Estudo da associação de complexos nitrosilos de rutênio liberadores de NO com o ... · 2009. 9....

1

Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto Departamento de Quiacutemica Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Quiacutemica

lsquolsquoEstudo da associaccedilatildeo de complexos nitrosilos de rutecircnio

liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco

ftalocianina ZnPC em sistemas de liberaccedilatildeo utilizados na

Terapia Fotodinacircmicarsquorsquo

Daniela Silva Maranho

Dissertaccedilatildeo apresentada agrave Faculdade de

Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto da

USP como parte das exigecircncias para a obtenccedilatildeo

do tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias Aacuterea Quiacutemica

RIBEIRAtildeO PRETO -SP

2008

2







Orientador Prof Dr Antonio Claudio Tedesco






2008

3

FICHA CATALOGRAacuteFICA

Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo

de Ribeiratildeo Preto USP

Maranho Daniela Silva

Estudo da associaccedilatildeo de complexos nitrosilos de rutecircnio liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina ZnPC em sistemas de liberaccedilatildeo utilizados na Terapia Fotodinacircmica 96 p il 30cm

Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo PretoUSP ndash Aacuterea de concentraccedilatildeo Quiacutemica Orientador Tedesco Antocircnio Claacuteudio

1 Terapia Fotodinacircmica 2 oacutexido niacutetrico 3 complexo nitrosilo de rutecircnio 4 neoplasias

4

Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de Ribeiratildeo Preto

Folha de Aprovaccedilatildeo

Membros da Comissatildeo Julgadora da Dissertaccedilatildeo de Mestrado de Daniela Silva Maranho

apresentada ao Departamento de Quiacutemica da Faculdade de Filosofia Ciecircncias e Letras de

Ribeiratildeo Preto ______

Comissatildeo Julgadora

____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo) ____________________________________________ (NomeInstituiccedilatildeo)

5

DEDICATOacuteRIA

Dedico este trabalho agrave minha famiacutelia

Primeiramente agrave Deisy Silva Maranho minha matildee grande mulher que com seu amor e alegria

sempre me motivou Seu apoio incondicional e imensuraacutevel me deu a forccedila necessaacuteria para

encarar todos os desafios para assim conseguir alcanccedilar tudo que desejei

Ao meu pai querido Alcides Maranho com seu carinho e amor sempre me guiou pelo

caminho do bem Homem sereno exemplo de honestidade seu caraacuteter singular foi a base da

minha formaccedilatildeo moral

Aos meus irmatildeos queridos

Dinho uma pessoa muito especial que com toda sua sensibilidade me mostrou que o que

importa nessa vida eacute ser feliz Um cuidado uacutenico comigo meu iacutedolo

Ana Deisy com sua ternura sempre foi a certeza de encontrar em casa o carinho mais sincero

Du atraveacutes de sua escolha me mostrou que natildeo haacute barreiras para alcanccedilarmos nossos sonhos

tudo eacute possiacutevel

Agrave minha querida avoacute Zica com seus 98 anos ainda reza por mim e confia nas minhas

conquistas

Obrigada pela confianccedila e por tanto amor

6

AGRADECIMENTOS

A Deus

por tudo que tenho por ser meu descanso e a certeza da minha felicidade Com a ajuda dos

anjos e santos consigo me manter firme e confiante

ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo(Fl 413)

7

AGRADECIMENTOS

Principalmente ao Prof Dr Antonio Claudio Tedesco por ter confiado no meu

crescimento na pesquisa Obrigada pela paciecircncia pelo apoio carinho pelos momentos de

descontraccedilatildeo mas principalmente pelos grandes ensinamentos

Ao professor Prof Dr Roberto Santana da Silva pelo faacutermaco cedido pelas

sugestotildees pelo apoio e principalmente pela forma carinhosa que sempre me recebeu

Agrave professora Profa Dra Lusiane Maria Bendhack pelo apoio e pela grande

disponibilidade em todos os momentos em que precisei

Agrave professora Dra Renata Galvatildeo de Lima pela enorme ajuda amizade e pelas horas

de alegria

A Joseacute Honorato Ferreira Neto uma pessoa essencial para minha felicidade Obrigada

por confiar em mim e por resgatar em mim a vontade de conquistar meu espaccedilo Ao seu lado

sou muito feliz porque o amo e por causa do seu amor sou completa Obrigada por tudo Que

o nosso amor sempre contribua para nosso crescimento profissional e para nossa vida juntos

Amo vocecirc

Graccedilas a este trabalho conquistei amigas valiosas e eternas

Agrave minha amiga tatildeo querida Paty a melhor pessoa desse mundo Natildeo tenho palavras

para dizer tudo que jaacute fez por mim serei eternamente grata por tecirc-la como companheira A

certeza de ter seu ombro amigo me ajudou a enfrentar os mais diversos problemas Valeu

doida

Agrave minha amiga Alessandra a alegria em pessoa obrigada por tantos conselhos cafeacutes

terapias e festas Eacute um exemplo de vida para mim

A todo o grupo de Fotoquiacutemica e Fotobiologia por sempre me ajudarem Agrave Dani

Manfrim pelos ensinamentos e pela amizade A Fernando Lucas Primo pela enorme

disponibilidade em me socorrer e nesta uacuteltima etapa do trabalho tive a oportunidade de

reconhececirc-lo como um grande amigo Acircngelo Gilson e Paula obrigada pela amizade e pela

8

oacutetima convivecircncia Marcilene Paloma Gisele Andreza Carol Dani Zancanela Nathaacutelia

todos os alunos da iniciaccedilatildeo obrigada pelo apoio e amizade

Agrave minha querida Oliacutempica o socorro imediato Natildeo apenas como teacutecnica do

laboratoacuterio mas uma amiga uacutenica Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado

Agraves minhas amigonas Nati Tati Carol Carolzinha Ciacutentia Flavitcha e Fernandinha que

sempre estatildeo a postos para o que der e vier adoro vocecircs Ao povo do ldquosaia justardquo aos que

faltaram citar Val os Jotas obrigada por este instante particular do nosso dia

Agraves minhas grandes amigas Ana Luacutecia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a

infacircncia

Agrave Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor A saudade eacute infinita

Agraves minhas cunhadas e sobrinhos tios e tias principalmente meus padrinhos Neacuteia e

Deacutelio e tambeacutem minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas

Agrave Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias

Ao meu primeiro professor de Quiacutemica Joseacute Dirceu pela consideraccedilatildeo que sempre

demonstrou por mim

Agraves minhas companheiras de casa Jordana e Caacutessia pela ajuda diaacuteria e amizade

Ao pessoal da Secretaria do Departamento da Secretaria de Poacutes-Graduaccedilatildeo em

especial a Lacircmia pela enorme paciecircncia e cooperaccedilatildeo

Agrave Capes CNPq pelos auxiacutelios financeiros sem os quais o trabalho natildeo seria

realizado

9

SUMAacuteRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi

I INTRODUCcedilAtildeO 1

I1 Cacircncer 1

I2 Terapia Fotodinacircmica 2

I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD 5

I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica 9

I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio12

I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos15

II OBJETIVOS18

III PARTE EXPERIMENTAL 19

III1 Materiais 19

III2 Preparaccedilotildees 20

III3 Aparelhagem 22

III4 Meacutetodos 25

III41 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina e do

complexo Ru-tpy em meio homogecircneo 25

III42 Preparaccedilatildeo da ZnPC do complexo de rutecircnio e da associaccedilatildeo dos dois

faacutermacos em meio lipossomal26

III43 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de

partiacuteculas 27

III44 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina do

complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal 28

III45 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-

tpy no sistema lipossomal 29

Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho

10

III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da Zinco ftalocianina

e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 30

III47 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e

para o sistema misto 31

III48 Estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser

31

III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (Φ∆)

32

III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em

675 nm 33

III411 Estudos in vitro 37

III4111 Crescimento e manutenccedilatildeo da cultura de ceacutelulas da linhagem neoplaacutesica de

melanoma de rato (B-16 F10) 37

III4112 Controle da integridade da membrana celular 38

III4113 Determinaccedilatildeo da Toxicidade da ZnPC do complexo Ru-tpy e do sistema

lipossomal misto na ausecircncia de luz 40

II4114 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema

lipossomal misto 41

IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO42

IV1 Estudos Fotofiacutesicos 43

IV 11 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da Zinco ftalocianina (ZnPC) e

do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal 43

IV12 Caracterizaccedilatildeo do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partiacuteculas

48

IV 13 Estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC associada ao complexo

Ru-tpy em meio lipossomal 50


11

IV14 Estudos de supressatildeo de fluorescecircncia da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-

tpy em meio lipossomal 52

IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) da ZnPC e de sua

associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 56

IV16 Medidas de fluorescecircncia resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e

da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal 60

IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser 63

IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete

(Φ∆) 68

IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em

675 nm 70




IV22 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal

misto 77

V CONCLUSOtildeES 80

VI REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 82


12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD) ------------------ 5

Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo -- 7

Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas-------- -------------- 11

Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-

tpy) --

15

Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar

mostrando interaccedilotildees com diferentes substacircncias -----------------

16

Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas --------------- 27

Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico

gasoso -------------------------------------------------------------------

34

Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da

fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------

36

Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol ------- 44

Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em

tampatildeo fosfato pH= 74 ----------------------------------------------

45

Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610

nm) da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol -----------------------------

46

Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do

complexo Ru-tpy (minus) e dos dois compostos associados (minus) -----

47

Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada

ao complexo Ru-tpy (minus) em meio lipossomal ---------------------

51

Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC

(50 micromolL-1) conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio

lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo crescente (0 a 500

micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52

Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da

ZnPC conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy

(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

53

Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em

10 molL-1 de tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o

comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o cronoamperograma de

liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em -02

V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy -------------------

55


13

Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o

fotossensibilizador ZnPC (50 micromolL-1) associado ao complexo

Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da

figura representa o resiacuteduo meacutedio -----------------------------------

61

Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo

de fotoacutelise por pulso de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada

ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio lipossomal apoacutes

excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo

maacutexima do triplete centrada no comprimento de onda de 480

nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a

aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento

dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute

mostrada no inserto ---------------------------------------------------

66

Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em

lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de

energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----

71

Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-

tpy (500 micromolL-1) incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo

do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num

intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------

72

Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o

complexo Ru-tpy sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm ------------

73

Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de

incubaccedilatildeo com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1=

lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em lipossoma 3 =

ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e 4 = ZnPC Ru-tpy (50

micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal --------------------

76

Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas

B16-F10 1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-

tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal 3 =

ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal -

----------------------------------------------------------------------------

78


14

LISTA DE TABELAS

Tabela I Tamanho das partiacuteculas ------------------------------- 50

Tabela II Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf) ---- 59

Tabela III Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude

relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio

homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo

Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62

Tabela IV Tempos de vida dos estados excitados tripletes

(τt) Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador

ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-

tpy ----------------------------------------------------------------

67

Tabela V Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do

oxigecircnio singlete ------------------------------------------------

69

Tabela VI Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas

com as formulaccedilotildees lipossomais estudadas -----------------

77


15

LISTA DE SIacuteMBOLOS E ABREVIATURAS

ZnPC Zinco ftalocianina

Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutecircnio

EROs Espeacutecies reativas de oxigecircnio

ERONs Espeacutecies reativas de nitrogecircnio

NO Oacutexido niacutetrico

TFD Terapia fotodinacircmica

HpD Hematoporfirina

FS Fotossensibilizador

1O2 Oxigecircnio singlete

bullOH Radical hidroxila

bullO2minus Acircnion radical superoacutexido

H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio

S0 Estado fundamental

Sn Estado excitado singlete superior

S1 Estado excitado singlete

T1 Estado excitado triplete

0F Fotossensibilizador no estado fundamental

1F Fotossensibilizador no estado singlete

3F Fotossensibilizador no estado triplete

S Substrato bioloacutegico

3O2 Oxigecircnio molecular

S-OOH Peroacutexidos

NO+ Iacuteon nitrosocircnio

NO- Acircnion nitroacutexido


16

O2 Gaacutes oxigecircnio

CO Monoacutexido de carbono

[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ Complexo nitrosilo de rutecircnio

DPPC DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina

SRE Sistema do retiacuteculo endotelial

LLC Lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo

PEG Polietileno glicol

DMF Dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfoacutexido

ε Coeficiente de absortividade molar

If0 Intensidade de fluorescecircncia na ausecircncia do supressor

If Intensidade de fluorescecircncia na presenccedila do supressor

kq Constante de supressatildeo

τ0 Tempo de vida do fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor

[Q] Concentraccedilatildeo do supressor

Ksv Constante de Stern-Volmer

Φf Rendimento quacircntico de fluorescecircncia

Φ∆ Rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete

τ∆ Tempo de vida de oxigecircnio singlete

ΦNO Rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO

MTT 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium

τs Tempo de vida de fluorescecircncia

A Amplitude relativa

T1 Estado triplete excitado

17

τt Tempo de vida dos estados tripletes

1ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete

0ZnPC Zinco ftalocianina no estado fundamental

3ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete

ISC Cruzamento intersistema


18

RESUMO

Neste trabalho propusemos a utilizaccedilatildeo do fotossensibilizador Zinco ftalocianina

(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutecircnio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo

tempo de circulaccedilatildeo (LLC) com o objetivo de analisar o efeito sineacutergico das espeacutecies reativas

de oxigecircnio (EROs) e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas respectivamente

pelos mesmos atuando sobre uma linhagem celular neoplaacutesica

Foram estudadas as propriedades fotofiacutesicas e fotoquiacutemicas do sistema misto

ZnPCRu-tpy empregando-se teacutecnicas de espectroscopia no estado estacionaacuterio e resolvido

no tempo Com isto foi possiacutevel determinar importantes paracircmetros que elucidaram seu perfil

fotodinacircmico confirmando sua viabilidade para aplicaccedilatildeo em estudos in vitro e in vivo

Estes estudos tambeacutem indicaram uma possiacutevel interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo

Ru-tpy atraveacutes do mecanismo de transferecircncia de eleacutetron do fotossensibilizador para o

complexo de rutecircnio desta forma liberando o oacutexido niacutetrico (NO)

Realizamos os estudos em meio bioloacutegico utilizando a linhagem neoplaacutesica B16-F10

avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausecircncia e na presenccedila de luz

Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPCRu-tpy em meio

lipossomal apresenta propriedades fotofiacutesicas e fotobioloacutegicas uacuteteis gerando as espeacutecies

reativas (EROs e ERONs) atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinacircmica (TFD)

Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash DS Maranho Resumo

19

ABSTRACT

We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)

associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes

(ldquostealth liposomerdquo) with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of

oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated acting on the

neoplastic cell line

The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPCRu-tpy were

studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time

With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its

photodynamic profile confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo

These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex

Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium

complex which leads to release nitric oxide (NO)

We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10

evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light

Our results demonstrated that the system ZnPCRu-tpy in the ldquostealth liposomerdquo

presents useful photophysical and photobiological properties generating the species reactives

(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT)

Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Abstract

20

I INTRODUCcedilAtildeO

I1 Cacircncer

ldquoCacircncerrdquo eacute o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia Eacute uma

doenccedila caracterizada pelo crescimento desordenado de ceacutelulas que sofreram mutaccedilotildees

geneacuteticas invadindo e destruindo os tecidos adjacentes podendo espalhar-se (metaacutestase) para

outras regiotildees do corpo Quase todos os tumores satildeo causados por anomalias no material

geneacutetico das ceacutelulas normais Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes

como a exposiccedilatildeo excessiva agrave radiaccedilatildeo ultravioleta (cacircncer de pele) a infecccedilatildeo por certos

viacuterus (cacircncer no colo do uacutetero alguns linfomas) tabagismo (cacircncer no pulmatildeo na laringe) o

alcoolismo (cacircncer no estocircmago no pacircncreas) entre outros

A Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede apontou em 2005 a morte de 35 milhotildees de pessoas

por doenccedilas crocircnicas no mundo sendo que aproximadamente 76 milhotildees ou 217

correspondam agraves neoplasias No Brasil as estimativas segundo o Instituto Nacional do Cacircncer

para o ano de 2008 e vaacutelidas tambeacutem para o ano de 2009 apontam que ocorreratildeo 467 mil

casos novos de cacircnceres O cacircncer de pele do tipo natildeo-melanoma seraacute o mais incidente na

populaccedilatildeo brasileira seguido pelos tumores na proacutestata e no pulmatildeo para o sexo masculino e

o cacircncer de mama e de colo de uacutetero para o sexo feminino

Diante deste cenaacuterio fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de

novas terapias para o tratamento do cacircncer bem como na pesquisa de sistemas que permitam

a detecccedilatildeo precoce e assistecircncia aos pacientes

Os tratamentos claacutessicos adotados contra o cacircncer satildeo realizados atraveacutes da cirurgia

radioterapia quimioterapia ou transplante de medula oacutessea sendo em muitos casos

necessaacuterio combinar essas modalidades No entanto esses tratamentos convencionais

apresentam inuacutemeras desvantagens como por exemplo a desfiguraccedilatildeo do paciente

resultando em prejuiacutezos agrave sua auto-estima inuacutemeros efeitos colaterais (quimioterapia e

Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Introduccedilatildeo

21

radioterapia) aleacutem de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman Allen e Van

Lier 1999)

Em virtude disso tratamentos alternativos tecircm sido desenvolvidos dentre os quais se

destaca a Terapia Fotodinacircmica (TFD) que por sua vez eacute uma teacutecnica pouco invasiva e que

pode ser aplicada repetidamente no mesmo local aleacutem de apresentar miacutenimos efeitos

colaterais (Pandey 1992 Kuumlbler 2005)Assim o FDA (US Food and Drug Administration)

a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de vaacuterias doenccedilas em especial o

cacircncer

I2 Terapia Fotodinacircmica

A utilizaccedilatildeo da luz como agente modulador da resposta bioloacutegica dos organismos

vivos eacute conhecida haacute muito tempo Seu uso como agente terapecircutico remonta a 3000 AC

quando os egiacutepcios usaram-na para tratar vitiligo atraveacutes de uma combinaccedilatildeo de plantas

ingeridas pelo paciente e sua exposiccedilatildeo agrave luz solar O sucesso do tratamento baseava-se no

desenvolvimento no organismo de uma reaccedilatildeo fotoquiacutemica mediada pelos psoralenos

presentes nas plantas (Spikes e Bommer 1993)

No entanto foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a

combinaccedilatildeo de baixas concentraccedilotildees de certos compostos coloridos (usualmente chamados de

corantes ex eosina e acridina) na presenccedila de luz poderia rapidamente induzir a destruiccedilatildeo

de protozoaacuterios e parameacutecios

Apoacutes Raab as primeiras experiecircncias visando a aplicaccedilatildeo dos efeitos fotodinacircmicos

no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek

que empregaram uma soluccedilatildeo aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o

cacircncer de pele observando-se uma reduccedilatildeo na massa tumoral apoacutes o tratamento


22

No periacuteodo de 1960 a 1967 Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes 1960)

investigaram o acuacutemulo preferencial de um derivado hematoporfiriacutenico (Photofrin I HpD)

em tumores utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidecircncia da luz

proporcionou a regressatildeo da doenccedila Subsequumlentemente Lipson obteve sucesso no tratamento

de uma mulher que possuiacutea cacircncer de mama usando HpD e irradiaccedilatildeo seletiva do tumor com

luz visiacutevel marcando assim o iniacutecio da TFD como terapia cliacutenica para cacircncer (Simpliacutecio

Maionchi e Hioka 2002)

Nos anos 70 Dougherty et al (Dougherty 1978 Dougherty 1984 Dougherty 1985)

demonstraram que o HpD em combinaccedilatildeo com luz vermelha poderia erradicar

completamente o crescimento de tumores de mama em ratos Diante deste resultado a

purificaccedilatildeo do HpD realizado por Dougherty levou agrave produccedilatildeo do Photofrin II que foi

aplicado em vaacuterios testes de cacircnceres de bexiga e pele sendo a primeira droga aprovada pelo

FDA para uso em humano conduzindo agraves pesquisas modernas de TFD

No Brasil a teacutecnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa

em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP no estudo de novos sistemas de liberaccedilatildeo

de faacutermacos e fotossensibilizadores aplicados agrave TFD (Macaroff et al 2005 Primo Bentley e

Tedesco 2008 Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Simioni et al 2008) O procedimento da

TFD vem sendo aplicado em estudos cliacutenicos desde 1999 pela equipe do Dr Guilherme

Cestari Filho com a implementaccedilatildeo desta teacutecnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jauacute-

SP onde pacientes com cacircncer nas cordas vocais estocircmago garganta e pulmatildeo vecircm sendo

tratados Aleacutem das aplicaccedilotildees cliacutenicas tecircm sido realizadas pesquisas cientiacuteficas para o

desenvolvimento de novas fontes de luz laser

Em 2000 no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo

Preto-USP foram iniciados tratamentos de doenccedilas de pele utilizando TFD com a

participaccedilatildeo de um grupo composto por farmacecircuticos quiacutemicos meacutedicos e fiacutesicos (Souza et

al 2005 Tedesco Rotta e Lunardi 2003 Turchiello et al 2003)


23

A Terapia Fotodinacircmica (TFD) consiste na administraccedilatildeo sistecircmica ou toacutepica de

certos agentes fotossensibilizadores que apoacutes se localizarem preferencialmente nos tecidos

neoplaacutesicos satildeo ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presenccedila de

oxigecircnio molecular levam a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) e radicais livres (ex

espeacutecies reativas de oxigecircnio bullO2- e bullOH denominadas EROs) que satildeo toacutexicos para as ceacutelulas

(Figura 1)

Figura 1 - Princiacutepio baacutesico da terapia fotodinacircmica (TFD)

O faacutermaco fotossensibilizador ou a luz isolados natildeo apresentam toxicidade para o

organismo Entretanto a combinaccedilatildeo dos dois agentes em presenccedila de oxigecircnio induz a morte

das ceacutelulas tumorais (Mironov et al 2003)


24

I3 Mecanismos Fotoquiacutemicos e Fotofiacutesicos da TFD

A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado capaz de ser

absorvida pelo faacutermaco fotossensibilizador (FS) A faixa espectral em que esta absorccedilatildeo

ocorre deve estar situada preferencialmente na regiatildeo entre 600 e 850 nm conhecida como

ldquojanela terapecircuticardquo onde a transparecircncia do tecido bioloacutegico eacute elevada e a absorccedilatildeo desta

irradiaccedilatildeo por moleacuteculas endoacutegenas do sistema bioloacutegico eacute praticamente nula A penetraccedilatildeo da

luz nos tecidos eacute mais efetiva na regiatildeo de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na regiatildeo de 700-800

nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald 2001 Bonett e Martinez 2001)

Desta maneira a irradiaccedilatildeo do tumor leva a absorccedilatildeo da luz pelo faacutermaco

fotossensibilizador previamente incorporado levando as moleacuteculas a um estado eletrocircnico de

maior energia e na presenccedila de oxigecircnio molecular (presente no meio) desencadeia vaacuterios

processos fotofiacutesicos levando a produccedilatildeo de espeacutecies reativas excitadas que acabam por

induzir a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (1O2 bullO2

minus bullOH H2O2) definidas como

EROs Estas espeacutecies atacam centros especiacuteficos dentro dos sistemas celulares

desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular

(De Rosa e Crutchley 2002 Bonnett e Berenbaum 1989)

No diagrama de Jablonski (Figura 2) estatildeo representados os processos fotofiacutesicos e

fotoquiacutemicos que um fotossensibilizador pode sofrer apoacutes a absorccedilatildeo de radiaccedilatildeo visiacutevel

O faacutermaco fotossensibilizador no estado fundamental (S0) apoacutes absorver um foacuteton de

luz eacute excitado a um estado eletrocircnico de maior energia (Sn) decaindo rapidamente por

processos natildeo radiativos ao mais baixo estado singlete (S1) A seguir daacute origem ao estado

excitado triplete de menor energia (T1) por um processo de interconversatildeo o mesmo via

cruzamento intersistema (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a De Rosa e

Crutchley 2002) Este decaimento energeacutetico eacute fundamental para a terapia fotodinacircmica A

substacircncia fotossensiacutevel localizada no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida

maior do que no estado singlete excitado (Sharman Allen e van Lier 2000) Dessa forma o


25

fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moleacuteculas de

oxigecircnio ou biomoleacuteculas localizadas proacuteximas a regiatildeo irradiada gerando espeacutecies

citotoacutexicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum 2004 Oleinick Morris e Belichenko

2002 Gorman et al 2004)

Figura 2 Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilizaccedilatildeo

Os processos de fotossensibilizaccedilatildeo podem ser explicados atraveacutes de dois

mecanismos distintos (Sharman Allen e Van Lier 1999 Foote 1991a)

- Mecanismo Tipo I envolve a abstraccedilatildeo de um aacutetomo de hidrogecircnio ou reaccedilotildees de

transferecircncia de eleacutetrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes

macromoleacuteculas bioloacutegicas levando agrave formaccedilatildeo de radicais livres eou iacuteons radicais Poucos

materiais bioloacutegicos apresentam facilidade de fotorreduccedilatildeo (por exemplo quinonas e

citoquinas) em processos nos quais temos a oxidaccedilatildeo do fotossensibilizador a caacutetion radical-π

e o substrato eacute reduzido A espeacutecie reduzida pode transferir um eleacutetron ao oxigecircnio molecular

presente no meio formando espeacutecies reativas de oxigecircnio como peroacutexidos acircnion superoacutexido

etc Este mecanismo de fotossensibilizaccedilatildeo eacute esquematizado abaixo

- Reaccedilatildeo redox com biomoleacuteculas produccedilatildeo de superoacutexido etc

0F rarr 1F rarr 3F


26

3F + S rarr F + bull + Sminus bull (transferecircncia de eleacutetrons)

Sminus bull + 3O2 rarr S + O2minus bull rarr HO bull + HO bull

Onde 0F 1F 3F eacute o FS no estado fundamental singlete e triplete respectivamente e S eacute o

substrato

- Mecanismo Tipo II ocorre a transferecircncia de energia para o oxigecircnio molecular com

formaccedilatildeo do oxigecircnio singlete (1O2) O oxigecircnio singlete eacute uma espeacutecie altamente reativa que

oxida vaacuterios substratos bioloacutegicos Acredita-se que o oxigecircnio singlete seja o principal

mediador dos danos fotodinacircmicos nos sistemas bioloacutegicos pois reage rapidamente e

indiscriminadamente com os mais variados materiais bioloacutegicos eletrofiacutelicos como lipiacutedios

insaturados proteiacutenas aacutecidos nucleacuteicos etc sendo apontado como o principal responsaacutevel

pela inativaccedilatildeo da ceacutelula tumoral Este mecanismo eacute esquematizado abaixo

- Mediado por oxigecircnio singlete Por exemplo a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica

0F rarr 1F rarr 3F

3F + 3O2 rarr 0F + 1O2 (transferecircncia de energia)

1O2 + S rarr S-OOH (peroacutexidos etc)


substrato

Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilizaccedilatildeo do

oxigecircnio singlete como espeacutecie reativa (Yamamoto Nagano e Okura 2003 Kochevar

Lambert e Lynch 1996 DePaoli DePaoli e Borissevitch 2002) tem sido grande a procura

por outras espeacutecies uacuteteis como radicais livres derivados dos corantes utilizados outras

espeacutecies radicalares independentes de oxigecircnio (Niziolek Korytowski e Girotti 2003) como

por exemplo as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira et

al 2007 de Lima R G 2006)


27

I4 Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinacircmica

Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substacircncias capazes de

absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moleacuteculas de oxigecircnio molecular

gerando EROs bem como causarem danos bioloacutegicos Estes compostos devem possuir certas

caracteriacutesticas bem como possuir propriedades fotofiacutesicas favoraacuteveis como baixa toxicidade

no escuro fotossensibilidade natildeo prolongada alta afinidade e penetraccedilatildeo preferencial nos

tecidos tumorais em relaccedilatildeo aos tecidos normais (o que em geral acontece com o aumento de

hidrofobicidade do FS) Aleacutem destas caracteriacutesticas eacute interessante que o FS seja anfifiacutelico ou

seja soluacutevel em meio fisioloacutegico mas que contenha tambeacutem uma matriz hidrofoacutebica

permitindo a sua permeaccedilatildeo na membrana celular

O grande avanccedilo da TFD teve iniacutecio com a descoberta da primeira geraccedilatildeo de

fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD) O primeiro composto aprovado

pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin

um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan

Photogem Photocarcinorin e Haematodrex) (Nyman e Hynninen 2004 Brown Brown e

Walker 2004) Estes FS de primeira geraccedilatildeo satildeo eficientes entretanto natildeo absorvem bem a

luz na regiatildeo do vermelho do espectro eletromagneacutetico (acima de 650 nm) dentro da

ldquojanela terapecircuticardquo e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporaccedilatildeo e

retenccedilatildeo pelos tecidos tumorais

Dentro da segunda geraccedilatildeo de moleacuteculas fotossensibilizadoras merecem destaque

alguns compostos potencialmente ativos como as clorinas e as ftalocianinas que tecircm sido

muito estudados nos uacuteltimos anos (Oliveira et al 2005 Nunes S M 1999) Comparados

com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versatildeo comercial Fotofrin esta segunda

geraccedilatildeo de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinacircmica As

ftalocianinas foram consideradas como oacutetimos agentes fotossensibilizadores para a TFD


28

devido a sua baixa toxicidade uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido

tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na regiatildeo do vermelho do espectro

(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata Tedesco e Marchetti 2004 Oliveira et

al 2005 Nunes Sguilla e Tedesco 2004)

A estrutura das ftalocianinas (Owens et al 1998) mimetizam as porfirinas em seu

macrociclo central que consiste de uma unidade ciacuteclica tetrapirroacutelica (Figura 3) Contudo nas

ftalocianinas as subunidades pirroacutelicas satildeo unidas por aacutetomos de nitrogecircnio enquanto nas

porfirinas as subunidades satildeo unidas atraveacutes de pontes de metileno Aleacutem disso nas

ftalocianinas a conjugaccedilatildeo do macrociclo eacute estendida por aneacuteis benzecircnicos sobre quatro

unidades pirroacutelicas resultando em uma forte banda de absorccedilatildeo na regiatildeo de 650 a 670 nm

Figura 3 Estrutura quiacutemica das metalo ftalocianinas

A complexaccedilatildeo das ftalocianinas com iacuteons metaacutelicos diamagneacuteticos tais como Zn2+

Al3+ e Ga3+ datildeo origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quacircntico do estado

excitado triplete (φT gt 04) e com tempos de vida longos (Darwent et al 1982)

Consequumlentemente pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquiacutemicas e


29

fotodinacircmicas Entre as metalo ftalocianinas o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades

fotofiacutesicas mais favoraacuteveis para a aplicaccedilatildeo na TFD (Oliveira D M 2006 Nunes S M

1999 Allen Sharman e Van Lier 2001)

Aleacutem disso a Zinco ftalocianina (ZnPC) eacute promissora para uso na TFD devido a sua

elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geraccedilatildeo eficiente de oxigecircnio singlete altamente

citotoacutexico ao alvo bioloacutegico (Rotta Lunardi e Tedesco 2003 Oliveira D M 2006 Lunardi

Rotta e Tedesco 2003)

O interesse pela combinaccedilatildeo de diferentes espeacutecies reativas de fotossensibilizadores

ou ateacute mesmo a combinaccedilatildeo de terapias tem sido crescente Este conceito de sinergismo na

TDF jaacute vem sendo trabalhado por exemplo na utilizaccedilatildeo de terapias conjuntas como a

Hipertermia e a TFD (Oliveira et al 2006) a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al 2008)

ou atraveacutes do uso combinado de faacutermacos fotossensibilizadores que atuam por diferentes

mecanismos com localizaccedilatildeo bioloacutegica diferentes como por exemplo as porfirinas e

ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco 2005)

Podemos tambeacutem combinar diferentes moleacuteculas de fotossensibilizadores em uma

mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores claacutessicos e ao mesmo tempo

induzir mudanccedilas na homeostase iocircnica celular usando por exemplo a ZnPC associada ao

quelante Ca2+ (Lunardi Rotta e Tedesco 2007) Aleacutem disso haacute porfirinas e ftalocianinas

associadas a moleacuteculas de eacuteteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na+

K+ induzindo mudanccedilas diretas no potencial de membrana que promovem a morte celular

(Pelegrino et al 2005)

Dentro deste contexto de sinergismo a proposta apresentada neste trabalho foi a de

associar o fotossensibilizador ZnPC ao complexo nitrosilo de rutecircnio

[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ doador de NO atraveacutes do uso de um sistema de liberaccedilatildeo de

faacutermaco adequado com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espeacutecies reativas de

oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) atuando sobre a linhagem de

ceacutelula neoplaacutesica (Barbugli P A 2007 de Lima R G 2006 Oliveira D M 2006)


30

I5 Compostos nitrosilos de rutecircnio

O oacutexido niacutetrico NO eacute a uacutenica moleacutecula endoacutegena conhecida que reuacutene as

propriedades de neurotransmissor de mediador constitutivo e indutiacutevel e de agente

citotoacutexico Possui accedilatildeo reguladora da pressatildeo sanguumliacutenea atua no sistema imunoloacutegico e nas

atividades do ceacuterebro fiacutegado pacircncreas uacutetero e pulmotildees (Cullota e Koshland Junior 1992

Feldman Griffith e Stuehr 1993 Ignarro 2000 Richter-Addo e Legzdins 1992 Wink et

al 1993)

A moleacutecula de NO eacute uma das moleacuteculas classificadas como mensageiro em vaacuterios

processos bioloacutegicos Nessa funccedilatildeo o NO natildeo depende de transportadores especiacuteficos nem

de canais de passagem intracelulares Ele se difunde pela ceacutelula com facilidade tanto em

meio hidrofiacutelico como em meio lipofiacutelico Sua accedilatildeo fisioloacutegica depende muito mais de suas

propriedades fiacutesico-quiacutemicas do que de sua conformaccedilatildeo espacial (Feldman Griffith e

Stuehr 1993)

Atribuem-se as accedilotildees bioquiacutemicas do oacutexido niacutetrico agrave diversidade de suas espeacutecies ou

seja a espeacutecie NO+ (iacuteon nitrosocircnio) que eacute formada pela retirada do eleacutetron desemparelhado

no orbital π e a espeacutecie NO- (acircnion nitroacutexido) que eacute formada pela adiccedilatildeo de um eleacutetron ao

orbital O acircnion nitroacutexido eacute isoeletrocircnico ao gaacutes oxigecircnio (O2) e pode existir no estado

singlete de maior energia ou no estado triplete de menor energia O iacuteon nitrosocircnio eacute

isoeletrocircnico ao monoacutexido de carbono (CO) e reage rapidamente com aacutegua e outros

nucleoacutefilos (Wink et al 1993)

Diante da variedade de condiccedilotildees no meio intracelular como tipo de ceacutelula alvo

concentraccedilatildeo de NO e a presenccedila de outras espeacutecies radicalar o NO atua em carcinogecircnese

progressatildeo tumoral e na terapia do cacircncer (Chiang et al 2005 Weller 2003) Sabe-se que a

apoptose ou morte celular programada eacute caracterizada por uma seacuterie de alteraccedilotildees celulares

morfoloacutegicas e bioquiacutemicas Um mau funcionamento deste processo contribui para a


31

patogecircnese de diversas doenccedilas (Miller e Marx 1998) O NO eacute um potente modulador da

homeostase operacional de ceacutelula prevenindo ou induzindo a apoptose Esta accedilatildeo eacute modulada

por interaccedilotildees diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular especiacuteficas Em

algumas ceacutelulas o NO pode promover a apoptose enquanto que em outras o NO pode inibir o

processo de morte celular programada (Chung et al 2001)

Devido agrave extrema instabilidade das moleacuteculas de NO em meio bioloacutegico e seu curto

tempo de meia vida (aproximadamente 5s) torna-se difiacutecil o estudo de seus efeitos

fisioloacutegicos Assim existe um grande interesse em compostos quiacutemicos que possam servir de

proacute-drogas para a liberaccedilatildeo controlada do NO nos sistemas bioloacutegicos (Works et al 2002

Ignarro 2000)

Eacute de interesse para os ensaios cliacutenicos o estudo envolvendo complexos metaacutelicos que

possam agir como doadores de NO em um organismo bioloacutegico haja vista a possibilidade de

se controlar a liberaccedilatildeo do oacutexido niacutetrico por reaccedilotildees fotoquiacutemicas eou redutimeacutetricas

Metalo-drogas cujo centro metaacutelico eacute o rutecircnio possuem boa aplicaccedilatildeo cliacutenica

principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal Isto se deve em parte agrave

semelhanccedila das propriedades fiacutesico-quiacutemicas deste metal com as do ferro O organismo

consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro atraveacutes do aumento da

produccedilatildeo de proteiacutenas captadoras de iacuteons ferro como a transferrina e a albumina Alguns

autores acreditam que o mecanismo de proteccedilatildeo contra a toxicidade do rutecircnio seria igual ao

do ferro (Allardyce e Dyson 2001)

O complexo metaacutelico doador de NO utilizado nesse projeto foi o

[Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ designado ao longo do trabalho por Ru-tpy Sua estrutura estaacute

apresentada na figura 4 Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof Roberto Santana da

Silva da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas de Ribeiratildeo Preto (FCFRP-USP) com o qual

desenvolvemos trabalhos de colaboraccedilatildeo


32

[Ru(terpy)(L)NO+]3+

HN

HN

COOH

NHNHq

RuIIL

N

NN

NO+

L

L=

Figura 4 Foacutermula estrutural do complexo [Ru(NHNH)(tpy)NO]3+ (Ru-tpy)

I6 Sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos

A solubilidade dos fotossensibilizadores eacute um fator essencial para seu uso no

tratamento de neoplasias utilizando a TFD Um dos desafios dos nossos estudos eacute vencer a

baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em aacutegua de muitos compostos determinada

quase sempre pela sua natureza hidrofoacutebica Portanto sua administraccedilatildeo intravenosa torna-se

uma tarefa difiacutecil

Dessa forma vaacuterios sistemas de liberaccedilatildeo de faacutermacos tecircm sido desenvolvidos para

modificar as propriedades fisico-quiacutemicas farmacocineacuteticas e bioloacutegicas dos

fotossensibilizadores (Konan Gurny e Alleacutemann 2002 Primo Bentley e Tedesco 2008

Renno e Miller 2001) Aleacutem disso esta estrateacutegia viabiliza a associaccedilatildeo dos

fotossensibilizadores com outros compostos uacuteteis para TFD tornando possiacutevel a utilizaccedilatildeo de

sistemas sineacutergicos (Primo et al 2008 Pelegrino et al 2005 Oliveira et al 2005 Macaroff

et al 2005)

Dentre os sistemas de liberaccedilatildeo em estudo destacam-se os lipossomas os eritroacutecitos

resselados isolados do sangue as nanopartiacuteculas biodegradaacuteveis as microesferas proteacuteicas e

polimeacutericas entre outros sistemas (Chen Pogue e Hasan 2005 Lovcinsky et al 1999 Primo

Bentley e Tedesco 2008 Simioni et al 2007)


33

Os lipossomas satildeo estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas

fosfolipiacutedicas Satildeo formadas em aacutegua pela agregaccedilatildeo de moleacuteculas anfifiacutelicas (como por

exemplo as moleacutecula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina ndash DPPC) e o Colesterol em

bicamadas que se fecham resultando em um compartimento interno aquoso) conforme

mostrado na figura 5

Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de uma vesiacutecula unilamelar mostrando interaccedilotildees com

diferentes substacircncias

Estes sistemas podem solubilizar faacutermacos lipofiacutelicos (na bicamada lipiacutedica) que de

outra forma seriam difiacuteceis de serem administrados intravenosamente podem prolongar o

tempo de accedilatildeo do faacutermaco liberando este lentamente no corpo Deste modo satildeo endocitados

ou fagocitados por ceacutelulas abrindo novas oportunidades para faacutermacos que dependem da

administraccedilatildeo lipossomal (Hoebeke 1995) Podem tambeacutem incorporar substacircncias

hidrofiacutelicas (dentro do compartimento interno aquoso)

Os lipossomas e outros veiacuteculos de liberaccedilatildeo de faacutermacos quando satildeo administrados

via intravenosa tendem a ser rapidamente fagocitados por macroacutefagos em vaacuterios tecidos do

sistema do retiacuteculo endotelial (SRE) com acuacutemulo preferencial no fiacutegado e no baccedilo Este

processo de remoccedilatildeo pode ocorrer primeiramente pela opsonizaccedilatildeo dos lipossomas realizado


34

pelas opsoninas que satildeo elementos do soro sanguiacuteneo que se ligam agraves partiacuteculas estranhas e

promovem a fagocitose seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macroacutefago

(Woodle e Lasic 1992)

Com base nas consideraccedilotildees apresentadas existe a necessidade de que o sistema de

liberaccedilatildeo contendo o faacutermaco circule na corrente sanguiacutenea por um tempo mais longo

visando uma seletividade deste faacutermaco em um tecido alvo especiacutefico Surgiram entatildeo os

chamados lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)

(Allen Hansen e Rutledge 1989) nos quais a bicamada lipiacutedica conteacutem glicolipiacutedios ou mais

recentemente lipiacutedios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes Sguilla e Tedesco

2004) Desta forma estes sistemas satildeo capazes de escapar do sistema imunoloacutegico e

permanecer estaacutevel por um tempo mais prolongado na corrente sanguumliacutenea dirigindo-os assim

a outros siacutetios no organismo

Portanto a ideacuteia de utilizar compostos fotossensiacuteveis que satildeo capazes de liberar

diferentes espeacutecies reativas associados em um mesmo sistema de liberaccedilatildeo abre um amplo

campo de accedilatildeo dentro da TFD tornando a ideacuteia da TFD sineacutergica cada vez mais promissora


35

II OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofiacutesico

fotoquiacutemico e fotobioloacutegico os efeitos da associaccedilatildeo de dois compostos fotoativos (ZnPC e

Ru-tpy) em sistemas de veiculaccedilatildeo do tipo lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) de

modo que esta accedilatildeo sineacutergica viesse a maximizar a accedilatildeo fotodinacircmica dos mesmos

Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Objetivos

36

III PARTE EXPERIMENTAL

III1 Materiais

Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento preacutevio DL-

α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma Chemical Company) Colesterol (Avanti Polar

Lipids) polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids) Zinco ftalocianina (Aldrich) O

complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de

pesquisa do Profordm Drordm Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos

trabalhos de colaboraccedilatildeo

Todas as soluccedilotildees aquosas foram preparadas com aacutegua ultra pura obtida atraveacutes de

filtragem sequencial com colunas de troca iocircnica em um sistemas E-Pure da Barnestead D

3750 com filtragem final em membrana de 02 microm de diacircmetro pressatildeo maacutexima de operaccedilatildeo

em 50 psi (34 Kgcm2) e resistividade de 18 mΩ

As soluccedilotildees tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 utilizadas nas preparaccedilotildees

lipossomais e nos demais experimentos foram preparadas pela mistura de diferentes volumes

de soluccedilotildees de fosfato monobaacutesico de soacutedio 001 molL-1 (Sigma) e fosfato dibaacutesico de soacutedio

001 molL-1 (Sigma) preparados em aacutegua ultrapura

Os solventes de grau analiacutetico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento

preacutevio dimetilformamida-DMF (Sigma) dimetilsulfoacutexido-DMSO (Sigma) etanol (Merck)

isopropanol (Merck)

Os estudos envolvendo cultura de ceacutelulas utilizaram os seguintes materiais meio de

cultura RPMI 1640 (Gibco BRL) antibioacutetico (PenicilinaStreptomicina-Gibco BRL) glicose

(Sigma) bicarbonato de soacutedio (NaHCO3 Nuclear) soro fetal bovino (Gibco BRL) tampatildeo

Hankacutes (Gibco BRL) 3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium (MTT Sigma)

corante azul de tripan (Gibco BRL) tripsina-EDTA (Gibco BRL)

Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Parte Experimental

37

Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplaacutesica de melanoma de rato B-16

F10 adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC) Esse tipo de ceacutelula

neoplaacutesica eacute obtido originalmente de ratos C57BL6JDD A induccedilatildeo deste tipo de neoplasma

(melanoma cutacircneo) eacute feita pela injeccedilatildeo de metilcolantreno na cavidade toraacutexica de ratos A

remoccedilatildeo do fluido presente nesta cavidade eacute feita apoacutes dois dias e a subsequumlente transfusatildeo

para outros animais garante a proliferaccedilatildeo deste tipo de ceacutelulas

A soluccedilatildeo de soro bovino fetal foi preacute-aquecida a 56degC para inativaccedilatildeo das enzimas

Em seguida foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20degC O soro

bovino fetal apresenta em sua composiccedilatildeo baacutesica insulina hormocircnios e vaacuterios outros fatores

indispensaacuteveis ao crescimento celular

Aleacutem destes materiais encontram-se agrave disposiccedilatildeo diferentes solventes orgacircnicos bem

como outros sais inorgacircnicos comumente utilizados em laboratoacuterio

III2 Preparaccedilotildees

As soluccedilotildees de tampatildeo fosfato (pH 74) 10 mmolL-1 foram rotineiramente

preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluccedilotildees de fosfato de soacutedio monobaacutesico 10

mmolL-1 e fosfato de soacutedio dibaacutesico 10 mmolL-1 em aacutegua ultrapura

As soluccedilotildees estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSODMF

(11) e as soluccedilotildees estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampatildeo fosfato pH 74

as duas soluccedilotildees foram armazenadas por um periacuteodo natildeo superior a duas semanas na

ausecircncia de luz a - 20 oC

As concentraccedilotildees foram determinadas espectrofotomeacutetricamente utilizando-se os

coeficientes de extinccedilatildeo molar em 670 nm ε = 23 x 105 molL-1 cm-1 em DMSODMF para a

Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 245 x 10 4 molL-1 cm-1 para o complexo Ru-tpy


38

Todas as formulaccedilotildees lipossomais de DPPC foram preparadas pelo meacutetodo de

injeccedilatildeo conforme descritos na seccedilatildeo Meacutetodos III42 e armazenadas na ausecircncia total de luz a

temperatura ambiente por ateacute 10 dias

As soluccedilotildees de tampatildeo Hankacutes (contendo antibioacutetico sem bicarbonato de soacutedio e

fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluiccedilatildeo 10 vezes em aacutegua ultrapura seguida de

filtraccedilatildeo com membrana esteacuteril de poro de 022 microm

A soluccedilatildeo de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular atraveacutes

da contagem de ceacutelulas foi preparada na concentraccedilatildeo de 04 utilizando-se tampatildeo Hankrsquos

como solvente (pH 72) Posteriormente a soluccedilatildeo final foi filtrada atraveacutes de uma membrana

de poro de 022 microm e em seguida aliquotada

A soluccedilatildeo de tripsina 025 utilizada no processo de replicagem celular para

desprender as ceacutelulas aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a

soluccedilatildeo estoque 10 vezes concentrada em tampatildeo fosfato esteacuteril com pH=74

O meio de cultura RPMI 1640 utilizado no crescimento e manutenccedilatildeo das culturas

neoplaacutesicas de melanoma de rato B-16 F10 conteacutem 20 mmolL-1 de L-glutamina e

adicionamos 20 g de bicarbonato de soacutedio e 24 g de Hepes para sua preparaccedilatildeo

