NÚCLEO DE ESTUDOS E TREINAMENTO DA SBAC-PE- NETSBAC-PE -

2005

BACTERIOLOGIA CLÍNICAJurandi David

MANUAL DE IDENTIFICAÇÃO DAS ENTEROBACTÉRIAS

TESTES BIOQUÍMICOS (SIMPLIFICADOS) E ASPECTOS MORFOCOLONIAL PARA IDENTIFICAÇÃO DAS Enterobacteriaceae:

Escherichia coliKlebsiella

EnterobacterSerratiaProteus

SalmonellaShigella

ProvidenciaCitrobacter

EdwardsiellaHafnia

YersiniaFamília das ENTEROBACTERIACEAE

A família das Enterobacteriaceae é composta de numerosos gêneros de bacilos Gram negativos, entretanto, cerca de 10 são responsáveis pela maioria

de infecções clínicas, incluindo-se: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Morganella, Citrobacter, Serratia, Salmonella, Shigella e Yersinia.

Várias espécies de Enterobacteriaceae colonizam o trato intestinal de humanos, porém, podem causar tanto infecções do trato intestinal como extra-intestinal, especialmente em pacientes imunocomprometidos. As infecções extra-intestinais mais comuns causadas pelas enterobactérias são: urinária, trato respiratório, feridas e do sangue. Quatro gêneros são conhecidos por causar infecções intestinais: Escherichia coli (enteropatogenicas), Salmonella, Shigellas e Yersinia. Um quinto gênero que tem sido implicado nas doenças diarréicas, Plesiomonas, está em vias de ser incluído na família das Enterobacteriacae.

A família das enterobacteriaceae não formam esporos. Crescem bem sob condições aeróbicas nos meios de rotina laboratorial, incluindo agar sangue. Geralmente, as enterobactérias crescem abudantemente depois de 18 a 24 h a 35O C.

Alguns gêneros apresentam características morfocolonial típicas: Klebsiella pode se apresentar na forma de colônias mucóides (Fig. 4); Proteus apresenta um véu espalhando-se por toda a placa; Yersinia, colônias pequenas e puntiformes, Serratia apresenta pigmentação vermelha quando incubada no meio de Mueller-Hinton a temperatura ambiente, devido a uma substância conhecida como prodigiosina (Fig. 10). Enterobacter sakazakii apresenta pigmentação amarela.

Os caracteres indicador, seletivo e diferencial dos meios de cultura utilizados no isolamento primário das amostras para cultura, manifestam-se das seguintes formas:

- Agar MacConkey: distingue os gêneros fermentadores de lactose dos não fermentadores. Os que fermentam a lactose tomam a cor rosa ou avermelhada os que não fermentam apresentam-se incolor (Fig. 9). A cor rosa escuro que envolve as colônias de E.coli e outros gêneros que fermentam a lactose, ocorre devido a precipitação dos sais de bile contido no meio (Fig. 9). O ágar MacConkey não possui glicose em sua composição.

- Agar Hektoen: ajuda a diferenciar patógenos entéricos dos não patógenos. Devido constar em sua formulação salicina e citrato férrico amoniacal, a maioria dos gêneros da flora normal do intestino fermenta a salicina produzindo uma cor salmom (Fig. 2), enquanto os entéricos patogênicos não fermenta a salicina e as colônias se apresentam na cor verde (Fig. 11). O citrato férrico amoniacal permite a detecção de H2S (gás sulfídrico) produzido pelas Salmonellas, manifestando-se como pigmentação de cor escura (Fig. 12). O sorbitol adicionado ao ágar MacConkey serve para identificar a E. coli O157:H7 em amostras de fezes sanguinolenta e auxilia o diagnóstico da Síndrome uremica hemolítica (SUH). As colônias de E. coli O157:H7 apresentam-se incolores (sorbitol negativo) enquanto as outras espécies apresentam-se na cor rosa (sorbitol positivo) (Fig.8). A OXOID comercializa esse meio sob o código CM 813 (Agar MacConkey sorbitol).

