Estudo bioguiado através da atividade anticolinesterásica e da ...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

DAYSE SANTOS ALMEIDA CASSIANO

ESTUDO BIOGUIADO ATRAVÉS DA ATIVIDADE

ANTICOLINESTERÁSICA E DA ANÁLISE POR CLAE-DAD E CLAE-DAD-EM/EM DE Ocotea spp. (LAURACEAE)

Feira de Santana, BA 2014

DAYSE SANTOS ALMEIDA CASSIANO

ESTUDO BIOGUIADO ATRAVÉS DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA E DA ANÁLISE POR CLAE-DAD E

CLAE-DAD-EM/EM DE Ocotea spp. (LAURACEAE)

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.

Orientador: Prof. Dr. Alexsandro Branco

Feira de Santana, BA 2014

Ao Criador, Deus

AGRADECIMENTOS

A Deus pela proteção ininterrupta e por renovar minhas forças em cada nova fase da

minha vida.

Ao meu querido esposo Nadson pelo amor, compreensão, apoio e incentivo.

Aos meus pais, Nita e Nivaldo e as minhas irmãs Dayane e Daysyane pelo amor e

carinho mesmo estando longe.

Ao meu orientador, Prof. Alexsandro Branco (UEFS) por mais uma vez ter acreditado e confiado em mim.

À Profª Rosilene Moretti Marçal (UFS) por ceder seu laboratório e sempre estar

disposta a me ensinar.

Ao Prof. Jorge M. David (UFBA) por facilitar a utilização do laboratório de Produtos

Naturais e pelo carinho com que me recebeu.

Aos amigos do laboratório de fitoquímica da UEFS pelo convívio e amizade. Às minhas “secretárias” Patrícia e Isabela que me deram uma mãozinha no final do

doutorado.

Aos novos amigos que fiz na UFBA.

Aos amigos de Feira de Santana e Salvador, especialmente ao casal Valéria e

Juninho, às amigas Ingrid e Mona Lisa, ao casal Avelino e Lídia e ao meu tio

Erivaldo que me cederam um lugarzinho em suas casas no período em que estive

em Feira de Santana e Salvador.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBiotec) pela oportunidade e

à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

bolsa de estudo.

“Até os jovens se cansam e ficam exaustos, e os moços tropeçam e caem; mas os que esperam no Senhor, renovam as suas forças. Voam alto como águias; correm e não se cansam, caminham e não se fatigam.”

(Isaías 40:30 e 31)

“...De cada lado do rio estava a árvore da vida... E as suas folhas servirão para a cura das nações”

(Apocalipse 22:2)

RESUMO

A família Lauraceae é constituída por 52 gêneros dentre os quais o gênero Ocotea Aubl. se destaca devido ao grande número de espécies de elevada importância econômica. O presente trabalho teve como principal objetivo realizar um estudo bioguiado pelo ensaio in vitro de avaliação da atividade anticolinesterásica a partir de espécies de Ocotea ainda não estudadas e disponíveis no semiárido baiano. Os extratos em diclorometano de O. pomaderroides (EDiOPom), O. percoriacea (EDiOPer), O. spixiana (EDiOS), e Ocotea sp. (EDiOsp) inibiram a atividade acetilcolinesterásica em 71,86; 92,09; 74,45 e 77,74%, respectivamente. Os extratos hexânicos: EHexOPom, EHexOPer e EHexOsp apresentaram atividade anticolinesterásica de 92,18; 83,28 e 86,72%, respectivamente e os extratos em acetato de etila: EAcOPOm e EAcOsp inibiram a ação da acetilcolinesterase em 74,25 e 76,19%. Os extratos EDiOPom e EDiOPer foram fracionados por cromatografia em coluna de sílica gel e as frações obtidas também foram submetidas a avaliação da atividade anticolinesterásica. As frações 4/5 (obtida de EDiOPom), 5/6 (proveniente de EDiOPer) e 10/7 (obtida de 5/6) demonstraram atividade anticolinesterásica de 89,03; 87,23 e 99,94%, respetivamente, comparável ao padrão eserina que inibiu a atividade da enzima em 94,35%. As frações ativas 4/5, 5/6 e 10/7 possuem, portanto, elevado potencial como produto biotecnológico com potente atividade acetilcolinesterásica. As análises do perfil químico por CLAE-DAD e CLAE-DAD-EM/EM dos extratos mais ativos revelaram a presença de flavonoides glicosilados derivados da quercetina e do canferol, além de flavonoides di-cumaroil glicosilados como substâncias majoritárias presentes nas amostras testadas. A partir da fração 5/5 (obtida de EDiOPom) foi possível isolar o β-sitosterol, identificado por RMN de 1H e 13C. Este trabalho descreve pela primeira vez estudos químicos e biológicos realizados com as espécies Ocotea pomaderroides, O. percoriacea e O. spixiana. Palavras-chave: Lauraceae. Ocotea. Atividade anticolinesterásica. Flavonoides glicosilados acilados.

ABSTRACT

The Lauraceae family consists of 52 genera among which the Ocotea Aubl. genus stands out due to the large number of species of high economic importance. The present work aimed to carry out a study in vitro bio-guided assay, evaluating the acetylcholinesterase inhibitory activity from Ocotea species not yet studied and available in Bahia State's Semi-arid region. The dichloromethane extracts of Ocotea pomaderroides (EDiOPOm), O. percoriacea (EDiOPer), O. spixiana (EDiOS) and Ocotea sp. (EDiOsp) inhibited the acetylcholinesterase activity in 71.86; 92.09; 74.45 and 77.74 %, respectively, for 30 minutes. The hexane extracts: EHexOPom, EHexOPer and EHexOsp showed acetylcholinesterase inhibitory activity of 92.18; 83.28 and 86.72%, respectively, and the extracts in ethyl acetate: EAcOPOm and EAcOsp inhibited the action of acetylcholinesterase in 74.25 and 76.19%. The EDiOPom and EDiOPer extracts were fractionated by chromatography on silica gel column and the fractions obtained were also submitted to the evaluation of anticholinesterase activity. Fractions 4/5 (obtained from EDiOPom), 5/6 (obtained from EDiOPer) and 10/7 (obtained from 5/6) showed anticholinesterase activity of 89.03; 87.23 and 99.94%, respectively, comparable to the standard eserine that inhibited the enzyme activity in 94.35%. The active fractions 4/5, 5/6 and 10/7 have therefore high potential as biotechnological products with potent anticholinesterase activity. The chemical analysis of the profile by HPLC-DAD and HPLC-DAD-MS/MS of the most active extracts revealed the presence of flavonoids glycosides derived from quercetin and kaempferol, as well as di-cumaroil glycosides flavonoids as major compounds present in the samples tested. From the fraction 5/5 (obtained from EDiOPom) it was possible to isolate the β-sitosterol, identified by 1H and 13C NMR. This study describes, for the first time, chemical and biological studies with Ocotea pomaderroides, O. percoriacea and O. spixiana species. Keywords: Lauraceae. Ocotea. Acetylcholinesterase inhibitory activity. Acylated glycosides flavonoids.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estruturas dos principais terpenos encontrados em óleos

essenciais de espécies de Ocotea 24

Figura 2 Principais tipos de sesquiterpenos encontrados em espécies de Ocotea

25

Figura 3 Sesquiterpenos encontrados em espécies de Ocotea 26 Figura 4 Compostos fenólicos encontrados em espécies de Ocotea 29 Figura 5 Lignanas descritas em espécies de Ocotea 30 Figura 6 Principais tipos de neolignanas encontradas em espécies de

Ocotea 31

Figura 7 Alcaloides encontrados em espécies de Ocotea 32 Figura 8 Flavonoides encontrados em espécies de Ocotea 33 Figura 9 Inibidores da acetilcolinesterase utilizados para o tratamento de

DA 37

Figura 10 Espécies de Ocotea coletadas no semiárido baiano 40 Figura 11 Cromatograma por CLAE-DAD de EEtOPer e espectros no UV 65 Figura 12 Estrutura química geral dos flavonoides 67 Figura 13 Cromatograma por CLAE-DAD de EEtOsp e espectros no UV 69 Figura 14 Cromatograma por CLAE-DAD de EHexOPer e espectros no

UV 71

Figura 15 Cromatograma por CLAE-DAD de EHexOsp e espectros no UV 72 Figura 16 Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOPom e espectro no UV 73 Figura 17 Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOPer e espectros no UV 74 Figura 18 Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOS e espectros no UV 75 Figura 19 Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOsp e espectros no UV 76 Figura 20 Cromatograma por CLAE-DAD de EAcOPom e espectros no UV 79 Figura 21 Cromatograma por CLAE-DAD de EAcOsp e espectros no UV 81 Figura 22 Cromatogramas por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5 e

espectros no UV 84

Figura 23 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 3/6 e espectros no UV 86 Figura 24 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 4/6 e espectros no UV 87 Figura 25 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/6 e espectros no UV 88 Figura 26 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 6/6 e espectros no UV 89 Figura 27 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/7 e espectro no UV 91 Figura 28 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 6/7 e espectros no UV 92

Figura 29 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 7/7 e espectros no UV 93 Figura 30 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 8/7 e espectros no UV 95 Figura 31 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 9/7 e espectros no UV 97 Figura 32 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 10/7 e espectros no

UV 98

Figura 33 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 11/7 e espectros no UV

100

Figura 34 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 12/7 e espectros no UV

102

Figura 35 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOPom

107

Figura 36 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOPer

109

Figura 37 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOS

111

Figura 38 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOsp

113

Figura 39 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EAcOPom

116

Figura 40 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EAcOsp

120

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Estado de conservação das espécies de Ocotea, segundo as

categorias descritas na Lista Vermelha da União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (sigla em inglês, IUCN).

22

Quadro 2 Rota biossintética dos fenilpropanoides 28

Quadro 3 Reação de Ellman 63

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Massa total (g) e rendimento (%) dos extratos etanólicos

obtidos a partir dos processos de moagem e da extração por maceração

41

Tabela 2 Massa total (g) das partições obtidas a partir dos extratos etanólicos brutos

42

Tabela 3 Fracionamento de EDiOPom (CC 5) 45 Tabela 4 Fracionamento de 4/5 (CC 10) 46 Tabela 5 Fracionamento de 5/5 (CC 9) 47 Tabela 6 Fracionamento de 6/5 (CC 8) 47 Tabela 7 Fracionamento de EDiOPer (CC 6) 49 Tabela 8 Fracionamento de 5/6 (CC 7) 50 Tabela 9 Inibição da atividade acetilcolinesterásica na presença dos

extratos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min 59

Tabela 10 Inibição da atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas das colunas cromatográficas 5 (EDiOPom), 6 (EDiOPer) e 7 (Fr 5/6 de EDiOPer) nos tempos 30 e 60 min

64

Tabela 11 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EEtOPer

68

Tabela 12 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EEtOsp

70

Tabela 13 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EHexOPer

71

Tabela 14 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EDiOPom, EDiOPer e EDiOS

75

Tabela 15 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EDiOsp

78

Tabela 16 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EAcOPom

81

Tabela 17 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EAcOsp

83

Tabela 18 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5

85

Tabela 19 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 3/6

86


87

Tabela 21 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por 88

CLAE-DAD da fração 5/6 Tabela 22 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por

CLAE-DAD da fração 6/6 91


92


94


96


97


99


101


103

Tabela 30 Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos diclorometano de espécies de Ocotea

106

Tabela 31 Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos acetato de etila de Ocotea pomaderroides

115

Tabela 32 Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos acetato de etila de Ocotea sp.

119

Tabela 33 Dados dos espectros de RMN de 13C [300 MHz, CDCl3, δ (ppm)] do β-sitosterol isolado de EDiOPom e valores da literatura

124

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos

etanólicos brutos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

54

Gráfico 2 Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos hexânicos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

55

Gráfico 3 Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos em diclorometano de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

56

Gráfico 4 Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos em acetato de etila de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

57

Gráfico 5 Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos butanólicos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

57

Gráfico 6 Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos aquosos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

58

Gráfico 7 Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de EDiOPom nos tempos 30 e 60 min

60

Gráfico 8 Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de EDiOPer nos tempos 30 e 60 min

61

Gráfico 9 Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de 5/6 (proveniente de EDiOPer) nos tempos 30 e 60 min

62

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1 Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea

pomaderroides 48

Esquema 2 Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea percoriacea 51

Esquema 3 Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea notata 52

Esquema 4 Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea sp. e Ocotea spixiana

52

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 4/5 (EDiOPom)

137

Anexo 2 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 5/6 (EDiOPer)

140

Anexo 3 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 10/7 (EDiOPer)

149

Anexo 4 Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

155

Anexo 5 Ampliação 1 do espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

156

Anexo 6 Ampliação 2 do espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

157

Anexo 7 Espectro de RMN de 13C (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

158

Anexo 8 Ampliação 1 do espectro de RMN de 13C (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

159


160


161

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AcOEt Acetato de etila

CC Cromatografia em coluna CCD Cromatografia em camada delgada

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

CLAE-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector

de arranjo de diodos

CLAE-EM Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a

espectrometria de massas

DAD Detector de arranjo de diodo

EtOH Etanol

Gal Galactose

Glu Glicose

Hex Hexano m/z Relação massa carga

MeOH Metanol

nm Nanômetros

RMN Ressonância magnética nuclear

RMN de 13C Ressonância magnética nuclear de carbono-13

RMN de 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio tR Tempo de retenção

UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana

UFBA Universidade Federal da Bahia

UV Ultravioleta

Xyl xilose

δ Deslocamento químico em ppm

λmáx Comprimento de onda (nm) de absorção máxima

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 17

2 REVISÃO DA LITERATURA 20

2.1 FAMÍLIA LAURACEAE 20

2.2 O GÊNERO Ocotea E SUA IMPORTÂNCIA ECONÔMICA 21

2.3 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DO GÊNERO Ocotea 23

2.3.1 Terpenos 23

2.3.2 Fenilpropanoides e derivados 27

2.3.3 Lignanas 29

2.3.4 Neolignanas 30

2.3.5 Alcaloides 31

2.3.6 Flavonoides 32

2.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO GÊNERO Ocotea 34

2.5 ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA E DOENÇA DE ALZHEIMER 36

3 OBJETIVOS 38

3.1 GERAIS 38

3.2 ESPECÍFICOS 38

4 MATERIAIS E MÉTODOS 39 4.1 COLETA E IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA 39

4.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS E PARTIÇÕES 40

4.3 ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA 42

4.4 ESTUDO QUÍMICO BIOGUIADO 43

4.4.1 Procedimentos experimentais gerais 43

4.4.2 Fracionamento dos extratos bioativos 45 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 53

5.1 ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS EXTRATOS BRUTOS E PARTIÇÕES DE ESPÉCIES DE Ocotea

53

5.2 FRACIONAMENTO BIOGUIADO E ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DAS FRAÇÕES

60

5.3 ANÁLISE POR CLAE-DAD DOS EXTRATOS BIOATIVOS 65 5.4 ANÁLISE POR CLAE-DAD DAS FRAÇÕES BIOATIVAS 83 5.5 ANÁLISE POR CLAE-DAD-EM/EM DOS EXTRATOS

BIOATIVOS

104

6 CONCLUSÕES 126

REFERÊNCIAS 127

ANEXOS 137

17

1 INTRODUÇÃO

Os estudos sobre a composição química de extratos de plantas medicinais

são bastante comuns. No entanto, numa investigação fitoquímica com o objetivo de

se isolar os princípios ativos de uma planta, a escolha de uma espécie pode ser

bastante difícil devido à grande quantidade de plantas existente no planeta, sendo que a maioria é desconhecida sob o ponto de vista científico (HOSTETTMANN et

al., 2003). Várias abordagens para a seleção de espécies vegetais têm sido

apresentadas na literatura, dentre elas, três tipos são alvo de maiores investigações:

a) abordagem randômica – escolha da planta sem qualquer critério, tendo como

fator determinante a sua disponibilidade; b) abordagem quimiotaxonômica – seleção da espécie correlacionada com a ocorrência de uma dada classe química de

substância em um gênero ou família; c) abordagem etnofarmacológica – seleção da

espécie de acordo com o uso terapêutico evidenciado por um determinado grupo

étnico (MACIEL et al., 2002).

