ESTUDIO MICROBIOLÓGICO, MOLECULAR Y ACCIONES DE …

ESTUDIO MICROBIOLÓGICO, MOLECULAR Y ACCIONES DE VIRULENCIA DE MICROORGANISMOS CARIOGÉNICOS: PROTOCOLOS PRÁCTICOS DE

LABORATORIO

GIOMAR ANDREA SANCHEZ MARTÍNEZ

PONTIFIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

BOGOTÁ

JULIO 11 DE 2008


LABORATORIO


Trabajo de grado presentado como requisito parcial Para optar al titulo de BACTERIOLOGÍA

Dr. FREDY GAMBOA JAMES

Bacteriologo, Ms.C., Ph.D.

PONTIFIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

BOGOTÁ

JULIO 11 DE 2008


LABORATORIO


APROBADO

NOTA DE ADVERTENCIA

Articulo 23 de la Resolucion N° 13 de Julio de 1946

�La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por

sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique

nada contrario al dogma y a la moral catolica y por que las tesis no

contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea

en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia�.

DEDICATORIA

Es maravilloso poder alcanzar la meta anhelada por cada ser humano, y

dejar una huella de conocimiento y esfuerzo en la formación profesional

que hemos logrado en nuestra estadía por la universidad; es importante

saber que nuestro conocimiento será utilizado por aquellos futuros

bacteriólogos que emprenden un nuevo camino en el área de la salud

para el servicio de la comunidad y en la adquisición de nuevos

conocimientos.

Es grato dar el reconocimiento a aquellas personas que aportaron parte

de esfuerzo para formarnos y que lucharos junto a nosotros por alcanzar

nuestras metas, sin dejarnos desfallecer en ningún momento. Gracias a

sus deseos de enseñanza y mejoramiento nos inculcaron las ganas de

seguir luchando y mejorando día a día un país que necesita de personas

humanitarias que se sensibilicen por el bienestar de otro y al mismo

tiempo saber que nuestra ayuda puede ser crucial en la vida de una

persona.

Por eso, de todo corazón dedicamos este triunfo obtenido:

A Dios, por darnos la oportunidad de luchar en una causa justa a favor de

la humanidad, por guiarnos en todo momento y permitir formarnos como

profesionales humanitarios sin desconocer el origen de nuestra vida y el

objetivo de ser Bacteriólogos.

A mi familia, por su esfuerzo y apoyo incondicional, por tolerar aquellos

momentos de abandono y preocupación al responder por nuestros

objetivos propuestos desde el momento que ingresamos a ser parte de la

Comunidad Javeriana. Dios los bendiga por existir y ser parte de nuestra

vida, formación personal y profesional.

A mi compañero Arley Leonardo Sánchez Candía por su apoyo

emocional, por no dejarme desfallecer en ningún momento y por guiarme

en los momentos de adversidad. Orientarme en el rumbo de mi vida

profesional y nunca permitirme olvidar el sentido de mi profesión y el

motivo por el que decidí convertirme en Bacterióloga al servicio de la

comunidad, nunca lo olvidare.

A mis maestros de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad

Javeriana, por ayudarnos y orientarnos en las etapas criticas de nuestro

nuevo conocimiento; por servirnos de apoyo, de amigos en los tiempos

difíciles y nos facilitaron encontrar el mundo de sabiduría a través del

conocimiento para encontrar lo nuevo e innovador de esta vida que en

este momento comenzamos.

AGRADECIMIENTOS

• Agradecemos a Dios por darnos la oportunidad de llevar a cabo el

Trabajo de grado, y continuar con nuestra formación educativa que

nos permitirá ser excelentes profesionales sin olvidar el concepto de

humanidad en el momento de ejercer la profesión de Bacteriólogos.

• A nuestras familias por su apoyo moral, emocional y económico,

además por ser el principal motor de motivación para terminar

nuestros estudios.

• A la Pontificia Universidad Javeriana, por brindarnos la oportunidad de

realizar nuestros estudios en Bacteriología

• A nuestro Director Fredy Gamboa James , docente de la Facultad de

Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, por brindarme la

oportunidad de trabajar con el, y poder descubrir áreas de

conocimiento en las que los Bacteriólogos se pueden desempeñar

profesionalmente, por la asesoría adecuada y orientarme en el

desarrollo de nuestro trabajo de grado, ya que sin su ayuda no

hubiese sido posible la culminación de este trabajo y la satisfacción de

saber que este documento servirá de guía para nuevos pupilos en el

área de la salud.

• A mi compañero Arley Leonardo Sánchez Candía por su apoyo

emocional, por no dejarme desfallecer en ningún momento y por

guiarme en los momentos de adversidad que tuve en todo el desarrollo

profesional. Te doy gracias por ser la persona que en todo momento

tubo fe en mi; y aunque no todo me salía bien siempre existía una

frase de consuelo y apoyo �No te preocupes, se que tú vas a salir

adelante, no desfallezcas ni te des por vencida�.

TABLA DE CONTENIDO

pág.

INTRODUCCIÓN 1

FORMULACION DEL PROBLEMA 3

JUSTIFICACIÓN 6

OBJETIVOS 7

MATERIALES Y METODOS 8

1. CAPITULO 1 ECOLOGÍA MICROBIANA ORAL 11

1.1 FLORA NORMAL DEL CUERPO 12

1.1.1 Microbiologia de la nariz y nasofaringe 13

1.1.2 Microbiologia del tracto digestivo 13

1.1.3 Microbiologia de la cavidad oral 14

1.1.4 Microbiologia de la saliva, placa subgingival, placa supragingival 14

1.2 ESTRUCTURA Y COMPOSICION DE LA CAVIDAD BUCAL 16

1.2.1 Mucosa 17

1.2.2 Encía 17

1.2.3 Ligamento periodontal 18

1.2.4 Cemento radicular 11

1.2.5 Proceso de formacion alveolar 19

1.2.6 Dentina 21

1.2.7 Esmalte 21

1.3 RESPUESTA INMUNE Y DETERMINANTES ECOLOGICOS ORALES 21

1.3.1 Respuesta inmunologica 22

1.3.2 Factores protectores del huesped 24

1.3.3 Factores fisicoquimicos de la cavidad oral 25

1.3.4 Factores de adhesion, agregacion y coagregacion bacteriana 26

1.3.5 Factores nutricionales 28

2. CAPITULO 2 BIOPELICULA Y PLACA DENTAL 32

2.1 DEFINICION DE BIOPELÍCULA 32

2.2 CARACTERISTICAS BIOLÓGICAS Y COMUNICACIÓN EN LAS

BIOPELÍCULAS 33

2.3 PROCESO DE COLONIZACION E INFECCIONES EN LAS QUE ESTAN

INVOLUCRADAS LAS BIOPELICULAS 35

2.4 ETAPAS EN EL PROCESO DE FORMACION DE BIOPELÍCULAS 38

2.4.1 Primera etapa, colonización o adherencia 38

2.4.2 Segunda etapa, agrupamiento, crecimiento y formacion de la matriz

extracelular 39

2.4.3 Tercera etapa, crecimiento de la matriz 39

2.5 RESISTENCIA DE LAS CELULAS MICROBIANAS DE LA PELICULA 41

2.6 LA PLACA DENTAL 41

2.6.1 Formación de la placa dental 42

2.6.2 Colonizacion primaria 43

2.6.3 Colonizacion secundaria 43

2.6.4 Placa madura 44

2.6.6 Fase de mineralizacion 44

2.7 RESPUESTA INMUNE CONTRA LA PLACA DENTAL 45

3. CAPITULO 3 MICROORGANISMOS IMPORTANTES EN LA CARIES

DENTAL 50

3.1 CARIES DENTAL 51

3.1.1 Factores de riesgo 51

3.2 GENERO STREPTOCOCCUS 52

3.2.1 Grupo streptococo viridans 54

3.2.2 Grupo Mutans 55

3.2.3 Grupo oralis 62

3.3 BACTERIAS ANAEROBIAS FACULTATIVAS DE INTERES EN LA

CAVIDAD ORAL 64

3.3.1 Genero Lactobacillus 64

3.3.2 Genero Actinomyces 67

4. CAPITULO 4 FACTORES DE VIRULENCIA DE MICROORGANISMOS

CARIOGENICOS 75

4.1 FACTORES DE VIRULENCIA 75

4.2 Acidofilo 76

4.2 Acidogenico 76

4.3 Acidurico 76

4.4 Produccion de polisacaridos extracelulares 76

4.5 Produccion de polisacaridos intracelulares 77

4.6 Sintesis de glucanos y fructanos 77

4.7 Proteinas de adhesión celular 77

4.8 Glucosil transferasa 77

4.9 Produccion de dextranasa 78

5. CAPITULO 5 TOMA DE MUESTRA Y MEDIOS DE CULTIVO 80

5.1 TOMA DE MUESTRA DE LA CAVIDAD ORAL 81

5.2 AGAR COLUMBIA 82

5.2.1 Composicion del medio 82

5.2.2 Preparación 82

5.2.3 Control de calidad 82

5.3 AGAR ESTREPTOCOCOS (KF) 83


5.3.2 Preparacion 83


5.4 AGAR EXTRACTO DE LEVADURA 85




5.5 AGAR GELATINA NUTRITIVA 85


5.5.2 Procedimiento 86



5.6 AGAR MAN-ROGOSA-SHARPE 87





5.7 AGAR MUELLER-HINTON 88





5.8 AGAR ROGOSA 90

5.8.1 Componentes del medio 90




5.9 AGAR SANGRE 91

5.9.1 Composición del medio 91




5.10 AGAR SANGRE AZIDA 92





5.11 AGAR TIPTCASA SOJA 93


5.11.2 Procedmiento 94



5.12 CALDO TODD HEWITT 94

5.12.1 Composion del medio 94




5.13 INFUSIÓN CEREBRO CORAZON 95




5.14 MEDIO CISTINA TRIPTOSA 96



5.15 MEDIO ROJO DE METILO Y VOGES POSKAUER 97





6. CAPITULO 6 DESCRIPCION DE PRUEBAS BIOQUIMICAS Y SISTEMAS DE

ANEROBIOSIS 101

6.1 PRUEBA DE CATALASA 101

6.1.2 Reactivo 101


6.1.4 Interpretacion 102


6.2 PRUEBA DE OXIDASA 102

6.2.1 Reactivos 102




6.3 PRUEBA DE BACITRACINA 103





6.4 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE BIBLIS Y ESCULINA 104





6.5 PRUEBAS DE FERMENTACION DE HIDRATOS DE CARBONO 106





6.6 PRUEBA DE DESCARBOXILASA 107





6.7 PRUEBA DE UREASA 108





6.8 PRUEBA DE TSI (TRIPLE AZUCAR HIERRO) 109





6.9 PRUEBA DE INDOL 111


6.9.2 Reactivo de Kovacs 111




6.10 PRUEBA DE NITRATOS 112



6.10.3 Reactivos 112



6.11 PRUEBA DE OXIDACION Y FERMENTACION 113





6.12 PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS 114





6.13 PRUEBA DE LICUEFACCION DE LA GELATINA 115





6.14 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE PIRROLIDONIL- β-NAFTILAMIDA 116





6.15 PRUEBA DE MOVILIDAD 117




6.16 PATRON DE MC FARLAND 117



6.17 PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL 118





6.18 SISTEMAS DE ANAEROBIOSIS 119

7. CAPITULO 7 SISTEMAS COMERCIALES UTILIZADOS EN LA

IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS CARIOGENICOS 122

7.1 TASA DE SECRECION DE SALIVA 123

7.1.1 Procedimeinto 123

7.1.2 Resultados 123

7.2 CAPACIDAD TAMPON DE LA SALIVA 124



7.3 RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN SALIVA 125




7.4 SISTEMA API 20E 127

7.5 SISTEMA API RAPID 20E 127

7.6 SISTEMA API RAPID ID 32 STREPT. 127

8. CAPITULO 8 TECNICAS SEROLOGICAS Y MOLECULARES 129

8.1 TECNICAS SEROLOGICAS 129

8.1.1 Inmunofluorescencia directa 129

8.1.2 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) 130

8.2 TECNICAS BASADAS EN BIOLOGIA MOLECULAR 132

8.2.1 Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) 132

8.2.2 PCR cebadores arbitrarios(AP) 133

8.2.3 PCR con enzimas de restriccion (RFLP) 134

8.2.4 PCR amplificación del DNA polimórfico (RAPDs) 134

8.2.5 PCR en longitud de fragmentos amplificacion en polimorfismos (AFLP) 134

9. CAPITULO 9 VIABILIDAD Y PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS 136

9.1 MÉTODOS DE PRESERVACIÓN A TÉRMINO CORTO 137

9.1.1 Subcultivo 137

9.1.2 Medio de cultivo adecuado 138

9.1.3 Condiciones de almacenamiento 138

9.1.4 Frecuencia de transferencia 138

9.1.5 Inmersión en aceite mineral 139

9.1.6 Desecacion 139

9.1.7 Congelacion comun 141

9.2 METODOS DE PRESERVACION A TERMINO LARGO 142

9.2.1 Liofilización 142

9.2.2 Ultracongelación 144

9.3 CONGELAMIENTO EN MICROTUBOS DE SERINA 146

CONCLUSIONES 148

ANEXOS 149

INDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1.1 Microorganismos que hacen parte de la flora normal del cuerpo

humano 13

Figura 1.2 Componentes que hacen parte del diente 18

Figura 2.1 Pelicula de Enterococcus faecalis 37

Figura 2.2 Proceso de formación de una biopelícula 40

Figura 2.3 Corte transversal de cateter intravascular 41

Figura 2.4 Proceso de formacion de la placa dental. 44

Figura 3.1 Proceso de formacion de la caries dental 53

Figura 3.2. Ruta Embden- Meyerhof - Parnas utilizada por los Estreptococos 58

Figura 3.3 Sistema fosfoenolpiruvato fosfotransferasa. 59

Figura 3.4 Esquema de identificacion del grupo Streptococo viridans 64

Figura 3.5 Clasificación de Lactobacillus 66

Figura 3.6 Esquema de identificacion de especie de Actinomyces 70

Figura 3.7 Esquema de identificación para microorganismos cariogénicos 71

Figura 7.1 Procedimiento de la tasa de secrecion salival 123

Figura 7.2 Procedimiento de la prueba para evaluar la capacidad de tampon 124

Figura 7.3 Procedimiento de recoleccion y procesamiento de saliva 125

Figura 7.4 Observacion en medio de cultivo 126

Figura 7.5 Sistema API 20E 127 Figura 8.1 ELISA indirecto 131

Figura 8.2 ELISA tipo Sandwich 131

Figura 8.3 Proceso de la reaccion en cadena de la polimerasa 133

Figura 8.4 Ciclos de la Reaccion en cadena de la polimerasa 133

INDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla 1.1 Microorganismos que se encuentran en saliva, placa supragingival

y subgingival. 17

Tabla 2.1 Susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos plantonicos y

sesiles. 35

Tabla 2.2 Microorganismos involucrados en en procesos de infeccion y

colonizacion de materiales sinteticos. 39

Tabla 2.3. Composicion microbiana en la formacion de placa dental 45

Tabla 2.4. Teorías de mineralización de la placa dental 46

Tabla 3.1 Microorganismos relacionados con caries dental 52

Tabla 3.2 Caracteristica de diferenciacion entre genero 54

Tabla 3.3 Clasificacion del grupo de Streptococcus mutans 56

Tabla 3.4 Clasificación de especies de Lactobacillus 68

Tabla 3.5 Clasificacion de especies del genero de Actinomyces 69

Tabla 6.1 Realizacion del patron de McFarland 122

Tabla 7.1 Resultados del flujo salival 124

Tabla 7.2 Resultados de la capacidad de tampon de la saliva 125

Tabla 7.3 Recuento de S. mutans y genero Lactobacillus 126

27

ANEXOS

Pág.

Anexo 1 Reaccion de la prueba de oxidasa. 150

Anexo 2 Hidrólisis de bilis y esculina 150

Anexo 3 Reaccion de descarboxilacion de Lisina 150

Anexo 4 Reaccion de descarboxilacion de Ornitina 151

Anexo 5 Reaccion de descarboxilacion de Arginina 151

Anexo 6 Reaccion quimica de la prueba de ureasa 151

Anexo 7 Reaccion de la prueba de TSI 152

Anexo 8 Reaccion quimica de la prueba de indol. 152

Anexo 9 Reaccion de nitratos. 152

Anexo 10 Reaccion de la prueba de licuefaccion en gelatina 153

Anexo 11 Reaccion de la prueba de hidrólisis de pirrolidonil- β-naftilamida 153

28

INTRODUCCIÓN

En el ecosistema de la cavidad bucal existen más de 600 especies microbianas

en constante interrelación y dinamismo. En esta acción las especies microbianas

en continuo anabolismo y catabolismo, tomando nutrientes y aportando

productos de su metabolismo al ambiente bucal, pueden producir equilibrio o

desequilibrio microbiológico. Ecológicamente, la caries dental es considerada

consecuencia de un desequilibrio en el ecosistema oral que lleva al predominio

de una flora, antes considerada normal en cavidad oral y ahora convertida en

patógena.

La cavidad oral se considera un microambiente propicio para que se presente la

colonización de microorganismos como Streptococcus mutans, especies de

Actinomyces, especies de Lactobacillus, entre otros, que son capaces de

sobrevivir a los diferentes mecanismos de protección que posee la boca. La

saliva, uno de estos mecanismos de protección, cumple un papel importante

debido a que regula el pH de la boca y mantiene el equilibrio en la microbiota

oral. Muchos de estos microorganismos tienen mecanismos de patogenicidad

que le sirven como resistencia a los diferentes mecanismos protectores de la

cavidad oral. Cuando existe una alteración en el equilibrio de la microbiota oral,

hay microorganismos capaces de establecerse y colonizar estas estructuras de

dentarias. Entre estos microorganismos encontramos a Streptococcus mutans,

especies de Actomyces, especies de Lactobacillus, etc., que llevan a cabo la

colonización primaria. Cuando se dan determinadas situaciones estos

microorganismos alteran el pH que lleva al desarrollo del proceso infeccioso.

La caries dental se define como un proceso patológico infeccioso caracterizado

por la destrucción localizada de los tejidos duros dentales. Los principales

microorganismos asociados a la producción de caries dental son en orden de

frecuencia: 1. S. mutans (principalmente el serotipo c) y en menor proporción S.

sobrinus y S. gordonii; y 2. especies de Lactobacillus y Actinomyces. El hecho de

reconocer a S. mutans como el microorganismo más importante en la iniciación

de la caries, conduce a diseñar medidas dirigidas hacia la eliminación o

29

disminución de este microorganismo en la cavidad oral. La caries dental y la

enfermedad periodontal han sido consideradas como las enfermedades de

mayor peso en la historia de la morbilidad bucal a nivel mundial y se considera

actualmente como el mayor problema de salud bucodental en el mundo,

llegando a afectar entre 60% y 90% de la población escolar y adulta. En

Colombia, la caries es la enfermedad oral de mayor prevalencia en la población

adolescente y a nivel mundial ocupa el tercer lugar como motivo de consulta

externa, después de las enfermedades cardiovasculares y respiratorias.

La Monografía se centrará en el estudio de microorganismos de gran importancia

en la caries dental. Con este fin se describirán las características microbiológicas

de estos microorganismos, sus implicaciones clínicas, factores de virulencia y

patogenicidad, medios de cultivo útiles en el aislamiento, técnicas de

identificación, procesamiento de muestras. También se hablará de ecología

microbiana oral, biopelículas y placa dental, aspectos que tienen gran

importancia en el proceso de desarrollo de la caries dental.

En un capítulo dedicado a aspectos prácticos, como aporte fundamental y

carente hasta el momento, se hará una descripción muy detallada de medios de

cultivo, pruebas bioquímicas, sistemas comerciales útiles en la identificación de

microorganismos de cavidad y técnicas y métodos moleculares, técnicas de

preservacion de microorganismos, útiles en la identificación de microorganismos

participantes en el inicio y desarrollo de caries dental.

Por esta razón se considera que las enfermedades periodontales necesitan

factores desencadenantes para que dichos microorganismos se adapten a las

condiciones del ambiente de la cavidad bucal y como consecuencia se desarrolla

como enfermedad. Para llevar a cabo la identificación de microorganismo

causante para patología se debe contar con un diagnóstico presuntivo basado

en pruebas microbiológicas que le ayuden al odontólogo a orientarlo en el

tratamiento profiláctico.

30

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

A nivel de la cavidad bucal existe una diversidad de microorganismos que viven

en forma transitoria o definitiva que tiene la capacidad de colonizar varias

estructuras dentarias hasta el punto de afectar la estabilidad bucal. Muchos de

estos microorganismos son capaces de alterar el medio bucal para empezar a

colonizar y conducir al desarrollo de enfermedades bucodentales. Por este

motivo se considera que el ambiente bucal es un medio propicio para que se

lleve a cabo este proceso, favoreciendo el crecimiento y actividad microbiana.

Dentro de la cavidad bucal, mecanismos protectores que controlan la

colonización y actividad de algunos microorganismos potencialmente nocivos.

Algunos microorganismos son capaces de vivir en presencia de estos factores; la

microflora residente normal se establece en la boca durante los primeros meses

de vida. Una vez que esto ha ocurrido, la invasión y colonización por

microorganismos extraños son impedidas por lo general por la combinación de

acciones químicas y físicas de la saliva y por el antagonismo competitivo de la

flora nativa. (2)

En las secreciones bucales se encuentran varios factores antimicrobianos dentro

de los que se encuentran lisozimas, lactoperoxidasa, lactoferrina, glicoproteínas

de alto peso molecular. La lisozima es una enzima hidrolítica que rompe el

enlace entre la N-acetilglucosamina y el ácido N- acetilmuramico; estos enlaces

se encuentran en el péptido glicano de la pared celular bacteriana. En algunas

ocasiones la lisozima puede intervenir en la lisis de las bacterias mediada por un

anticuerpo o complemento. Cuando se reduce o elimina el flujo salival, se

predisponen al rápido desarrollo de la caries; pero el deterioro de la salud bucal

puede ser extremadamente rápido y dramático. Este tipo de caries se puede

presentar en personas con escasa o sin experiencia previa de caries y de

manera característica se presenta dispersión de lesiones cervicales. Es probable

que los efectos de buffer de la saliva basados principalmente en los sistemas

amortiguadores de fosfato y bicarbonato ácido carbónico, sean de mayor

importancia en relación con caries. (1)

31

Debido al efecto patogénico que tienen los carbohidratos fermentables, la dieta

es uno de los elementos que predisponen a la caries dental y la enfermedad

periodontal, sobre todo después de una ingestión de grandes cantidades de

alimentos azucarados a intervalos irregulares durante el día. Esto se debe a que

los carbohidratos constituyen el sustrato cariogénico por excelencia, el cual es

utilizado preferentemente por los diferentes microorganismos que forman parte

de la flora oral para su metabolismo, cuyo producto final son una serie de ácidos

como el láctico que disuelven los minerales del diente. Los hidratos de carbono

ingeridos son convertidos por las bacterias en polisacáridos extracelulares

adhesivos, los cuales contribuyen a la formación de biopelículas. (4)

Para que se lleve a cabo la colonización de la placa bacteriana en la superficie

dentaria se necesita que intervengan y se lleven a cabo diferentes mecanismos;

como son la adherencia a la película adquirida (colonización primaria),

agregación interbacteriana (colonización secundaria) y multiplicación

(colonización secundaria) . Sin embargo, en general la placa supragingival es

adherente y contiene una flora predominantemente conformada por

microorganismos Gram positivos. (1)

Actualmente se conoce que los componentes salivares absorbidos sirven como

receptores para las proteínas de unión de Streptococcus mutans, mientras que

las glucosiltransferasas (Gtf) y los glucanos adsorbidos refuerzan esta

adherencia. Al llevarse a cabo las interacciones bacterianas en la película

adquirida; debe transcurrir cierto tiempo hasta que la sacarosa induzca su

aparición. Otros microorganismos que se pueden encontrar son los lactobacilos,

cuyo número es representativo en placas cariogénicas. (1)

Son muchos los factores que contribuyen a la formación de la caries dental como

los microorganismos bucales y los carbohidratos retenidos, que son las fuerzas

de ataque, la secreción salival que es una fuerza ambiental capaz de favorecer o

disminuir el proceso, el pH de la placa. (2)

A partir de la publicación de la Ley 100 de 1993 en la cual por medio del Art. 162

el Sistema General de Seguridad Social de Salud crea las condiciones de

acceso a un Plan Obligatorio de Salud para todos los habitantes del territorio

nacional antes del año 2001. Este Plan permitirá la protección integral de las

familias y enfermedad general, en las fases de promoción y fomento de la salud

32

y la prevención, diagnostico, tratamiento y rehabilitación para todas las

patologías.

Toda la población se ve afectada por este tipo de enfermedades dentales, las

cuales son prevenibles por medio de la utilización e implementación de

tratamientos profilácticos con el fin de disminuir la susceptibilidad del paciente

para que sufra de caries dental y reducir la posibilidad de que los diferentes

agentes etiológicos se puedan adherir a las estructuras dentarias con el futuro

pronostico de la perdida de estructuras dentales como tejidos de sostén (encías)

y estructuras duras (dientes).

Todo lo anterior ratifica la necesidad de elaborar un documento actualizado

teórico y con enfoque practico que permita trabajar mejor en el diagnóstico,

identificación, prevención y control de la caries dental.

33

JUSTIFICACIÓN

El análisis y recopilación de información bibliográfica relacionada con las

características microbiológicas de bacterias de importancia en caries, sus

implicaciones clínicas, factores de virulencia y patogenicidad, medios de cultivo

útiles en el aislamiento, técnicas de identificación, procesamiento de muestras,

ecología microbiana oral, biopelículas y placa dental, permitirá tener un

documento actualizado y muy útil para estudiantes o profesionales de

Bacteriología y Odontología, que trabajen o vayan a trabajar en este tópico de

las infecciones humanas.

El capítulo dedicado a aspectos prácticos, permitirá tener una descripción muy

detallada de medios de cultivo, pruebas bioquímicas, sistemas comerciales útiles

en la identificación de microorganismos de cavidad y técnicas y métodos

moleculares útiles, que ayudará y será una herramienta muy útil a la hora de

hacer la búsqueda de microorganismos cariogénicos en muestras de cavidad

oral.

34

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Elaborar una monografía actualizada que presente información de las

características microbiológicas de bacterias de importancia en caries dental, sus

implicaciones clínicas, factores de virulencia y patogenicidad, además que

contenga protocolos claros y de muy fácil asimilación que permita realizar las

técnicas necesarias para la identificación de los microorganismos de importancia

en caries dental.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Describir las características microbiológicas de bacterias de importancia en

caries dental, sus implicaciones clínicas, factores de virulencia y

patogenicidad.

• Describir el fundamento de cada una de las técnicas microbiológicas que se

utilizan para la identificación de microorganismos cariogénicos.

• Presentar con claridad el proceso que se lleva a cabo en la cavidad oral

para que se desarrolle la caries dental.

• Organizar los temas en alrededor de 9 capítulos.

35

MATERIALES Y MÉTODOS

DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

El estudio que se va ha realizar es de tipo transversal exploratorio; con la

investigación científica para suplir la necesidad de contar con un escrito

actualizado que documente información de las características microbiológicas de

bacterias de importancia en caries dental, sus implicaciones clínicas, factores de

virulencia y patogenicidad, técnicas microbiológicas y moleculares.

• Variables del Estudio: El estudio se enfocara en variables dependientes

y variables independientes; las cuales serán citadas a continuación:

1. Variables dependientes: Microorganismos cariogénicos.

2. Variables Independientes: Factores de virulencia, Medios de cultivo,

Pruebas Bioquímicas, Sistemas comerciales de identificación, Caries

dental.

MÉTODOS

� La Monografía se llevará a cabo con una investigación bibliográfica de gran

calidad científica con análisis y estudio sobre los principales microorganismos

cariogénicos, teniendo en cuenta cada una de los aspectos mencionados en

los objetivos. La revisión bibliográfica se realizara en las siguientes fuentes

bibliográficas:

1. Revista Cubana Estomatologia

2. Revista NOVA

3. Colombia medica

36

4. Universitas Scientarum

5. Universitas Odontológica

6. Oral Microbiology and Immunology

7. Microbiologia oral Liebana Ureña José, 2000

8. Microbiological Review

37

9. Revista Estomatológica Herediana

10. Revista de la Asociación Dental Mexicana

11. Canadian Journal Microbial

12. Journal of Periodontal Research

13. Journal of Bacteriology

14. Revista de Investigación y Ciencia

15. Clinical Microbiology Reviews

16. Advances in Dental Research

17. Acta Odontológica Venezolana

18. International Microbiology

19. Clinical Microbiology and Infection

20. Infection and Inmunity

21. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica

22. Journal of Medical Microbiology

23. Applied and Environmental Microbiology

24. Revista Latinoamericana de Microbiologia

� La Monografía se estructurará en alrededor de 9 capítulos que

tentativamente son:

1. Ecología microbiana oral

2. Biopelículas y placa dental

3. Microorganismos de importancia en caries dental

4. Factores de virulencia de microorganismos cariogénicos

5. Descripción de medios de cultivo

6. Descripción y fundamento de las pruebas bioquímicas

7. Sistemas comerciales utilizados en la identificación de microorganismos

de cavidad oral

8. Sistemas moleculares útiles en la identificación de microorganismos de la

cavidad oral.