1

As Enterobacteriaceae são muito ativas bioquimicamente. Fermentam a glicose e outros carboidratos, com ou sem, produção de gás, são oxidase negativa (se o gênero Plesionoma for incluído será uma exceção), catalase positiva e reduz nitrato a nitrito. Uma vasta bateria de testes bioquímicos pode ser utilizada para identificação das enterobactérias, porém na rotina laboratorial , sem prejuízo da segurança do diagnóstico e por medida de economia, procuramos simplificar o número de testes desde que os mesmos nos conduza até a identificação do gênero bacteriano e muitas vezes identifica-se até a espécie (Ex: Shigellas). Testes propostos constituídos pelos seguintes meios de cultura:

- Triagem - TSI (triple sugar iron) (ver fig. pág. 9) - onde se avalia a capacidade de a bactéria fermentar ou não, glicose, lactose, sacarose; produzir ou não H2S; produzir ou não gás (CO2 e H2) .

Demais testes:

- S I M - avalia a capacidade de a bactéria produzir ou não, H2S; de produzir ou não indol e de ser ou não móvel.

- Uréia - avalia a capacidade de a bactéria hidrolizar ou não, a uréia (ver fig. pág. 8).

- Citrato - avalia a capacidade de a bactéria utilizar ou não o carbono (C) de uma fonte inorgânica que é o citrato sódico (ver fig. pág. 8).

Outras provas adicionais poderão ser utilizadas quando se encontrar dificuldades na identificação utilizando apenas os meios acima descritos. Sugerimos os seguintes meios: LDC (lisina descarboxilase), ODC (ornitina descarboxilase), Malonato, fenilalania desaminase.

CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS SEGUINTES GÊNEROS: Escherichia , Shigella e Salmonella

a) Escherichia coli

E. coli enquadra-se no grupo entérico Escherichia coli-Shigella. Atualmente, o gênero Escherichia é composto por 5 espécies, porém a única de interesse clínico é a E.coli. A E.coli é encontrada normalmente no trato gastrointestinal de humanos e animais.

A disseminação de E. coli é feita de pessoa – pessoa pela rota fecal-oral ou por contaminação de alimentos, água, leite e alimentos mal cozidos. Podem causar infecção gastrointestinal e extra-intestinal, nesta última, compreendendo: trato urinário; septicemia; pneumonia nosocomial; meningites em recém-nascidos e infecção de feridas.

As espécies de E.coli que causam gastroenterites ou enterites, podem ser agrupadas em 5 (cinco) diferentes apresentações clínicas:

2

1) entorotoxigenica – diarréia do viajante ;2) enteropatogênica clássica – causa de diarréia em crianças no mundo inteiro,

provocando febre, vômitos e diarréia aquosa;3) enteroinvasora – doença diarréica ;4) enterohemorrágica O157:H7 – colite hemorrágica e se associa à síndrome

uremica hemolítica (HUS) em crianças e adolescentes . Produza a toxina Shiga-like;

5) enteroagregativa – a mais recente, se associa á diarréia crônica e persistente.

E. coli diferencia-se das demais enterobactérias pela reação MUG positiva (metilumberifenil--D-glucoronide). Esse teste é utilizado na detecção de E. coli em amostras de água.

A maioria das E. coli é móvel, com exceção da espécie enteroinvasora, que é imóvel (mobilidade negativa).

Algumas espécies de E. coli pode não fermentar a lactose, podendo ser confundida com o gênero Shigella .

A Shiga-like toxina produzida pela E. coli O157:H7, só pode ser identificada em cultura de células ou técnicas moleculares.

b) Shigella

O gênero Shigella é composto de 4 espécies dos sub grupos A, B, C e D.

- A - S. dysenteriae; - B - S. flexneri; - C - S. boydii; - D - S. sonnei.

As Shigellas são anaerogênicas (não produzem gás), não fermentam a lactose, com exceção de S. sonnei que fermenta tardiamente.

Sintomas clínicos mais comuns: autolimitada, inicialmente com febre, cólicas abdominais, diarréia aquosa. Poucos dias após a instalação do quadro as fezes apresentam muco e sangue, sugerindo que a bactéria penetra na mucosa intestinal . Grande número de leucócitos PMN pode ser observado no Gram das fezes.

S. dysenteriae, causa disenteria, sendo a mais severa forma de Shigelose devido a produção de toxina Shiga. A síndrome uremica hemolítica é uma das mais sérias complicações da infecção. É rara ser isolada no Brasil.

Humanos são os reservatórios naturais das Shigellas que se disseminam pelo contato de pessoa-pessoa ou por via de alimentos e água contaminados. Cerca de 10 (dez) bactérias podem causar uma infecção, comparando com 100.000 (cem mil) de Salmonella ou outro patógeno entérico, para causar uma

3

infecção. Por tal razão, Shigelose é a mais comum infecção entre o pessoal que trabalha em laboratório .

