Embrapa- Meio ambiente Junho 2013 Jaguariúna

Dr. Marcelo Asprea

Jefe de Bioterio y Cirugía Experimental

Hospital de Pediatría “Prof Dr. Juan P. Garrahan”

masprea@hotmail.com

Métodos alternativos

de substituição do animal de

laboratorio

Aprendizagem sem matar: um guia

para a consciência

Usar animais de laboratório........ sem animais de laboratório ???

Alternativas no uso da a.l.

Provas de eficácia e segurança Politica-legislacion As Three Rs na educação e formação Bem-estar dos animal e refinamento Substituição e redução de pesquisa básica

VíDEOS

O rato dePVC no treinamento

microcirúrgico

O número de animais utilizados em programas de formação educacional pode ser reduzida por meio de dispositivos artificiais, como a anastomose e a MD PVC-RAT

Assim, como técnicas in vitro, permitem desenvolver habilidades, tornando mais fácil a transição de modelos vivos

MD PVC-Rat

PLASTINAÇÃO

Processamento de tecido

Obtenção das amostras para trabalhar

Passamos a realizar a dissecação dos corpos São fixados com formol neutralizado a 4% por três dias

Dois dias de lavado

Como corpos preparados passa a transmiti-los através de uma passagem de álcool

isopropílico, para, em seguida, imersão em acetona para um mês

Passar de resina-acetona, provandose 3 diferentes tipos de resinas: MF-100, MC-40 e MF-300 polimorfos de plástico para cada tipo de preparação

Uma vez impregnados vai combinar com o uso de calor e catalisadores

Desenvolvimento de alternativas aceitáveis regulamentares testes in vitro in vivo

Nos últimos quinze anos houve grandes mudanças nos protocolos de avaliação de segurança, desde a introdução e a aceitação de um número crescente de métodos in vitro para esta finalidade, substituição ou complementar testes in vivo

Na busca constante de progressos científicos e considerações éticas

Dentro de EU, em particular, isso levou a mudanças na legislação regulatória relacionados a produtos químicos (REACH) e produtos de consumo (Alteração da Directiva 7º de cosméticos)

O maior desafio para o desenvolvimento de métodos é a necessidade de validar contra um ponto final do conhecimento humano, usando animais vivos

Irritação ocular The skin Ethic Human Corneal Epitheliun(HCE)

O modelo tem sido pre-validado por ECVAM

e foi projetado para identificar as substâncias que podem causar irritação nos olhos

Qualquer substância que provoca uma viabilidade▼50 % após a exposição e a incubação pós-tratamento, é considerado irritante para os olhos

HET CAM

HET CAM

Irritação e corrosão da pele OECD 439 and OECD 41 In Vitro Irritation: Reconstituted Human Epidermis

Test Method and In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test.

Episkin é um modelo totalmente validado para avaliação de compostos irritantes

corrosivo em conformidade com a disposição das NU GHS Cat 2

sendo irritante se a viabilidade do tecido após a exposição e pós-tratamento▼ 50%, ou não-irritante se a viabilidade do tecido é ▲ 50 %

e corrosivo para a pele se a viabilidade após exposição de 3 minutos é▼ 50%

ou, se a viabilidade éou, se a viabilidade é▲ 50 % Após a exposição de 3 minutos, mas▼ 15% após 1 h de exposição.

EPI SKIN

• Skin Corrosion • Skin irritation of chemicals • Percutaneous absorption

Uso de artérias criopreservadas de rato

para treinamento em microcirurgia Introdução

Tubos silastic são usados como material de treinamento para anastomose microvascular. No entanto, a textura do

silastic difere do original

Objetivo

No presente trabalho, avalia o uso dos segmentos arteriais preservados de rato para treinamento de anastomose

arterial

Treinamento de microanastomoses com tubos sintéticos. Vários tipos de anastomoses incluindo termo terminal A, a termo lateral B, la lado lateral interrompido C e sutura contínua D, pode ser testado em tubos de silastic.

Resultados

O material de criopreservado tinha em todos os casos, a consistência e a textura dos vasos normais, sendo um método mais confiável para a formação microcirúrgica com materiais sintéticos.

