RIKA MACHADO DE SALLES

ESTUDO DO PAPEL DO ATP NA ATIVAO DO SISTEMA

IMUNE E NA PROTEO DURANTE A INFECO POR

Plasmodium chabaudi

Dissertao apresentada ao

Programa de Ps-Graduao em

Imunologia do Instituto de Cincias

Biomdicas da Universidade de

So Paulo para obteno do

Ttulo de Mestre em Cincias.

So Paulo 2011

RIKA MACHADO DE SALLES

ESTUDO DO PAPEL DO ATP NA ATIVAO DO SISTEMA

IMUNE E NA PROTEO DURANTE A INFECO POR

Plasmodium chabaudi

Dissertao apresentada ao

Programa de Ps-Graduao em

Imunologia do Instituto de Cincias

Biomdicas da Universidade de

So Paulo para obteno do

Ttulo de Mestre em Cincias.

rea de concentrao: Imunologia

Orientador: Prof. Dr. Maria Regina DImprio Lima Verso Original

So Paulo 2011

DADOS DE CATALOGAO NA PUBLICAO (CIP) Servio de Biblioteca e Informao Biomdica do

Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo

reproduo no autorizada pelo autor

Salles, rika Machado de. Estudo do papel do ATP na ativao do sistema imune e na proteo durante a infeco por Plasmodium chabaudi. / rika Machado de Salles. -- So Paulo, 2011. Orientador: Maria Regina D'Imprio Lima. Dissertao (Mestrado) Universidade de So Paulo. Instituto de Cincias Biomdicas. Departamento de Imunologia. rea de concentrao: Imunologia. Linha de pesquisa: Imunologia das parasitoses. Verso do ttulo para o ingls: Role of ATP in the immune response to blood-stage Plasmodium chabaudi malaria. Descritores: 1. Plasmodium 2. Sistema imune I. Lima, Maria Regina D'Imprio II. Universidade de So Paulo. Instituto de Cincias Biomdicas. Programa de Ps-Graduao em Imunologia III. Ttulo.

ICB/SBIB0181/2011

UNIVERSIDADE DE SO PAULO INSTITUTO DE CINCIAS BIOMDICAS

_____________________________________________________________________________________________________________

Candidato(a): rika Machado de Salles.

Ttulo da Dissertao: Estudo do papel do ATP na ativao do sistema imune e na proteo durante a infeco por Plasmodium chabaudi.

Orientador(a): Maria Regina D'Imprio Lima.

A Comisso Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertao de Mestrado, em sesso pblica realizada a .............../................./.................,

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Nome completo: ................................................................................... Instituio: ............................................................................................

Examinador(a): Nome completo: ................................................................................... Instituio: ............................................................................................

Presidente: Nome completo: ................................................................................... Instituio: ............................................................................................

Este trabalho foi realizado no Laboratrio de Imunologia das Parasitoses

do Departamento de Imunologia, do Instituto de Cincias Biomdicas, da

Universidade de So Paulo, sob orientao da Prof. Dr. Maria Regina

DImprio Lima. O presente projeto recebeu auxlio financeiro do CNPq -

projeto nmero 471869/2010-4 e FAPESP (Fundao de amparo

Pesquisa do estado de So Paulo) processo nmero - 05/51170-7 e bolsa -

processo nmero 2009/ 06652-4.

Dedico este trabalho os meus pais queridos, Rozeval e Elizabeth, ao meu

irmo Rafael e ao meu namorado Eduardo

AGRADECIMENTOS

Agradeo a Deus pelos bons caminhos traados que resultaram na

concluso deste trabalho, aos meus pais e ao meu irmo Rafael pela confiana

e compreenso de minha ausncia durante perodos de dedicao ao

laboratrio, a toda a minha famlia que me incentivou e colaborou com esta

conquista.

Agradeo imensamente ao meu namorado Eduardo Leal Rodrigues pelo

grande apoio e dedicao durante este momento de minha vida. Amo voc.

Agradeo imensamente a minha orientadora Maria Regina DImprio

Lima pela total dedicao mesmo nos momentos mais difceis, exemplo to

precioso que guardarei por toda a vida. Toda a minha admirao.

Ao professor Robson Coutinho, co-orientadora deste estudo, por toda

dedicao, conhecimento e estmulo, realmente imprescindveis para o

desenvolvimento e a concluso deste estudo.

Ao Prof. Jos Maria Alvarez Mosig (Pepe) pela contribuio neste

trabalho e pelo convvio agradvel.

A todos os amigos do laboratrio, Eduardo, Sheyla, Claudia, Sandra,

Henrique, Raquel, Christian, Andr, Genoilson, Fernanda, Letcia, Maria,

Giovana, Rafael e Beatriz, que de forma direta ou indireta contriburam para a

realizao deste trabalho.

Aos tcnicos do Laboratrio de Imunologia das Parasitoses (LIP),

Rogrio, Meire, Danilo, urea e Mariana, meus sinceros agradecimentos por

toda ajuda fornecida.

Aos meus amigos do Departamento, em especial a Lorena.

Aos funcionrios dos Biotrios de Camundongos Isognicos do

Departamento de Imunologia pela manuteno e fornecimento dos

camundongos.

A todo o pessoal da secretaria do Departamento, Jotelma (J), Eny,

Amanda e Amarildo (in memoriam), pela ateno, carinho e pacincia.

Ao pessoal da portaria do ICB IV, que sempre me trataram com respeito

e carinho durante todos esses anos de convivncia.

Aos membros da banca examinadora por me concederem a honra de t-

los como avaliadores, e assim, poder enriquecer o meu trabalho e meu

conhecimento.

"A menos que modifiquemos a nossa maneira de pensar, no

seremos capazes de resolver os problemas causados pela

forma como nos acostumamos a ver o mundo Albert Einstein

RESUMO

Salles, EM. Estudo do papel do ATP na ativao do sistema imune e na proteo durante a infeco por Plasmodium chabaudi. [Dissertao (Mestrado em Imunologia)]. So Paulo: Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo; 2011.

Estima-se que a malria seja responsvel por um milho de mortes anuais, atingindo principalmente crianas. O sistema imune participa tanto na proteo contra a infeco pelo plasmdio, como no desenvolvimento das sndromes associadas malria (anemia, malria cerebral, acidose metablica e choque sistmico). Recentemente, tem sido mostrado que a imunidade inata capaz de detectar sinais liberados por clulas ou tecidos danificados como o ATP e o cido rico. Esses sinais de perigo parecem ser importantes para promover a regulao da inflamao aps o trauma ou injrias ocasionadas pelos patgenos. Porm, a relevncia fisiolgica desses sinais na resposta imune e seu mecanismo de ao ainda no esto claros. Na malria, provvel que o ATP seja liberado no momento da ruptura dos eritrcitos, a partir de clulas danificadas do endotlio vascular ou de clulas do sistema imune mortas por ativao. Assim, neste estudo ns avaliamos o papel do ATP na ativao do sistema imune e no desenvolvimento da doena durante a infeco com P. chabaudi. Nossos resultados sugerem que, a concentrao de ATP no soro e permeabilizao de linfcitos do sangue maior aps a ruptura dos eritrcitos. Durante a infeco, as clulas T e as clulas dendrticas possuem uma capacidade exacerbada de resposta ao ATP, que pelo menos em parte depende do P2X7R. Alm disso, a presena funcional de receptores purinrgicos parece ser importante para a fase inicial da resposta imune ao P. chabaudi. A inibio farmacolgica do receptor reduziu o nmero de clulas, produo de IFN- e injria heptica. Desta forma a utilizao do antagonistas do P2X7R poderia ser benfico na resoluo de problemas ocasionados pelo aumento acentuado do sistema imune.

Palavra-chave: P. chabaudi; Sinais de dano; ATP; P2X7

ABSTRACT

Salles, EM. Role of ATP in the immune response to blood-stage Plasmodium chabaudi malaria. [Masters Thesis (Immunology)]. So Paulo: Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo; 2011.

It is estimated that malaria accounts for one million deaths annually, affecting mainly children. The immune system participates in both the protection against infection by the plasmodium, as in the development of the syndromes associated with malaria (anemia, cerebral malaria, metabolic acidosis and systemic shock). Recently, it has been shown that innate immune is able to detect signals released by damaged cells or tissues as ATP and uric acid. These danger signals appear to be important to promote the regulation of inflammation after trauma or injuries caused by pathogens. However, the physiological relevance of these signals in the immune response and its mechanism of action remain unclear. In malaria, it is likely that ATP is released upon rupture of erythrocytes, vascular endothelial cells damaged or dead cells of the immune system activation. In this study we evaluated the role of ATP in the activation of the immune system and the development of disease during infection with P. chabaudi. Our results suggest that ATP concentration serum and permeabilization of blood lymphocytes is higher after the rupture of erythrocytes. During infection T cells and dendritic cells have a heightened ability to respond to ATP which is partly dependent on P2X7R. Moreover, the presence of functional purinergic receptors appears to be important for the initial phase of the immune response to P. chabaudi. The pharmacological inhibition of the receptor reduced the number of cells, liver damage and IFN-, thus the use of the P2X7 receptor antagonists could be beneficial in solving problems caused by the sharp increase in the immune system. Keywords: P. chabaudi; damage signals; ATP; P2X7

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Ocorrncia de Malria no Mundo ---------------------------------------- 20 Figura 2 - Quantificao de ATP no soro e permeabilizao de linfcitos do sangue antes e aps o rompimento dos eritrcitos ---------------------------- 41 Figura 3 - Permeabilizao de linfcitos T CD4+ e DC de camundongos C57BL/6 e P2X7R-/- com o sobrenadante de eritrcitos parasitados e no parasitados lisados ------------------------------------------------------------------------- 43 Figura 4 - Permeabilizao induzida por ATP de clulas do bao de camundongos C57BL/6 e P2X7R-/- infectados com P. chabaudi -------------- 45 Figura 5 - Permeabilizao de linfcitos T CD4+ e DC tratados com BBG de camundongos infectados e no infectados -------------------------------------- 46 Figura 6 - Proliferao de linfcitos T CD4+ e T CD8+ mantidos em cultura com diferentes concentraes de ATP ------------------------------------------------ 48 Figura 7 - Proliferao de linfcitos T CD4+ e TCD8+ tratados com BBG ou Apyrase ------------------------------------------------------------------------------------ 50 Figura 8 - Tamanho celular e expresso de CD69 em linfcitos do bao de camundongos C57BL/6 tratados com BBG em cultura. ---------------------- 51 Figura 9 - Influncia do ATP na produo de citocinas e NO no sobrenadante de cultura de clulas do bao ---------------------------------------- 53 Figura 10 - Parasitemia e nmero de clulas em camundongos C57BL/6, P2XR-/- e C57BL/6 tratados com BBG ------------------------------------------------ 55 Figura 11 - Nmero de linfcitos T produtores de IFN e linfcitos B produtores de anticorpos em camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG -------------------------------------------------------------------------- 57 Figura 12 - Expresso de marcadores de superfcie durante a fase aguda da infeco com P. chabaudi ------------------------------------------------------------ 59

