Enzimas Cap 05 - Sa Pereira P

BIOPROCESSOS PARAPRODUÇÃO DE ENZIMAS

Elba P.S.Bon, Nei Pereira Jr.,

Leda Maria Fortes Gottschalk, Paula Sá-Pereira,

José Carlos Roseiro e Maria Antonieta Ferrara

SUMÁRIOAs enzimas industriais são majoritariamente produzidas por microrganismos, emboraalguns biocatalisadores sejam extraídos de tecidos animais e vegetais. Para o desenvolvi-mento dos processos microbianos de produção de biocatalisadores, diversos aspectosdevem ser otimizados com vistas à obtenção de elevados rendimentos e produtividades:linhagem produtora, matéria-prima empregada e formulação do meio de cultivo e oti-mização de parâmetros operacionais. Os processos industriais compreendem um con-junto de operações que incluem o tratamento da matéria prima, o preparo e esteriliza-ção de meios de propagação e produção e a fermentação propriamente dita. A esta, se-guem-se as etapas de separação e concentração de produto, seguidas ou não da sua pu-rificação. Os processos industriais de produção de enzimas são desenvolvidos, em suamaior parte, em cultivos submersos aerados, em biorreatores com agitação mecânica,que permitem maior controle dos parâmetros operacionais. A batelada alimentada é aforma mais empregada de condução do bioprocesso. O cultivo no estado sólido étambém utilizado, principalmente nos países orientais por apresentar vantagens para aprodução de algumas enzimas, especialmente as produzidas por fungos filamentosos.

Avanços recentes nas técnicas de biologia molecular, notadamente a expressão he-teróloga em espécies microbianas seguras e de fácil cultivo, têm aumentando o leque deenzimas obtidas por processos microbianos, permitindo a obtenção de maiores rendi-mentos e produtividades. Estas técnicas devem continuar a impulsionar a diversificaçãoe o desenvolvimento da produção de enzimas em escala industrial.

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INTRODUÇÃOAs enzimas estão presentes em todas as células vivas, onde exercem a função de catalisa-dores das reações que compõe as vias catabólicas e anabólicas do metabolismo celular.Esses biocatalisadores são moléculas de proteínas e seu poder catalítico está associado àconformação nativa, que depende de condições específicas de pH, temperatura e forçaiônica do meio (ATLAS, 1997; MADIGAN et alii, 2000). Condições ambientais afasta-das das ótimas podem provocar a desnaturação da biomolécula, isto é, mudança na suaestrutura tridimensional nativa, freqüentemente irreversível, acompanhada de perdade sua atividade catalítica.

Embora alguns biocatalisadores sejam extraídos de tecidos animais (por exemplo,pancreatina, tripsina, pepsina e renina) e vegetais (por exemplo, papaína, bromelina,ficina, malte, peroxidase), as enzimas industriais são, na sua maior parte, obtidas a par-tir de microrganismos (LAMBERT e MEERS, 1983; EUROPEAN COMISSION, 2002;ANTRANIKIAN, 2005; OLEMPSKA-BEER et alii, 2006; SANT’ANNA JR., 2001). A tabe-la 5.1 apresenta exemplos de enzimas comerciais microbianas.

Os microrganismos são as principais fontes de enzimas industriais e especiais devi-do à grande variedade de atividades catalíticas, à possibilidade da produção das enzimaspor processos fermentativos em grande escala com a regularidade necessária e à simpli-cidade dos requerimentos nutricionais. Muitas enzimas, entretanto, ainda são extraídasde tecidos vegetais e animais, com sua produção influenciada pela sazonalidade.

Como as enzimas são proteínas, sua estrutura é codificada por genes específicos e asíntese envolve transcrição, tradução e processos pós-traducionais (ATLAS, 1997;MADIGAN et alii, 2000). Algumas enzimas estão sempre disponíveis e são designadasconstitutivas, enquanto outras, designadas indutivas, são sintetizadas em resposta àscondições ambientais. Com relação a estas últimas, as células possuem mecanismos deregulação da expressão gênica, que são acionados, dentre outros fatores, por substânci-as que podem exercer o papel de indutores, ativadores, inibidores ou repressores(ATLAS, 1997 e MADIGAN et alii, 2000).

A biossíntese da enzima pode ser associada ao crescimento sendo, então, a taxa deformação de produto proporcional ao aumento da biomassa; ou não associada ao cres-cimento celular e, nesse caso, a taxa de formação de produto é independente da taxa decrescimento celular ou varia com a taxa específica de crescimento de forma complexa(NIELSEN et alii, 2003; SCHMIDELL et alii, 2001).

As enzimas microbianas podem ser intracelulares como a glicose oxidase, peri-plásmicas como a invertase e a asparaginase de leveduras ou extracelulares, como asproteases e as carboidrolases. As enzimas microbianas excretadas são normalmentemais estáveis e produzidas em maiores quantidades. Estes biocatalisadores têm a fun-ção principal de degradar macromoléculas presentes no meio ambiente, como a celu-lose, o amido, a lignina e proteínas, para absorção dee seus componentes como nutri-entes.

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO96

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Tabela 5.1 Exemplos de enzimas comerciais obtidas a partir de microrganismos

Enzima Microrganismos produtores

aminopeptidase Aspergillus niger, A. oryzae, Lactococcus lactis, Rhizopus oryzae

Alfa-amilase Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, B.

licheniformis

Catalase Aspergillus niger, Micrococcus luteus

Celulase Aspergillus niger, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, Humicola

isolens, Streptomyces lividans, Trichoderma reesei. T. viride,

Dextranase Chaetomium erraticum, Penicilium lilacinum

Alfa-galactosidase Aspergillus niger,

Beta-glucanase Aspergillus niger, A. aculeatus, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis,

Humicola isolens Talaromyces emersonii

Fitase Aspergillus niger

Glucoamilase Aspergillus niger, Rhizopus delemar, R. niveus, R. oryzae

Glicose isomerase Streptomyces murinus, S. olivochromogenes,

Hemicelulase Aspergillus niger, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis

Inulase Aspergillus niger

Invertase Saccharomyces cerevisiae

Lactase Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis,

Lípase Aspergillus niger, Penicilium camembertii, Candida lipolytica, C.

rugosa, P. roqueforti, Rhizopus oryzae

Pectinase Aspergillus aculeatus, A. niger, A. pulverulentuns, Penicilium

funiculosum

Protease Bacillus halodurans, Aspergillus melleus, A. niger, A. oryzae, B. subtilis,

B. licheniformis, Penicilium citrinum, Rhizopus niveus, S. fradiae

Pululanase Bacillus acidopullulyticus, B. circulans

Xilanase Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Humicola insolens, Penicilium

funiculosum, Trichoderma reesei

Fonte: European Comission, 2002.

Embora a maioria das enzimas industriais seja exocelular e produzida por fungos ebactérias, a tecnologia do DNA recombinante vem sendo crescentemente utilizada para aprodução de biocatalisadores. No atual estágio de conhecimentos, é teoricamente possívelexpressar qualquer enzima de interesse, codificada por genes de origem animal, vegetal oude microrganismos, em microrganismos hospedeiros bem adaptados à fermentação emlarga escala. É de especial importância a expressão heteróloga nas bactérias Escherichiacoli, Bacillus subtilis e B. licheniformis, nas leveduras Saccharomyces cerevisiae, Pichia pas-

CAPÍTULO 5 � BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 97

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toris e Hansenula polymorpha (estas duas últimas metilotróficas) e nos fungos Aspergillusniger e Aspergillus oryzae (CEREGHINO e CREGG, 2000; GELLISSEN, 2000; ADRIO eDEMAIN, 2003; OLEMPSKA-BEER et alii, 2006). Exemplos de enzimas comerciais produ-zidas por microrganismos recombinantes são apresentados na tabela 5.2.

Tabela 5.2 Exemplos de enzimas comerciais produzidas por microrganismos recombinantes.

