP do NCBI (153)

e International HapMap

Project (154)

para auxiliar na seleção dos SNPs. A distribuição dos haplótipos foi

identificada com o objetivo de selecionar os SNPs mais informativos. Devido aos

dados do HapMap Project e dbSNP serem derivados de populações de não-

brasileiros, os genótipos gerados no nosso estudo servirão para uma primeira análise

da distribuição dos haplótipos na nossa população, o que, certamente, poderá

beneficiar futuros estudos.

Metodologia 40

4.6 Genotipagem por TaqMan ® SNP Genotyping Assays

A genotipagem foi realizada utilizando a técnica TaqMan ® SNP Genotyping

Assays (Thermo Fisher Scientific, CA, EUA) através da identificação da base com

uso de sondas marcadas com fluoróforos, com amplificação pela reação em cadeia da

polimerase (PCR) em tempo real. Os kits TaqMan® contém primers

(oligonucleotídeos) que flanqueiam a região polimórfica para amplificação dos

produtos por PCR, além de duas sondas (fragmento de DNA de oligonucleotídeos de

18-22 pb) complementares à sequência alvo, sendo cada uma específica para um dos

alelos descritos (polimórfico e tipo selvagem). Esta sonda apresenta na extremidade

5' um fluoróforo (dye reporter) e extremidade 3' um quencher (molécula que aceita

energia do fluoróforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor).

Enquanto as sondas estão intactas, a interação entre os dye reporters e os

quenchers impede que a fluorescência seja emitida. Durante a atividade exonuclease

5‟ --> 3‟ da Taq DNA polimerase, a sonda ligada ao fragmento é clivada, causando a

liberação do dye reporter e a emissão de fluorescência. Como apenas a sonda

específica para um determinado alelo é capaz de se ligar a ele, apenas a fluorescência

emitida por ela será detectada. Como cada sonda é marcada com uma fluorescência

diferente, através da leitura da fluorescência emitida é possível determinar o genótipo

da amostra. Esse processo se repete em cada ciclo e não interfere com o acúmulo de

produto da PCR.

Além do dye reporter e da molécula quencher, uma molécula denominada

MGB (Minor Groove Binder) também está afixada a sonda, tendo a função de elevar

a sua temperatura de anelamento, permitindo ligação mais especifica, e evitando que

Metodologia 41

ela se ligue inespecificamente a seqüência correspondente ao outro alelo. Os

polimorfismos foram detectados através dos seguintes ensaios, VEGFA -634G>C

(rs2010963) ensaio (C___8311614_10), VEGFA 936 C>T (rs3025039) ensaio

(C__16198794_10), VEGFA -460 C>T (rs833061) ensaio (C___1647381_10),

MTHFR C677T (rs1801133) ensaio (C___1202883_20) e MTHFR A1298C

(rs1801131) ensaio (C____850486_20).

A fluorescência emitida na reação foi detectada em Real Time PCR Step One

Plus (Applied Biosystem, Life Technologies, Foster City, EUA), que faz a

discriminação alélica através da emissão de luz em comprimento de onda

característico. Os genótipos serão determinados de acordo com o perfil de emissão

das fluorescências ao final da reação de PCR. Para amplificação dos fragmentos

desejados utilizaremos as seguintes condições de reação: 5,0 µL do master mix , 0,5

µL de Taqman Genotyping 20X, 3,5 µL de água RNase DNase Free e 1,0 µL

contendo 10 ng de DNA, somando um total de 10 µL para cada reação. Foram

utilizados os seguintes parâmetros de ciclagem: 30 seg a 60 °C, 10 min a 95 °C,

seguidos por 50 ciclos a 92 °C por 15 min e 60 °C por 1 min.

4.7 Análise estatística

Os dados foram analisados utilizando o software SPSS v.17 para realização

dos testes estatísticos. As frequências alélicas foram estimadas pelo método da

contagem gênica com pLINK. O teste Qui-quadrado foi utilizado para verificar se a

distribuição genotípica está de acordo com a hipótese do equilíbrio de Hardy-

Weinberg. A existência de associações entre variáveis categóricas será avaliada pelos

Metodologia 42

testes Qui-quadrado de Pearson e exato de Fisher quando apropriado. Para as

variáveis quantitativas foram utilizados o teste-t ou Mann-Whitney obedecendo a

regra de distribuição normal. As diferenças foram consideradas significativas para

valores de p<0,05, correção de Bonferroni para múltiplas associações foi utilizada

para confirmação da associação em modelo univariado. A magnitude destas

associações será estimada como Odds ratios (OR), utilizando intervalos de confiança

de 95%. Os valores de Odds ratio serão ajustados de acordo com as possíveis

variáveis de confusão através de regressão logística multivariada. Analise de

sobrevida foi realizada utilizando o teste de Logrank (Mantel-cox) para estimar a

porcentagem de sobrevida relacionado aos genótipos dos SNPs estudados.

5 Resultados

Resultados 44

5 RESULTADOS

5.1 Características clínicas e laboratoriais

Foram avaliados 119 pacientes portadores de infecção crônica pelo VHC e

CHC acompanhados no ambulatório de nódulo do Hospital Universitário Osvaldo

Cruz da universidade de Pernambuco e Instituto do Fígado e Transplantes de

Pernambuco. Foram utilizados 128 indivíduos de banco de sangue com triagem

sorológica para HIV, VHC, VHB, Chagas, HTLV e Sífilis para caracterizar a

frequência dos genótipos na nossa população. Dentre os indivíduos com CHC,

70,59% foram homens e 29,41% mulheres. A média de idade dos participantes foi de

62,3 anos (variação de 46 a 86 anos). Na análise de alguns fatores de risco para

neoplasia, com relação ao IMC, a média foi de 25,6 (variação de 15,2 a 38,5). Foi

ainda observado a presença de diabetes mellitus em 33,61% dos casos.

De acordo com a classificação de Child-Pugh, ficaram assim distribuídos: A

60,9%; B 36,5%; C 2,6%. A avaliação do tamanho do tumor, foi feita pelo seu maior

diâmetro, e nos casos de apresentação multinodular, foi mensurado aquele de maior

tamanho em seu maior diâmetro, a média foi de 4,4 cm (variação de 0,5 a 13,8 cm).

Apresentaram-se de forma uninodular 46,21% dos casos e multinodular 52,10%, não

foi caracterizado dois dos 119 pacientes estudados.

Dentre os exames laboratoriais avaliados, nos indivíduos portadores de VHC

e CHC, obtivemos uma média de bilirrubina total (BT) de 1,6 mg/dL (variação de 0,4

a 7,2 mg/dL), Aspartato aminotransferase (AST) média de 98,9 U/L (variação de 16

Resultados 45

a 237 U/L), Alanina aminotransferase (ALT) média de 90,2 U/L ( variação de 18 a

249 U/L), Gamaglutamil transpeptidase (GGT) média de 239 U/L (variação de 26 a

1629 U/L), Fosfatase alcalina (FA) média de 168,4 U/L (variação de 36 a 630 U/L),

Plaquetas em número, com média de 119037 (variação de 12000 a 324000), Alfa 1

fetoproteina (AFP) média de 1492,5 ng/mL (variação 1,7 a 60.500). A frequência do

genótipo 1 nesta população estudada foi de 67%. A nossa amostra não apresentou

diferença significativa com relação as variáveis clínicas idade, sexo, IMC e presença

de DM, bem como com as variáveis laboratoriais BT, AST, ALT, GGT, FA,

plaquetas e genótipo 1 do VHC quando comparados os diferentes estágios do BCLC,

apresentando diferença estatística, quando avaliados o Child p=<0,0001, o tamanho

do tumor p=<0,0001, e a apresentação uninodular ou multinodular p=<0,0001.

Observamos também diferença estatística significativa com relação a variável

laboratorial AFP p=0,002 (Tabela 1).

Resultados 46

Tabela 1 - Características clínicas e laboratoriais relacionadas aos pacientes com

CHC e VHC, com a classificação do BCLC (Barcelona Clinic Liver

Cancer)

Abreviações: VHC- vírus da hepatite C; CHC- Carcinoma hepatocelular; BCLC- Barcelona Clinic Liver Cancer;

IMC- índice de massa corpórea; BT- bilirrubina total; AST- aspartato aminotransferase; ALT- Alanina

aminotransferase; GGT- Gama glutamil transpeptidase; FA- Fosfatase alcalina; AFP: alfa 1 fetoproteína; VHC-

vírus da hepatite C.

Variáveis HCV-CHC

(n=119)

BCLC-0/A

(n=60)

BCLC-B

(n=32)

BCLC-C

(n=25) p-value

Clínicas

Idade (anos) 62,30±8,63 62,17±8,79 62,5±9,13 63,08±7,74 0,79

Sexo masculino 84 (70,59%) 40 (66,67%) 23 (71,9%) 21 (84%) 0,27

IMC (kg/m2) 25,60±4,32 26,1±4,79 24,8±3,2 25,34±4,19 0,70

Diabetes 40 (33,61%) 20 (33,32%) 9 (28,12%) 8 (32%) 0,87

CHILD A 60,9% 88% 40,62% 24%

<0,0001 CHILD B 36,5% 10,34% 56,25% 72%

CHILD C 2,6% 1,66% 3,13% 4%

Tamanho tumor 4,4±2,6 2,8±1,2 5,9±2,7 6,15±2,96 <0,0001

Uninodular 55 (46,21%) 43 (71,67%) 10 (31,25%) 2 (8%) <0,0001

Multinodular 62 (52,10%) 17 (28,33%) 22 (68,75%) 23(92%)

Laboratoriais

BT [mg/dL]

(min-max) 1,6 (0,4-7,2) 1,7 (0,5-7,22) 1,4 (0,5-3,7) 1,74 (0,36-5,51) 0,70

AST (U/L)

(min-max) 98,9 (16- 237) 103,9 (28-237) 93,2 (31-183,9) 96 (16-225) 0,46

ALT (U/L)

(min-max) 90,2 (18-249) 100,7 (18-240) 84,4 (26-208) 75,92 (18-249) 0,05

GGT (U/L)

(min-max)

239

(26-1629)

232,8

(26-1133)

184,7

(41-532)

320,61

(50-1629) 0,10

FA (U/L)

(min-max)

168,4

(36-630)

151,2

(51-320)

192,3

(36-618,3)

170,74

(61-630) 0,40

Plaquetas

(min-max)

119037

(12000-

324000)

107701,7

(12000-

230000)

131645,2

(46000-

247000)

131260,9

(55000-

324000)

0,18

AFP ng/mL

(min-max)

1492,5

(1,7-60500)

660

(1,8-19000)

691,9

(1,7-9604)

4468,65

(1,97-60500) 0,002

VHC genótipo 1

(%) 67% 63,32% 50% 52% 0,50

Resultados 47

5.2 Análise da frequência dos genótipos e distribuição dos SNPs (single

nucleotide polimorphisms) nos genes, MTHFR e VEGF em pacientes com

CHC e VHC, e indivíduos controles

A posição dos polimorfismos do MTHFR e VEGF no cromossomo,

frequência esperada e observada, informações sobre o Equilíbrio de Hardy-

Weinberg, frequência do Minor Alelo (alelo menos frequente) e do Major Alelo

(alelo mais frequente), estão descritas na Tabela 2. No presente estudo, as

frequências genotípicas observadas e esperadas dos SNPs do MTHFR e VEGF foram

consistentes com o Equilíbrio de Hardy-Weinberg, com valor de p superior a 0,05

para as análises.