Figura 13 - Expresso de marcadores de superfcie em clulas esplnicas de camundongos C57BL/6, P2X7-/- e C57BL/6 tratados com BBG, no dia 7 de infeco por P. chabaudi ------------------------------------------------------------- 60 Figura 14. Receptores P2X7 contribuem para o dano no fgado de camundongos infectados com P. chabaudi ------------------------------------------ 62

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - eATP modula a resposta imune em vrios tipos celulares atravs da ligao com receptores P2 ---------------------------------------------------------------- 29

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMP - 2-amino-2-metil-1-propanol

APC- Clula apresentadora de antgeno

APC-Cy7- Aloficocianina-Cy7

ATP Adenosina Trifosfato

BBG Brlliant Blue G

BSA - Albumina srica Bovina

CD Grupos de diferenciao

CFSE Carboxifluorescein Diacetate Succinimidil Ester

DC Clulas dendrticas

DNA - cido desoxirribonuclico

EB - Brometo de Etdeo

ELISA - Ensaio imunoenzimtico

EP Eritrcito parasitado

FITC- Fluorescena

GPI - glicosil-fosfatidil-inositol

i.p - intraperitoneal

IFN Interferon

Ig - Imunoglobulina

IL- Interleucina

LT - Linfotoxina

mAb Anticorpo monoclonal

MHC Complexo principal de Histocompatibilidade

NFB Fator de transcrio nuclear b

NK clula Natural Killer

PAMP Padro molecular Associado a Patgenos

PBS Salina Tamponada com fosfato

PE- Ficoeritrina (Phycoerythrin)

PE-Cy7 - Ficoeritrina-Cy7

PerCp - Complexo protena clorofila peridinina

PLA2 - Fosfolipase A2

PRR Receptor de Reconhecimento padro

RNA cido Ribonuclico

RPMI Meio McCoy de cultura modificado

SFB Soro fetal Bovino

Th Clula T helper

TLR Receptor tipo Toll

TNF Fator de Necrose Tumoral

WT - Wild Type

WHO World Health Organization

SUMRIO

1 Introduo ------------------------------------------------------------------------- 19

1.1 Aspectos Gerais da malria humana ----------------------------------------- 20

1.2 Modelo de infeco pelo Plasmodium chabaudi --------------------------- 24

1.3 Mecanismos de liberao de ATP --------------------------------------------- 26

1.4 Funo dos receptores purinrgicos na resposta imunolgica -------- 27

2 Objetivo ----------------------------------------------------------------------------- 32

3 Material e Mtodos -------------------------------------------------------------- 34

3.1 Camundongos e infeco -------------------------------------------------------- 35

3.2 Tratamento ex vivo e in vivo ---------------------------------------------------- 35

3.3 Suspenso de clulas do bao e sangue ----------------------------------- 35

3.4 Ensaio de permeabilizao induzida por ATP ------------------------------ 35

3.5 Deteco de ATP no soro ------------------------------------------------------- 36

3.6 Anlise fenotpica das clulas por citometria de fluxo -------------------- 36

3.7 Ensaio de proliferao (marcao com CFSE) ---------------------------- 36

3.8 Deteco de citocinas no sobrenadante de cultura ----------------------- 37

3.9 Deteco Intracelular de IFN- ------------------------------------------------- 37

3.10 Quantificao de NO pela Reao de Griess ------------------------------ 37

3.11 ELISPOT para Clulas Secretoras de Ig ------------------------------------ 38

3.12 Anlise histopatolgica ---------------------------------------------------------- 38

3.13 Anlise estatstica ----------------------------------------------------------------- 38

4 Resultados ------------------------------------------------------------------------- 39

4.1 Quantificao de ATP no soro e permeabilizao de linfcitos T do

sangue de camundongos antes e aps a ruptura dos eritrcitos ----- 40

4.2 Permeabilizao de clulas esplnicas atravs da abertura de

canais purinrgicos ---------------------------------------------------------------- 42

4.3 Papel do ATP na proliferao de linfcitos T CD4+e T CD8+ do

bao de camundongos infectados --------------------------------------------- 46

4.4 Produo de citocinas e NO no sobrenadante da cultura de clulas

do bao na presena de diferentes concentraes de ATP ------------ 52

4.5 Parasitemia e nmero de clulas no bao de camundongos

C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG ------------------------ 54

4.6 Nmero de clulas produtoras de IFN- e anticorpos em

camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG ---- 56

4.7 Expresso de marcadores de superfcie durante a fase aguda da

infeco com P. chabaudi ------------------------------------------------------- 58

4.8 Anlise histopatolgica do fgado de camundongos C57BL/6

tratados e no tratados com BBG e P2X7R-/- infectados com P.

chabaudi e controles -------------------------------------------------------------- 61

5 Discusso -------------------------------------------------------------------------- 63

6 Concluso -------------------------------------------------------------------------- 72

Referncias ------------------------------------------------------------------------------- 74

1 INTRODUO

20

1.1 Aspectos gerais da malria humana

A malria permanece um srio problema de sade pblica, com

aproximadamente um tero da populao exposta a regies de transmisso

estvel. A Organizao Mundial de Sade (WHO) estimou 250 milhes de

casos de malria com 900.000 mortes no ano de 2009, com mais de 90% dos

casos encontrados na frica sub-Saariana, principalmente crianas menores

de cinco anos (Figura 1). Em 2009, foram confirmados no Brasil 306.908 casos

de malria, com 97% dos casos concentrados em seis estados da regio Norte:

Acre, Amap, Amazonas, Par, Rondnia e Roraima (Ministrio da Sade,

2011). A maioria dos casos ocorre em reas rurais, mas h registro da doena

em reas urbanas.

Figura 1 - Ocorrncia de Malria no Mundo. Adaptado de World Malaria Report, WHO. 2010

A malria caracterizada como uma doena infecciosa aguda ou

crnica causada por protozorios parasitos do gnero Plasmodium,

21

transmitidos por meio da picada de um mosquito Anopheles fmea. H cinco

espcies de plasmdios que infectam humanos: Plasmodium falciparum,

Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae e Plasmodium

knowlsei. No Brasil, trs espcies esto associadas malria em seres

humanos: P. vivax, P. falciparum e P. malariae (Ministrio da Sade, 2011).

A infeco tem incio quando os esporozotos so introduzidos atravs

da pele pela picada do vetor. Os esporozotos atingem a corrente sangunea e

migram para o fgado, onde passam por uma fase assintomtica de diviso

rpida em hepatcitos (estgio pr-eritroctico). Os parasitos, dentro de

hepatcitos, multiplicam-se e do origem a milhares de novos parasitos

(merozotos), que rompem a clula e caem diretamente na corrente sangunea.

No sangue, o parasito infecta eritrcitos maduros com alta taxa de expanso

(Good e Doolan, 2010). Os ciclos eritrocticos repetem-se a cada 48 horas nas

infeces por P. vivax e P. falciparum e a cada 72 horas nas infeces por P.

malariae.

O bao tem um papel importante na malria como stio de remoo de

eritrcitos parasitados, gerao de imunidade e produo de novos eritrcitos

(Engwerda et al., 2005). Os principais alvos para a resposta imune durante o

ciclo eritroctico so os merozotos livres e parasitos intra-eritrocticos. Na

malria, a resposta imune caracterizada pela produo de citocinas pr-

inflamatrias. A produo de IFN- (interferon-gama) representa um papel

central na imunidade malria. Clulas NK (do ingls Natural killer) esto entre

as primeiras clulas a produzir IFN- aps a exposio in vitro de clulas

mononucleares do sangue perifrico (PBMC) a eritrcitos infectados com P.

falciparum (Artavanis-Tsakonas e Riley, 2002). As clulas T CD4+ e a produo

de IFN- possuem um papel importante no controle da parasitemia durante a

fase aguda da infeco (Angulo e Fresno, 2002). Durante a resposta imune

inata, o reconhecimento imune de sinais de perigo liberados durante a infeco

proporciona um aumento na resposta inflamatria. Dentre alguns receptores de

sinais de perigo, os receptores do tipo toll (TLR, do ingls Toll like receptors)

possuem uma importante funo na induo de uma resposta pr-inflamatria

na malria. Estudos com malria humana mostraram uma alta expresso de

TLR em pacientes infectados com P. falciparum (McCall et al., 2007), que se

mostram ainda funcionalmente mais ativas durante a fase aguda para a

22

induo de uma resposta pr-inflamatria (Franklin et al., 2009). Duas

categorias de molculas derivadas do plasmdio que induzem resposta

inflamatria do hospedeiro tm sido caracterizadas: Molculas ancoradas por

GPI (glicosil-fosfatidil-inositol) e o DNA (do ingls deoxyribonucleic acid) do

plasmdio (Hafalla et al., 2011). Mais precisamente, GPI de P. falciparum

parece induzir a produo de citocinas pr-inflamatrias pelos macrfagos

atravs da interao de molculas GPI com TLR1 e 2 (Ropert et al., 2008; Zhu

et al., 2011). Outra molcula derivada do plasmdio extensamente estudada

a hemozona, um resduo insolvel e cristalino que se origina da ingesto da

hemoglobina pelo parasito. A hemozona tem sido relacionada a um aumento

da reposta imune inata por se ligar ao DNA do plasmdio capaz de induzir a

ativao do TLR 9 (Parroche et al., 2007). Tais molculas bioativas induzem a

produo de citocinas pr-inflamatrias como o TNF- (do ingls tumor

necrosis factor-alpha) e interleucina (IL)-1, IL-6 e IL-12 (Ropert et al., 2008).

Desta forma, embora a citocina TNF- seja protetora contra o parasito, altas

concentraes desta citocina esto associadas com maior gravidade da

doena e morte (Clark et al., 2006). Citocinas anti-inflamatrias, tais como IL-10

e TGF- (do ingls transforming growth factor beta), so importantes para

controlar a exacerbao da resposta imunolgica. Logo, alguns fatores

relacionados gravidade da doena, como a anemia severa, tm sido

relacionados com quantidade insuficiente de IL-10 e altas concentraes de

TNF- (Kurtzhals et al., 1998). Por outro lado, o aumento da resposta anti-

inflamatria est correlacionado com um crescimento rpido do plasmdio na

infeco em humanos (Walter et al., 2005).

