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ENZIMAS EM ENGENHARIA GENTICABrbara Fernandes RodriguesKarine Emanuelle da SilvaLuis Paulo Costa Ribeiro

Divinpolis/MGMaio/2015

Disciplina: EnzimologiaProfessora: Hrica L. Santos

1Engenharia Gentica ou Tecnologia do DNA RecombinanteConjunto de tcnicas que permite identificar, isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos.

2Engenharia Gentica ou Tecnologia do DNA RecombinanteA Engenharia Gentica teve a sua origem no final dos anos 60 e incio dos anos 70.

Em experincias com bactrias, vrus e pequenas molculas de DNA circular presentes em bactrias, foi identificada a sua "ferramenta" primordial.

3Engenharia Gentica ou Tecnologia do DNA RecombinanteIsolamento, extrao e o enxerto de gene humano para a produo de insulina em bactrias da espcie Escherichia coli.

Genes HumanosE. coliInsulina44Engenharia Gentica ou Tecnologia do DNA RecombinanteEssa estratgia vivel, dada a existncia de enzimas capazes de "clivar" o DNA em pontos especficos.

Enzimas de restrioPodem ser usadas para cortar segmentos de DNA que contenham informaes para a sntese de uma determinada protena.

Hoje mais de 90% dos diabticos so tratados com insulina produzida por Engenharia Gentica.

5Tcnicas de ClonagemUm pedao de DNA estranho enxertado em um plasmdeo bacteriano.

Tanto o plasmdeo quanto o pedao de DNA a ser enxertado tm que ser submetido mesma enzima de restrio, que os cortar em regies com a mesma sequncia.

O DNA ser soldado ao plasmdeo pelas enzimas DNA ligases.

O resultado o DNA recombinante.

66Tcnicas de Clonagem

7Tcnicas de ClonagemTcnica de PCR (Reao em Cadeia da Polimerase).

A partir de amostras mnimas de DNA, so utilizadas pequenas sequncias iniciadoras.

Nucleotdeos e a enzima DNA polimerase empregam um mecanismo cclico e automtico, que permite a produo de mltiplas cpias do segmento inicial.8Tcnicas de ClonagemInsero dos plasmdeos nas clulasPlasmdeos e clulas so colocados em contato.Apenas algumas clulas conseguem absorver o plasmdeo novo.Adiciona-se antibitico ao meio de cultivo para selecionar as bactrias que receberam o plasmdeo novo.

A primeira vez que se obteve a sntese de uma protena humana por uma bactria transformada foi em 1977.

99Plasmdeo, Obteno de Genes e Enzimas de RestrioAs bactrias, em particular Escherichia coli, constituem um dos principais materiais biolgicos empregados na Tecnologia do DNA Recombinante.

Ciclo de vida rpido (20 minutos).Cultivo em um espao pequeno.Apresenta menos nmero de genes.Diviso celular por fisso binria.10Plasmdeo, Obteno de Genes e Enzimas de RestrioA clula bacteriana contm pequenas molculas de DNA circular, denominadas plasmdeos.

1111Plasmdeo, Obteno de Genes e Enzimas de RestrioGenes estranhos bactria podem ser incorporados aos seus plasmdeos, e assim, tais bactrias passam a produzir as protenas que esses genes codificam.

Os plasmdeos portadores de genes que conferem resistncia a drogas so chamados plasmdeos R.

Alm dos plasmdeo, outros vetores so tambm teis na tecnologia do DNA recombinante como: os vrus e os lipossomos.

1212Plasmdeo, Obteno de Genes e Enzimas de RestrioObteno de genes para enxerto

Utilizao de biblioteca de genesObteno do gene em laboratrio a partir de RNA mensageiroSntese do gene, nucleotdeo por nucleotdeo, na sequncia desejada

1313Enzimas de RestrioForam descobertas por Hamilton Smith, Daniel Nathans e Werner Arber.

So protenas encontradas em muitos microrganismos e utilizadas largamente em engenharia gentica para produzir fragmentos de DNA com extremidades conhecidas.

Cada bactria tem suas prprias enzimas de restrio e cada enzima reconhece apenas um tipo de sequncia.

1414Enzimas de RestrioAs bactrias as produzem naturalmente para se defenderem da invaso de alguns vrus.

Possuem a propriedade de quebrar o DNA do invasor em certos pontos especficos.

Cada tipo de enzima de restrio corta uma regio especfica do DNA.

So divididas em vrias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos locais de reconhecimento e de clivagem.

1515Enzimas de RestrioPodem ser usadas para fragmentar o material gentico, deixando extremidades livres para serem ligadas.

O nmero de clivagens feito por cada uma dessas enzimas no material gentico bem definido (especificidade).

Cada enzima de restrio gera uma famlia nica de fragmentos quando cliva um determinado material gentico.

1616Enzimas de RestrioEnzimas de restrio tipo IISo as mais interessantes para os Bilogos Moleculares. Reconhecem sequncias especficas de nucleotdeos do DNA e atuam como tesouras moleculares.

Enzimas de metilaoSo denominadas DNA ligases. Os alvos so sequncias especiais de nucleotdeos do DNA. Atuam nas extremidades dos DNA's, juntando peas para a construo de uma molcula de DNA recombinante.

1717Enzimas Modificadoras do DNA ou RNA (Produo de Hbridos)So ferramentas essenciais para a tcnica de clonagem.