Enzima Organismo doador do gene Microrganismo hospedeiro

aminopeptidase Aspergillus sp. Trichoderma reesei

Alfa-amilase Thermoactinomyces sp. Bacillus amyloliquefaciens,B. subtilis

Arabinofuranosidase Aspergillus sp. Aspergillus niger

Catalase Aspergillus sp. Aspergillus niger

Celulase Myceliopthora sp. Aspergillus oryzae

Quimosina Estômago de bezerro Escherichia coli

Ciclodextrina gluconotransferase Thermoanaerobacter sp. Bacillus licheniformis

Alfa-galactosidase Guar (planta indiana) Saccharomyces cerevisiae

Beta-glucanase Trichoderma sp. Trichoderma reesei

Fitase Peniophora sp. Aspergillus niger

Glucoamilase Dado não disponível Pichia pastoris

Glicose isomerase Actinoplanes sp. Streptomyces lividans

Lacase Myceliopthora sp. Aspergillus oryzae

Lactase Kluyveromyces sp. Kluyveromyces lactis

Lípase Rhizomucor sp. Aspergillus oryzae

Pectina liase Bacillus sp. Bacillus licheniformis

Penicilina amidase Alcaligenes sp. Alcaligenes faecalis

Protease Rhizomucor sp. Aspergillus oryzae

Pululanase Bacillus sp. Bacillus subtilis

Xilanase Bacillus sp. Bacillus subtilis

Fonte: European Comission, 2002.

Abrindo ainda mais o leque de possibilidades do uso industrial de enzimas, exis-tem os biocatalisadores produzidos por microrganismos extremófilos e, particularmen-te, por aqueles do domínio Archea. Estes microorganismos vivem em ambientes hojeconsiderados exóticos, mas que eram comuns na terra primitiva, tais como temperatu-ras elevadas, em alguns casos superiores a 100�C, alta salinidade, valores de pH inferio-


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res a 2,0 ou superiores a 10,0 e estresse nutricional. Apesar dos extremófilos serem co-nhecidos há mais de 40 anos, só recentemente foi intensificada a busca por novas espé-cies. O interesse biotecnológico corrente em enzimas destes microrganismos é motiva-do por sua estabilidade em condições normalmente desnaturantes para enzimas meso-fílicas. As extremozimas, além da sua termoestablidade, são mais estáveis ao pH, con-centração de sais, pressão, solventes orgânicos e metais pesados, do que as enzimas me-sofílicas, e sua atividade pode aumentar na presença de alguns detergentes. Seu uso po-deria, em princípio, eliminar a necessidade da adição de reagentes estabilizadores deenzimas, reduzindo os custos de processos enzimáticos.

Atenção particular vem sendo dada às extremozimas de microrganismos extremó-filos e hipertermófilos. Um grande número de extremozimas de arquéas hipertermofí-licas, intracelulares ou extracelulares, tem sido investigado e dados referentes à sua pro-dução, purificação, caracterização estrutural e funcional estão disponíveis na literatura.

As extremozimas podem também formar a base de processos inteiramente novos.O exemplo mais marcante é a Taq polimerase, de Thermus aquaticus, que é empregadaamplamente nos procedimentos de PCR (polymerase chain reaction). Esta técnica, in-ventada em meados da década de 80 por Kary Mullis da Cetus Corporation, é atualmen-te a base para análises forenses, como, por exemplo, o mapeamento de DNA (DNA-fin-gerprinting) para exames de paternidade e procedimentos de criminalística. A técnicaPCR, também usada em diversas áreas de pesquisas e em diagnósticos médicos (porexemplo, na detecção de infecção por HIV), aumentou a sensibilidade das técnicas deprocura de várias doenças genéticas, incluindo algumas formas de câncer.

Na PCR, uma enzima conhecida como DNA polimerase, copia repetidas vezes a fitade DNA, produzindo grande quantidade de material genético. Este processo requer oaquecimento e resfriamento da mistura de reação em repetidos ciclos. Na época em queMullis inventou a técnica, a polimerase utilizada era originária de microrganismos quenão eram termófilos e, assim, a atividade cessava na etapa de incubação a quente do pro-cedimento e era necessária a reposição manual da enzima a cada ciclo. Para solucionar oproblema, no final da década de 80, os pesquisadores isolaram a DNA polimerase deThermus aquaticus (Taq polimerase), que é muito tolerante ao calor, o que levou ao de-senvolvimento de uma tecnologia de PCR totalmente automatizada. Esta bactéria termo-fílica foi isolada, em 1965, de uma piscina de água fervente do Parque Nacional Yellowsto-ne, nos Estados Unidos da América. Para sobreviver, T. aquaticus sintetiza enzimas queatuam em temperaturas elevadas, dentre as quais uma DNA polimerase, que auxilia a bac-téria a produzir o seu próprio DNA. A polimerase de T. aquaticus é ativa em temperaturassuperiores a 95°C. Outras aplicações de PCR envolvem tanto exames de paternidade eanálises em criminalística. Mais recentemente, alguns usuários de PCR passaram a substi-tuir a Taq polimerase pela Pfu polimerase, isolada da Archaea hipertermofílica Pyrococ-cus furiosus, que tem atividade ótima em 100�C. O potencial industrial das extremozimasé muito grande e, por esta razão, o número de extremozimas isoladas, clonadas e caracte-rizadas vem aumentando rapidamente (ANDRADE et alii, 1999; ANTRANIKIAN et alii,2005; ATLAS, 1997; EUROPEAN COMISSION, 2002; JORGENSEN, 1997; MADIGAN etalii, 2000; MORACCI, 1995; NUNES, 1995; STETTER, 1999; WOESE et alii, 1990).

Apesar das diferenças existentes entre as diversas classes de microrganismos pro-dutores de enzimas, principalmente entre os procariotas e eucariotas, e também entre


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as enzimas com relação a massa molecular, propriedades físico-químicas e grau de gli-cosilação, os mecanismos básicos da biossíntese enzimática são similares o suficientepara permitir um tratamento genérico do processo microbiano da sua produção.

MICRORGANISMOS PRODUTORES: CARACTERÍSTICAS ENUTRIÇÃOA primeira etapa da produção microbiana de uma enzima de interesse consiste na iden-tificação e aquisição do microrganismo produtor, que pode ser uma linhagem selvagemou modificada por genética clássica ou por técnicas de biologia molecular. A linhagemde interesse pode ser adquirida de coleções de cultura científicas ou de serviço ou sele-cionada a partir de amostras de solo, água, ar, tecidos vegetais como caules ou frutas emdecomposição, fezes de animais e vísceras de insetos como os cupins e outras fontes.

Idealmente, o microrganismo a ser utilizado em um processo de produção de enzi-ma deve ter as seguintes características:

� Ser seguro sob o ponto de vista biológico (status GRAS – generally recognized assafe).� Apresentar elevada capacidade de síntese e excreção da enzima.� Suportar condições ambientais adversas, relacionadas com a pressão osmótica, a

temperatura e a força iônica do meio.� Ser tolerante à presença de substâncias tóxicas, que podem ser geradas no pro-

cesso de tratamento da matéria-prima ou pelo próprio metabolismo celular.O melhoramento de linhagens produtoras, para atender total ou parcialmente os

critérios acima, tem sido fundamental para a produção de enzimas em larga escala. A mu-tagênese clássica era tradicionalmente empregada com este objetivo. O uso recentemen-te da tecnologia do DNA recombinante permite o aumento substancial do rendimentoem enzima através da utilização de promotores eficientes e da introdução de múltiplas có-pias do gene que codifica para a enzima de interesse (PENG et alii, 2005; EUROPEANCOMISSION, 2002; ADRIO e DEMAIN, 2003; OLEMPSKA-BEER et alii, 2006).

A manutenção e a preservação de microrganismos são etapas de extrema impor-tância para assegurar a sua viabilidade e prevenir mudanças genéticas que levem à redu-ção ou perda de propriedades fenotípicas. Técnicas de manutenção e conservação demicrorganismos estão amplamente descritas na literatura e incluem repicagens perió-dicas, conservação em parafina ou em glicerol, liofilização e crioconservação (DEMAINe SOLOMON, 1986).