9. Técnicas de preservación de microorganismos

• Para el cumplimiento de cada una de las actividades planteadas por el

cronograma, se estipula cierto tiempo para la obtención y procesamiento de

la información en la cual se llevara un control de cada una de estas

38

actividades; con el fin de conocer si se llevo a cabo esta actividad o por el

contrario no se obtuvieron los resultados adecuados.

39

CAPITULO 1

ECOLOGÍA MICROBIANA ORAL

Para definir los procesos involucrados en las patologías infecciosas orales, es

necesario entender la ecología de la cavidad oral e identificar los factores

responsables de la transición de una relación comensal a una patogénica en el

huésped. La ecología no solo estudia las interrelaciones entre los organismos y

su ambiente vivo y no vivo, sino además el papel y contribuciones de estos

organismos en la naturaleza y en los ciclos biológicos y ecológicos que

mantienen en equilibrio los delicados eventos que ocurren en un ambiente

determinado (1,11).

El desarrollo de la comunidad de microorganismos orales usualmente envuelve

una sucesión de poblaciones; proceso que comienza con la colonización del

hábitat por grupos de microorganismos pioneros, y que continua hacia la

diversidad y complejidad de la comunidad microbiana. Uno de los aspectos más

difíciles de estudiar han sido los factores que inciden en la alteración del balance

en el ecosistema oral. Gracias a las técnicas de biología molecular nuestros

conocimientos sobre la microbiología oral se han multiplicado en forma

exponencial y en la actualidad se considera que la cavidad oral del ser humano

es el nicho ecológico con mayor biodiversidad conocido hasta la fecha (11,13).

Se calcula que existen más de 600 especies microbianas en la cavidad oral que

colonizan y que interactúan entre si durante un largo periodo de tiempo. La

mayor parte de la flora oral tiene la característica de ser transitoria, y solo

quedarían como residentes aproximadamente unas 20 especies. Por si solas y

en estado de equilibrio, la mayoría de las bacterias de la cavidad oral son

inofensivas; sin embargo, cuando se conjugan condiciones especiales del

ambiente oral, de los mecanismos de virulencia del microorganismo y de la

respuesta del huésped, estas bacterias se convierten en actores principales,

exhibiendo todo su potencial virulento que conduce al estado de enfermedad

(9,11,13,24).

40

El establecimiento de la causa microbiana de las enfermedades odontogénicas,

caries dental, patologías infecciosas pulpares y periapicales, gingivitis y

enfermedad periodontal, es compleja e intimamente relacionada con los

microbios de la zona (11,13).

1.1 FLORA NORMAL DEL CUERPO HUMANO

El cuerpo humano es una estructura compleja, formada por diversas cavidades:

tracto respiratorio, tracto digestivo, aparato circulatorio, sistema neurológico, etc.

El cuerpo humano posee mecanismos de defensa naturales y adquiridos que le

sirven como sistemas de defensa en el momento de ser invadido por

microorganismos que tienen la capacidad de producir enfermedades a nivel de

cada una de las estructuras que lo componen. Por ejemplo, la cavidad oral es un

ambiente propicio y adecuado para que microorganismos que hacen parte de la

flora normal de esta cavidad y mediante cambios físicos y químicos que suceden

en el ambiente oral den paso a la colonización y multiplicación de

microorganismos aerobios, anaerobios y anaerobios facultativos que tienen la

capacidad de invadir las zonas más profundas de la cavidad oral y ocasionar por

ejemplo, enfermedades periodontales(10). En la figura 1.1 se presentan los

principales microorganismos que hacen parte de la flora normal del cuerpo

humano.

Figura 1.1. Microorganismos que hacen parte de la flora normal del cuerpo humano.

41

Cada una de las cavidades que conforman el cuerpo humano posee un sistema

de protección contra los agentes extraños que ingresan al cuerpo humano. A

continuación se presentan los microorganismos y los mecanismos de defensa

que ocurren en los sitios o cavidades del cuerpo humano.

1.1.1 Microbiología de la nariz y nasofaringe: En forma paralela al proceso de

filtración del aire algunos microorganismos alcanzan a pasar las barreras

protectoras dadas por los pelos nasales y el moco nasal. El moco nasal evita la

entrada de muchos microorganismos patógenos al tracto respiratorio y el

movimiento ciliar permite la eliminación del resto de microorganismos patógenos.

Algunos microorganismos alcanzan a atravesar y a colonizar estas dos

superficies. Entre los microorganismos que predominan encontramos a

Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus y en bajas concentraciones

se encuentran a microorganismos pertenecientes al grupo de Streptococos

viridans y especies del género Corynebacterium. Se debe tener en cuenta que

en el momento en que a una persona se le suministra algún tipo de

medicamento (inmunosupresores, antimicrobianos, etc.), se puede alterar el

habitat microbiano y en consecuencia se produce la disminución o erradicación

de los microorganismos, que facilitan que otros microorganismos patógenos

puedan habitar estas dos estructuras (1,3-4,8,11,12).

1.1.2 Microbiología del tracto digestivo: En el aparato digestivo se llevan a

cabo movimientos (deglución y peristaltismo) que facilitan la eliminación de

muchos microorganismos a través de la producción de heces. En el estomago se

encuentran básicamente dos mecanismos de defensa: 1. El jugo gastrico, y 2.

microvellosidades. El pH ácido del jugo gastrico no permite la adherencia de los

microorganismos a las paredes del estomago, y las enzimas digestivas y la bilis

del jugo gástrico actúan como sustancias antimicrobianas. Las microvellosidades

aumentan el área de absorción intestinal y por medio de movimientos de barrido

permite la eliminación de residuos alimentarios que no son absorbidos y

microorganismos que no se adhieren a la mucosa del tracto digestivo.

El tubo digestivo es una de las estructuras que se encuentra colonizada por

diversos microorganismos. En el duodeno podemos encontrar especies del

género Lactobacillus, Enterococcus faecalis y difteroides, en el íleon y el colon

se encuentra a Bacteroides fragilis (anaerobias) y a Escherichia coli

(enterobacteria) (1,3,11).

42

1.1.3 Microbiología de la cavidad oral: La cavidad oral esta formada por las

siguientes estructuras: lengua, encías, dientes, mucosa bucal y surco gingival.

Estas estructuras manejan concentraciones de oxigeno muy diferentes entre si,

lo cual hace que cada una de estas posea un mecanismo de defensa en

particular. Los mecanismos de defensa que se pueden encontrar son el flujo

salival y el líquido gingival. El flujo salival esta compuesto por proteínas y

enzimas que ayudan a eliminar un número significativo de microorganismos;

igualmente las enzimas del flujo salival mantienen la integridad de la mucosas

heridas al no facilitar la colonización de microorganismos patógenos. El liquido

gingival, se encuentra a nivel de las fisuras del diente, es rico en proteínas e

inmunoglobulinas, proteínas del complemento. La función que cumple el liquido

gingival es que por su alta concentración de proteínas favorece la adhesión de

microorganismos al surco gingival y evita su eliminación; la zona del surco

gingival tiene bajas concentraciones de oxigeno permitiendo que solo

microorganismos anaerobios habiten esta zona. Hace que las bacterias no

puedan ser atacadas por las enzimas que hacen parte de la saliva.Las

inmunoglobulinas, complemento, hacen la función de patrullaje debido a que

controlan la concentración de microorganismos que se encuentran en el surco

gingival. La microbiota oral va cambiando o predominando desde el mismo

momento del nacimiento; con la aparición de la dentadura del niño se empiezan

a encontrar especies como Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis,

Streptococcus oralis y lactobacilos que van teniendo cambio cuantitativos según

sea el grado de higiene oral que posea la persona (1,3-5,8-11)

1.1.4 Microbiologia de la saliva, placa subgingival, placa supragingival

Microbiologicamente la saliva carece de microbiota propia, ya que los

microorganismos que se encuentran en ella son de carácter transitorio y

provienen de desprendimiento de los ecosistemas orales. En muestras de saliva

se han estimado poblaciones aerobicas y anaerobicas de 40 a 110 millones por

mililitro de saliva, respectivamente. En cuanto a la forma de cocos y bacilos,

constituyen respectivamente, el 65 y 35%.

Entre los cocos encontramos los gram positivos anaerobios facultativos con un

44%, gram negativos anaerobios estrictos con un 15% y los gram positivos

anaerobios estrictos y gram negativos aerobios con un 3%. Entre los bacilos se

43

presentan gram positivos anaerobios facultativos con un15%, los gram positivos

y gram negativos anaerobios estrictos con un 7% cada uno respectivamente, los

gram negativos anaerobios facultativos con un 4% y los gram positivos aerobios

con un 2%. En general, en la microbiota salival sobresañen los cocos gram

positivos anaerobios facultativos con un 44% y especies de Veillonella (cocos

gram negativos anaerobios estrictos) y Actinomyces (bacilos anaerobios

facultativos gram positivos) con un 15% cada uno.

La formación de la palca supragingival comienza con una película adquirida de

glicoproteínas que permite la colonización de microorganismos gram positivos y

gram negativos; esta película adquirida va tomando fuerza a medida que llegan

nuevos microorganismos, esta placa se va modificando permitiendo que la

microbiología de la placa supragingival cambie y predominen nuevas especies. A

nivel microbiológico en la placa supragingial podemos encontrar cocos gram

positivos anaerobios facultativos con un 37%, los gram negativos anaerobios

estrictos con un 12% y se pueden encontrar en un 1% gram positivos

anaerobios estrictos y gram negativos aerobios. Entre los bacilos se presentan

gram positivos anaerobios facultativos con un 40%, en un 3% podemos

encontrar gram negativos anaerobios facultativos y estrictos, en minoría se

puede encontrar gram positivos aerobios y anaerobios estrictos. En general, la

microbiota de la placa supragingival predominan los cocos gram positivos

anaerobios facultativos con un 40%, y especies de Streptococcus (cocos gram

positivos en cadena), especies de Enterococcus (cocos gram postivos que se

encuentran en pares o cadenas), especies de Micrococcus (cocos gram

positivos), y especies de Staphylococcus (cocos gram positivos en forma de

racimo).

En el proceso de formación de la placa subgingival, interviene la placa

supragingival; en el cual se observan cambios inflamatorios; trayendo como

consecuencia la disminución del potencial oxido reducción y el aumento de

nutrientes por el aumento del fluido gingival. La placa subgingival se forma en el

saco periodontal donde se observan microorganismos con morfología de cocos y

bacilos. Entre los cocos podemos encontrar gram positivos anaerobios

facultativos con un 50%, los gram negativos anaerobios estrictos con un 13% y

en menor cantidad gram negativos aerobicos y gram positivos anaerobios

estrictos entre 1 y 4% respectivamente. Entre los bacilos se presentan gram

44

positivos anaerobios facultativos con un 18%, los gram negativos anaerobios

estrictos y facultativos entre un 5-6% respectivamente, los gram positivos

aerobios y anaerobios facultativos en 1-3%. En la placa subgingival predominan

cocos gram positivos anaerobios facultativos con un 50% y especies de

Streptococcus (cocos gram positivos), y bacilos gram positivos anaerobios

facultativos en un 18% y especies de Actinomyces (bacilo gram positivo). En la

tabla 1.1 se realiza una breve descripcion de los microorganismos que se

encuentran en saliva, placa supragingival y subgingival (2-3,13).

Tabla 1.1. Microorganismos que se encuentran en saliva, placa supragingival y subgingival.

MICROORGANISMOS SALIVA PLACA SUBGINGIVAL

PLACA SUPRAGINGIVAL

COCOS 67% 65% 50%

GRAM-POSITIVOS ANAEROBIOS FAC.

50% 44% 37%

GRAM-POSITIVOS ANAEROBIO EST.

4% 3% < 1%

GRAM-NEGATIVOS AEROBIOS < 1% 3% 2%

GRAM-NEGATIVOS ANAEROBIOS EST.

13% 15% 12%

BACILOS 35% 32% 48%

GRAM-POSITIVOS ANAEROBIOS FAC.

15% 18% 40%

GRAM-POSITIVOS AAEROBIOS 2% < 1% < 1%

GRAM-POSITIVOS ANAEROBIO EST.

7% 3% < 1%

GRAM-NEGATIVOS ANAEROBIOS FAC.

4% 6% 3%

GRAM-NEGATIVOS ANAEROBIO EST.

7% 5% 3%

45

1.2 ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DE LA CAVIDAD BUCAL

La cavidad oral es una estructura que esta compuesta por diferentes tipos de

tejidos duros y blandos (3,11). Los tejidos de la cavidad oral, por su composición

intrínsica, facilitan o dificultan la colonización y/o multiplicacion de diferentes

microorganismos causantes de enfermedades infecciosas a nivel bucal. Tal es la

importancia de los tejidos, que es necesario hacer una breve descripción de los

principales elementos que se ven afectados por estos microorganismos. En la

figura 1.2 se presentan los componentes que hacen parte del diente.

Figura 1.2. Componentes que hacen parte del diente

1.2.1. Mucosa: Es la encargada de recubrir los labios, paladar, mejillas y

encías. Esta formada principalmente por epitelio escamoso estratificado que

varía en la forma histológica según su localización en la cavidad bucal. La

mucosa oral esta constituida por la mucosa masticatoria (encía, recubrimiento

del paladar duro), mucosa especializada (recubre el dorso de la lengua) y la

mucosa remanente (3,11).

1.2.2. Encía: Forma parte de la mucosa masticatoria, recubre la apófisis

alveolar y rodea la porción cervical del diente. Este tipo de mucosa se adhiere

con firmeza al hueso alveolar y al cemento adyacente por medio de fibras de

tejido conectivo, por lo cual no se observa movilidad. La encía se divide en:

• Encía marginal: Se encuentra localizada en el borde que rodea al diente.

46

• Encía insertada: Este tipo de encía se encuentra subyacente al hueso

alveolar y se extiende hasta el hueso alveolar.

• Encía interdental: Ocupa el espacio entre los dientes por debajo del

área de contacto.

1.2.3. Ligamento Periodontal: Está formado por tejido conectivo blando que

rodea la raíz del diente y la conecta al hueso. El ligamento periodontal esta

constituido por fibras de colágeno. La porción terminal de las fibras del ligamento

periodontal que se insertan en el cemento y hueso reciben el nombre de Fibras

de Sharpey. La biosíntesis de colágeno ocurre a nivel de los fibroblastos para

formar moléculas de tropocolageno. El colágeno es una proteína compuesta por

aminoácidos como la Glicina, Prolina, Hidroxilisina e hidroxiprolina (3,11). Las

fibras de colágeno tipo I se reúnen para formar fascículos y las fibrillas de tipo II

se reúnen para formar fibras.

A nivel del ligamento periodontal se encuentran tres diferentes tipos de células

que son:

� Células de tejido conectivo: Incluye a los fibroblastos, cementoblastos y

osteoblastos. Los osteoblastos son células ovoides que se orientan a lo

largo de las fibras de colágeno emitiendo prolongaciones de seudópodos.

Estas células sintetizan colágeno y también fagocitan fibras de colágeno

viejo mediante la hidrólisis enzimática.

� Restos epiteliales: Son remanentes de la vaina radicular de Hertwig,

que se desintegra durante el desarrollo radicular. Estos restos epiteliales

se distribuyen cerca del cemento a través del ligamento periodontal.

Estos restos intervienen en la formación de quistes periapicales.

� Células de defensa: Esta formada por macrófagos, mastocitos y

eosinofilos.

Las funciones del ligamento periodontal son de tipo físico, formativo y de

remodelación, nutricionales y sensitivas.

� Física: El poseer un tejido blando le facilita proteger los vasos y nervios

de lesiones causadas por fuerzas mecánicas, le permite la inserción del

47

diente al hueso y la conservación de los tejidos gingivales en relación

adecuada de los dientes.

� Formadora y remodelación: Las células del ligamento periodontal

intervienen en la formación y resorción del cemento y hueso. Los

fibroblastos elaboran las fibras de colágeno, también pueden convertirse

en cementoblastos y osteoblastos.

� Sensitiva y nutricional: El ligamento periodontal aporta nutrientes al

hueso, cemento y encía por medio de los vasos linfáticos. El ligamento

periodontal se encuentra inervado por fibras nerviosas sensitivas que

transmiten las sensaciones de presión y dolor (3,11).

1.2.4. Cemento Radicular: Es un tejido calcificado que recubre la raíz y cuenta

con una matriz interfibrilar calcificada y una parte de fibrillas de colágeno. Existen

dos fuentes de fibras de colágeno que son:

� Sharpey (extrínsecas): Es una porción conformada por fibroblastos que

hacen parte del ligamento periodontal.

� Matriz Perse (intrínsecas): Son fibras producidas por cementoblastos y

son las encargadas de producir sustancia interfibrilar como

proteoglicanos, glicoproteínas y fosfoproteínas.

El cemento radicular se encuentra dividido en dos tipos:

� Cemento acelular: Es el primero en formarse y esta constituido

principalmente por las fibras de Sharpey que cumple la función de

soporte dentario. Estas fibras se encuentran mineralizadas por completo.

� Cemento celular: Se forma luego de que el diente llega al plano oclusal;

contiene células denominadas cementocitos que se comunican entre sí a

través de un sistema de canalículos conectados.

El cemento radicular cumple las siguientes funciones:

� Funcion de resorción y reparación: Puede suceder por causas locales

o sistémicas; por lo general hay células gigantes multinucleadas y

macrófagos mononucleares que sufren resorción activa. La resorción del

48

cemento puede alternarse con periodos de reparación y deposito de

cemento nuevo.

� Brinda inserción radicular a las fibras del ligamento periodontal (3,11)

1.2.5. Proceso de formación alveolar: Es la porción del maxilar y la

mandíbula que forma y apoya los alvéolos dentarios; este proceso se lleva a

cabo desde la erupción de los dientes. El proceso alveolar consiste de:

� Una lámina externa de hueso cortical.

� La pared alveolar interna esta compuesta por hueso alveolar y hueso

fascicular.

� Trabecúlas esponjosas: se encuentran reforzadas por láminas corticales,

vestibular y lingual.

� El hueso alveolar se empieza a formar desde la etapa fetal que consta de

una dosificación intramembranosa y una matriz calcificada con

osteocitos. Los osteocitos extienden prolongaciones hacia los canalículos

que se despliegan desde las lagunas; a través de estos canalículos se

transporta oxigeno (O2) y nutrientes.

� El hueso esta constituido por materia inorgánica (minerales en forma de

hidroxiapatita, calcio, fosfato, hidroxilos, carbonatos, citrato, sodio,

magnesio, flúor) y la orgánica (colágeno, baja cantidad de osteocalcina,

osteonectina, proteína morfogénica ósea, fosfoproteinas,

proteoglucanos). La resorción ósea es un proceso complejo relacionado

con la aparición de superficies óseas erosionadas (lagunas de Howship)

y células multinucleadas grandes (osteoclastos).

� En el hueso alveolar se pueden encontrar osteoclastos y osteoblastos en

las siguientes áreas:

1. En la superficie de las trabéculas óseas del hueso esponjoso.

2. En la superficie externa del hueso cortical que demarca los

maxilares.

3. En los alvéolos hacia el ligamento periodontal.

49

4. En la parte interna del hueso cortical. Los osteoblastos producen

osteoide que consiste en fibras de colágeno y una matriz de

glucoproteínas; la cual experimenta la calcificación por depósitos

de minerales donde posteriormente se va a convertir en

hidroxiapatita (3,11).

1.2.6 Dentina: La dentina es un tejido duro que esta formada por túbulos y en la

parte interna se localizan fibras nerviosas que transmiten estímulos de dolor. La

composición estructural de la dentina se encuentra dividida en materia

inorgánica y materia orgánica. En la materia inorgánica podemos encontrar

cristales de hidroxiapatita y en la materia orgánica encontramos fibras de

colágeno tipo I. Al interactuar la materia orgánica e inorgánica cumplen la función

de delimitar los túbulos dentinarios donde circula el líquido encargado de realizar

la permeabilidad dentinaria.

1.2.7 Esmalte: El esmalte dental es un tejido mineralizado, acelular que se

encuentra en la superficie de la corona del diente. El esmalte esta constituida por

materia orgánica (agua) y cerca del 96% es materia inorgánica (cristales de

hidroxiapatita). La materia inorgánica hace más susceptible al esmalte de sufrir

procesos de desmineralización en medios ácidos.

1.3 RESPUESTA INMUNE Y DETERMINANTES ECOLÓGICOS ORALES

Como ya se dijo previamente, el ecosistema bucal esta formado por diferentes

microorganismos que hacen parte de la microbiota oral. Los determinantes

ecológicos orales son aquellos parámetros, factores y situaciones que favorecen

la presencia de microorganismos en la cavidad oral. En el momento en que los

microorganismos presentes en la cavidad bucal encuentran la oportunidad de ser

patógenos, se desencadena un serie de reacciones producidas por el sistema

inmunológico del cuerpo humano. El éxito de las reacciones inmunologicas

podría conducir a la eliminación o control de estos microorganismos y así mismo

a disminuir el riesgo de sufrir enfermedades infecciosas en cavidad oral (7).

1.3.1 Respuesta inmunologica: En la respuesta inmunologica intervienen dos

tipos de sistemas que son el sistema innato y el sistema adptativo. Estos

50

sistemas empiezan a actuar en el momento en que ingresa un agente extraño al

cuerpo como bacterias, hongos, parasitos, polen, etc. Estos agentes pueden

activar uno o ambos sistemas dependiendo del grado de concentración del

agente extraño que ha ingresado al cuerpo.

A nivel de la repuesta inmune se pueden encontrar diferentes factores de riesgo

no específicos que se describen a continuacion:

� Flujo Salival: Cuando se reduce o elimina el flujo salival, se puede dar

origen a xerostomía que predispone al rápido desarrollo de la caries. La

reducción del flujo de la saliva también se encuentra asociada a la

obstrucción de los conductos salivales, como consecuencia de

tratamiento quirúrgico, o después de terapia con algunos medicamentos.

En estos pacientes el deterioro de la salud bucal puede ser

extremadamente rápido y dramático. Este tipo de caries se puede

presentar en personas con escasa o sin experiencia previa de caries y de

manera característica se presenta dispersión de lesiones cervicales. Es

probable que los efectos de buffer de la saliva basados principalmente en

los sistemas amortiguadores de fosfato y bicarbonato ácido carbónico,

sean de la mayor importancia en relación a la caries. Así mismo, la

velocidad del flujo varía en diferentes individuos (3,6).

� Factores químicos: En las secreciones bucales se encuentran varios

factores antimicrobianos: lisozimas, lactoperoxidasa, lactoferrina y

glicoproteínas de alto peso molecular. La lisozima es una enzima que se

encuentra en la saliva, secreción nasal (moco), lagrimas y también se

puede encontrar en células fagocíticas como los neutrófilos. Esta enzima

hidroliza el enlace entre la N-acetilglucosamina y el ácido N-

acetilmuramico; estos enlaces se encuentran en el péptido glicano de la

pared celular bacteriana. En algunas ocasiones la lisozima puede

intervenir en la lisis de las bacterias mediada por un anticuerpo-

complemento. La lactoferrina es una proteína revestida de hierro

normalmente sintetizada por las células epiteliales acinares neutrófilas;

se encuentra principalmente en la saliva, intestino y la principal fuente de

lácteos (leche). Presenta gran capacidad de unión con el hierro y actúa

para eliminar las formas libres de ese metal de las superficies mucosas.

Si los microorganismos no consiguen el hierro necesario para su

51

metabolismo, se retarda su crecimiento (11). La lactoperoxidasa es una

enzima que se potencializa cuando en el medio se encuentra peroxido y

tiocinato, trayendo como consecuencia la formación de un inhibidor

bacteriano; esta enzima se obtiene en la leche y saliva. La

lactoperoxidasa es una enzima hemoprotéica, tiene gran afinidad por la

superficie del esmalte y mantiene su actividad después de la unión;

puede resultar en un importante mecanismo de defensa limitador de la

colonización microbiana temprana de la superficie del diente, La

peroxidasa y el peroxido generan compuestos químicos altamente

reactivos que enlazan o inactivan varios sistemas enzimáticos

microbianos intercelulares, así como componentes superficiales

microbianos. Tiene un efecto antibacteriano contra ciertas bacterias que

no producen catalasa, incluyendo los lactobacilos y los estreptococos

(11). Los microorganismos habituales o propios de flora oral que

colonizan la boca, por lo general son resistentes a la acción de la lisozima

y así parece poco probable que esta enzima desempeñe un papel

importante contra la protección de la caries dental; sin embargo, puede

ser un factor útil para prevenir la colonización de la boca por microbios

extraños (3).

Se pueden encontrar dos mecanismos inmunologicos especificos por los cuales

los anticuerpos y las células de defensa activas alcanzan las estructuras

dentarias donde se forma la placa denta: la saliva y el líquido subgingival. Estos

dos líquidos sirven de vehículo de las respuestas inmunológicas humorales

(mediadas por anticuerpos) y celulares (mediadas por células). Estas respuestas

también pueden ser locales y generalizadas (3).

� Anticuerpos salivales: La IgA es la inmunoglobulina predominante en

las secreciones mucosas, con concentraciones relativamente bajas en el

suero. En las glándulas salivales, las moléculas de IgA son secretadas

por las células plasmáticas, en tanto que otra proteína conocida como el

componente secretor es producida en las células epiteliales del

recubrimiento de los conductos, que le da la propiedad a la IgA secretora

de no ser degradada por las enzimas proteolíticas de las secreciones

exocrinas. La IgA secretora es la predominante en la saliva humana, los

anticuerpos de esta clase de inmunoglobulinas son los que mas

52

probablemente proporcionan protección contra los microorganismos

cariogénicos (3).

La estimulación del sistema secretor de la IgA puede también evitar

posibles reacciones inmunológicas adversas resultantes de la

estimulación de altos niveles de anticuerpos del suero, hipersensibilidad

inmediata o inmunidad celular. Sin embargo, no se sabe de modo

definitivo que los anticuerpos salivales IgA ejerzan una función decisiva

en la inmunidad de la caries. Los anticuerpos derivados del surco gingival

también pueden contribuir a dicha inmunidad, pero su aparición en la

saliva parece depender en gran medida de la inflamación de la encía

(11).

� Anticuerpos Séricos: Los mecanismos posibles por los cuales los

anticuerpos pueden operar para inhibir la caries, incluyen:

1. Prevención de la adherencia de la bacteria a la superficie dental

y/o a la placa.

2. Inhibición de enzimas especificas, como glucosiltransferasas,

responsables de la síntesis de polisacáridos extracelulares a partir

de sacarosa

3. Inactivación del metabolismo de las bacterias como la

fermentación de los carbohidratos.

4. Inhibición del crecimiento o muerte de las bacterias

5. Opsonización de las bacterias

1.3.2. Factores protectores del huésped : existen factores protectores del

huésped que posee la misma cavidad bucal para limitar la microbiota oral, entre

los cuales encontramos:

� Integridad de la mucosa: La continuidad de cada una de las capas de la

cavidad bucal limita la colonización de determinados microorganismos en

algunas zonas dentales. La presencia en la lamina propia de algunos

anticuerpos, leucocitos y tejido linfoide puede cooperar en la defensa

frente algunos microorganismos; el moco también impide la adhesión de

53

microorganismos debido a que bloquea los receptores de las adhesinas

bacterianas.

� Masticación, deglución y succión: Estos diferentes mecanismos

mecánicos que se llevan a cabo en el proceso de alimentación permiten

el arrastre de algunos microorganismos al tracto digestivo donde la

mayoría son destruidos por el jugo gástrico y otro tipo de enzimas que

son capaces de degradar algunos componentes de la pared bacteriana.

1.3.3 Factores fisicoquímicos de la cavidad oral: La cavidad oral es un

microambiente favorable para que algunos microorganismos sean capaces de

sobrevivir en este ambiente. El ambiente bucal se ve influenciado por los

siguientes factores:

� Humedad: Esta dada por el contenido de agua (saliva) que maneja la

cavidad oral, la cual permite el intercambio de nutrientes, reacciones

metabólicas, eliminación de productos de desecho.

� pH: La cavidad oral maneja un pH normal entre 6,7-7,5 óptimo para el

desarrollo de la mayor parte de los microorganismos. El pH es un factor

que puede variar por el consumo de bebidas, alimentos (dulces) o

metabolitos bacterianos que se obtienen a partir de la utilización de

carbohidratos. El pH es regulado por la saliva debido a que contiene

bicarbonatos que liberan acido carbónico débil cuando se encuentra

acido en el medio. Finalmente en esta reacción se forma agua y CO2 .

HCO3- +H+ H2CO3

H2CO3 H2O + CO2

� Temperatura: La temperatura de la boca es de aproximadamente 37 ºC,

la cual es optima para el desarrollo de microorganismos mésofilos que

tienen la capacidad de colonizar la cavidad oral. Esta temperatura puede

sufrir cambios dependiendo de la dieta; lo cual hace que existan cambios

bruscos y repentinos, por lo cual se cree que los microorganismos se

pueden adaptar a estos cambios para poder sobrevivir.