Resultados 48

Tabela 2 – Distribuição dos SNPs em pacientes com CHC e VHC, grupo controle e verificação do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW)

Abreviações: SNP - single nucleotide polimorphisms; CRH – cromossomo; O(HET) – frequência relativa observada nos heterozigotos ; E(HET) – frequência relativa

esperada nos heterozigotos; EHW- Equilíbrio de Hardy-Weinberg; MTHFR – metilenotetrahidrofolato redutase; VEGF – fator de crescimento endotelial vascular.

CHR SNP Gene Grupo Minor alelo Majoralelo Genótipos O(HET) E(HET) p-Value (EHW)

1 rs1801131 MTHFR HCC C A 9/45/65 0,3782 0,3893 0,8136

1 rs1801131 MTHFR Controle C A 10/39/79 0,3047 0,3547 0,1319

1 rs1801133 MTHFR HCC T C 12/42/65 0,3529 0,4008 0,2502

1 rs1801133 MTHFR Controle T C 10/60/58 0,4688 0,4297 0,4103

6 rs2010963 VEGF HCC C G 18/48/53 0,4034 0,4567 0,2282

6 rs2010963 VEGF Controle C G 18/64/46 0,5 0,4761 0,7102

6 rs3025039 VEGF HCC T C 0/31/88 0,2605 0,2266 0,2138

6 rs3025039 VEGF Controle T C 0/37/91 0,2891 0,2473 0,07268

6 rs833061 VEGF HCC C T 16/59/44 0,4958 0,4723 0,6987

6 rs833061 VEGF Controle C T 21/54/53 0,4219 0,4688 0,2611

Resultados 49

5.3 Análise de associação com os genes MTHFR e VEGF e características do

tumor em pacientes com CHC e VHC

Com relação as características do tumor foram realizadas analises de

associação genética entre os genes MTHFR e VEGF e a classificação BCLC. Não foi

observada nenhuma associação estatisticamente significativa comparando a

frequência dos SNPs, com a classificação BCLC no estudo de associação alélica

(Tabela 3) assim como nos modelos genotípicos de associação para todas as

comparações (dados não mostrados).

Tabela 3 - Análise dos SNPs dos genes MTHFR e VEGF em pacientes com CHC e

VHC divididos de acordo com a classificação BCLC

CHR SNP Gene Minor

alelo

BCLC

(B/C)

BCLC

(A)

Major

alelo p-value OR (IC 95%)

1 rs1801131 MTHFR C 0,2193 0,2833 A 0,2595 0,7105 (0,3917-

1,289)

1 rs1801133 MTHFR T 0,2982 0,2667 C 0,5916 1,169 (0,6611-

2,066)

6 rs2010963 VEGF C 0,3333 0,3667 G 0,5932 0,8636 (0,5043-

1,479)

6 rs3025039 VEGF T 0,1316 0,125 C 0,8804 1,061 (0,4928-

2,283)

6 rs833061 VEGF C 0,4474 0,325 T 0,05446 1,681 (0,9884-

2,86)

Abreviações: SNP– single nucleotide polimorphisms; ; MTHFR– metilenotetrahidrofolato redutase;

VEGF– fator de crescimento endotelial vascular; CHC– carcinoma hepatocelular; VHC– vírus da

hepatite C; CHR– cromossomo; OR– odds ratio; IC– intervalo de confiança.Minor alelo- alelo menos

frequente, Major alelo – alelo mais frequente.

Resultados 50

Quando foi analisada a relação dos SNPs com a apresentação do número de

tumores, observamos que os genes MTHFR e VEGF tem influência no

desenvolvimento da apresentação dos tumores na forma de uninodular ou

multinodular. Os alelos C (rs1801131) MTHFR e C (rs2010963) VEGF foram

associados com a proteção para o desenvolvimento de CHC multinodular com uma

frequência alélica C (rs1801131) no gene da MTHFR de 0,18 vs 0,32 para os

pacientes com tumor multinodular e uninodular respectivamente, p=0.012 OR 0.46

IC (0.25-0.85), e frequência alélica C (rs2010963) no gene da VEGF de 0.27 vs 0.43,

p=0,009 OR 0,48 IC (0,28-0,84) para os pacientes com tumor multinodular e

uninodular respectivamente. Contrariamente o alelo T (rs1801133) MTHFR foi

associado com fator de risco para o desenvolvimento de CHC multinodular, com

uma frequência alélica no gene da MTHFR de 0,33 para os pacientes com tumor

multinodular, vs 0,21 para os pacientes com tumor uninodular, p=0,040 OR 1,83 IC

(1,02-3,29), após a correção de bonferroni para múltiplas associações apenas o

(rs2010963) no gene da VEGF mostrou-se significativo (tabela 4).

Resultados 51

Tabela 4 - Análise dos SNPs dos genes MTHFR e VEGF em pacientes com CHC e VHC divididos de acordo com o número de tumores

CHR SNP Gene Minor alelo Multinodular Uninodular Major alelo p-value OR (IC 95%)

1 rs1801131 MTHFR C 0,1855 0,3273 A 0,01267 0,4681 (0,2561-0,8555)

1 rs1801133 MTHFR T 0,3387 0,2182 C 0,04086 1,835 (1,022-3,297)

6 rs2010963 VEGF C 0,2742 0,4364 G 0,009456* 0,488 (0,2828-0,842)

6 rs3025039 VEGF T 0,1129 0,1455 C 0,4573 0,7477 (0,3468-1,612)

6 rs833061 VEGF C 0,4032 0,3636 T 0,5344 1,182 (0,6968-2,007)

*Estatisticamente significativo após correção de bonferroni para comparações múltiplas (p<0.01)

Abreviações: CHR-cromossomo; SNP- single nucleotide polimorphisms; ; MTHFR– metilenotetrahidrofolato redutase; VEGF– fator de crescimento endotelial vascular; CHC–

carcinoma hepatocelular; VHC– vírus da hepatite C; CHR– cromossomo; OR– odds ratio; IC– intervalo de confiança.

Resultados 52

Com relação a análise de modelos genotípicos de associação genica entre as

formas uninodular e multinodular, observamos associação estatisticamente

significativa para o gene MTHFR (rs1881131) nos modelos genotípico e dominante

(p=0.036) e (p=0.042, OR 2.18 IC 1.04-4.59), respectivamente, estando o genótipo

AA associado ao desenvolvimento do CHC na forma multinodular. Para o

(rs1801133) do gene MTHFR o modelo genético dominante foi o único com

associação significativa, com a presença do genótipo CT/TT associado com o

desenvolvimento do CHC na forma multinodular (p=0,04 OR 2,13 IC 1,01 - 4,54).

Em relação ao gene VEGF (rs2010963) foi observado associação estatisticamente

significativa nos modelos genotípico e recessivo, sendo os genótipos GG/GC

associados com o desenvolvimento do CHC na forma multinodular (p=0,018) e

(p=0,005, OR 4.95 IC 1.52-16.13), respectivamente (Tabela 5).

Resultados 53

Tabela 5 - „Análise dos modelos de associação genética dos genes MTHFR e VEGF

em pacientes com CHC e VHC divididos de acordo com o número de

tumores

Gene (SNP) Multinodular

(62)

Uninodular

(55)

Modelo de

associação p-valor OR (IC 95%)

MTHFR

(rs1881131)

AA 40 (0,64) 25 (0,45) AA vs AC vs CC p=0,036

AC 21 (0,34) 24 (0,44) AA/AC vs CC p=0,050; 7,47 (0,87-64,17)

CC 1 (0,02) 6 (0,11) AA vs AC/CC p=0,042, 2,18 (1,04-4,59)

(rs1801133)

CC 28 (0,45) 35 (0,64) CC vs CT vs TT p= 0,150

CT 26 (0,42) 16 (0,29) CC/CT vs TT p=0,372, 0,53 (0,15-1,87)

TT 8 (0,13) 4 (0,07) CT/TT vs CC p=0,04, 2,13 (1,01 – 4,54)

VEGF

(rs2010963)

GG 32 (0,52) 21 (0,38) GG vs GC vs CC p=0,018

GC 26 (0,42) 20 (0,36) GG/GC vs CC p=0,005, 4,95 (1,52-16,13)

CC 4 (0,06) 14 (0,26) GG vs GC/CC p=0,192, 1,73 (0,82-3,61)

(rs3025039)

CC 48 (0,77) 39 (0,71) CC vs CT vs TT p=0,525

CT 14 (0,23) 16 (0,29) CC/CT vs TT -

TT 0 (0) 0 (0) CC vs CT/TT p=0,525, 1,41 (0,61-3,23)

(rs833061)

TT 21 (0,34) 22 (0,40) TT vs TC vs CC p=0,815

TC 32 (0,52) 26 (0,47) TT/TC vs CC p=0,999, 0,85 (0,30-2,48)

CC 9 (0,14) 7 (0,13) TT vs TC/CC p=0,565, 0,77 (0,36-1,63)

Resultados 54

Avaliamos também as características clínicas do tumor e laboratoriais que

apresentaram diferença estatisticamente significativa quando relacionadas com a

classificação BCLC, demonstradas na tabela 1, que foram, a média do nível sérico de

AFP, a classificação de Child-Pugh, a média do tamanho do tumor, e sua relação

com o melhor modelo genético observado na tabela 5 para os genes MTHFR

(rs18011131 e rs1801133) e VEGF (rs2010963). Contudo, não foi observada

diferença significativa com nenhuma das variáveis supracitadas (Tabela 6).

Resultados 55

Tabela 6 - Características laboratoriais e do tumor de pacientes com CHC e VHC em relação aos genótipos dos genes MTHFR

(rs18011131 e rs1801133) e VEGF (rs2010963)

* Pacientes com tumores multinodulares foi considerado o tamanho do maior tumor

Variável

MTHFR rs1801131

P

MTHFR rs1801133

P

VEGF rs2010963

P AA

(n=60)

AC+CC

(n=48)

CC

(n=60)

CT+TT

(n=48)

CC

(n=18)

CG+GG

(n=99)

AFP (ng/mL) 29,5

(1,73-60.500)

60,9

(1,80-4770) 0,65

47,5

(1,73-20302)

26,4

(1,97- 60.500) 0,45

16,7

(1,80-530)

36,7

(1,73-60.500) 0,14

Child-Pugh AA

(n=64)

CA+CC

(n=51)

CC

(n=62)

CT+TT

(n=53)

CC

(N=17)

CG+GG

(n=98)

A 41 (64%) 29 (57%) 0,43

39 (63%) 31 (58%) 0,62

9 (53%) 59 (60%) 0,57

B/C 23 (36%) 22 (43%) 23 (37%) 22 (42%) 8 (47%) 39 (40%)

BCLC AA

(n=65)

CA+CC

(N=52)

CC

(N=63)

CT+TT

(N=54)

CC

(N=18)

CG+GG

(N=99)

A 31 (48%) 29 (56%) 0,38

34 (54%) 26 (48%) 0,53

10 (55%) 50 (50%) 0,79

B/C 34 (52%) 23 (44%) 29 (46%) 28 (52%) 8 (45%) 49 (50%)

Tamanho do

tumor*

CHC (cm)

3,7 (1,3-13,8) 4,0 (0,5-13) 0,96 3,9 (0.5-9,0) 3,75 (1,3-13,8) 0,76 3,2 (1,6-13) 3,9 (0,5-13,8) 0,63

Resultados 56

Na análise de regressão logística binária, ajustada para as variáveis sexo e idade,

observamos que, para o gene do VEGF (rs2010963), os genótipos GG/GC é fator de risco

independente no desenvolvimento do CHC da forma multinodular p =0,013, 4,78 (1,38 –

16,67) (Tabela 7).