A abordagem randômica é a menos utilizada devido à demora que este

método pode proporcionar ao processo de descoberta de uma planta que apresente considerável atividade biológica tendo a espécie sido escolhida ao acaso.

Dentre os diferentes critérios de seleção, a quimiotaxonomia ou ciência da

classificação das plantas em função de seus constituintes químicos pode conduzir a

informações importantes uma vez que algumas classes de substâncias são

características de uma família botânica ou mesmo de um gênero (HOSTETTMANN

et al., 2003). Segundo Giordani et al. (2008), ao considerar as informações botânicas

e quimiotaxonômicas, a escolha das plantas a serem investigadas torna-se mais

selecionada.

Como estratégia para investigação de plantas medicinais, a abordagem

etnofarmacológica consiste em combinar informações adquiridas junto a

comunidades locais que fazem uso da flora medicinal com estudos químicos/farmacológicos realizados em laboratórios especializados. O método

etnofarmacológico permite a formulação de hipóteses quanto à(s) atividade(s)

farmacológica(s) e à(s) substância(s) ativa(s) responsáveis pelas ações terapêuticas

18

relatadas pelas populações usuárias (ELIZABETSKY e SOUZA, 2007). Tanto a

pesquisa bibliográfica como a informação popular servem de base para a indicação

da atividade farmacológica. Historicamente, a maioria das plantas medicinais foi introduzida nas primeiras farmacopéias por sua ação terapêutica (LAPA et al., 2003).

A combinação da abordagem quimiossistemática e etnofarmacológica torna

ainda mais acertado o método de escolha da espécie a ser estudada. Além disso, a

utilização de técnicas direcionadas para o isolamento de substâncias químicas ou frações de extratos de plantas através de screening, seguido de prospecção

direcionada por bioensaio, também conhecida como “estudo químico de plantas

medicinais orientado pela análise biológica” (CALIXTO, 2001) ou estudo bioguiado,

são essenciais para a obtenção de bons resultados com uma relação interessante

de custo-benefício. Essa relação de benefício é vista através da redução de tempo e

menor gasto de materiais, quando comparado a outros modelos descritos na

literatura, pois durante o isolamento e seleção dos compostos, estes são monitorados diretamente pela atividade biológica de interesse (HAMBURGER e

HOSTETTMANN, 1991; MARTINEZ et al., 1996; RITCH-KRC et al., 1996). Desta

forma, estudos com espécies inativas para determinada atividade farmacológica

podem ser descontinuados ou direcionados para outros testes biológicos.

O progresso da biologia celular e da farmacologia molecular, nas últimas

décadas, deu um impulso importante para o desenvolvimento de testes biológicos baseados nos mecanismos de ação de algumas doenças. Quando as causas de

uma doença são conhecidas, é possível agir diretamente sobre os receptores ou em

mecanismos enzimáticos envolvidos na patologia (HAMBURGER e

HOSTETTMANN, 1991). Um alvo interessante e atualmente bastante explorado é a

inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE), que pode ser utilizada para atenuar o

desenvolvimento da doença de Alzheimer, a qual é responsável pela maioria dos

casos de demência na terceira idade (FULTON e BENFIELD, 1996).

Através do uso popular, várias plantas têm sido utilizadas para o tratamento de

desordens cognitivas, incluindo doenças neurodegenerativas e diversas desordens

neurológicas. Abordagens etnofarmacológicas e estudos bioguiados têm conduzido

a identificação de inibidores potenciais da enzima AChE a partir de recursos vegetais. Muitos métodos para screening de inibidores da AChE provenientes de

19

plantas são baseados na reação de Ellman utilizando a determinação

espectrofotométrica através da cromatografia em camada delgada e ensaios em

microplacas (MUKHERJEE et al., 2007). Na busca por novos fármacos, os produtos naturais destacam-se pela

diversidade estrutural e, assim, as plantas são candidatas importantes para

screening de novos compostos bioativos. Ao considerar as informações

etnofarmacológicas, botânicas e quimiotaxonômicas, a seleção das plantas a serem

investigadas torna-se mais elaborada (GIORDANI et al., 2008). Considerando esse conjunto de fatores, o gênero Ocotea da família Lauraceae, particularmente,

desponta como uma fonte promissora de novas substâncias bioativas, justificando a

avaliação química e farmacológica das espécies presentes no Brasil,

especificamente disponíveis na região do semiárido baiano.

20

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 FAMÍLIA LAURACEAE

A família Lauraceae é constituída por 52 gêneros e aproximadamente 3000

espécies que compreendem árvores e arbustos e se distribuem geograficamente

nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente na Ásia e América,

sendo que no Brasil ocorrem 25 gêneros e cerca de 400 espécies (WERFF e

RICHTER, 1996; TAKAKU et al., 2007; SOUZA e LORENZI, 2005)

Espécies desta família apresentam vários grupos de metabólitos secundários,

em sua maioria, compostos aromáticos, que possuem relevância significativa para

classificação quimiotaxonômica em Lauraceae (BATISTA et al., 2010). A presença de alcaloides ou lignoides, por exemplo, é uma característica marcante da família

Lauraceae, uma vez que estas classes de metabólitos secundários são muito

exploradas e estudadas farmacologicamente por apresentarem efeitos biológicos

importantes (ELDEEN et al., 2005; ZANIN e LORDELLO, 2007; MORAIS et al.,

1998).

A família Lauraceae também possui grande relevância dentre as demais famílias pela sua importância econômica. Algumas espécies têm sido utilizadas na

culinária e na medicina popular, na marcenaria e construção civil, na fabricação de

papel, na indústria de perfumaria e indústria química. Dentre os muitos gêneros pertencentes a esta família, o gênero Ocotea Aubl. merece um especial destaque

devido ao grande número de espécies que são utilizadas para diferentes fins

(MARQUES, 2001a).

21

2.2 O GÊNERO Ocotea E SUA IMPORTÂNCIA ECONÔMICA

O gênero Ocotea é um dos maiores da família Lauracea, possuindo cerca de

350 espécies, entre árvores e arbustos, distribuídas na América tropical e

subtropical, desde o México até a Argentina, com poucas espécies na África e em

Madagascar e ausentes na Ásia (ROHWER et al., 1993; QUINET, 2008). Algumas espécies deste gênero, como a O. porosa (“imbuia”) e O. odorifera

(“sassafrás”) possuem grande importância econômica pela produção de madeira de

lei de excelente qualidade para a construção civil e naval (SOUZA e LORENZI,

2005).

Devido à curta viabilidade das sementes, frutificação errática e crescimento

lento, a dificuldade de propagação associada à extração de madeira tem levado à extinção muitas espécies de Ocotea, razão pela qual são encontrados na literatura vários estudos de cultura de tecidos in vitro para o gênero (FUNASAKI et al., 2009;

PELEGRINI et al., 2011; HANAI et al., 2010).

Outro fator que contribuiu para o risco de extinção de algumas espécies, principalmente O. odorifera, foi a grande exploração na década de 90 do óleo de

sassafrás, rico em safrol que é um metabólito secundário de alto valor comercial, utilizado como matéria-prima para síntese de vários produtos na indústria de

fármacos, inseticidas piretróides e perfumes (RIVA et al., 2011). O quadro 1

categoriza as espécies de Ocotea presentes na lista vermelha elaborada pelo Órgão

Internacional que discrimina o estado de conservação da natureza.

22

Quadro 1: Estado de conservação das espécies de Ocotea, segundo as categorias descritas na Lista Vermelha da União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (sigla em inglês, IUCN). EXTINTO AMEAÇADA BAIXO RISCO

Extinto Extinto na natureza

Criticamente em perigo

Em perigo Vulnerável Dependente de conservação

Quase ameaçada

Pouco preocupante

O. aciphylla X O. argylei X O. basicordatifolia X O. benthamiana X O. clarkei X O. cymbarum X O. foetens X O. gabonensis X O. glaucosericea X O. harrisii X O. jorge-escobarii X O. kenyensis X O. lancilimba X O. langsdorffii X O. monteverdensis X O. otuzcensis X O. pachypoda X O. porosa X O. pretiosa X O. puberula X O. raimondii X O. rivuralis X O. robertsoniae X O. rotundata X O. rugosa X O. staminoides X O. uxpanapana X O. viridiflora X Fonte: IUCN 2013.

23

A prospecção tecnológica para o gênero em estudo foi realizada em fevereiro

de 2014 nos bancos públicos de patentes nacional e europeu, Instituto Nacional de

Propriedade Industrial (INPI) e European Patent Office (EPO), respectivamente. No INPI apenas uma patente foi encontrada para o gênero Ocotea, referente aos óleos

essenciais para controle de pragas à base de O. odorifera e Eucalyptus viminalis

(APC, 2013). As patentes depositadas no EPO são referentes a uma composição

para inibição de fibrose (NIPPON, 2013), uma composição para uso externo (LION,

2001), a utilização da madeira e seus extratos com atividade inseticida e repelente

(CNRS, 2001), alcaloides do gênero utilizados para o alívio da ansiedade (FERRARI

e CASAGRANDE, 1975), método de extração de alcaloides (CASAGRANDE, 1973),

alcaloides do gênero (SIPHAR, 1969a; 1969b) e produção de derivados

metilenodioxifenil (FMC, 1960).

2.3 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DO GÊNERO Ocotea

Estudos fitoquímicos prévios tem evidenciado a presença de lignanas,

neolignanas, alcaloides benzilisoquinolínicos e aporfínicos, fenilpropanoides, flavonoides e sesquiterpenos, além de uma variedade de monoterpenos presentes

nos óleos essenciais (CHAVEZ et al., 1995; FARAGO et al., 2005).

2.3.1 Terpenos

A composição química dos óleos essenciais de várias espécies de Ocotea já

foi descrita, revelando a presença de uma grande diversidade de monoterpenos, com predominância de α-pineno (M1) e β-pineno (M2), além dos sesquiterpenos β-

cariofileno (S1) e germacreno-D (S2) (TAKAKU et al., 2007; GARRETT et al., 2010;

FARAGO et al., 2010) (Figura 1).

24

Figura 1: Estruturas dos principais terpenos encontrados em óleos essenciais de espécies de Ocotea

M1 M2

S1 S2

Também foram encontrados em extratos de folhas e cascas de espécies de Ocotea outros sesquiterpenos, principalmente com esqueletos eudesmânicos (I), calamenênicos (II) e cadinânicos (III) (CHAVEZ et al., 1995; DAVID e YOSHIDA,

1998; LORDELLO et al., 2000) (Figura 2).

25

Figura 2: Principais tipos de sesquiterpenos encontrados em espécies de Ocotea

I II

V

III IV O sesquiterpeno aromático (1R*, 4S*)-7-hidroxicalameneno (S3) foi isolado

das folhas de O. elegans (BATISTA et al., 2010) e O. corymbosa (DAVID e

YOSHIDA, 1998). Dos frutos verdes de O. corymbosa também foram isolados os

sesquiterpenos eudesmânicos (1S*,4S*,5R*,7R*,10R*)-10-desmetil-1-metil-11-eudesmano (S4), (1S*,4R*,5R*,7R*,10R*)-10-desmetil-10-hidroxi-1-metil-3-oxo-11-

eudesmano (S5) e (5R*,7R*)-10-desmetil-1-metil-1,10-dioxo-1,10-seco-11-eudesmano (S6) (CHAVEZ et al., 1995) (Figura 3).

26

Figura 3: Sesquiterpenos encontrados em espécies de Ocotea

S3 S4 S5

S6 S7 S8

S9 S10 S11

S12 S13

S16

S14 S15

27

A partir das cascas de O. pulchella foram isolados os sesquiterpenos

eudesmânicos 11-eudesmen-4α-ol (S7) e 4-furanoeudesmen-6-ona (S8) (BOTEGA

et al., 1993) (Figura 3). Recentemente, sesquiterpenos do tipo eremofilano (IV) foram descritos em

Ocotea pela primeira vez por Camargo et al. (2013) que isolaram das folhas de O.

lancifolia sete sesquiterpenos eremofilanos: ácido 4β,5β,7β-eremofil-9-en-12-oico (S9); ácido 4β,5β,7β-eremofil-1(10)-en-12-oico (S10); ácido 4β,5β,7β-eremofil-1(10)-

en-2-oxo-12-oico (S11); 4β,5β,7β-eremofil-9-en-12,8α-olido (S12); 4β,5β,7β-eremofil-

9-en-12,8β-olido (S13); ácido 4β,5β,7β-eremofilan-9α,10α-epóxi-12-oico (S14);

4β,5β,7β-eremofil-11-en-10α-ol (S15) e um sesquiterpeno aromadendreno (V),

espatulenol (S16), o qual já havia sido descrito em Ocotea catharinensis (FUNASAKI

et al., 2009) (Figuras 2 e 3).

2.3.2 Fenilpropanoides e derivados

De ocorrência muito frequente em Ocotea, os fenilpropanoides quase sempre

estão presentes nas frações voláteis obtidas de troncos e folhas, junto com mono e

sesquiterpenos (CHAVEZ et al., 1995). São normalmente do tipo alil ou propenilfenóis, cujo precursor básico é o aminoácido L-fenilalanina que, através de

uma série de transformações que incluem a formação do ácido cinâmico, resulta na

formação de aldeídos, alcoóis e finalmente dos alil e propenilfenóis (FUNASAKI,

2006) (Quadro 2).

28

Quadro 2: Rota biossintética dos fenilpropanoides

Fonte: Adaptado de DEWICK, 2002; BARROS, 2008.

O fenilpropanoide mais comum no gênero é o safrol (F1), principal constituinte

do óleo de sassafrás obtido de Ocotea odorifera, O. pretiosa e O. fragrantissima, de

grande valor industrial (FUNASAKI, 2009) (Figura 4).

Do extrato etanólico de O. cymbarum foram obtidos os derivados alilfenóis: apiol (F2); dilapiol (F3); 4-hidroxi-2,3,5-trimetoxialilbenzeno (F4) e apioglicol (F5)

(ANDREI et al., 1988). Um éster metílico do ácido 4-O-E-cafeoilquínico (F6) foi

isolado das folhas de O. corymbosa (BATISTA et al., 2010) (Figura 4).

29

Figura 4: Compostos fenólicos encontrados em espécies de Ocotea

F1 F5

F2 R1 ̶ R2=CH2, R3=Me

F3 R1= Me, R2=R3=CH2

F4 R1= R3=Me, R2=H F6

2.3.3 Lignanas

A diversidade estrutural de lignanas (dímeros de alcoóis coniferílicos) é

bastante restrita em espécies de Lauraceae (FUNASAKI, 2006). A Iangambina (L1), uma das lignanas mais conhecidas do gênero, foi obtida

de O. duckei (NETO et al., 2008) e o lioniresinol (L2) foi isolado de O. cymbarum

(ANDREI et al., 1988) e O. minarum (GARCEZ et al., 2005) (Figura 5).

Lignanas furofurânicas também foram encontradas em O. duckei (MORAIS et

al., 1996, 1998; BARBOSA-FILHO et al., 1999). Lignanas com esqueletos tetraidrofurânicos foram encontradas apenas em O. foetens (LOPEZ et al, 1995) e

O. veranguensis (CROSSLEY e DJERASSI, 1962).

30

Figura 5: Lignanas descritas em espécies de Ocotea

L1 L2

2.3.4 Neolignanas

De acordo com Gottlieb (1972), as neolignanas, principalmente

biciclooctânicas (VI) e benzofurânicas (VII) (Figura 6), constituem o principal grupo

de metabólitos secundários da família Lauraceae, devido à elevada frequência e

grande variedade de substituintes e configurações.

