Escherichia coliA Escherichia coli foi isolada, pela primeira vez, em 1885 por Theodor Eschrich, um bacteriologista alemo, sendo considerada um habitante natural do tracto intestinal. T. Eschrich atribuiu a esta bactria o nome de Bacterium coli (bacterium = forma de bastonete, coli = colon, o seu habitat natural). Posteriormente, o nome do gnero foi alterado para Escherichia em sua homenagem (Neidhardt et al, 1996). bastante conhecida e estudada, principalmente porque extremamente fcil de manipular em laboratrio. O seu crescimento rpido, apresentando requisitos nutricionais simples, exibindo uma fisiologia e bioqumica interessantes.

Caracterizao do AgenteA Escherichia coli caracteriza-se taxonomicamente como pertencendo ao Reino Monera, Filo Proteobactria, Ordem Enterobacteriales, Famlia Enterobacteriaceae e Gnero Escherichia. Enterobacteriaceae uma famlia numerosa com distribuio ubiquitria, encontrando-se nos solos, plantas, guas, frutos, vegetais, garos de cereais e em animais, desde os insectos ate ao homem (brenner, 1986). O gnero Escherichia compreende cinco espcies: Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia hermannii e Escherichia vulneris que pertencem famlia Enterobacteriaceae (3) Destas cinco espcies apenas a E. coli tem um importante significado clnico, embora , E. hermannii e E. vulneris j tenham sido isoladas de infeces extra intestinais ( Sousa, 2000). E. coli apresenta antignios de superfcie: O (somtico) polissacardeos da membrana externa; antignios flagelares H relacionados com protenas dos flagelos e ainda antignios K, relacionados com polissacardeos capsulares. Em 1947, Kauffmann props um mtodo para a diferenciao das estirpes de E. coli com base na determinao dos trs principais antignios encontrados na superfcie bacteriana: os antignios superficiais O, K e H. Desde ento as estirpes de E. coli so classificadas por serotificao, atravs da utilizao de anticorpos especficos para os antignios O e H. A serotificao permite, em estudos epidemiolgicos e de patogenicidade de E. coli, a diferenciao de estirpes virulentas de estirpes incuas. Caractersticas gerais de identificao E. Coli um bacilo Gram-negativo, aerbio facultativo, no esporulado; na sua maioria com mobilidade atravs de flagelos, dispostos isoladamente, aos pares ou agregados em colnias (3). Pode ocorrer isolado, aos

pares ou em cadeia; tem cpsula ou micro cpsula; fermenta glucose e outros glcidos com produo de acido e gs a 44-45C. So quimioorganotrficos, fermentam e oxidam os glcidos. So oxidase negativos, catalase positivos, vermelho de metilo positivo, e citrato negativo. Reduzem nitrato a nitrito, so negativas para presena de H2S e ureia. Desenvolve-se a temperaturas na ordem dos 7C e 46C, sendo 37C a temperatura ptima, embora existam estirpes que capazes de se multiplicarem a 4C. So facilmente destrudas a temperaturas superiores a 60C, mas resistem por vrios meses em temperaturas de refrigerao.

Isolamento e identificaoO isolamento e identificao procede-se atravs da cultura da bactria em meio slido, selectivo Agar Levine (Difco), em meio Brain Heart Infusion (BHI) (Difco) utilizado para o crescimento de E. coli e em meio Mueller Hinton Agar II(MH) (Difco), utilizado para a determinao da sensibilidade a antibiticos da espcie E. coli, ou atravs de testes bioqumicos de identificao bacteriana. O processo de identificao bioquimica de E. coli efetuado atravs da determinao de um nmero mnimo de propriedades caractersticas que permitem a sua identificao com a qual podemos diferenciar gneros bacterianos, atraves de testes bioquimicos. A capacidade do microorganismo fermentar a frutose, lactose e/ou glucose, e de produzir gs e/ou sulfureto de ferro.

Agar de trs aucares e ferro (TSI) (Difco): Teste de identificao com a qual podemos

diferenciar gneros bacterianos. Teste da Oxidase (Mast Diagnostics) e Catalase: provas de interesse na identificao de Enterobactrias e Campylobacter. Teste oxidase