Tabela 7 - Análise de regressão logística para predizer ocorrência de tumores

multinodulares em 117 pacientes com CHC e VHC

Abreviações: CHC- carcinoma hepatocelular; VHC- vírus da hepatite C; OR- odds ratio; IC-

intervalo de confiança; MTHFR- metilenotetrahidrofolato redutase; VEGF- fator de

crescimento endotelial vascular

Variáveis p-value OR 95% I.C.

Idade 0,868 1,004 0,958 1,053

Sexo Masc. 0,098 2,099 0,873 5,049

MTHFR (rs1801131- AA) 0,335 1,506 0,655 3,465

MTHFR (rs1801133 - CC) 0,132 0,537 0,240 1,205

VEGF (rs2010963 – GG/GC) 0,013 4,78 1,38 16,67

Resultados 57

5.4 Análise da frequência alélica dos genes MTHFR e VEGF nas populações

de Recife, Europeia e Africana

A Tabela 8 compila as frequências alélicas da população obtida nesse estudo

de indivíduos de banco de sangue e das populações do 1000 genomes Europeia

(EUR) e Africa (AFR) para critério de comparação.

Tabela 8 - Frequência alélica dos genes MTHFR e VEGF nas populações de

Recife (REC) estudada, Europeia (EUR) e Africana (AFR)

** De acordo com 1000 genomes

* Indivíduos do estudo ....

Abreviações: MTHFR- metilenotetrahidrofolato redutase; VEGF – fator de crescimento endotelial

vascular; REC- Recife; EUR- Europeia; AFR- Africana; SNP - single nucleotide polimorphisms.

MAF- Minor allele frequency (frequência do alelo menor)

Gene SNP Cromossomo Troca Alelo

polimórfico

Frequência

REC

(MAF)*

Frequência

EUR(MAF)

**

Frequência

AFR(MAF)

**

MTHFR rs1801131 1 p36.22 A1298C C 0,23 0,31 0,15

MTHFR rs1801133 1 p36.22 C677T T 0,31 0,36 0,09

VEGF rs2010963 6 p21.1 G634C C 0,39 0,31 0,32

VEGF rs3025039 6 p21.1 C936T T 0,14 0,12 0,08

VEGF rs833061 6 p21.1 T460C C 0,37 0,50 0,32

Resultados 58

5.5 Análise de sobrevida dos pacientes com CHC e VHC, estratificados pelos

genótipos dos genes MTHFR (rs1801131), MTHFR (rs1801133) e VEGF

(rs2010963)

Na Análise de sobrevida foram avaliados 92 pacientes com CHC e VHC,

estratificados pelos genótipos dos genes MTHFR (rs1801131), MTHFR (rs1801133)

e VEGF (rs2010963), genes estes, que demostraram associação estatisticamente

significativa, com relação a forma de apresentação do tumor, se uninodular ou

multinodular.

Na análise do gene MTHFR (rs180133), em que o alelo T confere risco do

desenvolvimento da forma multinodular, não foi observada relação estatisticamente

significativa (p=0,968) (Figura 11). No gene MTHFR (rs1801131), em que o alelo C

confere proteção para a forma multinodular, também não foi observada relação

estatisticamente significativa (p=0,774) (Figura 12). E no gene VEGF (2010963),

onde o alelo C confere proteção para a forma multinodular, não foi observada relação

estatisticamente significativa (p=0,882) (Figura 13), com relação a análise de

sobrevida.

Resultados 59

Figura 11 - Análise de sobrevida de 92 pacientes com CHC infectados pelo vírus

da hepatite C estratificados pelos genótipos do gene MTHFR

(rs181133), o teste de Logrank (Mantel-cox) foi realizado, contudo

não foi observada uma relação estatisticamente significativa p=0,968

Resultados 60

Figura 12 - Análise de sobrevida de 92 pacientes com CHC infectados pelo vírus da

hepatite C estratificados pelos genótipos do gene MTHFR (rs181131),

o teste de Logrank (Mantel-cox) foi realizado, contudo não foi

observada uma relação estatisticamente significativa p=0,774

Resultados 61

Figura 13 - Análise de sobrevida de 92 pacientes com CHC infectados pelo vírus

da hepatite C estratificados pelos genótipos do gene VEGF

(rs2010963), o teste de Logrank (Mantel-cox) foi realizado, contudo

não foi observada uma relação estatisticamente significativa p=0,882

6 Discussão

Discussão 63

6 DISCUSSÃO

O presente estudo teve como interesse, estimar a frequência dos

polimorfismos do gene do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)

rs2010963, rs3025039, rs833061 e da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)

rs1801131 e rs1801133 em pacientes com carcinoma hepatocelular infectados com o

vírus da hepatite C na população atendida em centros de referência em hepatologia

na cidade do Recife, e avaliar a presença de associação entre estes polimorfismos e

características clínicas, laboratoriais e do tumor, utilizando ainda, nas análises, as

classificações de Child-Pugh, BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer) e sobrevida

dos pacientes.

Neste estudo, todos os pacientes que foram avaliados, eram cirróticos, e o

diagnóstico de CHC foi dado por método de imagem, através de algoritmo validado

em 2005 que utiliza como critério radiológico, a presença de realce intenso da lesão

na fase arterial do contraste e lavagem do contraste (washout) nas fases venosas

tardias (150)

, exceto um paciente que foi transplantado pela disfunção hepática, e o

diagnóstico de CHC foi dado como achado do explante. Dos 119 pacientes

estudados, 70 (59%) foram homens, com idade média de 62,3 anos, dados

condizentes com o estudo epidemiológico de Carrilho F.J. et al. (2010) que avaliou

1.405 pacientes de todas as regiões do Brasil (8)

. A variável laboratorial alfa 1

fetoproteina, também apresentou um aumento estatisticamente significativo, no seu

valor médio, de acordo com o aumento na graduação de estadiamento do BCLC

(p=0,002).

Discussão 64

A AFP é uma glicoproteína sérica de cadeia simples, detectada pela primeira

vez em 1963. Possui um peso molecular de 70 kDa e é produzida principalmente no

hepatócito fetal, nas células do trato gastrointestinal fetal e no saco vitelino. Foi

inicialmente descrita como específica para o CHC e carcinoma de células

embrionárias. Ela tem meia vida de aproximadamente 4 a 5 dias e sua função

fisiológica é desconhecida (69)

. Em indivíduos saudáveis, a síntese de AFP para no

nascimento (70)

. Liu C et al. (2013), em estudo de uma coorte chinesa retrospectiva,

observaram que os altos níveis de alfa 1 fetoproteína, estavam correlacionados com o

tamanho maior do tumor, invasão vascular e a baixa diferenciação do tumor (155)

.

Corroborando com nosso achado de AFP mais alta nos estágios mais avançados do

BCLC, onde gradualmente vai ocorrendo aumento do tumor, podendo ocorrer

aumento do número de nódulos e invasão vascular, bem como doença extra-hepática.

A Angiogênese é um processo fundamental que envolve a fisiologia normal

dos órgãos, o desenvolvimento de tecidos de reparação e uma variedade de processos

patológicos (99)

. O VEGF pode estimular diretamente o crescimento de novos vasos

sanguíneos (156)

e tem um importante papel na angiogênese do CHC (120)

. O estudo de

Yao (2005), sugere que o nível sérico do VEGF se correlaciona com o estágio do

tumor e o comportamento mais agressivo do CHC (157)

. Alterações nos níveis

plasmáticos do VEGF podem estar relacionados com a presença de polimorfismos no

gene do VEGF, alguns estudos correlacionam polimorfismos no VEGF e o

aparecimento de CHC (115, 158)

.

Neste estudo, ao fazer as análises de associação genética com a classificação

BCLC, não foi encontrado associação estatisticamente significativa entre os grupos

BCLC (B/C) e (A). O Estudo de Baitello et al. (2016) avaliou o polimorfismo no

Discussão 65

gene do VEGF (C936T- rs3025039) em 102 pacientes com diagnóstico de CHC, da

população de São Paulo, e correlacionou com a classificação de BCLC, mas também

não encontrou associação (159)

. Wu et al. (2013) mostraram uma associação do CHC

em pacientes com VHB, com o polimorfismo no gene do VEGF (rs833061), mas não

fez a correlação com o BCLC (115)

. Contudo, Kong et al. (2007) avaliaram 416

pacientes coreanos, com diagnóstico de CHC de diferentes etiologias e analisou 19

polimorfismos no gene do VEGF. Na avaliação do gene VEGF (rs2010963), o

genótipo GG esteve associado com o aumento do tamanho do tumor e ainda com

estágio mais avançado do BCLC (p=0,025), porém não encontrou associação com o

número de nódulos (116)

.

O presente estudo observou que os genótipos GG/GC (rs2010963) do gene

VEGF apresentou significância estatística tanto na análise univariada assim como na

multivariada como fator de risco para o desenvolvimento do CHC na forma

multinodular. De fato, esse SNP (rs2010963) está localizado na região não traduzida

5‟(5‟-UTR) regulatória do gene VEGF (-634) (116)

, já é demostrado que essa variante

é capaz de afetar o padrão de expressão genica e consequentemente alterar a síntese

da proteína ativa do VEGF. O polimorfismo nessa região (genótipo CC) tem sido

associado com diminuição da expressão do gene VEGF, e dessa forma, os genótipos

GG/GC estariam associados com uma maior expressão do gene e consequentemente

aumento da angiogênese levando a uma tumorogênese mais acentuada repercutindo

em formas multinodulares (160)

. Park et al. (2000) observaram que os níveis de VEGF

aumentavam progressivamente a medida que os nódulos evoluíam de displasia de

baixo grau, displasia de alto grau e CHC precoce (120)

. O estudo de Deli e cols. (2005)

relatou uma expressão VEGF positiva, usando imunohistoquímica, em 72 dos 105

Discussão 66

pacientes com CHC (68,6%) (122)

. A expressão do VEGF no tumor com invasão

venosa microscópica está significativamente maior do que nos CHC sem invasão

venosa microscópica (123)

. Outros estudos, embora com um número pequeno de

pacientes, têm demostrado um a associação do genótipo GG (rs2010963) com

neoplasia de tumores sólidos como, câncer coloretal (161)

e osteossarcoma (162)

,

A relação entre o polimorfismo no gene MTHFR (rs1801133) e o CHC vem

sendo estudada, mas os resultados são controversos (146, 147)

. Jin et al. (2009)

conduziram uma meta análise que evidenciou que o polimorfismo no gene MTHFR

(rs1801133), aumenta o risco de CHC especialmente nos pacientes europeus com

doença hepática crônica. Nesta avaliação dez estudos mostraram que o genótipo TT

aumenta o risco de CHC quando comparado ao genótipo CT. Porém conclui-se que

esta associação necessita de mais estudos em outras etnias (148)

. O estudo de Kwak et

al. (2008), realizado em população coreana, não mostrou associação entre os

polimorfismos nos genes MTHFR (rs1801133) e MTHFR (rs1801131) e o risco de

CHC (163)

.