A espécie O. porosa, conhecida popularmente como “imbuia” e muito utilizada

no Brasil para a construção de móveis, é uma das espécies de Lauraceae mais

investigadas quimicamente e apresenta uma predominância da neolignana

benzofurânica porosina (AIBA et al., 1973).

Também foi relatada a presença de grande diversidade de neolignanas

hexaidrobenzofurânicas e biciclooctânicas nas folhas, caules e embrióides cutivados in vitro de O. catharinensis (LORDELLO, 1996; LORDELLO e YOSHIDA, 1997;

HARAGUCHI et al., 1983; ISHIGE et al., 1991).

31

Figura 6: Principais tipos de neolignanas encontradas em espécies de

Ocotea

VI VII

2.3.5 Alcaloides

Além dos lignoides, os alcaloides são uma classe de metabólitos secundários

de ocorrência bastante frequente em espécies de Ocotea. No entanto, foi observado

dutante os levantamentos realizados até o momento que, em espécies que

acumulam lignoides não foi constatada a presença de alcaloides (ZANIN e

LORDELLO, 2007).

A partir das cascas de O. puchella foram isolados os alcaloides benzilisoquinolínicos: 1-(p-metoxibenzoil)-6,7-metilenodioxiisoquinolina (A1); 1-(hidroxi-p-metoxibenzil)-6,7-metilenodioxiisoquinolina (A2) e seus derivados 1,2-di-

hidro-derivados (A3 e A4) (BOTEGA et al., 1993) (Figura 7).

O alcaloide aporfínico talicminina (A5) foi obtido de O. puberula (BARALLE et

al., 1973) e o alcaloide indólico triptofol-5-O-β-D-glicopiranosideo (A6) foi isolado a

partir dos frutos de O. minarum (GARCEZ et al., 2005) (Figura 7).

Vários alcaloides aporfínicos foram encontrados em O. macrophylla: nantenina (A7), glaucina (A8), isocordina (A9) e deidronantenina (A10) foram

isolados da madeira, enquanto (S)-3-metoxi-nordomesticina (A11), (S)-N-

etoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina (A12), (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticina

(A13) e (S)- N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina (A14) foram obtidos do

extrato etanólico do caule de O. macrophylla (PABON e CUCA, 2010) (Figura 7).

32

Figura 7: Alcaloides encontrados em espécies de Ocotea

R1 R2 X

A1 O O, ∆1,2 N A6 A2 H OH, ∆1,2 N A5

A3 O O NH

A4 H OH NH A2 H OH, ∆1,2 N

A7 A8

R1 A11 H A12 COOCH2CH3 A13 COH A14 COOCH3 A9 A10

2.3.6 Flavonoides Os flavonoides são metabólitos secundários de ocorrência muito frequente no

reino vegetal e também foram encontrados em espécies de Ocotea. A maioria dos

flavonoides isolados até o momento são derivados das agliconas quercetina (FL1) e de di-hidroquercetina (FL2) e essa característica parece ser comum para o gênero

(Figura 8).

33

Figura 8: Flavonoides encontrados em espécies de Ocotea

FL1 FL2

FL3 R1=Rha FL4 R2=β-D-Glu FL7 R1=H FL5 R2=β-D-Gal

FL6 R2=β-D-Xyl

FL8 R3= β-D-glicopiranosídeo

FL9 R4= β-D-glicopiranosídeo

FL10 R5= β-D-glicopiranosídeo O flavonoide (2R*, 3R*)-astibina (FL3) foi isolado das folhas de O. elegans e

os flavonoides glicosilados quercetina-3-O-β-D-glicose (FL4), quercetina-3-O-β-D-

galactose (FL5) e quercetina-3-O-β-D-xilose (FL6) foram encontrados nas folhas de

O. corymbosa (BATISTA et al., 2010). A partir dos frutos de O. minarum foram isolados a cumarina escopoletina e os flavonoides taxifolina (FL7), quercetina-7-O-β-

34

D-glicopiranosídeo (FL8), eriodictiol-3’-O-β-D-glicopiranosídeo (FL9) e prunina

(naringenina-7-O-β-D-glicopiranosídeo) (FL10) (GARCEZ et al. 2005) (Figura 8).

2.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO GÊNERO Ocotea

Vários extratos e substâncias isoladas de espécies de Ocotea já foram

testados para diversas atividades biológicas. O alcaloide reticulina, isolado da entrecasca de O. duckei, apresentou efeito

antiespasmódico (MARTIN et al., 1993), depressor do sistema nervoso central (SNC)

em ratos e camundongos (MORAIS et al., 1998), ação bloqueadora neuromuscular

em músculo esquelético de sapos (KIMURA et al., 1983) e efeito hipotensor em

ratos normotensos (DIAS et al., 2004). A iangambina, lignana extraída de O. duckei é uma antagonista seletivo de

PAF (fator de ativação plaquetária), capaz de discriminar subtipos de receptores

PAF em órgão isolado de ratos (JESUS-MORAIS et al., 2000). Além disso, a

iangambina demonstrou efeito de proteção contra colapso cardiovascular e choque

anafilático (TIBIRICA et a., 2001), apresentou atividade antialérgica (SERRA et al.,

1997), analgésica e antitumoral em células de câncer colorretal (HAUSOTT et al., 2003).

A glaziovina, um dos alcaloides proaporfínicos mais importantes

farmacologicamente, foi isolado pela primeira vez por Gilbert e cols. (1965) a partir da Ocotea glaziovii. A esta substância foram atribuídas propriedades ansiolítica e

tranquilizante, sendo registrada com o nome comercial de Suavedol® nos anos 70

como uma especialidade terapêutica do laboratório SIMES (PERÉZ et al., 2005,

FERRARI e CASAGRANDE, 1975). O alcaloide bis-benzilisoquinolínico, rupununina, isolada de O. rodiaei foi

patenteado em 1994 como febrífugo, contraceptivo, inibidor do crescimento de

tumores, antiviral, antimitótico, agente neuroativo e ainda como pesticida

(GORINSKY, 1994). O alcaloide aporfínico dicentrinona, isolado de O. leucoxyon,

apresentou atividade inibitória da enzima topoisomerase I (ZHOU et al., 2000).

35

A neolignana biciclo[3,2,1]octânica, sibilenona, isolada do tronco da madeira

de O. bullata, tem sido utilizada como medicamento tradicional na África devido à

alta atividade anti-inflamatória com efeito inibitório da 5-lipoxigenase (ZSCHOCKE et al., 2000).

O extrato etanólico das folhas de O. glomerata demonstrou atividade larvicida

contra Aedes aegypti (LUNA et al., 2005) e antibacteriana contra cepas resistentes

de S. aureus (LIMA et al., 2006). O extrato etanóico bruto obtido das cascas do

caule e folhas de O. duckei apesentou atividade antimicrobiana contra 6 diferentes

cepas de Staphylococcus aureus enquanto a iangambina, extraída da mesma

planta, apresentou atividade antimicrobiana contra todas as cepas de Escherichia

coli testadas (ANTUNES et al., 2006). O óleo essencial de O. notata apresentou

atividade no ensaio de toxicidade sobre Artemia salina Leach e atividade

antibacteriana contra duas cepas ATCC de Staphylococcus aureus (25923 e 9213),

S. epidermidis (12223) e Enterococcus faecalis (29212) (GARRETT et al., 2007).

Extratos etanólicos de galhos de Ocotea ceanothifolia, O. leucoxylon e O.

minor e o extrato etanólico de folhas de O. minor apresentaram atividade

anticolinesterásica no teste qualitativo utilizando cromatoplacas de camada delgada

(YAMAGUCHI et al., 2012). A avaliação quantitativa da atividade anticolinesterásica dos extratos hidrometanólicos (1,0 mg/mL) das cascas frescas e estocadas de O.

bullata evidenciou alta atividade com inibições de 87,1±2,63 e 84,8±3,98%,

respectivamente (AMOO et al., 2012). Os óleos voláteis de folhas de O. nectandrifolia e O. puberula, coletadas nas

diferentes estações do ano, foram considerados inativos para a atividade

anticolinesterásica por apresentarem inibições abaixo de 40%. A ausência de

atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase nos óleos das duas espécies foi

atribuída aos baixos teores de monoterpenos (RAGGI, 2008), uma vez que

Miyazawa et al. (1997) afirmam que os monoterpenos são os principais

responsáveis pela atividade anticolinesterásica dos óleos essenciais.

Apesar da grande quantidade de artigos publicados de trabalhos realizados com o gênero Ocotea, várias de suas espécies ainda não foram estudadas do ponto

de vista químico e/ou biológico. Dentre elas, as espécies Ocotea pomaderroides, O.

36

percoriacea e O. spixiana não possuem registro na literatura de sua composição

química e/ou atividade biológica.

2.5 ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA E DOENÇA DE ALZHEIMER

A Doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa,

progressiva, que afeta principalmente a população idosa, responsável por 50-60%

dos casos de demência em pessoas com mais de 65 anos de idade (FRANCIS et

al., 1999). Os principais sintomas associado a DA envolve deficiência orgânica

cognitiva, principalmente perda de memória. Outras características associadas com

os estágios avançados de DA inclui déficit na linguagem, depressão, problemas de

comportamento, inclusive agitação, alterações de humor e psicose (BARBOSA FILHO et al., 2006).

Dados epidemiológicos indicam um crescimento potencialmente considerável

na prevalência da doença nas próximas duas décadas (JOHNSON et al., 2000).

A neurotransmissão colinérgica é especialmente afetada em pacientes com a

doença de Alzheimer e um dos mais promissores caminhos para tratar esta doença

é aumentar o nível de acetilcolina no cérebro usando inibidores da acetilcolinesterase (AChE) (ENZ et al., 1993).

Vários inibidores da AChE estão sendo investigados para o tratamento de DA. Entretanto, somente a tacrina (1, Cognex®), donezepil (2, Aricept®), rivastigmina (3,

Exelon®) e galantamina (4, Reminyl®) foram aprovados pela Food and Drug

Administration nos Estados Unidos (ZAROTSKY et al., 2003), e destes apenas 1, 3 e

4 são comercializados no Brasil, a preços bastante onerosos (TREVISAN e

MACEDO, 2003) (Figura 9). Diante disto, a busca por métodos alternativos para o

tratamento da doença de Alzheimer, como a utilização de plantas que apresentem

atividade anticolinesterásica, seria de grande interesse para a população brasileira.

Vários estudos têm sido realizados no Brasil com o objetivo de selecionar plantas

com atividade anticolinasterase para tratamento da doença de Alzheimer

(TREVISAN e MACEDO, 2003; VIEGAS Jr et al., 2004, TREVISAN et al., 2006).

37

Figura 9: Inibidores da acetilcolinesterase utilizados para o tratamento de DA

1

2

4 3

38

3 OBJETIVOS

3.1 GERAIS

Contribuir para o conhecimento químico e biológico de espécies do gênero Ocotea do semiárido baiano, a partir do estudo bioguiado pela atividade

anticolinesterásica.

3.2 ESPECÍFICOS

Coletar as espécies Ocotea notata, O. pomaderroides, O. percoriacea e O.

spixiana em municípios do semiárido baiano;

Obter os extratos brutos e partições das espécies coletadas;

Submeter os extratos brutos e partições das espécies de Ocotea a um screening

para verificação da atividade anticolinesterásica;

Selecionar os extratos bioativos para realização do fracionamento bioguiado;

Realizar a caracterização química dos extratos, partições e frações das espécies

testadas através de CLAE-DAD e CLAE-DAD-EM/EM ;

Identificar os principais constituintes das frações que evidenciarem atividade

anticolinesterásica promissora;

Correlacionar a atividade biológica e as classes de metabólitos secundários

encontrados nas espécies em estudo.

39

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 COLETA E IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA

A escolha do gênero a ser trabalhado neste estudo foi feita a partir da

aborgadem quimiossistemática. As espécies foram escolhidas de acordo com a

ausência de estudos químicos e biológicos relatados na literatura e disponibilidade

na região do semiárido baiano. A coleta da espécie Ocotea notata (Figura 10) foi realizada no município de

Morro do Chapéu (11°37’39,9’’S; 41°00’3,8’’W), estado da Bahia, Brasil, em março

de 2009, sob supervisão da botânica Tânia R. S. Silva (UEFS). As espécies O.

percoriacea, O. pomaderroides, O. spixiana e Ocotea sp. (Figura 10) foram

coletadas no município de Rio de Contas (13º22’26,9”S e 41º53’27,5”W), Bahia,

Brasil, em agosto de 2012, com o auxílio do botânico Francisco H. F. do

Nascimento. As exsicatas das espécies coletadas encontram-se depositadas no

Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana (HUEFS) sob os números,

201417, 201419, 201420 e 201421. A espécie Ocotea sp. ainda não foi identificada pela possibilidade de tratar-se

de uma espécie nova e endêmica da região do semiárido baiano.

40

Figura 10: Espécies de Ocotea coletadas no semiárido baiano

A: Ocotea notata (Nees) Mez; B: Ocotea percoriacea Kosterm.; C: Ocotea pomaderroides (Meisn.) Mez; D: Ocotea sp. E: Ocotea spixiana (Nees) Mez

4.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS E PARTIÇÕES

Para obtenção dos extratos etanólicos brutos, as folhas de cada espécie,

separadamente, foram secas à temperatura ambiente e moídas em moinho de facas

(tipo Willey). O pó seco das folhas de cada espécie foi submetido à extração por maceração em erlenmeyer com etanol (EtOH) por 5 dias e posterior filtração. Os

filtrados obtidos foram concentrados em rotaevaporador rendendo os extratos

etanólicos brutos de cada espécie, os quais foram submetidos a um processo de

partição líquido-líquido com solventes em ordem crescente de polaridade (hexano,

diclorometano, acetato de etila e butanol). Uma parte de cada extrato etanólico bruto obtido foi dissolvido em H2O/EtOH (3:1) e com o auxílio de um funil de separação

foram realizadas extrações com hexano. A fase hexânica foi coletada e concentrada

em rotaevaporador rendendo o extrato hexânico. O extrato hidroetanólico foi

particionado com diclorometano dando origem ao extrato diclorometânico e extrato

hidroetanólico residual, o qual foi submetido a sucessivas extrações com acetato de etila (AcOEt) e n-butanol (n-BuOH), rendendo os extratos acetato de etila e n-

41

butanólico, respectivamente. Finalmente, o extrato aquoso residual foi parcialmente

concentrado em rotaevaporador rendendo o extrato aquoso.

Por ter sido coletada antes das demais espécies, a obtenção do extrato e partições da espécie O. notata serviu como piloto para realizações das extrações

posteriores.

A tabela 1 descreve a massa total do pó seco obtido de cada espécie após

moagem das folhas e a massa total e rendimento dos extratos etanólicos brutos

obtidos por maceração.

Tabela 1: Massa total (g) e rendimento (%) dos extratos etanólicos obtidos a partir dos processos de moagem e da extração por maceração Espécies Pó seco (g) EEt (g) Rend.(%)

O. notata 715,00 171,74 24,02 O. pomaderroides 890,00 245,47 27,58 O. percoriacea 2.500,00 409,37 16,37 O. spixiana 1.200,00 191,95 15,99

Ocotea sp. 2.090,00 401,38 19,20 EEt: Extrato etanóllico bruto

Aproximadamente 190,00g do extrato etanólico de Ocotea sp., 100,00g

dos extratos etanólicos de O. pomaderroides, O. percoriacea e O. spixiana, e 50,00g

do extrato etanólico de O. notata, foram submetidos ao particionamento com

solventes em ordem crescente de polaridade e as massas totais de cada partição

estão descritas na tabela 2.