A ruptura de eritrcitos parasitados tipicamente acompanhada pela

febre, nusea, dores de cabea e outros sintomas de uma reposta pr-

inflamatria, na qual se acredita ser derivada de clulas do sistema imune inato

(Stevenson e Riley, 2004). A produo de IFN- pelas clulas T e outras

citocinas pr-inflamatrias podem facilitar a produo de TNF- pelos

moncitos (Scragg et al., 1999). TNF- pode contribuir para o desenvolvimento

de malria cerebral devido ao aumento de ICAM-1 (do ingls inter-cellular

adhesion molecule 1) no endotlio vascular cerebral (Wassmer et al., 2011), e

desta forma proporcionar o seqestro de eritrcitos infectados nas vnulas

capilares e ps-capilares. Os eritrcitos infectados aderidos ao endotlio

23

obstruem o fluxo sanguneo, causam hipoxia no crebro e aumentam a

inflamao (Turner, 1997). Alm da malria cerebral, outras complicaes

podem ser encontradas durante a infeco. A anemia grave em humanos

ocorre devido ao aumento da retirada de eritrcitos da corrente sangunea, que

parece estar relacionado s mudanas na superfcie ou estrutura de eritrcitos

no infectados (Looareesuwan et al., 1991). Os eritrcitos parasitados tambm

apresentam mudanas na membrana. O plasmdio capaz de alterar a

permeabilidade da membrana para sobreviver dentro dos eritrcitos,

aumentando a expresso de transportadores e canais de ons (Merckx et al.,

2009). A abertura de canais de ons induzida pelo P. falciparum em eritrcitos

humanos importante como uma via de liberao de ATP (adenosina

trifosfato) (Akkaya et al., 2009).

Algumas complicaes observadas no quadro clnico de pacientes com

malria so provenientes do aumento das citocinas pr-inflamatrias (Clark et

al., 2006). Sabe-se que alguns fatores derivados do parasito ou do hospedeiro

so importantes sinais de dano reconhecidos pelas clulas do sistema

imunolgico e proporcionam o aumento da resposta pr-inflamatria. Um

estudo recente mostra que eritrcitos infectados com P. falciparum, P. berghei

e P. yoelii acumulam hipoxantina e xantina (Orengo et al., 2008). A formao

do cido rico ocorre atravs da degradao de altas concentraes de

hipoxantina e xantina dentro de eritrcitos infectados e a liberao acontece no

momento da ruptura dos eritrcitos. O cido rico considerado um sinal de

dano liberado de clulas mortas e capaz de induzir a secreo de TNF-. Os

eritrcitos infectados tambm possuem aumento na quantidade de ATP

intracelular. O ATP capaz de induzir o aumento de Ca++ no plasmdio e de

ajudar na invaso do parasito a novos eritrcitos (Levano-Garcia et al., 2010).

Desta forma, o ATP torna-se importante tanto para o ciclo do parasito como

para o reconhecimento de dano pelas clulas do hospedeiro. Os sinais de dano

liberados por clulas ativadas ou mortas durante a reposta imune so

importantes mecanismos de aumento da resposta pr-inflamatria. Portanto o

estudo dos mecanismos de interao dos sinais de dano com o sistema

imunolgico torna-se essencial para o desenvolvimento de novas terapias de

reduo da resposta pr-inflamatria exacerbada.

24

1.2 Modelo de infeco pelo Plasmodium chabaudi

Devido dificuldade de se estudar a doena humana, a infeco de

camundongos por plasmdios de roedores tem sido utilizada como modelo

experimental da malria. Entre os diferentes modelos, a infeco pelo

Plasmodium chabaudi (cepa AS; aqui chamado de P. chabaudi) bastante

utilizada na compreenso da resposta imune contra o plasmdio durante a fase

eritroctica. O ciclo eritroctico do P. chabaudi sicrnico e as hemcias

infectadas com esquizontes so capazes de aderir em clulas endoteliais

(sequestro) (Cox et al., 1987) e em eritrcitos no infectados do hospedeiro

(Mackinnon et al., 2002). Esses dois fenmenos tambm ocorrem durante a

infeco pelo Plasmodium falciparum (Bagnaresi et al., 2009), e poderiam ser

considerados caractersticas evolutivas convergentes que facilitariam a evaso

do sistema imune.

Na fase inicial da doena causada pelo P. chabaudi, observa-se

esplenomegalia associada a uma intensa ativao dos linfcitos T e B,

caracterizada pela grande produo de molculas efetoras do tipo 1, tais como

IFN- e IgG2a (Falanga et al.,1987; D'Imprio Lima et al., 1991; D'Imprio Lima

et al., 1996 ; Sardinha et al., 2002 ). Na malria, o bao tem uma importante

participao na reduo da parasitemia durante a infeco aguda.

Camundongos que sofrem esplenectomia e so infectados com P. chabaudi

possuem altos picos de parasitemia, que se prolonga como resultado de uma

diminuio na capacidade de filtrao do sangue e lento desenvolvimento de

resposta imune contra o plasmdio (Yap e Stevenson, 1994).

Os linfcitos T CD4+, T CD8+ (Podoba e Stevenson, 1991) e NK (Mohan

et al., 1997) tm sido implicados no controle inicial da parasitemia, atravs de

mecanismos efetores mediados pelo IFN-. Clulas T no so essenciais

para o controle da parasitemia, no entanto a ausncia de tais clulas prolonga

a parasitemia e atrasa a eliminao do parasito (Seixas e Langhorne, 1999).

Os anticorpos de fase aguda tambm contribuem para limitar a infeco (Mota

et al., 1998), ainda que a maioria deles possua especificidades no

relacionadas ao parasita (D'Imperio Lima et al., 1996). Conforme a doena

progride, alguns linfcitos T e B ativados so eliminados por apoptose (Helmby,

2000) e a resposta imune especfica gerada, garantindo a destruio dos

25

parasitos e a proteo contra infeces subseqentes. Paralelamente ao

controle da infeco aguda, uma mudana de resposta do tipo 1 para o tipo 2

observada, com produo predominante de IL-4 e IgG1, um padro tambm

caracterstico da resposta de memria a uma segunda infeco com baixo

inculo de parasitos (Falanga et al., 1987, D'Imperio Lima et al., 1996). A

resposta adquirida contra o P. chabaudi mediada por linfcitos B, T CD4+ e

CD8+ (Suss et al., 1988; Podoba e Stevenson, 1991).

Em relao s molculas envolvidas na ativao do sistema imune

decorrente da infeco pelo P. chabaudi, existem algumas evidncias. O

aumento da resposta inflamatria est diretamente relacionado com o

reconhecimento de molculas derivadas do patgeno e pouco se sabe sobre a

participao de sinais de dano na malria. O adaptador MyD88, e

possivelmente os TLR a ele associados, em clulas apresentadoras de

antgeno (APC) tem um papel importante, ainda que parcial, na resposta pr-

inflamatria, ativao de clulas T e patogenia da malria, mas no so crticas

para o controle imunolgico do estgio eritroctico do P. chabaudi (Franklin et

al., 2007; Seixas et al., 2009). Franklin e colaboradores (2007) mostraram que

TLR9 e MyD88 so importantes para a induo de IL-12 e IFN- e favorecem o

aumento de resposta a agonistas de TLR resultando em super produo de

citocinas pr-inflamatrias e sintomas semelhantes a sepse durante a fase

aguda da malria.

Podemos postular, no entanto, que a ruptura dos eritrcitos infectados

com o plasmdio possa desencadear uma resposta inflamatria que poderia

ser induzida tanto por fatores derivados do parasito como por fatores derivados

do hospedeiro. Alm do reconhecimento de molculas do patgeno, o sistema

imune possui receptores para o reconhecimento de sinais de dano. Todos os

sinais de perigo liberados no momento da infeco devem ser importantes para

o aumento ou reduo da resposta inflamatria e poderiam contribuir na

patologia induzida pela infeco.

26

1.3 Mecanismos de liberao de ATP

A molcula de ATP foi primeiramente identificada como uma fonte de

energia livre utilizada para manuteno celular. Algumas dcadas atrs,

pesquisadores descobriram que clulas do sistema nervoso eram capazes de

liberar ATP e, desta forma, este fenmeno foi denominado de nervos

purinrgicos (Burnstock, 1972). Recentemente, inmeras funes

extracelulares foram descritas para os cidos nuclicos. Dentre tais funes,

tem sido mostrado que a imunidade inata capaz de detectar sinais liberados

por clulas ou tecidos danificados como o ATP e o cido rico (Ishii e Akira,

2008; Kono e Rock, 2008).

O ATP conhecido como um sinal de dano ou padro molecular

associado ao dano (DAMP) (Di Virgilio, 2005). Uma vez liberado, o ATP

contribui para o desencadeamento da resposta inflamatria juntamente com os

padres moleculares associados patgenos (PAMP) (Mariathasan e Monack,

2007). Esses sinais de perigo parecem ser importantes para promover a

regulao da inflamao aps o trauma ou injrias ocasionadas pelos

patgenos. Porm, a relevncia fisiolgica desses sinais na resposta imune e

seu mecanismo de ao ainda no esto claros. Trs modos de liberao de

ATP tm sido descritos: (a) Decorrentes de dano celular devido presso

osmtica, isquemia, inflamao, apoptose ou necrose, (b) liberao de ATP

atravs de vesculas, e (c) liberao de ATP mediada por canais. A liberao

de ATP e subseqente ativao de receptores P2 ajudam a estabelecer nveis

basais de ativao para vias de transduo de sinais e regulam um amplo

repertrio de respostas que incluem o fluxo de sangue nos tecidos, transporte

de ons, regulao do volume da clula, sinalizao neuronal e interaes

patgeno-hospedeiro (Ross e Paul, 2010).

A liberao basal de ATP pode ser aumentada por uma perturbao

mnima da clula atravs de estmulo fsico ou qumico. O ATP extracelular tem

um importante papel no transporte de ons em diversos tipos celulares, em

particular, em mudanas no meio osmtico (Schliess et al, 2007). Para manter

o seu volume sob tais condies, as clulas aumentam a secreo de ons por

um processo denominado RVD (do ingls regulatory volume decrease). O

estresse osmtico promove a liberao de ATP que resulta na ativao de

27

receptores P2 e contribui para o RVD por desencadear um aumento

dependente de Ca++ na secreo de ons (Wang et al., 1996).

Na malria, provvel que o ATP seja liberado no momento da ruptura

dos eritrcitos infectados ou durante a invaso dos eritrcitos pelo plasmdio. A

liberao de ATP tambm pode ocorrer durante a resposta imune dentro das

sinapses imunolgicas ou por clulas do endotlio vascular danificadas pela

ao de molculas efetoras do sistema imune. Eritrcitos e linfcitos T

secretam ATP por canais de panexina-1 (Locovei et al., 2006). Canais de

panexina-1 so responsveis pela liberao de ATP, que atua como sinais

find-me, e medeia a permeabilidade da membrana durante apoptose (Cheleni

et al., 2010). Sob condies normais, as clulas so expostas a baixas

concentraes de ATP extracelular. O ATP extracelular rapidamente

degradado pela ao combinada de ecto-nucleotidases (Zimmermann, 2000)

formando ADP, AMP e adenosina. Portanto, o ATP e seus metablitos exercem

importante papel modulando a funo celular de maneira autcrina ou

parcrina atravs dos receptores purinrgicos.

1.4 Funo dos receptores purinrgicos na resposta imunolgica

Durante a infeco patognica e injria tecidual, cidos nuclicos e seus

metablitos, tais como nucleotdeos, nucleosdeos e cido rico, podem ser

liberados de clulas mortas do hospedeiro e modificar a resposta imune. Os

cidos nuclicos e seus metablitos so, de fato, reconhecidos por receptores

especficos do hospedeiro, tais como TLR, RLR (do ingls RIGlike receptors),

NLR (NOD-like receptors) e receptores purinrgicos (Ishii e Akira, 2008).