Permitem a multiplicao idntica de genes especficos e fragmentos em clulas hospedeiras apropriadas para aumentar o nmero de cpias.

O isolamento dos fragmentos genticos especficos alcanado pela fragmentao do DNA com enzimas de restrio tipo II.

1818Enzimas Modificadoras do DNA ou RNA (Produo de Hbridos)O cDNA ou os fragmentos do genoma podem, ento, ser modificados por enzimas que atuam sob a molcula de DNA (exonucleases, quinases ou fosfatases).

T4 DNA ligases auxiliam na insero dos fragmentos isolados obtidos pelas enzimas de restrio em veculos de clonagem.

As molculas quimricas obtidas deste modo so introduzidas nas novas clulas hospedeiras.

1919Enzimas Modificadoras do DNA ou RNA (Produo de Hbridos)O crescimento de clulas hospedeiras sob condies seletivas garante que apenas os microrganismos transformados se repliquem.

Os vetores introduzidos so identicamente amplificados de um modo seletivo para diferentes nmeros de cpias, dependendo da natureza do vetor usado.

2020Aplicaes da Tcnica do DNA RecombinanteTerapia GnicaA transferncia de material gentico com o propsito de prevenir ou curar uma enfermidade qualquer.

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21Aplicaes da Tcnica do DNA RecombinanteProduo de MedicamentosVesculas seminais de ratos transformadas em biorreatores.

MetodologiaPara montar o gene artificial, alm da sequncia de bases contendo as instrues para produzir o hGH, foi utilizado tambm um promotor.

O DNA construdo foi microinjetado em vrios embries de camundongos. Obteve-se ento, animais transgnicos produzindo hGH no seu smen.

2222Aplicaes da Tcnica do DNA RecombinanteAgricultura Bioinseticidas;Bactrias modificadas para aumentar a resistncia de plantas ao frio;Plantas modificadas com gene de resistncia a herbicidas;Melhoramento gentico das plantas visando adicionar caractersticas nutricionais;Plantas mais resistentes a certos tipos de insetos

2323Aplicaes da Tcnica do DNA RecombinantePerspectivas FuturasCombate bactria causadora do amarelinho em plantas de laranja;

Descobrir a sequncia de genes de Xanthomonas citri, que afeta plantas de laranja. (98% do sequenciamento pronto);

Sequenciamento dos 50 mil genes da cana de acar para torn-la mais resistente ao ataque de insetos;

Desenvolvimento de um eucalipto transgnico para tentar aumentar a produo de celulose no Brasil.

2424Aplicaes da Tcnica do DNA Recombinante25

25Animais Transgnicos como Biorreatores de ProtenasTcnicas utilizando bactrias como modelos biolgicos de biorreatores demonstraram caractersticas importantes. Porm, suas habilidades em relao a modificaes ps-traducionais so limitadas.

O cultivo de clulas de mamferos foi uma alternativa interessante para resolver este problema. Entretanto, para produes em larga escala, este sistema apresenta custo extremamente alto, tornando-se invivel.

Com base nessas caractersticas biolgicas e econmicas, surgiu uma alternativa em potencial: a produo de animais transgnicos como modelos de biorreatores de protenas com elevado valor biolgico.

2626Animais Transgnicos como Biorreatores de Protenas oneroso, mas a relao custo-benefcio mostra-se favorvel, pois o animal pode reproduzir-se e propagar o gene de interesse a sua prognie.

A expresso de protenas em determinados rgos, torna esses animais viveis como biorreatores de protenas de importncia biomdica.

O isolamento de protenas expressas nos fluidos corporais apresenta vantagens sobre os tecidos.

Leite, urina, sangue, plasma seminal, fluidos de insetos, claras de ovos de aves, ovas e embries de peixes.

2727Animais Transgnicos como Biorreatores de ProtenasA Eritropoetina humana (EPO) uma das protenas humanas mais utilizadas para a produo de biofrmacos.

Atualmente, tem sido utilizada para propsitos teraputicos como o tratamento de falncia renal que culmina em um quadro de anemia.

Contudo, os gastos para obteno de frmacos utilizando esse hormnio so altssimos.

Por isso que tem se buscado alternativas como a produo de bovinos transgnicos capazes de sintetizar grandes quantidades de EPO.

Estima-se que vinte animais seriam suficientes para suprir toda a demanda mundial desse hormnio.

2828Animais Transgnicos como Biorreatores de Protenas

29Animais Transgnicos como Biorreatores de ProtenasVantagensModificaes ps-traducionais realizadas de maneira eficiente;Baixo custo em relao cultura de clulas;Produo em larga escala do produto desejado.

DesvantagensDificuldade na construo dos vetores com os genes promotores;Barreiras reguladoras existentes sobre a experimentao com animais.

3030RefernciasCOELHO, M. A. Z.; SALGADO, A. M.; RIBEIRO, B. D. Tecnologia Enzimtica. Petrpolis: EPUB, 2008. 288 p.

COLLARES, T.; SEIXAS, F. K.; CAMPOS, V. F.; CAVALCANTI, P. V.; DESCHAMPS, J.C. Animais transgnicos biorreatores. Rev Bras Reprod Anim, Belo Horizonte. V. 31, n. 4 2004. p. 462-478, 2007.

MENDES, C. M. Produo de Eritropoetina recombinante humana no leite de camundongas transgnicas. Tese (Doutorado em Medicina Veterinria). Universidade de So Paulo, So Paulo. 2009.3131