42

Tabela 2: Massa total (g) das partições obtidas a partir dos

extratos etanólicos brutos

Espécies EHex EDic EAc EBu*

O. notata 9,82 - 18,99 20,30 O. pomaderroides 4,66 5,46 1,68** 49,35 O. percoriacea 5,23 6,06 51,53 78,65 O. spixiana 8,81 10,47 12,55 62,79 Ocotea sp. 14,22 5,47 56,43 111,13 EEt: Extrato etanóllico bruto, EHex: Extrato hexânico, EDic: Extrato diclorometano, EAc: Extrato acetato de etila, EBu: Extrato butanólico; *extratos pastosos; **houve perda de massa

Os extratos butanólicos e aquosos não secaram completamente e

permaneceram na forma pastosa. Apenas uma pequena porção destes extratos foi

concentrada com o auxílio de um secador para realização dos ensaios in vitro.

4.3 ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA

A avaliação da atividade anticolinesterásica foi realizada conforme o método

utilizado por Atta-ur-Rahman et al. (2001), com modificações. Os extratos e frações

testados foram diluídos em metanol para obtenção da concentração estoque a

10mg/mL. O padrão utilizado como controle positivo foi a eserina na concentração

500µM. Numa microplaca de 96 poços foram pipetados 140µL de tampão fostato

0,1M contendo albumina bovina sérica (BSA) 0,1%, 20µL da amostra a ser testada

ou do padrão e 20µL da enzima acetilcolinesterase 5U/mL diluída em tampão fosfato

0,1M. Após incubação de 15 minutos em temperatura ambiente foram adicionados

10µL de DTNB 10mM e 10µL de ACTI 75mM. As absorbâncias da reação enzimática foram obtidas a 405nm em leitor de microplacas EL800 (BioTek®) nos tempos 0; 30

e 60min logo após a adição do ACTI. O branco consistiu na substituição da amostra

a ser testada por 20µL de tampão fostato 0,1M contendo albumina bovina sérica

(BSA) 0,1%. Todas as amostras foram testadas em triplicata em cada experimento.

43

A enzima acetilcolinesterase (AChE) tipo VI-S obtida de Electrophorus

electricus (enguia elétrica), iodeto de acetiltiocolina (ACTI), 5,5’-ditiobis-(ácido 2-

nitrobenzóico) (DTNB ou reagente de Ellman), eserina [(-)-fisostigmina)] e o tampão fosfato 0,1M (pH 7,5) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).

O cálculo da porcentagem da atividade enzimática foi feito conforme as

fórmulas descritas abaixo:

%A T30 = (T30-T0)amostra x 100/(T30-T0)branco

e %A T60 = (T60-T0)amostra x 100/(T60-T0)branco,

onde: %A é a porcentagem da atividade enzimática, T0 corresponde ao

tempo logo após o início da reação, T30 corresponde ao tempo de 30 min após a

primeira leitura e T60 corresponde ao tempo de 60 min logo após a primeira leitura. Os gráficos foram plotados como atividade colinesterásica (%A) embora os

dados na seção dos resultados sejam expressos como inibição da atividade

colinesterásica (%I). A porcentagem de inibição da atividade colinesterásica foi

calculada como 100% - %A (SANTOS et al., 2012).

4.4 ESTUDO QUÍMICO BIOGUIADO

4.4.1 Procedimentos experimentais gerais

As colunas cromatográficas (CC) foram eluídas em sílica gel 60 (70-230

mesh, Acros Organics), sílica tipo flash (35-75 µm, Acros Organics) ou Sephadex

LH-20 (Pharmacia®) e as análises cromatográficas em camada delgada (CCD) foram

desenvolvidas em cromatofolhas de alumínio (Merck), visualizadas em UV (254 e

360 nm) e reveladas em iodo.

44

As análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detector

de arranjo de diodos (DAD) foram realizadas em cromatógrafo líquido Merck-Hitachi

LaChrom Elite com coluna LiChrospher® 100 RP-18 (150 mm X 4 mm; 5 μm). Para a fase móvel utilizou-se um gradiente de H2O/H3PO4 0,1% (A) e MeOH (B) conforme

descrito abaixo.

Tempo (min) A (%) B (%)

0 75 25

20 0 100

24 0 100

25 75 25

35 75 25

O fluxo da fase móvel e a temperatura da coluna foram de 1 mL/min e 30°C,

respectivamente. Os espectros no UV foram adquiridos na faixa de 200 a 400 nm,

sendo que para registro dos cromatogramas, os comprimentos de onda foram

escolhidos após as análises.

As análises por CLAE acoplada a espectrometria de massas (EM) foram

realizadas em Espectrômetro de massas Bruker Daltonics® (modelo Equire Plus

3000), com fonte de íons eletrospray (ESI) e analisador íon trap e cromatógrafo

Shimadzu® com coluna Phenomenex Luna C-18 (250 x 4.6 mm - 5um), Bombas LC-

20AD, Controladora CBM-20A, Detector SPD-20A e injetor automático SIL-20AC. O gradiente de solventes utilizado foi H2O/CH2O2 0,2% (A) e ACN (B) nas seguintes

condições: 0-20 min A (75-0%) e B (25-100%), 20-24 min: A (0%) e B (100%), 24-25

min: A (0-75%) e B (100-25%) e 25-35 min: A (0%) e B (100%). A temperatura do

forno da coluna e o fluxo da fase móvel foram de 40oC e 1mL/min, respectivamente.

As análises por CLAE-DAD-EM/EM e RMN de 1H e 13C foram realizadas na

Central analítica do Instituto de Química da Universidade Federal de São Paulo

(USP). Os demais procedimentos foram realizados no Laboratório de Fitoquímica da

Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) e Laboratório de Química de

Produtos Naturais da Universidade Federal da Bahia (UFBA).

45

4.4.2 Fracionamento dos extratos bioativos

Todos os extratos foram submetidos à análise por CLAE-DAD. Os extratos

que apresentaram atividade anticolinesterásica superior ou igual a 60% de inibição

da atividade da enzima foram selecionados e submetidos à análise por CLAE-DAD-

EM/EM. Baseado nas análises por CLAE-DAD e CLAE-DAD-EM/EM, alguns extratos

bioativos foram submetidos ao fracionamento através da cromatografia em coluna

(CC), eluída com misturas de solventes em ordem crescente de polaridade. As

frações obtidas foram monitoradas por CCD e CLAE-DAD. O extrato diclorometano de O. pomaderroides (EDiOPom; 3,0g) foi submetido

a CC de sílica gel eluída com CH2Cl2, CH2Cl2/MeOH e MeOH e originou 11 frações

de aproximadamente 100 mL cada. Após análise por CCD, as frações 4/5 a 6/5 e 9/5

foram submetidas à CLAE-DAD. Baseado no perfil químico evidenciado pelos cromatogramas e espectros de UV, algumas frações foram selecionadas para

análise por CLAE-DAD-EM/EM (Tabela 3, Esquema 1).

Tabela 3: Fracionamento de EDiOPom (CC 5)

Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1/5 CH2Cl2 7,5 mg Reservada

2/5 CH2Cl2 199,8 mg Reservada

3/5 CH2Cl2/MeOH (99:1) 253,3 mg CLAE-DAD

4/5 CH2Cl2/MeOH (97:3) 66,3 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM






10/5 CH2Cl2/MeOH (1:1) 42,9 mg Reservada

11/5 MeOH 29,8 mg Reservada

46

A subfração 4/5 foi submetida ao fracionamento por CC em sílica flash eluída

com Hex; Hex/AcOEt e AcOEt e forneceu 20 subfrações de aproximadamente 150

mL cada. Suas subfrações foram monitoradas por CCD, unidas de acordo com a semelhança do perfil cromatográfico e submetidas à CLAE-DAD. As frações 2-3/10 e

4/10 também foram analisadas por CLAE-DAD-EM/EM (Tabela 4, Esquema 1).

Tabela 4: Fracionamento de 4/5 (CC 10)

Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1/10 Hex/AcOEt (95:5) 10,4 mg CLAE-DAD

2-3/10 Hex/AcOEt (95:5) 2,4 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM

4/10 Hex/AcOEt (95:5) 2,9 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM

5-6/10 Hex/AcOEt (95:5) 1,5 mg CLAE-DAD

7/10 Hex/AcOEt (95:5) 1,4 mg CLAE-DAD






18/10 Hex/AcOEt (9:1) 0,4 mg CLAE-DAD 19/10 Hex/AcOEt (4:1) 17,7 mg CLAE-DAD

20/10 AcOEt 1,4 mg CLAE-DAD

A subfração 5/5 foi submetida ao fracionamento por CC em sílica flash eluída com Hex; Hex/AcOEt, AcOEt e MeOH e rendeu 43 subfrações que foram

monitoradas por CCD, unidas de acordo com a semelhança do perfil cromatográfico

e submetidas à CLAE-DAD (Tabela 5, Esquema 1). A fração 2/9 rendeu uma

substância pura que foi analisada por RMN de 1H e 13C.

47


Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1/9 Hex/AcOEt (9:1) 3,3 mg CLAE-DAD



4-5/9 Hex/AcOEt (9:1) 2,0 mg CLAE-DAD 6-36/9 Hex/AcOEt (1:1) 5,3 mg CLAE-DAD


38/9 AcOEt 3,8 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM




42/9 AcOEt 0,7 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM

43/9 MeOH 1,2 mg CLAE-DAD

A subfração 6/5 foi submetida ao fracionamento por CC em Sephadex eluída com CH2Cl2/MeOH (1:1) e forneceu 10 subfrações de aproximadamente 100 mL

cada. As subfrações foram monitoradas por CCD e unidas de acordo com a

semelhança do perfil cromatográfico (Tabela 6, Esquema 1).


Frações Massa Análises realizadas

1/8 2,2 mg CLAE-DAD

2/8 3,1 mg CLAE-DAD

3/8 4,0 mg CLAE-DAD

4-8/8 15,7 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM

9/8 2,4 mg CLAE-DAD

10/8 1,7 mg CLAE-DAD

48

Esquema 1: Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea pomaderroides

CC10 CC9 CC8

CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-MS CC 5

H2O/EtOH (3:1) Partição CLAE-DAD Teste IAchE

EEtOPom

23 Frações

Moagem

Secagem EtOH Pó seco Folhas

CLAE-DAD Teste IAchE CC 11

CCD CLAE-DAD

11 Frações

CLAE-DAD Teste IAchE

CLAE-EM CCD

Fr 4/5 Fr 5/5 Fr 6/5

20 Frações 43 Frações 10 Frações

CCD CLAE-DAD

CCD CLAE-DAD

CCD CLAE-DAD

EHexOPom EAqOPom EBuOPom EAcOPom EDiOPom


CLAE-MS



O extrato diclorometano de O. percoriacea (EDiOPer; 6,0g) foi submetido a

CC em sílica gel eluída com CH3Cl, CH3Cl/MeOH e MeOH e originou 11 frações de aproximadamente 100 mL cada. Após análise por CCD todas as frações foram

submetidas à CLAE-DAD (Tabela 7, Esquema 2).

49

Tabela 7: Fracionamento de EDiOPer (CC 6)

Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1/6 CH3Cl 0,24 g CLAE-DAD, CLAE-EM/EM

2/6 CH3Cl/MeOH (99:1) 1,19 g CLAE-DAD


4/6 CH3Cl/MeOH (9:1) 0,18 g CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 5/6 CH3Cl/MeOH (4:1) 2,56 g CLAE-DAD, CLAE-EM/EM

6/6 CH3Cl/MeOH (3:2) 0,27 g CLAE-DAD, CLAE-EM/EM





11/6 MeOH 0,11 g CLAE-DAD

A subfração 5/6 foi submetida ao fracionamento por CC em sílica flash eluída

com Hex; Hex/AcOEt; AcOEt, AcOEt/MeOH e MeOH e forneceu 26 subfrações de aproximadamente 100 mL cada. Após análise por CCD as subfrações 3/7 a 20/7

foram submetidas à CLAE-DAD e as frações 4/7, 7/7 e 10/7 foram analisadas por

CLAE-DAD-EM/EM (Tabela 8, Esquema 2).

50


Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1-2/7 Hex 6,6 mg Reservado



5/7 Hex/AcOEt (4:1) 122,5 mg CLAE-DAD 6/7 Hex/AcOEt (4:1) 103,3 mg CLAE-DAD











17/7 AcOEt 50,1 mg CLAE-DAD 18/7 AcOEt/MeOH (4:1) 66,9 mg CLAE-DAD

19/7 AcOEt/MeOH (7:3) 318,3 mg CLAE-DAD

20/7 AcOEt/MeOH (7:3) 212,9 mg CLAE-DAD

21/7 AcOEt/MeOH (3:2) 67,8 mg Reservado




25/7 MeOH 33,5 mg Reservado

26/7 MeOH 87,8 mg Reservado

51

Esquema 2: Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea percoriacea

CC7

CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-MS CC 6


EEtOPer Moagem


11 Frações


CCD

26 Frações

CCD CLAE-DAD CLAE-EM

Teste IAchE

EHexOPer EAqOPer EBuOPer EAcOPer EDiOPer





Fr 5/6

Todos os extratos em diclorometano foram submetidos à CCD eluída com

CH2Cl2, visualizadas em UV e reveladas com reagente Dragendorff para verificação

da presença de alcaloides. O estudo químico buioguiado das espécies Ocotea notata, O. spixiana e

Ocotea sp. está resmido nos esquemas 3 e 4.

52

Esquema 3: Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea notata


EEtON Moagem


EHexON EAqON EBuON EAcON





Esquema 4: Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea sp. e O. spixiana


EEt Moagem


EHex EAq EBu EAc EDi






53

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS EXTRATOS BRUTOS E PARTIÇÕES DE ESPÉCIES DE Ocotea

Para avaliação da atividade anticolinesterásica dos extratos, foi realizada uma

triagem testando-se apenas a concentração máxima geralmente utilizada para este

tipo de teste com extratos (Rhee et al., 2001; Eldeen et al., 2005). A concentração

final dos extratos e da eserina em cada poço foi de 1 mg/mL e 50µM,

respectivamente.

Eldeen et al. (2005) consideram, para testes com extratos, atividade

anticolinesterásica moderada inibições menores que 60%. Vinutha et al. (2007) classificam a inbição da atividade acetilcolinesterásica como potente quanto a

inibição for maior que 50%, moderada quando a inibição for de 30-50% e baixa

quando a inibição for menor que 30%. Para este trabalho, os extratos e frações

foram considerados ativos quando a inibição da atividade acetilcolinesterásica foi

maior que 60%.

As leituras das absorbâncias foram realizadas nos tempos 0; 30 e 60 min para avaliar possíveis alterações da atividade enzimática no decorrer do tempo. Uma vez

que a atividade enzimática é calculada em relação ao branco (ao qual é atribuído a

atividade máxima da enzima), os valores de atividade enimática dos extratos e

frações que foram superiores a 100% foram corrigidos para o máximo de 100%. As

médias dos resultados em triplicata da atividade acetilcolinesterásica na presença de

cada extrato nos tempos 30 e 60 minutos são mostrados nos gráficos 1 a 6.

54

Gráfico 1: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos etanólicos brutos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

De acordo com o gráfico 1, os extratos etanólicos brutos de O. percoriacea e

Ocotea sp. apresentaram melhor atividade anticolinesterásica com porcentagens de

inibição da atividade enzimática de 79,55 e 71,65% no tempo 30min e 74,68 e

67,62% no tempo 60min, respectivamente (Tabela 9). No entanto, considerando que os extratos etanólicos brutos de O.

pomaderroides, O. notata e O. spixiana também apresentaram uma considerável

inibição da atividade anticolinesterásica (40 a 50%), todos os extratos foram

particionados para avaliação da atividade anticolinesterásica das partições,

denominadas extratos hexânico, diclorometano, acetato de etila, butanólico e

aquoso.

55

Gráfico 2: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos hexânicos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

Os extratos hexânicos de O. pomaderroides, O. percoriacea e Ocotea sp.

apresentaram porcentagens de inibição da atividade acetilcolinesterásica de 92,18;

83,28 e 86,72%, respectivamente no tempo 30min. No tempo 60min a inibição permaneceu muito semelhante ao tempo 30min (T60: 92,91; 81,72 e 86,34%,

respectivamente). A ação do extrato hexânico de O. pomaderroides destaca-se pela

inibição da atividade enzimática comparável ao padrão eserina, que apresentou

atividade anticolinesterásica de 95,66% no tempo 30 e 92,05% no tempo 60 min

(Gráfico 2, Tabela 9).