Os receptores purinrgicos so divididos em duas classes principais: P1

(receptores de adenosina) e P2 (receptores de nucleotdeos extracelulares). H

quatro tipos de receptores P1 (A1, A2A, A2B e A3) (Fredholm et al., 2001). Os

receptores P2 so divididos em duas subclasses: P2X e P2Y. Os receptores

P2Y so acoplados protena G e sua famlia inclui 8 membros:

P2Y1,2,4,6,11,12,13 e 14. Os receptores P2X (P2X1-7) proporcionam a

abertura de canais de ons ativados pelo ATP extracelular e so seletivos para

ctions monovalentes e divalentes (Na+, K+ e Ca2+) (North, 2002).

Todos os receptores P2X, com a exceo de P2X5, podem facilitar a

28

entrada de Ca2+ em resposta ao estmulo pelo ATP extracelular (eATP), desta

forma sugerindo que receptores P2X podem regular a ativao de linfcitos T.

A liberao de ATP e a ativao autcrina de receptores P2X1 e P2X4 tm

funes importantes na amplificao de sinais do TCR (do ingls T cell

receptor) e na comunicao intracelular nas sinapses imunolgicas formadas

entre clulas T e clulas apresentadoras de antgenos (Woehrle et al., 2010).

Receptores P2X esto presentes em muitas clulas do sistema imune, tais

como macrfagos, moncitos, neutrfilos, mastcitos, clulas dendrticas,

linfcitos T e clulas NK, tendo sido vistos como importantes componentes da

resposta imune inata contra infeces, podendo induzir diretamente a morte de

patgenos em macrfagos e clulas epiteliais infectadas (Coutinho-Silva et al.,

2001). Alguns receptores P2X so sensveis a concentraes micromolares de

eATP e a quantidade de eATP est diretamente relacionada com o tipo de

resposta induzida na clula alvo (Tabela 1).

29

Tabela 1 eATP modula a resposta imune em vrios tipos celulares atravs da ligao com receptores P2.

Tipo de clula Resposta - baixo [eATP] Resposta - alto [eATP]

Eosinfilos Quimiotaxia; Induo de

secreo de IL-8

Induo de secreo de IL-

8

Neutrfilos Quimiotaxia; Degranulao

aumentada e produo de

ROS (do ingls Reactive

oxygen species)

Adeso aumentada ao

endotlio

Moncitos ou macrfagos

Quimiotaxia; Secreo

induzida de citocinas

inflamatrias

Secreo aumentada de

citocinas inflamatrias

Clulas dendrticas imaturos

Quimiotaxia; Maturao Maturao

Clulas dendrticas maduras

Secreo reduzida de

citocinas inflamatrias,

incluindo IL-1, IL-6, IL-12 e

TNF-.

Secreo aumentada de

citocinas inflamatria,

incluindo IL-1, TNF- e IL-

23; Induo de clulas

Th17

Clulas T e B

Coestimulao para

estimulao antignica

Coestimulao para

estimulao antignica;

Shedding de L-selectina

Fonte: Adaptado de Trautmann ( 2009).

A resposta a baixas concentraes de eATP mediada por receptores

P2 com alta afinidade (P2X1, P2X3, P2Y2 e P2Y13) e afinidade intermediria

(P2X2, P2X4, P2X5, P2Y1, P2Y4 e P2Y11). A resposta a altas concentraes

de ATP mediada por receptores P2X7 (Trautmann, 2009).

Os receptores P2X7 foram inicialmente descritos como receptores P2Z

nas clulas do sistema imune (macrfagos e mastcitos) a partir do fenmeno

de induo, por eATP, de permeabilizao das membranas plasmticas dessas

30

clulas e solutos de at 900 Da (Steinberg et al., 1990). O papel fisiolgico dos

receptores P2X7 ainda permanece pouco entendido. A sua participao nos

mecanismos de morte celular tem sido proposta baseando-se principalmente

no fenmeno da permeabilizao e na induo de apoptose em alguns tipos de

clulas como timcitos e macrfagos (Matuano-Barradas et al., 2003; Bulanova

et al., 2005). Estudos recentes sugerem que atravs do reconhecimento pelo

receptor P2X7, a molcula de ATP ativa o complexo inflamossomo-NALP3, um

conjunto de molculas da imunidade inata que controla as caspases

inflamatrias e induz a produo de IL-1 e IL-18. Alguns trabalhos mostram

que o ATP em doses milimolares estimula a produo de citocinas pr-

inflamatrias atravs de receptores P2X7 (Bours et al., 2006).

Mecanismos envolvidos na produo de IL-1 mediada por ATP tm

sido extensivamente estudados (Ferrari et al., 2006). O eATP parece ser um

sinal crucial para desencadear a sntese e a liberao de IL-1 atravs de um

sinal inflamatrio tal como lipopolissacardeos. A IL-1 aumenta a sntese de

iNOS (do ingls inductible nitric oxide synthase), sustenta a produo de NO

(do ingls nitric oxide), aumenta a expresso de molculas de adeso sobre

clulas endoteliais, promove o extravasamento de leuccitos, modula o

metabolismo muscular e induz febre. Ao contrrio da IL-1, a IL-18 no um

pirgeno endgeno. A IL-18 se liga a um receptor heterodimrico induzindo

a sntese de outras citocinas pr-inflamatrias, CD95L, diversas quimiocinas,

ICAM-1 e VCAM-1 (do ingls vascular cell adhesion protein 1) sobre clulas

endoteliais (Dinarello, 2002).

Em linfcitos, os receptores P2X7 tm sido associados com a regulao

negativa de L-selectina e CD23 (Gu et al., 1998). A estimulao do TCR resulta

em translocao de receptores P2X1 e P2X4 juntamente com hemicanais de

panexina-1 para a sinapse imune, enquanto os receptores P2X7 esto

uniformemente distribudos na superfcie dos linfcitos, de modo a interagir

com as molculas resultantes de dano celular. O ATP liberado de clulas T

ativadas atravs de canais de panexina-1 ativa receptores P2X para sustentar

a sinalizao MAPK (do ingls mitogen-activated protein kinase) (Schenk et al.,

2008). A remoo de eATP, inibio, mutao ou silenciamento de receptores

P2X1 e P2X4 em linfcitos inibem a entrada de Ca++ , fatores nucleares de

clulas T ativadas (NFAT) e induo de sntese de IL-2 (Woehrle et al., 2010).

31

Portanto, os receptores purinrgicos possuem grande importncia na ativao

de clulas T devido a necessidade de uma elevao sustentada de Ca++

intracelular. Assim, inmeras evidncias indicam a importncia da sinalizao

purinrgica atuando em conjunto com o sistema imune tanto no combate

patgenos quanto na resoluo de danos no organismo. Por outro lado, certos

patgenos intracelulares parecem utilizar mecanismos envolvendo receptores

de nucleotdeos em suas estratgias de escape. Assim, alguns patgenos

podem proteger clulas infectadas contra a apoptose dependente do receptor

P2X7 devido produo de ATPases que consomem o eATP (Yilmaz et al.,

2008; Levano-Garcia et al., 2010).

Desta forma, a participao dos receptores purinrgicos nos processos

de morte e ativao celular pode ser relevante na induo da resposta aguda

na malria, por meio de interaes com sinais de dano decorrentes da

infeco.

2 OBJETIVOS

33

Objetivo geral: Avaliar o papel do ATP na ativao do sistema imune, no

desenvolvimento da doena e na proteo durante a infeco com P. chabaudi.

O projeto subdivide-se em cinco partes que abordam cinco objetivos

especficos:

1. Avaliar a concentrao de ATP no soro e a permeabilizao de linfcitos

do sangue antes e aps a ruptura dos eritrcitos.

2. Avaliar a funcionalidade de P2X7R , atravs da permeabilizao

induzida por ATP, em DC, linfcitos TCD4 +, linfcitos T CD8+ e B de

camundongos C57BL/6 controles e infectados com P. chabaudi.

3. Comparar o estado de ativao de clulas dendrticas, linfcitos T CD4+,

T CD8+ e B, tratados com o antagonista P2X7R (BBG; do ingls Brilliant blue G)

ou com Apyrase, de camundongos controle e infectados com P. chabaudi.

4. Quantificar a produo de citocinas e NO no sobrenadante de cultura de

esplencitos de camundongos infectados com P. chabaudi, tratados com BBG

ou com Apyrase.

5. Analisar o perfil celular, os produtos de clulas efetoras e a patologia

induzida pela doena em camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados

com BBG infectados com P. chabaudi.

3 MATERIAL E MTODOS

35

3.1 Camundongos e infeco

Camundongos C57BL/6 (WT; do ingls wild type) fmeas, com 6 a 8 semanas

de idade, foram fornecidos pelo biotrio do Departamento de Imunologia da

Universidade de So Paulo (Originalmente da The Jackson Laboratory) e

mantidos em condio SPF (do ingls specific pathogen-free). O P. chabaudi

cepa AS foi mantido como previamente descrito (Podoba e Stevenson, 1991).

Camundongos foram inoculados via intraperitoneal (ip) com 106 eritrcitos

parasitados (EP) por P. chabaudi. Os camundongos knockouts para P2X7R

foram fornecidos pelo Dr. Robson Coutinho Silva (Universidade Federal do Rio

de Janeiro). As parasitemias foram monitoradas atravs de esfregaos

sanguneos corados com Giemsa.

3.2 Tratamento ex vivo e in vivo

Clulas esplnicas foram tratadas em cultura com um antagonista do receptor

P2X7R (BBG; Sigma-Aldrich) ou com Apyrase (Sigma- Aldrich). O BBG foi

diludo em PBS na concentrao de 1 mM (estoque) e 35 M em cultura para 1

x106 clulas. No tratamento in vivo com BBG, utilizamos 45,5 mg/Kg e a

administrao foi realizada a cada 48h. Para a hidrlise do ATP utilizamos 20

U/ml de Apyrase na cultura.

3.3 Suspenses de clulas do bao e sangue

As clulas foram lavadas e mantidas em RPMI 1640 gelado e suplementado

com penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 g/ml), 2-mercaptoetanol (50

M), L-glutamina (2 mM), piruvato de sdio (1 mM) e 3-20% de soro fetal

bovino inativado pelo calor. Todos os suplementos foram adquiridos da Life

Technologies. Os eritrcitos do bao no foram lisados para evitar a exposio

das clulas ao ATP liberado pelos eritrcitos e as clulas do sangue foram

separadas atravs do gradiente de Percoll 70% (GE Health Care). O nmero

de clulas foi contado utilizando a cmara de Newbauer (Sigma-Aldrich).