Analisamos os SNPs do gene MTHFR (rs1881131 e rs1801133) nos pacientes

com CHC e VHC com relação a todas as variáveis clínicas, porém só encontramos

resultado estatisticamente significativo, com relação à forma de apresentação do

tumor, se uninodular ou multinodular no modelo univariado sendo o genótipo AA do

rs1801131 e os CT/TT do rs1801133 relacionados com o risco para forma

multinodular. Estudos funcionais sobre variantes do gene MTHFR demostraram que

a variante rs1801133-TT tem sido relacionada com a diminuição da atividade da

enzima responsável pela reparação do DNA e consequentemente do surgimento do

CHC (146, 147, 163-165)

, adicionalmente em uma meta-analise, foi observado que o

Discussão 67

genótipo CC do rs1881131 está associado como fator de proteção em pacientes com

hepatocarcinoma (166)

e em outras neoplasias (167)

.

O estudo de Kuo et al. (2014), na população de Taiwan, não encontrou

diferença estatística quando avaliou o gene MTHFR (rs1801133) e sua relação com o

número de nódulo (168)

. Os resultados divergentes encontrados nas diferentes

populações sugerem que os SNPs sofrem interferência de fatores ambientais e da

composição étnica da população, demonstrado nos resultados dos estudos em

diferentes populações. Neste estudo foi demostrado uma diferença entre as SNPs

estudadas em relação ao MAF encontrado em população europeia e africana, esse

fato sugere um componente genético heterogêneo importante que pode influenciar

em fenótipos clínicos específicos da nossa população.

Na análise de sobrevida, o estudo de Kong et al. (2007) avaliou a relação do

polimorfismo do gene VEGF (rs2010963), em 416 pacientes coreanos, e evidenciou

um aumento da sobrevida associada ao genótipo CC (p=0,023) (116)

. Quando da

análise de sobrevida, foi utilizado dados de 92 pacientes com CHC e VHC,

estratificados pelos genótipos dos genes MTHFR (rs1801131), MTHFR (rs1801133)

e VEGF (rs2010963). Nesta nossa casuística, não foi observado relação

estatisticamente significante. Provavelmente o tamanho amostral pequeno limitou o

poder desta análise.

Este estudo foi o primeiro a analisar características do tumor em pacientes

com HCC infectados com HCV associando polimorfismos dos genes MTHFR e

VEGF em uma população etnicamente miscigenada revelando importantes achados

sobre a influência desses polimorfismos na forma de apresentação dos tumores.

Contudo, mais estudos são necessários para confirmar essa hipótese em outras

Discussão 68

populações com outras etiologias e com estratificação para a apresentação do tumor,

além de estudos funcionais do impacto dessas variantes na produção da molécula

ativa. Portanto, esse tipo de abordagem poderá trazer avanços na conduta clínica dos

pacientes com CHC infectados com VHC e consequentemente irá impactar no

prognostico e medidas terapêuticas.

7 Conclusões

Conclusões 70

7 CONCLUSÕES

1. Este estudo analisou a relação dos genes MTHFR e VEGF nos pacientes com

CHC e VHC com relação a todas as variáveis clínicas, e encontramos que em

ambos genes, MTHFR (rs1801131) e VEGF (rs2010963) os alelos C

conferem proteção para o desenvolvimento do CHC na sua forma

multinodular, enquanto que no gene MTHFR (rs1801133) o alelo T confere

risco para o desenvolvimento de CHC na forma multinodular.

2. Ao fazer análise de regressão logística, apenas o alelo C da VEGF

(rs2010963) é fator de proteção independente para o desenvolvimento da

forma multinodular do carcinoma hepatocelular.

3. Não foi evidenciada associação dos genes MTHFR (rs1801131), MTHFR

(rs1801133) e VEGF (rs2010963) na análise de sobrevida na população

estudada.

8 Anexos

Anexos 72

ANEXO A- Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa.

Anexos 73

ANEXO B- Termo de consentimento livre e esclarecido.

HOSPITAL UNIVERSITÁRIO OSWALDO CRUZ

DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE PERNAMBUCO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

I- DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL

1- Nome do paciente............................................................................ ....................................

Documento de Identidade N°.....................................Sexo: .................................................

Data de Nascimento:............/............./.......................

Endereço:..................................................................................................................................

Bairro:.........................................................................Cidade....................................... ...........

CEP.............................................................................Telefone( ).................................. .

2- Responsável legal:........................................................................................................... .....

Natureza (grau de parentesco, tutor, curador etc).....................................................................

Documento de Identidade:..........................................Sexo......................................................

Data de Nascimento:........../............../.........................

Endereço:.................................................................................................................... ..............

Bairro:.........................................................................Cidade..................................................

CEP.............................................................................Telefone( )......................... ..........

II – DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA

1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: Avaliação dos polimorfismos A1195G, G765C,

T8473C do gene da ciclooxigenase 2 (Cox-2), polimorfismos C2578A, G634C, C460T, C936T do

gene do Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e polimorfismos C677T e C1298A da

Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) em pacientes com Carcinoma hepatocelular e vírus da

hepatite C

2. PESQUISADORA: Sylene Coutinho Rampche de Carvalho

CARGO/FUNÇÃO: Médica INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL N° 11715

UNIDADE DO HUOC/UPE: AMBULATÓRIO HEPATOLOGIA

3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:

RISCO MÍNIMO

(Probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano como consequência imediata ou tardia do estudo)

Anexos 74

III – REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU

REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA CONSIGNADO:

1. Justificativa e objetivos da pesquisa

O câncer resulta da combinação de alterações genéticas e elementos externos.

O VHC, é na nossa população, uma importante etiologia para a cirrose hepática culminando

com o CHC. O mecanismo de carcinogênese no CHC, como em outros tipos de câncer permanece

ainda não muito claro. Embora o CHC ocorra em fígados que são afetados pela doença de base como

cirrose pela hepatite C, acredita-se que alterações genéticas sejam a base desta patologia. Alguns

estudos vem sendo conduzidos para investigar a associação entre polimorfismos genéticos e o risco de

CHC, mas os resultados são controversos.

Convidamos o(a) Senhor(a) a participar de uma pesquisa que tem por objetivo avaliar os

polimorfismos A1195G, G765C, T8473C do gene da ciclooxigenase 2 (Cox-2), polimorfismos

C2578A, G634C, C460T, C936T do gene do Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e

polimorfismos C677T e C1298A da Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) em pacientes com

Carcinoma hepatocelular e vírus da hepatite C. Com essa avaliação será possível identificar fator de

risco genético para o desenvolvimento de câncer gástrico em pacientes portadores de hepatite C. Este

estudo será conduzido pela pesquisadora executante Sylene Coutinho Rampche de Carvalho, no

Hospital Universitário Osvaldo Cruz de Pernambuco, localizado na Rua Arnóbio Marques 310- Santo

Amaro- Recife- PE – CEP: 50100-130 Campus Universitário- Tel 81-34230501.

Solicitamos que leia cuidadosamente este termo de consentimento e faça qualquer pergunta para

esclarecer todas as dúvidas antes de concordar em participar deste estudo.

2- Procedimentos que serão utilizados e propósitos, incluindo a identificação dos procedimentos

que são experimentais:

A pesquisa consistirá num estudo completo do seu fígado abrangendo perguntas gerais,

perguntas relacionadas à hábitos alimentares, breve exame físico, colheita de sangue para exames

laboratoriais. Também serão realizadas medidas denominadas antropométricas que consistem em

peso, altura, circunferência de abdome.

O sangue coletado será enviado para o laboratório de pesquisa no setor de biologia molecular na

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

3- Desconforto e riscos esperados:

A entrevista e o exame físico deverão ter uma duração média de 15-20 minutos, os

desconfortos da colheita de sangue serão os mesmos de qualquer exame laboratorial, incluindo

desconforto no local da punção. A avaliação nutricional com determinação de medidas

antropométricas também não acarreta desconfortos.

4- Benefícios que poderão ser obtidos:

As alterações diagnosticadas durante o estudo serão documentadas e esta informação poderá

trazer benefícios à sua pessoa sob a forma de orientação ambulatorial mais eficaz. Não há garantia dos

benefícios que possam resultar da sua participação neste estudo, exceto o acompanhamento

ambulatorial. Por outro lado, o conhecimento adquirido neste estudo poderá beneficiar outras pessoas.

5-Procedimentos alternativos que possam ser vantajoso para o indivíduo:

O(A) Sr(a) tem a alternativa de não participar desta pesquisa caso não o deseje.

Anexos 75

IV – ESCLARECIMENTOS DADOS PELO ORIENTADOR SOBRE GARANTIAS DO

SUJEITO DA PESQUISA CONSIGNADO:

1. Acesso, a qualquer tempo, às informações sobre procedimentos, riscos e benefícios relacionados à

pesquisa, inclusive para dirimir eventuais dúvidas. As informações do questionário e de sua avaliação

estarão à sua disposição sempre que desejar, e o(a) Sr(a) tem toda liberdade de fazer perguntas caso

tenha alguma dúvida.

2. Liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e de deixar de participar do estudo,

sem que isto traga prejuízo à continuidade da assistência. O(A) Sr(a) poderá se retirar da pesquisa a

qualquer momento, sem precisar se justificar, e continuar a gozar de todos os direitos como paciente.

3. Salvaguarda da confidencialidade, sigilo e privacidade: As informações aqui reunidas serão

sigilosas e somente serão divulgadas para a equipe de saúde que cuida do seu caso, a fim de que seu

atendimento seja o melhor possível, ou para estudos e publicações científicas, sendo que neste caso

seu nome e sua identidade não serão conhecidos.

4. A disponibilidade de assistência no ambulatório de Hepatologia, por eventuais danos à saúde.

5. Viabilidade de indenização por eventuais danos à saúde decorrentes da pesquisa: O acesso ao

projeto é de forma voluntária e não está prevista nenhuma idenização. O paciente expressa ainda sua

concordância e vontade em se submeter aos exames referidos, assumindo a responsabilidade e risco

pelos eventuais efeitos indesejáveis que venham ocorrer em decorrência do mesmo.

V. INFORMAÇÓES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS

PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE

INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS.

Dra Sylene Coutinho Rampche de Carvalho Fone: 3465 4959

Comitê de ética do Hospital Universitário Osvaldo Cruz Fone: 2101 1536

VI. CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO

Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi

explicado, consinto em participar do presente Protocolo de Pesquisa, bem como autorizo a saída de

minha amostra de sangue coletada para processamento da pesquisa na Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo.