Apoacutes a preparaccedilatildeo de cada meio antes da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de soro bovino fetal o

pH foi ajustado para 74 sendo a mistura filtrada para sua esterelizaccedilatildeo com filtro esteacuteril de

022 microm em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco esteacuteril

Antes da sua utilizaccedilatildeo este meio foi enriquecido com 10 de soluccedilatildeo de soro

bovino fetal 1 mL de antibioacuteticoantimicoacutetico denominado meio completo

III3 Aparelhagem

Nas preparaccedilotildees lipossomais feitas pelo meacutetodo de injeccedilatildeo em meio orgacircnico utilizam

uma bomba de injeccedilatildeo peristaacuteltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i)


39

Nos estudos espectrofotomeacutetricos foram realizadas as medidas de intensidade de

absorccedilatildeo em um espectrofotocircmetro de absorccedilatildeo modelos U-3000 da Hitachi e os espectros de

emissatildeo de fluorescecircncia foram registrados em dois espectrofluoriacutemetros Jobin Yvon

Fluorolog 3 da Spex modelo FL3 e F-4500 da Hitachi usando celas de quartzo de 1 cm de

caminho oacuteptico

Para as medidas de decaimento de fluorescecircncia foi utilizado o meacutetodo de contagem

simples de foacutetons O sistema utilizado para excitaccedilatildeo consiste de um conjunto de lasers No

iniacutecio do processo um laser de diodos com dois feixes emitindo em 809 nm cada qual com

24 W de potecircncia bombeia um laser de estado soacutelido (NdYVO4 - Millenia Xs - Spectra

Physics) que emite em 1064 nm O feixe passa entatildeo por um cristal dobrador de frequumlecircncias e

o feixe final com potecircncia podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm

bombeia um laser de titacircnio-safira (Tsunami - Spectra Physics) o cristal de titacircnio-safira gera

pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 ateacute 1080 nm com

frequumlecircncia maacutexima de repeticcedilatildeo dos pulsos igual a 82 MHz Um filtro bi-refringente seleciona

o comprimento de onda desejado Apoacutes o selecionador de pulsos o feixe passa por um

gerador de segundos e terceiros harmocircnicos cujos comprimentos de onda do feixe na saiacuteda

estatildeo na faixa utilizada para excitaccedilatildeo de nossas amostras que vai de 280 ateacute 330 nm O sinal

detectado como pulso de excitaccedilatildeo chamado IRF (instrument response function) tem largura

total a meia altura de 60 ps Este estudo foi realizado com o auxiacutelio do Laboratoacuterio de

Biofiacutesica Molecular da FFCLRPUSP o qual eacute coordenado pelo Profordm Dr Amando Siuiti Ito

A fonte de irradiaccedilatildeo utilizada nos experimentos de determinaccedilatildeo do espectro de

absorccedilatildeo do transiente e do tempo de vida do triplete dos faacutermacos estudados foi um sistema

laser Nd-YAG da Continuum modelo SURELITE I-10 Para o agente fotossensibilizador

ZnPC e para o complexo de rutecircnio em estudo foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo o

terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG (355 nm) A energia meacutedia utilizada foi da ordem de 30

mJcm2 atraveacutes de uma fenda de 80 mm de diacircmetro A uma distacircncia de 100 cm da fenda


40

do laser foi posicionado um suporte termostatizaacutevel para celas com agitaccedilatildeo magneacutetica

(Hellmam CUV-O-Stir)

A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um Power meter

Field Master da Coherent (Santa Clara CA) usando-se uma cabeccedila de detecccedilatildeo LM-30 V

Nos estudos envolvendo a detecccedilatildeo do espectro de absorccedilatildeo de transiente na faixa de

300 a 800 nm adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto em intervalos de 10 nm

apoacutes a excitaccedilatildeo (λexc=355 nm) com laser de Nd-YAG Os sinais dos transientes gerados

foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um

osciloscoacutepio digital da Tektronix modelo TDS 340A sendo consecutivamente transferidos

para um microcomputador e analisados com o auxiacutelio do software Gem fornecido pela

Edinburgh Analytical Instruments (Livingston UK) Para a obtenccedilatildeo do tempo de vida do

estado excitado triplete no comprimento de onda maacuteximo de absorccedilatildeo do triplete foi feita uma

meacutedia de 10 pulsos de laser

O terceiro harmocircnico do laser Nd-YAG tambeacutem foi utilizado como fonte de excitaccedilatildeo

nos estudos de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete pela ZnPC O sinal de emissatildeo de

fosforescecircncia do oxigecircnio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um

fotodetector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823A

Nos experimentos de fotoacutelise e ensaios bioloacutegicos de fototoxicidade em ceacutelula

utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de

emissatildeo em 675 nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de potecircncia de 200 mJ

A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor

amperomeacutetrico amiNO-700 desenvolvido pela Innovative Intruments Inc (NOmeter) Este

sensor eacute formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeaacutevel e tem

sensibilidade na faixa de 50 nAmpeacutere a 50 microAmpeacutere com tempo de resposta relativamente

curto compatiacutevel com o sistema pulsado de irradiaccedilatildeo proposto

Nos estudos do tamanho das partiacuteculas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano

system ZS da Malvern-UK o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no


41

comprimento de onda de 633 nm permitindo realizar medidas natildeo invasivas por ldquobackscatter

opticsrdquo (NIBS) e possui a capacidade de determinar tamanho de partiacuteculas no intervalo de 2

nm a 3 microm As medidas foram realizadas num acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da

medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento O

equipamento realiza em meacutedia 12 determinaccedilotildees para cada anaacutelise

Os trabalhos em cultura de ceacutelulas da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela

de fluxo laminar modelo A152 da Veco esterilizada com luz germicida e fluxo contiacutenuo de

ar Foram tambeacutem utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento

celular microscoacutepio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para anaacutelise de forma tamanho e

crescimento de cultura) centriacutefuga da CentriBio autoclave modelo AB-42 da Phoenix

banhos termostatizaacuteveis Fischer Scientific modelo 801 e espectrofotocircmetro para leitura de

microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device

Aleacutem destes equipamentos foram utilizados balanccedila eletrocircnica Libror (modelo AEL

200) sistema vortex Genie 2 ultrason Branson (modelo 2210) pH-metro (modelo accumentreg

50 da Fisher Scientific)

III4 Meacutetodos


complexo Ru-tpy em meio homogecircneo

A investigaccedilatildeo das propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC e do

complexo Ru-tpy em meio homogecircneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de

absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia

Os estudos espectroscoacutepicos no estado estacionaacuterio da ZnPC foram realizados em

meio orgacircnico (etanol) e do complexo de rutecircnio foram realizados em tampatildeo fosfato pH 74


42

Os espectros de absorccedilatildeo foram registrados em uma cela de absorccedilatildeo de 1 cm de

caminho oacuteptico utilizando como referecircncia os meios em estudo na ausecircncia dos faacutermacos Os

espectros de absorccedilatildeo foram entatildeo registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300

a 800 nm

Com base na anaacutelise dos dados espectrais de absorccedilatildeo foi determinado a seguir o

espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC utilizando-se os comprimentos de onda de

excitaccedilatildeo maacutexima deste para excitaccedilatildeo das amostras Os espectros de emissatildeo de

fluorescecircncia foram registrados dentro da faixa especiacutefica 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa

em 610 nm

III42 Preparaccedilatildeo Zinco ftalocianina do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois

faacutermacos em meio lipossomal

Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de

circulaccedilatildeo (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) preparados pelo meacutetodo pelo

meacutetodo de injeccedilatildeo conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes Sguilla e Tedesco

2004)

Uma soluccedilatildeo etanoacutelica de 0360 mL contendo 207 mg de DPPC (0525 mmolL-1)

027 mg de colesterol (014 mmolL-1) e um volume adequado de corante para se obter uma

concentraccedilatildeo final 50 micromolL-1 da ZnPC Foram injetadas por uma bomba peristaacuteltica com

velocidade de adiccedilatildeo controlada sobre uma soluccedilatildeo 35 micromolL-1 de PEG 2000 em tampatildeo

fosfato pH 74 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 50 mL) A

soluccedilatildeo tampatildeo estava contida em um recipiente ciliacutendrico de 20 cm de diacircmetro e a injeccedilatildeo

foi realizada agrave aproximadamente 25 cm abaixo da superfiacutecie liacutequida a uma temperatura de

57oC sob agitaccedilatildeo magneacutetica na ausecircncia de luz e com uma velocidade de 10 microLs (360

microLh)


43

Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo

procedimento descrito acima sendo o complexo de rutecircnio adicionado junto a soluccedilatildeo tampatildeo

nas concentraccedilotildees de 50 x 10-6 molL-1 e 5 x 10-3 molL-1 antes da adiccedilatildeo do lipiacutedeo

Apoacutes cada preparaccedilatildeo lipossomal foi registrado o espectro de absorccedilatildeo dos faacutermacos

associados ao sistema lipossomal a fim de se verificar a eficiecircncia da incorporaccedilatildeo e a

ausecircncia de formaccedilatildeo de agregados superiores A concentraccedilatildeo da ZnPC e do complexo de

rutecircnio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar

Figura 6 Figura esquemaacutetica da preparaccedilatildeo dos lipossomas


partiacuteculas

Realizamos o estudo do tamanho das partiacuteculas lipossomais formadas com o intuito de

averiguar a viabilidade destas preparaccedilotildees quanto a homogeneidade no tamanho das partiacuteculas

formadas e influecircncias de agentes formadores deste sistema (ZnPC complexo Ru-tpy DPPC

colesterol e PEG) em suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas

Utilizamos como ferramenta de anaacutelise as teacutecnicas de espalhamento de luz para

determinaccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas coloidais e medidas de intensidade de emissatildeo de

fluorescecircncia para os sistemas com presenccedila do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina

(ZnPC) e do complexo Ru-tpy


44

As amostras foram diluiacutedas em aacutegua mili-Q (proporccedilatildeo 110) e submetidas a medidas

de espalhamento dinacircmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS

(Malvern-UK) Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho

oacuteptico e as mediccedilotildees foram feitas agrave temperatura ambiente (25ordmC) O equipamento possui um

laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as

mediccedilotildees natildeo invasivas por ldquobackscatter opticsrdquo (NIBS) As mediccedilotildees foram feitas num

acircngulo de detecccedilatildeo de 173ordm e a posiccedilatildeo da mediccedilatildeo na cubeta foi automaticamente

determinada pelo software do equipamento O equipamento realiza em meacutedia 12

determinaccedilotildees para cada anaacutelise Neste experimento o equipamento utiliza um laser

modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em

meacutedia vinte e duas medidas para cada amostra analisada


complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal

As propriedades espectroscoacutepicas no estado estacionaacuterio da ZnPC do complexo Ru-

tpy e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em

medidas diretas dos espectros de absorccedilatildeo e de emissatildeo de fluorescecircncia Os espectros de

absoccedilatildeo foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissatildeo de fluorescecircncia

fotoestacionaacuteria foram registrados na faixa de 630 a 750 nm com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm

em cela de quartzo de 1 cm de caminho oacuteptico


45


tpy no sistema lipossomal

A supressatildeo da fluorescecircncia emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi

estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor

O estudo espectroscoacutepico de supressatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio do

fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 Para o complexo

Ru-tpy a concentraccedilatildeo final foi definida ateacute 50 micromolL-1

A emissatildeo de fluorescecircncia foi obtida por excitaccedilatildeo da amostra em comprimento de

onda fixo de 610 nm

Em celas de fluorescecircncia de quartzo com caminho oacuteptico de 10 cm foram colocados

20 mL do lipossoma de ZnPC Apoacutes termostatizar agrave 37oC foram feitas as medidas de

intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia inicial na ausecircncia do supressor A cada medida

foram adicionadas aliacutequotas crescentes de uma soluccedilatildeo estoque do supressor (Ru-tpy)

tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentraccedilatildeo maacutexima de 50 micromolL-1

Estas soluccedilotildees foram agitadas e termostatizadas agrave 37oC e em seguida foram realizadas as

medidas de intensidade de emissatildeo de fluorescecircnca na presenccedila do supressor

Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados

inicialmente pela equaccedilatildeo 1 de Stern-Volmer

If0If = 1 + kq τ0 = 1 + Ksv [Q] (equaccedilatildeo 1)

Onde If0 e If satildeo as intensidades de fluorescecircncia na ausecircncia e presenccedila do supressor

respectivamente kq eacute a constante de velocidade de supressatildeo τ0 eacute o tempo de vida do

fluoroacuteforo na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute a

constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)


46

Os graacuteficos de Stern-Volmer foram construiacutedos a partir das intensidades de

fluorescecircncia relativas e os valores das constantes de supressatildeo de Stern-Volmer Ksv foram

obtidos utilizando-se o meacutetodo de ajuste linear de acordo com a equaccedilatildeo 1

III46 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da Zinco ftalocianina

e de sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal

A determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia para o FS estudado neste

trabalho nos diferentes meios e na ausecircncia e na presenccedila do complexo Ru-tpy foi realizada

atraveacutes do meacutetodo relativo utilizando-se a ZnPC em etanol como padratildeo conforme

formalismo descrito por Demas e Crosby 1971 (Demas e Crosby 1971)

em que φ eacute rendimento quacircntico Aacuterea eacute a integral sobre a banda de emissatildeo e n eacute o iacutendice de

refraccedilatildeo do solvente

Uma soluccedilatildeo de ZnPC em meio orgacircnico utilizada como padratildeo (Φf = 028) foi

inicialmente preparada de modo a obter uma absorbacircncia constante na faixa de 01 (no

comprimento de onda de excitaccedilatildeo) As soluccedilotildees contendo a ZnPC em etanol incorporada aos

lipossomas de longo tempo de circulaccedilatildeo (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio

lipossomal tambeacutem foram preparadas por diluiccedilotildees infinitas para obter absorbacircncias da

ordem de 01 (no comprimento de onda de excitaccedilatildeo) de modo a minimizar o efeito de filtro

interno A seguir foi traccedilado o espectro de emissatildeo de fluorescecircncia corrigido em cada

ambiente estudado sendo determinada a aacuterea sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm


para o sistema misto

Os tempos de vida de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1) incorporada aos

lipossomas e da sua associaccedilatildeo com o complexo de rutecircnio em meio lipossomal foram


47

obtidas pela teacutecnica de contagem simples de foacutetons O comprimento de onda de excitaccedilatildeo e de

emissatildeo utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm respectivamente Para cada medida de

decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens As curvas de decaimento de

fluorescecircncia foram analisadas utilizando-se o software operacional do proacuteprio instrumento

com ajuste exponencial os quais foram validados atraveacutes do valor miacutenimo na funccedilatildeo chi-

quadrado (χ2)


Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da

associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotoacutelise por

pulso de laser As soluccedilotildees de trabalho foram preparadas de maneira semelhante agravequelas

descritas anteriormente na concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o fotossensibilizador ZnPC

e 500 micromolL-1 para o complexo Ru-tpy

Utilizou-se como fonte de excitaccedilatildeo o terceiro harmocircnico (355 nm) do laser pulsado

de Nd-YAG como descrito anteriormente na seccedilatildeo III3

O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorccedilatildeo maacutexima do

transiente gerado e para a determinaccedilatildeo do tempo de vida do estado excitado triplete do

mesmo foi de 480 nm

O espectro de absorccedilatildeo do transiente foi registrado ponto a ponto em intervalos de

100 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm onde se utilizaram disparos

ajustados na razatildeo de 3 disparos sequumlenciais para cada intervalo de 10 nm com excitaccedilatildeo do

laser em 355 nm


48

III49 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)

Inicialmente analisou-se a eficiecircncia quacircntica de geraccedilatildeo de 1O2 para a Zinco

ftalocianina em meio orgacircnico (etanol) As soluccedilotildees possuiacuteam a mesma intensidade de

absorccedilatildeo em 355 nm (Abs = 03) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigecircnio

por 30 minutos Uma soluccedilatildeo de feoforbide-a com as mesmas caracteriacutesticas das soluccedilotildees

que continham as amostras foi utilizada como amostra padratildeo (Φ∆= 059) (Arbogast et al