56

Gráfico 3: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos em diclorometano de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

De acordo com o gráfico 3 e tabela 9, todos os extratos diclorometano

testados apresentaram atividade anticolinesterásica com porcentagens de inibição da atividade enzimática acima de 60%. Os extratos diclorometano de O.

pomaderroides, O. percoriacea, O. spixiana e Ocotea sp. inibiram a atividade

acetilcolinesterásica em 71,86; 92,09; 74,45 e 77,74%, respectivamente, no tempo

30 min e 71,59, 89,30; 77,65 e 77,59%, respectivamente, no tempo 60 min. A

inibição da atividade enzimática produzida pelo extrato diclorometano de O.

percoriacea foi semelhante ao efeito do padrão eserina.

57

Gráfico 4: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos em acetato de etila de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

Os extratos acetato de etila mais ativos foram das espécies O. pomaderroides e Ocotea sp. que apresentaram porcentagens de inibição da atividade

acetilcolinesterásica de 74,25 e 76,19%, respectivamente no tempo 30min e 75,81 e

72,97%, respectivamente, no tempo 60min (Gráfico 4, Tabela 9).

Gráfico 5: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos butanólicos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

58

Conforme mostram os gráficos 5 e 6 e tabela 9, nenhum extrato butanólico ou

aquoso das espécies de Ocotea avaliadas foi capaz de inibir a atividade enzimática

da acetilcolinesterase em mais de 60% nos diferentes tempos avaliados (T30 e T60).

Gráfico 6: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos aquosos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

59

Tabela 9: Inibição da atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min.

T30 EEt EHex EDi EAc EBu EAq O. pomaderroides 52,10±9,51 92,18±1,63 71,86±3,09 74,25±9,99 44,48±3,27 20,74±7,48

O. percoriacea 79,55±8,28 83,28±1,30 92,09±2,73 43,71±12,25 28,45±8,28 16,17±13,24

O. notata 50,74±1,65 22,44±11,50 - 51,91±5,60 41,90±4,57 19,86±10,98

O. spixiana 45,79±7,09 58,55±20,93 74,45±1,00 50,73±3,75 27,08±3,01 27,57±17,40

Ocotea sp. 71,65±9,58 86,72±1,73 77,74±10,98 76,19±3,74 44,77±15,21 9,32±8,33

T60 EEt EHex EDi EAc EBu EAq O. pomaderroides 49,36±12,50 92,91±2,93 71,59±1,42 75,81±8,16 38,13±4,74 17,00±11,65

O. percoriacea 74,68±5,29 81,72±2,11 89,30±5,81 36,84±7,34 17,98±5,59 4,37±7,57

O. notata 48,54±1,86 23,96±7,48 - 47,78±7,90 41,24±3,00 5,24±9,07

O. spixiana 36,88±8,23 56,37±19,63 77,65±2,32 48,31±5,61 27,59±5,16 7,54±7,96

Ocotea sp. 67,62±12,29 86,34±4,71 77,59±11,17 72,97±1,82 41,50±14,74 0,68±1,17

Controles T30 T60 Eserina 95,66±1,46 92,05±1,47

MeOH 0,93±1,61 0,79±1,37

60

5.2 FRACIONAMENTO BIOGUIADO E ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DAS

FRAÇÕES

De acordo com os resultados da avaliação da atividade anticolinesterásica,

todos os extratos em diclorometano foram ativos. Isto sugere a presença de

substâncias ativas que fazem parte de alguma classe química em comum, uma vez

que cada classe de substâncias químicas tem afinidade por um dos solventes

utilizados nas partições. Sendo assim, os extratos em diclorometano das duas

primeiras espécies avaliadas, EDiOPom e EDiOPer, foram selecionados para

fracionamento bioguiado.

Após o fracionamento de EDiOPom (CC 5) e EDiOPer (CC 6 e 7), suas

frações também foram submetidas à avaliação da atividade anticolinesterásica.

Gráfico 7: Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de EDiOPom nos tempos 30 e 60 min

As subfrações 4/5, 5/5 e 6/5 apresentaram atividade anticolinesterásica maior

que 60%, com porcentagens de inibição da atividade enzimática de 96,56; 74,49 e

70,53%, respectivamente, após 60 min (Gráfico 7, Tabela 10). A subfração 4/5

apresentou atividade comparável ao controle positivo, eserina, e foi submetida a fracionamento (CC 10).

61

Gráfico 8: Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de EDiOPer nos tempos 30 e 60 min

As subfrações 3/6, 4/6, 5/6 e 6/6 apresentaram atividade anticolinesterásica

maior que 60%, com porcentagens de inibição da atividade enzimática de 62,32; 62,05; 87,23 e 62,17%, respectivamente, após 30 min (Gráfico 8, Tabela 10).

A subfração 5/6, que apresentou melhor atividade anticolinesterásica, foi

submetida a fracionamento (CC 7).

62

Gráfico 9: Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de 5/6 (proveniente de EDiOPer) nos tempos 30 e 60 min

De acordo com o gráfico 9 e tabela 10, as subfrações 5/7 a 12/7 e 15/7

apresentaram atividade anticolinesterásica com porcentagens de inibição da

atividade enzimática acima de 80% em T30 e T60. As subfrações 9/7 e 10/7 produziram efeito inibitório de 98,78 e 99,94%, respectivamente (T30), resultado

melhor que o obtido para o padrão eserina (% inibição: 94,35%, T30).

A avaliação da atividade anticolinesterásica segue o método de Ellman que se baseia na hidrólise do substrato acetiltiocolina (5) pela enzima acetilcolinesterase

(6), gerando como produto a tiocolina (7), que reage com o ácido 5,5’-ditiobis-[2-

nitrobenzóico] (DTNB ou reagente de Ellman) (8), produzindo 2-nitrobenzoato-5-

mercaptotiocolina (9) e 5-tio-2-nitrobenzoato (10), que podem ser detectados a 405

nm (TREVISAN E MACEDO, 2003) (Quadro 3).

63

Quadro 3: Reação de Ellman

FONTE: Adaptado de SILVA, 2001

Em geral, testes que utilizam reagentes de cor apresentam algumas limitações para avaliação de extratos que, em geral, apresentam coloração

esverdeada intensa devido à presença de clorofila e de alguns metabólicos

secundários que possuem cor. Outro fator limitante é a utilização de um solvente

orgânico que não interfira no ensaio e que seja capaz de solubilizar todas as

amostras (Rhee et al., 2001). O desvio-padrão elevado observado nos resultados de alguns extratos pode ter ocorrido devido à presença de pequenas bolhas de ar no

início da reação (logo após a pipetagem dos reagentes) que interferem na leitura.

Apesar das limitações e interferências, o método de avaliação da atividade

anticolinesterásica utilizado foi capaz de identificar os extratos e frações mais ativos

e direcionar o fracionamento biomonitorado.

64

Tabela 10: Inibição da atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas das colunas cromatográficas 5 (EDiOPom), 6 (EDiOPer) e 7 (Fr 5/6 de EDiOPer) nos tempos 30 e 60 min.

EDiOPom EDiOPer CC 5 T30 T60 CC6 T30 T60 CC7 T30 T60

Fr 2/5 0,00±0,00 35,47±3,93 Fr 1/6 30,11±14,80 31,66±3,35 Fr 3/7 41,87±6,17 51,01±4,47

Fr 3/5 0,00±0,00 42,57±0,77 Fr 2/6 50,34±9,72 56,12±3,36 Fr 4/7 65,62±5,93 72,90±1,60

Fr 4/5 89,03±6,64 96,56±1,89 Fr 3/6 62,32±4,90 63,24±0,82 Fr 5/7 90,73±2,14 90,83±0,31

Fr 5/5 44,02±3,79 74,49±1,46 Fr 4/6 62,05±11,36 67,79±10,06 Fr 6/7 94,09±3,50 95,01±4,02

Fr 6/5 48,06±0,47 70,53±3,62 Fr 5/6 87,23±9,99 88,32±7,83 Fr 7/7 85,25±2,65 88,10±1,28

Fr 7/5 25,08±1,03 54,44±6,21 Fr 6/6 62,17±7,51 64,49±6,72 Fr 8/7 90,48±3,76 91,16±1,30

Fr 8/5 1,25±2,16 22,28±3,85 Fr 7/6 37,41±14,55 45,66±6,20 Fr 9/7 98,78±2,12 98,68±1,60

Fr 9/5 0,00±0,00 0,00±0,00 Fr 8/6 26,18±14,33 36,34±2,22 Fr 10/7 99,94±0,10 98,40±2,76

Fr 10/5 0,00±0,00 0,00±0,00 Fr 9/6 40,70±13,15 46,85±4,94 Fr 11/7 84,35±11,44 87,34±9,06

Fr 11/5 0,00±0,00 3,15±2,90 Fr 10/6 39,29±12,07 43,81±4,82 Fr 12/7 94,71±3,60 94,01±4,55

Fr 11/6 21,00±18,38 5,23±5,01 Fr 13/7 57,60±7,84 65,02±5,53

Fr 14/7 63,56±2,95 67,31±1,83

Controles Fr 15/7 83,99±1,89 88,48±3,41

Eserina 94,35±1,44 91,78±0,77 Fr 16/7 34,10±9,63 39,57±9,15

MeOH 0,00±0,00 0,00±0,00 Fr 17/7 41,19±0,85 47,90±7,28

Fr 18/7 9,94±9,05 8,70±4,22

Fr 19/7 22,68±15,53 29,85±3,42

Fr 20/7 35,15±6,06 47,98±2,43

65

5.3 ANÁLISE POR CLAE-DAD DOS EXTRATOS BIOATIVOS

A técnica de CLAE-DAD é uma ferramenta bastante utilizada para análise do

perfil de substâncias fenólicas presentes em amostras obtidas de plantas

(ANDERSEN e MARKHAM, 2006). Por apresentarem cromóforos distintos entre si,

diferentes classes e subclasses de fenólicos podem ser identificadas a partir do

espectro de absorção no UV.

As análises por CLAE-DAD realizadas contribuíram para avaliação do perfil

químico dos metabólitos secundários presentes nos extratos e frações através da

comparação dos espectros de UV obtidos com os dados disponíveis na literatura.

As figuras 11 e 13 a 21 apresentam os cromatogramas e os espectros no UV

dos extratos que apresentaram melhor atividade (inibições maiores que 60%) como inibidores da enzima acetilcolinesterase.

Figura 11: Cromatograma por CLAE-DAD de EEtOPer (λ=330 nm) e espectros no UV

Pico 1 (tR: 15,87 min) Pico 2 (tR: 16,45 min)

66




Pico 9 (tR: 22,32 min)

De acordo com Fossen e Andersen (2006) os picos dos cromatogramas

obtidos por CLAE-DAD com bandas entre 240-285 nm e 300-550 nm estão

relacionados à presença de flavonoides.

67

O espectro de UV-VIS de flavonoides inclui duas bandas de absorção, sendo

que a banda I é característica de absorção devido ao grupo cinamoil do anel B

(figura 12) e encontra-se na região de comprimento de onda (λ) que varia de 210 a 350 nm para as flavonas, enquanto nos flavonois é encontrada entre 350 a 385 nm

(HARBORNE et al., 1975; TSIMOGIANNIS et al., 2007). Os flavonois são flavonas

substituídas na posição C-3 por uma hidroxila (ZUANAZZI e MONTANHA, 2007). A

banda II, característica do grupo benzoil do anel A e encontrada na faixa de 250 a

290 nm, é muito semelhante entre os diversos subgrupos de flavonoides

(HARBORNE et al., 1975; TSIMOGIANNIS et al., 2007).

Figura 12: Estrutura química geral dos flavonoides

O aumento do grau de hidroxilação do núcleo leva ao aumento do efeito

batocrômico e, consequentemente, os espectros deslocam-se no sentido dos

maiores comprimentos de onda. A metilação ou glicosilação dos grupamentos

hidroxila em geral não altera os respectivos espectros, exceto na hidroxila

característica dos flavonois (em C-3) ou em C-4’, quando se percebe efeito

hipsocrômico na banda I (HARBORNE et al., 1975; ZUANAZZI e MONTANHA, 2007). A acilação de um flavonoide tende a anular o efeito das hidroxilas fenólicas

no espectro UV. A acilação de um açúcar por substituintes do tipo ácido cinâmico é

revelada pela presença de duas bandas de absorção na região do UV, sendo que a

banda adicional (310-335 nm) corresponde à presença do grupamento acila

(HARBORNE et al., 1975).

A análise do cromatograma por CLAE-DAD do extrato etanólico bruto de Ocotea percoriacea (EEtOPer) (Figura 11, Tabela 11) revelou que os picos 1, 2, 3 e

4 apresentam espectros no ultravioleta característicos da presença de flavonois,

68

com máximos de absorção em torno de 255 e 355 nm. Os picos 5, 6 e 7 do mesmo

cromatograma possuem espectros no UV provavelmente pertencentes à classe das

flavonas ou flavonóis com uma hidroxila a menos em C-3’. Os picos 8 e 9 possuem bandas de absorção semelhantes, em torno de 266 e

312, e pertencem à mesma classe química. De acordo com Harborne et al. (1975)

esse padrão de absorção no UV pode indicar a presença de flavonoides acilados.

No entanto, foram necessárias análises por meio de outras técnicas, como CLAE

acoplada à espectrometria de massas para melhor elucidação da classe química

destas substâncias (resultados apresentados posteriormente).

Tabela 11: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EEtOPer Pico tR (min) λmáx (nm)

1 15,87 255, 355 2 16,45 253, 355 3 16,67 255, 355 4 16,91 256, 349 5 17,38 266, 347 6 17,80 265, 347 7 18,17 264, 342 8 21,95 267, 312 9 22,32 266, 317

O cromatograma por CLAE-DAD do extrato etanólico bruto de Ocotea sp.

(EEtOsp) (Figura 13, Tabela 12) apresentou os picos 3, 4 e 5, com espectros no UV

característicos de flavonois, enquanto os picos 6, 7 e 8 provavelmente pertencem à

classe das flavonas ou flavonóis com uma hidroxila a menos em C-3’.

Os picos 9 e 10 possuem bandas de absorção máxima em torno de 280 e 310

nm. De acordo com Tsimogiannis et al. (2007), di-hidroflavonois, flavanonas e

isoflavonas exibem banda I de baixa intensidade, frequentemente aparecendo como

ombro que absorve entre 300-330nm, sendo a banda II (λmáx=277 a 295nm) a banda

principal.

69

Figura 13: Cromatograma por CLAE-DAD de EEtOsp (λ=320 nm) e espectros no UV




70



Tabela 12: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EEtOsp Pico tR (min) λmáx (nm)

1 11,90 288 2 12,32 255, 354 3 12,90 254, 354 4 13,26 256, 354 5 13,50 255, 351 6 14,05 265, 338 7 14,41 265, 345 8 14,47 264, 338 9 18,92 279, 311 10 19,33 282, 314

A análise por CLAE-DAD do extrato hexânico de O. pomaderroides

(EHexOPom), no comprimento de onda 320 nm, não revelou a presença de nenhum

pico, o que indica que não existe na amostra substâncias químicas que contenham

grupamentos cromóforos que absorvem nessa região.

71

Figura 14: Cromatograma por CLAE-DAD de EHexOPer (λ=300 nm) e espectros no UV



O pico 1 do cromatograma por CLAE-DAD do extrato hexânicos de Ocotea

percoriacea (EHexOPer) apresentou espectro no UV característico de flavona ou

flavonol com uma hidroxila a menos em C-3’, enquanto os picos 2 e 3 apresentaram

espectro no UV semelhantes aos picos 8 e 9 do cromatograma por CLAE-DAD de EEtOPer (Figura 14, Tabela 13).