3.4 Ensaio de permeabilizao induzida por ATP

As clulas foram marcadas com anticorpos monoclonais (mAb) anti-CD4, CD8,

B220, IAb e CD11c e mantidas em cultura na presena de ATP (25-500 M) por

36

15 minutos em estufa a 37 C, nos 5 minutos finais, acrescentamos o corante

brometo de etdeo (EB) na concentrao de 2,5 M. O corante penetra na

clula e a torna fluorescente apenas quando o receptor est presente e

funcional. As clulas foram captadas em um citmetro de fluxo BD FACSCanto.

Os dados foram analisados utilizando-se o programa FlowJo v.7.2.2 (Tree Star

Inc)..

3.5 Deteco de ATP no soro

O ATP liberado no soro de camundongos infectados e controles foi

determinado utilizando o kit ATP Bioluminscence Assay (Sigma-Aldrich). O soro

(50 l/well) foi colocado em uma placa de 96 poos (Costar) e o reagente

luciferase foi adicionado na mesma quantidade do soro (vol/vol). A leitura foi

realizada em um luminmetro de microplaca Berthold com temperatura

controlada, e a concentrao de ATP foi determinada baseada em sinais de

luminescncia.

3.6 Anlise fenotpica das clulas por citometria de fluxo:

As clulas (1 x 106) foram marcadas com mAb anti-CD4, CD8, B220, CD11c,

CD69, CD62L, CD80, CD86 e MHCII obtidos da BD Pharmingen, conjugados

fluorescena (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), complexo protena

clorofila peridinina (PerCP), ficoeritrina-Cy7(PE-Cy7) e aloficocianina-Cy7

(APC-Cy7). As clulas foram captadas em um citmetro de fluxo BD

FACSCanto. Os dados foram analisados utilizando-se o programa FlowJo

v.7.2.2 (Tree Star Inc).

3.7 Ensaio de proliferao (marcao com CFSE)

A resposta proliferativa de clulas T ao parasita foi medida como previamente

descrito (Elias et al., 2005). Em resumo, 3 x 107 clulas esplnicas foram

suspensas em PBS com 0,1% de BSA foram incubadas com 5,6-carboxy-

fluorescein-succinimidyl-ester (CFSE; Molecular Probes) em uma concentrao

final de 5 M por 20 minutos em 37 C. As clulas (1 x 106) foram cultivadas

em placas de 96 poos (Costar) com 3 x 106 EP ou apenas em meio, por 72h,

em 37C com 5% de CO2. A proliferao foi avaliada por citometria de fluxo,

37

considerando-se a reduo da intensidade de fluorescncia do CFSE.

3.8 Deteco de citocinas no sobrenadante de cultura

Para detectarmos a presena das citocinas IFN-, TNF-, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10,

IL-1, IL-12, IL-17 no sobrenadante de culturas em proliferao estimuladas

com EP, utilizamos o kit Fluorokine MAP (Bioplex) e seguimos as

recomendaes do fabricante (R&D Systems).

3.9 Deteco Intracelular de IFN-

Esplencitos (1 x 106 clulas/poo) foram colocados em cultura na

presena ou ausncia de anticorpos anti-CD3 (5 g/mL) e anti-CD28 (5

g/mL) solveis, em meio contendo Stop Golgi (Pharmingen) e mantidos

por 12 horas 37 C e 5% de CO2. As clulas foram marcadas com os

anticorpos anti-CD4 e CD8 (PharMingen). A seguir, os esplencitos foram

fixados com tampo Cytofix/Cytoperm (BD PharMingen) e

permeabilizados com PermWash (PharMingen). Os esplencitos foram

marcados internamente com os mAbs anti-IFN- marcados com

fluorocromos (PharMingen). As amostras foram analisadas em citmetro

de fluxo FACSCanto e os dados foram analisados utilizando-se o

programa FlowJo v.7.2.2 (Tree Star Inc).

3.10 Quantificao de NO pela Reao de Griess

Os sobrenadantes das culturas de clulas infectadas e controles foram

coletados 72h aps a infeco. A quantificao de NO foi feita pela reao de

Griess (Green et al., 1982).

O volume de 50 l foi misturado com 50 l da soluo A (2,5 ml de cido

fosfrico, 0,5 g de sulfanilamida, 47,5 ml de H2O de milliQ) e soluo B (0.05 g

de N-1-naphitiletilenodiamida, 50 ml de H2O de milliQ) de Griess (vol/vol) numa

placa de 96 poos e incubado por 10 minutos na estufa a 37 C. A leitura foi

feita em leitor de microplacas (MR5000 Dynatech, USA), no comprimento de

onda de 540/570 nm. A curva padro foi feita utilizando diluies de NaNO3 de

200 M a 1.56 M.

38

3.11 ELISPOT para Clulas Secretoras de Imunoglobulinas

O ensaio de ELISPOT (ELISA SPOT assay) foi realizado como descrito

previamente (DImprio Lima et al., 1991). Em resumo, anticorpos de cabra

anti-imunoglobulina (Ig) total de camundongo (10 g/mL) foram adsorvidos

overnight (4C) em microplacas de 96 poos (Costar), bloqueado com

gelatina 1% (Merck) diluda em PBS 1X, por 120 min. Clulas do bao diludas

(1 x 106 at 5 x 102 clulas/poo) foram cultivadas em meio RPMI 1640 com

1% SFB, por 6 h, 37 C em 5% CO2. Os spots foram revelados adicionando

os anticorpos goat anti-mouse IgM, IgG2a ou IgG1 biotinilados, posteriormente,

adicionando a estreptoavidina conjugada fosfatase alcalina (todos os

anticorpos e conjugados so Southern Biotechnology Associates). Foi utilizado

como substrato 5-Bromo-cloro-3-indolil fosfato (Sigma-Aldrich) diludo em

tampo 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP) (Merck). E, a partir das diluies

(nmero de clulas plaqueadas vs spots) e o total do nmero de esplencitos

plaqueados, o nmero de clulas secretoras de Ig por bao foi calculado.

3.12 Anlise histopatolgica

O fgado foi coletado e fixado em formaldedo 10% tamponado por 48h para

histopatologia e a patologia avaliada atravs microscopia dos cortes

histolgicos dos tecidos corados pelos mtodos hematoxilina-eosina a fim de

visualizar alteraes celulares e teciduais.

3.13 Anlise estatstica

A anlise estatstica foi realizada com o teste Two-way ANOVA, seguido por

anlise do Teste de Bonferroni. Todas as anlises estatsticas foram realizadas

no programa Prisma 4 (Graph Pad Software) e as diferenas entre os trs

grupos sero consideradas significativas para valores de p

4 RESULTADOS

40

4.1 Quantificao de ATP no soro e permeabilizao de linfcitos T do

sangue de camundongos antes e aps a ruptura dos eritrcitos.

De acordo com as hipteses iniciais deste trabalho, analisamos a

quantidade de ATP no soro de camundongos C57BL/6 infectados com P.

chabaudi antes e aps a ruptura dos eritrcitos. Primeiramente,

acompanhamos a parasitemia em diferentes horrios. Esfregaos sanguneos

de camundongos no 6 dia de infeco foram realizados entre os horrios de

09h00 min as 14h00 min (Figura 2A) e os diferentes estgios do ciclo

eritroctico do plasmdio foram determinados. O principal objetivo neste

experimento foi determinar o intervalo de tempo entre a queda das

porcentagens de esquizontes maduros e a formao de trofozotos jovens em

forma de anel. Desta forma foi possvel observar o perodo que ocorre o

rompimento dos eritrcitos. A reduo no nmero de esquizontes ocorreu aps

as 12h00 min e o aparecimento de trofozotos em forma de anel aps as 13h00

min. Assumimos o horrio de 12h30 min como o melhor momento para a coleta

do soro aps a esquizogonia devido ao recente rompimento dos eritrcitos.

Camundongos C57BL/6 foram infectados com P. chabaudi e 100 l de sangue

foram coletados no 6 dia de infeco (parasitemia 25 30%) antes e aps a

ruptura dos eritrcitos assim como controles no infectados. Escolhemos o 6

dia de infeco devido alta parasitemia sem o risco de anemia. O soro foi

coletado e devidamente armazenado em freezer -20 C. Quantificamos o ATP

nos soros armazenados e observamos que camundongos infectados possuem

maior quantidade de ATP no soro que camundongos controle no infectados.

Camundongos infectados possuem um aumento nos nveis de ATP no soro

aps o perodo de esquizogonia (Figura 2B).

Outro fator importante observado foi a permeabilizao de linfcitos do

sangue. Desta forma podemos quantificar a sensibilidade da clula em

resposta ao ATP (300 M). Portanto, nosso objetivo foi observar a capacidade

de permeabilizao da clula frente ao ATP antes e aps a ruptura dos

eritrcitos. Verificamos que os linfcitos T CD4+ e T CD8+ do sangue de

camundongos no 4 dia de infeco (parasitemia 2 4%) com P. chabaudi so

mais suscetveis ao do ATP em comparao com o controle (Figura 1C).

Aps a ruptura dos eritrcitos, os linfcitos T CD4+ apresentaram um aumento

41

da permeabilizao induzida por ATP quando comparados com a

permeabilizao de linfcitos antes da ruptura. No entanto, os linfcitos T CD8+

apresentaram uma queda na permeabilizao induzida por ATP aps a ruptura

dos eritrcitos no 5 dia de infeco. A permeabilizao espontnea foi maior

aps a ruptura dos eritrcitos tanto nos linfcitos T CD4+ como nos linfcitos

TCD8+ de camundongos infectados com P. chabaudi.

Figura 2 Quantificao de ATP no soro e permeabilizao de linfcitos do sangue antes e aps o rompimento dos eritrcitos. A. Estgios do ciclo eritroctico do P. chabaudi foram verificados em diferentes horrios atravs de esfregaos sanguneos de camundongos no 6 dia de infeco. B. Dosagem de ATP no soro de camundongos antes e aps a ruptura dos eritrcitos no 6 dia de infeco e controles no infectados. C. Comparao da permeabilizao espontnea ou induzida por 300 M de ATP, de linfcitos T CD4+ e T CD8+ provenientes do sangue de camundongos infectados com P. chabaudi () e controles no infectados (), antes e aps a ruptura dos eritrcitos, durante os dias 4 e 5 de infeco. Os dados so representativos das mdias desvio padro (n=4) com 2 experimentos realizados em separado. *p

42

4.2 Permeabilizao de clulas esplnicas atravs da abertura de canais

purinrgicos.

A princpio, verificamos que aps a ruptura dos eritrcitos parasitados, a

permeabilizao dos linfcitos do sangue aumenta. Para corroborar a hiptese

do aumento de permeabilizao devido ruptura dos eritrcitos, realizamos um

experimento onde as clulas do bao foram expostas ao sobrenadante de

eritrcitos parasitados e no parasitados lisados. Desta forma, nosso objetivo

foi verificar se o sobrenadante era capaz de induzir permeabilizao nas

clulas TCD4+ e DC do bao de camundongos C57BL/6 no 4 dia de infeco

com P. chabaudi e controles no infectados. A permeabilizao foi maior nas

clulas T CD4+ e DC de camundongos infectados que foram expostas ao

sobrenadante de eritrcitos parasitados lisados (Figura 3).