O crescimento do microrganismo em biorreatores para a produção da enzima deinteresse está diretamente relacionado à disponibilidade das substâncias necessárias asuas necessidades nutricionais. Água, fontes de carbono e energia, nitrogênio e oxigê-nio são algumas das necessidades comuns a todos os microrganismos. Os microrganis-mos necessitam ainda de elementos minerais tais como fósforo, enxofre, potássio, cál-cio, magnésio, sódio, ferro e, em alguns casos, cloro. Requerem também os chamadoselementos traços, que desempenham importante papel como constituintes de enzimase coenzimas. Estes últimos incluem manganês, cobre, zinco, molibdênio, cromo, ní-


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quel, cobalto e boro e são, em geral, necessários em pequenas quantidades(JENNINGS, 1988).

O potencial para metabolizar fontes de carbono varia entre os microrganismos. Deuma forma geral, os compostos orgânicos da natureza, incluindo desde os chamadoscompostos C1 (CO, CO2, formaldeído, metanol, metilamina), até as macromoléculascomplexas (amido, proteínas, lipídios, celulose, hemicelulose, lignina, ácidos nucléi-cos), podem ser utilizados como fonte de carbono e/ou energia, desde que os micror-ganismos possuam os sistemas enzimáticos extra- e intracelulares e de transporte ade-quados. As macromoléculas são inicialmente convertidas extracelularmente a subuni-dades menores por enzimas hidrolíticas, sendo, então, transportadas para o interior dacélula e metabolizadas em vias catabólicas e/ou anabólicas. Os carboidratos são a prin-cipal fonte de carbono e de energia, sendo a glicose a fonte de carbono universal(KRÄMER e SPRENGER, 1993; MADIGAN et alii, 2000; ATLAS, 1997; CORTE-REAL etalii, 2003).

Os microrganismos apresentam grande diversidade na assimilação de fontes de ni-trogênio: os autotróficos são capazes de utilizar nitrato, amônio e, em alguns casos, ni-trogênio gasoso como única fonte de nitrogênio. Outros, entretanto, necessitam do su-primento deste elemento sob a forma de compostos orgânicos, como aminoácidos ouuréia (MADIGAN et alii, 2000).

Muitos microrganismos são incapazes de sintetizar certos aminoácidos, purinas, piri-midinas ou vitaminas que, sendo constituintes obrigatórios de proteínas estruturais oufuncionais, ácidos nucléicos ou coenzimas, devem ser adicionados ao meio de culturasempre que necessário. Estas substâncias são denominadas fatores de crescimento(MADIGAN et alii, 2000). Ressalta-se que microrganismos recombinantes podem reque-rer a complementação do meio de cultura com fatores de crescimento como resultadodos procedimentos de Biologia Molecular, que muitas vezes utilizam marcadores nutrici-onais para a seleção dos transformantes (GLAZER e NIKAIDO, 1995; WALKER, 1998).

O oxigênio faz parte da composição da maioria das moléculas que constituem a es-trutura celular e das que integram o metabolismo. Assim sendo o seu suprimento sob aforma gazosa e/ou ligado molecularmente é essencial para a manutenção do metabo-lismo da maior parte dos microrganismos aeróbios ou anaeróbios.

MEIOS DE CULTURA PARA PRODUÇÃO DE ENZIMASAs características físico-químicas do meio de cultivo são de fundamental importância, nãoapenas para o crescimento celular como também para o rendimento em produto. Istoocorre porque as células são capazes de responder aos estímulos químicos e físicos domeio externo através de mecanismos bioquímicos que regulam a expressão gênica e a fisi-ologia do microorganismo e, por extensão, seu desempenho na formação do produto de-sejado. Conforme já mencionado, esses mecanismos são acionados, dentre outros fato-res, por indutores, ativadores, inibidores e repressores (ATLAS, 1997; MADIGAN et alii,2000).

A regulação por glicose da produção de enzimas extracelulares tem sido muito es-tudada e é bem conhecido o efeito repressor deste açúcar na produção de varias enzi-


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mas, como celulases, amilases (LAMBERT e MEERS, 1983) e invertase (DYNESEN etalii, 1999; GEORIS et alii, 1999). Recentemente, a regulação por nitrogênio passou adespertar interesse devido ao efeito negativo do sulfato de amônio na produção de al-gumas enzimas como ligninases, peroxidases e particularmente glicoamilase produzidapor Aspergillus awamori (BON, 1993).

A regulação por nitrogênio de enzimas intracelulares de levedura tem sido extensi-vamente estudada (MAGASANIK e KAISER, 2002) assim como a interrelação entre asvias de sinalização da regulação da expressão gênica via o circuito do carbono e do nitro-gênio (BERTRAM, 2002; COOPER, 2002). Adicionalmente, a partir dos estudos da regu-lação por nitrogênio da enzima asparaginase II, localizada no espaço periplásmico de Sac-charomyces cerevisie, e cuja atividade aumenta durante a estarvação por nitrogênio(DUNLOP e ROON, 1975), aprofundaram-se os estudos sobre sua regulacão por nitro-gênio e também a da enzima invertase, igualmente localizada no periplasma da célula dalevedura (BOM, 1997; OLIVEIRA, 2003; OLIVEIRA, 2005). Estes trabalhos identificarampadrões comuns da regulação por nitrogênio das enzimas intracelulares e periplásmicasde leveduras, indicando a importância desta regulação na expressão dos genes que codifi-cam para enzimas industriais de interesse e por extenção no rendimento do processo deprodução. Assim sendo, identificada a regulação por nitrogênio, deve ser evitado, na for-mulação do meio de cultivo, o uso de fontes de nitrogênio repressoras, como amônio, efavorecido o uso de fontes não repressoras, como uréia ou prolina.

Processos microbianos industriais podem utilizar meios de composição quimica-mente definida ou meios complexos. No primeiro caso, os componentes do meio são, namedida do possível, qualitativa e quantitativamente conhecidos. Esses meios apresentam,em geral, elevado custo e são empregados principalmente para a produção de enzimas te-rapêuticas. Os meios de composição complexa, utilizados na maioria dos processos, em-pregam matérias-primas industriais, provenientes principalmente do setor agrícola,como por exemplo, melaço, açúcar não refinado, licor sulfítico, sucos de fruta e materiaisamiláceos (milho, arroz, batata, trigo, etc.) (EUROPEAN COMISSION, 2002; KRISHNA,2005; SPENCER-MARTINS e SÁ-NOGUEIRA, 2003).

A matéria-prima é um dos componentes mais relevantes nos custos de produção,podendo representar, em alguns casos, até 75% do custo total, sendo esta uma das ra-zões para o crescente interesse no aproveitamento de resíduos lignocelulósicos agroin-dustriais e florestais como matérias-primas para processos microbianos industriais.Estes resíduos, dentre os quais destacam-se bagaço de cana-de-açúcar, sabugo de milho,palha de arroz e farelo de trigo, são de grande interesse por não possuírem custos deprodução diretos. O uso em bioprocessos representa, assim, uma forma de se agregarvalor a resíduos abundantes, dando solução para seu acúmulo, que representa um sérioproblema ambiental.

Viabilidade técnica, balanços energéticos e economicidade são aspectos relevantesque devem ser considerados na escolha da matéria-prima. Em geral, esta deve apresen-tar as seguintes características:


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� Ter composição adequada para o crescimento do microrganismo e formação doproduto de interesse.

� Ter baixo custo de obtenção, beneficiamento, transporte e estocagem.

� Ter elevada disponibilidade e facilidade de padronização dos componentes.

�Não contribuir para dificultar os processos de separação do produto.

O perfil das matérias-primas tradicionalmente utilizadas nos processos microbia-nos convencionais não sofreu significativas modificações nos últimos cinqüenta anos. Ouso da tecnologia do DNA recombinante, entretanto, vem gradativamente aumentan-do a importância de fontes de carbono pouco utilizadas anteriormente. Como exem-plo, a crescente utilização das leveduras metilotróficas Pichia pastoris e Hansenula poly-morpha, para a produção de enzimas recombinantes preconiza o seu crescimento inici-al em fontes de carbono menos repressoras como o glicerol e a indução do gene deinteresse com metanol (CEREGHINO e CREGG, 2000; GELISSEN, 2000).

As principais fontes de carbono e energia para os processos microbianos são osaçúcares, como glicose e sacarose. Outras importantes fontes são as matérias-primasamiláceas e lignocelulósicas.