Tabela 13: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EHexOPer Pico tR (min) λmáx (nm)

1 18,05 264, 334 2 21,86 270, 311 3 22,23 264, 316

72

Figura 15: Cromatograma por CLAE-DAD de EHexOsp (λ=300 nm) e espectros no UV




73

Os espectros no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EHexOsp tiveram

intensidade muito fraca, impossibilitando a obtenção das absorções máximas (Figura

15).

Figura 16: Cromatograma por CLAE-DAD (λ=300 nm) de EDiOPom e espectro no UV

tR: 22,48 min, UV máx: 265 e 316 nm

Os espectros no UV de todos os picos dos cromatogramas por CLAE-DAD de

EDiOPom, EDiOPer e EDiOS (figuras 16, 17 e 18, tabela 14) apresentaram bandas

de absorção semelhantes aos picos 8 e 9 do cromatograma de EEtOPer e picos 2 e

3 do cromatograma de EHexOPer. Isso sugere que esta seja uma das principais

classes químicas responsáveis pelo efeito anticolinesterásico demonstrado pelos

extratos testados. A utilização do reagente Dragendorff na CCD não evidenciou a presença de alcaloides nestes extratos.

74

Figura 17: Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOPer (λ=300 nm) e espectros no UV



75

Figura 18: Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOS (λ=300 nm) e espectros no UV



Tabela 14: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD de EDiOPom, EDiOPer e EDiOS

EDiOPom EDiOPer EDiOS Pico tR (min) λmáx (nm) tR (min) λmáx (nm) tR (min) λmáx (nm)

1 22,48 265, 316 21,35 264, 311 20,79 263,313 2 - - 21,83 266, 315 21,18 268, 311 3 - - 22,19 266, 315 21,55 266, 316

76

Figura 19: Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOsp (λ=320 nm) e espectros no UV




77





78

Pico 15 (tR: 26,27 min)

Apesar dos espectros no UV dos picos 1 a 5 do cromatograma por CLAE-

DAD de EDiOsp apresentarem baixa intensidade, os mesmos assemelham-se aos

espectros no UV de flavonoides (Figura 19, tabela 15). Os espectros no UV dos picos 9 a 12 mostraram máximos de absorção em 267 e 312 nm e pertencem à

mesma classe dos picos 8 e 9 do cromatograma de EEtOPer, picos 2 e 3 do

cromatograma de EHexOPer e todos os picos dos cromatogramas de EDiOPom,

EDiOPer e EDiOS, conforme discussão anterior.

Tabela 19: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EDiOsp Pico tR (min) λmáx (nm)

1 13,28 269, 324 2 13,54 253, 341 3 14,44 265, 341 4 14,79 265, 327 5 15,24 271, 367 6 16,46 295, 316 7 16,77 269, 327 8 17,16 nd 9 17,47 265, 318 10 18,39 269, 312 11 18,92 267, 312 12 19,32 267, 316 13 21,66 337 14 23,84 289 15 26,27 nd

nd: não detectado

79

Figura 20: Cromatograma por CLAE-DAD de EAcOPom (λ=330 nm) e espectros no UV




80



Pico 11 (tR: 22,46 min)

A análise do cromatograma por CLAE-DAD de EAcOPom (Figura 20, Tabela

16) revelou que os picos 1 a 3 apresentam espectros no ultravioleta característicos

da presença de flavonois, com máximos de absorção em torno de 255 e 350 nm. Os

picos 4 e 5 do mesmo cromatograma possuem espectros no UV provavelmente

pertencentes à classe das flavonas ou flavonóis contendo uma hidroxila a menos em

C-3’.

Os picos 7 a 11 demonstram bandas de absorção semelhantes, em torno de

260 e 317, e pertencem à mesma classe química já discutida, que se supõe ser

responsável pelo efeito anticolinesterásico observado.

81

Tabela 16: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD de EAcOPom Pico tR (min) λmáx (nm)

1 16,02 255, 354 2 16,61 255, 358 3 17,07 255, 349 4 17,55 264, 346 5 18,32 264, 343 6 18,80 257, 317 7 20,18 267, 317 8 20,88 264, 317 9 21,69 263, 317 10 22,08 267, 313 11 22,46 266, 316

Figura 21: Cromatograma por CLAE-DAD de EAcOsp (λ=320 nm) e espectros no UV


82





83

Os picos 3, 4 e 5 do cromatograma por CLAE-DAD de EAcOsp (Figura 21,

Tabela 17) possuem espectros no UV característicos da presença de flavonois,

enquanto os picos 6, 7 e 8 apresentam bandas de absorção semelhantes às flavonas ou flavonóis contendo uma hidroxila a menos em C-3’.

Os picos 9 e 10 exibem máximos de absorção em torno de 280 e 310 nm, da

mesma forma que os picos 9 e 10 do cromatograma por CLAE-DAD de EEtOsp

(Figura 13, Tabela 12) .

Tabela 17: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD de EAcOsp Pico tR (min) UV máx (nm)

1 11,99 289 2 12,59 nd 3 12,97 256, 355 4 13,35 256, 355 5 13,57 256, 349 6 14,17 265, 336 7 14,48 265, 342 8 14,83 264, 341 9 18,96 282, 308 10 19,37 284, 310

nd: não detectado

5.4 ANÁLISE POR CLAE-DAD DAS FRAÇÕES BIOATIVAS

As figuras 22 a 34 apresentam os cromatogramas e os espectros no UV das

frações que apresentaram melhor atividade, ou seja, inibições da atividade da

enzima acetilcolinesterase maiores que 60%.

As frações da CC 5 (frações 4/5, 5/5 e 6/5) são provenientes de EDiOPom.

Todos os picos dos cromatogramas por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5

apresentaram tempos de retenção e bandas de absorção no UV semelhantes (λmáx

em torno de 200 e 250 nm) (Figura 22, tabela 18). A partir destes dados pode-se

apenas sugerir que estas frações ativas provenientes da CC 5 contém compostos

aromáticos (PAVIA et al., 2010). Outras análises espectroscópicas são necessárias

para estabelecer a classe química a qual pertencem estas substâncias.

84

Figura 22: Cromatogramas por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5 (λ=250 nm) e espectros no UV

Fração 4/5

Pico 3 (tR: 27,53 min) Fração 5/5



Fração 6/5


85

Tabela 18: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5

Fr 4/5 Fr 5/5 Fr 6/5 Pico tR (min) λmáx (nm) tR (min) λmáx (nm) tR (min) λmáx (nm)

1 - - 23,69 270 23,70 255 2 - - 27,19 260, 280 sh - - 3 27,53 250 27,52 255 - -

*máximo observado; sh: ombro (shoulder)

As frações da CC 6 (frações 3/6, 4/6, 5/6 e 6/6) são resultantes do

fracionamento de EDiOPer.

Os picos 1, 2 e 3 dos cromatogramas por CLAE-DAD das frações 3/6 e 4/6

apresentaram tempos de retenção e espectros no UV compatíveis com bandas de

absorção de compostos aromáticos (Figuras 23 e 24 e tabelas 19 e 20).

86

Figura 23: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 3/6 (λ=260 nm) e espectros de UV



Tabela 19: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 3/6 Pico tR (min) λmáx* (nm)

1 23,61 270 2 27,17 250 3 27,79 290

*máximo observado

87





1 23,68 270 2 27,17 250 3 27,49 250

*máximo observado

88





1 18,00 265, 315 2 18,55 265, 315 3 18,99 265, 315 4 23,64 270

*máximo observado

89

Os espectros no UV dos picos 1, 2 e 3 do cromatograma por CLAE-DAD da

fração 5/6 (Figura 25, Tabela 21) apresentaram bandas de absorção semelhantes

aos picos 1, 2 e 3 do cromatograma de EDiOPer e picos 8 e 9 de EEtOPer, o que reafirma a possibilidade de que essa classe de substâncias seja responsável pelo

efeito anticolinesterásico.

A análise do cromatograma por CLAE-DAD da fração 6/6 (Figura 26, Tabela

22) revelou que os picos 3 a 6 apresentam espectros no ultravioleta característicos

da presença de flavonois, com máximos de absorção em torno de 255 e 360 nm,

semelhantes aos picos 1 a 4 de EEtOPer. Os picos 7, 8 e 9 do mesmo

cromatograma possuem espectros no UV provavelmente pertencentes à classe das

flavonas ou flavonóis contendo uma hidroxila a menos em C-3’ (λmáx em torno de 265

e 350 nm) da mesma forma que os picos 5 a 7 do cromatograma de EEtOPer.



90





91


1 7,64 255 2 10,37 275, 310 3 11,90 255, 360 4 12,45 255, 360 5 12,69 255, 360 6 12,92 255, 360 7 13,37 265, 350 8 13,85 265, 350 9 14,19 265, 345

*máximo observado

As frações da CC 7 (frações 5/7 até 12/7) derivam do fracionamento de Fr

5/6.

Figura 27: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/7 (λ=260 nm) e espectro de UV

tR: 23,60 min, UV máx: 270 nm O pico 1 (tR: 23,60 min) do cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/7

(Figura 27) apresenta espectro no UV com máximo de absorção em 270 nm

semelhante ao pico 1(tR: 23,61 min) do cromatograma da fração 3/6 (Figura 23).

92





1 12,88 225, 275 2 14,19 255 3 15,86 290, 320 4 17,34 nd

*máximo observado; nd: não detectado

93

Os picos 4 (tR: 14,18 min) e 5 (tR: 15,85 min) do cromatograma por CLAE-

DAD da fração 7/7 (Figura 29, Tabela 24) são semelhantes aos picos 2 (tR: 14,19 min) e 3 (tR: 15,86 min) do cromatograma da fração 6/7. Os picos 6 (tR: 18,78 min) e

7 (tR: 19,56 min) do mesmo cromatograma pertencem à mesma classe química. O

espectro no UV do pico 8 (tR: 27,09 min) apresenta máximos de absorção em

440, 415 e 265, dados que diferem dos resultados já apresentados e podem indicar

a presença de pigmentos.




94



Tabela 24: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 7/7 Pico tR (min) UV máx* (nm)

1 12,01 250 2 12,89 270 3 13,96 220, 265 4 14,18 255 5 15,85 220, 315 6 18,78 240 7 19,56 240 8 27,09 265, 415, 440

*máximo observado

O pico 1 (tR=12,86, λmáx= 225 e 275 nm) do cromatograma da fração 8/7

(Figura 30, Tabela 25) parece ser equivalente ao pico 1 (tR=12,88, λmáx= 225 e 275

nm) do cromatograma da fração 6/7 (Figura 28, Tabela 23). O pico 2 (tR: 15,85 min)

da fração 8/7 é semelhante aos picos 5 do cromatograma da fração 7/7 e pico 3 do cromatograma da fração 6/7.

95

Os espectros no UV dos picos 8 e 9 do cromatograma da fração 8/7

assemelham-se ao espectro no UV do pico 8 (tR: 27,09 min) do cromatograma da

fração 7/7 (Figura 29, Tabela 24). Figura 30: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 8/7 (λ=260 nm) e espectros de UV



96





1 12,86 225, 275 2 15,85 225, 315 3 18,03 280 4 18,71 240 5 19,55 240 6 23,93 260, 330, 430 7 24,26 270, 330, 435 8 27,12 270, 415, 440 9 27,51 260, 320, 410

*máximo observado

97





1 15,59 240, 330 2 26,17 270, 325, 410 3 27,44 270, 325, 410

*máximo observado

98

A mesma classe de substâncias encontradas nas frações 7/7 e 8/7 (Figuras

29 e 30), com cromóforos que absorvem em regiões em torno de 400 nm, foi

encontrada nas frações 9/7 (pico 2, tR: 26,17 min e pico 3, tR: 27,44 min), 10/7 (pico 5, tR: 26,16 min), 11/7 (picos 7 a 10) e 12/7 (picos 5 a 10) (Figuras 31 a 34 e Tabelas

26 a 29).




99



1 13,47 250 2 15,53 240, 330 3 18,74 350 4 24,46 nd 5 26,16 270, 325, 410

*máximo observado; nd: não detectado

100





101




1 11,32 250 2 13,51 230 3 13,77 225, 290 4 18,77 240, 350 5 19,59 265, 360 6 20,13 250, 320, 410 7 22,20 275, 410 8 24,44 270, 410 9 24,94 265, 410 10 26,18 270, 325, 410

*máximo observado

102





103




1 12,01 220, 260, 300 2 13,76 230, 285 3 14,23 230, 280 4 16,29 230, 280 5 19,29 275, 325, 410 6 20,13 250, 340, 410 7 22,23 275, 330, 370, 410 8 25,11 (nd), 415, 435 9 26,48 265, 420, 445 10 26,95 265, 420, 445

*máximo observado, nd: não detectado

104

5.5 ANÁLISE POR CLAE-DAD-EM/EM DOS EXTRATOS BIOATIVOS

Para melhor elucidação estrutural das substâncias responsáveis pelo efeito

anticolinesterásico apresentado, os extratos e frações mais ativos foram analisados

por CLAE-DAD-EM/EM.

Esta técnica desempenha um papel proeminente como uma ferramenta

analítica para detecção e identificação de metabólitos secundários conhecidos e

farmacologicamente ativos, provenientes de plantas. Quando comparada aos outros

métodos de detecção, a espectrometria de massas não só permite a determinação

da estrutura química de algumas substâncias naturais já descritos na literatura,

como também oferece excelente sensibilidade para analisar amostras em pequenas

quantidades em um tempo relativamente curto, além de ser bastante útil para avaliar flavonoides e outros constituintes fenólicos (SALDANHA et al., 2013).

As análises por CLAE-DAD-EM/EM realizadas contribuíram para identificação

ou confirmação da classe química de alguns metabólitos secundários presentes nos

extratos e frações através da comparação dos espectros de massas obtidos com os

dados disponíveis na literatura.

As figuras 35 a 38 apresentam os cromatogramas de íons totais e os espectros de massas dos extratos em diclorometano e acetato de etila que

apresentaram melhor atividade anticolinesterásica.

Os cromatogramas de íons totais por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) de

EDiOPom, EDiOPer, EDiOS e EDiOsp apresentaram picos majoritários com perfis

de fragmentação semelhantes e uma região com picos sobrepostos no tempo de

retenção entre 24 e 28 minutos.

Os fragmentos do pico 1 (tR=17,0 min), presente em EDiOPom e EDiOS,

indicaram a presença de 2 substâncias com massa molecular de 724 e 740. A fragmentação do íon m/z 723 [M-H]- originou os fragmentos m/z 577 [(M-H)-146]-,

559 [(M-H)-164]-, 413 [(M-H)-310]- e 285 [(M-H)-438]- (Tabela 30). Esse perfil de

fragmentação é semelhante ao descrito para a substância canferol 3-O-α-L-(2,3-di-

E-p-cumaroilramnopiranosídeo) (platanosídeo), encontrada no extrato acetato de

105

etila de Platanus acerifolia (KAOUADJI, 1990), indicando a presença de flavonoide

di-cinamoil glicosídeo em O. pomaderroides.

Esse dado está de acordo com o espectro de UV encontrado para o pico majoritário do cromatograma por CLAE-DAD de EDiOPom (λmáx= 265 e 316nm). De acordo com Kaouadji (1990), a presença de mais de um ácido p-cumárico ligados ao

açúcar do flavonoide apresenta alta absorção em torno de 312 nm e uma banda

menos perceptível (ombro) em 360 nm. Flavonoides glicosilados contendo ácido p-cumárico já foram encontrados no

gênero Ocotea. Garcez et al. (1995) isolaram 3 derivados p-cumaroil da afzelina

(canferol-3-O-α-L-ramnose) a partir do extrato clorofórmico de folhas de O.

vellosiana.