54

� Potencial oxido-reducción: La mayor parte de los microorganismos

orales son anaerobios o anaerobios facultativos, hecho que se encuentra

influenciado por el potencial oxido-reducción. (1,3,11).

� Saliva: El flujo salival ayuda a la limpieza de las diferentes estructuras

dentales facilitando la eliminación de algunos microorganismos. Contiene

factores de coagulación como VIII, IX, X y XII que intervienen en el

momento de que se presentan heridas a nivel bucal; impidiendo la

infección por microorganismos oportunistas. También sirve como sistema

amortiguador del pH bucal el cual no permite que los ácidos lleven a cabo

el proceso de desmineralización en el esmalte del diente (1,3,6).

Existe una diversidad de componentes que hacen parte de la saliva entre

los cuales cabe destacar las enzimas como son lisozima o muramidasa,

peroxidasa, lactoferrina, aglutininas salivares; otros factores que

interviene en las funciones que cumple la saliva son el complemento,

leucocitos e IgAs secretoria.

• Flujo gingival: Los diferentes componentes celulares y humorales que

hacen parte del sistema inmunologico, que circulan vía sanguinea

pueden llegar hasta las superficies dentales y epiteliales de la cavidad

oral por medio del flujo gingival. La concentración de fluido gingival se

puede alterar como causa de agentes externos como la inflamación

producida por una mala higiene que desencadena en gingivitis o

periodontitis. Este fluido esta formado principalmente por

Inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgE), particulas del sistema de complemento

y un porcentaje de las enzimas que hacen parte de la saliva.

• Fluido oral: La saliva es considerada una mezcla de varias secreciones

que proviene de la glándula salival, fluido cervicular y productos de la

mucosa oral. Estos fluidos constituyen el principal mecanismo de defensa

a nivel bucal teniendo en cuenta que es un ambiente que se encuentra

expuesto a alteraciones causadas por el mismo huésped que en su

momento serán perjudiciales para su estado de salud bucal.

1.3.4. Factores de adhesión, agregación y coagregación bacteriana: La

cavidad oral es un ambiente que se encuentra en continuo cambio de la

microbiota oral, debido a la dieta alimenticia que se tiene. El flujo salival, la

55

masticación, la deglución, la higiene bucal y la descamación de las células

epiteliales son algunas actividades que ayudan a eliminar cierto número de

microorganismos que se encuentran en zonas poco accesibles y que les brinda

condiciones adecuadas para que puedan sobrevivir.

Para que se lleve a cabo la interacción de microorganismos con las diferentes

estructuras de la cavidad oral se debe tener en cuenta las adhesinas o

moléculas superficiales que posee cada bacteria, que tienen como principal

función permitirle a la bacteria adherirse a la superficie del tejido dental del

huésped. La interacción del microorganismo también depende de los receptores

que van a interactuar con las adhesinas, entre los cuales encontramos los

carbohidratos del glicocalix y glucoproteinas salivales absorbidas de forma

selectiva al esmalte. Las glucoproteínas salivales actúan como receptores en el

proceso de agregación y coagregación. A continuación se describirán los

principales tipos de adhesión, agregación y coagregacion en la cavidad oral

(1,3,11).

� Unión Lectina-Carbohidratos: Las lectinas son proteínas que hacen

parte de la estructura bacteriana y tienen la capacidad de unirse a

monosacáridos o polisacáridos; en algunos casos las lectinas pueden

interaccionar con carbohidratos que están presentes en las superficies de

células, tejidos vivos o inerte. Los microorganismos pueden utilizar las

lectinas para mediar el proceso de adhesión a las estructuras antes

mencionadas.

� Unión proteína-proteína: En el proceso de interaccion entre proteina y

proteina se lleva a cabo un reconocimiento entre los peptidos que hacen

parte de la superficie bacteriana y la superficie del tejido inerte o vivo

� Uniones mediadas por glucanos: La union mediada por los glucanos

que se encuentran localizados en las superficies del tejido con afinidad

hacia los glucanos.

� Uniones por ácidos lipoteicoicos: Los ácidos lipoteicoicos son

componentes de los microorganismos que les facilita la unión a las

diferentes estructuras dentales por la interacción con el receptor

específico que en algunos casos puede ser la fibronectica.

56

� Adhesión a células epiteliales: Las bacterias que comúnmente habitan

la cavidad oral se adhieren fuertemente a la fibronectina. La fibronectina

cumple el papel de impedir la adhesión de ciertas adhesinas a los

receptores dentales(1,3).

1.3.5. Factores nutricionales: La microbiota oral obtiene los diferentes tipos

de nutrientes a partir de secreciones producidas por cada uno de los tejidos del

huésped (endógenas), a partir de los procesos químicos que llevan a cabo otras

bacterias (interbacteriana) y la principal es la dieta alimenticia que posee la

persona.

• Fuentes endógenas: El líquido que circula en la boca es el principal

proveedor de nutrientes para estos microorganismos. La saliva proviene

de las glándulas mayores (parótidas, submaxilares, sublinguales). El flujo

salival depende de factores como la cantidad de alimento ingerido por la

persona. Esta compuesta en baja cantidad por carbohidratos,

aminoácidos libres y en mayor cantidad proteínas, glucanos, calcio y

fosfato que son los principales componentes que utilizan las bacterias. El

liquido gingival se origina a partir de los capilares sanguíneos cercanos al

epitelio de unión; esta formado por albúmina, glucoproteinas,

lipoproteínas, hemina, α-2 globulina, sodio, potasio, calcio, magnesio,

fosfatos inorgánicos, muchos de estos compuestos son esenciales para

el desarrollo de microorganismos que viven en el surco gingival (4).

� Fuentes interbacterianas: Son las de mayor importancia a nivel

bacteriano. Las bacterias solo pueden utilizar para su metabolismo

moléculas como azucares, aminoácidos; las cuales deben ser

degradabas para que ser asimiladas por el metabolismo. Principalmente

la degradación de las macromoléculas que se ingiere en la dieta son

degradadas por exoenzimas de origen bacteriano. Las bacterias cuando

en el proceso de degradación producen un exceso de aminoácidos,

purinas, pirimidinas, vitaminas, etc., son excretados al exterior y

aprovechados por otros microorganismos que hacen parte de la

microbiota oral.

� Fuentes exogenas: Los diferentes compuestos de la dieta permanecen

muy poco tiempo en la cavidad oral, pero los mas importantes son los

57

carbohidratos como principal fuente energética de las bacterias y de la

cual en el momento de degradación se producen diferentes ácidos que

permiten la colonización de otros microorganismos (1,3).

58

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60

CAPITULO 2

BIOPELICULA Y PLACA DENTAL

Las biopelículas microbianas han sido descritas en muchos sitios desde que

Antón van Leeuwenhoek examinó los �minúsculos animalículos� en la placa

dental de su propio diente. La biopelícula microbiana (biofilm o biocapa) es el

resultado de la colonización, crecimiento y metabolismo celular microbiano

organizado sobre superficies sin vida o tejidos. Las biopelículas microbianas

poseen además una arquitectura estructural y funcional, que conducen, a los

microorganismos inmersos en él, entre otros, a cambios en procesos

metabólicos, respuestas a nutrientes y resistencia a agentes antimicrobianos. En

definitiva se podría decir que la biopelícula microbiana es una estrategia muy

antigua de crecimiento, empleada por numerosos microorganismos para

favorecer su supervivencia en medios ambientes artificiales y naturales con

continuo flujo de nutrientes.

Día a día, en la medida en que se ha contado con mejores instrumentos de

observación y análisis, los terminos de biopelícula y placa dental han tenido

grandes modificaciones. Estas modificaciones han sido realizadas por cientificos,

que por medio de la observacion microscopica y otras técnicas han logrado no

solo la identificacion de los microorganimos actores en el biopelícula sino

también de otros factores como las fibrillas de polisacaridos que le permiten a los

microorganimos adherirse a la estructura dental o material vivo o artificial

colonizado.

2.1 DEFINICIÓN DE BIOPELÍCULA

Marshall en 1976 definió a las biopelículas como �muy finas fibrillas de polimeros

extracelulares que atan las bacterias a las superficies�. Dos años después,

Costerton dejo claro que las biopelículas son � comunidades de bacterias atadas

61

en sistemas acuáticos y encerradas en una matrix de glicocalix, de naturaleza

polisacárida, que media en la adhesión�. Este mismo autor en el año 1987

describió que los �biofilms constan de células individuales y microcolonias, todas

embebidas en una matrix aniónica con exopolimeros y muy altamente hidratada�.

Characklis and Marshall en 1990 describieron otros aspectos de los biofilms,

características de heterogeneidad espacial y temporal, y el papel de sustancias

inorgánicas o abióticas mantenidas en la matrix del biofilm.

Unos años más tarde en 1995, Costerton menciona que las �biopelículas pueden

adherirse irreversiblemente a superficies e interfaces, incluyendo agregados

microbianos, floculos y poblaciones adherentes, dentro de los espacios

porosos del medio colonizado�. Costerton y Lappin-Scott también en 1995

añaden que �la adhesión dispara la expresión de genes que controlan la

producción de componentes bacterianos necesarios para la adhesión y

formación del biofilm�.

En la actualidad se tiene la siguiente construcción del termino biopelicula �El

biofilm es el producto de una comunidad microbiológica sesil, caracterizado por

células que están irreversiblemente atadas a un sustrato o interface,

embebidas en una matrix de sustancias polimericas extra-celulares

que ellas han producido, y exhiben un fenotipo alterado con relación a la

tasa de crecimiento y transcripción de genes � (1,4,7,9,19).

2.2. CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS Y COMUNICACIÓN EN LAS

BIOPELÍCULAS

Las células microbianas que forman parte de la biopelícula microbiana (células

sesiles) poseen propiedades diferentes a las células microbianas (células

plantónicas) que están en estado libre no formando película. Estas propiedades

están dadas por la generación de señales de las células microbianas entre sí, y

al establecimiento de gradientes físico-químicos dentro de la película, que

modifican el metabolismo de estas bacterias. En las microcolonias se forman

canales de agua bien definidos que permiten el ingreso de nutrientes del fluido

externo al interior de los nichos microcoloniales, remueven productos

metabólicos por el mismo proceso y permiten el equilibrio iónico y molecular. La

síntesis de los exopolímeros de la matriz parece estar regulada por una variedad

62

de factores, entre los cuales la superficie de adhesión parece ser de particular

importancia. La magnitud y naturaleza de esta producción dependen de factores

fisiológicos, disponibilidad de carbono y nitrógeno, y del tipo de bacterias que

componen la película. Así, por ejemplo, el alto fluido de saliva que se da durante

la masticación, brinda una gran disponibilidad de nutrientes que facilita la

organización de películas compactas y estratificadas sobre la superficie de los

dientes (3,5,6,18). En la tabla 2.1 se realiza una describcion de los

microorganismos plantonicos y sesiles con respecto a la susceptibilidad al

antibiotico.

Tabla 2.1. Susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos plantonicos y sesiles.

MICROORGANISMO ANTIBIOTICO PLANTÓNICO SESIL Staphylococcus aureus Vancomicina 2 (MBC) 20

Pseudomonas aeruginosa

Imipenem 1(MIC) >1024

Escherichia coli Ampicilina 2 (MIC) 512 Pseudomonas pseudomallei

Ceftazidima 8 (MBC) 800

Streptococcus sanguis Doxiciclina 0.063 (MIC) 3.15

Con relación a los exopolímeros que se encuentran en la matriz de la película

microbiana , se tienen dos hechos importantes: 1. mientras no existan adhesinas

(proteínas del microorganismo), los exopolímeros son sobreproducidos para que

colaboren con la adhesión inicial de células a las superficies; y 2. los

exopolímeros protegen a las células bacterianas contenidas dentro de la

película, contra la desecación y la respuesta inmune del hospedero, y restringen

la difusión de agentes antimicrobianos hacia el interior de la película. Como se

dijo anteriormente el glicocálix constituye una barrera física para la penetración

de antibióticos. Este bloqueo depende en gran medida de la naturaleza del

antibiótico, la capacidad de unión del glicocálix hacia este, los niveles del agente

usado terapéuticamente y la tasa de crecimiento de la microcolonia. Por ejemplo,

para antibióticos como la tobramicina y cefsoludina, los efectos de unión al

glicocálix son mínimos con lo cual estos pasan al interior de la película, pero

para antibióticos cargados positivamente como la gentamicina, la unión a los

polímeros polianiónicos de la matriz es alta y su acceso a las células es

impedido (11,13).

63

Las bacterias que se encuentran sumergidas en el biofilm tienen la capacidad de

comunicarse por medio de señales quimicas y de intercambiar material genetico

por medio de procesos como conjugacion, transferencia de plasmidos o

transferencias de transposones. Hay que tener en cuenta el fenomeno de

�Quorum Sensing�. Este fenomeno implica la regulacion de expresion de ciertos

genes a traves de la acumulacion de productos quimicos. El Quorum puede

proporcionarle a los microorganismos la capacidad de resistencia a un

antimicrobiano e incluso influenciar en la colonizacion de unas especies (1,9,

15).

En la actualidad se conoce que las bacterias tienen la capacidad de comunicarse

entre ellas por la generación de señales químicas denominadas �autoinductores�.

Los autoinductores le permiten a la bacteria establecer relaciones de simbiosis

con otras bacterias y al mismo tiempo le permiten potencializar su mecanismo de

patogenicidad contra el cuerpo humano. Entre los sistemas de señalización

encontramos que las bacterias Gram-positivas utilizan péptidos de bajo peso

molecular como agentes de sensibilidad al Quorum, pero esto no ocurre con las

bacterias Gram-negativas por que utilizan el sistema de señalización de Acil-

homoserina lactona (17).

2.3. PROCESOS DE COLONIZACIÓN E INFECCIONES EN LAS QUE ESTÁN INVOLUCRADAS LAS BIOPELÍCULAS

Varios de los procesos infecciosos que se presentan en el cuerpo humano; como

caries dental, enfermedad periodontal, otitis media, infecciones musculo

esqueléticas y endocarditis bacteriana, están relacionados con la presencia de

biopelículas. En cada una de las infecciones mencionadas anteriormente se

observa un proceso crónico, persistente y de difícil erradicación.

Con el logro en avances tecnológicos, en medicina y odontología se empezaron

a utilizar aparatos construidos de materiales sintéticos como válvulas cardíacas,

marcapaso e implantes dentarios. Es difícil imaginar que las bacterias puedan

colonizar biomateriales médicos, en los cuales, una vez instalados en el sitio

elegido del cuerpo humano, existe un sometimiento a un paso continuo de

fluidos. Sin embargo, la colonización y posterior formación de la biopelícula se da

64

por un principio de dinámica de fluidos conocido como flujo laminar, en donde la

velocidad del fluido es más grande en el centro y se acerca a cero a lo largo de

las paredes de un cilindro. La velocidad cero del fluido a lo largo de las paredes

es ideal para la adhesión bacteriana, colonización, formación y crecimiento de la

biopelícula. Existen muchos aparatos de uso en medicina en los que se ha

demostrado la colonización microbiana y posterior formación de película. Entre

estos aparatos se encuentran: válvulas cardíacas prostéticas, catéteres del

sistema nervioso central, catéteres urinarios, lentes de contacto, dispositivos de

uso intrauterino y líneas de agua de unidades dentales. En la figura 2.1 se ilustra

una fotografia realizada por microscopía electrónica de barrido en la que se

observa la película de Enterococcus faecalis (bacteria muy implicada en

infecciones humanas) formada en un catéter intravascular de teflón. La flecha

señala la película en forma de masas y que recubre el catéter a lo largo.

Los microorganismos que se han encontrado relacionados con infecciones

crónicas asociadas a implantes sintéticos son el Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus aureus y otros microorganismos gran-negativos (16). En la tabla

2.2 se enuncian los microorganismos involucrados en procesos de infección y

colonización de materiales sintéticos (1, 8, 14, 22).

Figura 2.1 Pelicula de Enterococcus faecalis: Fotografía por microscopía electrónica de barrido en la que se observa la película de Enterococcus faecalis (catéter intravascular de teflón). La flecha señala la película en forma de masas y que recubre el catéter a lo largo.

65

Pero los microorganismos que hacen parte de la biopelículas tiene la capacidad

de adherirse a implantes y células epiteliales.

• Las válvulas cardiacas con frecuencia son colonizadas por

microorganismos orales. Entre estos microorganismos podemos

mencionar la especies de Actinobacillus actinomycetemcomitans, que se

encuentra involucrado como agente etiológico de la enfermedad

periodontal.

• Los implantes que se realizan a nivel de cadera son extraídos como

consecuencia de procesos infecciosos causados por Propionibacterium

acnés.

• En la formación de la enfermedad periodontal, se observa un proceso

inflamatorio, que tiene como consecuencia el debilitamiento del soporte

dental y posterior a ello la perdida del diente. En el inicio de la

enfermedad periodontal se encuentra una biopelícula dental, formada por

componentes de la saliva y el moco que es secretado por la mucosa oral.

Esta biopelícula favorece la adhesión de los microorganismos transitorios

que se encuentran sumergidos en la saliva; permitiendo que las bacterias

se multipliquen y se extienda la zona de colonización.

• La endocarditis de origen infecciosos se relaciona constantemente con

bacterias que pertenecen al grupo de Streptococcus viridans. Las

bacterias que forman parte del grupo de streptococcus viridans se

desplazan a través del torrente sanguíneo alcanzando el tejido cardiaco y

desencadenando en poco tiempo el proceso infeccioso si se cuenta con

un implante sintético en este tejido.

• Los cateteres urinarios son fabricados a partir de polimeros sinteticos;

con frecuencia se utiliza latex siliconisado. Este material facilita la

colonizacion de microorganismos oportunistas para adherirse a las

paredes de los cateteres y empezar a desarrollar biopeliculas. Los

microorganismos que tienen la capacidad de adherirse a los materiales

sinteticos empiezan a sintetizar polisacaridos extracelulares que facilitan

el proceso de agregacion y co-agregacion de otros microorganismos (20).

En la tabla 2.2. se relacionan los microorganismos que se encuentran

involucrados en procesos de infeccion y colonizacion de aparatos construidos

en materiale sintetico.

66

Tabla 2.2. Microorganismos involucrados en en procesos de infeccion y

colonizacion de materiales sinteticos

PROCESOS INFECCIOSOS ESPECIES INVOLUCRADAS EN LA BIOPELÍCULAS

CARIES DENTAL Especies de Streptococcus, Actinomices y Lactobacillus

ENFERMEDAD PERIODONTAL Fusobacterium nucleatum Porphyromona gingivalis

INFECCIONES MUSCULO ESQUELÉTICAS

Especies de Staphylococcus

ENDOCARDITIS Streptococcus del grupo viridans MATERIALES SINTETICOS ESPECIES INVOLUCRADAS EN LA

BIOPELÍCULAS LENTES DE CONTACTO Pseudomonas aureginosa, Cocos gram

positivos CISTITIS POR CATÉTERES URINARIOS Escherichia coli, Bacilos gram

negativos CATETERES CENTRALES VENOSOS Staphylococcus epidermididis MARCAPASOS, DISPOSITIVOS ORTOPÉDICOS Y PRÓTESIS DEL PENE

Staphylococcus epidermididis y Staphylococcus aureus

2.4 ETAPAS EN EL PROCESO DE FORMACIÓN DEL BIOPELÍCULAS:

La mayoría de bacterias que forman películas prefieren un ambiente húmedo y

amplias superficies lisas sobre las cuales adherirse y multiplicarse. La formación

de la película microbiana se realiza básicamente en tres etapas.

2.4.1 Primera etapa, colonización o adherencia: La colonización del sitio en

donde se ha de formar la película, es el primer paso y empieza con el

reconocimiento de la superficie por parte de los microorganismos. Este

reconocimiento se da gracias a la participación de fuerzas químicas que

estabilizan la adhesión a nivel molecular. Hasta este momento la adherencia es

reversible (se puede revertir), y se hace irreversible cuando ocurren

interacciones selectivas entre las adhesinas (proteínas de adhesión de los

microorganismos) y vesículas bacterianas con los receptores específicos en el

tejido o superficie inerte. El proceso de colonización microbiana se favorece

67

además por la incorporación y almacenamiento de sustancias que están

presentes en el flujo constante de líquidos como sangre u orina y, en el caso de

la película dental, la saliva. La adherencia también se facilita en algunas

bacterias gram-negativas provistas de flagelos o fimbrias. Los estafilococos y

micobacterias no tienen mecanismos de movilidad pero tienen la capacidad de

formar biopelícula (10).

2.4.2 Segunda etapa, agrupamiento, crecimiento y formación de la matriz extracelular: Después de que se lleva a cabo el proceso de colonización

(adhesión), los microorganismos se multiplican, se agrupan y las células hijas se

extienden alrededor del sitio de unión formando micro colonias. Las bacterias

empiezan a formar una matriz extracelular protectora. Esta matriz, fibrosa e

hidratada, está constituida fundamentalmente por materiales microbianos

extracelulares, glicocálix o limo, y por proteínas del líquido en el que se

encuentra inmerso. El glicocálix o exopolímero tiene, dependiendo del tipo de

bacterias, entre otros, constituyentes básicos como alginato, celulosa, glucosa,

manosa, galactosa y xilosa (3,4). En la figura 2.2 se da a conocer el proceso de

formación de una biopelícula.

Figura 2.2. Proceso de formación de una biopelícula.

2.4.3 Tercera etapa, crecimiento de la matriz. La matriz aumenta de tamaño

por el agrupamiento de otros microorganismos, con lo cual asegura un ambiente

rico en nutrientes para permitir la multiplicación y sobrevivencia microbiana

68

(Figura 2.3). Además, en esta etapa el intercambio de señales entre los

microorganismos favorece la multiplicación y formación de micro colonias. Las

señales tienen como fin conducir a la producción de muchas proteínas útiles

para los microorganismos de la película. En resumen, la película se convierte en

un complejo entramado de especies microbianas entremezcladas, inmersas y

sostenidas en una matriz extracelular en la que existen unos canales que

facilitan la distribución de los nutrientes. No todas las biopelículas están relacionados con procesos infecciosos. Los

Lactobacilos que se encuentran presentes en la cavidad vaginal poseen un

efecto benefico en el pH vaginal al fermentar el glucógeno producido por las

células epiteliales vaginales y mantener un pH ácido. Cuando se destruye esta

biopelícula comienzan a aparecer infecciones causadas por diferentes

microorganismos patógenos. Otro caso que se puede mencionar es en la

biopelícula formada por microorganismos en la placa dental, que se mantienen

en equilibrio hasta que las condiciones del microambiente se alteren. Estas

condiciones se pueden alterar cuando la persona tiene una alta ingesta de

alimentos o bebidas ricas en azucares, que conducen a los microorganismos

cariogénicos a utilizar estos carbohidratos como fuente energética para su

metabolismo con formación final de ácidos, que tienen la capacidad de disolver

el esmalte dental llevando a la formación de caries (1,16,21,22,).

Figura 2.3 Corte transversal de catéter intravascular de teflón con película microbiana, observado por microscopía electrónica de barrido. Se aprecia una capa blanca de exopolisacárido producido por microcolonias de Enterococcus faecalis.

69

2.5 RESISTENCIA DE LAS CÉLULAS MICROBIANAS DE LA PELÍCULA

La flexibilidad en el cambio en la estructura y fisiología de las bacterias dentro de

la película (células sesiles) permite que ellas desarrollen rápidas respuestas

fenotípicas, no solo por nutrientes y tasa de crecimiento, sino también por

variaciones en temperatura, pH y la continua exposición a concentraciones

subefectivas de antibióticos. Estas respuestas fenotípicas incluyen cambios

cualitativos, en una amplia variedad de componentes celulares, como proteínas,

ácidos grasos, fosfolípidos asociados con el desarrollo de la célula, y

cuantitativos en la producción de enzimas extracelulares y polisacáridos. Los

cambios en el fenotipo inevitablemente afectan la susceptibilidad hacia un amplio

rango de antibióticos, desinfectantes, antisépticos y preservativos. Una

consecuencia del crecimiento de las bacterias en la película es una marcada

resistencia a los agentes antimicrobianos, por ejemplo se han encontrado

bacterias (sesiles) de las películas 500 veces mas resistentes a agentes

antibacterianos con relación a las células libres (plantonicas). En resumen, el

hecho de que el microorganismo no sucumba ante el tratamiento antimicrobiano

puede deberse a factores relacionados con la bacteria y con la película. Los

relacionados con la bacteria son debidos a una tasa lenta de crecimiento de

esta dentro de la película, a una inherente resistencia a los agentes usados, a la

adquisición de resistencia, en cepas previamente susceptibles, por mutación

genética o por transferencia de material genético de otras especies, y al

surgimiento de preexistentes pero no expresados fenotipos de resistencia. Los

relacionados con la película incluyen problemas de penetración del antibiótico o

inactivación de este en la película.

2.6. LA PLACA DENTAL

En odontología, la placa dental es considerada como una biopelícula oral, con

una compleja y variada comunidad bacteriana, que en ciertas circunstancias

lleva a la iniciación y progresión de enfermedades periodontales. Fue en el año

de 1898 en que se comenzó a utilizar el término de placa dental. Black la definió

como una �masa microbiana que recubría las lesiones cariosas presentes en la

dentadura�. En 1976, Bowen cambia el concepto por �depósitos blandos que

70

forma una biopelícula que se adhiere a la superficie dentaria�. Marsh y Martin, en

el año 2000 proponen que la �placa dental es una comunidad microbiana

compleja que se encuentra localizada en los dientes, dentro de una matriz de

origen bacteriano y salival�. Esta teoría se sigue manteniendo hasta el día de

hoy, fundamentalmente debido a que se ha demostrado que la placa dental esta

formada por diferentes especies de microorganismos que son capaces de

sobrevivir y de modificar las condiciones salivales para facilitar su sobrevivencia

(4,19).

La placa dental se forma a partir de la biopelícula que en un determinado

momento le brinda las condiciones adecuadas a algunos microorganismos para

que colonicen ciertas estructuras dentales. La microbiota que hace parte de la

biopelícula se forma en un principio por la interacción de los microorganismos

con las estructuras dentarias para establecer posteriormente relaciones

interbacterianas en donde algunas bacterias le brindan factores de crecimiento a

otras para que se establezcan (4,19).

La placa dental se clasifica según su localización a nivel buco dental en: 1. placa

supragingival que esta formada principalmente por bacterias Gram-positivas, y 2.

placa subgingival que se localiza en los sacos periodontales y en donde

predominan bacterias Gram-negativas (22).

2.6.1 Formación de la placa dental: La placa dental empieza con depósitos

blandos que se fijan a las estructuras dentarias duras. Minutos después de que

se realiza la higiene oral se comienza a formar una capa acelular sobre la

superficie dentaria formada por adsorción selectiva de proteínas y glucoproteínas

salivales. En la superficie de la hidroxiapatita predominan enlaces de grupo

fosfato con carga negativa que interactúan con macromoléculas de la saliva y del

líquido gingival con carga positiva, conduciendo a la formación de enlaces

iónicos (1,5,6). El dextrano es el polisacáridos de origen bacteriano de mayor

prevalencia; a medida que va aumentando la composición mineral se va

calcificando la placa y se da paso a la formación del sarro. El gel hidratado que

cubre la biopelícula cumple la función de barrera para algunos microorganismos

que no hacen parte de la microbiota oral. Al no realizarse una higiene oral

adecuada se empieza a formar una capa de color grisácea sobre la superficie

dentaria. Los depósitos de placa se forman preferiblemente en hendiduras y

71

fisuras de la estructura dental. En la figura 2.4 se realiza una describción del

proceso de formacion de la placa dental. (4,12,19,22).

Figura 2.4. Proceso de formacion de la placa dental.

2.6.2 Colonización primaria: Se lleva a cabo cuando las bacterias se unen a

glicoproteínas que hacen parte de la película adquirida. El primer colonizador

que se encuentra en los dientes es Streptococcus sanguis por la utilización de

enlaces tipo lectina-carbohidrato. Posteriormente otros microorganismos

colonizan el diente mediante enlaces débiles reversibles con la película y se

empiezan a desarrollar procesos de agregación y coagregación. Especies de

Veillonella, que sobreviven a partir del lactato que producen otras bacterias y

que además poseen mecanismos de protección contra el O2 por medio de a

enzima superóxido dismutasa, forman parte de los microorganismos que se

coagregan. En esta fase la microbiota de la placa esta conformada

principalmente por cocos Gram-positivos y pocos anaerobios estrictos de las

especies de Prevotella, Porphyromonas y Fusobacterium. Con el proceso de

72

multiplicación va aumentando el numero de microorganismos que es capaz de

adaptarse a este ambiente.

2.6.3 Colonización secundaria: comienza en promedio cinco días después de

que se lleva a cabo la colonización primaria, cuando los microorganismos

aerobios comienzan a proliferar y aumenta el numero de las bacterias

anaerobias estrictas que invaden las zonas mas profundas en donde hay poco

O2.

2.6.4. Placa madura: ocurre cuando la placa se hace dura y se encuentra unida

firmemente a la estructura dental. Los microorganismos que mas predominan

son los anaerobios estrictos o anaerobios facultativos. En la tabla 2.3 se realiza

una descripcion de los microorganismos que se pueden encontrar en la

colonizacion primaria, colonizacion secundaria y los microorganismos que

predominan en la placa madura o final.