1991) Na detecccedilatildeo do φ∆ utilizou-se o meacutetodo fotofiacutesico que consiste no monitoramento da

intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 em 1270 nm empregando-se o sistema

resolvido no tempo (EAI ndash LP 900 pulsado com um laser NdYAG a 355 nm com um

detector de germacircnio da North Coast Scientific Corporation modelo 823 A) item III3 A

potecircncia do laser de NdYAG utilizado na detecccedilatildeo do φ∆ produzido pelo fotossensibilizador

ZnPC e da associaccedilatildeo dos dois faacutermacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso A

intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi determinada pelo meacutetodo relativo

com base na equaccedilatildeo 2 conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al 1991)

∆

∆

∆∆ Φ=Φτ

τRef

Ref

RefI

I

(Equaccedilatildeo 2)

na qual Iref eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pelo composto

padratildeo I eacute a intensidade de emissatildeo de fosforescecircncia do 1O2 produzido pela amostra Φ∆ref eacute

o rendimento quacircntico de produccedilatildeo de 1O2 produzido pela referecircncia τ∆ref eacute o tempo de vida

do 1O2 produzido pela referecircncia e τ∆ eacute o tempo de vida do 1O2 produzido pela amostra


49

III410 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm

A liberaccedilatildeo fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperomeacutetrico

amiNO ndash 700 o NOmeter Sua calibraccedilatildeo foi realizada atraveacutes de uma soluccedilatildeo aquosa padratildeo

de NO gasoso (Kudo et al 1997) Em uma quantidade de 10 mL de tampatildeo borbulhou-se

argocircnio por 30 min a fim de remover todo o oxigecircnio presente no meio O gaacutes NO foi gerado

por uma soluccedilatildeo de aacutecido niacutetrico 50 na qual mergulharam-se pedaccedilos de cobre metaacutelico

(Cu0) (Equaccedilatildeo 3) Antes de borbulhar a soluccedilatildeo padratildeo o gaacutes passou por uma soluccedilatildeo de

KOH para remover possiacuteveis traccedilos de NO2 presentes na mistura gasosa Esse aparato foi

construiacutedo em uma capela (Figura 7)

3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3

-(aq)rarr 2NO(g) + 3Cu2+

(aq) + 6NO3-(aq) + 4H2O(l) (Equaccedilatildeo 3)


50

Figura 7 Aparato montado em capela para geraccedilatildeo de oacutexido niacutetrico gasoso

O oacutexido niacutetrico gasoso foi borbulhado por 1 hora Tempo suficiente para saturar a

soluccedilatildeo aquosa A concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo aquosa de NO foi determinada por titulometria

conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti 2000) para o qual encontrou-se um valor 21

times 10-3 molL-1 Assim a partir dessa soluccedilatildeo padratildeo de concentraccedilatildeo conhecida de NO gasoso

calibrou-se o aparelho Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de

tampatildeo apoacutes borbulhar argocircnio por 30 min ajustou-se o aparelho para o zero Este tampatildeo

deve apresentar o mesmo pH do tampatildeo que seraacute utilizado para dissolver o composto no

momento da fotoacutelise A seguir gerou-se uma concentraccedilatildeo conhecida de NO na soluccedilatildeo de

anaacutelise pela adiccedilatildeo de um volume especiacutefico da soluccedilatildeo padratildeo de NO Apoacutes alguns

segundos quando o valor da corrente de NO na soluccedilatildeo permaneceu constante adicionou-se

uma nova quantidade da mesma soluccedilatildeo padratildeo O aumento observado de corrente mostrou-

se proporcional agrave concentraccedilatildeo de NO adicionado

Com relaccedilatildeo agrave utilizaccedilatildeo do NOmeter alguns cuidados devem ser considerados pois a

membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente Para


51

cada membrana eacute necessaacuteria uma nova calibraccedilatildeo Eacute importante que a calibraccedilatildeo seja feita no

mesmo pH em que seraacute realizado o experimento de fotoacutelise A resposta amperomeacutetrica do

eletrodo depende da concentraccedilatildeo hidrogeniocircnica do meio

Nos experimentos de fotoacutelise houve um acompanhamento da variaccedilatildeo

espectroscoacutepica na regiatildeo UV-visiacutevel e outro com registro amperomeacutetrico in situ da liberaccedilatildeo

de NO gasoso (NOmeter) Para os dois tipos os experimentos foram realizados em triplicata

Para a realizaccedilatildeo do experimento de fotoacutelise com acompanhamento da variaccedilatildeo do

espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a

Zinco ftalocianina em meio lipossomal Foi obtido um espectro UV-visiacutevel inicial antes da

irradiaccedilatildeo A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo

espectro na regiatildeo do UV-visiacutevel Esse procedimento foi repetido ateacute que natildeo houvesse mais

variaccedilatildeo no espectro da amostra

A fotoacutelise com acompanhamento in situ da liberaccedilatildeo de NO gasoso foi realizada pelo

acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada Como ilustra a figura 8 abaixo


52

Figura 8 Medida do NO liberado atraveacutes do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo)

O caacutelculo de rendimento quacircntico de NO (φNO) foi realizado com base nos resultados

obtidos em cada pico do cronoamperograma no qual foi calculado um valor de concentraccedilatildeo

de NO liberado Com o valor da intensidade da luz incidente (Is) fornecida calculou-se pela

Equaccedilatildeo 4 o rendimento quacircntico φt para cada irradiaccedilatildeo Esses valores foram plotados em

um graacutefico em funccedilatildeo do tempo O valor extrapolado para tempo zero por regressatildeo linear foi

admitido como sendo o do rendimento quacircntico de liberaccedilatildeo de NO (φNO) Isso foi feito com

o intuito de minimizar o efeito de fotoacutelises secundaacuterias Ou seja a partir de certo tempo de

irradiaccedilatildeo pode ocorrer fotodegradaccedilatildeo dos produtos e o rendimento quacircntico calculado

passa a natildeo corresponder agrave reaccedilatildeo de interesse


53

)101(tI

nabs

s

Lt minusminustimestimes

=φ (Equaccedilatildeo 4)

nL = nuacutemero de moles de NO liberados pela reaccedilatildeo fotoquiacutemica

Is = intensidade da luz incidente

t = tempo de fotoacutelise (s)

1 - 10-abs = quantidade de luz absorvida pela amostra onde abs eacute o valor da

absorbacircncia da amostra no comprimento de onda de irradiaccedilatildeo

III411 Estudos in vitro


melanoma de rato (B-16 F10)

Para a manutenccedilatildeo e crescimento das ceacutelulas B-16 F10 satildeo necessaacuterios vaacuterios

cuidados como o descongelamento e a preparaccedilatildeo do meio de cultura das mesmas

As matrizes de ceacutelulas B-16 F10 (05 x 106 ceacutelulasmL) estocadas em nitrogecircnio

liacutequido foram descongeladas a 37degC e adicionadas a um frasco de cultura (Corning esteacuteril de

75 cm2) contendo 100 mL do meio completo (RPMI 1640) O frasco de cultura foi colocado

em uma incubadora a 37degC com 50 de CO2 durante 48 horas

Apoacutes este periacuteodo realizou-se a primeira repicagem de ceacutelulas Como as ceacutelulas

crescem aderidas no frasco celular foi necessaacuteria a utilizaccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de tripsina

005 para soltaacute-las sendo necessaacuterio o contato com esta soluccedilatildeo por aproximadamente 60

segundos Assim o meio contendo as ceacutelulas foi adicionado em um tubo cocircnico do tipo

Falcon e centrifugado a 25 degC com rotaccedilatildeo constante de 5000 rpm durante 5 minutos O

sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo as ceacutelulas

foram entatildeo distribuiacutedas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm2


54

A troca de meio destas ceacutelulas foi realizada sempre que necessaacuterio em meacutedia a cada

dois dias Quando o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas atingiu 15 x 106 ceacutelulasmL ou uma nova

subcultura de ceacutelulas (05 x 106 ceacutelulasmL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e

congeladas

No processo de congelamento as ceacutelulas foram lavadas com o meio RPMI e

posteriormente congeladas em tubos criogecircnicos contendo uma soluccedilatildeo composta de soro

fetal bovino e DMSO (9010) numa proporccedilatildeo final de 41

III4112 Controle da integridade da membrana celular

Quando se trabalha com cultura de ceacutelulas costuma-se analisar a integridade da

membrana celular como controle de viabilidade em funccedilatildeo do crescimento Este controle foi

feito tambeacutem para avaliar o nuacutemero meacutedio de ceacutelulas presente na cultura bem como para

avaliar o nuacutemero de ceacutelulas com rompimento de membrana plasmaacutetica Este teste utiliza o

corante azul de tripan e eacute chamado teste de exclusatildeo do azul de tripan

Assim com base no nuacutemero total de ceacutelulas contadas tem-se uma amostragem

estatiacutestica de toda a cultura celular Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do

crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth 1996 Freshney 1986)

Sendo assim em um tubo de 15 mL foram colocados 180 microL de tampatildeo Hanks 180

microL de soluccedilatildeo de azul de tripan (04 mv) e 20 microL da suspensatildeo de ceacutelulas A mistura foi

agitada e apoacutes dois minutos com a ajuda da cacircmara de Neubauer fez-se a contagem das

mesmas e calculou-se a viabilidade celular

Um outro meacutetodo para avaliar a atividade celular eacute o meacutetodo que se baseia no uso do

corante (3[45-dimetiltiazol-2-il]-25-brometo difenil tetrazolium) conhecido como teste do

MTT Este ensaio eacute apropriado para se determinar espectrofotometricamente o nuacutemero total

de ceacutelulas como funccedilatildeo da atividade mitocondrial intacta ou seja ceacutelulas vivas


55

O meacutetodo do MTT eacute simples confiaacutevel e reprodutiacutevel Soluccedilotildees de MTT dissolvidas

em meio de cultura ou em soluccedilotildees salinas balanceadas na ausecircncia de indicador vermelho de

fenol satildeo de cor amarelada A dehidrogenase mitocondrial das ceacutelulas viaacuteveis atuam sobre o

anel tetrazolium produzindo cristais de formazan de cor puacuterpura os quais satildeo insoluacuteveis em

soluccedilatildeo aquosa Os cristais satildeo entatildeo dissolvidos em isopropanol acidificado O produto

obtido eacute monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm Um aumento ou diminuiccedilatildeo

no nuacutemero de ceacutelulas resulta em uma mudanccedila concomitante na quantidade do formazan

formado indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al 1991 Mosmann 1983)

O meacutetodo do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro eacute bem estabelecido

para o uso com placas de poccedilos muacuteltiplos Para melhores resultados devem ser empregadas

sempre as ceacutelulas na sua fase logariacutetmica de crescimento e o nuacutemero final de ceacutelulas natildeo deve

exceder 10 x 106 ceacutelulasmL Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na

ausecircncia do faacutermaco em estudo

Inicialmente as ceacutelulas B-16 F10 foram removidas da incubadora sendo levadas agrave

capela de fluxo laminar e distribuiacutedas nas placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) A estas

ceacutelulas foi adicionada uma soluccedilatildeo de MTT 10 mgmL A cultura foi conduzida agrave incubadora

por 4 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram removidas da estufa de CO2 e os

cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adiccedilatildeo de isopropanol

O teste eacute finalizado atraveacutes de medidas espectrofotomeacutetricas da absorbacircncia no

comprimento de onda de 560 nm descontando-se a absorbacircncia de fundo a 690 nm

(Freshney 1986) Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas

(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max


56


lipossomal misto na ausecircncia de luz

Uma suspensatildeo de 05 x 106 ceacutelulasmL da linhagem B-16 F10 foi preparada

inicialmente As ceacutelulas foram entatildeo incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm) com

meio completo Apoacutes as ceacutelulas atingirem confluecircncia (de 24 a 48 horas) o meio foi retirado

e as ceacutelulas foram lavadas com 5 mL de tampatildeo Hankacutes Logo em seguida a retirada do

tampatildeo foram adicionadas as soluccedilotildees em estudo para serem testadas em um meio especiacutefico

contendo 3 de soro fetal bovino no volume final de 3mL Depois de 3 horas de incubaccedilatildeo

das ceacutelulas as soluccedilotildees foram retiradas lavadas novamente com tampatildeo Hankacutes e soltas com

a soluccedilatildeo de tripsina 025 Estas suspensotildees de ceacutelulas foram entatildeo transferidas para um

tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi retirado e as ceacutelulas

foram suspensas com os seus respectivos meios As suspensotildees foram em seguida

transferidas para as placas de poccedilos muacuteltiplos (96 poccedilos) com 200 microL por poccedilo de meio

completo Depois de 24 horas o meio foi retirado as ceacutelulas foram lavadas com 200 microL de

tampatildeo Hanks e foram adicionados 50 microL da soluccedilatildeo de MTT 1 mgmL As ceacutelulas foram

incubadas por mais 4 horas e 150 microL de isopropanol foram acrescentados para completa

solubilizaccedilatildeo do formazan


lipossomal misto

Nos estudos de fototoxicidade foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares

(ceacutelulas B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal variando a concentraccedilatildeo da Zinco

ftalocianina de 1 e 5 micromolL-1 e a concentraccedilatildeo fixa de 50 micromolL-1 para o complexo de

rutecircnio Entatildeo analisamos o efeito da concentraccedilatildeo da ZnPC sob a concentraccedilatildeo fixa do

complexo de rutecircnio Neste experimento as ceacutelulas com aproximadamente 1 x 106 ceacutelulasmL


57

foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37o C em uma estufa de CO2 Os

sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampatildeo Hankacutes nas placas de Petri

A cultura celular foi submetida agrave intensidade de irradiaccedilatildeo de 05 Jcm2 obtido do

sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech no comprimento de onda de emissatildeo em 675

nm acoplado a uma fibra oacuteptica operando no maacuteximo de 300 mW de potecircncia

Apoacutes a irradiaccedilatildeo tampatildeo Hankacutes foi removido as ceacutelulas foram transferidas para as

placas de multipoccedilos com meio RPMI completo e levadas agrave estufa de CO2 por um periacuteodo de

24 horas Apoacutes este intervalo foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliaccedilatildeo

da viabilidade celular

Os dados encontrados atraveacutes do teste de MTT foram analisados utilizando o

programa Excel Microsoft 2003 e as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas no programa Prism

30 atraveacutes dos testes de anaacutelise de variacircncia (One-way Anova) sendo aplicado o poacutes-teste

Newman-Keuls


58

IV RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Este trabalho se baseia nos estudos para a utilizaccedilatildeo sineacutergica das espeacutecies

reativas de oxigecircnio (EROs) e das espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) geradas pelo

emprego de um agente fotossensibilizador claacutessico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de

rutecircnio Ru-tpy capaz de potencializar a accedilatildeo da Terapia Fotodinacircmica no tratamento de

ceacutelulas neoplaacutesicas

Realizamos o estudo destes faacutermacos associados agrave veiacuteculos de liberaccedilatildeo de origem

lipiacutedica como os lipossomas Neste trabalho escolheu-se os lipossomas de longo tempo de

circulaccedilatildeo (LLC) a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0525 mmolL-1 e

polietileno glicol (PEG) preparados pelo meacutetodo de injeccedilatildeo etanoacutelica conforme descrito na

seccedilatildeo III42

Sendo assim foi realizada inicialmente a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica do

sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy Aleacutem deste estudo foi realizada

a caracterizaccedilatildeo espectroscoacutepica da ZnPC em meio orgacircnico (etanol) e do complexo Ru-tpy

em tampatildeo fosfato para efeito de comparaccedilatildeo

Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Resultados e Discussatildeo

59

IV1 Estudos Fotofiacutesicos


do complexo Ru-tpy em meio homogecircneo e lipossomal

A escolha do faacutermaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na

investigaccedilatildeo preliminar dos paracircmetros fotofiacutesicos em soluccedilatildeo homogecircnea e nos sistemas

micro-heterogecircneos a serem utilizados em sua veiculaccedilatildeo in vitro e in vivo Tais sistemas satildeo

importantes pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais sendo este um

dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD Estes estudos

mimetizam ao maacuteximo os sistemas bioloacutegicos reais oferecendo assim a possibilidade de se

controlar a biodistribuiccedilatildeo e farmacocineacutetica dos sistemas quando administrados nos tecidos

tumorais e peritumorais

Com base nas consideraccedilotildees apresentadas na primeira etapa do trabalho foram

realizados estudos espectroscoacutepicos no estado fundamental (espectroscopia de absorccedilatildeo e de

emissatildeo de fluorescecircncia no estado estacionaacuterio) da ZnPC em etanol do complexo Ru-tpy em

tampatildeo fosfato e dos faacutermacos associados em meio lipossomal

Nas Figuras 9 e 10 respectivamente estatildeo apresentados os espectros de

absorccedilatildeo para a ZnPC (50 micromolL-1) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampatildeo fosfato