Aps verificarmos a permeabilizao induzida pela ruptura dos

eritrcitos, nosso prximo passo foi observar se a permeabilizao era

dependente do P2X7R. Portanto, utilizamos o sobrenadante de eritrcitos

parasitados e no parasitados lisados sobre as clulas de camundongos

C57BL/6 Knockout para o P2X7R (P2X7R-/-). A permeabilizao de clulas do

bao de camundongos P2X7R-/- infectados com P. chabaudi induzida pelo

sobrenadante de eritrcitos parasitados lisados foi menor que nos

camundongos WT (Figura 3). Da mesma forma, observamos tambm a

reduo de permeabilizao de linfcitos T CD4+ de camundongos P2X7R-/-

quando foram expostos ao sobrenadante de eritrcitos no parasitados. A

permeabilizao mais expressiva foi em DC de camundongos WT infectados.

Para todos os grupos, utilizamos o meio de cultura como controle basal de

permeabilizao.

43

Figura 3 Permeabilizao de linfcitos T CD4+ e DC de camundongos C57BL/6 e P2X7R-/- com o sobrenadante de eritrcitos parasitados e no parasitados lisados. Comparao da permeabilizao de linfcitos T CD4+ e DC do bao induzida pelo sobrenadante de eritrcitos parasitados e no parasitados lisados ou apenas meio. As clulas permeabilizadas foram retiradas de camundongos infectados com P. chabaudi (4 dia) e controles. Os dados so representativos das mdias desvio padro (n=3) com 3 experimentos realizados em separado. *p

44

em clulas de camundongos infectados com P. chabaudi no 7 dia de infeco

como em clulas de camundongos saudveis (dados no apresentados). Desta

forma, verificamos que durante a infeco os linfcitos T e DC do bao tornam-

se suscetveis a ao do eATP.

Aps constatarmos um aumento de permeabilizao em clulas do bao

de camundongos infectados, nosso prximo objetivo foi determinar se a

permeabilizao encontrada era dependente do P2X7R. Assim, comparamos a

permeabilizao espontnea e induzida por ATP (300 M) de clulas do bao

de camundongos C57BL/6 e P2X7R-/- no 4 dia de infeco e controles. As

clulas de camundongos P2X7R-/- no so capazes de se permeabilizar aps o

contato com o ATP, ao contrrio das clulas de camundongos C57BL/6 nas

quais possuem expressiva permeabilizao induzida por ATP (Figura 4B).

45

Figura 4 Permeabilizao induzida por ATP de clulas do bao de camundongos C57BL/6 e P2X7R-/- infectados com P. chabaudi. A. Permeabilizao induzida por diferentes concentraes de ATP (0, 25, 50, 100, 300 e 500 M) de clulas TCD4+ e DC do bao de camundongos no 4 (), 7 dia de infeco com P. chabaudi () e controles (). B. Permeabilizao espontnea e induzida por ATP (300 M) de clulas TCD4+ e DC do bao de camundongos WT e P2X7 -/- infectados com P. chabaudi (4 dia). Os dados so representativos das mdias desvio padro (n=3). *p

46

Com o intuito de corroborar a hiptese da permeabilizao dependente

do P2X7R, tratamos esplencitos totais de camundongos no 4 dia de infeco

com P. chabaudi e controles com um antagonista do P2X7R (BBG).

Analisamos a permeabilizao induzida por 300 M de ATP em linfcitos T

CD4+ e DC tratados com o BBG e controles no tratados. As clulas tratadas

com BBG apresentaram uma reduo significativa na permeabilizao

comparadas com as clulas no tratadas (Figura 5).

Figura 5. Permeabilizao de linfcitos T CD4+ e DC tratados com BBG de camundongos infectados e no infectados. Permeabilizao induzida por ATP (300 M) de clulas do bao de camundongos infectados com P. chabaudi (4 dia) e controles tratadas com BBG. Os dados so representativos das mdias desvio padro (n=3). *p

47

de camundongos infectados (Dia 4) + EP. Todas as clulas foram marcadas

com CFSE e submetidas a diferentes concentraes de ATP. As clulas no

sofreram a lise induzida de eritrcitos, uma vez que observamos que a lise

altera a permeabilizao celular. Ao avaliar o nmero de clulas T

CD4+CFSElow, observamos que os linfcitos T CD4+ estimulados com EP (Dia

4+EP) apresentaram um pequeno aumento no nmero de clulas proliferando,

quando deixados em cultura com 25 M de ATP. No entanto o aumento de

ATP em cultura resultou na diminuio no nmero de clulas totais e

conseqentemente uma diminuio no nmero de clulas proliferando (Figura

6A). O aumento encontrado na porcentagem de clulas proliferando no reflete

um aumento real do nmero de clulas T CD4+CFSElow encontradas na cultura,

de acordo com os dados obtidos, doses aumentadas de ATP induz uma

reduo no nmero de clulas totais (Figura 6A). Os linfcitos T CD8+ no

apresentaram uma proliferao expressiva, no entanto observamos uma

mesma reduo no nmero de clulas totais e proliferando quando deixados

em cultura com doses crescentes de ATP (Figura 6B).

48

FIGURA 6 - Proliferao de linfcitos T CD4+ e T CD8+ mantidos em cultura com diferentes concentraes de ATP. A e B, Proliferao de linfcitos TCD4+ e T CD8+ esplnicos de camundongos controles e infectados com P. chabaudi mantidos em cultura com diferentes concentraes de ATP (0, 25, 100, 300 e 500 M). As clulas foram marcadas com CSFE e mantidas em cultura por 72h na presena ou ausncia de EP e ATP. Os dados do nmero de clulas totais e nmero de clulas proliferando so representativos das mdias desvio padro (n=3). Os dot plots representam a intensidade de fluorescncia de CFSE em clulas TCD4+ e TCD8+. A porcentagem de proliferao foi analisada pela reduo de intensidade de fluorescncia do CFSE. *p

49

Outro parmetro avaliado foi a proliferao de clulas do bao de

camundongos no 4 dia de infeco e controles, com ou sem o estmulo (EP),

tratadas com um antagonista do P2X7R (BBG). Observamos, na cultura de

clulas do dia 4 + EP, uma reduo significante no nmero total de linfcitos T

CD4+ e no nmero de clulas proliferando quando tratadas com BBG (Figura

7A). Os linfcitos T CD8+ que receberam o estmulo apresentaram uma

reduo no nmero de clulas totais, quando tratadas com BBG, e uma queda

no nmero de clulas proliferando (Figura 7B). Portanto, o tratamento das

clulas com BBG resultou em diminuio no nmero de esplencitos de

camundongos no 4 dia de infeco na cultura. Desta forma, verificamos se a

eliminao do ATP tambm foi capaz de reduzir o nmero de clulas e a

proliferao. O tratamento de esplencitos com apyrase, funciona como um

catalisador da hidrlise do ATP, permitindo a eliminao do ATP na cultura.

Observamos uma reduo no nmero de linfcitos T CD4+ e T CD8+ tratados

com apyrase e deixados em cultura na presena de EP (Figura 7A e B). No

entanto, somente os linfcitos T CD4+ tratados com apyrase apresentaram uma

reduo significativa no nmero de clulas proliferando.

50

FIGURA 7- Proliferao de linfcitos T CD4+ e TCD8+ tratados com BBG ou Apyrase. A e B, Proliferao de linfcitos TCD4+ e T CD8+ esplnicos tratados com BBG ou Apyrase e controles no tratados, de camundongos controles e infectados com P. chabaudi. As clulas foram marcadas com CSFE e mantidas em cultura por 72h na presena ou ausncia de EP. Os dados do nmero de clulas totais e nmero de clulas proliferando so representativos das mdias desvio padro (n=3). Os dot plots representam a intensidade de fluorescncia de CFSE em clulas TCD4+ e TCD8+. A porcentagem de proliferao foi analisada pela reduo de intensidade de fluorescncia do CFSE. Os dados so representativos de 2 experimentos realizados em separado. *p

51

O tamanho da clula est diretamente relacionado com a ativao

celular. Portanto, avaliamos o tamanho das clulas do bao de camundongos

no 4 dia de infeco, estimuladas com EP, tratadas e no tratadas com BBG .

A figura 8 demonstra claramente uma reduo no nmero de clulas grandes

B220+ e CD4+, desta forma corroborando com os resultados de reduo da

proliferao quando as clulas so tratadas com BBG (Figura 7).

52

FIGURA 8 Tamanho celular e expresso de CD69 em linfcitos do bao de camundongos C57BL/6 tratados com BBG em cultura. Tamanho celular de linfcitos TCD4+ e B220+ do bao de camundongos no 4 dia de infeco com P. chabaudi, estimulados com EP e tratados ou no tratados com BBG. B. Expresso de CD69 em linfcitos TCD4+ e B220+ do bao de camundongos no 4 dia de infeco com P. chabaudi, estimulados com EP e tratados ou no com BBG. As clulas foram mantidas em cultura por 72h. Os dados so representativos de 2 experimentos realizados. *p

53

FIGURA 9 - Influncia do ATP na produo de citocinas e NO no sobrenadante de cultura de clulas do bao. A. Quantificao de citocinas secretadas no sobrenadante de cultura de clulas do bao de camundongos controles e infectados com P. chabaudi, na presena ou ausncia de EP com diferentes concentraes de ATP (0, 25, 50, 100, 300 e 500 M). *p

54

4.5 Parasitemia e nmero de clulas no bao de camundongos C57BL/6,

P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG

Os experimentos realizados em cultura mostraram diferenas

significativas em clulas tratadas com BBG e Apyrase. Desta forma,

analisamos o perfil de resposta em camundongos deficientes do P2X7R e em

camundongos tratados com BBG e infectados com P. chabaudi. O tratamento

com BBG foi realizado em dias alternados tendo incio um dia antes da

infeco com P. chabaudi. Todos os grupos foram infectados e a parasitemia

acompanhada at o 7 dia de infeco. Verificamos uma reduo significativa

da parasitemia no grupo tratado com BBG em relao ao grupo WT no 6 dia

de infeco (Figura 10A), no entanto no 7 dia no houve diferena

significativa. Acompanhamos os grupos de camundongos P2X7-/- e WT at o

20 dia de infeco e no constatamos diferenas (Figura 10A). Analisamos o

perfil de clulas do bao de camundongos WT, P2X7-/- e WT tratados com BBG

no 7 dia de infeco. Verificamos uma reduo significativa no nmero de

clulas totais do bao nos grupos P2X7-/- e WT tratados com BBG no 7 dia de

infeco (Figura 10B). Os camundongos P2X7-/- tiveram uma reduo

significativa no nmero de clulas B220+ e CD11c+IAb+ e o grupo WT tratado

com BBG apresentou uma diminuio nas quatro populaes celulares (TCD4+,

TCD8+, B220+ e CD11c+IAb+) (Figura 10C). importante notar que somente os

camundongos infectados apresentaram uma reduo significativa nas

populaes.