Os substratos na forma polimérica podem exigir hidrólise prévia, química ou enzi-mática, se o agente microbiano não for capaz de sintetizar enzimas extracelulares neces-sárias para a sua degradação. No caso de fermentações no estado sólido, pode-se pres-cindir de pré-tratamentos, intensivos em energia e, conseqüentemente, onerosos, jáque muitos microrganismos têm a habilidade de atacar o complexo contendo ospolissacarídeos e outras macromoléculas.

A escolha da fonte de carbono é muito importante pois a síntese de diversas enzi-mas está sujeita à repressão catabólica. A glicose, por exemplo, apesar de ser, em geral,excelente fonte para crescimento celular, tem sido reportada, conforme já menciona-do, como repressora para a produção de diversas enzimas, como á-amilase, celulase e

invertase. Para manter baixa a concentração de carboidrato durante o processo fer-mentativo, este pode ser adicionado gradativamente durante o processo fermentativo(batelada alimentada) ou ainda podem ser utilizadas fontes de assimilação lenta, comoamido ou lactose. Para a obtenção de rendimentos elevados de alguns biocatalisadores,como lactase e pectinase, a presença do substrato é requerida para indução da sínteseda enzima (MADIGAN et alii, 2000).

Entre as fontes de nitrogênio inorgânicas, o sulfato de amônio é o sal mais utilizadodevido ao seu baixo custo, mas pode-se também empregar o nitrato de sódio. Adicional-mente, existe uma grande disponibilidade de fontes de nitrogênio orgânico de grandeaplicação em processos microbianos industriais, como a uréia. As principais fontes de ni-trogênio complexas empregadas são: extrato de levedura, rico em vitaminas do comple-xo B e aminoácidos; licor da maceração do milho, subproduto da industrialização do mi-lho, fonte bem balanceada em carbono, nitrogênio, enxofre e sais minerais, contendoainda vitaminas, como riboflavina, niacina, ácido pantotênico, biotina e piridoxina; fari-nha de soja, resíduo da indústria de produção de óleo de soja, rico em nitrogênio, o qual


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é, entretanto, mais complexo e de mais difícil assimilação do que o nitrogênio do licor damaceração do milho (EUROPEAN COMISSION, 2002; SANT’ANNA JR., 2001).

Da mesma forma que as fontes de carbono, as fontes de nitrogênio devem ser esco-lhida com bastante critério. Conforme mencionado anteriormente, fontes de nitrogê-nio chamadas de preferenciais, ricas ou de fácil metabolismo, como o íon amônio, aglutamina, a asparagina e a mistura de aminoácidos e peptídeos presentes na peptona eem outros concentrados protéicos comerciais, são repressoras da produção de diversasenzimas. Ao contrário, prolina e uréia, ornitina e alantoina, entre outros, chamadas defontes não preferenciais, pobres ou de difícil metabolismo, são fontes de nitrogênionão repressoras e, portanto, o seu uso favorece, em geral, a produção de enzimas(ADRIO, 2003; WALKER, 1998; MAGASANIK e KAISER, 2002; BON e WEBB, 1993).

A otimização da composição do meio de cultura para obtenção do máximo rendi-mento em produto não é uma tarefa fácil. Abordagens empíricas têm sido tradicional-mente adotadas, nas quais os efeitos de cada componente do meio sobre o rendimentoem biomassa e produto são investigados em frascos agitados. As fontes de carbono sãoexaminadas e, posteriormente, as fontes de nitrogênio, até que todas as combinaçõesdos componentes do meio tenham sido examinadas, determinando-se assim o meio decomposição otimizada. Ressalte-se que este procedimento envolve um grande númerode experiências e demanda bastante tempo, sendo os constituintes investigadosindividualmente e, via de regra, ignorados os efeitos interativos entre os mesmos.

Métodos estatísticos, que permitem otimizar as concentrações dos componentesfundamentais do meio, podem ser utilizados para aumentar a eficiência desta etapa.Após seleção dos principais componentes do meio que afetam o rendimento em produ-to e produtividade, eles são combinados em altas e baixas concentrações (ausente, senão essencial para o crescimento), de acordo com uma metodologia estatística (plane-jamento fatorial), que permite o planejamento de 2n experimentos, onde ‘n’ é o núme-ro de variáveis envolvidas. Desta forma, o efeito de um componente individual no rendi-mento em produto pode ser determinado com um número relativamente pequeno deexperimentos, mesmo que os demais componentes variem (DEMAIN e SOLOMON,1986; RODRIGUES e IEME, 2005).

O valor do pH do meio de cultura é parâmetro de fundamental importância e tam-bém deve ser otimizado, de forma a proporcionar um bom crescimento celular e eleva-dos rendimentos em produto, devendo-se levar em conta, logicamente, a preservaçãoda atividade biológica da enzima. Se a produção da enzima de interesse não for associa-da ao crescimento celular, o valor do pH ótimo da etapa de crescimento pode ser dife-rente daquele da etapa de produção do biocatalisador. Este é o caso da produção de di-versas enzimas heterólogas pela levedura metilotrófica Pichia pastoris, como por exem-plo, a enzima asparaginase (FERRARA et alii, 2006).

PROCESSOS MICROBIANOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMASO processo microbiano de produção de enzimas, quer nativas ou recombinantes, com-preende um conjunto de operações que incluem o tratamento da matéria prima, o pre-


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paro de meios de propagação e produção, a esterilização e a transformação do substratoem produto por via bioquímica, seguida de processos de separação e purificação doproduto. Um esquema simplificado é apresentado na figura 5.1.


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Figura 5.1 Esquema simplificado de um processo microbiano de produção de enzima.

TRATAMENTO DAMATÉRIA PRIMA

PREPARO DOMEIO

EFLUENTE /RESÍDUO

TRATAMENTO /APROVEITAMENTO

ESTERILIZAÇÃO

BIORREATOR DEPROPAGAÇÃO

BIORREATORDE PRODUÇÃO

INOCULAÇÃO

BANCO DECÉLULAS

FILTRAÇÃODO AR

AERAÇÃO

SEPARAÇÃODE CÉLULAS

BIOMASSA

MEIO ISENTODE CÉLULAS

ROMPIMENTOCELULAR

PURIFICAÇÃO DABIOMOLÉCULAINTRACELULAR

PURIFICAÇÃO DABIOMOLÉCULA

EXTRACELULAR

BIOMOLÉCULACOM ALTO GRAU

DE PUREZA

BIOMOLÉCULACOM ALTO GRAU

DE PUREZA

EFLUENTE /RESÍDUO

TRATAMENTO / APROVEITAMENTO

EsterilizaçãoA maior parte dos processos de produção de enzimas ocorre com culturas puras. Assim,para prevenir contaminações, o bioprocesso é conduzido sob condições assépticas. Ossubstratos sólidos são mantidos em câmaras a temperatura elevada por períodos detempo apropriados, enquanto que os meios líquidos são esterilizados no próprio bior-reator ou em vasos separados.

A esterilização com vapor saturado sob pressão é a mais usual para meios de cultura eequipamentos, e pode ser realizada em conjunto ou separadamente e, ainda, em batela-da ou de forma contínua (BAILEY e OLLIS, 1986; RAJU e COONEY, 1993; SCHMIDELLet alii, 2001).

Na prática industrial, é comum a esterilização de meios de cultura de forma des-contínua em conjunto com o biorreator, fazendo-se passar vapor saturado sob pressãoatravés de serpentinas ou camisas (aquecimento indireto), ou introduzindo-se o vaporsaturado pelo difusor do vaso, sob agitação mínima (aquecimento direto). Neste últimocaso, deve-se levar em consideração a diluição do meio de cultura causada pela conden-sação do vapor ao entrar em contato com a superfície mais fria do meio. A temperaturausual de esterilização é de 121�C.

Na esterilização descontínua, o tempo total de esterilização é relativamente gran-de, podendo dar origem à decomposição de nutrientes termo-sensíveis, como as vitami-nas, ou provocar reações indesejáveis entre os constituintes do meio, como por exem-plo, reações entre aminoácidos e açúcares (reação de Maillard). Esta modalidade de es-terilização vem sendo substituída, sempre que possível, pela esterilização contínua, naqual a integridade dos constituintes do meio é conservada mais eficazmente, já que oaquecimento e o arrefecimento são praticamente instantâneos.