Recife,__________________________________

________________________________________

assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal

________________________________________

assinatura da testemunha

_________________________________________

assinatura do pesquisador (carimbo ou nome legível)

9 Referências

Referências 77

9 REFERÊNCIAS

1. Shiffman ML. Natural history and risk factors for progression of hepatitis C

virus disease and development of hepatocellular cancer before liver transplantation.

Liver Transpl. 2003;9(11):S14-20.

2. Sangiovanni A, Prati GM, Fasani P, Ronchi G, Romeo R, Manini M, Del

Ninno E, Morabito A, Colombo M. The natural history of compensated cirrhosis due

to hepatitis C virus: A 17-year cohort study of 214 patients. Hepatology.

2006;43(6):1303-10.

3. Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis

C virus infection. Nat Rev Immunol. 2005;5(3):215-29.

4. WHO. Globocan 2012. Disponível em:

globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx2012 [cited 2018 09/08].

5. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics. Cancer J

Clin. 2005;55:74-108.

6. Ioannou GN, Splan MF, Weiss NS, McDonald GB, Beretta L, Lee SP.

Incidence and predictors of hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis. Clin

Gastroenterol Hepatol. 2007;5(8):938-45, 45 e1-4.

7. Kikuchi L, Chagas AL, Alencar RS, Paranagua-Vezozzo DC, Carrilho FJ.

Clinical and epidemiological aspects of hepatocellular carcinoma in Brazil. Antivir

Ther. 2013;18(3 Pt B):445-9.

8. Carrilho FJ, Kikuchi L, Branco F, Goncalves CS, Mattos AA; Brazilian HCC

Study Group. Clinical and epidemiological aspects of hepatocellular carcinoma in

Brazil. Clinics (São Paulo). 2010;65(12):1285-90.

Referências 78

9. Berlau J, Glei M, Pool-Zobel BL. Colon cancer risk factors from nutrition.

Anal Bioanal Chem. 2004;378(3):737-43.

10. Patil VM, Gupta SP, Samanta S, Masand N. Current perspective of HCV

NS5B inhibitors: a review. Curr Med Chem. 2011;18(36):5564-97.

11. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M.

Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis

genome. Science. 1989;244:359-62.

12. Hijikata M, Kato N, Ootsuyama Y, Nakagawa M., Shimotohno k. Gene

mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro

processing analysis. Biochemistry. 1991;88:5547-51.

13. Kaito M, Watanabe S, Tsukiyama-Kohara K, Yamaguchi K, Kobayashi Y,

Konishi M, Yokoi M, Ishida S, Suzuki S, Kohara M. Hepatitis C virus particle

detected by immunoelectronmicroscopic study. J Gen Virol. 1994;75(7):1755-60.

14. Penin F, Dubuisson J, Rey FA, Moradpour D, Pawlotsky J. Structural biology

of hepatitis C virus. Hepatology. 2004;39(1):5-19.

15. Jing G, Lee J, Lee K. Chemical genetics-based development of small

molecules targeting hepatitis C virus. Arch Pharm Res. 2017;40(9):1021-36.

16. Bartenschlager R, Lohmann V. Novel cell culture systems for the hepatitis C

virus. Antiviral Res. 2001;52(1):1-17.

17. Barone AA. Hepatite por VHC - Aspectos virológicos e suas implicações

práticas. I Consenso da Sociedade Brasileira de Infectologia para o Manuseio e

Terapia da hepatite C. São Paulo: Sociedade Brasileira de Infectologia; 2008. p.20-3.

18. Smith DB, Bukh J, Kuiken C, Muerhoff AS, Rice CM, Stapleton JT,

Simmonds P. Expanded classification of hepatitis C virus into 7 genotypes and 67

Referências 79

subtypes: updated criteria and genotype assignment web resource. Hepatology.

2014;59:318-27.

19. Simmonds P, Bukh J, Combet C , Del´eage G, Enomoto N, Feinstone S,

Halfon P, Inchausp´e G, Kuiken C, Maertens G, Mizokami M, Murphy DG,

Okamoto H, Pawlotsky J, Penin F, Sablon E, Shin-I T, Stuyver L J, Thiel H, Viazov

S, Weiner AJ, Widell A. Consensus Proposals for a Unified System of Nomenclature

of Hepatitis C Virus Genotypes. Hepatology. 2005;42(4):962-73.

20. Pereira LM, Spinelli V, Ximenes RA, Cavalcanti MS, Melo R, Jucá N,

Mizokami M, McFarlane IG. Chronic hepatitis C infection: influence of the viral

load, genotypes, and GBV-C/HGV coinfection on the severity of the disease in a

Brazilian population. J Med Virol. 2002;67(1):27-32.

21. Alter HJ, Conry-Cantinela C, Melpolder J, De Tan, Van Raden M, Herion D,

Lau D, Hoofnagle JH. Hepatitis C in asymptomatic blood donors. Hepatology.

1997;26(3 (suppl 1)):29-33.

22. Seeff LB. The history of the„„natural history‟‟of hepatitis C (1968-2009).

Liver Int. 2009;29(Suppl 1):89-99.

23. Chevaliez S, Pawlotsky JM. Diagnosis and management of chronic viral

hepatitis: antigens, antibodies and viral genomes. Best Pract Res Clin Gastroenterol.

2008;22(6):1031-48.

24. Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis. Gastroenterology.

2008;134(6):1655-69.

25. Marcellin P. Hepatitis B and hepatitis C in 2009. Liver Int. 2009;29(Suppl

1):1-8.

26. Di Bisceglie AM. Natural history of hepatitis C: its impact on clinical

management. Hepatology. 2000;31(4):1014-8.

Referências 80

27. Missiha SB, Ostrowskim M, Heathcote EJ. Disease progression in chronic

hepatitis C: modifiable and nonmodifiable factors. Gastroenterology.

2008;134(6):1699-714.

28. Harris DR, Gonin R, Alter HL, Wright EC, Buskell ZJ, Hollinger FB, Seeff

LB; National Heart, Lung and Blood Institute Study Group. The relationship of acute

transfusion-associated hepatits to the development of cirrhosis in the presence of

alcohol abuse. Ann Intern Med. 2001;134(2):120-4.

29. Seef LB. Natural history of chronic hepatitis C. Hepatology. 2002;36(5):S35-

S46.

30. Wiley TE, Brown J, Chan J. Hepatitis C infection in African Americans:Its

natural history and histological progression. Am J Gastroenterol. 2002;97(3):700-6.

31. Pessione F, Ramond MJ, Njapoum C, Duchatelle V, Degott C, Erlinger S,

Rueff B, Valla DC, Degos F. Cigarette smoking and hepatic lesions in patients with

chronic hepatitis C. Hepatology. 2001;34(1):121-5.

32. El-Zayadi AR. Heavy smoking and liver. World J Gastroenterol.

2006;12(38):6098-101.

33. Scognamiglio P, Galati V, Navarra A, Longo MA, Aloisi MS, Antonini MG,

Puoti M, Almasio PL, Ippolito G, Girardi E. Impact of hepatitis C virus infection on

lifestyle. World J Gastroenterol. 2007;13(19):2722-6.

34. Chu C, Lee S. Hepatitis B virus/hepatitis C virus coinfection:epidemiology,

clinical features, viral interactions and treatment. J Gastroenterol Hepatol.

2008;23(4):512-20.

35. Cheruvu S, Marks K, Talal AH. Understanding the pathogenesis and

management of hepatitis B/HIV and hepatitis B/ hepatitis C virus coinfection. . Clin

Liver Dis. 2007;11(4):917-43.

Referências 81

36. Roe B, Hall WW. Cellular and molecular interactions in coinfection with

hepatitis C vírus and human immunodeficiency vírus. Expert Rev Mol Med.

2008;10(e30):1-19.

37. Veldt BJ, Chen W, Heathcote EJ, Wedemeyer H, Reichen J, Hofmann WP,

Knegt RJ, Zeuzem S, Manns MP, Hansen BE, Schalm SW, Janssen HLA. Increased

risk of hepatocellular carcinoma among patients with hepatitis c cirrhosis and

diabetes mellitus. Hepatology. 2008;47(6):1856- 62.

38. Chen CI, Yang HI, Yang WS, Liu CJ, Chen PJ, You SL, Wang LY, Sun CA,

Lu SN, Chen DS, Chen CJ. Metabolic factors and risk of hepatocellular carcinoma

by chronic hepatitis B/C infection. A follow up study in Taiwan. Gastroenterology.

2008;135(1):111-21.

39. Davila JA, Morgam RO, Shaib Y, McGlynn KA, El-Serag HB. Diabetes

increases the risk of hepatocellular carcinoma in the United States: a population

based case control study. Gut. 2005;54(4):533-9.

40. Yu MC, Yuan JM. Environmental factors and risk for hepatocellular

carcinoma. Gastroenterology. 2004;127(5 Suppl 1):S72-8.

41. Santantonio T, Wiegand J, Gerlach JT. Acute hepatitis C: current status and

remaining challenges. J Hepatol. 2008;49(4):625-33.

42. Afdhal NH. The natural history of hepatitis C. Semin Liver Dis.

2004;24(Suppl 2):3-8.

43. Thompson CJ, Rogers G, Hewson P, Wright D, Anderson R, Cramp M,

Jackson S, Ryder S, Price A, Stein K. Surveillance of cirrhosis for hepatocellular

carcinoma: systematic review and economic analysis. Health Technol Assess.

2007;11(34):1-206.

Referências 82

44. Venook AP, Papandreou C, Furuse J, Guevara LL. The incidence and

epidemiology of hepatocellular carcinoma: a global and regional perspective.

Oncologist. 2010;15(4):5-13.

45. Akinyemiju T, Abera S, Ahmed M, Alam N, Alemayohu M A, Allen C, Al-

Raddadi R, Alvis-Guzman N, Amoako Y, Artaman A, Ayele TA, Barac A, Bensenor

I, Berhane A, Bhutta Z, Castillo-Rivas J, Chitheer A, Choi JY, Cowie B, Dandona L,

Dandona R, Dey S, Dicker D, Phuc H, Ekwueme DU, Zaki MS, Fischer F, Fürst T,

Hancock J, Hay SI, Hotez P, Jee SH, Kasaeian A, Khader Y, Khang YH, Kumar A,

Kutz M, Larson H, Lopez A, Lunevicius R, Malekzadeh R, McAlinden C, Meier T,

Mendoza W, Mokdad A, Moradi-Lakeh M, Nagel G, Nguyen Q, Nguyen G, Ogbo F,

Patton G, Pereira DM, Pourmalek F, Qorbani M, Radfar A, Roshandel G, Salomon

JA, Sanabria J, Sartorius B, Satpathy M, Sawhney M, Sepanlou S, Shackelford K,

Shore H, Sun J, Mengistu DT, Topór-Mądry R, Tran B, Ukwaja, Vlassov V, Vollset

SE, Vos T, Wakayo T, Weiderpass E, Werdecker A, Yonemoto N, Younis M, Yu C,

Zaidi Z, Zhu L, Murray CJL, Naghavi M, Fitzmaurice C; Global Burden of Disease

Liver Cancer Collaboration. The burden of primary liver cancer and underlying

etiologies from 1990 to 2015 at the global, regional, and national level results from

the Global Burden of Disease Study 2015. JAMA Oncol. 2017;3:1683-91.