Foi eleito pedículos das artérias congelados aos tubos de silastic

Conclusão

Segmentos criopreservados são um material biológico apropriado para treinamento microcirúrgico. Elas podem ser obtidas de outras experiências, e esta é uma forma eficaz de reduzir o número de animais criados e mortos para fins educacionais

SIMULAÇÃO

“É o processo de criação de um modelo de sistema real para fazer experiências com ele, a fim de compreender seu comportamento ou avaliar novas estratégias, dentro dos limite impostos por um determinado critério ou uma combinação deles, para o seu funcionamento”

R.E. Shannon

Winter Simulation Conference

(WSC)

The Winter Simulation Conference (WSC) é o principal fórum para divulgar os últimos desenvolvimentos no campo da simulação Além de uma qualidade técnica e programa de extensão incomparável, WSC Ele fornece um local proeminente em simulação para médicos, pesquisadores, disciplinas da indústria, serviços, governo, militares e setores acadêmicos. En 2011 WSC fue " Simulação para um mundo sustentável "

Utilidade na avaliação

O fornecimento de tecnologias de simulação nos dá possibilidades emocionantes para avaliação de competências e a melhoria da prática clínica

Quando usado de forma criativa e adequada, eles formam um instrumento útil para os educadores que fazem a seguinte pergunta:

‘’Esse profissional é competente? ‘’

Perguntas e respostas...

“Aprendizagem com simuladores se baseiam nos objetivos. Podemos aprender com base em erros e refletir sobre eles ’’

‘' Só aprendemos quando temos uma pergunta e buscamos a resposta e não quando a resposta

nos aparece sem que procuremos por ela ”

Simulação-objetivos

Fornecem elementos para a formação inicial e contínua de alunos e profissionais, evitando riscos aos pacientes

Desenvolver programas de estudo contendo experiências educacionais controladas, podem ser reproduzidos com simuladores de alta tecnologia

Simulação-objetivos

Contribuir para as certificações das faculdades e instituições pertencentes ao sistema de saúde

Reduzir os custos diretos e indiretos a eventos adversos em institutos de saúde

Estabelecer acordos para desenvolver programas de formação contínua para a Comunidade e para o pessoal de saúde relacionadas com instituições

Aplicação

Educação Treinamento Avaliação Pesquisa Testes com equipe médicos

Formação de habilidades

microcirúrgicas com modelo in silico

Introdução: Embora a exposição direita dos procedimentos no ambiente da sala de cirurgia, juntamente com a prática em animais de laboratório, ainda é visto como o padrão de ouro do ensino em cirurgia, prática em simuladores atualmente está sendo validada como uma importante ferramenta educacional Há uma enorme quantidade de modelos inanimados de formação, juntamente com as inovações atualmente aceitas que fazem parte dos currículos de cursos de treinamento em cirurgia

Material e métodos:

Usando a experiência acumulada em programas de simulação de centros de formação e treinamento em cirurgia, identificadas as competências específicas que eram de confiança tendo em conta por meio de exercícios com tecidos inanimados Através de revisões foram encontrados cinco modelos de treinamento inanimado: manipulação básica, princípios básicos em nós, para a realização de anastomose, experiência com tecido real e treinamento de realidade virtual

Alternativas em testes

de toxicidade com peixes

Previsão da toxicidade de produtos químicos com linhas de células e embriões de peixe

OCDE 203 (Teste agudo de peixe)

OCDE 210 (Teste de toxicidade de fase de vida antes do tempo)

OCDE 305 (Ensaio de bioconcentração)

A OCDE TG 203

Este teste requer um número considerável de peixe, 42−60, necessita-se de cinco

dias úteis, produz litros de resíduos tóxicos

3 milhões de peixes são utilizados anualmente na América do Norte para

pesquisas (SE. Belanger, Procter & Gamble, comunicação pessoal)

Na Europa, apenas 140 mil peixes foram usados em 2008 para requisitos

normativos apenas para cumprir a exigências do REACH

Portanto, há muito tempo vem se

buscando uma abordagem alternativa,

nonanimal

BIOMARCADORES

TESTES IN VITRO (linhas celulares)

MODELOS MATEMÁTICOS DE PREVISÃO

Disponibilidade de troca de informações,Flexibilidade, Estratégias integradas

Tests

Relación Cuantitativa Estructura-Actividad

(QSAR)

Evitar a repetição desnecessária de experimentos in vivo e in vitro:

protocolos e estudos ambientais cinéticos da droga química-toxicocinética

Desenvolvimento uma linha celular

Derivam de órgãos e tecidos de diferentes espécies de peixes

Cultiva as células primária, obtendo sucesso: linha celular

Estas linhas de célula são permanentes ou imortalizadas

Biodisponibilidade não é influenciada pelo componente do soro

Animais são apenas necessários para a geração (uma única criatura)

Uma vez estabelecida a linha celular, mais animais não são necessários

Citotoxicidade basal se correlacionam bem com as linhas de mamíferos

Esta diferença de sensibilidade de in vitro-in vivo parece ser verdadeira para as

linhas de duas células de peixes e linhas de células de mamíferos

Tendo uma boa correlação entre in vitro e in vivo, nível de toxicidade, juntamente

com as diferenças de sensibilidade, o papel dos ensaios... É FUNDAMENTAL!!!!!