(500 micromolL-1)


60

Figura 9 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol

O espectro de absorccedilatildeo da ZnPC (50 micromolL-1) em etanol revelou um maacuteximo de

absorccedilatildeo na banda-Q do espectro em 666 nm Esta banda estaacute localizada dentro da janela

terapecircutica (600-800 nm) regiatildeo maacutexima de penetraccedilatildeo tecidual reforccedilando desta forma a

ideacuteia de que este faacutermaco pode ser muito uacutetil para os estudos in vivo futuros (Nunes S M T

2003 Oliveira D M 2006)


61

Figura 10 Espectro de absorccedilatildeo do complexo Ru-tpy 50 micromolL-1 em tampatildeo fosfato pH=

74

Jaacute o perfil do espectro de absorccedilatildeo para o complexo Ru-tpy apresentou como

esperado uma banda em 356 nm atribuiacuteda como sendo uma banda Transferecircncia de Carga

Metal Ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOHNO+) Observou tambeacutem a banda

de TCML na regiatildeo do visiacutevel (500 nm) devido agrave transiccedilatildeo dπ(RuII)rarrπ(bdqi-COOH) Este

comportamento para o complexo nitrosilo de rutecircnio foi muito estudado (Oliveira et al 2004

de Lima et al 2005) e estaacute de acordo com a literatura (de Lima R G 2006)

Utilizamos tambeacutem a espectroscopia de fluorescecircncia para a caracterizaccedilatildeo das

propriedades fotofiacutesicas da Zinco ftalocianina (50 micromolL-1)


62

Figura 11 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia (excitaccedilatildeo fixa em 610 nm) da ZnPC (50

micromolL-1) em etanol

O espectro para a ZnPC sob excitaccedilatildeo de 610 nm demonstra o maacuteximo de emissatildeo de

fluorescecircncia 682 nm coerente com dados jaacute relatados na literatura (Tedesco Rotta e

Lunardi 2003 Oliveira et al 2006)

No entanto ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda

distintos 355nm e 532 nm natildeo observamos uma emissatildeo de fluorescecircncia Este

comportamento foi observado tambeacutem para outros nitrosilos de rutecircnio como discutido por

Sauaia et al 2005 (Sauaia et al 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al 2004)

Os perfis espectrocoacutepicos de absorbacircncia e emissatildeo de fluorescecircncia para a associaccedilatildeo

lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram tambeacutem avaliados e discutidos a seguir

Os sistemas lipossomais estudados satildeo compostos de DPPC col PEG na

concentraccedilatildeo de 11607 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina col = colesterol e PEG =

polietileno glicol)

A figura 12 mostra os espectros de absorccedilatildeo da ZnPC do complexo Ru-tpy e da

associaccedilatildeo dos dois compostos em meio lipossomal


63

10

08

06

04

02

00

Abs

orbacirc

ncia

800700600500400300

Comprimento de onda (nm)

Figura 12 Espectro de absorccedilatildeo em meio lipossomal da ZnPC (minus) do complexo Ru-tpy (minus) e

dos dois compostos associados (minus)

Podemos observar que apoacutes a associaccedilatildeo dos faacutermacos no sistema lipossomal natildeo

houve mudanccedilas na posiccedilatildeo dos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e emissatildeo maacutexima dos

faacutermacos estudados nem tatildeo pouco mudanccedilas em seus perfis espectrais

A espectroscopia de absorccedilatildeo dos faacutermacos associados no sistema lipossomal tambeacutem

natildeo revela a presenccedila de diacutemeros ou agregados superiores para a faixa das concentraccedilotildees

estudadas (para ZnPC 50 micromolL-1 e para o complexo 500 micromolL-1) Um perfil espectral com

bandas finas de absorccedilatildeo centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena

em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy idecircntico ao observado em

soluccedilatildeo homogecircnea confirma que natildeo houve mudanccedilas nas propriedades espectrais dos

mesmos apoacutes sua incorporaccedilatildeo nesse sistema de liberaccedilatildeo


64


Este estudo eacute realizado apenas para analisar o tamanho das partiacuteculas formadas

determinando uma caracteriacutestica particular do sistema de veiculaccedilatildeo preparado A anaacutelise da

distribuiccedilatildeo do tamanho da ZnPC do complexo Ru-tpy e da associaccedilatildeo dos dois compostos

em meio lipossomal foi realizada no Laboratoacuterio de Tecnologia Farmacecircutica da

FCFRPUSP da Profordf Dordf Maria Vitoacuteria Lopes Badra Bentley em um equipamento adquirido

junto ao grupo Multiusuaacuterio do qual fazemos parte

A teacutecnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterizaccedilatildeo dos

lipossomos os quais devem apresentar dimensotildees nanomeacutetricas









determinaccedilotildees para cada anaacutelise

O tamanho das partiacuteculas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento

dinacircmico da luz Neste experimento o equipamento utiliza um laser modulado e mede o

deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partiacuteculas e realiza em meacutedia vinte e duas

medidas para cada amostra analisada

A teacutecnica de determinaccedilatildeo do tamanho a partir do diacircmetro hidrodinacircmico de

partiacuteculas por espalhamento de luz se baseia na anaacutelise do movimento Browniano de

partiacuteculas que eacute representado por uma funccedilatildeo de correlaccedilatildeo (G) com decaimento exponencial

conforme descrito pela equaccedilatildeo 5


65


Onde A eacute a linha de base B eacute o intercepto para a funccedilatildeo de correlaccedilatildeo

ΓΓΓΓ = Dq2 sendo D o coeficiente de difusatildeo translacional q = (4 π n λo) sin (θ 2) sendo n o

iacutendice de refraccedilatildeo da soluccedilatildeo λλλλo o comprimento de onda do laser θθθθ o acircngulo da luz

espalhada e ττττ eacute o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlaccedilatildeo

O tamanho meacutedio eacute entatildeo calculado a partir da funccedilatildeo de correlaccedilatildeo utilizando-se

vaacuterios algoritmos presentes no software do equipamento Em nosso trabalho utilizamos o

algoritmo CONTIN mais satisfatoacuterio para distribuiccedilotildees dentro do intervalo de tamanho

esperado

A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partiacuteculas encontrado nas amostras

analisadas

( ) ( )[ ]ττ Γminus+= 2exp1 BAG


66

Tabela I - Tamanho das partiacuteculas

Lipossoma Tamanho de partiacutecula (nm)

Vazio 66

ZnPC 78

Ru-tpy 72

ZnPCRu-tpy 82

Os resultados obtidos demonstram um diacircmetro meacutedio de 745 nm para os lipossomas

Entretanto ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPCRu-tpy Este

efeito eacute esperado uma vez que deve se considerar a associaccedilatildeo de duas moleacuteculas no mesmo

sistema de liberaccedilatildeo Apesar disto este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa

que permite uma interaccedilatildeo celular e sua interiorizaccedilatildeo


Ru-tpy em meio lipossomal

Nos estudos de emissatildeo de fluorescecircncia apresentados na figura 13 observa-se

somente uma diminuiccedilatildeo da intensidade de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC apoacutes sua

associaccedilatildeo ao complexo


67

20x106

15

10

05

00

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scecircn

cia

800780760740720700680660640


Figura 13 Espectro de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (minus)e associada ao complexo Ru-

tpy (minus) em meio lipossomal

Diante destes resultados achamos interessante observar qual a interferecircncia do

complexo de rutecircnio na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC analisando tambeacutem o valor do

rendimento quacircntico de fluorescecircncia do sistema lipossomal misto (ZnPCRu-tpy)

A reduccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia da ZnPC em meio lipossomal apoacutes a

associaccedilatildeo com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressatildeo induzida

pelo complexo de rutecircnio

Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interaccedilatildeo da ZnPC com

o complexo Ru-tpy natildeo leve a mudanccedilas draacutesticas no perfil e comportamento de absorccedilatildeo o

mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC levando a uma reduccedilatildeo do

tempo de vida da mesma


68


tpy em meio lipossomal

A supressatildeo da intensidade de fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo Ru-tpy foi

monitorada pela medida da intensidade de fluorescecircncia com excitaccedilatildeo fixa em 610 nm em

funccedilatildeo do aumento de concentraccedilatildeo do complexo de rutecircnio na faixa de concentraccedilatildeo (0 a

500 micromolL-1) (Figura 14)

Figura 14 Efeitos da supressatildeo na emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC (50 micromolL-1)

conforme adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy em meio lipossomal na faixa de concentraccedilatildeo

crescente (0 a 500 micromolL-1)

Os dados obtidos agrave partir dos experimentos no estado estacionaacuterio foram analisados






69

fluoroacuteforo ZnPC na ausecircncia do supressor [Q] eacute a concentraccedilatildeo do supressor e Ksv = kq τ0 eacute

a constante de supressatildeo de Stern-Volmer (Lehrer 1971)




Figura 15 Graacutefico de Stern-Volmer para a supressatildeo da fluorescecircncia da ZnPC conforme

adiccedilatildeo do complexo Ru-tpy (R2 = 0982964)

A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 57934 mol-1L de acordo com ajuste

linear mostrado na figura 15 Com este valor conseguimos calcular a constante de supressatildeo

kq deste sistema pela equaccedilatildeo 1 mostrada acima

O kq obtido foi de 19 x 1012 mol-1L s-1 sugerindo uma grande capacidade de supressatildeo

da fluorescecircncia da ZnPC pelo complexo de rutecircnio Para efeito de comparaccedilatildeo calculamos o

kq do supressor AQS- (910-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de


70

supressatildeo de fluorescecircncia da ZnPC em suspensatildeo lipossomal realizado anteriormente

(Nunes S M 1999) O kq obtido por este supressor AQS- foi de 367 x 1010 mol-1Ls-1

Pela anaacutelise dos espectros de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC no sistema lipossomal

misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados observamos que o

complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS-

confirmando portanto este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPCRu-tpy)

Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquiacutemicos que

sugerem um possiacutevel processo de transferecircncia de eleacutetron da interaccedilatildeo da ZnPC com o

complexo Ru-tpy A Figura 16 apresenta um voltamograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10

mmolL-1) em tampatildeo fosfato (100 mmolL-1) usando NaBF4 (01 molL-1) como eletroacutelito

suporte Podemos observar duas curvas catoacutedicas reversiacuteveis em -013 V e -060 V (vs

AgAgCl) atribuiacutedas agrave reduccedilatildeo do NO0NO+ e NO0NO- respectivamente estando de acordo

com a literatura (Sauaia et al 2005a) A liberaccedilatildeo de NO pelo complexo Ru-tpy foi tambeacutem

comprovada pela detecccedilatildeo de NO in situ quando uma soluccedilatildeo aquosa do complexo Ru-tpy foi

submetida a um potencial de eletroacutelise de -020 V vs AgAgCl O experimento foi realizado

sob atmosfera de argocircnio para minimizar reaccedilotildees secundaacuterias envolvendo o consumo de NO

livre O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletroacutelise foi iniciada e estaacute

apresentado no inserto da Figura 16 indicando a presenccedila de NO livre


71

Figura 16 Voltanograma ciacuteclico do complexo Ru-tpy (10 mmolL-1) em 10 molL-1 de

tampatildeo fosfato (pH 74) (As setas indicam o comeccedilo e a direccedilatildeo) O inserto eacute o

cronoamperograma de liberaccedilatildeo do NO controlada pelo potencial de eletroacutelise em

-02 V vs AgAgCl da soluccedilatildeo do complexo Ru-tpy

Desta forma o mecanismo de supressatildeo do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o

estado singlete excitado da ZnPC Estima-se que energia da banda Q da ZnPC eacute de 181 eV

Levando em consideraccedilatildeo que o estado fundamental da ZnPCZnPC+ tem um potencial de

oxidaccedilatildeo de +080 V vs AgAgCl (Ma et al 2007) foi estimado que a variaccedilatildeo de potencial

para 1ZnPC foi -100 eV para o estado singlete Para o complexo de rutecircnio

[Ru(NHNHq)(tpy)NO+]3+[Ru(NHNHq)(tpy)NO0]2+ seu potencial de reduccedilatildeo eacute -013 V vs

AgAgCl Desta forma a ZnPC deve reduzir facilmente o NO como descrito na equaccedilatildeo 6


72

1ZnPC + [Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ rarr ZnPC +[Ru(H2O)(NHNHq)(tpy)]2++ NO0


Portanto o mecanismo descrito de transferecircncia de eleacutetron eacute o principal responsaacutevel

pela interaccedilatildeo do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy Sabemos ainda

que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificaccedilatildeo de oxigecircnio

singlete deste sistema reforccedila a ideacuteia de que algum processo de energia estaacute ocorrendo entre

3ZnPC e o oxigecircnio molecular do meio liberando 1O2

IV15 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia (ΦΦΦΦf) da ZnPC e de sua

associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal

As medidas das propriedades de fluorescecircncia de uma moleacutecula (espectro de

fluorescecircncia espectro de excitaccedilatildeo rendimento quacircntico e tempo de vida de fluorescecircncia)

satildeo importantes para o entendimento da fotoquiacutemica e fotofiacutesica das espeacutecies no estado

excitado singlete

A absorccedilatildeo de um foacuteton de luz por uma moleacutecula no estado fundamental (So) promove

seus eleacutetrons aos estados excitados singletes mais energeacuteticos (Sn) de onde os mesmos

podem retornar para o estado fundamental por vaacuterios processos radiativos e natildeo radiativos A

razatildeo entre os nuacutemeros de foacutetons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo

radiativo (denominado fluorescecircncia) e o nuacutemero total de foacutetons absorvidos define um

paracircmetro fotofiacutesico denominado rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) (Turro 1978)

O rendimento quacircntico de fluorescecircncia (Φf) pode ser definido como (Lakowicz

1999)


73

volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nordm

volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moleacuteculas de ordmn=Φ f


Esse paracircmetro fotofiacutesico nos fornece a relaccedilatildeo entre a quantidade de moleacuteculas que

efetivamente fluorescem (nF) em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de moleacuteculas que foram

eletronicamente excitadas (Nexc)

exc

F

fN

n=Φ (Equaccedilatildeo 8)

O nuacutemero de moleacuteculas excitadas eacute em princiacutepio equivalente ao nuacutemero de foacutetons

incidentes e absorvidos

Nas medidas experimentais de Φf eacute necessaacuterio que haja uma correccedilatildeo preacutevia do

espectro de emissatildeo do material ou o uso de um padratildeo que apresente propriedades

semelhantes agraves da espeacutecie em anaacutelise (o espectro de emissatildeo da amostra deve apresentar a

mesma faixa do de emissatildeo do padratildeo) (DemasCrosby 1971)

Os Φf geralmente satildeo determinados de forma relativa agraves propriedades previamente

definidas para um composto padratildeo (DemasCrosby 1971) conforme descrito na parte

experimental (seccedilatildeo III46)

Uma vez que a TFD eacute altamente dependente da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) o