Tabla 2.3. Composicion microbiana en la formacion de placa dental

Colonización primaria

• Streptococcus sanguis

• Streptococcus mutans,

• Streptococcus mitis, Actinomyces viscosus,

• Corynebacterium matruchotii

• Veillonella spp., Prevotella spp.

• Fusobacterium nucleatum

Colonización secundaria

• Actinomyces viscosus

• Streptococcus mutans

• Lactobacilos

Placa madura

• Micrococcus spp., Peptrostrestococcus spp.

• Veillonella spp., Propionibacterium spp.

• Corynebacterium matruchotii

• Prevotella spp., Porphyromonas spp.

• Fusobacterium nucleatum

2.6.5. Fase de mineralización: Transcurrido cierto tiempo la placa madura

llega a un proceso de mineralización y da origen a cálculo, tártaro o sarro, que

73

son depósitos calcificados localizados habitualmente en las hendiduras

existentes en medio de los dientes y que se caracterizan por tener un color

amarillo o café . En la tabla 2.4 se explican las tres teorias de mineralizacion de

la placa dental (2,4,12,19) .

Tabla 2.4. Teorías de mineralización de la placa dental

TEORIAS DE MINERALIZACIÓN

• Saturación de

sales en la saliva

que pueden

precipitar a pH

alcalino

• El sistema amortiguador de la cavidad oral esta

formado por el bicarbonato que aumenta el pH por

medio de la disminución de calcio y fosfato en forma

ionizada.

• Sistema

Pirofosfato-

Pirofosfatasa

• Algunas bacterias producen pirofosfato que bloquea

los depósitos de Calcio y Fosforo disminuyendo el

proceso de calcificación del cálculo; pero cuando

libera pirofosfatasa facilita el proceso de

mineralización de la placa dental

• Microcristales

intracelulares

• Están formados por:

Hidroxiapatita- Ca10(OH)2 (PO4)6

Whitlockita Ca(PO4)2

Fosfato octocálcio Ca8H2 (PO4)6

Brushsita CaHPO4 X 2H2O

2.7 RESPUESTA INMUNE CONTRA LA PLACA DENTAL.

Como se dijo previamente, la placa dental está formada por una comunidad

microbiana muy compleja, entre los que destacan los cariogénicos y los

relacionados con la enfermedad periodontal. En la placa dental se encuentran

también componentes microbianos como los lipopolisacáriods, dextranos y

ácidos lipoteicoicos que pueden tener efectos inmunopotenciadores o

inmunosupresores sobre la respuesta inmune (9).

Para que se induzca una respuesta inmune a los componentes de la placa

dental, estos deben ser absorbidos por la encía, proceso en el que su tamaño o

peso molecular es decisivo. Cuanto menor sea el peso molecular de un antígeno

más fácil será su adsorción. Tras la adsorción, los antígenos de la placa dental

74

estimularán una gran variedad de mecanismos inmunológicos que incluyen la

síntesis de anticuerpos, la activación del complemento, la fagocitosis y la

activación de los linfocitos T y B. Del resultado de esta respuesta inmune

dependerá que se desarrollen o no la caries dental y la enfermedad periodontal

(23).

La respuesta inmune frente a los componentes de la caries dental depende del

estado de maduración del sistema inmune del individuo. El sistema inmune va

madurando durante el desarrollo fetal y a los 4 meses ya se detecta el factor C3

del complemento y actividad de los linfocitos T. Al nacer se detectan niveles

séricos de IgG en el recién nacido, que han sido transferidos por la madre, y que

son importantes en la protección frente a los primeros colonizadores orales como

Lactobacillus y Veillonella. Estos anticuerpos maternos desaparecen a los 5

meses del nacimiento. Para cuando Streptococcus mutans comienza a colonizar

la cavidad oral (al aparecer la primera dentición) . La respuesta celular del recién

nacido a los antígenos de la placa dental refleja la sensibilización materna. Se ha

demostrado que la acumulación de la placa produce una respuesta inflamatoria

en la encía que tiene como consecuencia la activación de los linfocitos T y B

frente a los antígenos de la placa dental. (23).

75

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78

CAPITULO III

MICROORGANISMOS IMPORTANTES EN

CARIES DENTAL

Ecológicamente, la caries dental es considerada consecuencia de un

desequilibrio en el ecosistema oral que lleva al predominio de una flora, antes

considerada normal en cavidad oral y ahora convertida en patógena. Como se

sabe, la caries dental es un proceso patológico infeccioso, multifactorial,

localizado, poseruptivo y transmisible que destruye los tejidos duros dentales.

Los principales microorganismos asociados a la producción de caries son en

orden de frecuencia: 1. Streptococcus mutans ( principalmente el serotipo c) y en

menor proporción S. sobrinus y S. gordonii; y 2. especies de Lactobacillus y

Actinomyces. En general en la comunidad científica hay consenso en señalar a

S. mutans como el microorganismo más importante en caries dental, y por lo

tanto las estrategias de aislamiento, identificación, tipificación, prevención y

control van dirigidas principalmente hacia el (13).

Estos microorganismos pueden colonizar la cavidad oral por cambios de pH que

es influenciado por el metabolismo bacteriano sobre sustratos obteniendo como

producto final acidos. Cuando existe esta alteración en la cavidad oral hay la

posibilidad de que microorganismos como el Sreptococcus mutans, inicien el

proceso de la formación de la caries; posteriormente es el Sreptococcus sanguis

el que permanece y facilita la colonizacion de otras especies que pertenecen al

Genero de Actinomyces y Lactobacillus. El proceso de formacion de caries

dental es el que define que microorganismo va a ser el colonizador final; por las

caracteristicas ambientales donde se desarrolle el proceso cariogenico y las

caracteristicas microbiologicas del microorganismos que esta en capacidad de

vivir en un ambiente aerobico o anaerobio. En la tabla 3.1 se describen los

microorganismos relacionados con la caries dental donde se clasifican por su

morfologia y coloracion de Gram (8).

79

Tabla 3.1 Microorganismos relacionados con caries dental

3.1 CARIES DENTAL

La caries dental se considera como una enfermedad infecciosa crónica que con

lleva a una destrucción progresiva e irreversible del diente. En este proceso se

encuentran implicados diversos factores que favorecen su desarrollo, entre

ellos destacamos: 1. Dieta rica en hidratos de carbono con elevada actividad

cariogénica, 2. La susceptibilidad del diente, 3 La presencia de microorganismos

cariogénicos (especies de Streptococcus, Actinomyces, Lactobacillus).

En una primera fase del proceso de formacion de la caries es reversible; si la

lesión progresa se forma una cavidad que permite el acceso de los

microorganismos a las capas internas del diente; facilitando el ingreso de estos

microorganismos hasta el nervio, produciendo inflamación, necrosis pulpar y por

último destrucción de la pieza dentaria. Las lesiones cariosas son el resultado

de la disolución mineral de los tejidos duros del diente por los productos finales

del metabolismo ácido de aquellas bacterias capaces de fermentar

carbohidratos, en especial, azucares (2,9-12,19)

3.1.1 Factores de riesgo: La caries dental es una patología infecciosa

multifactorial, por tal motivo al realizar la evaluación de un paciente para

determinar el riesgo de presentar caries; se deben considerar ciertos factores

que pueden ayudar con el proceso de formación de caries. Estos factores se

encuentran asociados a la dieta que consume diariamente la persona y la

COCOS GRAM POSITIVOS BACILOS GRAM POSITIVOS

Streptococcus mutans Lactobacillus casei

Streptococcus sobrinus Lactobacillus fermemtum

Streptococcus sanguis Lactobacillus oris

Lactobacillus plantarum

Actinomyces israelii

Actinomyces naslundii

80

higiene bucal; facilitando que aquellos microorganismos que se encuentran

presentes en la saliva y placa dental, aumenten su actividad cariogénica. En la

figura 3.1 se describe el proceso de formacion de la caries dental cuando en el

diente se ha adquirido la pelicula; el S. mutans realiza su adhesion por medio de

proteinas de adhesion celular y la produccion de polisacaridos extracelulares por

la accion de la enzima Glucosil transferasa. El S. mutans puede realizar la

produccion de polisacaridos extracelulares por realizar el metabolismo a partir de

carbohidratos como la sacarosa obteniendo como producto final de su

metabolismo acidos que desmineralizan el diente (9,22).

Figura 3.1. Proceso de formacion de la caries dental

3.2 GENERO STREPTOCOCCUS

Son bacterias de morfología de cocos Gram positivos que se encuentran en

cadena, no posee catalasa y son anaerobios facultativos. Esta tolerancia al

oxigeno se ve favorecida por enzimas peroxidasas de tipo Flavínica y

pseudocatalasa, los Streptococcus crecen a una temperatura optima de 37º C y

algunos tienen la capacidad de crecer en medios como bilis esculina y crecen en

81

altas concentraciones de Cloruro de sodio. Muchos de los microorganismos que

hacen parte de este género tienen un metabolismo fermentativo como producto

final se obtienen ácidos que disminuyen el pH. En la tabla 3.2 se realiza

unabreve describcion de algunas caracteristicas de diferenciacion entre Generos

(17).

Tabla 3.2 Caracteristica de diferenciacion entre genero

Genero Vancomicina Catalasa Gas-Glucosa

LAP PYR Hidrólisis esculina

NaCl 6.5%

Arginina dihidrolasa

Streptococcus S - - + - V V V Enterococcus S - - + + + + V Lactococcus S - - + + +- V - Aerococcus S - - V V - + -

Gemella S - - V V - - - Vagococcus S - - + + + +- V

A nivel estructural del microorganismo se pueden encontrar partes de interés

como son:

� Ácidos teicoicos y lipoteicoicos: Los ácidos teicoicos se encuentran

estrechamente relacionados con la mureina y se conocen también como

la parte antígenica a nivel estructural de la bacteria. En el caso contrario

los ácidos lipoteicoicos forman una malla fibrilar asociada a las proteínas

parietales que favorecen la adhesión de estos microorganismos a las

células del huésped.

� Carbohidratos parietales: Los carbohidrtaos parietales se encuentran

situados fuera de la mureina y su principal función es favorecer la

adhesión, agregación y coagregacion bacteriana en las células del

huésped.

� Proteínas parietales: Estas proteínas cumplen funciones como ser parte

de la partícula antigénica del microorganismo, función enzimatica como la

glucosil y fructosiltransferasa; actúan como adhesinas o fijan la película

adquirida a las estructuras dentarias duras.

� Fimbrias: Sirven como puente de unión entre las estructuras dentarias y

bacterianas.

82

� Capsula: La capsula sirve como mecanismo de protección frente a

cambios bruscos del medio ambiente. Puede estar formada por

componentes como acido hialurónico o polisacáridos.

� Glicocálix: Esta estructura se encuentra formada por glucanos y

fructanos que ayudan en la adhesión y formación de la placa dental.

Los microorganismos que hacen parte de este genero se pueden clasificar por

tipo de hemólisis en Agar sangre de cordero, características nutricionales,

características fisiológicas.

� Tipo de hemólisis: El tipo de hemólisis se puede evidenciar en el

momento de que se cultiva al microorganismo en un Medio de Agar

Sangre de cordero al 5% donde la bacteria en estudió se siembra por

aislamiento permitiendo la identificación de hemólisis si corresponde

alfa, beta o gamma .

� Características fisiológicas: El estudio de las características

fisiológicas se puede lograr a través del estudio de algunas pruebas que

facilitan la orientación hacia la especie y genero pero en ocasiones se

tiene dificultad debido a que no todos los laboratorios cuentan con estos

sistemas de identificación comerciales dirigidos específicamente para la

identificación de especie.

� Características nutricionales: Las características nutricionales nos

ayudan en el momento de realizar la recuperación y aislamiento de un

microorganismos que proviene de una muestra clínica (8-9,17, 27).

3.2.1 Grupo streptococcus viridans: A este grupo pertenecen principalmente

los microorganismos que habitan en la cavidad oral y se encuentran

directamente relacionados con la colonización de estructuras dentarias. Su

implicación patógena se encuentra estrechamente relacionada a la formación de

procesos odontogénicos como la formación de placa dental y caries dental. En

este grupo se puede encontrar al Streptococcus mutans, Streptococcus oralis,

Streptococcus salivarius, Streptococcus milleri. En la tabla 3.3 se realiza la

clasificacion del grupo de Streptococcus viridans.

83

A nivel de la cavidad oral se pueden destacar como principales factores de

virulencia los siguientes:

� Síntesis de polisacáridos extracelulares.

� Síntesis de polisacáridos intracelulares.

� La capacidad que tiene para disminuir el pH acidificándolo como

consecuencia del metabolismo bacteriano.

Tabla 3.3 Clasificacion del grupo de Streptococcus mutans

Grupo Hidrólisis arginina

Hidrólisis esculina

VP Acido- manitol

Acido-sorbitol

Ureasa Nombres

s. mutans - + + + + - S. Mutans S. Sobrinus S. Cereus

S. Sanguis

+ + - - - - S.Sanguis S. Parasanguis S. Gordonii S. Crista

S mitis - - - - - - S. Mitis S. Oralis

S. salivarius

- + + - - V S. Salivarius S. vestibularis

3.2.2 Grupo Mutans: Este grupo esta constituido por muchas especies pero los

que mas tienen relevancia a nivel oral son el Streptococcus mutans y el

Streptococcus sobrinus. La pared bacteriana de estos microorganismos esta

formada por glucosa, ramnosa, y galactosa. Son anaerobios facultativos; en el

momento de realizar una siembra en el medio de cultivo Agar Sangre se puede

observar una hemólisis α y ß.

El sustrato que más relevancia tiene en su metabolismo es la sacarosa; este

carbohidrato facilita la disminucion del pH por la produccion de acidos; al mismo

tiempo ayuda a la síntesis de polisacáridos intracelulares y extracelulares

bacterianos. La sacarosa es utilizada en su mayoría como sustrato energético

84

bacteriano para llevar a cabo todos sus procesos metabólicos. Cuando el

microorganismo tiene en su interior la sacarosa 6-P esta es degradada

rápidamente por enzimas de tipo invertasas que tiene la función de convertir

esta sacarosa en fructuosa y glucosa fosforilada para que sigan la vía de

Embden-Meyerhof-Parnas obteniendo finalmente lactato y en bajas cantidades

formato, acetato y etanol. En la figura 3.2 se describe el proceso metabolico

bacteriano a partir de la sacarosa por la via de Embden-Meyerhof-Parnas.

Para que las bacterias puedan utilizar la vía Embden- Meyerhof- Parnas deben

llevarse a cabo una secuencia de reacciones bioquímicas; las cuales se

mencionaran a continuación:

� Fosforilar la sacarosa para que pueda ser degradada internamente.

� Sacarosa-6-P es hidrolizada por la enzima hidrolasa sacarosa-6-P para

que se convierta en Glucosa-6-P.

� Glucosa-6-P por medio de una isomerasa es convertida en Fructuosa-6-

P.

� Fructuosa-6-P posteriormente por una fosfofructosinasa se le adiciona un

grupo fosfato convirtiéndola en Fructuosa 1-6 bifosfato.

� Fructuosa 1-6 bifosfato es convertido a gliceraldehido-3-P por la acción

de una aldolasa.

� Gliceraldehido-3-P después de varias reacciones bioquímicas en la que

intervienen enzimas como fosfogliceratocinasa, enolasa, se obtiene el

fosfoenolpiruvato.

� Fosfoenolpiruvato que por medio de la piruvatocinasa se obtiene el

piruvato.

� El piruvato puede ser convertido en lactato o formato dependiendo de la

actividad enzimática que actúe sobre el piruvato.

� Cuando actúa la enzima piruvato formato liasa sobre el piruvato se

obtiene finalmente formato.

� Pero cuando actúa la enzima lactato deshidrogenasa sobre el piruvato

finalmente se va a obtener lactato.

Hay que tener en cuenta que las reacciones metabólicas bacterianas se pueden

ver influenciadas por la cantidad de sustratos o por enzimas reguladoras del

proceso metabólico. Es importante citar el ejemplo de la piruvatocinasa; la cual

85

en concentraciones altas de sacarosa a nivel intracelular y extracelular, las

reacciones enzimáticas no son capaces de degradar los productos intermedios

de la glicolisis que al no ser eliminados pueden llegar a ser tóxicos para el mismo

microorganismo (19).

Figura 3.2. Ruta Embden- Meyerhof - Parnas utilizada por los Estreptococos

Estas bacterias pueden contar con dos mecanismos de transporte interno que es

sistema fosfoenolpiruvato fosfotransferasa y el sistema ligado a permeasas.

� SISTEMA FOSFOENOLPIRUVATO FOSFOTRANSFERASA: En el

sistema fosfoenolpiruvato fosfotransferesa se necesita la participación de

un complejo fosfotransferasa el cual esta formado por una proteína

86

enzimatica soluble denominada (PES), una proteína ligada a la

membrana bacteriana denominada (PEM) y una proteína de bajo peso

molecular (PBPM) que se puede fosforilar en el momento que sea

necesario (1,19).

El complejo fosfotransferasa cumple un papel importante en la

transferencia de un grupo fosfato al sustrato de la sacarosa para que

pueda ser internalizado y utilizado en el interior de la bacteria. La proteína

enzimatica soluble realiza la transferencia del grupo fosfato que

pertenece al fosfoenolpiruvato a la proteína de bajo peso molecular; la

cual es fosforilada pero a la vez por medio de la proteína ligada a la

membrana bacteriana transfiere el grupo fosfato al sustrato que se desea

metabolizar como es el caso de la sacarosa que se convierte en

sacarosa-6-P para que sea mas fácil su utilización en el interior de la

bacteria. La enzima piruvatocinasa juega un papel muy importante en el

sistema fosfoenolpiruvato fosfotransferasa; debido a que en bajas

concentraciones extracelulares de glucosa-6-P o sacarosa y fructuosa 1-6

diP se inhibe la función de esta enzima por tanto no se puede internalizar

ningún sustrato energético mientras que con grandes concentraciones de

sacarosa extracelular se puede internalizar la que sea necesaria como

fuente energética. En la figura 3.3 se describe el funcionamiento del

Sistema fosfoenolpiruvato fosfotransferasa (1,19).

Figura 3.3 Sistema fosfoenolpiruvato fosfotransferasa.

� SISTEMA DE TRANSPORTE LIGADO A PERMEASAS: Este sistema

se activa cuando hay altas concentraciones extracelulares de sacarosa,

87

obteniéndose como parte del producto final la liberación de electrones

que son transferidos al NAD+, con el fin de obtener moléculas de alta

energía como es el ATP a partir del ADP. Este tipo de energía se

conserva en la célula gracias al potencial eléctrico que se genera a través

de la membrana por medio de la utilización de cadenas transportadoras

de electrones donde se pierde gran cantidad de energía mediante

ATPasas que requieren la utilización de Ca++ y Mg++; facilitando el

intercambio de iones Na+ y PO43-. Estos microorganismos tienen la

capacidad de producir ácidos (acidogénesis), crecer a pH ácido

(acidofilia) disminuir el pH al pH acido (poder acidúrico); son factores que

ayudan a que los microorganismos que hacen parte del grupo Viridans

tengan la propiedad de ser cariogénicos es decir producir caries dental.

(19)

En el grupo de Streptococcus viridans se encuentrn varias especies involucradas

en craies dental; estos microorganismos se pueden diferenciar por los productos

de su metabolismo.

� Streptococcus mutans: Pertenece al grupo viridans que llevan a cabo

alfa hemólisis; producen polisacáridos extracelulares a partir de la

sacarosa. S. mutans, microorganismo Gram-positivo, fue aislado e

identificado por Clarke en 1924 a partir de lesiones cariosas en humanos.

Lo denominó S. mutans por las formas mutantes en que se presenta,

cocobacilo (forma ovalada) en un medio ácido y coco (forma redonda) en

un medio alcalino. En cultivos de agar sangre las colonias de este

microorganismo son fácilmente diferenciadas: altas, convexas,

pulvinadas, y mucoides, de 0.5 a 1 m.m de diámetro, y opacas con un

aspecto que recuerda al vidrio esmerilado. Esta bacteria es anaerobica

facultativa, es decir que puede utilizar el oxígeno para su crecimiento

pero si este no está presente también puede sobrevivir; sin embargo, su

crecimiento óptimo ocurre en anaerobiosis. En forma concomitante con la

síntesis de dextrano a partir de la sacarosa, las colonias de este

microorganismo emiten un exudado acuoso en la superficie del medio de

cultivo a menudo lo suficientemente abundante para que corra y forme un

charco en torno a la colonia. En medios de cultivo con sacarosa este

microorganismo puede producir polisacáridos extracelulares, adquiriendo

88

una apariencia opaca, rugosa y blanca, no adherente al medio de cultivo

y ocasionalmente rodeada por polímeros de glucano de aspecto húmedo.

Estos estreptococos no hidrolizan el almidón y fermentan la inulina,

rafinosa, manitol y sorbitol.

Estas bacterias se caracterizan por llevar a cabo adhesión, agregación y

posteriormente coagregacion; además metabolizan polisacáridos de tipo

glicógeno (reserva para situaciones de stress), producen dextranasa,

fructanasas y glucogeno fosforilasa, que son enzimas extracelulares que

van a degradar dextranos y fructanos en el exterior. El Streptococcus

mutans tiene la capacidad de sintetizar polisacáridos intracelulares. (7,14)

El Streptococcus mutans posee proteínas parietales que se pueden

liberar al exterior favoreciendo el proceso de adhesión y formación de la

biopelícula. Este microorganismo coloniza principalmente superficies

dentarias como el esmalte y cemento dentario, con la capacidad de

producir daño a nivel de las estructuras internas del diente.

Varios de los sistemas de patogenicidad del Streptococcus mutans se

fundamentan en su poder ácidofilo, acidógeno y acidúrico. Esta bacteria

es capaz de metabolizar azucares obteniendo productos finales como

ácido láctico y ácidos orgánicos que tienen un efecto de post Ph corto.

Este efecto en el pH favorece a los microorganismos que no son capaces

de adaptarse en medios acidos y las bacterias disminuyen su

metabolismo (concentracion de acidos), y el pH se vuelve básico para lo

cual la bacteria se recupera rápidamente.(28)

1. Adquisición de S. mutans: S mutans se encuentra en forma

permanente en la cavidad oral después de la erupción dental,

debido fundamentalmente a que requiere la presencia de tejido

duro no descamativo para su colonización. La principal fuente de

adquisición y transmisión de S. mutans en los niños es a partir de

la saliva de sus madres. Estas evidencias provienen de diferentes

estudios que han demostrado un idéntico patrón de DNA

cromosomal en las bacterias de los niños y sus madres. Por todo

lo anterior es importante recordar que S. mutans es un

89

microorganismo que forma parte de la flora oral microbiana, por lo

que se puede encontrar tanto en pacientes sin caries como en

pacientes con caries. Actualmente los estudios se dirigen no solo

hacia la búsqueda de S. mutans en saliva y placa dental, sino

hacia la cuantificación de este microorganismo. Diferentes

estudios han mostrado una correlación entre los recuentos de este

microorganismo en la cavidad oral con la prevalencia e incidencia

de la caries. Actualmente el hallazgo de un recuento alto de S.

mutans es un factor de riesgo a tener en cuenta en la prevención

y control de la caries dental (20).

2. Susceptibiliad antimicrobiana: Además de la caries dental e

infecciones piogénicas relacionadas, S. mutans es también un

agente infeccioso muy importante en endocarditis (18). La

participación de este microorganismo en infecciones orales y no

orales ha generado un interés por el conocimiento de su

susceptibilidad a agentes antimicrobianos. Uno de los

procedimientos más adecuados para conocer la susceptibilidad

antimicrobiana de las cepas S. mutans es la determinación de la

concentración mínima inhibitoria (CMI). Los agentes

antimicrobianos más utilizados son: penicilina, amoxicilina,

cefazolina, eritromicina, clindamicina, imipenem y vancomicina.

(1,5,10).

3. Bacteriocinas: Las bacteriocinas son proteínas antibióticas

producidas por una amplia variedad de especies bacterianas. La

supervivencia y proliferación de un microorganismo se puede dar

si este logra eliminar o desplazar a un organismo competente en

su nicho ecológico, en donde la competencia es muy intensa

debido a la diversidad de especies. Se ha sugerido que la función

de las bacteriocinas es la permitir el establecimiento y

permanencia de la cepa que la produce en el nicho que coloniza.

La mayoría de las cepas S. mutans producen bacteriocinas, que

se denominan específicamente mutacinas y que son las que

ejercen acción antagónica o inhibitoria sobre otros

microorganismos del medio oral. Los estudios sobre antagonismo

90

en caries dental empezaron en 1972 con ensayos realizados con

S. mutans y Veillonella alcalescens ; en esta investigación se

demostró que el crecimiento de V. alcalescens en placa dental

estuvo influenciado por el medio ambiente anaeróbico de la placa

y por la cantidad de ácido láctico producido por los organismos

formadores de placa. A través de muchos años ha continuado la

búsqueda de cepas S. mutans con capacidad antagónica y su

aplicación en control microbiológico para desplazar cepas nativas

virulentas de S. mutans. Diferentes investigaciones señalan que la

capacidad antagónica de S. mutans se debe a la producción de

bacteriocinas, por parte de este, que podrían conferir una gran

habilidad para desplazar a cepas nativas de la misma especie en

cavidad oral (4,1516).

� Streptococcus sobrinus: El Streptococcus sobrinus se caracterizan por

una α hemolisis, produce peróxido de hidrogeno, glucanos solubles e

insolubles. No tiene la capacidad de producir polisacáridos intracelulares

pero es mas acidúrico que el Streptococcus mutans. El Streptococcus

sobrinus presenta proteínas superficiales que cumplen la función de fijar

glucanos y servir como adhesión a diferentes estructuras; este

microorganismo tiene la capacidad de inducir la formación de caries a

nivel de superficies lisas, fosas y fisuras interproximales. (1,19)

3.2.3 Grupo oralis: Este grupo esta conformado por el Streptococcus

parasanguis, Streptococcus gordonii, Streptococcus crista, Streptococcus oralis,

Streptococcus mitis; pero la especie mas relevante de este grupo en la cavidad

oral es el Streptococcus sanguis. Todas estas especies tienen las siguientes

características: son α hemolíticos, producen peróxido de hidrogeno, no inician su

crecimiento a pH 5, no sintetizan polisacáridos intracelulares (19).

� Streptococcus sanguis: Esta especie se caracteriza por producir

peróxido de hidrogeno, se pueden observar colonias elevadas de

superficie y bordes lisos en medio MSA, se han podido clasificar tres

biotipos de acuerdo a la capacidad de fermentar rafinosa y amigdalina.

Se caracteriza por producir glucanos solubles pero no tiene actividad

91

dextranasa. Este microorganismo se caracteriza por tener actividad

proteolítica sobre la IgA la cual se utiliza en la cavidad oral como

mecanismo de defensa para bloquear las adhesinas y facilitar su

eliminación al tracto digestivo. Posee una proteína parietales SSP-5 que

le permite adherirse a la película adquirida por medio de receptores de

acido sialico de la mucina absorbida. (19,17)

Para la identicacion de las especie que hacen parte del grupo de Streptococos

viridans se debe relizar una serie de pruebas bioquimicas que orientan la

definicion de especie y genero (figura 3.4).

Figura 3.4 Esquema de identificacion del grupo Streptococo viridans.

92

3.3 BACTERIAS ANAEROBIAS FACULTATIVAS DE INTERES EN LA CAVIDAD ORAL

En este grupo podemos encontrar microorganismos cuyas características

morfológicas al microscopio son bacilos Gram positivos y su característica de

crecimiento es ser anaerobios facultativos; lo que le permite adaptarse ha

ambientes donde existan bajas o altas concentraciones de oxigeno; debemos

recordar que los principales grupos de interés a nivel de caries dental son el

Grupo de Lactobacillus y el Grupo Actinomyces.

3.3.1 Genero Lactobacillus: En este grupo encontramos mas de cuarenta

especies, pero las de relevancia a nivel de la cavidad oral son Lactobacillus

casei, Lactobacillus fermemtum, Lactobacillus oris, Lactobacillus plantarum.

Aunque su metabolismo es heterofermentativo, suelen crecer bien en

atmosferas que contengan entre 5-10% de CO2. Muchas de las especies de

Lactobacillus se encuentran relacionadas con las enfermedades de la cavidad

oral, en esta localización se aíslan preferiblemente de la saliva, dorso de la

lengua, placas supragingivales. (7)

El genero de Lactobacillus se a subdivido a su vez en tres grupos de acuerdo al

metabolismo de hidratos de carbono. En la figura 3.5 se realiza la clasificacion

de Lactobacillus a partir de su metabolismo fermentativo. (17,19)

• Homofermentativos: En sete grupo encontramos a los microorganismos

que a partir de la glucosa siguen la vía Embden-Meyerhof-Parnas,

obteniendo como producto parcial el piruvato. El piruvato por medio de la

enzima lactato deshidrogenasa se obtiene lactato como producto final y

no se origina la producción de CO2. Carecen de todas las enzimas que

intervienen en la ruta de las pentosas fosfato. Las especies de mas

relevancia en la cavidad oral son Lactobacillus salivarus, Lactobacillus

gasseri, Lactobacillus crispatus.