A partir do pico 1 também foi possível observar a presença de outro íon molecular em m/z 739 [M-H]- que originou os fragmentos m/z 593 [(M-H)-146]-, 447

[(M-H)-292]- e 301 [(M-H)-438]-, indicando a presença de outro flavonoide di-cinamoil glicosídeo, sendo que neste caso a aglicona é a quercetina (Tabela 30). A presença dos fragmentos m/z 301 e 285 no espectro de massas de flavonoides, obtido por

CLAE-DAD-EM/EM no modo negativo, caracteriza as agliconas como sendo a

quercetina e o canferol, respectivamente (SALDANHA et al., 2013).

O pico 2 (tR=17,3 min), presente em EDiOPom, apresentou o íon molecular m/z 723 [M-H]- que deu origem aos fragmentos m/z 577 [(M-H)-146]-, 559 [(M-H)-

164]-, 437 [(M-H)-286]- e 285 [(M-H)-438]-. Em EDiOPer foi observado um pico com o mesmo tempo de retenção com diferença nos fragmentos m/z 617 [(M-H)-106]- e

439 [(M-H)-284]- (Tabela 30).

O pico majoritário 3 (tR=17,8 min), presente em EDiOPom, EDiOPer, EDiOS e EDiOsp possui íon molecular m/z 723 [M-H]- que deu origem aos fragmentos em

comum m/z 577 [(M-H)-146]-, 437 [(M-H)-286]- e 285 [(M-H)-438]-. Em EDiOPer foi

observado o fragmento adicional m/z 559 [(M-H)-164]- e para EDiOPom foi verificada

também a presença a mais dos fragmentos m/z 676 [(M-H)-164]- e m/z 559 [(M-H)-

164]- (Tabela 30). O pico 3 em EDiOPom também apresentou íon molecular m/z 723 [M-H]- e os

mesmos fragmentos gerados pelo pico 2, diferindo na intensidade e presença do

106

fragmento m/z 676 [(M-H)-164]- , o que indica que provavelmente as substâncias dos

picos 2 e 3 em EDiOPom sejam isômeros (Tabela 30).

De modo semelhante ao pico 1, o padrão de fragmentação dos picos 2 e 3 e o espectro no UV demonstrados por estes picos majoritários sugerem a presença de flavonoides di-cinamoil glicosilados nos extratos diclorometano das espécies O.

pomaderroides e O. percoriacea, O. spixiana e Ocotea sp.

Com base apenas no perfil de fragmentação do espectro de massas não foi

possível caracterizar os picos 4 (tR=24,0 min) e 5 (tR=24,0 min).

Tabela 30: Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos diclorometano de espécies de Ocotea Pico tR

(min) [M-H]- (m/z) Fragmentos (m/z)

EDiOPom 1 16,9 739 723

593, 447, 301 577, 559, 413, 285

2 17,3 723 577, 559, 437, 285 3 17,8 723 676, 577, 559, 437, 285

EDiOPer 2 17,3 723 617, 577, 559, 439, 285 3 17,7 723 577, 559, 437, 285

5 24,0 953 785

937, 699 769, 699, 531

EDiOS 1 17,0 739 723

593, 301 577, 559, 413, 285

3 17,8 723 577, 437, 285

5 24,1 953 785

937, 699 769, 699, 531

EDiOsp 3 17,8 723 4 21,4 601 (?) 556, 289, 245 5 24,5 785 769, 699, 531

107

Figura 35: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOPom

Pico 1 (tR=16,9 min)

213.1 320.5 488.0588.6

738.8

806.6927.3970.2 1110.2

1359.8 1514.5

738.8722.9

-MS, 16.9min #387

0

2

4

6

8

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

285.0

412.9

558.8

576.7

-MS2(723.3), 16.7min #382

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

300.9 446.8

592.8

690.8

-MS2(739.0), 16.9min #388

0

1

2

3

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 2 (tR=17,3 min)

666.6

722.9

790.71076.2

722.9

790.7

-MS, 17.3min #399

0

1

2

3

4

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

108

254.9

284.9

436.8

558.7

576.8

602.5

-MS2(723.1), 17.6min #406

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z 744.7

-MS2(791.1), 17.4min #401

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z Pico 3 (tR=17,8 min)

722.9

790.7

858.2

722.9

790.7

-MS, 17.8min #411

0.0

0.5

1.0

1.5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 744.8

-MS2(791.1), 17.8min #413

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

285.2

436.9

558.6576.7

675.8

-MS2(723.2), 17.8min #412

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10Intens.

200 300 400 500 600 700 m/z

109

Figura 36: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOPer


643.5

722.9

790.7

880.6

722.9

790.7

-MS, 17.3min #405

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

284.9 438.6

558.7

576.8

617.3

-MS2(723.2), 17.4min #406

0

1

2

3

4

54x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 3 (tR=17,7 min)

722.8

790.7

902.7

722.8

790.7

-MS, 17.7min #417

0.0

0.5

1.0

1.5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

285.0

436.7 558.3

576.7

-MS2(723.1), 17.8min #418

0

1

2

3

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 5 (tR=24,0 min)

110

324.2 448.7 519.0 588.6656.5

687.3

724.5

785.4

860.5

953.5

999.4 1188.7 1304.0 1396.61456.9

953.5

785.4

-MS, 24.0min #591

0

2

4

6

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 699.2 937.5

-MS2(954.3), 24.1min #592

0

1

2

3

45x10

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

531.1699.2

769.2

-MS2(785.9), 23.9min #586

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z

111

Figura 37: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOS


590.9 658.8

738.8

806.7

854.2919.6 1044.2 1176.4

738.8

722.9

-MS, 17.0min #396

0

1

2

3

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

301.0

592.8

-MS2(739.1), 16.8min #392

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

254.9

285.0

351.0 413.0

558.7

576.9617.3 650.3

-MS2(723.1), 16.8min #391

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Pico 3 (tR=17,8 min)

112

722.9

790.7

882.3

722.9

790.7

-MS, 17.8min #420

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

284.9

437.0

576.6

-MS2(723.2), 17.8min #421

0

1

2

3

4

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 m/z Pico 5 (tR=24,1 min)

374.5 448.9

520.6588.7

656.5

687.3 730.1

786.3

831.2869.1

953.4

1053.5 1251.01312.7

953.4

785.2

-MS, 24.1min #594

0

1

2

3

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 m/z

699.1937.4

-MS2(954.1), 24.1min #595

0.0

0.5

1.0

1.5

2.05x10

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 m/z

531.0

699.2

769.2

-MS2(786.0), 24.2min #596

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 m/z

113

Figura 38: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOsp


656.3

722.8

790.8

943.3

722.8

790.8

-MS, 17.8min #422

0

1

2

3

4

5

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 744.7

-MS2(791.0), 17.7min #419

0

1

2

3

4

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z Pico 4 (tR=21,4 min)

289.1

356.9 492.6560.7

601.1

669.0 737.0 804.6 912.81022.11075.1 1160.6 1222.6 1438.8 1539.0

601.1

289.1

-MS, 21.4min #518

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

114

245.1

289.1

556.0

-MS2(601.4), 21.4min #519

0

1000

2000

3000

4000

5000

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z Pico 5 (tR=24,5 min)

112.8

255.1

316.8 452.8

613.1 687.3

731.0

785.3

866.7

953.5

1029.3 1133.61218.4 1288.1

1342.7 1462.8 1530.6

785.3

953.5

-MS, 24.5min #608

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

531.0699.2

769.3

-MS2(785.8), 24.1min #597

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

Os extratos EAcOPom e EAcOsp também foram submetidos à análise por

CLAE-DAD-EM/EM. Os resultados destas análises estão demonstrados nas figuras

39 e 40 e tabela 31 e 32.

O pico 1 (tR=4,9min) observado no cromatograma de íons totais de EAcOPom

obtido por CLAE-DAD-EM/EM não pode ser identificado com base apenas no seu

padrão de fragmentação (Figura 39, Tabela 31).

Os picos 2 (tR=10,3min) e 3 (tR=11,0min) foram identificados como sendo flavonoides glicosilados derivados da quercetina. Os fragmentos m/z 301[(M-H)-162]-

e m/z 301[(M-H)-132]- dos picos 2 e 3, respectivamente, indicam a presença de uma

hexose (glicose ou galactose) devido a perda de 162 Da, e presença de uma

pentose (xilose ou arabinose) devido a perda de 132 Da (Figura 39, Tabela 31).

115

O pico 4 (tR=12,9min) apresentou íon molecular em m/z 431[M-H]- que gerou

o fragmento m/z 285[(M-H)-146]-. Este perfil de fragmentação sugere a perda de

uma deoxihexose ligada a aglicona canferol (Figura 39, Tabela 31). Os picos 6 (tR=16,9min) e 7 (tR=17,3min) apresentaram perfil de fragmentação

semelhantes aos encontrados para os picos 1 e 2 do cromatograma de íons totais

por CLAE-EM/EM de EDiOPom (Figura 35, Tabela 30), indicando que os mesmos

flavonoides di-cumaroil glicosilados estão presentes nos extratos diclorometano e acetato de etila de O. pomaderroides.

Os picos 5 (tR=15,9min) e 8 (tR=17,7min) demonstraram perfil de

fragmentação que sugere a presença de flavonoides glicosilados derivados do canferol, contendo uma ou duas unidades de ácido p-cumárico, respectivamente

(Figura 39, Tabela 31).

Tabela 31: Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos acetato de etila de Ocotea pomaderroides Pico tR (min) [M-H]- (m/z) Fragmentos (m/z) 1 4,9 863 711, 693, 559, 531, 246 2 10,3 463 301 3 11,0 433 301 4 12,9 431 285 5 15,9 577 431, 285 6 16,9 739 593, 301 7 17,3 723 577, 559, 413, 285 8 17,7 723 577, 431, 285

116

Figura 39: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EAcOPom

Pico 1 (tR=4,9 min)

862.8

930.8

862.8

930.8

-MS, 4.9min #113

0

2

4

6

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

245.8 411.8 530.7 558.6

692.7

710.8

734.2

-MS2(863.2), 4.9min #114

0

2

4

6

84x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 2 (tR=10,3 min)

341.9

462.9

530.8

609.0

676.9788.6

834.3 926.8 1017.0 1100.1

462.9

609.0

-MS, 10.3min #241

0

2

4

6

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 300.9

-MS2(463.0), 10.3min #242

0

2

4

6

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 3 (tR=11,0 min)

117

433.0

500.8568.8 658.7 711.2

804.6

866.8

957.01048.7 1285.1

866.8433.0

-MS, 11.0min #259

0.0

0.5

1.0

1.5

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

150.8 179.0

300.8

-MS2(433.1), 11.1min #261

0

1

2

3

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z Pico 4 (tR=12,9 min)

430.8

498.8 566.7 634.8 702.7 770.4

862.8

975.8 1106.7

862.8

884.7

-MS, 12.9min #307

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

285.0

430.6

-MS2(863.1), 12.9min #308

0

1

2

34x10

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z Pico 5 (tR=15,9 min)

470.6 528.1

576.9

644.7

738.8

864.6 973.9 1066.1 1178.6 1247.9 1372.5 1462.6

576.9

738.8

-MS, 15.9min #385

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 284.9

430.8

-MS2(577.1), 15.9min #386

0

1

2

3

4

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

118


650.4

738.8

806.7

1100.4 1345.8

738.8

722.9

-MS, 16.9min #415

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

301.0

592.9

-MS2(739.1), 17.0min #416

0

1

2

3

45x10

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z Pico 7 (tR=17,3 min)

722.8

790.8

836.6 1053.9

722.8

790.8

-MS, 17.3min #427

0.0

0.5

1.0

1.5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

285.0

412.6

558.6

576.7

602.9650.2

-MS2(723.1), 17.4min #428

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Pico 8 (tR=17,7 min)

722.8

790.7

722.8

790.7

-MS, 17.7min #438

0

1

2

3

4

5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

119

229.8

285.0

395.7 430.9

576.7

-MS2(723.1), 17.7min #439

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

Tabela 32: Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos acetato de etila de Ocotea sp. Pico tR (min) [M-H]- (m/z) Fragmentos (m/z) 1a 5,5 863 711, 693, 559, 408 2a 6,6 863 711, 693, 559, 451

3a 10,7 449 595

303, 285, 177, 151 577, 505, 415, 300, 271, 179

4a 11,4 565 633

300, 271, 179 587, 565

5a 12,0 447 301 6a 12,9 417 285 7a 13,4 431 285 8a 18,3 723 645, 577, 559, 437, 285

Os picos 1a (tR=5,5min) e 2a (tR=6,6min) presentes no cromatograma de íons

totais de EAcOsp obtido por CLAE-DAD-EM/EM pertencem a mesma classe química

devido a semelhança dos seus íons moleculares e perfis de fragmentação, no

entanto, não puderam ser identificados com base apenas nestes dados (Tabela 32,

Figura 40). O pico 3a (tR=10,7min) possui íon molecular m/z 449 [M-H]- que deu origem

aos fragmentos m/z 303 [(M-H)-146]-, 285 [(M-H)-164]-, 177 [(M-H)-272]- e 151 [(M-

H)-298]- indicando a presença de um flavonoide glicosilado derivado do canferol. Os picos 5a (tR=12,0min), 6a (tR=12,9min) e 7a (tR=13,4min) também demonstraram íon

molecular e perfil de fragmentação que sugere a presença de flavonoides

glicosilados derivados da quercetina (5a) e do canferol (6a e 7a) (Tabela 32, Figura

40). O pico 8a (tR=18,3min) apresentou íon molecular m/z 723 [M-H]- da mesma

forma que os picos 7 e 8 de EAcOPom (Figura 39, Tabela 31), indicando tratar-se

provavelmente de um flavonoide acilado, derivado do canferol devido a presença do fragmento m/z 285.

120

Figura 40: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EAcOsp

Pico 1a (tR=5,5 min)

718.7

862.7

930.7

862.7-MS, 5.5min #136

0

2

4

6

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

408.0 512.4

558.7

656.7

692.6

710.7

-MS2(863.2), 5.4min #132

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 2a (tR=6,6 min)

604.3 718.7

862.7

940.3 1069.3 1240.01295.3

862.7

884.6

-MS, 6.6min #165

0

2

4

6

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

450.5558.6

692.7

710.7

778.5

-MS2(863.2), 6.6min #166

0.0

0.5

1.0

1.54x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 3a (tR=10,7 min)

121

373.0

448.8

516.8

594.9

662.7

720.7 789.2899.6

943.8 998.2 1065.31191.8 1315.4

594.9

448.8

-MS, 10.7min #263

0

2

4

6

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

150.9

177.1

285.0

303.0

322.9

-MS2(449.0), 10.6min #259

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z

178.8 225.7

271.0

300.0

324.8 372.7

414.7 504.4576.7

-MS2(595.1), 10.7min #264

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z Pico 4a (tR=11,4 min)

338.8432.8

564.8

632.7

694.8 749.3 830.5 879.5 959.3

564.8

632.7

-MS, 11.4min #281

0.0

0.5

1.0

1.5

2.05x10

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

179.0 254.9271.0

300.0

324.8 414.6 474.7

-MS2(564.9), 11.2min #276

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Pico 5a (tR=12,0 min)

446.8

514.8

578.8

646.7

894.8

1026.9

894.8

446.8

-MS, 12.0min #299

0

1

2

3

45x10

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

122

300.9

-MS2(447.0), 12.1min #301

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Pico 6a (tR=12,9 min)

248.1

416.9

484.6 552.9 620.6687.0

834.7

880.3 938.9 1115.6 1173.91329.1 1451.2

416.9

834.7

-MS, 12.9min #323

0

1

2

3

4

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

285.0

416.7

656.6 766.8 811.4

-MS2(834.8), 13.0min #325

0

500

1000

1500

2000

2500Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 7a (tR=13,4 min)

430.8

498.8

566.7634.7

702.8 770.7

884.8

993.1 1095.7 1195.0 1278.3 1378.51488.0 1563.0

430.8

498.8

-MS, 13.4min #335

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.05x10

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

255.2

284.9

-MS2(431.0), 13.4min #336

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Pico 8a (tR=18,3 min)

123

656.6

722.9

790.6861.2 955.6 1035.1

722.9

790.6

-MS, 18.3min #455

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.55x10

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

285.0

436.8

558.7

576.8

645.1

-MS2(723.2), 18.3min #456

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.04x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

As interpretações dos espectros de massas das frações ativas 4/5 (obtida de

EDiOPom), 5/6 e 10/7 (provenientes de EDiOPer) foram inconclusivas, havendo a

necessidade de análises espectrais adicionais.Os cromatogramas de íons totais por

CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) de Fr 4/5, 5/6 e 10/7 estão apresentados nos

anexos 1 a 3.

O espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) da substância pura proveniente do

fracionamento de Fr 5/5 (EDiOPom) mostrou sinais em δ 5,36 (H-6), sugerindo a presença de hidrogênio olefínico e um multipleto entre δ 3,47 a 3,60 (H-3) que pode

ser atribuído a hidrogênio ligado a carbono carbinólico. Foram observados ainda

sinais entre δ 0,60 e 2,40, característicos de absorções de hidrogênios metílicos,

metilênicos e metínicos (Anexos 4 a 6).

O espectro de RMN de 13C registrou a presença de 29 átomos de carbono. Os sinais em δ 140,77 e 121,74 foram atribuídos aos carbonos da ligação dupla entre

C-5 e C-6 do esteróide β-sitosterol. Foi observado ainda um sinal em δ 71,83

atribuído ao carbono carbinólico C-3 (Anexos 7 a 10).

A comparação dos dados espectroscópicos obtidos com dados descritos na

literatura (Tabela 33) permitiu confirmar que a substância isolada do extrato

diclorometano de O. pomaderroides trata-se do β-sitosterol. No entanto, como esta

não foi a fração mais ativa, não se pode atribuir a esta classe de substância

(fitoesteroides) qualquer contribuição para o efeito biológico observado.

124

Tabela 33: Dados dos espectros de RMN de 13C [300 MHz, CDCl3, δ (ppm)] do β-sitosterol isolado de EDiOPom e valores da literatura* Posição do

carbono δ

β-sitosterol literatura 1 37,26 37,33 2 29,72 31,63 3 71,83 71,73 4 42,32 42,20 5 140,77 140,71 6 121,74 121,63 7 31,92 31,96 8 31,68 31,81 9 50,14 51,13 10 36,52 36,43 11 21,09 21,09 12 39,78 39,79 13 42,32 42,37 14 56,78 56,75 15 24,31 24,15 16 28,26 25,25 17 56,06 56,02 18 11,99 11,84 19 19,41 19,46 20 36,16 36,07 21 18,79 18,68 22 33,95 33,95 23 26,07 26,10 24 45,84 45,82 25 29,15 29,15 26 19,83 19,77 27 19,03 19,21 28 23,07 23,13 29 11,87 11,04

*GRECA, MONACO, PREVITERA, 1990

Uma revisão realizada por Barbosa-Filho et al. (2006) descreveu 260

substâncias naturais relatadas na literatura que foram avaliadas para inibição da

atividade acetilcolinesterásica. A maioria das substâncias isoladas, identificadas e

testadas são alcaloides (139), enquanto as demais fazem parte das classes dos

monoterpenos (27), cumarinas (18), triterpenos (17), flavonoides (14), benzenoides

(13), diterpenos (8), sesquiterpenos (5), lignanas (2), entre outras.

Não foram descritos até o momento relatos que associem a atividade

anticolinesterásica à presença de flavonoides di-cumaroil glicosilados, no entanto,

125

um estudo realizado por Santos (2009) indicou que polifenóis derivados do ácido

cinâmico, como o ácido caféico, ácido p-cumárico e, principalmente, o ácido

rosmarínico apresentam atividade anticolinestererásica, além da atividade antioxidante. Isto sugere que o efeito demonstrado pelos extratos de Ocotea

pomaderroides e O. percoriacea descritos neste trabalho podem estar associados à

presença das unidades de derivados do ácido cinâmico ligadas aos flavonoides

glicosilados presentes nestas espécies estudadas.

126

6 CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos, os extratos hexânicos: EHexOPom,

EHexOPer e EHexOsp; diclorometano: EDiOPom, EDiOPer, EDiOS e EDiOsp; e

acetato de etila: EAcOPom e EAcOsp foram promissores como inibidores da

atividade da enzima acetilcolinesterase, apresentando resultados de inibição

superiores a 70%. Isso mostra que estes extratos apresentam potente atividade anticolinesterásica in vitro.

As frações obtidas de EDiOPom e EDiOPer também apresentaram atividade

anticolinesterásica, em alguns casos, superior ao padrão eserina testado.

A análise do perfil químico por CLAE-DAD e CLAE-DAD-EM/EM dos extratos

mais ativos revelou a presença de flavonoides glicosilados derivados da quercetina e do canferol, além de flavonoides di-cinamoil glicosilados como substâncias

majoritárias presentes nas amostras testadas. A partir da fração 5/5 (obtido de EDiOPom) foi possível isolar o β-sitosterol, identificado por RMN de 1H e 13C.

Para melhor caracterização química das substâncias presentes nas frações

responsáveis pelo efeito anticolinesterásico observado, serão necessárias análises

espectrais adicionais. Este trabalho contribuiu para o conhecimento científico das espécies Ocotea

pomaderroides e O. percoriacea presentes no semi-árido baiano e pela primeira vez

analisadas do ponto de vista químico e biológico. Além disso, as frações mais

ativas 4/5 (provenientes de EDiOPom), 5/6, 9/7 e 10/7 (originadas de EDiOPer)

possuem elevado potencial como produto biotecnológico com potente atividade

anticolinesterásica.

127

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137

ANEXOS

Anexo 1: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 4/5

(EDiOPom)


135.2

181.1

382.9

542.8 574.5

181.1

382.9

+MS, 14.1min #331

0

1

2

3

4

5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

107.2

121.3

135.2

145.1

153.1

163.0

+MS2(181.1), 14.1min #332

0

1

2

3

4

5

5x10Intens.

100 120 140 160 180 200 220 240 260 m/z Pico 2 (tR=19,7 min)

119.3 191.1218.9 260.8 291.8316.9 385.1

457.1

519.2558.2

607.1

685.9 745.5 809.5 863.3 910.4 977.2 1008.11077.6

1144.0

457.1

452.1

+MS, 19.7min #486

0.0

0.5

1.0

1.5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

138

155.0

273.1

317.0

363.1 405.1

435.0

+MS2(452.2), 19.9min #493

0

2

4

6

8

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 3 (tR=20,7 min)

117.1

157.0 222.4 289.8 326.7

357.1

399.0

420.9

442.0

483.0

531.1561.8587.0

641.2 695.6714.0

797.7

821.2

869.4 917.6 948.4 1021.81079.5

1154.31184.8

399.0

420.9

+MS, 20.7min #516

0.0

0.5

1.0

1.5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z 199.0

298.9

344.3

+MS2(399.0), 20.8min #517

0

1

2

3

4

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z Pico 4 (tR=25,5 min)

299.1464.4

485.2

531.1

613.2

679.3 738.3 774.2799.0839.2

870.1954.0

985.91054.4 1089.2 1170.3

613.2

937.5

+MS, 25.5min #647

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

7x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

139

356.8

595.2

+MS2(613.4), 25.7min #652

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z Pico 5 (tR=26,7 min)

122.2 170.8261.0

305.0 353.0 397.1424.9

470.2 553.2579.4

615.2

677.6

748.4

807.2832.7

865.7893.4

938.0969.1

1014.3

1081.7 1121.51177.3

615.2

746.5

+MS, 26.7min #679

0

1

2

3

4

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

271.0 315.9339.0

380.1414.6

429.1

464.3482.1

503.4

519.1531.0

558.8 576.9

603.1

613.8

+MS2(615.4), 26.9min #686

0

1

2

3

4x10Intens.

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z

140


(EDiOPer)

Pico 1 (tR=6,8 min)

357.9

715.8715.8

357.9

+MS, 6.8min #169

0

1

2

3

4

5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

239.0

297.9

310.9

341.7

358.0

+MS2(716.0), 6.8min #170

0

1

2

3

4

5

6

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z

165.0

192.0

297.9

311.0

341.0

+MS2(357.7), 6.6min #165

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.55x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z Pico 2 (tR=7,4 min)

141

125.8 204.8 297.9 341.2

372.0

416.7 445.3 594.9

669.5

714.8

744.1744.1

372.0

+MS, 7.4min #187

0.0

0.5

1.0

1.5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

354.0

372.0+MS2(744.1), 7.3min #183

0

1

2

3

4

5

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

177.0

208.0323.9

353.9

+MS2(372.2), 7.5min #189

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z Pico 3 (tR=7,9 min)

219.0 249.1

352.0

372.0

570.9

744.1

372.0

352.0

+MS, 7.9min #199

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

142

165.1192.0

208.0 323.9

338.1

353.9+MS2(372.1), 7.9min #200

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z

323.9 353.9

371.9

+MS2(744.1), 7.5min #188

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z

308.0

320.7

336.9

+MS2(352.2), 7.9min #201

0.0

0.5

1.0

1.5

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z Pico 4 (tR=8,3 min)

157.1 220.1

248.9

280.0

351.9372.0 557.8

594.9

630.7 709.7 770.4 855.2

280.0

594.9

+MS, 8.3min #211

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

143

248.9

+MS2(280.1), 8.4min #212

0

1

2

3

5x10Intens.

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z

190.1

218.9249.0

279.9

558.0

+MS2(595.3), 8.4min #213

0

1

2

3

4

4x10Intens.

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z Pico 5 (tR=9,0 min)

248.9

295.9

590.9590.9

295.9

+MS, 9.0min #229

0

2

4

6

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

235.9

248.9

+MS2(296.0), 9.1min #231

0.0

0.5

1.0

1.5

6x10Intens.

100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

144

190.9

218.7

248.9

295.9

+MS2(591.1), 9.3min #236

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.05x10

Intens.

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z Pico 6 (tR=9,6 min)

248.9

295.9

590.9590.9

295.9

+MS, 9.6min #246

0

2

4

6

8

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z Pico 7 (tR=13,2 min)

275.9

352.7 468.2 520.9

572.8

654.4 972.9

572.8

275.9

+MS, 13.2min #342

0

1

2

3

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z 297.9

500.0

+MS2(573.0), 13.2min #343

0

1

2

3

4

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z Pico 8 (tR=16,4-17,2min)

145

109.2157.1

218.9

275.0 306.7 351.1 381.4

438.9

504.0 558.9 601.1 658.3705.8

725.6

748.0

799.5 826.3853.3 885.5 917.3943.2 1006.5 1049.5 1106.1 1163.1

438.9

724.1

+MS, 16.4-17.2min #(431-455)

0

1

2

3

4

5

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

274.9403.5

438.8

+MS2(724.7), 17.0min #450

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z 147.0

169.0197.0 213.0 238.9

256.8 274.8

368.9

+MS2(439.0), 16.4min #432

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

5x10Intens.

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z Pico 9 (tR=20,7min)

145.0 373.1

399.0

421.1

473.0 538.7 632.3 658.7 701.3 755.0

818.6

866.8 934.4 990.7 1057.5 1105.7 1153.9

399.0

818.6

+MS, 20.7min #558

0

1

2

3

4

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

146

421.0+MS2(819.4), 20.8min #560

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.506x10

Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

143.0

199.0

298.9

+MS2(399.1), 21.0min #565

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Pico 10 (tR=24,0min)

153.3

258.9375.6

409.0462.5 518.9 565.2

598.2

637.1

667.4

691.8727.2

802.8

819.2

871.7 902.4 953.5 1027.8 1130.91161.1

667.4

785.7

+MS, 24.0min #651

0

1

2

3

4

5

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

561.1

593.1

607.0

+MS2(667.7), 24.0min #652

0

1

2

3

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z Pico 11 (tR=24,7min)

147

278.1 367.0 420.8 470.0 516.8550.1

593.0

653.3

704.7770.8

869.5

888.7918.5

986.0 1091.6 1174.3

653.3

869.5

+MS, 24.7min #673

0

2

4

6

6x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

504.1

549.0566.0

609.0

635.0+MS2(653.3), 24.8min #674

0

1

2

3

4

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Pico 12 (tR=25,1min)

398.9 606.9

667.4

689.5733.2758.3 836.9 881.6 917.6

956.2 1148.4

689.5

+MS, 25.1min #683

0.0

0.5

1.0

1.5

7x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z 580.0

606.9

635.0

+MS2(667.5), 25.3min #688

0

1

2

3

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Pico 12 (tR=25,8min)

148

399.0 518.8

621.1

668.5 710.7

770.6

853.6 918.6 971.8 1122.1

621.1

770.6

+MS, 25.8min #702

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.07x10

Intens.

200 400 600 800 1000 m/z 561.0

593.1

+MS2(621.3), 25.8min #703

0

2

4

6

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

149


(EDiOPer)


143.9

172.9277.0

299.0

361.0407.8

465.0 503.8533.8562.1 604.5 644.4 693.9 763.9 822.6 942.3

331.0

202.9

+MS, 12.6min #1831

0

1

2

3

4

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z

215.2

247.1

299.1

331.2

+MS2(331.0), 12.6min #1832

0

1

2

3

4

5

6

6x10Intens.

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z

150

144.4

162.3

169.3

201.2

+MS2(202.9), 12.6min #1833

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

6x10Intens.

80 100 120 140 160 180 200 220 m/z Pico 2 (tR=19,7 min)

143.9

172.9

216.9

284.2 349.1383.1 519.1 557.4

658.3 721.5 760.4 799.3 837.5 963.2

457.2

452.2

+MS, 19.7min #2884

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

7x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

313.1

369.2

457.2 +MS2(457.2), 19.7min #2885

0

2

4

6

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z

151

155.4

217.2 273.1

317.2

435.3

+MS2(452.2), 19.7min #2886

0

1

2

3

4

5

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z Pico 3 (tR=20,7 min)

202.8 236.5 288.9 325.0 361.6 440.2

483.1

515.1536.3617.8

668.9 703.0 753.6

399.2

421.1

+MS, 20.7min #3037

0

2

4

6

8

7x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

199.2

225.1

299.2

+MS2(399.2), 20.7min #3038

0

2

4

6

8

7x10Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z

152

147.3

203.1221.1

321.1

+MS2(421.1), 20.8min #3039

0

1

2

3

7x10Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z Pico 4 (tR=23,2 min)

171.9216.9

271.0305.1

399.1

548.4571.1

621.3

666.4753.5

821.5

855.6 905.6929.6 1037.81078.8

1121.6

485.3

421.2

+MS, 23.2min #3412

0

1

2

3

7x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

149.5 185.1

224.3

246.6283.4

322.4

335.3

353.1375.1

413.3

453.4

465.3

483.4

+MS2(485.3), 23.2min #3413

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z

153

147.3

203.2 221.1

321.1

403.3

+MS2(421.2), 23.2min #3414

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

7x10Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z Pico 5 (tR=24,4-24,7 min)

216.9 421.1 701.4 769.6

637.2

659.2

+MS, 24.4-24.7min #(3604-3645)

0.0

0.5

1.0

1.5

8x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

559.3

605.3

619.3+MS2(637.2), 24.5min #3617

0

1

2

3

8x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Pico 6 (tR=25,7-26,5 min)

154

421.1753.5

621.2

769.5

+MS, 25.7-26.5min #(3801-3923)

0.0

0.5

1.0

1.5

8x10Intens.

200 400 600 800 1000 m/z

473.3 547.4

561.3

621.3

+MS2(621.2), 25.9min #3830

0

1

2

3

4

5

8x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

155

Anexo 4: Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

156

Anexo 5: Ampliação 1 do espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

157

Anexo 6: Ampliação 2 do espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração

5/5 de EDiOPom

158

Anexo 7: Espectro de RMN de 13C (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

159

Anexo 8: Ampliação 1 do espectro de RMN de 13C (300 MHz, CDCl3) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

160


161


Estudo bioguiado através da atividade anticolinesterásica e da ...

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