Φf eacute uma propriedade fotofiacutesica de grande importacircncia para os FSs uma vez que interfere

diretamente na desativaccedilatildeo deste estado Compostos altamente fluorescentes usualmente satildeo

pouco eficientes como agentes fotodinacircmicos uma vez que a desativaccedilatildeo do estado singlete

excitado leva a baixa a produccedilatildeo de estados excitados tripletes formados pelo processo de

cruzamento intersistemas o que resulta em baixos processos de transferecircncia de energia entre

o estado excitado triplete e o oxigecircnio produzindo 1O2 Assim os baixos valores de Φf

encontrados contribuem para a formaccedilatildeo dos estados excitados tripletes e portanto a

produccedilatildeo o 1O2


74

Utilizamos como padratildeo uma soluccedilatildeo de ZnPC em etanol (Φf = 028) conforme

descrito por Oliveira 2006 (Oliveira et al 2006)

O meacutetodo utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton 1988b

Eaton 1988a) onde o rendimento quacircntico de uma amostra desconhecida eacute dado em relaccedilatildeo a

um padratildeo como demonstrado na Equaccedilatildeo 9

padratildeo

amostra

padratildeo

amostra

padratildeo

padratildeo

amostraamostra x

n

nx

aAbsorbacircnci

aAbsorbacircncix

Area

Areaφφ =



refraccedilatildeo do solvente (DemasCrosby 1971)

As absorbacircncias no comprimento de onda de excitaccedilatildeo foram mantidas em

aproximadamente 001 minimizando a influecircncia da concentraccedilatildeo que pode atuar como um

filtro interno Todas as aacutereas sob os espectros de emissatildeo foram determinadas a partir dos

espectros de fluorescecircncia corrigidos Houve o cuidado para que todas as condiccedilotildees

experimentais fossem idecircnticas como temperatura equipamento caminho oacuteptico etc

A Tabela II a seguir demonstra os resultados

Tabela II - Rendimentos Quacircnticos de Fluorescecircncia (Φf)

Amostra

ΦΦΦΦf

ZnPC em etanol a 028

ZnPC em lipossoma a 013

ZnPCRu-tpy em

lipossoma

005

a (Oliveira et al 2006)


75

Pode-se observar que o rendimento quacircntico de fluorescecircncia do fotossensibilizador

ZnPC diminui apoacutes sua incorporaccedilatildeo no sistema lipossomal comparando esse resultado com

meio orgacircnico homogecircneo (Oliveira et al 2006) Esta diminuiccedilatildeo se torna ainda maior

quando a ZnPC estaacute associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma observando-se uma

diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de fluorescecircncia da ZnPC de 40 comparado com o valor

sem a associaccedilatildeo Este comportamento eacute confirmado no estudo de supressatildeo da fluorescecircncia

da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente

Um menor rendimento quacircntico de fluorescecircncia pode implicar em um maior

rendimento quacircntico de produccedilatildeo de estado excitado triplete de onde se originam os

processos de fotossensibilizaccedilatildeo responsaacuteveis pela morte das ceacutelulas malignas

No entanto embora ainda mais baixos os valores do Φf encontrados permitem que o

sistema apresente fluorescecircncia uacutetil para fotodiagnoacutestico


da sua associaccedilatildeo ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal

O tempo de vida de uma substacircncia fluorescente representa o tempo meacutedio que esta

moleacutecula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental A natureza

precisa do decaimento de fluorescecircncia pode revelar detalhes sobre as interaccedilotildees do

fluoroacuteforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos

Esta informaccedilatildeo estaacute contida no espectro de emissatildeo resolvido no tempo Estes estudos

complementam a caracterizaccedilatildeo do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado

ao complexo de rutecircnio

Dentre os meacutetodos disponiacuteveis para se medir os decaimentos de fluorescecircncia um dos

mais usados eacute o meacutetodo de contagem simples de foacutetons Neste meacutetodo a amostra eacute excitada


76

por um flash de luz e em seguida um sistema de detecccedilatildeo mede o tempo entre este pulso e a

chegada do primeiro foacuteton agrave fotomultiplicadora (Phillips e OConnor 1984)

O tempo de vida do estado excitado eacute derivado das curvas de decaimento que mostram

os decaimentos de fluorescecircncia ajustados bem como os desvios e resiacuteduos meacutedios Nas

curvas de decaimento de fluorescecircncia a intensidade de luz decresce com o tempo apoacutes a

remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo Para a ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em meio

lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17

O comprimento de onda de excitaccedilatildeo utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi

de 633 nm enquanto a emissatildeo de fluorescecircncia foi monitorada a 680 nm Para cada medida

de decaimento foram coletadas em meacutedia 10000 contagens




remoccedilatildeo da luz de excitaccedilatildeo A curva de decaimento obtida estaacute apresentada na Figura 17


77

Figura 17 Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (50

micromolL-1) associado ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em lipossoma O Inserto abaixo da

figura representa o resiacuteduo meacutedio

Os tempos de vida dos decaimentos estatildeo sumarizados na Tabela III


78

Tabela III - Tempos de vida de fluorescecircncia (τs) Amplitude relativa (A) para o

fotossensibilizador ZnPC em meio homogecircneo meio lipossomal e associado ao complexo

Ru-tpy

Sistemas ττττ1 (ns) A1 ττττ2 (ns) A2

ZnPC em etanola 400 plusmn 002 100 - -

ZnPC em lipossomaa 309 plusmn 006 472 094 plusmn 003 528

ZnPC Ru-tpy 319plusmn 004 720 091 plusmn 002 280


Quando incorporado ao lipossoma o decaimento cineacutetico de fluorescecircncia da ZnPC

apresenta uma cineacutetica biexponencial O decaimento biexponencial observado estaacute

relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal Assim os dois tempos de vida

encontrados para a ZnPC em meio lipossomal satildeo atribuiacutedas as moleacuteculas de ZnPC

localizadas em diferentes ambientes quiacutemicos de acordo com Oliveira 2006 (Oliveira et al

2006) Resultados similares tecircm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores tais

como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogecircneos (Balasubramaniam

e Natarajan 1997 Viswanathan e Natarajan 1996) A presenccedila do complexo Ru-tpy natildeo

provocou alteraccedilatildeo significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal

apresentou tambeacutem um segundo tempo de vida permanecendo a cineacutetica de decaimento do

tipo biexponencial Houve mudanccedila na populaccedilatildeo relativa de cada estado excitado o que estaacute

de acordo com o esperado considerando uma redistribuiccedilatildeo do fotossensibilizador com a

adiccedilatildeo de mais uma espeacutecie

Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio

em que a mesma se encontra Isto eacute confirmado pela diferenccedila entre os tempos de vida obtidos

para o meio homogecircneo (etanol)


79

Na sequumlecircncia dos estudos de caracterizaccedilatildeo dos estados excitados estaacute o estudo do

comportamento do estado excitado triplete

IV17 Estudos dos estados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser

A accedilatildeo fotodinacircmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas bioloacutegicos envolve

principalmente o primeiro estado excitado triplete (T1) do FS que eacute formado pelo cruzamento

intersistema do estado excitado singlete de vida curta inicialmente produzido pela absorccedilatildeo

da energia radiante A fotossensibilizaccedilatildeo celular ocorre devido a reaccedilatildeo desta espeacutecie

excitada (T1) com o oxigecircnio molecular usualmente presente no meio gerando oxigecircnio

singlete (Spikes 1986)

Entretanto cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas natildeo se limita apenas agrave

produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (1O2) como espeacutecies reativas de oxigecircnio A absorccedilatildeo de

eleacutetrons fotoinduzida por biomoleacuteculas apropriadas levam a reaccedilotildees de transferecircncia de

eleacutetrons ou abstraccedilatildeo de hidrogecircnio de moleacuteculas bioloacutegicas que resultam na produccedilatildeo de

radicais livres que podem atuar simultaneamente com a produccedilatildeo de oxigecircnio singlete

(processo do Tipo II) (Viola et al 1998)e tambeacutem com a produccedilatildeo de outras espeacutecies reativas

de oxigecircnio (EROs processos do Tipo I) Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando

na produccedilatildeo de mais de um tipo de espeacutecies excitadas

Segundo Rotta et al 2003 (Rotta Lunardi e Tedesco 2003)apoacutes a irradiaccedilatildeo a ZnPC

estaacute no seu estado triplete e pelo processo de transferecircncia de eleacutetrons pode formar o acircnion

radical ZnPC- que pode sua vez doa seu eleacutetron para o dioacutexido de hidrogecircnio produzindo

acircnion radical superoacutexido (O2-) A fotossensibilizaccedilatildeo tambeacutem pode gerar a formaccedilatildeo radical

hidroxila (OH) pela reduccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (Equaccedilotildees 10-14)


80

ZnPC + hν rarr 1ZnPC rarr 3ZnPC Equaccedilatildeo (10)

3ZnPC + ZnPC rarr ZnPCbull minus + ZnPCbull+ Equaccedilatildeo (11)

ZnPCbull minus + O2 rarr ZnPCbull+ + O2

bull minus Equaccedilatildeo (12)

O2 bull minus + O2

bull minus + 2H+ rarr H2O2 + O2

Equaccedilatildeo (13)

ZnPCbull minus + H2O2 rarr ZnPC + bullOH + OH - Equaccedilatildeo (14)

Dentre as teacutecnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorccedilatildeo

ou emissatildeo de um intermediaacuterio reacional de vida curta a teacutecnica de fotoacutelise por pulso de

laser eacute uma das mais utilizadas (Oliveira et al 2006 Pelegrino et al 2005 Simioni et al

2008) Esta teacutecnica eacute usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de

transientes oriundos de estados eletronicamente excitados

Nesta teacutecnica uma grande populaccedilatildeo de moleacuteculas do estado fundamental eacute promovida

para os estados excitados singletes superiores por um pulso raacutepido de luz de alta intensidade

Apoacutes o disparo do laser as moleacuteculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem

cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T1)

A diferenccedila baacutesica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado

excitado triplete - eacute que no estado excitado triplete as moleacuteculas apresentam uma vida meacutedia

mais longa (da ordem de micros a ms) podendo interagir com outras espeacutecies ou retornar ao

estado fundamental por emissatildeo de luz por um processo conhecido como fosforescecircncia Em

soluccedilatildeo homogecircnea a probabilidade e a eficiecircncia do processo de fotossensibilizaccedilatildeo

dependem de vaacuterios paracircmetros fotofiacutesicos tais como o rendimento quacircntico do estado

excitado triplete e sua velocidade de decaimento ou a transferecircncia de energia para o

oxigecircnio molecular solubilizado no meio

O espectro de absorccedilatildeo do transiente gerado por fotoacutelise por pulso de laser natildeo fornece

um valor absoluto para a absorbacircncia obteacutem-se na verdade a diferenccedila da absorccedilatildeo entre o

precursor e o transiente formado


81

Assim o espectro de absorccedilatildeo do transiente eacute dependente da concentraccedilatildeo do

precursor na regiatildeo onde este absorve e um valor negativo encontrado para a diferenccedila de

absorbacircncia (∆DO) corresponde a formaccedilatildeo de um intermediaacuterio com uma absortividade

menor que a do precursor ou seja o desaparecimento da absorccedilatildeo do espectro de partida no

estado estacionaacuterio

Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-

tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotoacutelise por pulso de laser como descrito

na sessatildeo III48 Os experimentos foram realizados na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-1 para a

ZnPC e 500 micromolL-1 para o complexo

Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τT) dos faacutermacos foram calculados

atraveacutes da anaacutelise cineacutetica das curvas de decaimento dos transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo

do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do proacuteprio aparelho

como mostrado na figura 18


82

Figura 18 Espectro de absorccedilatildeo do transiente obtido atraveacutes do meacutetodo de fotoacutelise por pulso

de laser da ZnPC (50 micromolL-1) associada ao complexo Ru-tpy (500 micromolL-1) em meio

lipossomal apoacutes excitaccedilatildeo por pulso de laser em 355 nm mostrando a absorccedilatildeo maacutexima do

triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado

fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm A curva de decaimento dos

transientes no maacuteximo da absorccedilatildeo triplete em 480 estaacute mostrada no inserto

Os tempos de vida obtidos estatildeo mostrados na Tabela IV


83

Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τt) Amplitude relativa (A) para o

fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy

Sistemas ττττt ( micromicromicromicros )

ZnPC em lipossoma 083

ZnPCRu-tpy 027

Os resultados obtidos atraveacutes dos experimentos de fotoacutelise por pulso de laser sugerem

que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida A diminuiccedilatildeo no tempo de

vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressatildeo do estado excitado

singlete da ZnPC na presenccedila do complexo Ru-tpy Este resultado estaacute de acordo com os

resultados de emissatildeo de fluorescecircncia para o sistema misto previamente descrito

Embora o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao

complexo de rutecircnio no sistema lipossomal tenha sido menor este tempo mostrou-se ser

suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigecircnio molecular

presente no meio produzindo oxigecircnio singlete ou outras espeacutecies reativas de oxigecircnio

(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinacircmica como seraacute mostrada nos estudos in

vitro

IV18 Determinaccedilatildeo do rendimento quacircntico de produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (ΦΦΦΦ∆∆∆∆)

A determinaccedilatildeo deste paracircmetro espectroscoacutepico eacute muito importante pois quantifica a

produccedilatildeo de uma das principais espeacutecies reativas responsaacutevel pela destruiccedilatildeo da ceacutelula

tumoral o oxigecircnio singlete 1O2 Esta espeacutecie em conjunto com outras espeacutecies radicalares

promovem uma seacuterie de processos foto-oxidativos em siacutetios endoacutegenos situados tanto no

citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipiacutedica (lipiacutedios proteiacutenas etc)

desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os

84

estudos fotoquiacutemicos e fotofiacutesicos envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo

fotodinacircmico

Assim um grande nuacutemero de investigaccedilotildees tem sido realizado em meio aquoso e

microheterogecircneo (Oliveira et al 2006 Spiller 1998) Para a determinaccedilatildeo do rendimento

quacircntico de oxigecircnio singlete (Φ∆) produzido pela ZnPC em meio homogecircneo lipossomal e

associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o meacutetodo fotofiacutesico que consiste na medida da

intensidade de luminescecircncia na regiatildeo do infravermelho (1270 nm) da espeacutecie gerada O Φ∆

determinado atraveacutes da intensidade do sinal de luminescecircncia do oxigecircnio singlete pode ser

determinado pela Equaccedilatildeo 2 (Spiller 1998)

Φ∆ = ( I Iref ) Φ∆ref ( τ∆ref τ∆ ) (Equaccedilatildeo 2)

onde I eacute a intensidade do sinal de luminescecircncia τ∆ eacute o tempo de vida do oxigecircnio singlete e

o subscrito ref se refere agrave substacircncia padratildeo

Nos estudos de determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oxigecircnio singlete o composto utilizado

como padratildeo foi o feoforbide-a pois este apresenta um alto rendimento quacircntico de oxigecircnio

singlete (Φ∆= 059)

Os tempos de vida do oxigecircnio singlete foram medidos pela transferecircncia de energia

entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigecircnio molecular presente no

meio Em todos os casos a intensidade maacutexima de fosforescecircncia no tempo t = 0 foi

determinada pela regressatildeo exponencial e os tempos de vida de 1O2 foram determinados pelo

tratamento do ajuste da curva Os valores dos rendimentos quacircnticos de produccedilatildeo do oxigecircnio

singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou natildeo ao complexo Ru-tpy

estatildeo apresentados na Tabela V


85

Tabela V - Valores de rendimento quacircntico de produccedilatildeo do oxigecircnio singlete