Em processos aeróbicos, o ar deve ser esterilizado antes de ser fornecido à cultura.Esta esterilização normalmente é efetuada por filtração com lã de vidro, material sinte-rizado ou membranas apropriadas (SANT’ANNA JR., 2001; EUROPEAN COMISSION,2002; RAJU e COONEY, 1993; SCHMIDELL et alii, 2001).

FermentaçãoOs processos microbianos de produção de enzimas ocorrem basicamente em cultivossubmersos e cultivos no estado sólido, sendo os primeiros os mais utilizados industrial-mente.

Cultivo submerso

Os processos submersos são aqueles em que a célula produtora se desenvolve no seio domeio de cultivo, sob agitação. No caso de fermentações aeróbicas, o oxigênio necessário àpopulação em desenvolvimento é suprido por borbulhamento de ar no líquido através deum compressor. As fermentações são conduzidas em biorreatores aerados e agitados me-canicamente (figura 5.2), em geral com volumes entre 20 e 200 m3, podendo chegar a 1000 m3. Os parâmetros operacionais, tais como pH, temperatura, consumo de oxigênio eformação de dióxido de carbono, são medidos e rigidamente controlados (MCNEIL eHARVEY, 1990; LAMBERT e MEERS, 1983; EUROPEAN COMISSION, 2002).


1ª prova

Os processos submersos oferecem uma série de vantagens, tais como:

� Facilidade de controle de variáveis físico-químicas do processo.

�Maior eficiência de absorção de nutrientes e excreção de metabólitos pela célu-la, levando a menores tempos de processo e conseqüentemente, a ganhos emprodutividade.

Dentre as desvantagens podem ser citados:

� Elevados custos com aeração e agitação, especialmente quando do uso de meiosreacionais com alta viscosidade e reologia complexa.

� Formação de espuma.

Os bioprocessos submersos podem ser operado de três modos: batelada simples,batelada alimentada ou contínuo. A batelada simples, na qual uma suspensão celular éadicionada ao meio de cultivo e o processo é transcorrido sem adição ou retirada demeio reacional, já foi a forma mais utilizada de produção de enzimas microbianas, sen-do, hoje em dia, pouco empregada. Caracteriza-se por alterações nas condições ambi-entais a dutante todo o processo: as concentrações de nutrientes diminuem e de célu-las, produtos e subprodutos aumentam (BAILEY e OLLIS, 1986; NIELSEN et alii, 2003;NIELSEN e VILLADSEN, 1993; SCHMIDELL et alii, 2001). O principal problema destaforma de operar processos microbianos é decorrente de fenômenos de inibição pelosubstrato, produto ou outros metabólitos.


1ª prova

Figura 5.2 Biorreator agitado mecanicamente.

Para contornar os problemas de inibição/repressão, outras formas de conduçãopodem ser utilizadas, como a batelada alimentada e suas variantes, que permitem a ma-nutenção da concentração dessas substâncias em níveis subinibitórios/sub-repressores,com implicações diretas no desempenho da célula (NIELSEN e VILLADSEN, 1993;SCHMIDELL et alii, 2001).

A batelada alimentada é definida como um modo de operação em que um ou maisnutrientes necessários ao crescimento celular e/ou formação de produto são adiciona-dos ao biorreator de forma intermitente ou continua, sem que ocorra retirada de mate-rial durante a operação.

A flexibilidade de operação oferecida por esta forma de fermentação é adequada aprocessos microbianos em que o crescimento celular e/ou formação de produtos sãosignificativamente sensíveis à concentração do substrato limitante. É adequada à produ-ção de várias enzimas extracelulares, uma vez que a formação destas biomoléculas é mu-itas vezes sujeita à repressão pelo substrato. Embora a cultura em batelada simples tenhasido inicialmente utilizada em muitos bioprocessos, a prática industrial mostra que ocultivo em batelada alimentada tem efeito favorável no acúmulo de muitas enzimas ex-tracelulares, sendo este processo hoje em dia muito utilizado na indústria de produçãode enzimas tais como amilases, celulases e proteases (EUROPEAN COMISSION, 2002).

Este modo de condução do bioprocesso tem sido também empregado com suces-so para a produção de enzimas heterólogas pela levedura metilotrófica Pichia pastoris.Neste caso, preconiza-se um cultivo multiestágio que permite atingir elevadas densida-des celulares (da ordem de 100 g l-1 em peso seco), no qual, inicialmente, a célula cresceem glicerol em batelada alimentada e, em seguida, a expressão da enzima é induzidaatravés do cultivo em metanol, também em batelada alimentada (GELISSEN 2000;CEREGHINO e CREGG, 2000; FERRARA et alii, 2006).

Apesar dos processos em batelada simples ou batelada alimentada serem emprega-dos com mais freqüência, a cultura contínua, na qual a alimentação de nutrientes e a reti-rada de produtos é efetuada continuamente durante o processo fermentativo (NIELSENe VILLADSEN, 1993; SCHMIDELL et alii, 2001), é empregada em algumas situações,como para a produção de glicose isomerase por Bacillus coagulans (LAMBERT eMEERS, 1986).

A principal vantagem da cultura contínua está ligada à possibilidade de se operar osistema por extensos períodos de tempo, resultando em aumento de produtividade.Adicionalmente, o agente biológico converte substrato em condições estacionárias,que podem ser determinadas previamente para o seu melhor desempenho. Outras van-tagens da condução contínua podem ser apontadas (BRITO, 2000): inexistência detempos improdutivos, levando o fermentador a permanecer muito mais tempo em ser-viço; as operações que antecedem e sucedem o processo podem ser realizadas continua-mente; possibilidade de instrumentação e controle automático, reduzindo os gastoscom mão-de-obra; e maior uniformidade do produto, tendo em vista que as condiçõesambientais são mantidas constantes. Os principais problemas dessa forma de conduçãosão a baixa concentração da enzima em comparação à batelada alimentada e o alto riscode contaminação e de degeneração da linhagem microbiana (EUROPEANCOMISSION, 2002).


1ª prova

Cultivo no estado sólido

Não obstante a fermentação submersa ter sido durante muito tempo, e ser até hoje, atecnologia mais empregada para a produção de enzimas, existe grande interesse em uti-lizar a fermentação no estado sólido com esta finalidade.

A fermentação no estado sólido é definida como um processo em que o crescimen-to microbiano e a formação de produto ocorrem na superfície de substratos sólidos naausência de água livre. É distinta da fermentação submersa, em que, via de regra, ossubstratos e outros nutrientes encontram-se na forma solúvel. Os substratos tradicional-mente utilizados são produtos agrícolas, como arroz, trigo, painço, cevada, milho e soja,além de substratos não convencionais, como os resíduos agroindustriais e florestais. Emlinhas gerais, a operação da fermentação no estado sólido pode ser realizada sem agita-ção mecânica, com agitação ocasional ou contínua, ou em colunas recheadas com cir-culação de líquido (MITCHELL et alii, 2000; PANDEY et alii, 2000; PANDEY et alii,2001; KRISHNA, 2005; COUTO e SANROMÁN, 2006).

A fermentação no estado sólido apresenta as seguintes vantagens:� Simplicidade dos meios de cultivo (o substrato sólido pode requerer somente

adição de água, embora outros nutrientes possam ser adicionados).� Ausência de requerimentos de máquinas e equipamentos sofisticados.� Possibilidade de uso de biorreatores com dimensões menores pelo fato do subs-

trato estar concentrado.� Reduzido consumo de energia.� Baixo grau de umidade, reduzindo os problemas de contaminação.� Condições de crescimento do microrganismo semelhantes às encontradas em

seu ambiente natural.�Maiores concentrações de enzima em relação às fermentações submersas.� Estabilidade da enzima excretada e baixo nível de repressão catabólica.� Ausência de formação de espuma.� Possibilidade de extração imediata do produto através da adição direta de sol-

ventes ou por filtração do meio fermentado.� Pequenas quantidades de águas residuais.Existem entretanto fatores limitantes nas fermentações no estado sólido, tais

como:�Menor acessibilidade ao substrato.� Problemas de transferência de massa (oxigênio e nutrientes), calor e quantida-

de de movimento.�Dificuldades de controle de variáveis físico-químicas, tais como pH, temperatu-

ra, oxigênio e grau de mistura.�Dificuldades no aumento de escala.Diversas enzimas de importância industrial, como proteases, amilases, glucoamila-

se, celulases, xilanases e pectinases são produzidas por fermentação no estado sólido.