Este teste consiste em colocar uma gota do reagente incolor tetrametil p-fenileno de amina, recm preparado e protegido da luz, num papel de filtro.Seguidamente, semeiam-se vrias colnias do microrganismo em estudo sobre a rea do papel de filtro contendo o reagente, utilizando uma ana. O teste considerado positivo quando na mistura do reagente com a massa bacteriana desenvolve uma colorao prpura num curto intervalo de tempo. A E.coli oxidase negativa e podendo assim ser diferenciada de outros bacilos Gram negativos. A prova pode ser feita tambm atravs de culturas em meio slido, adicionando-se o reagente oxalato de paminodimetilanilina. A reaco inicia-se com o desenvolvimento de uma colorao rsea e finalmente, uma colorao negra na superfcie das colnias indicando a ocorrncia de produo de citocromo-oxidase, representando assim um teste positivo. O teste negativo quando no ocorre alterao de cor ou houver o desenvolvimento de uma cor rsea plida. Teste de produo de catalase Esta enzima actua sobre a gua oxigenada (perxido de hidrognio 3 a 5%) desdobrando-a em oxignio e gua. Adiciona-se perxido de hidrognio sobre a cultura basteriana em meio lquido ou em gar inclinado. O teste considerado positivo quando h borbulhamento ou efervescncia devido liberao do oxignio. A E.coli catalase positiva, portanto a reaco vai desencadear efervescncia.

CATALASE

2H202 Perxido de Hidrognio Teste da produo de indol

2H20 gua

+

O2 Oxignio Livre

O indol resulta da degradao do aminocido triptofano pela enzima triptofanase. O teste realizado inoculando-se em meio de cultura rico em triptofano composto por 10g de peptona de soja, 5g de NaCl num litro de gua destilada a um pH de 7,2. Os tubos de 3 ml de meio so inoculados com colnias suspeitas e incubam-se a 37C durante 24 h. Aps a incubao colocar 0,5 ml do reagente de Kovac na parede interna do tubo. As bactrias que possuem triptofanases (ex: E. coli) metabolizam o aminocido produzindo NH4+ e indol. Aps a adio do reagente de Kovac, a reaco positiva se ao agitar formar um anel vermelho superfcie do meio.

Este resultado devido complexao do indol com o aldedo, em meio cido, formando o composto colorido. O teste apresenta resultados negativos com qualquer outra tonalidade de cor.

Vermelho de Metilo (Meio M.R.V.P., Oxoid) A capacidade do microrganismo de oxidar a glicose com produo de cidos. Serve para diferenciar organismos entricos, em particular E. coli de E. aerogenes Preparam-se tubos de 3 ml do meio, inoculam-se com colnias suspeitas de uma cultura pura e incubam-se a 37C durante 24 h. Passado esse tempo, revela-se com umas gotas do corante vermelho de metilo. Uma mudana de cor (vermelho) indica acidificao do meio e portanto reaco positiva. Glicose + H20 cidos ltico, actico e frmico + CO2 + H2 + Vermelho de metilo

Enterobacter aerogenes Glicose + O2 cido actico (2,3-butanodiol e Acetilmetilcarbinol) + CO2 + H2 (pH 6,0)

Teste da produo de urease. A urease uma enzima que degrada a uria em duas molculas de amnia e uma de anidrido carbnico. O teste consiste em transferir uma poro do crescimento bacteriano com uma ana para o meio contendo uria, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho fenol. Aps o crescimento o teste tem resultados positivos quando a urease desdobra a uria, alcalinizando o meio, adequirindo uma colorao rosa. O teste tem resultados negativos quando no h alterao da cor do meio. esperado um resultado negativo, pois a E.coli no possui a enzima urease capaz de hidrolisar a ureia. Preparam-se 100 ml de ureia Agar base (Difco) que so esterilizados por filtrao e adicionase a uma soluo temperada, de 15 g de Bacto Agar (Difco) em 900 ml, previamente esterilizada em autoclave, distribuindo-se depois, em tubos.

Utilizao do citrato como nica fonte de carbono

Alguns microrganismos como a E. coli no possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da clula, no conseguindo portanto crescer no meio contendo como nica fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato. Distribui-se o meio em tubos e deixa-se arrefecer. O teste feito semeando-se a bactria em meio slido inclinado de citrato de Simmons (Simmons Citrate Agar, Difco) e incuba-se durante 24 h a 37C. O teste apresenta resultados quando ocorre alteraao da cor verde do meio para azul devido ao transporte de citrato pela permease e a sua utilizao pela enzima citratase resultando na formao de oxaloacetato e acetato. O desdobramento do citrato induz a clivagem do fosfato de amnia, alcalinizando o meio. Com o metabolismo do citrato h formao de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul. O teste tem resultados negativos quando no h alteraao do meio.

AP120E (bioMrieux) Sistema comercial especfico para a identificao de Enterobactrias.