• Heterofermentativos estrictos: Carecen de la enzima aldolasa por lo

cual no pueden completar la vía glucolítica, entoces utilizan la vía de las

pentosas fosfato, produciendo acetato, etanol, formato, lactato y

producción de CO2. Destacándose las especies Lactobacillus fermemtum

y Lactobacillus brevis.

93

• Heterofermentativos facultativos: comienzan la ruta de las pentosas

fosfato a partir de gluconato por que poseen la enzima fosfocetolasa y

gluconato-6-P deshidrogenasa, produciendo acetato, etanol, formato,

lactato y CO2 lo cual se asemejaría al comportamiento de los

heterofermentativos estrictos. Las especies mas representativas son

Lactobacillus casei y Lactobacillus plantarum.

Figura 3.5 Clasificación de Lactobacillus

Las especies que se encuentran en el grupo de homofermentativos tienen poder

acidógeno y acidúrico, iniciando su crecimiento a pH 5, ejercen una débil pero

constante actividad proteolítica; estos microorganismos no se pueden adherir

bien a estructuras lisas por lo cual se adhieren a las superficies dentarias por

que quedan atrapadas en las fisuras dentarias lo que les permite colonizar estas

estructuras.

Las especies que se relacionan con la caries dental no se debe a su poder de

adherencia si no al foco infeccioso que se desencadena en el momento que

quedan atrapados en las estructuras dentarias actuando como microorganismos

secundarios que ayudan al progreso de la caries.

En el momento de realizar un aislamiento en medios de cultivo se debe tener en

cuenta que crecen a una temperatura óptima de 36ºC. El medio que se utiliza

principalmente para su aislamiento es el de Rogosa- Mitchell-Wiseman, que

contiene componentes de glucosa, sacarosa y arabinosa, mezcla de sales,

extracto de levadura, monoleato de sorbitán; las colonias en un medio solido se

94

ven convexas, lisas y con bordes regulares. En la tabla 3.4 podemos encontrar

algunas especies del Genero de Lactobacillus (17,19).

• Lactobacillus acidophilus: Este microorganismo fue aislado por Moro

en el año de 1900 a partir de una muestra de heces fecales de un

lactante, su concentración en el tracto digestivo aumenta según el

porcentaje de consumo de carbohidratos en la dieta. Se caracteriza por

ser un bacilo Gram positivo, bastante gruesos y de longitud variable, con

un metabolismo de anaerobio facultativo, no posee ningún mecanismo de

desplazamiento, no produce espora. Este microorganismo tiene la

capacidad de estar en el tracto digestivo, vagina y cavidad oral. En la

cavidad oral se puede encontrar localizado en la mucosa oral, subgingival

y supragingival, estableciendo una relación en el proceso de formación

de la caries dental. Los antibióticos que se utilizan en tratamiento

profiláctico para Lactobacillus son los β-lactámicos; el Lactobacillus

acidophilus es sensibles a la penicilina por que estos antibióticos inhiben

la síntesis de peptidoglicano de la pared celular.

Estos microorganismos son Gram positivos, pero su coloración depende

del tiempo de vida que lleven en el medio; esto se debe tener en cuenta

debido a que cuando es un cultivo viejo estas bacterias en la coloración

de Gram son fáciles de decolorar y se podrán observar también como

Gram negativas. Estos microorganismos por su actividad metabólica

producen acido pero no gas.

Estas bacterias no realizan el proceso de fosforilación por transporte de

electrones lo que sugiere que la energía la obtiene a partir de la

fosforilación que realiza del sustrato. Algunas especies son capaces de

utilizar el oxigeno por la utilización de flavoproteinas de tipo oxidasa

donde se obtiene como producto H2O2. (10)

El Lactobacillus acidophilus produce vitamina K, lactasa y sustancias

antimicrobianas como acidolina, acidolfina, lactocidina y bacteriocina. La

bacteriocina es denominada AA11 con actividad bacterioproteolítica sobre

péptidos; esta sustancia es termoestable hasta 80ºC, pero es sensible a

la esterilización en autoclave por que pierde su actividad proteolítica.

(3,21)

• Lactobacillus casei: Son bacilos Gram positivos de cadena corta, tienen

como producto final de los carbohidratos acido láctico. Este

95

microorganismo se encuentra en productos lácteos como la leche,

prefiere realizar la fermentación de lactosa.

• Lactobacillus plantarum: Son bacilos gram positivos con un tamaño

aproximado de 0.8 X 3 µ; estos microorganismos se encuentran en la

vegetación, ayudando a la acidificación de productos agrícolas. Tiene la

capacidad de producir acetilcolina. Estos microorganismos no soportan

un pH acido entre 4.0-3.5, por que inactiva sus funciones de acidificación

(23).

Tabla 3.4 Clasificación de especies de Lactobacillus

Prueba L. acidophilus L. casei L. plantarum Β-Hemolisis Negativo Negativo Negativo

Negativo Negativo Negativo

Negativo Negativo Negativo Crecimiento a 15ºC Negativo Crecimiento Crecimiento Crecimiento a 45ºC Crecimiento V V

Manitol Negativo Acido V Rafinosa V Negativo Acido Arginina Negativo Negativo Negativo Esculina Negativo Negativo Negativo

Licuefacción de gelatina (22ºC)

Negativo Negativo Negativo

Indol Negativo Negativo Negativo PYR Negativo Negativo Negativo

3.3.2 Genero Actinomyces: Las bacterias que hacen parte de este grupo se

caracterizan por ser bacilos gram positivos que se pueden observar al

microscopio curvos, rectos, cocobacilos o con ramificaciones; carecen de

movilidad. Son bacterias anaerobias facultativas cuando hay presencia de O2

pero con una atmosfera de CO2 entre el 5-10%; es importante que esta regla no

aplica para las especies de Actinomyces israelii y Actinomyces meyeri por que

son anaerobias estrictas. En el proceso metabólico de estas bacterias se

obtienen productos finales como acido láctico, acido succínico, acido acético . En

la tabla 3.5 se realiza la clasificacion de especies del genero de Actinomyces.

(6,17,19,25)

Tabla 3.5 Clasificacion de especies del genero de Actinomyces

Prueba A. meyeri A israelii A. naeslundii A.odontolyticus A. viscosus

96

Catalasa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

Negativo Variable Negativo Negativo Negativo

Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Hidrólisis Esculina

Negativo Positivo Positivo Variable Variable

Pigmentacion rosa

Negativo Negativo Variable/positivo

Negativo

Manitol Negativo Variable Variable Acido Negativo Sacarosa Ácido Ácido Ácido Ácido

Xilosa Ácido Ácido Variable Variable Variable Maltosa Ácido Ácido Variable Acido Glucosa Ácido Ácido Ácido Ácido Ureasa Variable Negativo Negativo Negativo Negativo

Entre los factores de virulencia que se ven implicados en el proceso cariogénico

son:

• Fimbrias: Estas estructuras sirven como mecanismo de adherencia y

ayudan a iniciar el proceso de agregación y coagregación. Es importante

mencionar que una de las especies que tiene importancia a nivel de la

cavidad oral es Actinomyces naeslundii; en la bacteria Actinomyces

naeslundii se han identificado dos tipos de fimbrias de unión proteína-

proteína y uniones entre lectina y carbohidratos (6).

• Ureasa y Neuraminidasa: La ureasa es una enzima que a partir de la

urea lleva a la producción de amoniaco que elevaría el pH de la placa

dental; en cambio la Neuraminidasa actúa sobre el ácido siálico que

hacen parte de las glicoproteínas salivales, favoreciendo la colonización

de microorganismos primarios pertenecientes al Grupo de Streptococcus,

Grupo Actinomyces.

• Actividad proteolítica: Esta actividad tiene gran importancia en el

momento de que la caries dental avanza a dentina y pulpa, ocasionando

más daño dental.

• Producción de factores de virulencia: En el caso de Actinomyces

naeslundii tiene actividad osteoclástica con reabsorción ósea, elaboración

de sustancias quimiotácticas que actúan sobre los neutrófilos.

97

Al realizar un cultivo de Actinomyces se observan colonias secas, quebradizas,

que se observan filamentosas en los bordes. Crecen en agar sangre y caldo

tioglicolato (tioglicolato sódico como agente reductor). Existen medios selectivos

como el GMC (metronidazol y sulfato de cadmio), CFAT (sulfato de cadmio,

fluoruro sódico, acriflavina neutra, telurito potásico, y fucsina básica). En la figura

3.6 se realiza un esquema de identificacion para las especies de Actinomyces

(25).

Figura 3.6 Esquema de identificacion de especie de Actinomyces

98

Figura 3.7 Esquema de identificacion de microorganismos cariogénicos

99

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103

CAPITULO 4

FACTORES DE VIRULENCIA DE LOS MICROORGANISMOS CARIOGENICOS

El cuerpo humano se encuentra en constante contacto con miles de

microorganismos; algunos forman parte de la flora normal. En algunos casos

estos microorganismos pueden ser factores desencadenantes de enfermedades

a nivel de la cavidad oral; en el desarrollo de este proceso interviene la

capacidad del microorganismo para ocasionar daño en el cuerpo humano,

factores de virulencia que se enfoca en el grado de patogenicidad y la cantidad

necesaria para desencadenar una respuesta patológica en un lapso de tiempo.

Es importante enfatizar que los factores de virulencia y respuesta inmune del

cuerpo humano varían bajo condiciones de factores internos como la

temperatura, pH.

4.1 FACTORES DE VIRULENCIA

Las bacterias tienen la capacidad de producir enfermedades por dos

mecanismos: Colonización e invasión de tejido y producción de toxinas que se

pueden diseminar en todo el cuerpo humano. El proceso de colonización e

invasión de tejido solo se puede llevar a cabo si el microorganismo puede

sobrevivir a las condiciones del medio en que se encuentran sumergidos,

adaptándose a los cambios físicos y químicos que se realizan en la cavidad

bucal. Cuando estos microorganismos se adaptan, están en la capacidad de

utilizar los sustratos que se encuentran subyacentes a ellos para obtener energía

y al mismo tiempo multiplicarse, realizar el metabolismo necesario para subsistir.

En el proceso metabólico que realizan las bacterias utilizan principalmente

carbohidratos de tipo monosacárido y disacárido; que son introducidos al interior

de la bacteria por los dos mecanismos que se mencionaron anteriormente. En el

momento de existir una suspensión de aporte exógeno de carbohidratos, estas

bacterias utilizan los polisacáridos intracelulares y extracelulares que ellas

104

mismas han producido como es el caso de Streptococcus mutans, Lactobacillus

acidophilus, Actinomyces naeslundii, etc. En el momento de que algunos

microorganismos que ya se mencionaron encuentran las condiciones adecuadas

para colonizar las estructuras de la cavidad bucal, empiezan a replicarse y

aumentar el metabolismo con el fin de acidificar el pH para permitir su posterior

colonización.

Algunas de las características que son relevantes en el proceso de colonización

y replicación son: poder acidofílico, acidogenico, acidúrico, producción de

polisacáridos intracelulares, producción de polisacáridos extracelulares, síntesis

de glucanos y fructanos, proteínas de adhesión celular.

4.1.1 Acidofilo: Poder ácidofilo (reproducirse en pH ácido), el Streptococcus

mutans crece en hábitat que manejen pH bajos. Estas especies de

estreptococos manejan grandes cantidades de ATPasas asociadas a la

membrana que tiene la capacidad de funcionar a pH ácidos favoreciendo el

intercambio de H+ disminuyendo la acidificación intracelular.

4.1.2 Acidogénico: La propiedad acidogenica se realiza a partir de la enzima

lactato deshidrogenasa, la cual se encarga de convertir el propionato a lactato,

pero cuando el hidrato de carbonato es utilizado por las bacterias para producir

formato, acetato y etanol. El acido que es mas importante en el proceso

metabólico es el acido láctico debido a que se encuentra implicado en la

formación de caries dental a partir del principal azúcar con propiedades

cariogénicas como es la sacarosa; sirviendo como fuente para la obtención de

polisacáridos extracelulares.(4,5,7)

4.1.3 Acidúrico: El Streptococcus mutans crece en hábitat que manejen pH

bajos. Estas especies de estreptococos manejan grandes cantidades de

ATPasas asociadas a la membrana que tiene la capacidad de funcionar a pH

ácidos favoreciendo el intercambio de H+ disminuyendo la acidificación

intracelular; ete proceso se conoce como acidurico.

4.1.4 Producción de polisacáridos extracelulares: Los polisacáridos

extracelulares se obtienen a partir del sustrato de la sacarosa, como son los

glucanos hidrosolubles (dextranos), glucanos hidroinsolubles (fructanos). La

formación de estos polisacáridos depende de varias enzimas extracelulares de

tipo glucosiltransferasa (GTFS) y fructosiltransferasa (FTFS). Este tipo de

105

enzimas se puede encontrar localizado en las superficies bacterianas, en el

medio bucal o absorbido a la película adquirida.

4.1.5 Producción de polisacáridos intracelulares: Los polisacáridos

intracelulares se obtienen después de que se lleva a cabo la hidrólisis de la

sacarosa-6-P se obtienen altas concentraciones de Fructuosa-1,6-diP y otros

productos intermedios de la glicolisis activando una ADP-glucopirofosforilasa que

lleva a la formación de ADP-glucosa que al actuar la enzima glucógeno sintetasa

para obtener glucógeno; este producto sirve de reserva energético cuando no

hay disponibilidad de sacarosa u otro sustrato en el medio. (1,7)

4.1.6 Síntesis de glucanos y fructanos: En este proceso se utilizan enzimas

como la glucosil y glucosil transferasa; estas enzimas se obtienen a partir de

procesos metabólicos que realizan las bacterias a partir de sacarosa, glucosa,

producción de polisacáridos de glucanos y fructanos. La enzima glucosil

transferasa permite la adhesión de bacterias a las estructuras dentarias; además

sirven como mecanismo de evasión al sistema de barrido que realiza el flujo

salival. Un ejemplo que se puede citar es el Streptococcus mutans, que al utilizar

la glucosil transferasa secretada tiene la capacidad de sintetizar glucanos

insolubles y glucanos solubles; la principal función que cumplen los glucanos es

facilitar la agregación bacteriana para formar una matriz extracelular constituida

de polisacáridos que les permite resistir los movimientos mecánicos que se

realizan con el cepillo. La diferencia que se puede establecer entre los glucanos

solubles son mas fácil de degradar y ser utilizados por las bacterias mientras que

los glucanos insolubles son mas difíciles de degradar por las bacterias teniendo

características adherentes y siendo parre fundamental de la matriz acelular de la

placa permitiendo la acumulación de placa bacteriana. (2,4-7 )

4.1.7 Proteínas de adhesión celular: Estas son proteínas antigénicas que se

encuentran localizadas en la pared celular bacteriana e inician el proceso de

adhesión; tienen la capacidad de adherirse a las fibras de colágeno que hacen

parte de las estructuras de la cavidad bucal. Estas proteínas pueden interactuar

con la albúmina, glucoproteinas que hacen parte de la saliva.

4.1.8 Glucosil transferasa: Esta es una enzima que desempeña un papel

importante en los factores de virulencia de microorganismos como el

Streptococcus mutans. La enzima glucosiltransferasa cataliza la síntesis de

106

polisacáridos extracelulares, que favorecen la adhesión bacteriana a las

estructuras de la cavidad oral. Este proceso de metabolismo se realiza en el

momento que la bacteria utiliza los carbohidratos para obtener energía. La

glucosiltransferasa (GTF) es capaz de sintetizar glucano a partir de la glucosa y

la fructosiltransferasa, fructano a partir de la fructosa.

4.1.9 Produccion de dextranasa: La dextranasa ayuda a la movilizacion de

reservas de energia y desempeña un papel importante en la regulacion de la

enzima glucosiltransferasa; por medio de productos finales que se obtiene a

partir de los glucanos.(3,4)

107

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44 Nº 2, pag 331-384.

108

CAPITULO 5

TOMA DE MUESTRA Y MEDIOS DE CULTIVO

Este es un momento de gran importancia en ecología oral microbiana debido a

las grandes posibilidades que existen de entrar a un enorme fondo de

biodiversidad, que está aún en proceso de conocimiento y caracterización.

Aunque el balance químico ecológico depende en gran medida de los

microorganismos, poco se sabe del modo y de la dinámica de los ecosistemas

microbianos responsables de mantener este balance. Una razón crítica del

porque la información en esta materia es tan limitada, es que hasta hace muy

poco los microbiólogos debían cultivar los microorganismos para describirlos. Sin

embargo, únicamente una pequeña porción, menos del 1% de los organismos en

el medio ambiente pueden ser cultivados.

Hay muchas razones que justifican las deficiencias de las usuales estrategias de

cultivo: de hecho condiciones desfavorables nutritivas y de crecimiento, e

intrínsecas interdependencias de muchos microorganismos. Tradicionalmente

los microorganismos han sido caracterizados por su fenotipo, la colección de

propiedades celulares observables tales como morfología, propiedades

fisiológicas (la utilización de nutrientes), y estructura de los componentes

celulares ( tipos de lípidos). Debido a que el cultivo es un pre-requisito para

evaluar tales propiedades, muchos microbios no han podido ser caracterizados

en su hábitat natural. En la actualidad las técnicas de DNA recombinante y

filogenia molecular permiten sobrepasar las limitaciones del cultivo y conocer los

microorganismos del medio ambiente natural que no habían sido descritos. Las

características fisiológicas de los organismos son puntos importantes de

referencia, pero es necesario un concepto más general, cuantitativo, para

describir sistemáticamente la diversidad microbiana. La caracterización

filogenética de un organismo (filotipo) requiere únicamente la secuencia de uno o

más genes. En consecuencia, las diferencias cuantitativas y cualitativas de las

especies microbianas en comunidades naturales, pueden ser estudiadas por

secuenciación de genes del RNAr, obtenidos de DNA aislado directamente de

células en su medio ambiente ordinario. La utilidad del estudio y análisis de

109

comunidades microbianas por estos métodos va mucho más allá del ejercicio

taxonómico, ya que se puede: inferir propiedades de los microorganismos no

cultivables; realizar modelos de medios de cultivo; sintetizar sondas de

oligonucleótiodos para la identificación de morfología, detección de crecimiento

específico en cultivos mixtos, monitorear la distribución en la naturaleza, y

evaluar tasas relativas de crecimiento in situ; identificar fuentes o nichos de otros

géneros; y estudiar la biodiversidad de forma rápida y comprensiva.

Actividades de la microbiología oral

El cumplimiento de las tareas en microbiología oral exige la realización de tres

actividades; la primera de ellas, aislamiento e identificación de microorganismos,

se inicia con el cultivo de las muestras procedentes de la cavidad oral, en medios

específicos y en condiciones definidas, y va seguido de examen microscópico y

pruebas bioquímicas al microorganismo aislado. La segunda actividad involucra

el conocimiento de la resistencia o sensibilidad a antibióticos, biotipificación y

serotipificación. Por último, la tercera actividad involucra la identificación

epidemiológica o comparación de los aislamientos de la misma especie con el fin

de hacer el control de la infección o análisis de población. En los ultimos quince

años esta actividad se ha visto enriquecida con las técnicas de tipificación

molecular basadas en el análisis de DNA, que permiten hacer la identificación de

diferentes clones o grupos de clones (cepas que tienen un alto grado de relación

genética) entre cepas de la misma especie recogidas de diferentes fuentes, sitios

y momento (1,5)

A nivel de microbiología se utilizan medios de cultivo, que se utilizan para la

recuperación de microorganismo y aislamiento de microorganismos patógenos

provenientes de diferentes muestras. Estos medios se caracterizan por tener

componentes que facilitan su recuperación; existes medios que son específicos

para un grupo especial de microorganismos.

5.1 TOMA DE MUESTRAS DE LA CAVIDAD ORAL

Despues de realizar el diagnostico odontologico se procede a tomar muestras de

las diferentes regiones que hacen parte de la cavidad oral; para lo cual se sigue

el siguiente procedimiento:

110

� Se debe aislar la region dental con royos de algodón esteril, con el

proposito de dismunuir la contaminacion y hacer mas facil la toma de

muestra.

� Se procede a tomar muestra con un explorador de la placa bacteriana

observada y de las fisuras en medio de los dientes.

� Las muestras deben ser tomadas de la pare subgingival y supragingival.

� Estas muestras se toman con una cureta periodontal aplicando fuerza en

sentido coronal; se debe aplicar un poco de corriente de aire para facilitar

que se despegue la parte superior de la encia.

� Las muestras obtenidas se colocan en tubos esteriles que contienen 3 ml

de solucion fisiologica esteril.

� Las muestras de placa y saliva se diluyen en forma seriada de 10 en 10

en tubos que contienen tampón fosfato salino 0.05 M.

� Después de mezclar las muestras con el tampón fosfato salino 0.05 M en

vortex durante 30 segundos, se toman 100 ul de cada dilución y se

siembran en cajas de petri con agar mitis salivarius bacitracina (MSB),

Agar Rogosa (Lactobacillus), Caldo de infusion cerebro corazon, agar

Columbia con sangre, Medio con metronidazol y sulfato de cadmio con el

fin de hacer el aislamiento selectivo

� Despues de obtener crecimiento en las respectivas cajas se define si las

bacterias pertenecen al genero de Streptococcus o Lactobacillus y se

realiza coloracion de Gram, pruebas bioquimicas para determinar la

especie. son examinadas por la tinción de Gram y sometidas a las

siguientes pruebas bioquímicas: fermentación de rafinosa, manitol,

melobiosa, trehalosa e inulina; hidrólisis de la esculina en presencia y

ausencia de bilis; ureasa; hidrólisis de la arginina; y resistencia a la

bacitracina (5)

5.2 AGAR COLUMBIA

111

Se emplea para el cultivo y aislamiento de microorganismos en general y en

particular de aquellos que son especialmente exigentes a partir de una amplia

variedad de muestras. Permite la adición de sangre, de componentes selectivos

o factores de crecimiento. Las peptonas aportan la base nutritiva del medio, el

almidón se constituye como fuente de energía, el Sodio Cloruro mantiene el nivel

salino necesario para el buen desarrollo de los gérmenes y la sangre

desfibrinada, que se suele añadir, permite la observación de las reacciones

hemolíticas. A partir de esta base se prepara el agar sangre y el agar chocolate. (2)

5.2.1 Composicion del medio:

• Almidón de Maíz 1,0 g

• Peptona 10,0 g

• Peptona Biotriptasa 10,0 g

• Peptona Músculo Cardíaco 3,0 g

• Sodio Cloruro 5,0 g

• Agar 13,5 g

• Agu destilda 1.000 ml

5.2.2 Preparación: Realizar la suspensión en un matraz aforado de 2.000 ml de

950 ml de agua destilada mas 42, 5 gr (almidón de maíz, peptona, peptona

biotriptasa, peptona de músculo cardiaco, cloruro de sodio, agar), colocar en una

estufa hasta conseguir el punto de ebullición y agitar en varias ocasiones para

facilitar la homogenización del medio. Tapar la boquilla del recipiente con gasa

estéril y una cuerda; esterilizar a 121°C durante 15 minutos y luego se sirven en

cajas de petri.

5.2.3 Control de calidad: Este control se realiza con cepas comerciales

conocidas para observsr el buen funcionsmiento del medio y si se logran

observar los diferentes tipos de hemolisis.

� Neisseria meningitidis (ATCC 13090), buen crecimiento y no se observa

hemolisis.

112

� Staphylococcus aureus (ATCC 25923), buen crecimiento y se observa

una ß hemolisis.

� Streptococcus pneumonie (ATCC 6303), buen crecimiento y se observa

una α hemolisis.

5.3 AGAR ESTREPTOCOCOS KF

Se emplea para el aislamiento de Enterococos en agua, ya sea por siembra

directa o previa filtración por membrana y aplicando el procedimiento

correspondiente. La maltosa y la lactosa son los hidratos de carbono

fermentables, que con la peptona y el extracto de levadura constituyen el

conjunto nutriente del medio. El Sodio Azida es el agente selectivo. La adición

del 2,3,5-Trifenil-2HTetrazolio Cloruro da lugar a que los Enterococos, capaces

de reducirlo, presenten colonias de un color rojo oscuro (2).


• Extracto de Levadura 10,0 g

• Lactosa 1,0 g

• Maltosa 20,0 g

• Mezcla de Peptonas 10,0 g

• Sodio Azida 0,4 g


• Sodio Glicerofosfato 10,0 g

• Agar 20,0 g

5.3.2 Preparación: Realizar la suspensión de 1.000 ml de agua destilada en un

matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 76,4 gr ( extracto de levadura,

lactosa, maltosa, mezcla de peptona, sodio azida, cloruro de sodio, sodio de

glicerofosfato, agar) , colocar en una estufa hasta conseguir el punto de

ebullición y agitar en varias ocasiones para facilitar la homogenización del medio

(hervir durante un min.). Tapar la boquilla del recipiente con gasa estéril y una

cuerda; esterilizar a 121°C durante 10 minutos y luego se sirven en cajas de

petri.

113


conocidas para observar el buen funcionamiento del medio y si se logran


� Esherichia coli (ATCC 25922) no se observa crecimiento.

� Enterococcus faecalis (ATCC 19433), se observar un crecimiento de

colonias rojas.

5.4 AGAR EXTRACTO DE LEVADURA

Los nutrientes de este medio permiten el crecimiento de una gran variedad de

microorganismos (bacterias, hongos y levaduras). Para hacer recuentos de

hongos y levaduras debe suplementarse con antibióticos por ejemplo

Cloranfenicol a razón de 0,05 g por litro de medio (2).



• D-Glucosa 10,0 g

• Agar 20,0 g


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 35 gr ( extracto de levadura, D-

glucosa, agar) , colocar en una estufa hasta conseguir el punto de ebullición y

agitar en varias ocasiones para facilitar la homogenización del medio (hervir

durante un min.). Tapar la boquilla del recipiente con gasa estéril y una cuerda;

esterilizar a 121°C durante 15 minutos y luego se sirven en cajas de petri.




� Esherichia coli (ATCC 25922) se observa buen crecimiento.

� Staphylococcus aureus (ATCC 25923), se observ buen crecimiento.

114

5.5 AGAR GELATINA NUTRITIVA

Antes de emplear el agar como agente gelificante en la elaboración de los

medios de cultivo se empleaba la gelatina. No obstante, presentaba

inconvenientes tales como la presencia de determinados microorganismos que

eran capaces de utilizar la gelatina, el medio se licuaba debido a la producción

de gelatinasa. Actualmente, la capacidad de degradar la gelatina por parte de

algunos microorganismos se utiliza como carácter en la determinación e

identificación oficial (2,3).


• Gelatina 120,0 g

• Peptona de Gelatina 5,0 g

• Extracto de Carne de Res 3,0 g

5.5.2 Procedimiento :

• Sembrar la muestra por picadura. Incubar el medio con el

microorganismo a estudio a 20-22°C, o bien a la temperatura óptima para

el microorganismo.

• Si la incubación se realiza a temperatura superior a los 20-22°C (la

gelatina será líquida) antes de proceder a la lectura los cultivos deben

enfriarse en la nevera para no dar falsos positivos.

• Por regla general se aconsejan incubaciones máximas de 14 días con

lecturas cada 3, pero debe tenerse en cuenta que ciertos organismos

pueden tardar hasta varios meses en licuar la gelatina.


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 128 gr ( gelatina, peptona de gelatina

y extracto de carne de res) , colocar en una estufa hasta conseguir el punto de


(hervir durante un min.). Se dicionan en tubos can, se tapa la boquilla del tubo

con algodon; esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

115




� Esherichia coli (ATCC 25922) se observa buen crecimiento y gelatinasa

negativo.

� Staphylococcus aureus (ATCC 25923), se observa buen crecimiento y

gelatinasa positivo.

5.6 AGAR MAN-ROGOSA-SHARPE

Se emplea para el cultivo y recuento de Lactobacilos, tanto en productos lácteos

como en productos alimenticios en general. Si se acidifica a pH=5,5 ±0,1 permite

el recuento de los Lactobacilos propios del yogur. Man, Rogosa y Sharpe

desarrollaron este medio con el propósito específico de emplearlo para el cultivo

de Lactobacilos en productos derivados de la leche, aunque no por esto deja de

estar indicado en otras aplicaciones.

Por la presencia de la peptona, glucosa, manganeso y magnesio se aportan los

componentes nutritivos y energéticos para el crecimiento de los Lactobacilos. El

di-Amonio Hidrógeno Citrato inhibe el crecimiento de la mayor parte de

gérmenes contaminantes. El di-Potasio Hidrógeno Fosfato se emplea para

estabilizar el pH del medio. De esta manera este medio es ideal para el

crecimiento masivo de todas las cepas de Lactobacilos, incluso aquellas de

crecimiento lento y difícil. El crecimiento también puede mejorarse reduciendo el

pH hasta 5,5 aproximadamente, sin embargo, se dificulta la gelificación del

medio (2,5)


• Di-Amonio Hidrógeno Citrato 2,0 g

• Extracto de Carne 8,0 g


• D-Glucosa 20,0 g

• Magnesio Sulfato 0,2 g

• Manganeso(II) Sulfato 0,05 g

116

• Peptona Bacteriológica 10,0 g

• di-Potasio Hidrógeno Fosfato 2,0 g

• Sodio Acetato 5,0 g

• Tween 80 1,0 g

5.6.2 Procedimiento:

• Sembrar la muestra en la superficie o por incorporación.