55

FIGURA 10 - Parasitemia e nmero de clulas em camundongos C57BL/6, P2XR-/- e C57BL/6 tratados com BBG. A. Curva de parasitemia de camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG infectados com P. chabaudi. B. Nmero de clulas por bao de camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG, controles e infectados com P. chabaudi. C. Nmero de clulas TCD4+, TCD8+, B220+ e CD11c+ do bao de camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG, controles e infectados com P. chabaudi. Todos os dados so representativos das mdias desvio padro (n=3) de um experimento realizado. *P

56

4.6 Nmero de clulas produtoras de IFN- e anticorpos em camundongos

WT, P2X7-/- e WT tratados com BBG

Avaliamos o nmero de clulas produtora de IFN- e clulas produtoras

de anticorpos no 7 dia de infeco, uma vez que estes mecanismos efetores

so importantes no controle da malria e nas manifestaes clnicas

associadas doena. Os camundongos P2X7R-/- no apresentaram diferenas

no nmero de clulas produtoras de IFN- em relao aos camundongos

C57BL/6. Em relao aos linfcitos T CD8+, observou-se uma reduo

significativa no nmero de clulas dos camundongos C57BL/6 tratados com

BBG em comparao com o grupo C57BL/6 no tratado (Figura 11A). Os

camundongos controles no apresentaram diferenas entre os diferentes

grupos. Embora os linfcitos B sejam resistentes a permeabilizao por ATP, a

resposta imune mediada pelos linfcitos B foi analisada, uma vez que

observamos uma reduo no nmero total de linfcitos B220+ em

camundongos P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG (Figura10C). No

verificamos diferenas significativas no nmero de clulas produtoras de

anticorpos entre os grupos controle e nem entre os grupos de camundongos no

7 dia de infeco (Figura 11B).

57

FIGURA 11 - Nmero de linfcitos T produtores de IFN e linfcitos B produtores de anticorpos em camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG. A. Nmero de clulas TCD4+ e TCD8+ produtoras de IFN em camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG, controles e infectados com P. chabaudi. Os grficos representam as mdias desvio padro (n=3). B. Nmero de clulas produtoras de IgM, IgG1 e IgG2a em camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com BBG, controles e infectados com P. chabaudi. Os dados so representativos de um experimento realizado (n=3).

58

4.7 Expresso de marcadores de superfcie durante a fase aguda da infeco

com P. chabaudi.

Analisamos a expresso de marcadores de superfcie em clulas TCD4+,

TCD8+ e B220+ de camundongos C57BL/6, P2X7R-/- e C57BL/6 tratados com

BBG. Verificamos, atravs da intensidade de fluorescncia, uma reduo na

expresso de CD69 em linfcitos TCD4+ e B220+ nos camundongos C57BL/6

tratados com BBG em relao aos camundongos C57BL/6 (Figura 12A). Os

camundongos P2X7R-/- no apresentaram diferenas significativas e no

encontramos alteraes entre o grupo no infectado. Analisamos tambm a

expresso de molculas de classe II, CD80 e CD86 em linfcitos B e DC.

Encontramos somente diferenas significativas, entre o grupo infectado, na

intensidade de fluorescncia de molculas de classe II em linfcitos B (Figura

13). Outro fator importante observado foi a reduo da expresso de CD62L

em linfcitos T CD4+ e T CD8+ nos camundongos C57BL/6 tratados com BBG

(Figura 12B). Verificamos tambm diferenas na expresso de CD62L entre os

grupos controles.

59

FIGURA 12 - Expresso de marcadores de superfcie durante a fase aguda da infeco com P. chabaudi. A. Expresso de CD69 em clulas T CD4+, TCD8+ e B 220+ do bao de camundongos WT, P2X7-/- e WT tratados com BBG, controles e infectados com P. chabaudi. B. Porcentagem de clulas TCD4+CD62L- e TCD8+CD62L- do bao de camundongos WT, P2X7-/- e WT tratados com BBG, controles e infectados com P. chabaudi. Todos os dados so representativos das mdias desvio padro de um experimento realizado (n=3). .*p

60

FIGURA 13 - Expresso de marcadores de superfcie em clulas esplnicas de camundongos C57BL/6, P2X7-/- e C57BL/6 tratados com BBG, no dia 7 de infeco por P. chabaudi. Expresso de IAb, CD80 e CD86 em clulas T CD4+, T CD8+ e B 220+ esplnicas de camundongos C57BL/6, P2X7R e C57BL/6 tratados com BBG, controles e infectados com P. chabaudi. Os dados so representativos das mdias desvio padro de um experimento realizado (n=3).*p

61

4.8 Anlise histopatolgica do fgado de camundongos C57BL/6 tratados e

no tratados com BBG e P2X7R-/- infectados com P. chabaudi e controles.

Os cortes histolgicos do fgado dos camundongos foram realizados

para observarmos diferenas na patologia de camundongos C57BL/6, P2X7R-/-

e C57BL/6 tratados com BBG infectados com P. chabaudi. Portanto, os fgados

dos camundongos C57BL/6 tratados e no tratados com BBG e P2X7R-/-

infectados com P. chabaudi e controles foram coletados e fixado em

formaldedo 10% tamponado por 48h para histopatologia. A patologia foi

avaliada por meio da microscopia dos cortes histolgicos dos tecidos corados

pelos mtodos hematoxilina-eosina a fim de visualizar alteraes celulares e

teciduais.

O fgado dos camundongos C57BL/6 infectados com P. chabaudi

apresentou regies de intensa injria tecidual em todas as seces analisadas

(Figura 14B). No entanto, o fgado dos camundongos P2X7R-/- infectados no

apresentou nenhum sinal de leso (Figura 14D). importante ressaltar que o

fgado dos camundongos C57BL/6 e P2X7R-/- no infectados no apresentou

injria tecidual (Figuras 14A e C).

O tratamento com BBG obteve reduo parcial das leses hepticas nos

camundongos C57BL/6 infectados com P. chabaudi (Figura 14F). Porm,

observamos que apenas o tratamento com BBG em camundongos C57BL/6

proporciona pequenas regies de leso no fgado (Figura 14E). As leses

hepticas dos camundongos C57BL/6 infectados representam 24% da rea

total do fgado e os camundongos C57BL/6 tratados com BBG e infectados

apresentaram 4% da rea total do fgado lesionada (Figura 14G).

62

Figura 14 - Receptores P2X7 contribuem para o dano no fgado de camundongos infectados com P. chabaudi. Corte histolgico do fgado de camundongos: A. C57BL/6 no infectados, B. C57BL/6 infectados com P. chabaudi, C. C57BL/6 no infectados e tratados BBG, D. C57BL/6 infectados com P. chabaudi e tratados com BBG, E. P2X7R-/- no infectados, G. P2X7R-/- infectados com P. chabaudi. G. As leses foram calculadas de acordo com a rea de dano (m) em relao rea total. Os cortes histolgicos foram corados pelos mtodos hematoxilina-eosina. Todos os dados so representativos das mdias desvio padro de um experimento realizado (n=3). .*p

5 DISCUSSO

64

Os mecanismos pelos quais o sistema imunolgico consegue detectar e

responder a sinais de dano, tais como o ATP, so alvos de estudos recentes.

Durante muitos anos o eATP foi estudado como molcula neurotransmissora

do sistema nervoso, atuando tanto no sistema nervoso central como no

sistema nervoso perifrico (Burnstock, 2007). Alm da participao neuronal, o

eATP tem um importante papel em condies inflamatrias (Khakh e North,

2006). Sinais de dano, tais como o ATP, so liberados no meio extracelular

durante a morte celular ou por meio de canais na membrana durante uma

resposta inflamatria (Trautmann, 2009).

A ligao do ATP aos receptores P2X, chamados de receptores

purinrgicos ionotrpicos, proporciona uma permeabilizao celular que pode

atuar tanto na fisiologia (Corriden e Insen, 2010) como na ativao celular.

Durante uma resposta inflamatria, o ATP liberado por meio de clulas

apoptticas ou necrticas, dano tecidual ou por sinalizao parcrina e

autcrina (Junger, 2011). Na malria, possvel que durante o rompimento de

eritrcitos haja uma grande quantidade de ATP sendo liberada. A concentrao

citoslica de ATP varia entre 3 e 10 mM, no entanto a concentrao

extracelular de ATP fica em torno de 10 nM (Trautman, 2009). Esta diferena

nas concentraes intra e extracelulares mantida pela ao de ecto-atpases

que metabolizam o eATP em ADP, AMP e adenosina. Portanto, as

concentraes sricas de ATP so extremamente inferiores s concentraes

intracelulares ou quantidades liberadas pelas clulas. Neste trabalho

verificamos que a concentrao de ATP no soro de camundongos infectados

com P. chabaudi maior aps a ruptura dos eritrcitos. Alm disso, os

linfcitos do sangue tambm possuem diferenas na permeabilizao. A

permeabilizao espontnea e induzida dos linfcitos do sangue aumenta aps

a ruptura dos eritrcitos. Embora seja difcil identificar a principal fonte de

liberao de ATP, h trabalhos mostrando que eritrcitos infectados com P.

falciparum so capazes de liberar grande quantidade de ATP no meio (Akkaya

et al., 2009) e este ATP possui um importante papel durante a invaso pelo P.

falciparum de eritrcitos humanos (Levano-Garcia et al., 2010). O

sobrenadante de EP lisados realmente induz maior permeabilizao celular

que o sobrenadante de eritrcitos no parasitados. Alm disso, verificamos que

a permeabilizao, acima dos nveis basais, dependente do P2X7R. Desta

65

forma, estes resultados sugerem que realmente possvel haver

permeabilizao celular por meio da ligao do ATP a P2X7R aps a ruptura

de EP.

Em nosso estudo mostramos que no 4 dia de infeco com P. chabaudi

os linfcitos e DC do bao esto mais suscetveis ao do eATP. As clulas

do bao de camundongos infectados com P. chabaudi, quando expostas a

crescentes doses de ATP, aumentam a permeabilizao celular com maior

intensidade em comparao com o controle. As DC so importantes clulas de

deteco de sinais de dano (Di Virgilio, 2005) e, consequentemente,

apresentaram alta capacidade de responder ao ATP mesmo em baixas

concentraes. importante ressaltar que a permeabilizao encontrada em

clulas T CD4+ e DC dependente do P2X7R. Alm da utilizao de

camundongos P2X7R-/-, outro fator que corroborou para esclarecermos que a

permeabilizao dependente do P2X7R foi a utilizao de um antagonista de

P2X7R (BBG). O tratamento de clulas com BBG tambm foi capaz de reduzir

a permeabilizao de clulas do bao de camundongos infectados e controles.