Material e mtodosPara a realizao deste trabalho experimental, foram recolhidas 27 amostras de salsicha fresca de porco provenientes de quatro grandes superfcies comerciais. Material Ansa; Balana;

Bico de bunsen; Etiquetas e canetas de acetato; Estufa regulada a 37C; Frigorifico; Luvas; Pipetas de Pasteur; Pipetas graduadas; Pinas de pontas finas; Placas de Petri; Rgua; Suportes para tubos de ensaio; Tubos de ensaio; Zaragatoas esterelizadas; Homogeneizados; Homogeneizador (Stomaker); Outros: gua destilada; Escala de MacFarland;

Meios de cultura Agar Levine (Difco): utilizado para a cultura selectiva de E. coli. Brain Heart Infusion (BHI) (Difco): utilizado para o crescimento de E. coli. Mueller Hinton Agar II(MH) (Difco): utilizado para a determinao da sensibilidade a antibiticos da espcie E. coli. Testes Bioqumicos de Identificao Bacteriana Agar de trs aucares e ferro (TSI) (Difco) Realiza-se em tubos de ensaio, inocula-se em superfcie e em profundidade e incuba-se a 37C durante 24 h, em anaerobiose para E. coli.

Teste da Oxidase (Mast Diagnostics) e Catalase: provas de interesse na identificao de Enterobactrias e Campylobacter. Teste oxidase Este teste consiste em colocar uma gota do reagente incolor tetrametil p-fenileno de amina, recm preparado e protegido da luz, num papel de filtro.Seguidamente, semeiam-se vrias colnias do microrganismo em estudo sobre a rea do papel de filtro contendo o reagente, utilizando uma ana. O teste pode ser feito tambm atravs de culturas em meio slido, adicionandose o reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. Teste de produo de catalase Adiciona-se 0,5 ml de perxido de hidrognio (perxido de hidrognio 3 a 5%) sobre a cultura basteriana em meio lquido ou em gar inclinado. Teste da produo de indol O teste realizado inoculando-se em meio de cultura rico em triptofano composto por 10g de peptona de soja, 5g de NaCl num litro de gua destilada a um pH de 7,2. Os tubos de 3 ml de meio so inoculados com colnias suspeitas e incubam-se a 37C durante 24 h. Aps a incubao colocar 0,5 ml do reagente de Kovac na parede interna do tubo. Aps a adio do reagente de Kovac, a reaco positiva se ao agitar formar um anel vermelho superfcie do meio. Vermelho de Metilo (Meio M.R.V.P., Oxoid) Preparam-se tubos de 3 ml do meio, inoculam-se com colnias suspeitas de uma cultura pura e incubam-se a 37C durante 24 h.

Teste da produo de urease. O teste consiste em transferir uma poro do crescimento bacteriano com uma ana para o meio contendo uria, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho fenol Preparam-se 100 ml de ureia Agar base (Difco) que so esterilizados por filtrao e adiciona-se a uma soluo temperada, de 15 g de Bacto Agar (Difco) em 900 ml, previamente esterilizada em autoclave, distribuindo-se depois, em tubos. Utilizao do citrato como nica fonte de carbono Distribui-se o meio Simmons Citrate Agar, Difco em tubos e deixa-se arrefecer. O teste feito semeando-se a bactria em meio slido inclinado de citrato de Simmons (Simmons Citrate Agar, Difco) e incuba-se durante 24 h a 37C.

AP120E (bioMrieux) Mtodos de colheita, sementeira e isolamento Depois de descongeladas as 27 amostras foram maceradas, cerca de aproximadamente 0,5 g de um fragmento de salsicha e colocadas em sacos de transporte com soluo salina estril, e depois homogeneizadas no Stomaker durante um minuto. A partir de cada uma das suspenses semeou-se uma pequena poro nos meios adequados para o isolamento de E. coli. Isolamento e Identificao de E. coli Distribui-se homogeneamente 0,3 ml da suspenso da amostra em soluo salina sobre placas de Agar Levine sem suplemento de antibiticos. Incubaram-se as placas a 37C durante 24 h. Aps crescimento a incubao, e observa-se repicou-se o uma bacteriano

colnia com forma redonda, colorao negra e

brilho metlico esverdeado, com caractersticas idnticas E. coli e semeou-se em meio Agar BHI, que se identificou posteriormente atravs de testes bioqumicos: indol, vermelho de metilo, TSI, ureia e citrato. As estirpes indol e vermelho de metilo positivas, ureia e citrato negativas, e de glucose e frutose fermentativas com produo de gs, so identificadas como E. coli. Para o isolamento de culturas puras semeou-se por esgotamento em meio slido. Posteriormente leva-se a ansa ao rubro, verificando-se antes de colocar a ansa na zona semeada, se est suficientemente arrefecida (pode tocar-se num bordo da placa). De seguida fazem-se 3 ou 4 estrias paralelas com a ansa, a partir da zona do inculo. Repetir as estrias repetidas anteriormente, tendo o cuidado de rodar a placa. Levar ao rubro novamente a ansa, arrefecendo em cada passo. Colocar as placas invertidas na estufa, tendo o cuidado de as identificar previamente. Para a purificao da coluna inicial, se necessrio, devera repetir-se o processo partindo apenas de uma colnia suspeita perfeitamente isolada.