1ª prova

Esforços também vêm sendo envidados para a produção de fitase, tanase e esterases,dentre outras enzimas (KRISHNA, 2005; COUTO e SANROMÁN, 2006).

Dentre os microrganismos, os fungos filamentosos, principais produtores de enzi-mas comerciais, são também os mais importantes e os que melhor se adaptam à fermen-tação no estado sólido. Sua forma de crescimento em hifas e boa tolerância à baixa ativi-dade de água e elevada pressão osmótica conferem aos fungos vantagens com relaçãoaos microrganismos unicelulares para a colonização de substratos sólidos. Poucos traba-lhos foram desenvolvidos sobre a produção de enzimas por bactérias ou leveduras utili-zando esta tecnologia. Como exemplos podem ser citados: a produção de alfa amilasepor Aeromonas caviae, de celulases por Bacilus subtilis e de lipases por Candida rugosa(KRISHNA, 2005).

Quase todas as enzimas conhecidas e produzidas por outros processos poderiam,em teoria, ser obtidas por fermentação no estado sólido. Entretanto, e apesar das diver-sas vantagens citadas acima, esta tecnologia atualmente é muito mais desenvolvida nomundo oriental.

Controle do bioprocesso

Conforme já mencionado, as enzimas podem sofrer desnaturação quando submetidasa determinadas condições ambientais, que variam para cada enzima. Assim sendo, parâ-metros operacionais do bioprocesso, tais como pH e temperatura, devem ser rigida-mente controlados, de forma a garantir não apenas a manutenção das condições ótimasde cultivo do microrganismo produtor, mas também a preservação da atividadebiológica da enzima.

A concentração de oxigênio dissolvido também tem efeito marcante no crescimen-to celular e na síntese de enzimas. A maioria dos processos de produção de enzimas é ae-róbica, mas em alguns casos a limitação do fornecimento de oxigênio pode ser vantajosa,como no caso de produção de amiloglucosidase por Aspergilus niger (LAMBERT eMEERS, 1986). Condições anaeróbicas são utilizadas para a produção da enzima colage-nase por uma bactéria do gênero Clostridium.

Os processos aerados podem ser conduzidos com aeração natural ou forçada. Naprimeira modalidade, o oxigênio provém do ar ambiente. Grande parte dos processosconduzidos no estado sólido, descritos anteriormente, é aerado de forma natural.

Nos processos microbianos com aeração forçada em culturas submersas, o ar at-mosférico esterilizado é borbulhado no seio do meio, onde se dissolve parte do oxigê-nio que é utilizado pelo agente microbiano. Algumas vezes emprega-se oxigênio puroou misturado com ar, o que resulta em aumento na transferência de massa da fase gáspara a fase líquido, com a conseqüente melhoria do processo (AUNINS e HENZLER,1993; SCHMIDELL et alii, 2001).

O fornecimento de oxigênio a uma cultura em desenvolvimento constitui-se mui-tas vezes na limitação da tecnologia de produção. É de fundamental importância, porexemplo, a aeração de processos que utilizam leveduras metilotróficas para a produçãode enzimas heterólogas (GELISSEN 2000; CEREGHINO e CREGG, 2000).


1ª prova

SEPARAÇÃO, CONCENTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS

As operações que se seguem ao processo fermentativo (downstream) são de extremaimportância devido ao custo substancial de separação, concentração e/ou purificaçãodas enzimas de interesse tecnológico. O grau de pureza das enzimas comerciais varia depreparações enzimáticas brutas até altamente purificadas e depende da sua aplicação fi-nal. Além disso, a escolha do procedimento de purificação depende de sua origem (ani-mal, vegetal ou microbiana).

Geralmente, as preparações enzimáticas comerciais consistem essencialmente dosobrenadante da fermentação concentrado, ao qual podem ser misturados aditivospara estabilizar a atividade enzimática. São removidas, apenas, substâncias que podeminterferir no processo onde o biocatalisador será utilizado. Etapas de purificação desne-cessárias devem ser evitadas, pois são custosas em termos de equipamento, mão de obrae perda da atividade enzimática (EUROPEAN COMISSION, 2002). A figura 5.3 ilustraas etapas envolvidas na recuperação de enzimas e que envolvem procedimentos especí-ficos e brandos em relação ao pH, temperatura e força iônica, adequados à manutençãoda conformação nativa do biocatalisador e, por extensão, da sua atividade.


1ª prova

Figura 5.3 Etapas envolvidas na recuperação das enzimas (GERHARTZ, 1990).

Fermentação

PlantasÓrgãos de animais Microrganismos

Rompimento

Extração

Enzima Intracelular Enzima Extracelular

Rompimento

Filtração

Concentração

Purificação

Secagem

Produto Final

Quando a enzima é de origem animal, como a protease tripsina, os órgãos devemser transportados em baixa temperatura, congelados, triturados e as enzimas subse-qüentemente extraídas com uma solução tampão. No caso de enzimas provenientes detecidos vegetais, como papaína e bromelina, o material vegetal é triturado e as enzimasextraídas com o uso de solução tampão (GERHARTZ, 1990).

Etapas iniciais de separação e concentraçãoA maior parte das enzimas comercializadas industrialmente é extracelular e a primeiraetapa para o isolamento é a separação das células do meio de cultura. No entanto, existemenzimas intracelulares de grande interesse tecnológico e, neste caso, a primeira etapa deseparação envolve a ruptura das células, que pode ser feita utilizando-se métodos mecâni-cos, como a homogeneização em alta pressão e a moagem úmida. No primeiro método,que é o mais utilizado, as células são rompidas por forças cisalhantes seguida de simultâ-nea descompressão do sistema. Pode ocorrer inativação parcial das enzimas devido aoaquecimento e às fortes forças cisalhantes, devendo haver resfriamento adequado duran-te o processo. No caso da moagem úmida, são utilizadas bolas de vidro para a ruptura dascélulas. Além destes métodos, existem métodps outros não mecânicos, em que a rupturadas células é feita por lise química, térmica ou enzimática (SCHÜTLE e KULA, 1993;ABRAHÃO NETO, 2001; EUROPEAN COMISSION, 2002).

Após a ruptura das células, a próxima etapa é a separação das enzimas dos fragmen-tos celulares. Esta operação, que na indústria é efetuada por filtração contínua, é bastantecomplicada devido ao pequeno tamanho dos fragmentos celulares e à pequena diferençaentre a sua densidade e a do meio fermentado. No caso de se trabalhar com células maio-res, como leveduras, pode-se usar decantação. Os métodos mais conhecidos para separa-ção são: centrifugação, floculação, flotação, extração e filtração (GERHARTZ, 1990).

Atualmente, foram desenvolvidas centrífugas eficientes para separar as células efragmentos celulares em processo contínuo. A centrifugação tem sido empregada emgrande escala por ser sabidamente um método brando de simples aplicação e de baixoimpacto no rendimento final. O seu custo, no entanto, é relativamente alto e dificil-mente atinge-se a clarificação desejada da corrente de alimentação. A extensão da apli-cação das centrífugas depende do tamanho da partícula e do conteúdo de sólidos. Cen-trífugas tubulares envolvem forças centrífugas maiores e podem ser utilizadas para sedi-mentar partículas pequenas, mas não podem ser usadas continuamente. As centrífugascom discos empilhados, também conhecidas como separadores, foram desenvolvidaspara serem usadas continuamente na remoção de material sólido de suspensões. Os de-cantadores, que trabalham com baixa força centrífuga, são usados na separação de célu-las maiores ou de proteínas precipitadas (STEPHANOPOULOS, 1993).

A floculação de células pequenas para a formação de partículas maiores pode serobtida pela adição de colóides minerais, sais ou polímeros orgânicos (SANTOS et alii,1992). Os aglomerados podem ser então removidos por filtração ou por centrifugação.Se não houver a formação de agregados, as células podem ser separadas por flotação. Ascélulas são adsorvidas em bolhas de gás, levadas ao topo e acumuladas na espuma(GERHARTZ, 1990).