• Para la preparación en doble capa añadir a 1 ml de muestra a analizar,

15 ml del medio fundido a 45ºC, mezclar bien y dejar solidificar. Una vez

gelificado cubrir con una capa del medio fundido y dejar solidificar de

nuevo.

• De esta manera se obtiene una preparación en doble capa.

• Incubar en atmósfera al 5% de anhídrido carbónico a 37ºC de 2 a 3 días.

• Los microorganismos obtenidos deberán ser identificados por otros

métodos.


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 62 gr ( Di-Amonio Hidrógeno Citrato,

Extracto de Carne, Extracto de Levadura, D-glucosa, Sulfato de Magnesio,

Sulfato de Magnesio II, Peptona Bacteriológica, di-Potasio Hidrógeno Fosfato,

acetato de sodio, tween 80) , colocar en una estufa hasta conseguir el punto de


(hervir durante un min.). Tapar la boquilla del recipiente con gasa estéril y una

cuerda; esterilizar a 121°C durante 12 minutos y luego se sirven en cajas de

petri.




� Lactobacillus acidophilus (ATCC 9224) se observa buen crecimiento.

� Esherichia coli (ATCC 25922) se observa un crecimiento moderado.

5.7 AGAR MUELLER-HINTON

117

Se emplea para ensayos de sensibilidad de los microorganismos frente a

antibióticos y sulfamidas. También en aislamiento primario de Gonococos y

Meningococos. En la preparación de este medio es fundamental que las

concentraciones de timina, timidina y ácido 4-aminobenzoico, sean lo suficiente

bajas para no inhibir la actividad antibacteriana de antibióticos y sulfamidas. Las

dos primeras inhiben los antibióticos y el último las sulfamidas. El ensayo de

sensibilidad de un microorganismo frente a un antibiótico se puede realizar sobre

placas de agar Mueller-Hinton por procedimientos de difusión, por diluciones

seriadas o por técnicas turbidimétricas en el Caldo Mueller-Hinton. En las

técnicas de difusión se mide el halo de inhibición del crecimiento confluente

alrededor del depósito de antibiótico (discos, torrecillas, etc.). El diámetro del

círculo de inhibición es inversamente proporcional a la concentración mínima

inhibitoria (CMI) del agente antibacteriano (2)


• Almidón 1,5 g

• Infusión de Carne (a partir de 300 g) 2,0 g

• Peptona de Caseína Hidrolizada 17,5 g

5.7.2 Procedimiento

• El antibiograma debe ser efectuado sobre cultivos puros.

• En las técnicas de difusión se inoculan las placas de Agar para que

formen un confluente.

• Los discos u otros contenedores del antibiótico deben apoyarse sobre el

medio de manera que queden adheridos a él. Incubar a la temperatura

óptima del microorganismo durante 24 horas.


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 38 gr ( almidon, peptona de caseina

hidrolizada e infusion de carne,) , colocar en una estufa hasta conseguir el punto

de ebullición y agitar en varias ocasiones para facilitar la homogenización del

medio (hervir durante un min.). Se adiciona a cajas de petri, esterilizar a 121°C

durante 15 minutos.

118




� Esherichia coli (ATCC 25922) se observa buen crecimiento .

� Staphylococcus aureus (ATCC 25923), se observa buen crecimiento.

5.8 AGAR ROGOSA

Se emplea para el cultivo selectivo de Lactobacilos en microbiología médica y

alimentaria, principalmente en carnes, productos alimentarios y muestras clínicas

(orales, vaginales y fecales).

Con la triptona y el extracto de levadura se aportan los nutrientes, con el sorbitán

monooletato se suministran los ácidos grasos necesarios para el desarrollo de

los Lactobacilos, con los azúcares se le da contenido energético, con el di-

Amonio Hidrógeno Citrato y el Sodio Acetato se consigue la inhibición de la

mayor parte de los gérmenes contaminantes y con un ajuste del pH a 5,4 se

potencia este efecto inhibidor (2)

5.8.1 Componentes del medio:

• Di-Amonio Hidrógeno Citrato 2,0 g

• Arabinosa 5,0 g


• D(+)-Glucosa 10,0 g

• Hierro(II) Sulfato 0,03 g

• Magnesio Sulfato 0,57 g

• Manganeso(II) Sulfato 0,12 g

• Potasio di-Hidrógeno Fosfato 6,0 g

• Sacarosa 5,0 g

• Sodio Acetato 15,0 g

119

• Sorbitán Monooleato 1,0 g

• Triptosa10,0 g

• Agar 15,0 g


• El medio se puede usar en inoculación en superficie o por incorporación

en gelosa.

• Incubar a 37ºC de 48 a 72 horas en una atmósfera enriquecida con

Anhídrido Carbónico (5-10%).


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 75 gr (Di-Amonio Hidrógeno Citrato,

arabinosa, Extracto de Levadura, D-glucosa, Sulfato de hierro II, Sulfato de

Magnesio, Sulfato de Magnesio II, sacarosa, di-Potasio Hidrógeno Fosfato,

acetato de sodio, sorbitan monooleato, triptosa, agar) , colocar en una estufa

hasta conseguir el punto de ebullición y agitar en varias ocasiones para facilitar

la homogenización del medio (hervir durante un min.); añadir 1.32 de acido

acetico al 96%. Esta mezcla se vuelve a calentar y no se esteriliza.




� Esherichia coli (ATCC 25922) se observa buen crecimiento

� Stphylococcus aureus (ATCC 25923), se observa buen crecimiento

5.9 AGAR SANGRE

Se emplea, añadiendo sangre o sangre cocida, para el cultivo y aislamiento de

microorganismos exigentes, sobre todo patógenos y para su determinación. Si

no se añade sangre, es adecuado como base para la preparación de otros

medios especiales.

Dada la excelente base nutritiva, permite el crecimiento de prácticamente todos

los microorganismos que pudieran estar presentes. Si se añade sangre se

120

pueden determinar las distintas formas de hemólisis que pudieran tener lugar. Si

se calienta se obtiene el Agar Chocolate, también muy empleado. Por la adición

de distintos antibióticos se obtienen medios con caracteres selectivos (2,3,4).


• Infusión del Músculo Cardíaco (a partir de 375 g) 10,0 g

• Peptona de Carne 10,0 g


• Agar 15,0 g


• Sembrar las placas en la superficie del medio.

• Incubar a 37ºC de 24 a 48 horas.


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 40 gr (Infusión del Músculo Cardíaco,

peptona de carne, cloruro de sodio, agar) , colocar en una estufa hasta

conseguir el punto de ebullición y agitar en varias ocasiones para facilitar la

homogenización del medio (hervir durante un min.), esterilizar a 121°C durante

30 minutos; adicionar sangre desfibrinada al 5% y adicionar a cajas de petri.





una ß hemolisis.

� Streptococcus pneumoniae (ATCC 6303), buen crecimiento y se observa

una α hemolisis.

5.10 AGAR SANGRE AZIDA

121

Se emplea para el aislamiento de Streptococcus y Staphylococcus en muestras

de distintos orígenes. Si se añade 5% de sangre, es un medio adecuado para

determinar reacciones hemolíticas.

Es un medio con una buena base nutritiva. Si se añade un 5% de sangre es

adecuado para determinar reacciones hemolíticas típicas y para favorecer el

crecimiento de microorganismos exigentes (2).


• Sodio Azida 0,2 g

• Extracto de Carne 3,0 g

• Peptonas 10,0 g


• Agar 15,0 g


• Sembrar en la superficie del medio.

• Incubar a 37ºC de 36 a 48 horas.


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 32 gr (Sodio Azida , peptona,

extracto de carne, cloruro de sodio, agar) , colocar en una estufa hasta conseguir

el punto de ebullición y agitar en varias ocasiones para facilitar la

homogenización del medio (hervir durante un min.), esterilizar a 121°C durante

15 minutos; adicionar sangre desfibrinada al 5% y adicionar a cajas de petri.





una ß hemolisis.

� Streptococcus pneumonie (ATCC 6303), buen crecimiento y se observa

una α hemolisis.

122

5.11 AGAR TRIPTICASA SOJA (TSA)

Por el contenido de peptona de soja y peptona de caseína resulta una aportación

nutritiva que permite el desarrollo óptimo de un gran número de

microorganismos, tanto exigentes como no exigentes (2,3)

5.11.1 Composicion del medio

• Peptona de Soja 5,0 g

• Peptona de Caseína 15,0 g


• Agar 15,0 g

5.11.2 Procedimiento

• Realizar aislamiento con asa recta en los cuatro cuadrantes

• Incubar a 37ºC durante 24 hrs.


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 30 gr (Peptona de Soja, Peptona de

Caseína , cloruro de sodio, agar) , colocar en una estufa hasta conseguir el

punto de ebullición y agitar en varias ocasiones para facilitar la homogenización

del medio (hervir durante un min.), esterilizar a 121°C durante 15 minutos;

adicionar a cajas de petri.




� Staphylococcus aureus (ATCC 25923), buen crecimiento

� Streptococcus pneumonie (ATCC 6303), buen crecimiento

5.12 CALDO TODD HEWITT

123

Se emplea para el cultivo de Estreptococos ß-hemolíticos con fines de

tipificación serológica. También como medio general para enriquecimiento de

microorganismos patógenos y cultivos con sangre. Este medio con el objeto de

producir Hemolisina estreptocócica. Se trata de un medio muy nutritivo debido a

la alta concentración de sustancias proteicas. La Glucosa aporta la componente

energética y favorece la producción de hemolisina, el Sodio Cloruro la salinidad y

el Sodio Carbonato y el di-Sodio Hidrógeno Fosfato regulan el pH, factor este

último muy importante, ya que la Hemolisina producida podría ser destruida si la

acidez derivada de la fermentación de la glucosa no fuera neutralizada (2).



• Infusión de Músculo Cardíaco 3,1 g (a partir de 500 g)

• Peptona 20,0 g

• Sodio Carbonato 2,5 g


• di-Sodio Hidrógeno Fosfato 0,4 g


• Sembrar el medio con el material en estudio e incubar a 37ºC durante 24

horas.


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 30 gr (D(+)-Glucosa , Infusión de

Músculo Cardíaco , Peptona, cloruro de sodio, carbonto de sodio, di-Sodio

Hidrógeno Fosfato), colocar en una estufa hasta conseguir el punto de ebullición

y agitar en varias ocasiones para facilitar la homogenización del medio (hervir

durante un min.), adicionar tubos de 13x 100, se esterilizan a 121°C durante 15

minutos.




124

� Streptococcus mitis (ATCC 9895), buen crecimiento


5.13 INFUSIÓN CEREBRO CORAZÓN (BHI)

Por la presencia de peptona, infusión de cerebro de ternera e infusión de

corazón de res, se tienen los componentes necesarios para nutrir

microorganismos exigentes. La glucosa se emplea para la fermentación y el

fosfato como tampón. Por la adición de antibiótico es un medio adecuado para el

estudio de hongos patógenos. Debido a su contenido de glucosa es menos

indicado para la caracterización de hemólisis, pero puede utilizarse

suplementado con sangre (2,3). 5.13.1 Composicion del medio

• Infusión de Cerebro de Ternera (a partir de 200 g) 12,5 g

• Infusión de Corazón de Res (a partir de 250 g) 5,0 g


• Peptona de Gelatina 10,0 g

• Cloruro de Sodio 5,0 g

• Fosfato disódico de Hidrógeno 2,5 g


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 52 gr ( Infusión de Cerebro de

Ternera, Infusión de Corazón de Res, D(+)-Glucosa , Peptona de Gelatina ,

cloruro de sodio, Fosfato disódico de Hidrógeno) , colocar en una estufa hasta


homogenización del medio (hervir durante un min.), adicionar a tubos de 16x

100, se esterilizan a 121°C durante 15 minutos.




125

� Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), buen crecimiento


5.14 MEDIO DE CISTINA TRIPTOSA

Se emplea en la conservación de cepas de microorganismos exigentes, para los

estudios de movilidad y fermentación con la adición de hidratos de carbono. El

Medio CTA es un medio semisólido adecuado para la detección de la movilidad

bacteriana. Se pueden añadir carbohidratos a esta base para realizar estudios

de fermentación en una amplia gama de microorganismos, pero principalmente,

para los más exigentes como Neisserias, Pneumococos, Estreptococos y

Anaerobios no esporulados. Producto de la fermentación del carbohidrato

añadido al medio será un descenso en el pH por la producción de ácido, que

hará virar el indicador Rojo de Fenol. Si se ha producido fermentación el medio

pasa de rojo a amarillo (2-4).


• L-Cistina 0,5 g

• Peptona de Caseína 20,0 g

• Rojo Fenol 0,017 g


• Sodio Sulfito 0,5 g

• Agar 2,5 g


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 28.5 gr ( Infusión de Cerebro de

Ternera, Infusión de Corazón de Res, D(+)-Glucosa , Peptona de Gelatina ,

cloruro de sodio, Fosfato disódico de Hidrógeno) , colocar en una estufa hasta


homogenización del medio (hervir durante un min.), adicionar a tubos de 16x

100, se esterilizan a 118°C durante 15 minutos; adicionar carbohidratos al 1%

(glucosa, sacarosa)

126




� Esherichia coli (ATCC 25922) se observa buen crecimiento

� Staphylococcus aureus (ATCC 25923), se observa buen crecimiento

5.15 MEDIO ROJO DE METILO Y VOGES POSKAUER

Se emplea como medio diferencial para bacterias, principalmente

Enterobacteriáceas, según la reacción del Rojo de Metilo y la de Voges-

Proskauer. Es un medio apropiado los microorganismos Coliformes eran

capaces de dar una reacción ácida importante (bajar el pH del medio al menos a

4,4) al fermentar la glucosa, mientras que los aerógenos sólo producían una

ligera acidificación del medio. Para reconocer este fenómeno emplearon Rojo de

Metilo como indicador. El Rojo de Metilo presenta color amarillo por encima de

un pH de 5,1 y sólo presenta color rojo cuando el pH desciende hasta 4,4. Voges

y Proskauer observaron que también es un medio apropiado para determinados

gérmenes que eran capaces de dar una reacción colorimétrica en base a la

producción de 2,3-Butanodiol obtenido a partir de la fermentación de la glucosa.

La mezcla de peptonas constituye el componente nutritivo del medio y el tri-

Potasio Fosfato actúa como elemento regulador del pH (2,3,4).



• Peptona 7,0 g

• tri-Potasio Fosfato 5,0 g


• Sembrar 2 tubos para cada muestra.

127

• Incubar entre 30º y 37ºC de 24 horas a 4 días. Añadir a uno de los tubos

0,3 ml del Reactivo A y 0,1 ml del Reactivo B de Voges Proskauer por

cada ml de cultivo.

• Si aparece coloración, la prueba es positiva. Coger el otro tubo de cultivo

y añadir 0,1-0,2 ml del Reactivo Rojo de Metilo.

• Si se observa la aparición de coloración roja la prueba es positiva.

• Si los resultados son dudosos repetir el ensayo incubando 5 días a 30°C.


matraz aforado de 2.000 ml, adicionandole 17 gr ( D(+)-Glucosa, tri-Potasio

Fosfato , Peptona) , colocar en una estufa hasta conseguir el punto de ebullición

y agitar en varias ocasiones para facilitar la homogenización del medio (hervir

durante un min.), adicionar a tubos de 13x 100, se esterilizan a 121°C durante 15

minutos.




� Esherichia coli (ATCC 25922) se observa buen crecimiento, RM

(amarillos) negativo y VP (rojo) positivo

� Klebsiella pneumoniae (ATCC 23357), se observa buen crecimiento, RM

(rojo) positivo y VP (amarillo) negtivo

128

BIBLIOGRAFIA

1. Koneman Elmer William, 2004, �Diagnóstico microbiológico texto y atlas

color�, Quinta edicion, Editorial Medica Panamericana, Buenos Aires.(4)

2. Manual Basico de Microbiologia Cultimed, 2003, panread quimica S.A,

Edicion 11. (3)

3. McFaddin J., 2003, �Pruebas bioquimicas para la identificacion de

bacterias de importancia clinica�, Tercera edicion, Editorial Medica

Panamericana, Buenos Aires. (2)

4. Myriam Escobar de Rico, 1998, Fundamentos de microbiologia, Primera

edición, Centro Editorial Javeriano, pág.143-194 (5)

5. Rodríguez Pérez Elba, 2006, �Manual de microbiología oral�, Primera

Edición, McGraw- Hill Interamericana, México, Págs.:53-59. (1)

129

CAPITULO 6

DESCRIPCIÓN DE PRUEBAS BIOQUIMICAS Y SISTEMAS DE

ANAEROBIOSIS

En el campo de identificación de microorganismos a nivel de laboratorio clínico

existen pruebas bioquímicas que han permitido más fácil la identificación de

género y especie causantes de la caries dental. Como pruebas de oro se tienen

la realización de pruebas bioquímicas las cuales tienen por objetivo conocer el

tipo de metabolismo que llevan a cabo los microorganismos cariogénicos y como

se puede diferenciar una especie de otra.

6.1 PRUEBA DE CATALASA

La catalasa es una enzima de tipo citocromo; el grupo hemo de la catalasa es un

complejo de hierro y porfirina (protoporfirina IX). La catalasa descompone el

peróxido de hidrogeno (H2O2). El peróxido se descompone por medio de la

acción de dos enzimas que son:

• Catalasa (peróxido de hidrogeno oxidorreductasa).

• Peroxidasa, NADH, NADPH, citocromo C.

La descomposición catalítica del peróxido involucra la reducción del hierro

trivalente (Fe3+) a su forma reducida (Fe2+) y la reoxidacion de este ultimo

compuesto se realiza por el O2. La catalasa puede funcionar de dos formas: en

el catabolismo del H2O2 (reacción catalítica), oxidación peroxidativa de

pequeños sustratos como el alcohol etílico. (1,4,5)

6.1.1 Reactivo

• Peróxido de hidrogeno al 30%


• Con una aguja de inoculación recoger una muestra de colonia en estudio.

130

• Colocar la muestra en el centro de una lamina portaobjetos.

• Se coloca una gota de peróxido de hidrogeno al 30%

• Observar la reacción 2 segundos después

6.1.3 Interpretación

• Positiva: Se observa burbujeo inmediato por la formación de O2.

• Negativa: Ausencia de burbujas por que no hay presencia de O2.

6.1.4 Control de calidad:

� Staphylococcus aureus (ATCC 12600) positivo

� Streptococcus pyogenes (ATCC 12344) negativo

6.2 PRUEBA DE OXIDASA

La prueba de oxidasa se basa en la producción bacteriana de una enzima

oxidasa intracelular. Esta reacción se basa en un sistema citocromo oxidasa que

activa la oxidación del citocromo reducido por el oxigeno molecular, que a su

vez actúa como receptor de electrones en la fase terminal del sistema de

transferencia de electrones. El oxigeno oxida un sustrato por medio de la

intervención del sistema de transporte de electrones. El oxigeno actúa como

aceptor final del hidrogeno produciendo agua o peróxido de hidrogeno si es a

partir del hidrogeno. Libera suficiente energía para sintetizar ATP; este proceso

se denomina fosforilacion oxidativa(anexo.1) (1,4,5).

6.2.1 Reactivos

• Tiras reactivas

• Diclorhidrato de N-tetrametil-p-fenillendiamina al 1% en agua destilada

esteril.

6.2.2 Procedimiento

• Colocar sobre una lamina portaobjetos una tira reactiva.

131

• Adicionamos una muestra de la colonia que se quiere estudiar.

• Adicionamos de 2-3 gotas de Diclorhidrato de N-tetrametil-p-

fenillendiamina

• Esperar de 1-2 minutos.


• Positivo: Se observa un color morado.

• Negativo: No hay cambio de color.


� Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) positivo.

� Escherichia coli (ATCC 11775) negativo

6.3 PRUEBA DE BACITRACINA

La Bacitracina es un antibiótico que inhibe la síntesis de la pared celular

bacteriana. El esqueleto fundamental consiste en una estructura que esta

compuesta por peptidoglicano y otros polímeros que difieren de los diferentes

tipos de bacterias. La bacitracina inhibe una parte temprana de de la biosíntesis

de la pared celular, inhibiendo la desfosforilación del pirofosfato lipidico; el cual

es esencial para la síntesis de la pared e inhibe la reutilización de metabolitos

que son necesarios para la síntesis de nuevo peptidoglucano (1,2).

6.3.1 Composicion de medio:

• Agar

• Sangre de cordero al 5%.

• Agua destilada 1.000 ml.

• Sensidiscos de Bacitracina

132


• Con una asa recta se toma una muestra de la colonia; se realiza estrías

en el medio para realizar el aislamiento y en otra caja de petri con el

mismo medio tomamos con el asa otra colonia para sembrar en forma

masiva el inoculo.

• Con las pinzas las cuales deben ser previamente esterilizadas se toma un

sensidisco de bacitracina.

• Los medios inoculados se llevan a la incubadora a una temperatura de

37ºC durante 24 hr.

6.3.3 Interpretación:

• Se observa un halo alrededor del disco de Bacitracina; significa

crecimiento inhibido

• No se observa ninguna zona alrededor del disco de Bacitracina se

considera que el microorganismo es resistente al antibiótico.


� Streptococcus agalactiae grupo B (ATCC 13813) Resistente

� Streptococcus pyogenes (ATCC 12344) Sensible

6.4 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE BILIS Y ESCULINA

Determinar la capacidad de un microorganismo para hidrolizar el glucósido

esculina a esculetina y glucosa en presencia de bilis. La esculina (6- β glucósido-

7- hidroxicumarina) es derivado cumarinico donde se consigue la hidrólisis del

enlace β por una β-glucosidasa la cual libera la glucosa y se obtiene la

esculetina (6,7- hidroxicumarina).

La esculina es un glucósido, un derivado acetal de un monosacárido simple.

Cuando una sustancia se une a un azúcar por medio de una unión acetal,

resulta siendo un glucósido y la porción que se encuentra unida al azúcar se

133

denomina aglucona. Los grupos acetal se hidrolizan por acción de los ácidos

(Anexo 2) (4).


• Peptona de caseína 5 Gr

• Extracto de carne 3 Gr

• Bilis 40 Gr

• Esculina en polvo (C15H16O9) 1 Gr

• Citrato de hierro (III) y amonio (NH4) 2 HC6H5O7 0.5 Gr

• Agar agar 15 Gr

• Agua desionizada 1.000 ml

Después de realizar la esterilización adicionar

• Suero de caballo al 5%

La bilis esculina inhibe la mayoría de los cocos Gram positivos que no

pertenecen al grupo de estreptococos y cuando se encuentra a una

concentración del 20% inhibe el crecimiento bacterias anaerobias. En cambio la

azida sódica inhibe el crecimiento de las bacterias Gram negativas y reduce la

actividad de la catalasa. El medio se observa de color amarillo pálido

translucido.(3)


• Cuando el medio se tiene en un tubo de pico de flauta se realiza con el

asa recta una estría sobre la superficie inclinada; pero cuando se tiene el

medio en una caja de petri se realiza un aislamiento en los cuatro

cuadrantes de la caja de petri para obtener mas aislamiento del

microorganismo

• Se incuba a 37ºC por un periodo de tiempo de 48 hrs.

• Si se quiere recuperar una cantidad representativa de Streptococcus

mutans se recomienda incubar con un ambiente de CO2 obteniendo

como resultado una reacción positiva para bilis y esculina.


134

• Resultado positivo: Se observa un color castaño oscuro a negro que se

difunde en el pico de flauta (tubo); se observan halos de color castaño

oscuro alrededor del crecimiento de las colonias.

• Resultado negativo: No se observa el color castaño oscuro donde el

medio se mantiene de su color inicial.


� Enterococcus faecalis (ATCC 29212) positivo

� Streptococcus pyogenes (ATCC 12344) negativo

6.5 PRUEBAS DE FERMENTACION DE HIDRATOS DE CARBONO

Determinar la capacidad que tiene un microorganismo para degradar (fermentar)

un hidrato de carbono adicionado al medio con la producción final de acido. La

fermentación es un proceso anaerobio de oxido-reducción donde un sustrato

orgánico actúa como aceptor final de hidrogeno en lugar del oxigeno (1,4).

6.5.1 Composición del medio:

• Peptona (proteosa o digerido pancreático de caseína) 10 Gr

• Cloruro de sodio 5 Gr

• Rojo de fenol 0.018 Gr

• Agua destilada 1.000 ml

• Hidratos de carbono al 1% (inulina, lactosa, manitol, sorbitol, melibiosa,

rafinosa, trehalosa) 10 Gr

El indicador de pH mas utilizado es el rojo de fenol para observar la fermentación

del hidrato de carbono.


• Se toma con el asa redonda una muestra de la colonia aislada en el agar

sangre.

• Se inclina cada tubo con el hidrato de carbono correspondiente y se

introduce el asa para realizar una emulsión homogénea.

• Se agita el caldo para que se realice bien la emulsión.

135

• Se incuba a 37ºC por un lapso de 24 hrs.


• Positivo: Acido color amarillo

• Negativo: Color rojo


� Glucosa: Escherichia coli (ATCC 25922) formacion de acido; Alcaligenes

faecalis (ATCC 8750) no forma acidos.

� Lactosa: Escherichia coli (ATCC 25922) formacion de acido; Alcaligenes

faecalis (ATCC 8750) no forma acidos.

6.6 PRUEBA DE DESCARBOXILASA

La descarboxilación es un proceso donde las bacterias poseen enzimas

descarboxilasas que actúan sobre los aminoácidos en su carboxilo terminal para

obtener una amina o diamina y dióxido de carbono. La descarboxilación de la L-

arginina se obtiene agmatina; este producto es catalizado por la agmatinasa

para obtener putrescina y urea. La urea puede seguir siendo catabolizada por el

microorganismo siempre y cuando cuente con la enzima ureasa para obtener

amoniaco y dióxido de carbono (Anexo3,4,5) (1,4).


• Peptona 5 Gr

• Extracto de carne 5 Gr

• Purpura de bromocresol 0.1 Gr

• Rojo cresol 0.005 Gr

• Fosfato de piridoxal 0.005 Gr

• Glucosa 0.5 Gr


136

• Monoclorhidrato de arginina al 1% 10 Gr


• Con un asa redonda se toma una muestra de colonia y se emulsiona en

el caldo de arginina, lisina, ornitina y uno control.

• Incubar a 37ºC por 24 hrs.


• Positivo: Color purpura turbio

• Negativo: Color amarillo brillante

• Control: Amarillo


• Lisina: Klepsiella pneumoniae (ATCC 10031) positivo; Enterobacter

cloacae (ATCC 13047) negativo.

• Arginina: Enterobacter cloacae (ATCC 13047) positivo; Klepsiella

pneumoniae (ATCC 10031) negativo.

• Ornitina: Enterobacter cloacae (ATCC 13047) positivo; Klepsiella

pneumoniae (ATCC 10031) negativo.

6.7 PRUEBA DE UREASA

Determinar la capacidad de microorganismos para hidrolizar la urea en

amoniaco por medio de la enzima ureasa. En solución la urea se hidroliza a

carbonato de amonio mas agua. La ureasa se clasifica como una amidasa como

causa de la hidrólisis de las amidas.(Anexo 6) (2,4).


137

• Peptona 1 Gr

• Cloruro de sodio 5 Gr

• Fosfato monopotásico 2 Gr

• Glucosa al 1% 1 Gr

• Urea 20% 20 Gr

• Rojo fenol 0.012 Gr

• Agar agar 15-20 Gr

• Agua destilada 1000 ml


• Con un asa recta tomar una muestra de colonia

• Realizar una estría en la superficie de pico de flauta.



• Positivo: Color rosa-rojo

• Negativo: Color amarillo palido


• Proteus mirabilis (ATCC 29906) positivo.

• Escherichia coli (ATCC 11775) negativo

6.8 PRUEBA DE TSI (TRIPLE AZUCAR HIERRO)

En este medio se puede observar la capacidad de producción de gas en el

proceso de fermentación de azucares, producción de sulfuro de hidrogeno

gaseoso, que se visualiza por un precipitado de color negro que contiene hierro y

la capacidad para fermentar lactosa y sacarosa.

La lactosa y sacarosa son convertidos a glucosa para que se han metabolizados

por la Embden- Meyerhof la cual se realiza de firma aeróbica donde el oxigeno

138

actúa como aceptor final de electrones y en la parte inferior del medio se realiza

en anaerobiosis; donde los productos finales son reducidos a piruvato a través

del ciclo de Krebs, formando productos ácidos. Estos compuestos que se han

formado hacen virar el color rojo a amarillo. Pero si va bacteria no fermenta la

glucosa el medio se vera de color rojo (Anexo 7). (1,4,5)


• Extracto de levadura 3 Gr.

• Extracto de carne 3 Gr.

• Peptona 15 Gr

• Proteosa5 Gr

• Lactosa 10 Gr

• Glucosa 1 Gr.

• Sacarosa 10 Gr

• Tiosulfato de sodio 0,3 Gr

• Sulfato ferroso 0.5 Gr

• Indicador de pH rojo de fenol 0.024 Gr

• Agar 12 Gr



• Tomar una muestra de colonia con el asa recta.

• Se realiza una punción que cubra ¾ partes del tubo.