O c o n t r o l e micro b i o l g i c o na i n d s t r i a l c t ea assumeimportnciaaindamaiordevido o c o r r n c i a de um n m e r o c a d a vez m a is s i g n i f i c a t i v o d e s u r t o s d e t o x i n f e c a o a l i m e n t ar q u e , c o m f r e q n c i a , e s t o a s s o c i a d o s ao c o n s u m o de l e i t e e d e r i v a d o s ( C a m a r g o , 1996). O l e i t e , p o r s e r um p r o d u t o de o r i g e m a n i m a l , p o de v e i c u l a r v r i o s a g e n t e s p o t e n c i a l m e n te z o o n l i c o s . a l m d e ser um a l i m e n t o m u i t o r i co em s u a c o m p o s i o n u t r i c i o n a l , o q u e f a v o r e c e o c r e s c i m e n t o m i c r o b i a n o. O m o n i t o r a m e n t o m i c r o b i o l g i c o em a m o s t r as de l e i t e e o u t r o s a l i m e n t o s , r e a l i z a d o a t r a v s d a p e s q u i s a d e m i c r o r g a n i s m o s c h a m a d os i n d i c a d o r e s , q u e , q u a n d o p r e s e n t e s n o a l i m e n t o, p o d e m f o r n e c e r i n f o r m a e s s o b r e a s c o n d i es s a n i t r i a s d u r a n t e o p r o c e s s a m e n t o , p r o d u o ou armazenamento,possvelpresenadepatgenos, d e t e r i o r a o d o a l i m e n t o o u c o n t a m i n a o f e c al ( F r a n c o & L a n d g r a f , 1 9 9 6 ) . Na m i c r o b i o l o g ia l c t e a , s o d e g r a n d e i m p o r t n c i a c o mo i n d i c a d o r e s , o s m i c r o r g a n i s m o s a e r b i o s m e s f i l os ( M A M ) e o g r u p o d o s c o l i f o r m e s. M i c r o r g a n i s m o s a e r b i o s m e s f i l o s s o t o d os a q u e l e s c a p a z e s d e c r e s c e r e m t e m p e r a t u r a de 3 5 - 3 7 C e m c o n d i e s d e a e r o b i o s e . Esses m i c r o r g a n i s m o s i n d i c am a q u a l i d a d e s a n i t r i a c o m q u e o a l i m e n t o foi o b t i d o ou p r o c e s s a d o . Um n m e r o e l e v a d o d e s t e s m i c r o r g a n i s m o s i n d i c a q ue o a l i m e n t o i n s a l u b r e , m e s m o q u e p a t g e n os estejamausentes.Noentanto,deve-seconsiderar q u e t o d a s a s b a c t r i a s p a t o g n i c a s d e o r i g em a l i m e n t a r s o m e s f i l a s . e p o r t a n t o , u m a a l ta contagemdemesfilospodesignificarquehouve c o n d i e s p a r a o c r e s c i m e n t o de p a t g e n os ( F r a n c o & L a n d g r a f , 1 9 3 6 ). O g r u p o d o s c o l i f o r m e s t o t a i s o p r i n c i p al i n d i c a d o r u t i l i z a d o p a r a a v a l i a r a q u a l i d a de m i c r o b i o l g i c a da g u a e a l i m e n t o s ( C o v e r t e t a l . , 1 9 8 9 ; Matner e t a l . , 1 9 9 0 ) . s e n d o a p r e s e n a de m e m b r o s d e s s e g r u p o , i n d i c a t i v a d e t r a t a m e n to i n a d e q u a d o o u c o n t a m i n a o p s - d e s i n f e o . F a z em p a r t e d e s t e g r u p o , p r e d o m i n a n t e m e n t e , b a c t r i as p e r t e n c e n t e s a o s g n e r o s Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Kiebsialla, que t m a c a p a c i d a d e de f e r m e n t a r a l a c t o s e p r o d u z i n d o c i d o e g s q u a n do i n c u b a d a s a 3 5 - 3 7 C ( F r a n c o & L a n d g r a f , 1 9 9 6 ).