O resultado da exposio das clulas ao eATP est diretamente

relacionado com a concentrao de ATP no meio. As concentraes de ATP

acima de 100 M so capazes de ativar P2X7R e induzir a abertura do poro

(DiVirgilio et al., 2001). Porm, concentraes abaixo de 100 M podem induzir

a abertura de canais de ons por meio da ligao de receptores P2X (DiVirgilio

et al., 2001). A abertura de canais em linfcitos T induz o influxo de Ca2+

extracelular e auxilia a ativao e proliferao de linfcitos T (Loomis et al.,

2003; Budagian et al, 2003) e o eATP em linfcitos T CD4+ atua como um fator

co-estimulador, sendo que a gerao e liberao de mais ATP depende

exclusivamente da fora de ativao do linfcito T (Schenk, 2008). Sabendo

que durante a infeco aguda pelo P. chabaudi, h proeminente ativao de

linfcitos T CD4+ (Langhorne et al., 1989), tivemos grande interesse em

entender o papel do eATP na proliferao de tais clulas. Em nossos achados,

o eATP na concentrao de 25 M proporciona um aumento na proliferao de

clulas T CD4+ de camundongos no 4 dia de infeco com P. chabaudi que

foram estimulados com EP na cultura. O aumento na proliferao com baixas

doses de ATP no necessariamente dependente de P2X7R, uma vez que a

formao do poro necessita de altas concentraes de ATP. Este resultado

66

sugere que possa haver a participao de outros receptores de eATP que

auxiliariam na proliferao celular. Em 2010, Woehrle e colaboradores

mostraram que a liberao de ATP atravs de canais de panexina 1 e a

ativao autcrina de receptores P2X1 e P2X4 tem importante funo na

amplificao do sinal do TCR e comunicao entre clulas T e APC nas

sinapses imunes. Concentraes acima de 25 M de ATP diminuem o nmero

de clulas proliferando e no proliferando de forma que temos a falsa

impresso de aumento na proliferao celular com altas concentraes de

ATP. Estudos mostram que a ativao prolongada de P2X7R com altas

concentraes de ATP pode induzir apoptose (Aswad e Dennert, 2006) ou com

baixas concentraes induzir a ativao celular (Adinolfi et al., 2005). Porm, a

inibio da ligao do ATP a P2X7R, por meio do tratamento com BBG ou

Apyrase, tambm reduz o nmero de clulas proliferando. interessante

ressaltar que o tratamento das clulas com BBG reduz o nmero de clulas

grandes e reduz a expresso de marcadores da ativao tais como CD69. Em

resumo, os nossos resultados corroboram a noo de que o eATP em baixas

concentraes importante para a manuteno fisiolgica da clula e ativao

celular e em altas concentraes pode atuar como um sinal de dano e induzir a

morte celular.

A fase inicial que resulta em superproduo de citocinas pode depender

do tipo de interao entre clulas do hospedeiro, o parasita e os sinais de dano

liberados. Muitos estudos tm focado no papel dos receptores de

reconhecimento padro (PRRs) sobre as clulas do hospedeiro usadas para

reconhecer e responder ao plasmdio. Molculas do parasita e do hospedeiro,

tais como GPI e hemozona, induzem uma reposta na fase aguda com ativao

local de moncitos e do endotlio vascular (Ropert et al., 2008). Alm disso, os

sinais de dano tambm so mecanismos de induo de resposta imune.

McDonald e colaboradores mostraram que os sinais de dano intravasculares

guiam os neutrfilos para stios de inflamao estril, outro grupo verificou que

canais de panexina-1 so capazes de controlar a permeabilidade da

membrana e liberao de sinais find-me durante a apoptose (Chekeni et al.,

2010).

A produo de IFN- intensa durante a fase aguda da malria. A

produo de citocinas pr-inflamatrias so importantes para o controle do

67

parasito, no entanto a resposta inflamatria exacerbada pode induzir grave

patologia (Schofield e Grau, 2005). Verificamos que o tratamento das clulas

com BBG ou apyrase capaz de reduzir a produo de IFN- em culturas de

esplencitos de camundongos no 4 dia de infeco. Ainda assim, em altas

concentraes de eATP, tambm observamos reduo da produo de

citocinas na cultura. Estes resultados indicam que a concentrao de eATP

interfere no resultado inicial da resposta imune, principalmente atuando na

ativao dos linfcitos. Em altas concentraes, a ligao do eATP ao P2X7R

talvez seja importante para regular a produo exacerbada de IFN-.

Verificamos tambm que a produo de NO aumentou em baixas

concentraes de eATP.

As citocinas IL-10 e IL-4 foram somente liberadas, em maior

quantidade, na cultura de clulas do bao de camundongos no 4 dia de

infeco que receberam estmulo. A IL-10 tem um importante papel protetor na

malria. Durante a infeco com P. berghei ANKA, a IL-10 parece estar

envolvida na proteo contra a patognese induzida pela resposta Th1

(Kossodo et al., 1997). Alm disso, experimentos usando camundongos

knockouts para IL-10 infectados com P. chabaudi apresentam aumento na

patologia mediado por citocinas pr-inflamatrias (Li et al., 1999).

O papel do linfcito T CD8+ na fase aguda da malria principalmente

relatado durante a fase heptica, com alta produo de IFN- que ajudam na

morte de parasitas em hepatcitos infectados (Schofield et al, 1987). Durante o

estgio eritroctico de camundongos infectados com P. chabaudi, observamos

que a permeabilizao de linfcitos T CD8+ no acompanhou o ciclo do

parasito, como encontrado nos linfcitos T CD4+ e a proliferao de linfcitos T

CD8+ em cultura sob estmulo de EP baixa. Tem sido mostrado que o estgio

sanguneo do plasmdio induz DC a suprimir a resposta de linfcitos T CD8+

(Ocana-Morgner et al., 2003). A adio de ATP em cultura reduz o nmero de

linfcitos T CD8+. Os linfcitos T CD8+ podem tambm influenciar na

patognese da malria (Yanez et al, 1996; Belnoue et al., 2002). Em

camundongos infectados com P. berghei ANKA, o nmero de linfcitos T CD8+

infiltrando o crebro aumentado durante a malria cerebral, e estas clulas

contribuem para mudanas na permeabilidade da barreira hematoenceflica

atravs de mecanismos dependentes de perforina (Nitcheu et al, 2003).

68

As anlises realizadas in vivo apresentaram o mesmo perfil dos

experimentos realizados in vitro. Camundongos tratados com BBG

apresentaram um atraso na parasitemia no 6 dia de infeco, no entanto esta

diferena no persistiu em dias posteriores. Embora no tenhamos observado

diferenas significativas na parasitemia, os camundongos P2X7R-/- e os

camundongos tratados com BBG apresentaram reduo no nmero total de

esplencitos. Uma possvel explicao para esta reduo que a inibio da

ligao do ATP a P2X7R resulta em diminuio da ativao celular e,

consequentemente, reduo na proliferao. Camundongos P2X7R-/- obtiveram

maiores redues em linfcitos B e DC e camundongos tratados com BBG

apresentaram reduo em linfcitos B, DC e linfcitos T CD4+ e T CD8+. No

entanto, no foi verificada uma reduo significativa no nmero de clulas T

CD4+IFN-+ nos camundongos tratados com BBG, porm encontramos uma

reduo na populao de linfcitos T CD8+IFN-+.

Marcadores de ativao tais como CD69 tambm foram reduzidos em

camundongos tratados com BBG, desta forma corroborando os resultados in

vitro. Esta reduo na resposta inflamatria tambm foi observada por Peng e

colaboradores em ratos tratados com BBG que sofreram leso na coluna, alm

de uma melhora na injria local. Os camundongos tratados com BBG tambm

apresentaram alta expresso de CD62L nos linfcitos. A alta expresso de

CD62L pode estar relacionada com o atraso na ativao celular e reduo da

resposta imunolgica. A utilizao de grupos de camundongos mais

numerosos deve contribuir para reforar a importncia do ATP e do P2X7R na

resposta imune contra estes parasitos. Camundongos tratados com BBG

tambm reduziram a expresso de molculas de classe II do MHC em

linfcitos B. As DC no apresentaram diferenas significativas na expresso de

molculas de classe II do MHC, embora alguns estudos mostrem que a ligao

de ATP ao P2X7R potencialize a apresentao de antgenos pelas DC (Mutini

et al, 1999). Talvez a diferena na expresso de molculas de classe II em DC

de camundongos tratados com BBG seja expressiva no incio da infeco com

P. chabaudi.

As leses no fgado de camundongos infectados com P. chabaudi

encontram-se particularmente extremamente exacerbadas no 7 dia de

infeco. Surpreendentemente, grande parte destas manifestaes patolgicas

69

geradas no fgado dependente de P2X7R. O tratamento de camundongos

com BBG tambm reduz as reas de injria no fgado. Portanto, conclumos

que a injria heptica que ocorre durante a infeco aguda pelo P. chabaudi

induzida pela ativao de P2X7R. Durante a infeco aguda da malria, a

injria no fgado poderia ser proveniente da ativao dependente de P2X7R

em diversos tipos celulares. Em particular, a estimulao mediada por P2X7R

de clulas NKT ativadas induz aumento da produo de citocinas e injria

heptica (Kawamura et al., 2006). Em 2010, um trabalho publicado pelo nosso

grupo mostrou que, durante a infeco aguda com P. chabaudi, h um

aumento no nmero de clulas NKT no bao e produo de IFN- por estas

clulas (Muxel et al., 2010). Em conjunto, nossos resultados mostram que,

durante a fase aguda do ciclo eritroctico do P. chabaudi, linfcitos T e

principalmente DC so responsivos ao ATP. No bao, o ATP importante para

a ativao, proliferao de linfcitos e, conseqentemente, para a produo de

IFN-. Interessantemente, a administrao de um antagonista do P2X7R

resultou em queda da resposta imune inicial. Esta diminuio na resposta

imune poderia contribuir para a reduo das manifestaes patolgicas

ocasionadas pela exacerbao da resposta imune aguda na malria.

6 CONCLUSES

73

A infeco com o P. chabaudi capaz de aumentar a permeabilizao

dependente do P2X7R de linfcitos e DC do sangue e do bao

espontnea e em resposta ao eATP.

A quantidade de ATP no soro e a permeabilizao de linfcitos T do

sangue de camundongos infectados com P. chabaudi maior aps a

ruptura dos eritrcitos.

O sobrenadante de EP lisados capaz de induzir um aumento na

permeabilizao de clulas do bao em comparao com o

sobrenadante de eritrcitos no parasitados.

A proliferao de linfcitos T CD4+ do bao de camundongos infectados

com P. chabaudi em cultura, estimulada por EP, aumenta na presena

de baixas concentraes de eATP e diminui em altas concentraes.

O tratamento in vitro com BBG proporciona uma reduo de proliferao

de linfcitos, diminuio na expresso de CD69 e queda no nmero de

linfcitos T CD4+ e B de maior tamanho.

A hidrlise do ATP catalisada por Apyrase em cultura de esplencitos

com EP resulta em diminuio da proliferao de linfcitos T CD4+ e T

CD8+.

Alta concentrao de eATP reduz a produo de citocinas IL-6, TNF-,

IL-4 e IL-10 na cultura de esplencitos com EP.

Camundongos P2X7R-/- no 7 dia de infeco com P. chabaudi reduzem

o nmero de clulas B e DC do bao.

Camundongos tratados com BBG no 7 dia de infeco com P. chabaudi

reduzem o nmero de clul