Desenvolvimento de uma linha celular

Desvantagem

O problema: são menos sensíveis que o peixe vivo em testes de toxicidade

Apesar do considerável potencial, o uso de células de peixe, no entanto, não está

incluído nos ensaios prescritos pela lei

...mais vantagem

São geralmente mais fáceis de manter e mais tolerantes a condições de

crescimento simples

Amostras de água ou produtos químicos podem ser aplicadas às células com

temperaturas mais típicas das temperaturas a que o é peixe expostos

Estudos têm demonstrado que existe uma boa correlação entre a toxicidade

celular e toxicidade aguda em peixes, sobre tudo a sensibilidade relativa (exceção

dos compostos que exercem um modo específico de ação tóxica)

Subestima a toxicidade in vivo, portanto.......

Rotas para avançar a superar o obstáculo mencionado:

1. Linhas especificas de célula derivadas de tecidos que refletem a ação de

forma específica de um produto químico particular

2. Aumentam a sensibilidade da resposta celular por modificação de cultivo que

mais se assemelham a exposição in vivo

3. Pela fração química disponível que representa as células

Linha celular de branquiais de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)

Linha de celular branquiais de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), epitélio de

brânquia de RTgill-W1) é o local principal de absorção de poluentes da água nos

peixes

Também um objetivo primordial das muitas substâncias tóxicas que reflete a

deterioração do organismo inteiro e possivelmente morte

Deve ser capaz de detectar este dano e dano ser mensuráveis por vários

indicadores de viabilidade celular, tais como os danos da membrana citoplasmática

(célula) ou degradação da atividade metabólica ou integridade dos lisossomos

As Investigações........

Preparação de soluções químicas

Exposição das células para testar produtos químicos

Análises de viabilidade celular/ Três corantes fluorescentes

Alamar Blue (AB, Invitrogen, Basilea, Suiza) como uma medida para a atividade

metabólica celular

5-carboxyfluorescein diacetato acetoxi-etanolamina éster como uma medida

para a integridade da membrana celular

Vermelho neutro (NR, Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) como medida de

integridade de membrana dos lisossomos

Análise química

.

RESULTADOS

Relações concentração- resposta completa para 34 de 35 produtos químicos

Lindano, este produto químico não afetam a integridade da membrana celular

As três medidas de viabilidade celular foram bastante semelhantes valores CE50

aproximadamente um terço dos produtos químicos

Diferenças observadas parece ser independente das propriedades físico-químicas

Comparação de valores Vivo−In Vitro 10 vezes mais sensível do que o teste in vivo

2, 4-dinitrofenol (DNP-17-vezes)

pentachlor-ophenol-(PCP-14-vezes)

