ESPECTROFOTOMETRIACROMATOGRAFIAELETROFORESE

MÉTODOS BIOFÍSICOS DE SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES DE UMA SOLUÇÃO BIOLÓGICA

• As soluções biológicas, além da água (solvente), possuem um número enorme de componentes (íons, pequenas moléculas, glicose, uréia, creatinina, colesterol, lipídios complexos...). • Estudar a composição quantitativa e

qualitativa desses sistemas é indispensável. Os métodos biofísicos permitem separar e identificar esses componentes.

1- ESPECTROFOTOMETRIA

•POR MEIO DA ESPECTROFOTOMETRIA,

COMPONENTES DESCONHECIDOS DE UMA SOLUÇÃO PODEM SER

IDENTIFICADOS POR SEUS ESPECTROS DE COR

• É o método óptico mais usado nas investigações biológicas e físico-químicas. •Método colorimétrico que permite

detectar a concentração de compostos presentes em uma solução.• A energia utilizada é a luminosa – se baseia

na absorção da luz pelo composto a ser medido• Por meio da espectrofotometria,

componentes desconhecidos de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos

O olho humano percebe cores entre as faixas de 400 a 750 nm

ABSORÇÃO DA LUZ• A luz é uma forma de radiação eletromagnética

que possui características de onda e de partícula (fóton)• A interação da luz com a matéria depende da

estrutura química dos compostos• Compostos corados – cromóforo• Reagente cromogênico• A reação entre o composto cromóforo e o

reagente cromogênico origina um produto colorido – quanto mais concentrado – maior quantidade de luz ele absorve

A espectrofotometria consiste em:• Usar o espectro radiante (luz) para inspecionar

sistemas biológicos, principalmente soluções.• Um feixe de energia atravessa a solução e a sua

absorção oferece informações sobre a qualidade e quantidade dos Componentes do sistema

• Luz Monocromática:

• É a luz utilizada em experiências e em medidas espectrofotométricas• É aquela de um único comprimento de onda

Método de espectrofotometria• De absorção-É o processo fundamental-Passagem de um feixe de luz pela solução e mede-se sua absorção Aparelho utilizado é o espectrofotômetro que deve produzir a luz MC e medir a luz absorvida pelas soluções.

Curva de absorção espectral permite:

• Identificar substâncias - são uma “impressão digital”• Identificar grupamentos químicos • Identificar a pureza de substâncias - quando a curva

se afasta do esperado• Identificar os comprimentos de onda para dosagem

da substância - escolher comprimento de onda que seja especificamente absorvido por aquela substância

Determinação da concentração da substância

• É um dos métodos mais sensíveis e precisos • Quanto mais choques entre o feixe de energia e

a matéria absorvente, mais energia é absorvida. É dependente de 2 fatores:• Trajeto óptico• Concentração • Quando a concentração da substância é

constante, a absorção depende do comprimento do trajeto óptico. E quando o trajeto óptico é constante, a absorção dependerá da concentração

2 - CROMATOGRAFIA•Método de separação e identificação de

componentes dos sistemas biológicos (misturas) que consiste em movimentar o sistema, em condições apropriadas e separar espacialmente os componentes: a cada componente uma posição no trajeto.

• As substâncias vão se movimentar pelo sistema em velocidades diferentes e se separarem

• Ocorre pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel.• Esses sistemas podem ser: sólido –líquido ou

sólido-gás

• A fase líquida é a móvel , solvente • A fase sólida é a fixa, suporte ou matriz

• Analito: substância a ser analisada após separação

• A cromatografia é um dos métodos de análise que tem grande utilização devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas • É uma técnica que separa os componentes por diferença de

peso molecular, carga iônica e afinidade.• A cromatografia pode ser feita de vários modos, os mais

comuns são: em colunas e em placas

Métodos cromatográficos

Cromatografia de adsorção• Adsorção é a adesão física ou ligação de íons e moléculas

na superfície de uma outra molécula.

• Cromatografia em Camada Delgada • Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas)• As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV,

vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc.

Aplicabilidade na indústria farmacêutica

• Controle de qualidade de ativos e formas farmacêuticas:• Determinação da porcentagem do princípio ativo,

Quantificação das impurezas de um produto,• Determinação da composição ou formulação de um produto• Estudo de estabilidade e degradação de um produto

Vantagens:

• Alta precisão, curto espaço de tempo (1 a 20 minutos)- Métodos mais utilizados:• Cromatografia líquida (água, metanol, acetonitrila...)• Cromatografia gasosa (He, N2...)

3- ELETROFORESE

• É a separação de componentes de um sistema através da aplicação de um campo eletromagnético• Permite a separação de frações de moléculas

orgânicas como RNA, DNA, proteínas e enzimas• O princípio básico consiste na migração de

substâncias de acordo com suas cargas elétricas:- Componentes de carga negativa migrarão para o polo positivo- Componentes de carga positiva migrarão para o polo negativo

•Deve-se levar em conta , além das cargas elétricas o peso molecular das partículas a serem separadas:

•Quanto maior o peso molecular, mais lenta será a migração da partícula pelo gel e menor será a distância percorrida por ela

Fatores que condicionam a migração eletroforética

• A velocidade de migração das partículas vai depender dos seguintes fatores:• Força do campo aplicado• Carga, tamanho e forma das moléculas• Viscosidade , pH e temperatura do meio• A voltagem aplicada ao sistema deve ser adequada:• Deve ser o mais rápido possível, para evitar que os

componentes se difundam e se espalhem no sistema• Não pode ser muito alta, pois superaquece o

sistema, prejudicando a separação dos componentes

Métodos de eletroforese

EM GEL: - O mais usado é a poliacrilamida• Filtração pelos poros do gel (separa por tamanho

da molécula), além da separação por cargas• EM GEL DE POLIACRILAMIDA COM SDS:Proteínas são tratadas com sódio-Duodecil-Sulfato para igualar suas cargas (negativas) Serão separadas pelo peso molecular As mais leves chegarão primeiro ao polo positivo

Aplicabilidade prática• Estudo clínico do plasma:- Separação de proteínas no plasma ou no soro (mostra alterações peculiares de algumas patologias)• Há um elevado número de proteínas identificadas

no soro, que diferem entre si estruturalmente e participam em vários processos fisiológicos.

- A análise das proporções de suas frações tem considerável valor na abordagem de desordens agudas e crônicas, fornecendo informações clinicamente úteis.

Análise de DNA – teste de paternidade

• Gel de agarose ou poliacrilamida

• Em placa vertical

• A amostra colhida é trabalhada para que haja fragmentação das tiras de DNA

• As amostras são misturadas a um corante (bromofenol) leitura luz UV