1ª prova

A extração líquido-líquido em sistema aquoso de duas fases tem sido usada paraisolar enzimas intracelulares. Este método se baseia na mistura incompleta de diferen-tes polímeros (por exemplo, polietileno glicol (PEG)/dextrana) (ENFORS et alii,1992) ou de um polímero com um sal em solução aquosa. A primeira etapa da extraçãosepara os fragmentos celulares. Este método também pode ser utilizado na purificaçãode enzimas.

Durante a filtração de suspensões, o aumento da espessura da torta que se forma eda resistência causam a diminuição do fluxo. Dificuldades adicionais podem surgir de-vido à compressibilidade do material biológico. Os filtros a pressão, por terem uma ca-pacidade limitada, são geralmente usados na etapa final de filtração de soluções enzi-máticas. Os filtros a vácuo são normalmente escolhidos devido à compressibilidade domaterial biológico. O filtro rotatório a vácuo é muito usado para filtração contínua degrandes volumes (EUROPEAN COMISSION, 2002).

Recentemente, a filtração em fluxo cruzado (“cross flow filtration”) vem ganhan-do espaço para a separação (microfiltração) e para a concentração de enzimas(ultrafiltração).

Na filtração convencional, a solução ou suspensão é pressionada contra a membra-na, que deixa passar o solvente e os solutos dissolvidos. Os materiais em suspensão ficamretidos, acumulando-se na interface da membrana/solução, um fenômeno conhecidocomo polarização de concentração. Na filtração em fluxo cruzado, conhecida tambémcomo filtração tangencial, a solução de alimentação escoa tangencialmente pela super-fície da membrana, enquanto o permeado é transportado transversalmente à mesma.Neste caso, é possível operar o sistema em regime estabelecido. A polarização de con-centração continua presente, mas seu efeito é minimizado através da alteração da hi-drodinâmica de escoamento da corrente de alimentação (HABERT et alii, 1997). Na fi-gura 5.4 estão representados esquematicamente os dois modos de operação e suascurvas típicas de fluxo do permeado em função do tempo, mostrando que no fluxocruzado pode-se atingir o regime estabelecido.

A microfiltração com fluxo cruzado tem sido bastante mencionada na literatura(GOKLEN et alii, 1994; SANTOS et alii, 1992; JUNKER et alii, 1993).

Depois da separação, o volume a ser processado é geralmente grande, devendo serreduzido por concentração para garantir que se possa posteriormente alcançar umapurificação economicamente viável. A concentração das enzimas pode ser feita atravésde evaporadores a vácuo, por precipitação ou por ultrafiltração, em condições brandasque não levem à inativação das enzimas. A precipitação é um procedimento simplespara a concentração de enzimas que pode ser efetuada por adição de sais, solventes or-gânicos, soluções de polímeros ou por alteração do pH. No entanto, a precipitação é ge-ralmente utilizada em pequena escala porque quando o volume a ser processado é mui-to grande, o tempo de residência necessário é extremamente longo, especialmente nocaso de solventes orgânicos, podendo resultar na inativação das enzimas (GERHARTZ,1990).


1ª prova

A ultrafiltração representa técnica atrativa para a concentração de enzimas e suapurificação primária (KRSTIC et alii, 2007). A seletividade é definida pela relação de ta-manho entre as espécies presentes e os poros da membrana. A enzima que se desejaconcentrar deve ser inerte em relação ao material da membrana e o fluxo permeado éfundamentalmente convectivo devido à força motriz que é o gradiente de pressão. Oprocesso de ultrafiltração é um método comercialmente viável com uma alta produtivi-dade, além de oferecer uma pureza razoável. Adicionalmente, é extremamente simplesdo ponto de vista operacional e de escalonamento, por possuir sistemas modulares defácil operação (LI et alii, 2006).

Durante a concentração por ultrafiltração, independentemente da operação serdo tipo convencional ou tangencial, a concentração do soluto na interface membra-na/solução aumenta, já que a membrana é, supostamente, seletiva para o soluto. Imedi-atamente inicia-se uma retrodifusão deste soluto em direção ao seio da solução, estabe-lecendo-se um perfil de concentração do soluto nas proximidades da interface mem-brana/solução. Este fenômeno, que é conhecido como polarização da concentração, éreversível e se estabelece rapidamente podendo provocar uma queda inicial acentuadado fluxo do permeado. Além disto, pode ocorrer queda do fluxo devido a problemas deadsorção do soluto na membrana e eventual entupimento dos poros, fenômenos geral-mente irreversíveis, conhecidos como fouling (GOTTSCHALK, 2002). Esta queda nofluxo do permeado devido à polarização da concentração e ao “fouling” tem uma in-fluência negativa na viabilidade econômica do processo com membrana, e por esta ra-zão, medidas devem ser tomadas para minimizar sua incidência. Tanto a polarização daconcentração quanto o “fouling” dependem fortemente das condições operacionais eda característica da membrana, como as propriedades da alimentação, peso molecular


1ª prova

Figura 5.4 Filtração convencional x Filtração tangencial (GOTTSCHALK, 2002).

Filtração Convencional Filtração Tangencial

Tempo

Fluxo

Tempo

Fluxo

de corte ou cut off, pressão transmembrana e a velocidade de escoamento tangencial daalimentação (LI et alii, 2007). Para uma mesma pressão de operação, quanto maior a ve-locidade de escoamento tangencial da alimentação menor será a polarização de con-centração (HABERT et alii, 1997).

Diversos trabalhos na literatura utilizam a ultrafiltração para concentrar enzimas(ROSEIRO et alii, 1993; GOTTSCHALK, 2002; TAKAC et alii, 2000; KRSTIC et alii,2007; LI et alii, 2006) e para purificar enzimas em associação a outros métodos de purifi-cação (BÔER et alii, 2006; RIDGWAY e TUCKER, 1999; SRINIVAS et alii, 2002; PARK etalii, 1997; IVANOV et alii, 1996; GAWANDE e PATKAR, 2001).

A diafiltração consiste na operação dos processos de micro ou ultrafiltração comuma alimentação contínua de solvente em vazão igual a do permeado. Trata-se em reali-dade de uma operação de lavagem da solução problema. É bastante utilizada quando sedeseja purificar um determinado soluto de uma solução na qual os contaminantes sãocompostos com dimensões menores do que a do soluto de interesse (CASTRO-OCHOAet alii, 2005).

Na literatura já foram citados mais de 130 materiais utilizados para a fabricação demembranas, no entanto, apenas alguns desses materiais alcançaram uso industrial epoucos tiveram aprovação para aplicação na indústria alimentícia, farmacêutica e deprodutos infantis. Existem três polímeros principais utilizados para fabricação de mem-branas utilizadas para microfiltração e ultrafiltração: acetato de celulose, poliamida epolissulfona (CHERYAN, 1998). Recentemente, o uso de membranas cerâmicas temsido investigado na biotecnologia devido a sua resistência mecânica, térmica e química(KRSTIC et alii, 2007).

Purificação de enzimasPreparações enzimáticas parcialmente purificadas são suficientes para diversas aplica-ções industriais. No entanto, para uso medicinal e analítico ou para aplicação em pes-quisa, as enzimas devem ser extremamente puras, chegando, em alguns casos, em nívelde homogeneidade protéica. Procedimentos especiais, tais como cristalização, eletrofo-rese, diferentes tipos de cromatografia, extração líquido-líquido e fracionamento comespuma, são utilizados para purificação de enzimas, (SÁ-PEREIRA et alii, 2003; UHLIG,1998). Esses procedimentos implicam, em geral, custos bastante elevados,

As enzimas podem ser concentradas por cristalização usando-se sais, como o sulfa-to de amônio, ou solventes orgânicos, como etanol e acetona, mas geralmente a prepa-ração final não apresenta alta pureza, o que limita o uso deste método (JESUS et alii,1999; PARK et alii, 1997).