46. Kim K, Choi S, Park SM. Association of fasting serum glucose level and type

2 diabetes with hepatocellular carcinoma in man with chronic hepatitis B infection: a

large cohort study. Eur J Cancer. 2018;102:103-13.

47. Schlesinger S, Aleksandrova K, Pischon T, Jenab M, Fedirko V, Trepo E,

Overvad K, Roswall N, Tjønneland A, Boutron-Ruault MC, Fagherazzi G, Racine A,

Kaaks R, Grote VA, Boeing H, Trichopoulou A, Pantzalis M, Kritikou M, Mattiello

A, Sieri S, Sacerdote C, Palli D, Tumino R, Peeters PH, Bueno-de-Mesquita HB,

Weiderpass E, Quirós JR, Zamora-Ros R, Sánchez MJ, Arriola L, Ardanaz E, Tormo

MJ, Nilsson P, Lindkvist B, Sund M, Rolandsson O, Khaw KT, Wareham N, Travis

RC, Riboli E, Nöthlings U. Diabetes mellitus, insulin treatment, diabetes duration,

and risk of biliary tract cancer and hepatocellular carcinoma in a European cohort.

Ann Oncol. 2013;24(9):2449-55.

Referências 83

48. Regimbeau JM, Colombat M, Mognol P, Durand F, Abdalla E, Degott C,

Degos F, Farges O, Belghiti J. Obesity and diabetes as a risk factor for hepatocellular

carcinoma liver. Transplantation. 2004;10(2):S69-S73.

49. Ratziu V, Bonyhay L, Di Martino V, Charlotte F, Cavallaro L, Sayegh-

Tainturier MH, Giral P, Grimaldi A, Opolon P, Poynard T. Survival, liver failure,

and hepatocellular carcinoma in obesity-related cryptogenic cirrhosis. Hepatology.

2002;35(6):1485-93.

50. Dyson J, Jaques B, Chattopadyhay D, Lochan R, Graham J, Das D, Aslam T,

Patanwala I, Gaggar S, Cole M, Sumpter K, Stewart S, Rose J, Hudson M, Manas D,

Reeves H L. Hepatocellular cancer: the impact of obesity, type 2 diabetes and a

multidisciplinary team. J Hepatol. 2014;60:110-7.

51. Marrero JA, Fontana RJ, Fu S, Conjeevaram HS, Su GL, Lok AS. Alcohol,

tobacco and obesity are synergistic risk factors for hepatocellular carcinoma. J

Hepatol. 2005;42:218-24.

52. Bravi F, Bosetti C, Tavani A, Gallus S, La Vecchia C. Coffee reduces risk for

hepatocellular carcinoma: an updated meta-analysis. Clin Gastroenterol Hepatol.

2013;11:1413-21.

53. Bravi F, Tavania A, Bosetti C, Boffetta P, La Vecchia C. Coffee and the risk

of hepatocellular carcinoma and chronic liver disease: a systematic review and meta-

analysis of prospective studies. Eur J Cancer Prev. 2017;26(5):368-77.

54. Chang MH, You SL, Chen CJ, Liu C J, Lee CM, Lin SM, Chu HC, Wu TC,

Yang SS, Kuo HS, Chen DS; Taiwan Hepatoma Study Group Collaborators (24).

Decreased incidence of hepatocellular carcinoma in hepatitis B vaccinees: a 20- year

follow-up study. J Natl Cancer Inst. 2009;101(19):1348-55.

55. Morgan RL, Baack B, Smith BD, Yartel A, Pitasi M, Falck-Ytter Y.

Eradication of hepatitis C virus infection and the development of hepatocellular

Referências 84

carcinoma: a meta-analysis of observational studies. Ann Intern Med. 2013;158(5 Pt

1):329-37.

56. Forner A, Llovet JM, Bruix J. Hepatocellular carcinoma. Lancet.

2012;379(9822):1245- 55.

57. Sangiovanni A, del Ninno E, Fasani P, de Fazio C, Ronchi G, Romeo R,

Morabito A, Franchis R, Colombo M. Increased survival of cirrhotic patients with a

hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology.

2004;126(4):1005-14.

58. EASL. EASL Clinical Practice Guideline: Management of hepatocellular

carcinoma. J Hepatol. 2018;69(1):182-236.

59. Forner A, Vilana R, Ayuso C, Bianchi L, Soli M, Ayuso JR, Boix L, Sala M,

Varela M, Llovet JM, Brú C, Bruix J. Diagnosis of hepatic nodules 20 mm or smaller

in cirhosis: Prospective validation of the noninvasive diagnostic criteria for

hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2008;47(1):97-104.

60. Roskams T, Kojiro M. Pathology of early hepatocellular carcinoma:

conventional and molecular diagnosis. Semin Liver Dis. 2010;30(1):17-25.

61. Torzilli G, Minogawa M, Takayama T, Inau K, Hui AM, Kubota K, Ohtomo

K, Makuuchi M. Accurate preoperative evaluation of liver mass lesions without fine-

needle biopsy. Hepatology. 1999;30:889-93.

62. Levy I, Greig PD, Gallinger S, Langer B, Sherman M. Resection of

hepatocellular carcinoma without preoperative tumor biopsy. Ann Surg.

2001;234(2):206-9.

63. Burrel M, Llovet JM, Ayuso C, Iglesias C, Sala M, Miquel R, Caralt T,

Ayuso JR, Solé M, Sanchez M, Brú C, Bruix J; Barcelona Clinic Liver Cancer

Referências 85

Group. MRI angiography is superior to helical CT for detection of HCC prior to liver

transplantation: an explant correlation. Hepatology. 2003;38(4):1034-42.

64. Rimola J, Forner A, Tremosini S, Reig M, Vilana R, Bianchi L, Rodríguez-

Lope C, Solé M, Ayuso C, Bruix J. Non-invasive diagnosis of hepatocellular

carcinoma ≤2 cm in cirrhosis. Diagnostic accuracy assessing fat, capsule and synal

intensity at dynamic MRI. J Hepatol. 2012;56:1317-23.

65. ACR. Liver Imaging Reporting and Data System Version 2018. Disponível

em: https://www.acr.org/Clinical-Resources/Reporting-and-Data-Systems/LI-

RADS/CT-MRI-LI-RADS-v20182018 [cited 2018 09/09].

66. Darnell A, Forner A, Rimola J, Reig M, Criado A G, Ayuso C, Bruix J. Liver

imaging reporting and data system with mr imaging: evaluation in nodules 20 mm or

smaller detected in cirrhosis at screening US. Radiology. 2015;275:698-707.

67. Furlan A, Marim D, Cabassa P, Taibbi A, Brunelli E, Agnello F, Lagalla R,

Brancatelli G. Enhancement pattern of small hepatocelular carcinoma (HCC) at

contrast-enhanced US (CEUS), MDCT and MRI: Intermodality agreement and

comparasion of diagnostic sensitivity between 2005 and 2010 American Association

for the study of liver Diseases (AASLD). Eur J Radiol. 2012;81:2099-105.

68. Kim SE, Lee HC, Shim JH, Park HJ, Kim KM, Kim PN, Shin YM, Yu ES,

Chung YH, Suh DJ. Noninvasive diagnostic criteria for hepatocellular carcinoma in

hepatic masses > 2cm in a hepatitis B virus-endemic area. Liver Int. 2011;31:1468-

76.

69. Mueller SB, Micke O, Herbst H, Schaefer U, Willich N. Alpha-fetoprotein-

positive carcinoma of the pancreas: a case report. Anticancer Res.

2005;25(3A):1671-4.

Referências 86

70. Ishikawa K, Sasaki A, Haraguchi N, Yoshikawa Y, Mori M. A case of an

alfa-fetoprotein-producing intrahepatic cholangiocarcinoma suggests probable cancer

stem cell origin. Oncologist. 2007;12(3):320-4.

71. EASL. Clinical Practice Guidelines: Management of hepatocellular

carcinoma. J Hepatol. 2018;69(1):182-236.

72. Pugh RN, Murray-Lyon IM, Dawson JL, Pietroni MC, Williams R.

Transection of the oesophagus for bleeding oesophageal varices. Br J Surg.

1973;60(8):646-9.

73. Kamath PS, Wiesner RH, Malinchoc M, Kremers W, Therneau TM, Kosberg

CL, D'Amico G, Dickson ER, Kim WR. A model to predict surverval in patients

with end stage liver disease. Hepatology. 2001;33(2):464-70.

74. Sorensen JB, Klee M, Palshof T, Hansen HH. Performance status assessment

in cancer patients. An inter-observer variability study. Br J Cancer. 1993;67(4):773-

5.

75. Verger E, Salamero M, Conill C. Can Karnofsky performance status be

transformed to the Eastern Cooperative Oncology Group Scoring Scale and vice

versa? . Eur J Cancer. 1992;28A(8-9):1328-30.

76. Llovet JM, Brú C, Bruix J. Prognosis of hepatocellular carcinoma: the BCLC

staging classification. Semin Liver Dis. 1999;19(3):329-38.

77. Cabibbo G, Enea M, Attanasio M, Bruix J, Craxı A, Camma C. A meta-

analysis of survival rates of untreated patients in randomized clinical trials of

hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2010;51(4):1274-83.

78. CLIP Investigators . A new prognostic system for hepatocellular carcinoma: a

retrospective study of 435 patients: The Cancer of the Liver Italian Program (CLIP)

Investigators. Hepatology. 1998;28(3):751-5

Referências 87

79. Leung TW, Tang AM, Zee B, Lau WY, Lai PB, Leung KL, Lau JT, Yu SC,

Johnson PJ. Construction of the Chinese University Prognostic Index for

hepatocellular carcinoma and comparasion with the TNM staging system, the Okuda

staging system, and the Cancer of the Liver Italian Program staging system: a study

based on 926 patients. Cancer. 2002;94(6):1760-9.

80. Yau T, Tang VYF, Yao T-J, Fan S-T, Lo C-M, Poon R TP. Development of

Hong Kong Liver Cancer staging system with treatment stratification for patients

with hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 2014;146(7):1691-700.

81. Kitai A, Kudo M, Minami Y, Haji S, Osaki Y, Oka H, Seki T, Kasugai H,

Sasaki Y, Matsunaga T Validation of a new prognostic staging system for

hepatocellular carcinoma: a comparison of the biomarker-combined Japan Integrated

Staging Score, the Conventional Japan Integrated Staging Score and the BALAD

Score. Oncology. 2008;75(Suppl 1):83-90.

82. Llovet JM, Schwartz M, Mazzaferro V. Resection and liver transplantation

for hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis. 2005;25(2):181-200.

83. Ishizawa T, Hasegawa K, Aoki T, Takahashi M, Inoue Y, Sano K, Imamura

H, Sugawara Y, Kokudo N, Makuuchi M. Neither multiple tumors nor portal

hypertension are surgical contraindications for hepatocellular carcinoma.

Gastroenterology. 2008;134(7):1908-16.

84. Hasegawa K, Kokudo N, Makuuchi M, Izumi N, Ichida T, Kudo M, Ku Y,

Sakamoto M, Nakashima O, Matsui O, Matsuyama Y. Comparison of resection and

ablation for hepatocellular carcinoma: A cohort study based on a Japanese

nationwide survey. J Hepatol. 2013;58(4):724-9.