S. sonnei é a espécie mais comum causadora de Shigelose em países em desenvolvimento, seguida de S. flexneri. Isolados de S. dysenteriae é difícil de ser encontrado, caso seja identificado, o fato deverá ser levado ao conhecimento das autoridades sanitárias.

c) Salmonellas

O gênero Salmonella é composto de duas espécies: S. entérica e S. bongori , existindo atualmente, mais de 2.400 membros antigênicos distintos das duas espécies. S. entérica subespécie entérica (I) é isolada de humanos e do sangue de animais de campo.

A maior parte das infecções por Salmonellas são causadas por contaminação alimentar ou da água. Outros reservatórios inclui contato com os animais colonizados pelo microrganismo e contato humano. As infecções são autolimitadas; causam diarréias que se alogam por uma semana. S. typhi causa séria sepse conhecida como febre tifóide. Os sintomas inclui febre e dor de cabeça, normalmente sem diarréia. A infecção é mais comum em países em desenvolvimento. Infecções similares são comuns por Salmonellas sorotipos paratyphi A, B e C. Surtos de infecção causados por Salmonellas sorotipo Enteritidis tem aumentado nos EUA e geralmente está associado a contaminação alimentar, incluindo a ingestão de ovos crus ou mal cozidos. As Salmonellas sorotipo Typhimurium são mais resistentes a ação dos antimicrobianos.

O meio de cultura Agar bismuto sulfito, é o preferido para isolamento primário da Salmonella typhi (Fig. 16).

CONSIDERAÇÕE GERAIS SOBRE OS GÊNEROS: Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Pantoea e Raoultella

a) Klebsiella

Recentemente as espécies de Klebsiella: ornithinolitica, planticola e terrigenea , foram transferidas para um novo gênero criado: Raoultella. Ficou definido também, que as espécies ozanae e rhinoscleromatis são subespécie de Klebsiella pneumoniae.

Espécies de Klebsiella encapsuladas produzem colônias mucóides devido a grande quantidade de polissacarídeos presentes na cápsula.

b) Enterobacter

Existe atualmente 14 espécies do gênero Enterobacter, das quais, 10 têm sido encontradas em amostras clínicas. E. agglomerans foi transferido para o

4

novo gênero Pantoea. As duas espécies de Enterobacter mais comuns nos isolados de amostras clínicas, têm sido : E. aerogenes e E. cloacae.

c) Citrobacter

Duas novas espécies foram incluídas recentemente no gênero: gilleni e murliniae. Ficou definido que a denominação do Citrobacter diversus passa a ser Citrobacter koseri. As espécies mais comuns isoladas na clínica são: freundii; braaki e youngae . Várias espécies de Citrobacter produzem H2S, porém, outras não.

d) Serratia

Sete espécies de Serratia têm sido isoladas de amostras clínicas. As espécies marcescens, rubidae e plymutica produzem um pigmento vermelho devido a substância denominada prodigiosina.

Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter e Serratia, causam uma grande variedade de infecções, principalmente em pacientes hospitalizados. Tais bactérias são conhecidas por causar sepses, infecções respiratórias e raramente, meningites. Podem disseminar-se por transmissão de pessoa- pessoa, fluidos intravenosos e processos médicos invasivos. Espécies multiresistentes aos antimicrobianos têm causado surtos hospitalares, geralmente localizando-se em pacientes de UTI.

CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS GÊNEROS: Yersinia, Proteae (tribo), Edwardsiella e Hafnia

a) Yersinia

Compreende três espécies patógenas: pestis, enterocolitica e pseudotuberculosis. Existe mais 6 espécies que têm sido isoladas de amostras clínicas . Todas as espécies são móveis, exceto a Y. pestis.

Vamos nos referir apenas à espécie enterocolitica. Esta espécie é encontrada no mundo inteiro e as infecções devido a mesma, são adquiridas pela ingestão de alimentos e água contaminados. Y. enterocolitica pode causar enterocolite em humanos e mimetizar apendicite aguda pelo quadro que apresenta de linfodenite mesentérica e dores abdominais.

O meio de cultura ágar CIN (Cefsulodina-irgasan-novobiocina) é o mais específico e indicado para o isolamento da Yersinia enterocolitica. . As colônias de Aeromonas spp no meio CIN apresentam similar aparência Yersinia, sendo diferenciado pelo teste da oxidase (Aeromona +).

