Estratégias de classificação e identificação de bactérias: clássicas, genéticas e moleculares

Suporte clínico e assesoramento

Visão do microbiologista

Diagnose laboratorial da infecção

Agentes antimicrobianos Infecções novas ou resistentes

Tomada de decisões

Gestão do paciente

Isolamento de patógenosSangue– Bacteremia. Presença de bactérias no sangue. – Septicemia. Organismo virulento entrando de uma

foco infeccioso para o sangue até outros tecidos causando novas infecções.

– 10 ml ascepticamente em culturas aerobias/anaerobias

- Pode estar contaminado com bactérias da pele como Staphylococcus epidermidis .

Culturas de urina

• Comuns em hospitais.• Titulos de 105 organismos/ml• Avaliação microscópica• Nitrito. Bacteria entérica nitrato-nitrito

Culturas fecais

• pH cai rapidamente, vial contendo tampão fosfato para transporte.

• pH ácido inibe crescimento de Shigella e Salmonella.

• Crescimento de amostras em vários meios

Feridas e abcesos

• Cotonete ou siringa depois de limpar a superficie com alcool 70%.

• Feridas purulentas:

• S aureus, bactérias entéricas, P. Aeruginosa, Bactérias anaeróbicas: Bacteroides e Clostridium. Transporte anaeróbico

Espécimens genitais

• Descarga da urétra purulenta: gonorrea

• Transmitido por contato pessoal

• Resistente naturalmente a vancomicina, nistatina, colistina

• Gram negativa-gonococo

Métodos convencionais

Método convencional

• Depende da habilidade para cultivar– Treponema pallidum (sífilis, bactéria

anaeróbica)• Lento, especialmente para espécies

fastidiosas Mycobacterium spp.• Nem sempre definitivo

• A maioria das amostras clínicas são crescidas primeiro em meio enriquecido de uso geral como agar sangue, que suporta crescimento da maioria dos organismos aerobios e anaerobios facultativos, gram + e gramm -.

• Meio de enriquecimento, Uso de meio seletivo e condições de incubação necessárias para isolar o microorganismo de amostras. É uma parte importante da microbiologia clínica.

-Ágar Sangue: meio utilizado para a maioria dos materiais clínicos. Permite o crescimento de grande partedos patógenos não fastidiosos ou que requerem incubação especial. Devido a adição de sangue de carneiro desfribinado proporciona a leitura das hemólises causadas pelo genêro Streptococcus spp.

• O BD Hektoen Enteric Agar (agar entérico de Hektoen) é um meio para diferenciação moderadamente selectivo utilizado para o isolamento e diferenciação de microorganismos entéricos gram-negativos provenientes de amostras clínicas e não-clínicas. É um meio particularmente importante para o isolamento de espécies de Shigella e Salmonella.

Agar chocolate. Adição de sangue, mas só é adicionado qd a temperatura é de 80ºC (ocorre lise dos eritrócitos) microrg exigentes c/o o Género Neisseria.

• Tabela 24.1 mostra meios enriquecidos e meios seletivos para os isolamento de patógenos.

• Meio diferencial. São meios especializados que permitem a identificação de organismos baseado no seu crescimento e apariência no meio.

• Microbiologistas experientes podem fazer a tentativa de identificar um isolado clínico observando a cor e morfología das colonias do patógeno suspeito crescido em vários meios como descrito na tabela as described in Table 24.2.

Métodos de identificação dependentes do crescimento

• São métodos tradicionais para identificar patógenos observando as mudanças metabólicas induzidas pelo crescimentol. São rápidas e certeras.

Diagnóstico mudança de corSistema desenhado para testes da familia Enterobacteriaceae

• Table 24.3 gives important clinical diagnostic tests for bacteria.

Susceptibilidade a antimicrobianos

• Drogas antimicrobianas são usada amplamente

• Patógenos devem ser testados para a susceptibilidade a antibióticos individual para garantir a quimioterapia adequada. Esta abordagem rigorosa ao tratamento antimicrobiano é normalmente aplicada somente em ambientes de cuidados a saúde.

• O procedimento padrão que avalia a atividade antimicrobiana é chamado de método de Kirby–Bauer (Figure 24.8).