• Realizar una estria en la superficie de pico de flauta.

• Incubar a 37ºC por 24 hrs.


• Fermentación: Alc/A (rojo/amarillo) Solo fermenta la glucosa

A/A (amarillo/amarillo) Fermenta Glucosa, lactosa

139

Alc/Alc (rojo/rojo) Ausencia de fermentación de lactosa y

glucosa.

• Producción de Gas: Se visualiza la formación de burbujas.

• Producción de sulfuro de hidrogeno: precipitado de color negro


• Escherichia coli (ATCC 25922) acido/ acido, produccion de gas.

• Edwarsiella tarda (ATCC 15947) alcalino/acido, produccion de sulfuro de

hidrogeno (H2S)

6.9 PRUEBA DE INDOL

La capacidad de un microorganismo para degradar el aminoácido triptófano

depende de la producción de la enzima triptofanasa; la cual produce la

desaminación , dando como producto el indol, que al reaccionar con un aldehído

como p-dimetilaminobenzaldehido, da una reacción de color cereza en la

superficie del medio (Anexo 8) (4,5).


• Peptona de caseína 10 Gr.

• Cloruro de sodio (NaCl) 5 Gr.


• Triptofano al 1%

6.9.2 Reactivo de kovacs:

• Alcohol amílico o isoamílico puro 150 ml.

• P- Dimetilaminobenzaldehido 10 Gr.

• HCl 50 ml.


140

• Tomar una muestra de la colonia con un asa redonda.

• Cerca del mechero realizar la emulsión de la muestra en el medio de

cultivo


• Adicionar de 4-5 gotas de Kovacs.


• Positivo: Formación de un color cereza en la superficie.

• Negativo: No se observa ningún color.


• Escherichia coli (ATCC 25922) positivo

• Enterobacter cloacae (ATCC 23355) negativo.

6.10 PRUEBA DE NITRATOS

La utilización de nitratos se da por reducción a nitrito, eliminando una molecula

de oxigeno. Existen microorganismos con la capacidad de formar a partir de

nitrato hasta la formación de nitrógeno, amoniaco, oxido nítrico y combinando el

oxigeno con el hidrogeno (Anexo 9) (1,4,5).

6.10.1 Composición del medio


• Peptona de gelatina 5 Gr.

• Nitrato de potasio 0.1% 1 Gr.


• Polvo de Zinc


• Tomar una muestra de la colonia con un asa redonda.

• Disolver la muestra el el caldo de de nitratos.

141


• Adicionar 3 gotas de N,N-dimetil-α- naftilamina, Acido sulfanílico.

• En caso de dar negativo se adiciona polvo de zinc.

6.10.3 Reactivos:

• N,N-dimetil-α- naftilamina 0.6% : N,N-dimetil-α- naftilamina 6 Gr.

Acido acético glácial, 30% 1.000 mL.

• Acido sulfanílico 0.8%: Acido sulfanílico 8 Gr

Acido acético glacial 30% 1.000 mL.


• Positivo: Color rosa a rojo oscuro en 1-2 min.

• Negativo: No se observa cambio de color.

• Adición de polvo de zinc: Positivo: Color rojo

Negativo: Incoloro


• Escherichia coli (ATCC 11775) positivo.

• Acinetobacter lwoffi (ATCC 15309) negativo

6.11 PRUEBA DE OXIDACIÓN Y FERMENTACIÓN

Las bacterias utilizan los hidratos de carbono por un proceso de metabolismo

oxidativo o fermentativo por el requerimiento de oxigeno atmosférico y de una

fosforilación inicial. La fermentación es el proceso anaerobio que requiere la

fosforilación inicial de la glucosa antes de la degradación que obtiene como

producto final ácidos, mientras que la oxidación se realiza en ausencia de

compuestos inorgánicos como el nitrato y sulfato, este es un proceso aeróbico

estricto que involucra la oxidación directa de la molécula de glucosa no

fosforilada (1,4,5).


142

• Peptona de caseína 0.2% 2 Gr.

• Cloruro de sodio 5 Gr.

• Fosfato dipotásico 0.3 Gr.

• Agar 2-3 Gr.

• Azul de bromotimol 0.03-0.08 Gr.


• Glucosa 10% (después de la esterilización se obtiene al 1%) 10 Gr/100

ml

• Manitol 10% (después de la esterilización se obtiene al 1%) 10 Gr/100 ml

• Parafina estéril 100 ml por cada 1ml de agua destilada.


• Tomar con un asa recta una muestra de la colonia.

• Cerca del mechero realizar la inoculación en dos tubos de medio OF con

el azúcar correspondiente en las ¾ partes del medio.

• Adicionar 1 ml a uno de los tubos de medio OF con el hidrato

correspondiente y el otro no se le adiciona, incubar a 37ºC durante 48

hrs.


• Oxidación: Tubo sin parafina de color amarillo.

• Fermentación: Tubo cubierto con parafina amarillo.

• Fermentación y Oxidación: Los tubos con parafina y sin parafina de color

amarillo.

• Movilidad: Crecimiento alrededor de la punción realizada en el medio.


• Staphylococcus aureus (ATCC 12600) fermentacion.

• Micrococcus luteus (ATCC 4698) oxidacion.

6.12 PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS

143

Las sales biliares son sales de sodio de los acidos biliares que son sintetizados a

partir del colesterol. Estan conjugados con aminoácidos a travez de uniones de

amidaentre el grupo carboxilo del acido y grupo amino. En esta prueba por lo

general se utiliza desoxicolato de sodio son los compuestos líticos (1,4).


• Sal biliar al 10%, 10 Gr en 100 ml de agua destilada.

• Hidroxido de sodio, excento de carbonato 40 Gr.

• Agua destilada 100 ml.


• Tomar una muestra de colonia a partir del cultivo de Agar Sangre.

• Preparar una solución densa en solución fisiológica al 0.85%

• Agregar una gota de indicador de pH rojo de fenol.

• Adicionar 0.5 ml desoxicolato de sodio a un tubo con la suspensión en

cloruro de sodio.

• Mezclar la suspensión.

• Incubar a 37ºC a baño María durante 3 hrs.


• Soluble en bilis: Se observa un aclaramiento en la solución.

• Insoluble en bilis: Se observa la solución turbia.


• Streptococcus pneumoniae (ATCC 12344) soluble en bilis.

• Streptococcus mitis (ATCC 15909) insoluble en bilis.

144

6.13 PRUEBA DE LICUEFACCION DE LA GELATINA

La gelatinasa es una enzima derivada del colágeno animal, se adiciona en

medios para ver la capacidad de un microorganismo para producir enzimas

proteolíticas (proteinasas), que se detectan por la digestión de la gelatina; las

enzimas capaces de producir esta reacción son las gelatinasas( Anexo 10) (1,4).



• Peptona 5 Gr.

• Gelatina al 12% 120 Gr.



• Tomar una muestra de la colonia con asa recta.

• Realizar una punción en el Agar de Gelatina hasta las ¾ partes del tubo.

• Incubar el tubo a 25ºC durante 24 hrs.


• Licuefacción: La licuefacción de la gelatina comienza en la superficie del

medio y se extiende.

• Sin licuefacción: Medio permanece solido.


• Proteus vulgaris (ATCC 8427) crecimiento y licuefaccion.

• Escherichia coli (ATCC 25922) crecimiento.

6.14 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE PIRROLIDONIL- β-NAFTILAMIDA

145

Detectar la presencia de la enzima L-pirrolidonil arilamidasa (PYR) (Anexo 11)

(1,4).


• Agar tripticasa soya Solución acida 1% en acido clorhídrico concentrado

al 10%.

• p-Dimetilaminocinamaldehido


• Tomar una muestra de la colonia.

• Realizar estrías en la superficie del agar Tripticasa Soya cubriendo los

cuatro cuadrantes.

• Se incuba a 37ºC durante 24 hrs.

• Se adiciona 1 gota del reactivo PYR (L-pirrolidonil arilamidasa)

• Observar cambio de color después de dos minutos.


• Positivo: Color rojo cereza (PYR hidrolizado)

• Negativo: Color naranja o amarillo.


• Streptococcus pyogenes ( ATCC 19615) positivo.

• Streptococcus agalactiae (ATCC 12386) negativo.

6.15 PRUEBA DE MOVILIDAD

Las bacterias son móviles por medio de flagelos (1,4).


• Triptosa 10 Gr.

• Cloruro de sodio 5 Gr.

• Agar 5 Gr.

146



• Tomar una muestra de la colonia con un asa recta.

• Realizar una punción en todo el centro del medio hasta las ¾ partes.

• Incubar a 37ºC de 24-48 hrs.


• Positivo: Microorganismo móvil que migra desde la línea de siembra.

• Negativo: Crecimiento solo en la línea de la siembra.

6.16 PATRON DE MC FARLAND

Se realiza para medir la turbidez y servir como patron de referencia para la

concentracion microbiana (6,1,5)


• Cloruro de bario (BaCl2), solucion acuosa al 1%.

• Acido sulfúrico (H2SO4) solucion acuosa al 1%

• 10 tubos 13X100 de tapa rosca


• Despues de realizar la emulsion con las cantidades indicada (tabla 5.1).

• Tapar los 10 tubos con su respectiva tapa (tabla 6.1)

Tabla 6.1 Realizacion del patron de McFarland

147

ESTANDARES DE SULFATO DE BARIO Tubo Nº 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BaCl2 al 1% (ml)

0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

H2SO4 al 1% (ml)

9.95 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

Densidad aprox. de

celulas (millones/ml)

1.5 3. 6. 9. 12. 15. 18. 21. 24. 27. 30.

6.17 PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL

Algunos microorganismos tienen la capacidad de crecer en presencia de cloruro

de sodio (NaCl) al 6.5% como las bacterias pertenecientes al grupo de

enterococos D (1,4)


• Caldo infusion de corazon 25 gr.

• Indicador (1.6 gr de purpura, 1ml de bromocresol, disueltos en 100 ml de

etanol al 95%)1 ml.

• Glucosa al 1% 1 gr.



• Tomar con un asa redonda de dos a tres colonias

• Disolver la muestra en el caldo.

• Incubar a 37°C por 24 hr.


148

• Positivo: crecimiento

• Negativo: ausencia de crecimiento.


• Enterococcus faecalis positivo

• Streptococcus bovis negativo

6.18 SISTEMAS DE ANAEROBIOSIS

Los sistemas de anaerobiosis se utilizan a nivel clínico para conocer parte de la

forma de vivir del microorganismos y los requerimientos de oxigeno que utiliza. A

nivel comercial existen diferentes formas de obtener atmosferas anaerobias

como son las cámaras, jarras y bolsas de anaerobiosis. Es importante realizar un

control sobre la atmosfera anaerobia que se maneja en el sistema, esto se

puede realizar mediante la utilización de tiras indicadoras a base de azul de

metileno (1,2,4)

� Cámaras de anaerobiosis: En estas cámaras se consiguen atmosferas

anaerobias mediante una mezcla de gases que esta conformada por un

5% de hidrogeno (H2), 5-10% de dióxido de carbono (CO2), y 86-90% de

nitrógeno (N2). Posee un sistema de intercambio que esta conformado

por un compartimento rígido con una puerta interior y otra exterior.

� Jarras de anaerobiosis: Son recipientes cilíndricos de metal o plásticos

que se cierran herméticamente y se obtiene la atmosfera anaeróbica

después de introducir un sobre de GasPark; esta atmosfera de

anaerobiosis se obtiene al adicionar agua al sobre; obteniéndose como

resultado la liberación de H2 y CO2, este hidrogeno reacciona con el

oxigeno existente en la atmosfera y se obtiene agua. Existen otros sobres

de Anaerogen que no necesitan agua y solamente se abren.

� Bolsas de anaerobiosis: Son de material plástico transparente como

GasPark Pouch que contienen generadores e indicadores adecuados.

149

BIBLIOGRAFIA




Interamericana McGaw-Hill, España, Cap. 30-34.

3. Manual Basico de Microbiologia Cultimed, 2003, panread quimica S.A (4)

4. McFaddin J., 2003, �Pruebas bioquimicas para la identificacion de bacterias de importancia clinica�, Tercera edicion, Editorial Medica Panamericana, Buenos Aires.


edición, Centro Editorial Javeriano, pág.143-194

6. Rodríguez Pérez Elba, 2006, �Manual de microbiología oral�, Primera Edición, McGraw- Hill Interamericana, México, Págs.:53-59.

150

CAPITULO 7

SISTEMAS COMERCIALES UTILIZADOS EN LA IDENTIFICACION

DE MICROORGANISMOS CARIOGENICOS

En la actualidad se han desarrollo pruebas de identificación comerciales

especificas para genero y especie que facilitan el trabajo a nivel del

laboratorio.La saliva interviene en el proceso de limpieza de los dientes por

acción autoclitica o mecánica, la captación de iones por parte de los tejidos

dentales para que se lleve a cabo el proceso de desmineralización o

remineralización según sea conveniente; al mismo tiempo ayuda al control los

microorganismos con actividad cariogénica por la utilización de enzimas y

sistema de amortiguación del pH. Los sistemas comerciales ayudan a reducir el

tiempo de diagnostico; estas pruebas están formadas por medios de cultivo

deshidratado que en el momento de adicionar la muestra de estudio se hidrata;

estos medios después de cultivarse se obtiene un numero y este se busca en la

base de datos que nos designara el genero y especie. Aunque estos metodos

facilitan la identificacion a nivel microbiologico tiene el inconveniente de no poder

identificar especies que tienen mutaciones a nivel genetido por la utilizacion de

plasmidos.

En la actualidad los principales análisis que se realizan desde 1999 basados en

la saliva son: la tasa de secreción de la saliva, la capacidad que tiene como

tampón y el recuento de microorganismos que se encuentran en la saliva,

teniendo como relevancia primordial a S. mutans y especies de Lactobacillus

(3,7).

Los sistemas comerciales han tenido gran aceptación en el diagnostico clínico a

nivel de microbiología, por las siguientes razones:

• Su precisión en los resultados obtenidos se puede comparar con los

métodos convencionales.

• Los sistemas comerciales tienen un periodo de vida útil de un (1) año; lo

que no ocurre con los métodos convencionales.

151

• Minimización de espacio de almacenamiento.

152

• El tiempo de incubación no excede las 24 hr., y puede contar con una

base de datos para facilitar la obtención de especie y genero.

7.1 TASA DE SECRECIÓN DE SALIVA

El flujo de saliva varia de un individuo a otro; pero se debe tener en cuenta que

aquellas personas que manejan un bajo flujo salival están mas expuestas a

presentar enfermedades que afecte el periodonto. La mayoría de las funciones

que cumple la saliva se pueden realizar por reacciones químicas pero esto no

ocurre con el barrido mecánico; debido a que es un proceso físico donde

intervienen estructuras musculares como la lengua, carrillos, labios y el fluido

salival el cual permite tener mas acceso a las estructuras dentarias internas;

permitiendo la eliminación de residuos alimentarios con capacidad cariogénica y

al mismo tiempo la eliminación de microorganismos. Esto se convierte en un

factor de riesgo para sufrir de caries.

El flujo salival es de aproximadamente 500 ml/dia; el cual se ve influenciado por

diferentes factores como son la ingesta de comida, el proceso de masticación lo

cual aumenta este flujo pero hay otras condiciones naturales donde este flujo

disminuye como es durante el sueño debido a que no se realiza ninguna función

de ingesta de alimento. (1,3,4,6)

7.1.1 Procedimiento: El examen para evaluar el flujo salival consiste en que el

paciente realce el proceso de masticación de parafina para estimular el flujo de

saliva durante un minuto; posterior a esto se recolecta la saliva en un recipiente

calibrado para medir el volumen de saliva (figura 7.1)

Figura 7.1 Procedimiento de la tasa de secrecion salival

7.1.2 Resultados: Cuando el flujo salival estimulado desciende por debajo de

0.7 ml/min, constituye un trastorno denominado xerostomía (tabla 6.1).

153

Tabla 7.1 Resultados del flujo salival

RESULTADOS DE FLUJO SALIVAL ESTIMULADO

NORMAL DISMINUIDO

Flujo salival estimulado

>0.7 ml/ min.

< 0.7 ml/min

7.2 CAPACIDAD TAMPÓN DE LA SALIVA

Otra de las funciones que realiza la saliva es mantener el ph de la boca entre 5,7

- 7,6 neutralizando la producción de ácidos que facilita la colonización de

microorganismos cariogénicos. Por el manejo de sistema amortiguador de

bicarbonato, iones de calcio y fosfato que también contribuyen al proceso de

remineralización del diente. (1)

7.2.1 Procedimiento: Uno de los métodos mas utilizados para realizar la

determinación de pH en la saliva es de la casa comercial CRT® buffer de lvoclar-

Vivadent. Este método consiste en recoger una gota de saliva del paciente,

depositarla en la tira reactiva de pH y al cabo de min., observar el cambio de

color; se realiza la comparación con la carta de referencia de la casa comercial

(figura 7.2).

Figura 7.2 Procedimiento de la prueba para evaluar la capacidad de tampon

7.2.2 Resultado: La interpretación de la tira varia según el color emitido donde

la capacidad de tampón normalmente debe ser de color azul(>6); pero si el color

154

es de anaranjado o verde quiere decir que la saliva no esta realizando su funcion

de amortiguar el pH (tabla 6.2)

Tabla 7.2 Resultados de la capacidad de tampon de la saliva

VALORCION DE L CAPACIDAD TAMPON DE LA SALIVA

COLOR Anaranjado Verde Azul

pH < 4 4.5-5.5 >6

CAPACIDAD DE TAMPON

Baja Mediana Alta

7.3 RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN SALIVA

A nivel microbiológico se considera que la caries dental se obtiene como

resultado de la colonización mixta de varios microorganismos capaces de

producir compuestos ácidos alterando el pH, entre los cuales encontramos al

Streptococcus mutans, especies de lactobacillus y especies de Actinomyces. A

partir de 1999 se empezó a tener en cuenta el numero de S. mutans y especies

de lactobacillus por unidad de volumen de saliva; como factor de riesgo de una

persona para sufrir caries. (1)

7.3.1 Procedimiento: Uno de los métodos mas utilizados es el de casa

comercial CRT® bacteria. Para realizar este procedimiento se solicita al paciente

masticar una pastilla de parafina durante un minuto, pero al mismo tiempo se

introduce una pastilla de bacitracina en el recipiente de recolección de la

muestra. Con un gotero estéril se recoge una muestra de la saliva la cual se

dispersa en la lamina que esta cubierta con el medio a continuación se coloca en

una caja de petri poniéndola de forma horizontal en incubación durante 48 hrs., a

37ºC; después de transcurrido este tiempo se compara el medio de cultivo con

los parámetros emitidos por la casa comercial (figura 7.3).

155

Figura 7.3 Procedimiento de recoleccion y procesamiento de saliva

7.3.2 Resultados: Al realizar la comparación del cultivo con los parámetros

emitidos por la casa comercial se puede interpretar según la siguiente (figura

7.4)

Figura 7.4 Observacion en medio de cultivo

7.3.3 Interpretación: Al realizar la conparacion del medio despues de haber

incubado 24 hr y al realizr la comparacion del crecimiento con los parametros de

la casa comercial se puede determinr que grupo es y en que porcentaje se

puede encontrar.

156

Tabla 7.3 Recuento de S. mutans y genero Lactobacillus

RECUENTO DE S. MUTANS Y LACTOBACILLUS

TIPO DE BACTERIA ALTO RIESGO BAJO RIESGO

Streptococcus mutans

> 100.000 UFC/ml (105)

< 100.000 UFC/ml (105)

Lactobacillus spp. > 100.000 UFC/ml (105)

< 100.000 UFC/ml (105)

7.4 SISTEMA API 20E

El sistema es difícil de inocular, debido a que necesita una manipulación especial

para evitar la contaminación entre las diferentes pruebas bioquímicas que

maneja el sistema. (2)

Figura 7.5 Sistema API 20E 7.5 SISTEMA API RAPID 20E

157

Es un sistema en el cual se pueden obtener resultados antes de 24 hrs., estos

sustratos no se encuentran tamponados. Este sistema maneja cúpulas con

menores volúmenes; son inoculados con el patrón de McFarland de 0.5 con

sulfato de bario. Las pruebas de fermentacionse deben incubar 12 hrs, pero el

resto se incuba durante 4 hrs. (2)

7.6 SISTEMA API Rapid ID 32 Strept:

Este sistema es semiautomatizado que incluye 32 pruebas enzimáticos que

contienen medios de cultivo deshidratados. La preparación del inoculo se realiza

preparando un patrón 4 de McFarland. Las colonias del microorganismos que se

va a estudiar se toman de un cultivo de agar sangre. Estas pruebas se incuban a

36ºC por un periodo de 4 hrs., en aerobiosis; transcurrido este tiempo se pasan

los resultados a una base de datos y se obtiene el genero y especie.

158

BIBLIOGRAFIA

1. Henostroza Haro Gilberto, 2007, �Caries dental principios y

procedimientos para el diagnostico�, Primera edicion, Editorial

Universidad Peruana Cayetano herediana, Pag 96-99.





4. Manual Basico de Microbiologia Cultimed, 2003, panread quimica S.A (6)

5. McFaddin J., 2003, �Pruebas bioquimicas para la identificacion de bacterias de importancia clinica�, Tercera edicion, Editorial Medica Panamericana, Buenos Aires. (4)


edición, Centro Editorial Javeriano, pág.143-194 (7)

7. Rodríguez Pérez Elba, 2006, �Manual de microbiología oral�, Primera Edición, McGraw- Hill Interamericana, México, Págs.:53-59. (3)

159

CAPITULO 8

TECNICAS SEROLOGICAS Y

MOLECULARES

En la actualidad muchos laboratorios clinicos han implementado tecnicas de

estudios basadas en ensayos serologicos y tedcnicas moleculares que son de

alto costo pero que ayudan a la identificacion exacta de genero y especie

causante de una enfermedad a nivel buco dental.

Cada tecnica se fundamenta en detectar al microorganismo patogeno conocido a

nivel inmunologico como antigeno; que con minicas cantidades de la muestra se

puede detectar la presencia o ausencia. Estas tecnicas son de gran ayuda por

que hacen que el diagnostico sea mas exacto y se puedan detectar especies con

mutaciones que pueden hacer a las bacterias resistentes al tratamiento

profilactico.

8.1 TECNICAS SEROLOGICAS

En la utilización de pruebas serológicas debemos contar con una cantidad de

inmunoglobulinas especificas ya sean de origen natural o sintético; estos

anticuerpos deben reaccionara directamente con el antígeno de interés de

estudio si se encuentra presente en la muestra clínica.

8.1.1 Inmuofluorescencia directa: En la cual se busca determinar la presencia

del antigeno con antisueros especificos maracdos con una sustancia

fluorescente; en el momento de que se lleva la union entre antigeno anticuerpo,

ersta reaccion se puede evidenciar por medio de radiacin ultravioleta emitiendo

una longitud de luz.(1)

8.1.2 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA): En esta tecnica

se utiliza anticuerpos monoclonales especificos para la identificacion del

microorganismos. La reaccion se basa en tener una microplaca que tiene fijados

los anticuerpos marcados con una enzima, que en el momento de adicionar la

160

muestra directa o indirectamnente producen un colorante que se puede leer

utilizando un espectofotometro (5).

La técnica de ELISA se puede realizar en cuatro etapas:

• Conjugación del anticuerpo o antígeno con un enzima: Las enzimas

que se pueden utilizar son peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc., esta

conjugación donde se encuentra unido el anticuerpo con la enzima se

emplea en los ensayos directos e indirectos, sándwich.

• Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. Esta unión se

realiza con facilidad a componentes plásticos que tienen afinidad por las

proteínas.

• Formación de una o más capas de inmunocomplejos. Esta formación

puede recibir dos nombres distintos ; donde el antígeno unido a una palca

En el caso del antígeno unido a la placa se puede revelar mediante un

anticuerpo anti-antígeno marcado �ELISA directo� o el otro caso es

utilizando un anticuerpo primario anti-antígeno marcado �ELISA

indirecto�.

• Revelado de la reacción enzimática: Después de realizar el lavado con

el fin de eliminar todas las moléculas que no pueden formar

inmunocomplejos, se añade un sustrato enzimático que permite

evidenciar la reacción. Esta reacción se puede leer a una densidad óptica

mediante el espectrofotómetro.

En la tecnica de ELISA se pueden encontrar tres tipos de tecnicas que son las

siguientes:

� ELISA directo: Las micropocillos de la placa se encuentran recubiertos

por anticuerpos marcados; esta técnica se utiliza cuando se sospecha

que en la muestra se encuentra el antígeno. Como control de calidad se

deben realizar controles positivos y negativos (5).

� ELISA indirecto. Las micropocillos de la placa se encuentran

recubiertos con antígeno especifico, en el momento de adicionar la

161

muestra si se lleva una reacción en la formación de inmunocomplejos, se

adiciona un anti-anticuerpo marcado con una enzima (Anexo 12).

� Tipo sandwich: Los anticuerpos especificos se encuentran unidos a un

pozo en la microplaca, consecutivamente se añade la muestra donde el

objetivo final es encontrar el antigeno; si esta presente se lleva la union

entre antigeno y anticuerpo; despues de un corto periodo se realiza un

lavado para eliminar los residuos de muestra, luego se añade el sustrato.

La reaccion se interpretara como positiva cuando emite un color la

microplaca donde se llevo a cabo el analisis (Anexo 13). (5)

8.2 TECNICAS BASADAS EN BIOLOGIA MOLECULAR

La finalidad de los metodos de biologia molecular es detectar secuencias

especificas de ADN de un microorganismos y por medio de otras tecnicas

amplificar estas secuencias y realizar ciertos numeros de copias de la reaccuion

especifica.

8.2.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): La PCR se comenzó a

utilizar a partir del año de 1983 por K. Mullis, esta técnica facilita disponer de

varias copias del DNA, por medio de la utilización de varias enzimas como la

polimerasa que es una enzima que copia la hebra sencilla del DNA cuando este

se desnaturaliza después de que un primer se encuentre unido al extremo 5´

(Anexo 14,15).

La realización de la PCR se hace en varios pasos:

� Desnaturalización de las cadenas de ADN: En este proceso se aumenta

la temperatura entre 90°C-95°C, que rompe los puentes de hidrogeno y

se obtienen las cadenas monocatenarias.

� Se adicionan los Primers o cebadores que se unen a las cadenas

complementarias 5´-3´ y el otro a la cadena en sentido 3´-5´; limitando la

región de la cadena que se desea amplificar.

� Después de que se realiza este proceso se disminuye la temperatura

para permitir que los Primers se puedan unir a las cadenas

correspondientes por complementariedad.

162

� Luego se adiciona la ADN polimerasa (ATP, GTP, TTP, CTP) y

cofactores (magnesio) que ayudan para que se lleve la síntesis de la

cadena complementaria. En esta etapa la DNA polimerasa va añadiendo

los desoxinucleotidos trifosfato libres en sentido 3

• Este proceso se puede repetir de 30-35 ciclos; el cual se realiza en un

termociclador que regula las temperaturas que se necesitan en cada

paso; donde se repite el proceso de desnaturalización, hibridación y

síntesis de DNA (2,4,6).

8.2.2 PCR cebadores arbitrarios(AP): En esta tecnica se amplifican diferentes

fragmentos de ADN simultaneamente, utilizando un Primers de 915 pares de

bases. En esta reaccion se manejan temperaturas entre 35-39°C lo que favorece

la inespecificidad de la reaccion. Estos fragmentos de DNA se estudian por

tecnicas de electroforesis donde se utiliza gel de celulosa; el cual es coloreado

con Bromuro de etidio (2)

8.2.3 PCR con enzimas de restriccion (RFLP): En esta tecnica el DNA que se

ha obtenido mediante el proceso de extraccion, es digerido por unas enzimas de

restriccion; estas enzimas son las encargadas de cortar los acidos nucleicos en

regiones especificas. Los fragmentos que se obtienen se visualizan mediante la

tecnica de electroforesis. Posterior a esto se lleva a cabo el proceso de

hibridacion , utilizando una sonda que se une a los fragmentos fijados a la

membrana de nylon (Southem blotting), que posea una cadena complementaria.

(3)

8.2.4 PCR amplificación del DNA polimórfico (RAPDs): En esta técnica se

pueden utilizar primers arbitrarios, lo que da la ventaja de poder amplificar

cualquier región del DNA, el polimorfismo que se observa es consecuencia de

procesos de inserción y delesion que alteran una o mas secuencias del Primers.

Estas alteraciones se pueden observar por la presencia o ausencia de bandas;

esta técnica tiene la gran ventaja que son de bajo costo y de rápida utilización.

(3)

8.2.5 PCR en longitud de fragmentos amplificacion en polimorfismos

(AFLP): En esta tecnica se puede utilizar la digestion con enzimas de restriccion

163

del DNA polimorfico y posteriormente se realiza una amplificacion selectiva;

estos fragmentos se separan en un gel y se puede evidenciar por una

quimiluminiscencia. (3)

164

BIBLIOGRAFIA

1. A. O. Fung, C-Y Yang, B. Brough, F. Gu, C-M Ho, W. Shi, C. D.

Montemagno, 2005, �Fluorescent detection of oral pathogens by a solid-

phase inmunoasay on PDMS�, Revista Engineering in Medicine and

Biology, Volumen 1 Nº 4, pag 2630-2633.