85. Mazzaferro V, Regalia E, Doci R, Andreola S, Pulvirenti A, Bozzetti F,

Montalto F, Ammatuna M, Morabito A, Gennari L. Liver transplantation for the

treatment os small hepatocellular carcinomas in patients with cirrhosis. N Engl J

Med. 1996;334(11):693-9.

Referências 88

86. Kim WR, Lake JR, Smith JM, Skeans MA, Schladt DP, Edwards EB, Harper

AM, Wainright JL, Snyder JJ, Israni AK, Kasiske BL. OPTN/SRTR 2015 Annual

Data Report: Liver. Am J Transplant. 2017;17(Suppl 1):174-251.

87. Lencioni R, Crocetti L. Local-regional treatment of hepatocellular carcinoma.

Radiology. 2012;262(1):43-58.

88. Lencioni R, Cioni D, Crocetti L, Franchini C, Pina CD, Lera J, Bartolozzi C.

Early-stage hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis: long-term results of

percutaneous image-guided radiofrequency ablation. Radiology. 2005;234(3):961-7.

89. Shiina S, Teratani T, Obi S, Tateishi R, Fujishima T, Ishikawa T, Koike Y,

Yoshida H, Kawabe T, Omata M. A randomizaded controlled trial of radiofrequency

ablation with ethanol injection for small hepatocellular carcinoma. Gastroenterology.

2005;129(1):122-30.

90. Shiina S, Tateishi R, Arano T, Uchino K, Enooku K, Nakagawa H, Asaoka Y,

Sato T, Masuzaki R, Kondo Y, Goto T, Yoshida H, Omata M, Koike K.

Radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma: 10-year outcome and

prognostic factors. Am J Gastroenterol. 2012;107(4):569-77.

91. Raoul J, Sangro B, Forner A, Mazzaferro V, Piscaglia F, Bolondi L, Lencioni

R. Evolving strategies for the management of intermediate-stage hepatocellular

carcinoma: Available evidence and expert opinion on the use of transarterial

chemoembolization. Cancer Treat Rev. 2011;37(3):212-20.

92. Lencioni R, de Baere T, Soulen MC, Riling WS, Geschwind J-FH. Lipiodol

transarterial chemoembolization for hepatocellular carcinoma: A systematic review

of efficacy and safety data. Hepatology. 2016;64(1):106-16.

93. Sangro B, Carpanese I, Cianni R, Golfieri R, Gasparini D, Ezziddin S,

Paprottka PM, Fiore F, Van Buskirk M, Bilbao JI, Ettorre GM, Salvatori R,

Giampalma E, Geatti O, Wilhelm K, Hoffmann RT, Izzo F, Iñarrairaegui M, Maini

Referências 89

CL, Urigo C, Cappelli A, Vit A, Ahmadzadehfar H, Jakobs TF, Lastoria S; European

Network on Radioembolization with Yttrium-90 Resin Microspheres (ENRY).

Survival after ytrium-90 resin microsphere radioembolization of hepatocellular

carcinoma across Barcelona clinic liver cancer stages: a European evaluation.

Hepatology. 2011;54(3):868-78.

94. Villanueva A, Llovet JM. Therapies for hepatocellular carcinoma.

Gastroenterology. 2011;140(5):1410-26.

95. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc J-F, de Oliveira

AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, Schwartz M, Porta C, Zeuzem S, Bolondi L,

Greten TF, Galle PR, Seitz JF, Borbath I, Häussinger D, Giannaris T, Shan M,

Moscovici M, Voliotis D, Bruix J; SHARP Investigators Study Group. Sorafenib in

advanced hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 2008;359(4):378-90.

96. Bruix J, Qin S, Merle P, Granico A, Huang YH, Bodoky G, Pracht M,

Yokosuka O, Rosmorduc O, Breder V, Gerolami R, Masi G, Ross PJ, Song T,

Bronowicki JP, Ollivier-Hourmand I, Kudo M, Cheng AL, Llovet JM, Finn RS,

LeBerre MA, Baumhauer A, Meinhardt G, Han G; RESORCE Investigators.

Regorafenib for patients with hepatocellular carcinoma who progressed on sorafenib

treatment (RESORCE): a randomisided, double-bind, placebo-controlled, phase 3

trial. Lancet. 2017;389(10064):56-66.

97. Kudo M, Finn RS, Qin S, Han K-H, Ikeda K, Piscaglia F, Baron A, Park JW,

Han G, Jassem J, Blanc JF, Vogel A, Komov D, Evans TRJ, Lopes C, Ductus C, Guo

M, Saito K, Kraljevic S, Tamai T, Ren M, Cheng A-L. Lenvatinib vs sorafenib in

first-line treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma: a

randomised phase 3 non-inferiority trial. Lancet. 2018:391(10126):1163-73.

98. Fidler IJ, Yano S, Zhang RD, Fujimaki T, Bucana CD. The seed and soil

hypothesis: vascularisation and brain metástases. Lancet Oncol. 2002;3(1):53-7.

99. Folkman J, Shing Y. Angiogenesis. J Biol Chem. 1992;267(16):10931-4.

Referências 90

100. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, Perruzzi CA, Harvey VS, Dvorak HF.

Tumor cells secrete a vascular permeability fator that promotes accumulation of

ascites fluid. Science. 1983;219(4587):983-5.

101. Kaseb AO, Hanbali A, Cotant M, Hassan MM, Wollner I, Philip PA.

Vascular endothelial growth factor in the management of hepatocellular carcinoma: a

review of literature. Cancer. 2009;115(21):4895-906.

102. Lee EH, Kao WW, Schwarz RI. Cell density regulates prolyl 4-hydroxylase

activity independent of mRNA levels. Matrix Biol. 2001;19(8):779-82.

103. Ferrara N, Gerber HP, Le Couter J. The biology of VEGF and its receptors.

Nat Med. 2003;9:669-76.

104. Kroll J, Waltenberger J. Regulation of the endothelial function and

angiogenesis by vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A). Z Kardiol.

2000;89(3):206-18.

105. Lamszus K, Ulbricht U, Matscheke J, Brockmann MA, Fillbrandt R,

Westphal M. Levels of soluble vascular endotelial growth fator (VEGF) receptor 1 in

astrocytic tumors and its relation to malignancy, vascularity and VEGF-A. Clin

Cancer Res. 2003;9(4):1399-405.

106. Coulon S, Heindryckx F, Geerts A, Steenkiste CV, Colle I, Vlierberghe HV.

Angiogenesis in chronic liver disease and its complications. Liver Int.

2011;31(2):146-62.

107. Kim I, Moon SO, Koh KN, Kim H, Uhm CS, Kwak HJ, Kim NG, Koh GY.

Molecular cloning, expression, and characterization of angiopoietin-related protein.

Angiopoietin-related protein induces endothelial cell sprouting. J Biol Chem.

1999;274(37):26523-8.

Referências 91

108. Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva M, GospodarowiczS D, Fiddes J C,

Abrahamll JA. The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple

protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem.

1991;266(18):11947-54.

109. Devorak HF, Brown LF, Detmar M, Dvorak AM. Vascular permeability

factornascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and

angiogenesis. Am J Pathol. 1995;146(5):1029-39.

110. Woolard J, Wang WY, Bevan HS, Qiu Y, Morbidelli L, Jones ROP, Cui TG,

Sugiono M, Waine E, Perrin R, Foster R, Bell JD, Shields JD, Whittles CE, Mushens

RE, Gillatt DA, Ziche M, Harper SJ, Bates DO. VEGF165b, an inhibitory vascular

endothelial growth factor splice variant: mechanism of action, in vivo effect on

angiogenesis and endogenous protein expression. Cancer Res. 2004;64(21):7822-35.

111. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical

progress. Endocr Rev. 2004;25(4):581-611.

112. Balasubramanian SP, Cox A, Brown NJ, Reed MW. Candidate gene

polymorphisms in solid cancers. Eur J Surg Oncol. 2004;30(6):593-601.

113. Solovey A, Gui L, Ramakrishnan S, Steinberg MH, Hebbel R P. Sickle cell

anemia as a possible state of enhanced anti-apoptotic tone: Survival effect of

vascular endothelial growth factor on circulating and unanchored endothelial cells.

Blood. 1999;93(11):3824-30.

114. He Y, Ni J, Chen S, Jiang Y, Jia S, Gao Y. The vascular endothelial growth

factor-2549 insertion/deletion polymorphism is not associated with susceptibility to

hepatocellular carcinoma in Chinese. DNA Cell Biol. 2010;29(7):393-6.

115. Wu X, Xin Z, Zhangetal W, Wu X, Xin Z, Zhang W, Wu J, Chen K, Wang H,

Zhu X, Pan L, Li Z, Li H, Liu Y. Polymorphisms in the VEGFA promoter are

Referências 92

associated with susceptibility to hepatocellular carcinoma by altering promoter

activity. Int J Cancer. 2013;133(5):1085-93.

116. Kong SY, Park JW, Lee JA, Park JE, Park KW, Hong EK, Kim CM.

Association between vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and

survival in hepatocellular carcinoma patients. Hepatology. 2007;46(2):446-55.

117. Mise M Arii S, Higashituji H, Furutani M, Niwano M, Harada T, Ishigami S

I, Toda Y, Nakayama H, Fukumoto M, Fujita J, Imamura M. Clinical significance of

vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor gene expression

in liver tumor. Hepatology. 1996;23(3):455-64.

118. Yamamoto T, Kaneda K, Hirohashi K, Kinoshita H, Sakurai M. Sinusoidal

capillarization and arterial blood supply continuously proceed with the advance of

the stages of hepatocarcinogenesis in the rat. Jpn J Cancer Res. 1996;87(5):442-50.

119. Pang RWC, Joh JW, Johnson PJ, Monden M, Pawlik TM, Poon RP. Biology

of hepatocellular carcinoma. Ann Surg Oncol. 2008;15(4):962-71.

120. Park YN, Kim YB, Yang KM, Park C. Increased expression of vascular

endothelial growth factor and angiogenesis in the early stage of multistep

hepatocarcinogenesis. Arch Pathol Lab Med. 2000;124(7):1061-5.

121. Yao DF, Wu XR, Zhu Y, Shi GS, Dong ZZ, Yao DB, Wu W, Qiu LW, Meng

XY. Quantitative analysis of vascular endotelial growth fator, microvascular density

and their clinicopathologic featurres in human hepatocellular carcinoma.

Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2005;4(2):220-6.

122. Deli G, Jin CH, Mu R, Yang S, Liang Y, Chen D, Makuuchi M.

Immunohistochemical assessment of angiogenesis in hepatocellular carcinoma and

surrounding cirrhotic liver tissues. World J Gastroenterol 2005;11(7):960-3.

Referências 93

123. Huang GW, Yang LY, Lu WQ. Expression of hypoxia-inducible factor 1

alpha and vascular endothelial growth factor in hepatocellular carcinoma: impact on

neovascularization and survival. World J Gastroenterol. 2005;11(11):1705-8.

124. Cui J, Dong BW, Liang P, Yu DJ. Effect of c-myc, Ki-67, MMP-2 and VEGF

expression on prognosis of hepatocellular carcinoma patients undergoing tumor

resection. World J Gastroenterol. 2004;10(10):1533-6.