Já a eletroforese, em que a diferença da mobilidade das proteínas é imposta porum campo elétrico, é usada apenas em laboratório pois o calor gerado durante o pro-cesso e a interferência causada pela convecção são problemas associados ao escalona-mento deste método (GERHARTZ, 1990; SÁ-PEREIRA et alii, 2000).

A cromatografia é uma técnica de fundamental importância para a purificação deenzimas, que podem ser separadas de acordo com o seu tamanho, forma, carga, hidro-


1ª prova

fobicidade e afinidade bioespecífica. A separação cromatográfica é baseada na distribu-ição dos componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel.

Na cromatografia de peneira molecular ou cromatografia de exclusão, as molécu-las de proteínas são separadas pelo seu tamanho e forma. Este método trabalha com vo-lumes pequenos de soluções previamente concentradas, pois a capacidade máxima dacoluna é de 10% do seu volume. É comercialmente usada para separação e desaliniza-ção de soluções enzimáticas (GERHARTZ, 1990; IVANOV et alii, 1996; GAWANDE ePATKAR, 2001).

Na cromatografia de troca iônica, a separação baseia-se na carga líquida das proteí-nas presentes em uma mistura. A carga é influenciada pelo pH e esta propriedade é uti-lizada para separar as espécies protéicas. A capacidade de processamento de volumesmaiores de amostras diluídas torna este método bastante útil para aplicação industrial,desde que se disponha de uma matriz de troca iônica com boa resolução, com altos flu-xos e resistente ao gradiente salino e à mudança de pH (ABRAHÃO NETO, 2001;EUROPEAN COMISSION, 2002).

A cromatografia por interação hidrofóbica baseia-se na interação das regiões hi-drofóbicas das proteínas com os grupos hidrofóbicos da matriz. A adsorção ocorre emaltas concentrações salinas e o fracionamento é alcançado com um gradiente salino ne-gativo. Este método é ideal para a purificação de enzimas que foram concentradas porprecipitação com sulfato de amônio (GERHARTZ, 1990).

A cromatografia de afinidade, por sua vez, baseia-se na ligação bioespecífica da en-zima com ligantes presentes no suporte da coluna, que podem ser substratos ou inibido-res. A enzima de interesse é posteriormente recuperada por eluição com solução de pHou força iônica adequados. A despeito de sua seletividade muito elevada, essa técnicatem aplicação restrita à escala de laboratório ou a segmentos muito específicos, como ocaso das enzimas analíticas (SANT’ANNA, 2001).

A cromatografia de imunoafinidade ocupa um lugar único na tecnologia de purifi-cação pois utiliza anticorpos monoclonais que interagem especificamente com a enzi-ma a ser purificada (GERHARTZ, 1990).

A extração líquido-líquido permite a purificação das enzimas provenientes de caldosfermentativos ou de homogeinados de células (SRINIVAS et alii, 2002; DA SILVA e LOH,2006). A partição bifásica aquosa utiliza as propriedades das soluções de dois polímerosou de um polímero e de um sal de se separarem em duas fases aquosas quando certas con-centrações mínimas são excedidas. As duas fases aquosas assim formadas apresentamcomposição diferente, cada uma delas enriquecida em um dos constituintes do sistema,isto é, os dois polímeros, ou o polímero e o sal, concentram-se em fases distintas. O teor deágua destas fases é usualmente superior a 80%, podendo em alguns casos atingir valoressuperiores a 95%. Os sistemas bifásicos aquosos apresentam, portanto, ambientes suavespara moléculas e partículas biológicas (XU et alii, 2003; BANIK et alii, 2003).

Uma análise econômica sugere que a extração líquido-líquido pode ser favoravel-mente competitiva com as tecnologias já estabelecidas e com as vantagens de escalona-mento fácil, rapidez na purificação e alta seletividade (STEPHANOPOULOS, 1993).


1ª prova

O fracionamento com espuma, uma técnica de separação com bolhas adsortivas,pode ser empregado como um método adicional de purificação de enzimas ou até mes-mo substituir as operações cromatográficas. Especial atenção deve ser dada ao ajuste dosprincipais parâmetros que afetam a distribuição da enzima na espuma, como pH, con-centração da enzima e do detergente, velocidade superficial e tempo de formação de es-puma. Resultados recentes refutaram a hipótese que processos com espuma obrigatoria-mente vem acompanhados de perda da atividade enzimática (LINKE et alii, 2007).

Etapas finais de acabamentoAs preparações enzimáticas, brutas ou purificadas, devem manter as suas característicasde catalisador durante o armazenamento e comercialização até a sua aplicação, pois asenzimas são comercializadas com base na sua atividade catalítica. O fabricante normal-mente indica as condições de armazenamento e a validade da atividade nestas condições.

A maioria das preparações enzimáticas industriais contém, além da enzima ativa, ou-tras proteínas, estabilizantes, preservativos, sais e um diluente que permite a padroniza-ção entre as produções obtidas de diversas bateladas com diferentes atividades específi-cas. Para a manutenção da atividade enzimática é fundamental a preservação de sua con-formação nativa, sendo utilizados, para esta finalidade, aditivos, modificação químicacontrolada ou imobilização enzimática.

A estrutura das proteínas pode ser estabilizada em soluções de força iônica deter-minada de sais neutros, como sulfato de amônio e fosfato de potássio. Adicionalmente,altas concentrações de cloreto de sódio (20%) impedem o crescimento microbiano de-vido ao efeito osmótico. Polióis de baixo peso molecular como glicerol, sorbitol e mani-tol também estabilizam as enzimas e reprimem o crescimento microbiano devido à re-dução da atividade da água (EUROPEAN COMISSION, 2002). Além disso, várias enzi-mas podem ser mantidas na forma liofilizada por longos períodos de tempo na presen-ça de estabilizadores, como sais, carboidratos ou proteínas inertes, predominantemen-te albumina bovina sérica (BSA) (GERHARTZ, 1990). Outras substâncias que podemser adicionadas às preparações de enzimas para sua estabilização incluem: substratos,tióis para manter o ambiente redutor, antibióticos, ésteres de ácidos benzóicos comopreservativos de preparações enzimáticas líquidas, inibidores de enzimas contaminan-tes e agentes quelantes. Os aditivos devem ser compatíveis com o uso final da enzima emquestão. A maioria das preparações enzimáticas é comercializada na forma líquida ougranulada e os detalhes da metodologia empregada na estabilização somente sãorevelados a clientes quando necessário como informação confidencial (EUROPEANCOMISSION, 2002).

PERSPECTIVASA aplicação de técnicas de biologia molecular tem contribuído fortemente para a ex-ploração de novas enzimas e o desenvolvimento de novas propriedades enzimáticas ecertamente continuará a impulsionar o desenvolvimento na área de produção de enzi-


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mas (OLEMPSKA-BEER et alii, 2006; EUROPEAN COMISSION, 2002; ADRIO, 2003;PENG, 2005; OLEMPSKA-BEER, 2006; ANTRANIKIAN, 2005).

O uso dessas novas tecnologias permite aumentos substanciais nos rendimentos eprodutividades enzimáticos através do uso de sistemas de expressão eficientes ou que per-mitam a inserção de multicópias de genes. Assim, novas enzimas, ainda não acessíveis an-teriormente, podem ter seus genes clonados e serem produzidas em microrganismoshospedeiros de fácil cultivo em grande escala. Nesse contexto, são de especial importân-cia as chamadas extreomozimas, biocatalisadores naturalmente estáveis em condições ex-tremas de pH, temperatura e salinidade, obtidos a partir de organismos extremófilos.

Métodos modernos de engenharia de proteínas e de evolução molecular têm per-mitido, por sua vez, o aprimoramento de propriedades de uma dada enzima, tais comoestabilidade, mecanismos catalíticos, tipo e especificidade de substrato, atividade super-ficial, dependência de cofator, pH e temperatura ótimos e parâmetros cinéticos.

A biossegurança da produção de enzimas deve também ser melhorada através darestrição dos microrganismos produtores para poucas espécies bem conhecidas e segu-ras, empregadas como hospedeiras para genes de diversas fontes. Entretanto, a produ-ção de enzimas por microrganismos melhorados por genética clássica continuará a terum papel fundamental na produção de biocatalisadores.

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Enzimas Cap 05 - Sa Pereira P

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