• Antibiogramas são reportes periodicos para indicar a susceptibilidade de organismos isolados a antibioticos usados no local.

Fitas com um gradiente de concentração de antibiótico

Segurança no laboratório de microbiologia.

• Requer treinamento específico, planejamento e cuidado para prevenir infecção dos trabalhadores do laboratório com os patógenos.

• Materiais como culturas vivas, meios de cultura inoculados, usado agulhas hipodérmicas, e amostras de pacientes requerem precauções específicas para o manuseio seguro.

Métodos de Diagnóstico de Doenças InfecciosasImunologia Clínica e

Imunoensaios

•A resposta imune é um resultado natural da infecção. Os principais aspectos da imunidade estão resumidos na Figura 24,10.

• Respostas imunes específicas, em especial os títulos de anticorpos e testes cutâneos, podem ser monitorados para fornecer informações sobre infecções passadas, actuais infecções, e convalescença (Figura 24.11).

• Testes comuns de imunodiagnóstico de patógenos são apresentados na Tabela 24.5.

Anticorpos monoclonais e policlonais

• são usados para pesquisa e aplicações clínicas.

• Table 24.6 shows characteristics of monoclonal and polyclonal antibody production.

Reações in vitro antígeno-anicorpo: Serologia

• O estudo de reações antígeno-anticorpo in vitro são chamadas serologia.

• Reações antígeno-anticorpo requerem que o anticorpo se ligue ao antígeno. Tipos de reações: Table 24.7.

• Specifiidade (Table 24.8) and sensbilidade definem a precisão dos testes sorológicos individuais

• Reações de Neutralização (Figure 24.13) e precipitação (Figure 24.14) são alguns exemplos de testes de ligação de antígenos que produzem resultados visíveis envolvendo interações antígeno-anticorpo.

Agglutination

• testes de aglutinação direta são amplamente utilizados para determinação dos tipos sanguíneos (Figura 24.15).

• Uma série de testes de aglutinação passiva estão disponíveis para a identificação de uma variedade de agentes patogênicos e produtos relacionados com o patógeno. Os testes de soroaglutinação são rápidos, relativamente sensíveis, altamente específicos, de simples execução e de baixo custo. •Pérolas de latex-Proteína A liga Staphylococcus aureus•Nisseria gonorrheae, haemophilus influenzae , C neoformans, C. albicans

Anticorpos Fluorescentes

• anticorpos fluorescentes são usadas para a identificação rápida e precisa de patógenos e outras substâncias antigênicas de amostras de tecido e outros ambientes complexos. •Ex. Bacillus anthracis- antrax pode ser usado para diagnóstico com microscópio fluorescente (esporos mandados por correio)

• Fluorescent antibody-based methods (Figure 24.18) can be used for identification, quantitative enumeration, and sorting of a variety of cell types.

Immunoblot Procedures

• Immunoblot (Western blot) procedures (Figure 24.27) are used to detect antibodies to specific antigens or to detect the presence of the antigens themselves.

1, soro controle positivo HIV2, soro controle negativo (sadio)3, soro paciente positivo forte4, soro paciente positivo fraco5, branco

Diagnóstico molecular

• Nucleic acid hybridization is a powerful laboratory tool used to identify microorganisms (Figure 24.28).

• Para criar uma sonda de ácido nucléico, uma determinada seqüência de ácido nucléico para o microorganismo de interesse deve estar disponível • Talvez o uso mais difundido da tecnologia é baseado na aplicação de amplificação gênica (PCR). Vários métodos baseados em DNA são actualmente utilizados em clínicas, laboratórios de alimentos, e em pesquisa.

• Table 24.9 lists pathogens identified with nucleic acid probe and PCR methods.

Sequenciamento de rRNA• Maior avanço para classificar organismos• Diferenças na sequencia de nucleotídeos é usada

para classificar procariontes. • 16S rRNA• 23S rRNA

Actually look at the DNA thatcodes for the rRNA

How is this accomplished?Extract DNA from a colony, or froman environmental sample without growing the organism.

PCR with primers forrRNA sequences

Automated DNAsequencer

Coefficient of Similarity

Bacteria phylogenetic relationships based on rRNA sequences