As espécies de Yersinia: frederiksneii, intermédia, mollarettii, bercorvier, rohdei e Kristensenii, têm sido isoladas de amostras clínicas, porém suas patogenicidades não foram estabelecidas. Se forem isoladas em amostras fecais devem ser reportadas como não patogênicas.

5

b) Tribo Proteae, Proteus, Providencia e Morganella

São normalmente encontrados no trato gastrointestinal de humanos e podem causar infecções do trato urinário, podendo também ser encontrados em outros tipos de amostras. Atualmente existe 4 espécies de Proteus: mirabilis, vulgaris, penneri e myxofaciens. 5 espécies de Providencia: rettgeri, stuartii, alcalifaciens, rustigianii e heimbachae. 1 espécie de Morganella: morganii.

O Proteus mirabilis é o mais freqüente isolado dessa tribo. Causa infecção no trato urinário, infecta feridas e provoca septecemias. Está sempre associado ás infecções hospitalares.

Todos os gêneros da tribo Proteae são fenilalanina desaminase positivo. Os gêneros Proteus, Morganella e Providencia rettgeri são urease positivo.

Morganella morganii e Providencia sppsão virtualmente resistentes a ampicilina e cefalosporinas de 1ª e 2ª gerações por produção de beta-lactamase cromossômica AmpC. O teste do citrato é útil para distinguir o gênero Morganella (-) do gênero Providencia (+).

CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS GÊNEROS: Edwardsiella e Hafnia

a) Edwardsiella (ver fig. pág. 13)

Existe 3 espécies, porém a Edwardsiella tarda é a que mais se associa á doenças humanas. É causadora de um quadro de enterocolite similar a Salmonella, especialmente em crianças e adolescentes. Edwardsiella lembra muito a Salmonella nos seus aspectos morfocolonial e bioquímico, sendo diferenciado com os testes de indol (+) e citrato (-)

b) Hafnia

Possui apenas uma espécie: alvei. É encontrada no trato intestinal de humanos, sendo responsável por uma variedade de infecções oportunistas. Anteriormente, era classificada no gênero Enterobacter, porém Hafnia é lactose negativa (ver fig. pág 12) e Enterobacter lactose positiva. São muito similares em suas reações bioquímicas, exceto no teste do citrato: Hafnia é citrato negativo .

Interpretação dos testes

1 – Aspectos morfocoloniais nos meios seletivos e indicadores Ágar MacConkey (MC) e Ágar Hektoen (HE)

6

MC

Colônias lactose negativa Colônias lactose positiva (incolores) (rósea)

HE

Colônias amarelas, Colônias verdes, não fermentadoras Colônias verdes com fermentadoras de lactose de lactose, característica do pigmentação escura, e salicina, normalmente gênero Shigella características dos gêneros: não patogênicas entéricas (Plesiomonas shigelloides apresenta Salmonella, Proteus,

as mesmas características sendo Edwardsiella e Citrobacter diferenciada de Shigella pelo

teste de oxidase positivo)

2 – Testes bioquímicos

Meio de SIM

3 gotas do reagente de Kovac

7

Teste da urease

– +

Teste de mobilidade Teste do citrato

O indicador de mobilidade utilizadofoi o cloreto detrifeniltetrazolio (TTC)

– + – +

Triagem no TSI: Ácido/Ácido – com gás

8

Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3

Fig. 4 Fig. 5

E. coli Klebsiella Enterobacter Yersinia

Gênero Indol Mobilidade Uréia CitratoSorologia específica

Citrobacter koseri* V + + + XE. coli + +*** - - XEnterobacter spp - + - + XKlebsiella spp** - - + + XYersinia enterolítica - - + - +

V – variável.* – C. freundii é indol positivo.** – K. ozaenae é uréia negativa.*** – E. coli enteroinvasora é imóvel (mobilidade -).MacConkey – figuras 1, 4 e 5.Hektoen – figuras 2 e 3.

Triagem no TSI: Ácido/Ácido – com gás e H2S

MacConkey Hektoen Citrobacter (colônias escuras) Citrobacter Serratia

9

Fig. 6 Fig. 7

P. vulgaris Citrobacter

Gênero Indol Mobilidade Uréia CitratoProteus vulgaris + + + -Citrobacter spp V* + + +

* – C. koseri é indol +.