Poder preditivo da linhagem de células in vitro com base, a CE50

obtidos foram comparados com os peixes de dados de toxicidade aguda

Desenvolvimento de um modelo QSAR onde valores in vivo para todos

os fathead minnow (Pimephales promelas) testados

DISCUSSÃO

A linha celular contribuir para os esforços atuais para substituir ou reduzir o

uso de peixe para testes de toxicidade aguda de substâncias químicas

Estudos anteriores, linhas celulares parecia consistentemente menos

sensível que o peixe e este foi nenhuma diferença na concentração eficaz e

letal para menos de cinco vezes a 73% de produtos químicos

Por outro lado, maior sensibilidade aparente de exposições in vivo e a

dependência das propriedades físico-químicas das substâncias químicas de

teste dados in vitro não influenciam os resultados

A linha celular, RTgill-W1 parece ser capaz de predizer mortalidade aguda de

compostos com um suposto modo específico de ação

Também obteve resultados semelhantes para o embrião do peixe-zebra,

capazes de realizar alguns processos metabólicos

Em resumo,

Valores in vivo e in vitro, com a maioria dos produtos químicos se desvia menos

do que um fator de 5

Determinação das concentrações de exposição a produtos químicos é altamente

recomendada para ter em conta as perdas devido à absorção e evaporação

Uma modificação do teste OECD foi concluído recentemente para o teste de

toxicidade (FET) de embriões de peixe-zebra, como um meio para prever a

mortalidade aguda para peixes adultos

O mesmo nível de reconhecimento internacional poderia ser alcançado com o

ensaio da linha celular RTgill-W1, que compreende uma alternativa real para um

teste para animais

Além de regulação química e potencial aplicação em design de produto e teste

de toxicidade, análise da célula em sua atual linha fornece informações básicas

que serão necessárias para qualquer teste com linha de celular

Além de ser mais ético e econômico, também podem oferecer melhor

conhecimento sobre os modos de acção subjacente a toxicidade de produtos

Bibliografia

[1] Schirmer, K., Tanneberger, K., Kramer, NI, Völker, D., Scholz, S. Hafner, C.,

Lee, LEJ, Bols, NC, Hermens, JLM (2008). El desarrollo de una lista de

sustancias de referencia para las pruebas de las alternativas a los ensayos de

toxicidad de peces enteros. Aquatic Toxicology 90, 128-137

[2] Schirmer, K. (2006). Propuesta para mejorar los cultivos de células de

vertebrados para establecerlos como sustitutos para el análisis reglamentario

de los productos químicos y efluentes utilizando peces.Toxicología 224, 163-

183

[3] Grimm, V., Ashauer R., Forbes, V., Holman, U., Preuss, TG, Schmidt, A.,

van den Brink, PJ, Wogram, J., Thorbek, P. (2009). CREAM: un proyecto

europeo sobre Modelos de Efectos mecanicistas de Evaluación de Riesgos

Ecoloigcal de Productos Químicos. ESPR, en prensa

Neste momento, há poucas opções de tratamento disponíveis

(Nordmann et al., 2009; Pournaras et al., 2009).

BACTÉRIAS MULTIRRESISTENTES

Seminario de Investigación del laboratorio Hospital de Pediatría Prof. Dr Juan P. Garrahan. 15 de Octubre 2012

Grudman et al., 2006.

"Investigação da eficácia antibiótica de compostos bioativos de plantas para o

tratamento do impetigo e descolonização contra Staphylococcus aureus resistentes a

antibióticos em modelo animal". Hospital de Pediatría Prof Dr. Juan P. Garrahan-

Buenos Aires. 2012.

Bioativos plantas mostrou efeitos atb in vivo contra SARM

Fig. 4. Antibacterial effect of the rosemary compound in the skin infection model in mice infected with MRSA 1977 strain. The number of bacteria (CFU) extracted from each mouse is represented by the symbol. The median value of the data for each group is shown as a horizontal bar. The number of mice in each experimental group was as follow: untreated, n = 7; mupirocin, n = 9; Treatment 1, n = 9 ; Treatment 2 , n = 9. The untreated group was treated with vehicle as control of the bacterial growth.

Seminario de Investigación del laboratorio Hospital de Pediatría Prof. Dr Juan P. Garrahan. 15 de Octubre 2012

Table CFU recovered from the skin after the treatment

RESULTADOS: ATIVIDADE ATB IN VIVO CONTRA SARM

“ Irritação primária de pele em coelhos

vs

#Queratinócitos em uma matriz de colágeno e

fibroblastos humano

para bioativas de plantas com potencial de uso

na clínica contra bactérias multirresistentes”

# Banco de tecidos, Hospital Garrahan

www.alttox.org

http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/

http://iccvam.niehs.nih.gov/

http://www.oecd.org/

http://altweb.jhsph.edu/

http://bioinformatics.istge.it/hypercldb/indexes.html

http://oslovet.norecopa.no/

http://www.interniche.org/

http://www.animalearn.org/

http://www.humanesociety.org/

http://www.bio-sim.com/

http://www.hpacultures.org.uk/

•

•INMETRO

•RENAMA

•BRACVAM

RAMA

• I Congresso Latino-americano de Métodos alternativos. 25 al 29 Novembro 2012. Niteroi

• LATINFARMA 2013- 21 al 25 Outubro 2013. La Habana

II Congresso Latino-Americano de Métodos Alternativos

• 9º WC em Métodos Alternativos 24 al 28 de Agosto 2014. Praga

• III Congresso Latino-Americano de Métodos Alternativos. 10/2014.Aacytal. Buenos Aires

Muito obrigado!!!!