125. Wang ZL, Liang P, Dong BW, Yu XL, Yu DJ. Prognostic factors and

recurrence of small hepatocellular carcinoma after hepatic resection or microwave

ablation: a retrospective study. J Gastrointest Surg. 2008;12(2):327-37.

126. Guenther BD, Sheppard CA, Tran P, Rozen R, Matheus RG, Ludwig ML.

The structure and properties of methylenetetrahydrofolate reductase from

Escherichia coli suggest how folate ameliorates human hyperhomocysteinemia. Nat

Struct Biol. 1999;6(4):359-65.

127. Frost P, Blom HJ, Melos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers

GJ, den Heijer M, Kluijtmans LA, Heuvel LP, Van den Rozen R. A candidate

genetic risk fator for vascular disease: a common mutation in

methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet. 1995;10(11):111-3.

128. Botto LD, Yang Q. 5-10-Methylenetetrahydrofolate reductase gene variants

and congenital anormalies: a HuGE review. Am J Epidemiol. 2000;151(9):862-77.

129. Bydlowski SP, Magnanelli AC, Chamone DA. Hyperhomocysteinemia and

vaso-occlusive diseases. Arq Bras Cardiol. 1998:71(9):69-76.

130. Goyette P, Summer JS, Milos R, Duncan MV, Rosenblatt DS, Mathews RG,

Rozen R. Human methylenetetrahydrofolate reductase: isolation of cDNA mapping

and mutation identification. Nat Genet. 1994;7(2):195-200.

Referências 94

131. Sibani S, Christensen B, O‟Ferrall E, Saadi I, Hiou-Tim F, Rosenblatt DS,

Rozen R. Characterization of six novel mutations in methylenetetrahydrofolate

reductase (MTHFR) gene in patients with homocystinuria. Hum Mutat.

2000;15(3):280-7.

132. Frosst P, Blom HJ, Milos R. Govette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers

GJ, den Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP, Rozen R. A candidate genetic

risk fator for vascular disease: a commom mutation in methylenotetrahydrofolate

reductase. Nat Genet. 1995;10(1):111-3.

133. Neves L.B, Macedo DM, Lopes AC. Homocisteína. J Bras Patol Med Lab.

2004;40(5):311-20.

134. van der Put NM, Gabreels F, Stevens EM, Smeitink JA, Trijbels FJ, Eskes

TK, van den Heuvel LP, Blom HJ. A second common mutation in the

methylenetetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube

defects? Am J Hum Genet. 1998;62(5):1044-51.

135. Duthie SJ. Folic acid deficiency and cancer: mechanisms of DNA instability.

Br Med Bull. 1999;55(3):578-92.

136. Giovannucci E, Stampfer Mj, Colditz GA, Rimm EB, Trichopoulos D,

Rosner BA, Speizer FE, Willett WC. Folate, methionine and alcohol intake and risk

of colorectal adenoma. J Natl Cancer Inst. 1993;85(11):875-84.

137. Duthie SJ. Folate and cancer: how DNA damage, repair andmethylation

impact on colon carcinogenesis. J Inherit Metab Dis. 2011;34(1):101-9.

138. Bai JL, Zheng MH, Xia X, Ter-Minassian M, Chen YP, Chen F. MTHFR

C677T polymorphism contributes to prostate cancer risk among Caucasians: A meta-

analysis of 3511 cases and 2762 controls. Eur J Cancer. 2009;45(8):1443-9.

Referências 95

139. Langsenlehner T, Renner W, Yazdani-Biukê B, Langsenlehner U.

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and breast cancer risk: a nested-case-

control study and a pooled meta analysis. Breast Cancer Res Treat. 2008;107(3):459-

60

140. Le Marchand L, Wilkens LR, Kolonel LN, Henderson BE. The MTHFR

C677T polymorphism and colorectal câncer: the multiethinic cohort study. Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev. 2005;14(5):1198-203.

141. Mu LN, Cao W, Zhang ZF, Yu SZ, Jiang QW, You NC, Lu QY, Zhou XF,

Ding BG, Chang J, Chan CW, Wei GR, Cai L. Polymorphisms of 5-10-

methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), fruit and vegetables intake, and risk

of stomacle cancer. Biomarkers. 2007;12(1):61-75.

142. Karagas MR, Park S, Nelson HH, Andrew AS, Mott L, Schned A, Kelsey

KT. Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) variants and bladder cancer: a

population based case-control study. Int J Hyg Environ Health. 2005;208(5):321-7.

143. Yang CX, Matsuo K, Ito H, Shinoda M, Hatooka S, Hirose K, Wakai K, Saito

T, Suzuki T, Maeda T, Tajima K. Gene-environment interactions between alcohol

drinking and the MTHFR C677T polymorphism impact on esophageal cancer risk:

results of a case-control study in Japan. Carcinogenesis. 2005;26(7):1285-90.

144. Krajinovic M, Lamoth S, Labuda D, Lemieux-Blanchard E, Theoret Y,

Moghrabi A, Sinnett D. Role of MTHFR genetic polymorphisms in the susceptibility

to childhood acute lymphoblastic leucemia. Blood 2004;103(1):252-7.

145. Zanrosso CW, Emereciano M, Figueiredo A, Reis M, Cordeiro SNS,

Splendore A, Oliveira MS. Influência da metileno-tetrahidrofolato redutase na

patogênese das leucemias agudas infantis. Revista Brasileira de Cancerologia.

2005;51(4):289-95.

Referências 96

146. Fabris C, Toniutto P, Falleti E, Fontanini E, Cussigh A, Bitetto D, Fornasiere

E, Fumolo E, Avellini C, Minisini R, Pirisi M. MTHFR C677T polymorphism and

risk of HCC in patients with liver cirrhosis: role of male gender and alcohol

consumption. Alcohol Clin Exp Res. 2009;33(1):102-7.

147. Ventura P, Rosa MC, Abbati G, Marchini S, Grandone E, Vergura P,

Tremosini S, Zeneroli ML. Hyperhomocysteinaemia in chronic liver diseases: role of

disease stage, vitamin status and methylenetetrahydrofolate reductase genetics. Liver

Int. 2005;25(1):49-56.

148. Jin F, Qu LS, Shen XZ. Association between the methylenetetrahydrofolate

reductase C677T polymorphism and hepatocellular carcinoma risk: a meta-analysis.

Diagnostic pathology. 2009;4:39.

149. Qin X, Peng Q, Chen Z, Deng Y, Huang S, Xu J, Li H, Li S,Zhao J. The

association between MTHFR gene polymorphisms and hepatocellular carcinoma

risk: a meta-analysis. PloS one. 2013;8(2):e56070.

150. Bruix J, Sherman M; American Association for the Study of Liver D.

Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 2011;53(3):1020-

2.

151. Forner A, Reig M, de Lope CR, Bruix J. Current strategy for staging and

treatment: the BCLC update and future prospects. Semin Liver Dis 2010;30:61-74.

152. WHO. Report of a WHO Consultation on Obesity. Obesity: preventing and

managing the global epidemic. . Geneva: World Health Organization; 2000. Contract

No. 894.

153. dbSNP. Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp

[cited 2013 12/02/2013].

Referências 97

154. International HapMap Project. Disponível em:

http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/ [cited 2013 12/02].

155. Liu C, Xiao GQ, Yan LN, Li B, Jiang L, Wen TF, Wang WT, Xu MQ, Yang

JY. Value of α-fetoprotein in association with clinicopathological features of

hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2013;19(11): 1811-9.

156. Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, Goeddel DV, Ferrara N. Vascular

endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science.

1989;246(4935):1306-9.

157. Yao DF, Wu XR, Zhu Y, Shi GS, Dong ZZ, Yao DB, Wu W, Qiu LW, Meng

XY. Quantitative analysis of vascular endothelial growth factor, microvascular

density and their clinicopathologic features in human hepatocellular carcinoma.

Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2005;4(2):220-6.

158. Giacalone A, Montalto G, Giannitrapani L, Balasus D, Terranova A, Cervello

M, Soresi M, Marasa L. Association between single nucleotide polymorphisms in the

cyclooxygenase-2, tumor necrosis factor-α, and vascular endothelial growth factor-A

genes, and susceptibility to hepatocellular carcinoma. OMICS. 2011;15(3):193-6.

159. Baitello ME, Tenani GD, Ferreira RF, Nogueira V, Pinhel MA, Silva RC,

Silva RF, Fucuta PD, Godoy MF, Souza DR. VEGF polymorphisms related to higher

serum levels of protein identify patients with hepatocellular carcinoma. Can J

Gastroenterol Hepatol. 2016;2016:9607054.

160. Ratnasari N, Nurdjanah S, Sadewa AH, Hakimi M. The role of Vascular

endothelial growth factor -634 G/C and its solube receptor on chronic liver disease

and hepatocellular carcinoma. Arab J Gastroenterol. 2016;17(2):61-6.

161. Guo Q, Dai SB, Shen F, Yu D, Shen ST, Zhang Q, Huang JX, Wu ZD. VEGF

+405G/C (rs2010963) polymorphisms and digestive system cancer risk: a meta-

analysis. Tumour Biol. 2014;35(5):4977-82.

Referências 98

162. Tie Z, Bai R, Zhai Z, Zhang G, Zhang H, Zhao H, Zhou D, Liu W. Single

nucleotide polymorphisms in VEGF gene are associated with an increased risk of

osteosarcoma. Int J Clin Exp Pathol. 2014;7(11):8143-9.

163. Kwak SY, Kim UK, Cho HJ, Lee HK,Kim HJ, Kim NK, Hwang SG.

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methionine synthase reductase

(MTRR) gene polymorphisms as risk factors for hepatocellular carcinoma in a

Korean population. Anticancer Res. 2008;28(5A):2807-11.

164. Cui LH, Song Y, Si H, Shen F, Shin MH, Kim HN, Choi JS. Folate

metabolism-related gene polymorphisms and susceptibility to primary liver cancer in

North China. Med Oncol. 2012;29(3):1837-42.

165. D'Amico M, Pasta L, Sammarco P. MTHFR C677TT, PAI1 4G-4G, V Leiden

Q506, and prothrombin G20210A in hepatocellular carcinoma with and without

portal vein thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 2009;28(1):70-3.

166. Qi YH, Yao LP, Cui GB, Liang J, Shao QJ, Yan LF, Du P. Meta-analysis of

MTHFR C677T and A1298C gene polymorphisms: association with the risk of

hepatocellular carcinoma. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2014;38(2):172-80.

167. Zhuo X, Ling J, Zhou Y, Zhao H, Song Y, Tan Y. Polymorphisms of

MTHFR C677T and A1298C association with oral carcinoma risk: a meta-analysis.

Cancer Invest. 2012;30(6):447-52.

168. Kuo CS, Huang CY, Kuo HT, Cheng CP, Chen CH, Lu CL, Yang FL, Huang

RFS. Interrelationships among genetic C677T polymorphism of 5,10-

methylenetetrahydrofolate reductase, biochemical folate status, and lymphocytic p53

oxidative damage in association with tumor malignancy and survivals of patients

with hepatocellular carcinoma. Mol Nutr Food Res. 2014;58(2):329-42.