Triagem no TSI: Alcalino/Ácido

MacConkey - sorbitol MacConkey

E. coli E. coli E. coli sorbitol negativo sorbitol positivo O157:H7

10

Shigella

Fig. 8 Fig. 9

Hektoen

Shigella

Fig.10 Fig. 11 Shigella

Gênero Indol Mobilidade Uréia CitratoPigment. vermelha

Sorologia específica

E. coli + +* - - - X K. rhinoscleromatis - - - - - X Morganella + + + - - XProteus peneri - + + - - XProvidencia spp + + -** + - XSerratia spp - + - + +*** XShigella - - - - - +Yersinia spp - - + - - +

* – E. coli entoroinvasora é imóvel (mobilidade -).** – P. rettgeri é uréia +.*** – No meio de Mueller-Hinton, temp. ambiente.

Triagem no TSI: Alcalino/Ácido – com gás

Hektoen

11

Fig. 12 Salmonella spp

MacConkey

Hafnia

Fig.13 Hafnia

GêneroIndol Mobilidade Uréia Citrato

Sorologia específica

E. coli + + - - *Citrobacter spp - + - + XEnterobacter spp - + - + XHafnia - + - - XKlebsiella spp - - + + XProteus myxofaciens - + + - XProvidencia alcalifaciens + + - + XSalmonella entérica-para typhi

- + - + +

Serratia spp - + - + X

* – Sorologia para os grupos: clássica e enteroinvasora.

Triagem no TSI: Alcalino/Ácido – H2S

Hektoen

12

Colônias escuras Fig. 14 Proteus mirabilis(H2S +) são sugestivasdos gêneros Hektoendeste grupo

Fig. 15 Edwardsiella

Gênero Indol Mobilidade Uréia CitratoSorologia específica

Citrobacter spp - + - + XEdwardsiella tarda + + - - XProteus mirabilis - + + - XSalmonella spp - + - +* +**

* – S. typhi é citrato -.** – Sorologia com soro polivalente para Salmonella.

Triagem no TSI: Alcalino/Ácido – H2S fraco

Ágar bismuto sulfito

Colônias de Salmonella typhi

13

Fig. 16

H2S +

Salmonella entérica sorovar typhi

Gênero Indol Mobilidade Uréia CitratoSorologia específica

Salmonella entérica sorovar typhi

- + - - +*

* – Sorologia com soro polivalente para Salmonella.

Bactérias consideradas agentes de infecção do canal alimentar

EXOGENO ENDOGENO

Organismo DoençaMecanismoda doença

Organismo Doença

CompylobacterSpp.

Gastroenterite In/Inf/P BOCA

14

Salmonellaenteritidis

Gastroenterite In/InfStreptococcus

sanguis

Cárie dental e abscesso

dental

Salmonellatyphimurium

Gastroenterite In/InfStreptococcus

mutans

Cárie dental e abscesso

dental

Shigella dysenteriae

Desinteria bacilar In/Inf Prevotella sppGengivites,

periodontites

Shigella flexneri

Gastroenterite In/InfPorphyromonas

sppGengivites,

periodontites

Shigella boydii Gastroenterite In/Inf Fusobacterium sppGengivites,

periodontites

Shigella sonnei Gastroenterite In/Inf INTESTINO

Escherichia coliO157

Colite hemorrágica,

síndrome urêmica hemolítica e

falência renal crônica e aguda

T Streptococcus spp

Diverticulites, abcesso no apêndice,

sepses hepatobiliar e

peritonites

Salmonella typhi

Febre entérica tifóide

P Enterococcus spp Idem

Salmonella paratyphi

Febre entérica PColiformes

(Escherichia coli)Idem

Vibro cholerae Cólera T Klebsiella spp Idem

Staphylococcus aureus

Vomito (com diarréia)

T Bacteroides spp Idem

Bacillus cereusVomito (com

diarréia)T

PeptostreptococcusPeptococcus spp

Idem

Helicobacter pylori

Úlceras péptica/gástrica

MalignidadesT/Inf Clostridium spp Idem

Clostridium difficile

Diarréia associada ao uso de antibiótico

TLEGENDA:In – invasiva; Inf – inflamatória; P – penetração; T – toxina.

Bibliografia

MAZA, L. M. etal – Color Atlas of Medical Bacteriology, 2004 – ASM Press. Washington, D.C.STRUTHERES, J. Y. e WESTRAN, R. P. – Clinical Bacteriology, 2003 – ASM Press. Washington, D.C.

15

Contato

Jurandi David da SilvaProf. de Bacteriologia Clínica do NETSBAC-PE

e-mail: davibac@ig.com.brjurandidavid@bol.com.brdavibac@uol.com.br

telefone: (81) 3469-1901(81) 3421-7368(81) 9172-2946

16