2. Alaluusua S., Grönroos L., 2000, �Site-specific oral colonization of Mutans

Streptococci detected by arbitrarily primer PCR fingerprinting�, Caries

research, Volumen 34, pag 474-480. (3)

3. Becker Mitzi R., Boches Susan K., Dewhirst Floyd E., Galvin Jamie L.,

Griffen Ann l., Kenyon Sarah G.,Leys Eugene J., Moeschberger Melvin L.,

2002, �Molecular analysis of bacterial species asociatedwith childhood

caries�, Journal of Clinical Microbiology , Volumen 40 Nº3, pag 1001-

1009. (2)

4. IGARASHI T., GOTO N., YAMAMOTO A., 2000, PCR for detection and

identification for Steptococcus sobrinus, Journal Medical Microbiology,

Volumen 49, Pág. 1069-1074.



6. Takeshi Igarashi, Kiyoko Ichikawa, Ayako Yamamoto, Nobuichi Goto,

2001, �Identification of mutans streptococcal species by the PCR products

of the dex genes�, Journal of Microbiological Methods, Volumen 46, pag

99�105

165

CAPITULO 9

VIABILIDAD Y PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

La capacidad y habilidad para mantener microorganismos en estado viable

durante largos períodos de tiempo es muy importante para instituciones que los

coleccionan, para industrias que los utilizan y para el transporte de muestras que

los contienen.

La principal función de cualquier cepario o institución coleccionadora de

microorganismos es servir de depósito de todos los microorganismos aislados e

identificados en investigaciones realizadas en el pasado y en el presente. La

preservación apropiada de los microorganismos que hacen parte del cepario es

extremadamente importante y debe tener la misma atención que la

estandarización de equipos y la selección de reactivos químicos. Igualmente, la

preservación de microorganismos debe garantizar la viabilidad del organismo en

estado inactivo, puro, sin variaciones ni mutaciones, es decir, en una condición lo

más cercana posible a la original.

Entre otras, hay cuatro razones para contar con microorganismos debidamente

preservados:

1. En los procesos de enseñanza, para facilitar el aprendizaje, se requieren

microorganismos de referencia que exhiban características típicas.

2. En los laboratorios industriales se necesitan microorganismos para el

mantenimiento de la producción de ciertos productos.

3. En taxonomía, para realizar estudios comparativos.

4. En los laboratorios de investigación, para múltiples propósitos en estudios

metabólicos, genéticos, epidemiológicos, inmunológicos, fisiológicos y

patológicos.

5. El costo de la preservación y mantenimiento, así como el tiempo durante

el cual los microorganismos permanecen viables, determinan la selección

de la técnica de preservación. Hoy día, la mayoría de métodos

empleados en la preservación de microorganismos requieren sistemas de

166

almacenamiento altamente especializados, un gran soporte en equipo

tecnológico, conocimiento y con frecuencia ambientes controlados a

temperaturas muy bajas.

6. No todos los microorganismos responden de manera similar al método

empleado. A menudo, la disponibilidad de equipo, el espacio para

almacenar y la experiencia propia, determinan el método a emplear. Es

necesario tener el conocimiento y la experiencia en el manejo de estas

metodologías con el fin de hacer el mejor aprovechamiento de los

microorganismos confiados a un cepario.

7. En este capítulo se describen las principales características de los

métodos de preservación a término corto y largo, nuevas metodologías y

la experiencia con estos métodos en diferentes grupos bacterianos.

9.1 MÉTODOS DE PRESERVACIÓN A TÉRMINO CORTO

9.1.1. Subcultivo: La transferencia periódica (subcultivos) a medios de cultivo

frescos en tubos o cajas de petri es el método tradicionalmente usado para la

preservación de bacterias (1,2). El lapso en el cual se deben realizar nuevos

subcultivos depende del tipo y del metabolismo del microorganismo y como

también del medio de cultivo empleado para su mantenimiento. Con este

método de preservación, por ejemplo, cepas de los géneros Streptococcus,

Actinomyces, Corynebacterium y Staphylococcus tienen una viabilidad en

subcultivo de 1-2 meses y bacterias de los géneros Lactobacillus, Actinobacillus,

Bacteroides, Bifidobacterium y Haemophilus, tienen una viabilidad de una

semana (2,3).

Con el fin de obtener el mejor rendimiento de este método de preservación, es

necesario tener en cuenta tres aspectos:

1. Utilización de un medio de cultivo adecuado.,

2. Temperatura ideal de almacenamiento.

3. La Frecuencia de realización de las transferencias.

167

9.1.2 Medio de cultivo adecuado: En este método de preservación, se

prefieren los medios de cultivo mínimos o esenciales en los subcultivos, porque

disminuyen la tasa metabólica del microorganismo y, de hecho, su crecimiento,

lo prolonga el tiempo del subcultivo. Sin embargo, algunas bacterias requieren

medios de cultivo complejos para su crecimiento, o la adición específica de

sustancias al medio de cultivo que retardan la actividad metabólica del

microorganismo.

9.1.3 Condiciones de almacenamiento: El método de almacenamiento más

indicado para la conservación de los microorganismos subcultivados es la

incubación a temperatura ambiente (20 - 25 oC ). Debido a que algunos cambios

de temperatura tienden a llevar agenerar un secamiento rápido de los medios,

los cultivos almacenados en esta forma requieren cuidados constantes. Para

minimizar la deshidratación, se podrían usar tubos con tapa rosca con empaque

de caucho, sellar los tubos con parafilm (Sigma Chemical Co, St Louis, MO,

USA) o introducir los tubos en bolsas plásticas. Si se desea prolongar la

viabilidad del subcultivo de entre 3- a 5 meses, los tubos deben refrigerarse entre

5 y 8º 0C.

9.1.4 Frecuencia de las transferencias: La frecuencia para realizar

transferencias estará determinadao por la experiencia propia de quienes trabajan

con este método. Con esta metodología de preservación, Es importante seguir

las siguientes recomendaciones:

1. Mantener cultivos en duplicado como una precaución contra posibles

pérdidas.

2. Examinar la pureza de los cultivos después de cada transferencia.

3. Ejecutar un programa para monitorear la conservación de las

características fenotípicas.

4. En el momento de la transferencia, no seleccionar colonias aisladas

porque aumenta la posibilidad de aislar mutantes.

Las grandes desventajas de estea método de preservación son el riesgo de

contaminación en las transferencias, la transposición o pérdida de etiquetas, la

pérdida de los subcultivos, la selección de variantes o mutantes, el gran espacio

de almacenamiento requerido y el mantenimiento intensivo y laborioso.

168

9.1.5 Inmersión en aceite mineral

Muchas especies bacterianas son exitosamente preservadas con éxito por

durante meses o años por el método de inmersión en aceite mineral (aceite de

parafina de grado medicinal y una densidad de 0.865 a 0.890). Especies de los

géneros Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium y Actinobacillus

son preservadas con viabilidad entre 1 a y 3 años; sin embargo, cepas del

género Haemophilus escasamente se mantienen viables durante 1 un mes (3,4).

Con el fin de preservar con este método, el microorganismo se cultiva en medio

de cultivo sólido en pico de flauta o en medio líquido, y se incuba en las

condiciones apropiadas. Después de que se obtiene el crecimiento del

microorganismo, se adiciona el aceite en forma aséptica, formando una capa de

unos 2 cm aproximadamente (el agar en pico de flauta debe ser enteramente

cubierto por completo), con el fin de prevenir la deshidratación, y reducir la

actividad metabólica y el sobrecrecimiento excesivo del microorganismo. Las

transferencias del medio de cultivo cubierto con aceite se hacen por punción y se

siembran en un nuevo medio que se cubre con aceite estéril.

Las desventajas de este método son las mismas del subcultivo ordinario. La

contaminación de los cultivos generalmente ocurre por la inadecuada

esterilización del aceite mineral. El aceite debe esterilizarse por calentamiento en

un horno a 170°C durante dos horas (no se recomienda hacerlo en autoclave)

(6,4).

9.1.6 Desecación: Muchos microorganismos se mueren porque los medios

de cultivo en los que se aíslan se secan. Sin embargo, algunas bacterias que al

secarse forman esporas pueden ser preservadas durante años, usando el

método de desecación en forma apropiada. El principio de este método de

preservación de microorganismos, muy utilizado, tiene como principio

fundamental es remover el agua y evitar la rehidratación de las bacterias

preservadas. Para obtener buenos resultados con este método, es necesario

tener en cuenta el medio en el cual se va realizar la desecación del

microorganismo: suelo, arena, sílica gel, papel, gelatina y comprimidos

presecados (2).

� Suelo: Las bacterias que forman esporas han sido satisfactoriamente

preservadas por años dentro en de una mezcla estéril de suelo. Con este

169

fin, se inocula una suspensión de esporas bacterianas en tubos que

contienen el suelo estéril (puesto en el autoclave por unas cuantas

horas en dos días sucesivos). Los tubos con las esporas y el suelo se

mantienen a temperatura ambiente hasta la sequedad, para luego

cerrarlos con un tapón de caucho estéril y almacenarlos a temperatura

de refrigeración; sin embargo, especies de los géneros Actinomyces y

Bacillus han sido exitosamente preservadaos de entre 1 a y 2 años.

� Papel: Con este método, simple y económico, miembros de la familia

enterobacteriacea y del género Staphylococcus, así como otra gran

variedad de bacterias, han sido exitosamente preservados durante años.

El procedimiento involucra:

1. La saturación del papel estéril (tiras o discos) con una suspensión

bacteriana en concentración de 108 células por mililitro.

2. El papel se saca de la suspensión bacteriana y se deja secar al

aire o al vacío (lo que permite una mayor supervivencia del

microorganismo).

3. Las tiras o discos de papel se almacenan en tubos con

desecadores o se dejan entre dos capas de plástico transparente

estéril.

4. Las tiras o discos de papel se llevan al refrigerador, con el fin de

prolongar la viabilidad de las especies preservadas. La ventaja

fundamental de este método es el poco espacio reducido que

ocupan ocupado por las tiras o discos de papel en la etapa de

almacenamiento.

� Gelatina: En este método, la bacteria objeto de preservación se

resuspende en una pequeña cantidad de caldo nutritivo y se inocula en

un tubo que contiene de 2- a 5 ml de gelatina, en estado liquido,

mantenida a 30ºC, para lograr una densidad de 108- a 1010 células por

mililitro. Posteriormente, de 30- a 40 gotas de la suspensión bacteriana

en gelatina son colocadas en el centro de una caja de petri plástica,

estéril, con una jeringa estéril, e inmediatamente congeladas, liofilizadas

y transferidas asépticamente a tubos tipo eppendorf o contenedores

170

estériles para almacenar a temperatura de refrigeración (- 20°C). Para

recuperar las bacterias preservadas, la gota de gelatina desecada se

introduce asépticamente en un caldo o medio de cultivo adecuado para el

crecimiento del microorganismo. Las ventajas fundamentales

fundamentales de este método son:

1. Facilidad de uso.

2. Facilidad de almacenamiento, 30 óo 40 gotas de gelatina se

pueden mantener en un vial de 14 mm.

3. No genera contaminación.

4. Estabilidad de las características genéticas:, al no estar

creciendoneutralizar el crecimiento de la bacteria no hay

oportunidad para mutación o selección.

Con este método han sido preservados con éxito, diferentes miembros de

la familia enterobacteriaceae y del género Staphylococcus por lo menos

durante cuatro años (2).

� Comprimidos presecados: Materiales como el almidón, la peptona o el

dextrano han sido usados para preservar algunas especies microbianas.

En esta técnica, pequeños volúmenes de suspensiones bacterianas (108

células por mililitro) se adicionan sobre estos materiales para luego ser

sometidos a secado y almacenamiento al vacío. Este método ha

mostrado resultados satisfactorios en bacterias de manejo delicado y

difíciles de liofilizar (por ejemplo, Neisseria gonorrhoeae y Vibrio

cholerae).

9.1.7 Congelación común: La preservación de bacterias también se puede

hacer por congelación en un rango de temperaturas de entre 0 y - 20° C. En

general, aunque este método no se recomienda para la preservación, debido a

que algunos componentes del medio de cultivo pueden causar daños en las

células, está claro que algunas bacterias se pueden mantener por este método

en un rango de 6 meses a 2 años. Por ejemplo, Cepas de los géneros

Actinomyces , Bacillus y Clostridium se mantienen viables entre 2 y 3 años; y

171

especies de los géneros Bacteroides, Corynebacterium y Staphylococcus

permanecen viables por al lo menos durante 1 un año.

Hasta este momento, ninguno de los métodos mencionados hasta este momento

tiene aplicación universal, ya que en la mayoría de los casos han sido utilizados

en grupos particulares de microorganismos.

9.2 MÉTODOS DE PRESERVACIÓN A TÉRMINO LARGO

9.2.1 Liofilización: La liofilización, proceso en el cual el agua es removida por

evaporación de las suspensiones bacterianas congeladas, ha permitido la

preservación exitosa de una gran variedad de especies bacterianas

(Streptococcus, Lactobacillus, Actinobacillus, Actinomyces, Bacillus, Bacteroides,

Bifidobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Haemophilus y Staphylococcus)

por más de 30 años. En este proceso, las bacterias previamente aisladas e

identificadas son suspendidas en un medio crioprotector adecuado y después de

ser congeladas, son sometidas al vacío para extraer por sublimación el agua del

medio. Las bacterias liofilizadas pueden permanecer viables y almacenadas a

bajas temperaturas, por muchos años y ser fácilmente rehidratadas y

restauradas a su estado original en cualquier momento. La liofilización ha sido

universalmente utilizada para preservar diferentes microorganismos, entre los

que se encuentran, levaduras, hongos, bacterias y virus (5).

El equipo de liofilización más sencillo está conformado por un desecador unido a

una bomba de vacío. El desecador posee un compartimiento refrigerado

(condensador) para mantener en estado sólido las suspensiones bacterianas

previamente congeladas. A continuación se describen las condiciones con las

que se puede lograr una excelente liofilización.

� Preparación del microorganismo: El éxito del proceso de liofilización

depende del uso de bacterias sanas que han crecido en condiciones

óptimas. Se requiere de un número suficiente de células, por lo menos

108 células por mililitro, tomadas en el momento de máxima estabilidad y

viabilidad (en el último estado de la fase logarítmica).

172

� Agentes crioprotectores: Para facilitar la preservación de las células

durante largos períodos de tiempo es necesario que el medio a congelar

contenga un agente crioprotector. Los agentes crioprotectores retardan la

formación intracelular de cristales de hielo y reducen el potencial de daño

osmótico durante el congelamiento y el descongelamiento (1). Entre los

agentes crioprotectores utilizados se destacan alcoholes, carbohidratos,

aminoácidos, extracto de levadura y leche descremada (1).

Para la preservación de bacterias por congelamiento, los dos agentes

crioprotectores más utilizados son el glicerol y el dimetil-sulfóxido

(DMSO). En la liofilización, los crioprotectores más usados son: leche

descremada, combinaciones de dextrano (10%) y trealosa (5%), o

sacarosa (20%) y albúmina sérica bovina �fracción V� (10%) (8,9).

También existen un gran número de agentes osmoprotectores, entre

ellos, trealosa, ectoina y glicina betaina (GB)(1). La GB al 12% fue

evaluada en la preservación de miembros del género Acidothiobacillus, el

cual es difícil de preservar (1). Los resultados con este osmoprotector

indican que es un crioprotector muy útil, que trabaja muy bien en un

amplio rango de organismos procariotas, en diferentes procedimientos de

criopreservación. A continuación se describe el procedimiento seguido

con leche descremada al 20%, uno de los mejores agentes

crioprotectores:

1. Se prepara una solución de leche descremada al 20% en agua

estéril y se esterilizan pequeños volúmenes (5ml) a 116oC

durante 20 minutos, evitando el sobrecalentamiento que puede

generar la caramelización de la leche.

2. Se recoge asépticamente el crecimiento bacteriano (células sanas

que han crecido en condiciones óptimas) tanto del medio de

cultivo sólido como del líquido, y se resuspenden con leche

descremada al 20% para obtener una suspensión de por lo menos

108 células por mililitro.

3. Se dispensan 0.2ml de la suspensión bacteriana en leche

descremada en tubos eppendorf de 1ml y se llevan a temperatura

de -70°C por lo menos durante dos horas.

173

4. El intervalo de tiempo entre la congelación a -70°C y la extracción

del vapor de agua (liofilización) debe ser mínimo para evitar daños

en las células preservadas.

� Almacenamiento de las bacterias liofilizadas: Para lograr una mayor

viabilidad y duración de las bacterias liofilizadas, se recomienda

almacenar las bacterias liofilizadas a -70°C. Debe evitarse mantenerlas a

temperatura ambiente.

� Vigilancia de la viabilidad: La viabilidad de las bacterias debe ser

evaluada antes y después de la liofilización con el fin de determinar la

efectividad del proceso. Además de hacerse pruebas de viabilidad

periódicas para conocer la expectativa de vida de las bacterias

liofilizadas, es necesario realizar de nuevo pruebas de caracterización

bioquímicas, serológicas y genotípicas, con el fin de determinar si han

ocurrido cambios como resultado de la liofilización o del proceso de

almacenamiento.

9.2.2 Ultracongelamiento: La preservación por congelación ocasiona daños a

las células, durante las etapas de congelamiento y descongelamiento. Los daños

son causados por la concentración de sales y otros metabolitos y/o por la

formación de cristales de hielo que rompen la integridad celular. Estos efectos

nocivos se pueden eliminar mediante el ajuste gradual de las tasas de

congelamiento y descongelamiento, así como por la adición de sustancias

crioprotectoras a las células (glicerol), para el posterior sometimiento a la

ultracongelación. El ultracongelamiento se puede realizar con nitrógeno líquido a

� 196° 0C o con perlas de vidrio a �70°ºC.

� Nitrógeno líquido: La criopreservación con nitrógeno líquido a -196°C

proporciona excelentes resultados en microorganismos que no pueden

ser preservados de otra manera (4,5). Con este método, cepas de los

géneros Streptococcus, Lactobacillus, Actinobacillus, Actinomyces,

Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Corynebacterium,

Haemophilus y Staphylococcus han sido preservadas con éxito más de

30 años. Para obtener excelentes resultados con este método, es

necesario seguir las recomendaciones que se describen a continuación:

174

1. Equipo y viales: Actualmente se cuenta con una variedad de

refrigeradores de nitrógeno líquido con amplias características y

capacidad de almacenamiento, que facilitan el proceso. Un

ejemplo de estos equiposellos es el MVE (Cryogenics, Linde,

Union Carbide Corp.). Generalmente, los viales utilizados para el

almacenamiento son criotubos de polipropileno, viales y capilares

de vidrio.

2. Agentes crioprotectores: Se conocen dos tipos de agentes

crioprotectores; en el primer grupo se ubica el glicerol, que actúa

atravesando la membrana celular para proteger a la célula intra y

extracelularmente contra la congelación; el otro tipo de agentes

crioprotectores, la sacarosa, la lactosa, la glucosa, el manitol, el

sorbitol, el dextrano, la polivinil pirrolidona y el poliglicol, que

ejercen su acción protectora en el exterior de la célula. La

selección del agente crioprotector depende de la especie

bacteriana a preservar, y con esta finalidad se deben hacer

pruebas previas de tolerancia con el microorganismo para evaluar

los efectos tóxicos o benéficos. El glicerol y el DMSO se emplean

rutinariamente a concentraciones de 10 y 5 % (vol./vol.),

respectivamente, en medios de crecimiento apropiados.

3. Condiciones de la bacteria: La condición fisiológica de los cultivos

bacterianos desempeña un papel muy importante en la

supervivencia de las bacterias que se van a congelar en con

nitrógeno líquido, por lo que se prefiere el uso de células

metabólicamente activas, es decir, antes de la finalización de la

fase logarítmica de crecimiento.

� En perlas de vidrio a �70° C: En este método de almacenamiento las

bacterias a preservar se suspenden en un tubo que contiene una solución

de glicerol al 15% y perlas de vidrio, el cual se lleva a -� 70° 0C. El

método es rápido, de fácil manejo y no requiere de manipulación

posterior al período de almacenamiento. Algunas ventajas son:

1. Cuando se quieran utilizar las bacterias preservadas, cada perla

de vidrio provee material suficiente para realizar un subcultivo.

175

2. Es ideal en el almacenamiento de grandes colecciones de

microorganismos, ya quepues esto permite que un gran número

de viales puedan ser almacenados en un un mínimo espacio

reducido (1).

9.3 CONGELAMIENTO EN MICROTUBOS DE RESINA

Actualmente, en las instituciones que coleccionan microorganismos la

criopreservación se realiza en criotubos de polipropileno y en capilares de vidrio.

Las pajitas de resinas ionoméricas son utilizadas en la criopreservación de

materiales biológicos (3); sin embargo, se sabe muy poco acerca de la

criopreservación de microorganismos en estos microtubos (5,6).

Las pajitas de resina que se utilizan son de la empresa CryoBioSystem (CBS-

IVM Technologies, Láigle, France). En condiciones asépticas, a cada pajita de

resina se le coloca una boquilla con el fin de succionar con una bomba de

aspiración las bacterias a preservar. Posteriormente, el extremo libre de la pajita

se sella con la máquina manual SYMS (CBS-IMV Technologies) y se le coloca

una banda de identificación. Finalmente, se sella el otro extremo por donde se

hizo la succión. Las pajitas con las bacterias a preservar son llevadas al

congelador (Compatible Control Thermostat Unistat CC bath, Bioblock Scientific,

Illkirch, France) a -20°C. Para recuperar la bacteria preservada, se descongela

la pajita y se cortan los dos extremos sellados con la maquina térmica de corte

(CBS-IVM Technologies). Mediante presión realizada con una delgada punta

plástica aséptica, el botón celular es expulsado a un caldo de cultivo (6).

En un estudio realizado por Thammavongs y col. (6) se informa que, en

comparación con criotubos, la conservación en pajitas de resina conduce a un

ligero incremento en la supervivencia de Lactobacillus cremoris y Geotrichum

candidum (6). Este sistema presenta cuatro características principales:

1. Ofrece alta resistencia ante el estrés térmico.

2. El sellamiento hermético es seguro.

3. Es un sistema seguro por ser inviolable la identificación.

4. Permite mejor homogeneidad en el congelamiento y descongelamiento.

176

BIBLIOGRAFIA

1. Hubalek Z. Protectants used in the cryopreservation of

microorganisms. Cryobiol 2003; 46: 205-229.

2. Kirsop BE, Snell JJS. Maintenance of microorganisms. A manual of

laboratory methods. 1ª. ed. Orlando, Florida 32887: Academic Press

INC; 1984. Pp 14-15.

3. Lapage SP, Shelton JE, Mitchell TG, Mackenzie AR. Methods in

microbiology. Vol 3, London: Academic Press; 1970. Pp 135-228. (2)

4. Perkins JJ. Principles and methods of sterilization in health science.

Charles C Thomas, Publisher, Springfield, Illinois; 1976. Pp 286-292.

5. Rudge RH. Maintenance of microorganisms. A manual of laboratory

methods. 1ª. ed. Orlando, Florida 32887: Academic Press INC;1984.

Pp 23-33.

6. Speck ML, Cowman RA. Proceedings of the First International

Conference on Culture Collections, Tokyo. University of Tokyo

Press;1970. Pp 241-250.

177

CONCLUSIONES

• La caries dental es considerada consecuencia de un desequilibrio en el

ecosistema oral que lleva al predominio de una flora, antes considerada

normal en cavidad oral y ahora convertida en patógena.

• En el proceso de la caries se encuentran implicados diversos factores

que favorecen su desarrollo, entre ellos destacamos: 1. Dieta rica en

hidratos de carbono con elevada actividad cariogénica, 2. La

susceptibilidad del diente, 3 La presencia de microorganismos

cariogénicos (Streptococcus mutans y en menor proporción S. sobrinus,

S. gordonii; y 2. especies de Lactobacillus y Actinomyces).

• El proceso de formación de la caries dental se empieza a formar a partir

de la adhesión de glicoproteinas que hacen parte de la saliva, conocido

como biopelícula, en esta fase los microorganismos que hacen parte de

la cavidad oral reconocen las glicoproteinas y establecen enlaces que le

permiten adherirse. A partir de este momento las bacterias cariogenicas

realizan el metabolismo a partir de los carbohidratos (sacarosa),

onteniendo como resultado la acidificacion del medio y se realiza el

proceso de desmineralización del esmalte; observandose pequeñas

fisuras en la estructura dental.

• Las bacterias caroigénicas tienen la capacidad de producir enfermedades

por dos mecanismos: Colonización e invasión de tejido y producción de

toxinas que se pueden diseminar en todo el cuerpo humano.

• Algunas bacterias como Streptococcus mutans , S. sobrinus, S. gordonii;

Lactobacillus y Actinomyces son relevantes en el proceso de colonización

y replicación por : poder acidofílico, acidogenico, acidúrico, producción

de polisacáridos intracelulares, producción de polisacáridos

extracelulares, síntesis de glucanos y fructanos, proteínas de adhesión

celular.

178

• En la actualidad para la identificacion de microorganimos se emplean

tecnicas tradicionales como pruebas bioquimicas, medios de cultivo que

han sidero mejoradas por casas comerciales para disminuir el tiempo que

se necesita para su cultivo. Pero tambien hay otras pruebas que facilitan

la identificacion de microorganimos como son la prueba de reaccion en

cadena de polimerasa, que son mas costosas pero se identifica la

especie y posiblemente el serotipo. Es importante la conservación o

preservación de microorganismos es extremadamente importante y debe

garantizar el mantenimiento del organismo en estado inactivo, puro, sin

variaciones ni mutaciones

• La realización del documento se llevo satisfactoriamente, debido a que se

consiguió suficiente información que facilitó la elaboración de los

capítulos: Ecología microbiana oral, Biopelículas y placa dental,

Microorganismos de importancia en caries dental, Factores de virulencia

de microorganismos cariogénicos, Descripción de medios de cultivo,

Descripción y fundamento de las pruebas bioquímicas, Sistemas

comerciales utilizados en la identificación de microorganismos de cavidad

oral, Sistemas moleculares útiles en la identificación de microorganismos

de la cavidad oral, Técnicas de preservación de microorganismos; que

servirá como documento de consulta para aquellos estudiantes con

orientación profesional en Odontología y Bacteriología que se interesen

en la identificación de microorganismos cariogénicos.

179

BIBLIOGRAFIA

1. Baños Román Francisco Fernando, Refugio Aranda Jacobo, 2003, �Placa dentobacteriana�, Revista de la Asociación Dental Mexicana, Volumen 60 Nº, Pág. 34-36.

2. Calatrava O. Luis Alonso, �Crecimiento científico contemporáneo, escenario epidemiológico actual de las enfermedades bucales y currículo odontológico�,

3. Carranza Fermin A., 1995, �Peri odontología Clínica�, Octava Edición, Interamericana McGaw-Hill, Mexico, Cap. 1, 2, 6-8

4. Guillarte C., Perrone, Vicentelli M. Raúl, 2004, �Microorganismos de la placa dental relacionados con la etiología de la periodontitis� Volumen 42 Nº 3.

5. Liebana Ureña José, 2000, �Microbiologia oral�, Segunda Edición, Interamericana McGaw-Hill, España, Cap. 30-34

6. Peña Ruiz Tatiana, Delgado Ramos Ariel, Martínez Abreu Yudit, 2007, �Nociones actuales sobre la flora microbiana del surco gingival�, Revista Cubana Estomatologia, Volumen 44 Nº3.

7. Pérez Luyo Ada G., �La Biopelícula: una nueva visión de la placa dental�, Revista Estomatológica Herediana.

8. Rodriguez Pérez Elba, 2006, �Manual de microbiologia oral�, Primera Edición, Interamericana McGaw-Hill, Mexico, Pág. 53-59

9. Sarabia Maheli; Gómez Meriño Mercedes; García Oscar, 2005, �La dieta y su relevancia en la caries dental y la enfermedad periodontal�, Revista Médico de Camagüey, Volumem 9.

10. Serrano Granger Jorge, 2005, �La placa dental como biofilm. ¿Cómo eliminarla?�, RCOE, Volumen 10, Nº4, Pág. 431-439

180

ANEXOS

ANEXO. 1 Reaccion de la prueba de oxidasa.

ANEXO 2. Hidrólisis de bilis y esculina

ANEXO 3. Reaccion de descarboxilacion de Lisina

181

ANEXO 4. Reaccion de descarboxilacion de Ornitina

ANEXO 5. Reaccion de descarboxilacion de Arginina

ANEXO 6. Reaccion quimica de la prueba de ureasa.

182

ANEXO 7. Reaccion de la prueba de TSI

ANEXO 8. Reaccion quimica de la prueba de indol.

ANEXO 9. Reaccion de nitratos.

183

ANEXO 10 Reaccion de la prueba de licuefaccion en gelatina

ANEXO 11 Reaccion de la prueba de hidrólisis de pirrolidonil- β-naftilamida

ANEXO 12 ELISA indirecto

184

ANEXO 13 ELISA tipo Sandwich

ANEXO 14 Proceso de la reaccion en cadena de la polimerasa

185

ANEXO 15 Ciclos de la Reaccion en cadena de la polimerasa

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