Amostras ΦΦΦΦ∆∆∆∆

Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065

ZnPC em lipossomaa 023

ZnPCRu-tpy 016


De acordo com os dados na Tabela V pode-se observar que o rendimento quacircntico de

oxigecircnio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada

aos lipossomas Portanto haacute uma diminuiccedilatildeo do rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete

produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas devido ao fato de que com a

distribuiccedilatildeo do fotossensibilizador no lipossoma sua concentraccedilatildeo local na bicamada lipiacutedica

pode aumentar e por conseguinte as colisotildees das moleacuteculas do fotossensibilizador entre si

levando a uma supressatildeo das moleacuteculas no estado excitado (Oliveira D M 2006) Uma

outra explicaccedilatildeo eacute que uma vez gerado dentro do lipossoma o oxigecircnio singlete pode

rapidamente se difundir para outras regiotildees do sistema microheterogecircneo e ser suprimido e

gerar espeacutecies secundaacuterias (Roslaniec et al 2000)

Quando comparamos com os dados na literatura podemos observar que o resultado

obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy tambeacutem apresentou

uma diminuiccedilatildeo no rendimento quacircntico de oxigecircnio singlete em relaccedilatildeo ao rendimento

quacircntico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal Este resultado eacute bastante coerente com

os dados obtidos dos outros paracircmetros fotofiacutesicos como o Φf τs e τT1 em que o sistema misto

(ZnPC Ru-tpy ) apresenta uma diminuiccedilatildeo do valor quando o comparamos com os dados

obtidos para a ZnPC lipossomal sendo esperado portanto que o valor de Φ∆ fosse menor No

entanto continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidaccedilatildeo uacutetil para TFD


86

IV 19 Estudos de detecccedilatildeo de NO gerado por fotoacutelise de pulso a laser em 675 nm

Os experimentos de fotoacutelise por pulso de laser permitem a observaccedilatildeo das mudanccedilas

dos espectros de absorccedilatildeo que ocorre apoacutes agrave absorccedilatildeo da luz do pulso laser no intuito de

estudar a liberaccedilatildeo de NO dentro do processo de excitaccedilatildeo da ZnPC associada ao complexo

Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm

Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condiccedilotildees usuais utilizadas nos

estudos in vitro ou in vivo ou seja excitou com um laser contiacutenuo (CW) na regiatildeo visiacutevel do

espectro eletromagneacutetico

Concomitantemente acompanhou-se a liberaccedilatildeo in situ de NO gasoso pelo

acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada como descrito na sessatildeo III410

A variaccedilatildeo espectral na regiatildeo do UV-visiacutevel para o sistema durante a fotoacutelise em 675

nm representadas nas figuras 19 e 20

Pela Figura 19 podemos observar a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da Zinco

ftalocianina como jaacute era esperado em consequumlecircncia do seu processo de fotooxidaccedilatildeo


87

Figura 19 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 incorporadas em lipossomas sob

irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo

de 0 s a 150 s


88

Figura 20 Espectro de absorccedilatildeo da ZnPC 50 micromolL-1 e do complexo Ru-tpy (500 micromolL-1)

incorporados em lipossomas sob irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm na faixa total de energia de 0

J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s

No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPCRu-tpy) na Figura 20 observamos

novamente a diminuiccedilatildeo da banda em 670 nm da ZnPC e tambeacutem a reduccedilatildeo da banda TCML

(360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do complexo Ru-tpy em consequumlecircncia da saiacuteda de NO

gasoso Tais comportamentos espectroscoacutepicos satildeo justificaacuteveis diante dos experimentos

realizados por Rotta et al (Rotta Lunardi e Tedesco 2003) onde irradiou no comprimento de

onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteiacutena- Zinco ftalocianina (NacySNO-

ZnPC) em lipossoma e observou mudanccedilas das bandas de absorccedilatildeo na regiatildeo do ultra-violeta

em 300-350 nm e na regiatildeo do visiacutevel em 500-600 nm tendo comprovado a liberaccedilatildeo de NO

gasoso E de Lima 2006 (de Lima R G 2006) tambeacutem irradiou o complexo de rutecircnio

[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+ em 355 nm utilizado neste trabalho e observou a reduccedilatildeo da banda

TCML (360 nm) do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) tiacutepica da liberaccedilatildeo de NO pelo processo da

fotoacutelise


89

A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema

misto ZnPCRu-tpy (550 micromolL-1) durante a fotoacutelise em 675 nm sendo cada pulso de 25s e

10J de potecircncia

Figura 21 Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob

irradiaccedilatildeo do laser em 675 nm

A concentraccedilatildeo de NO gerado fotoquimicamente a partir do lipossoma contendo a

mistura ZnPCRu-tpy foi calculada pelos picos maacuteximos obtidos pelo cronoamperograma

apoacutes a irradiaccedilatildeo A partir dos pontos coletados obtivemos a concentraccedilatildeo meacutedia de NO

liberado de 027 micromolL-1

Assumindo que a irradiaccedilatildeo em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na

banda Q de transiccedilatildeo π ndashπ do fotossensibilizador no lipossoma contendo apenas a ZnPC

ocorreu uma diminuiccedilatildeo de 85 desta banda num tempo total de 100 s de irradiaccedilatildeo de 10 J

de energia com dose 318 Jcm2 Jaacute no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy

associados ocorre uma diminuiccedilatildeo de 65 dessa banda Os resultados demonstraram que a

excitaccedilatildeo do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutecircnio associados pode liberar NO

e 1O2 usando luz visiacutevel sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia

Fotodinacircmica


90

De acordo com os resultados fotofiacutesicos e fotoquiacutemicos ressaltamos novamente o

possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy envolvendo a

transferecircncia de eleacutetron do estado singlete excitado da ZnPC (equaccedilatildeo 16) para o complexo

Ru-tpy liberando NO (equaccedilatildeo 17) Desta forma como jaacute foi estabelecido que pode ocorrer

um processo de transferecircncia de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigecircnio

molecular do meio acarretaria assim na produccedilatildeo de oxigecircnio singlete (equaccedilatildeo 18)

Estes resultados demonstram que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma

ldquoantenardquo para o processo de transferecircncia de eleacutetron necessaacuterio para que o complexo de

rutecircnio libere o NO (de Lima R G 2006) Mostrando-nos uma situaccedilatildeo onde o complexo

nitrosilo de rutecircnio doador de NO atue claramente como um proacute-faacutermaco Aleacutem disso

considerando que a ZnPC um fotossensibilizador claacutessico possa agir no sistema pelos

mecanismos do tipo I e II para a produccedilatildeo de espeacutecies reativas (Foote 1991b) ocorre a

potencializaccedilatildeo da atividade fotodinacircmica pelo mecanismo de sinergismo (liberaccedilatildeo de NO e

1O2) como jaacute descrito de outras moleacuteculas fotossensibilizadoras (da Silva et al 2007)

ZnPC + hν rarr 1ZnPC (16)

1ZnPC+[Ru(NHNHq)(tpy)NO]3+rarr

0ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]2++NO0 (17)

1ZnPC (ISC) rarr 3ZnPC + 3O2 rarr 0ZnPC + 1O2 (18)

S = solvente ISC= cruzamento inter sistema


91




Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma para o complexo Ru-tpy

em lipossoma e para o sistema misto na ausecircncia de estiacutemulo luminoso foram feitos para

linhagens de ceacutelulas B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados

O tempo de incubaccedilatildeo utilizado na avaliaccedilatildeo da toxicidade celular foi de 3 horas pois

eacute o tempo ideal considerando que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador

ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubaccedilatildeo determinado pelo composto mais

fotossensiacutevel sem causar morte celular no escuro Neste caso nos orientamos pelo tempo de

incubaccedilatildeo jaacute determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira D M 2006) Os resultados

foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo meacutetodo do ldquoMTTrdquo (a

descriccedilatildeo detalhada desta metodologia foi apresentada na seccedilatildeo experimental item III22

Os resultados obtidos na avaliaccedilatildeo da toxicidade das ceacutelulas B16-F10 estatildeo

apresentados na figura 22 na forma de graacutefico de porcentagem da viabilidade celular em

funccedilatildeo dos sistemas utilizados


92

Figura 22 Porcentagem de ceacutelulas B16-F10 vivas apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo com as

formulaccedilotildees lipossomais estudadas 1= lipossoma vazio 2 = Ru-tpy 05 mmolL-1 em

lipossoma 3 = ZnPC 50 micromolL-1 em lipossoma e

4 = ZnPC Ru-tpy (50 micromolL-1 05 mmolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia estatiacutestica

das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way ANOVA seguido

do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (pgt 005 plt 005

plt001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3

Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1 2 e 3

com a viabilidade celular igual ou acima de 90 Entretanto para a combinaccedilatildeo sineacutergica da

ZnPC com 05 mmolL-l do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20

Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI


93

Tabela VI - Viabilidade celular apoacutes a incubaccedilatildeo por 3 horas com as formulaccedilotildees

lipossomais estudadas

Lipossoma Viabilidade Celular ()

ZnPC (50 micromolL-1) 93plusmn1

Ru-tpy (05 mmolL-1) 90plusmn2

ZnPC (50 micromolL-1 ) Ru-tpy

(05 mmolL-

77plusmn1

Portanto baseando-nos nestes resultados a fim de minimizar este efeito de

toxicidade do sistema misto (ZnPCRu-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade

utilizando uma concentraccedilatildeo do complexo Ru-tpy 10 vezes menor ou seja 500 micromolL-1

Sendo que esta concentraccedilatildeo foi a utilizada em toda caracterizaccedilatildeo fotofiacutesica e fotoquiacutemica do

sistema sineacutergico mostrada anteriormente


misto

Analisamos a seguir a fototoxicidade para a ZnPC (1 micromolL-1) em lipossoma e para

o sistema lipossomal misto variando-se a concentraccedilatildeo da ZnPC em 10 micromolL-1 e

50 micromolL-1 mantendo constante a concentraccedilatildeo do complexo Ry-pty 500 micromolL-1 Estes

estudos foram realizados como descrito na sessatildeo III24 e na presenccedila de luz com uma dose

de 05 Jcm2


94

Figura 23 Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para ceacutelulas B16-F10

1 = ZnPC 1 micromolL-1 em lipossoma 2 = ZnPCRu-tpy (1micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema

lipossomal 3 = ZnPCRu-tpy (5 micromolL-1 50 micromolL-1) no sistema lipossomal Significacircncia

estatiacutestica das diferentes formulaccedilotildees foi determinada pelo teste de variacircncia One-way

ANOVA seguido do poacutes-teste Newman-Keuls t-test para muacuteltiplas comparaccedilotildees (plt 005

plt 001) Cada SEM representa o desvio padratildeo (plusmn SD) para n = 3

Primeiramente na figura 23-A pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro

utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto apresentaram uma viabilidade

celular acima de 90 o que nos confirma que o sistema sineacutergico (ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-

1 500 micromolL-1) natildeo apresentou toxicidade para linhagem neoplaacutesica

Na figura 23-B pode-se observar que na presenccedila de luz o sistema lipossomal misto

(ZnPCRu-tpy) (50 micromolL-1 500 micromolL-1) mostrou uma alta capacidade em induzir morte

celular sob a irradiaccedilatildeo de luz (quase 95)


95

Este efeito apenas confirma nossa hipoacutetese de que o possiacutevel mecanismo de interaccedilatildeo

da ZnPC com o complexo de rutecircnio leva a uma formulaccedilatildeo onde o efeito sineacutergico das

espeacutecies produzidas induz a morte celular

Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciociacutenio permite uma melhor

accedilatildeo da TFD onde faacutermacos atuando sinergicamente produzindo espeacutecies reativas de

oxigecircnio (EROs) e as espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERONs) induzem in vitro uma

consideraacutevel morte celular apoacutes miacutenimas doses de luz pelo processo de fotossensibilizaccedilatildeo

(Tedesco Rotta e Lunardi 2003)


96

V CONCLUSOtildeES

Dentro da proposta do trabalho podemos destacar as seguintes conclusotildees

Pela anaacutelise das caracteriacutesticas espectroscoacutepicas da ZnPC e do complexo de rutecircnio

Ru-tpy pode-se observar que natildeo houve mudanccedila em seus perfis espectrais de absorccedilatildeo apoacutes

serem incorporados nos lipossomas Houve poreacutem houve uma reduccedilatildeo no perfil

espectroscoacutepico de emissatildeo de fluorescecircncia da ZnPC associada ao complexo de rutecircnio em

lipossoma resultantes de um processo de supressatildeo do primeiro estado excitado singlete da

ZnPC

Os rendimentos quacircnticos de fluorescecircncia (ΦF) da ZnPC e de sua associaccedilatildeo ao

complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados utilizando-se o meacutetodo relativo a

um composto padratildeo (ZnPC em etanol ΦF = 028) Pela anaacutelise dos dados pode-se observar

que houve a incorporaccedilatildeo da ZnPC no lipossoma e sua associaccedilatildeo ao complexo causaram

uma diminuiccedilatildeo no valor do ΦF

Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotoacutelise por pulso de laser os

resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes quando os comparamos aos dados da

literatura estes tempos diferentes sugerem a formaccedilatildeo de outras possiacuteveis espeacutecies reativas

pela associaccedilatildeo do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma

Nos estudos de fotoacutelise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em

meio lipossomal observou-se a diminuiccedilatildeo de sua banda em 670 nm cerca de 85 devido seu

processo de fotooxidaccedilatildeo apoacutes a irradiaccedilatildeo do laser Tal efeito tambeacutem foi observado no

estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal poreacutem essa diminuiccedilatildeo

foi de 65 ocorrendo tambeacutem a diminuiccedilatildeo da banda TCML do tipo dπ(RuII)rarrπ(NO) do

complexo Ru-tpy Este comportamento pode ser comprovado pela saiacuteda de NO gasoso

registrado no NOmeter

Dissertaccedilatildeo de Mestrado ndash D S Maranho Conclusotildees

97

Os estudos de citotoxicidade utilizando-se as linhagens B-16 F10 mostraram que a

incubaccedilatildeo destas ceacutelulas com o sistema misto ZnPCRu-tpy na concentraccedilatildeo de 50 micromolL-

1500 micromolL-1 foi a melhor combinaccedilatildeo encontrada para estes faacutermacos uma vez que

apresentaram uma viabilidade celular significativa No entanto sob accedilatildeo da luz nestas

mesmas condiccedilotildees pode-se observar uma alta atividade fotodinacircmica com uma diminuiccedilatildeo

bem significativa na viabilidade celular

Portanto a ideacuteia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a

produccedilatildeo das espeacutecies reativas EROs e ERONs pela combinaccedilatildeo da Zinco ftalocianina e do

complexo nitrosilo de rutecircnio nos mostrou ser bem eficiente na destruiccedilatildeo das ceacutelulas

neoplaacutesicas


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2







Orientador Prof Dr Antonio Claudio Tedesco






2008

3








4








5

DEDICATOacuteRIA















conquistas


6

AGRADECIMENTOS

A Deus




7

AGRADECIMENTOS









de alegria





Amo vocecirc





doida







8









infacircncia






demonstrou por mim





realizado

9

SUMAacuteRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi


I1 Cacircncer 1






II OBJETIVOS18


III1 Materiais 19


III3 Aparelhagem 22







partiacuteculas 27






10






31


32


675 nm 33








lipossomal misto 41






48




11









(Φ∆) 68


675 nm 70





misto 77




12

LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



36




45



46



47



51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

53






55


13





61










66




71





72



73






76





----------------------------------------------------------------------------

78


14

LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




tpy ----------------------------------------------------------------

67



69



77


15








HpD Hematoporfirina



















16

























17







18

RESUMO



















19

ABSTRACT



















20


I1 Cacircncer

























21


Lier 1999)






cacircncer

















22




























23






(Figura 1)






24





























25

















0F rarr 1F rarr 3F


26




substrato









0F rarr 1F rarr 3F




substrato









27



























28

















29





























30







al 1993)






Stuehr 1993)














31










Ignarro 2000)

















32

[Ru(terpy)(L)NO+]3+

HN

HN

COOH

NHNHq

RuIIL

N

NN

NO+

L

L=














et al 2005)






33



















34

















35

II OBJETIVOS






36


III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























38






















III3 Aparelhagem




39





caminho oacuteptico























40





























41
















III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





em 610 nm






2004)









microLh)


43










partiacuteculas










44





















45









onda fixo de 610 nm
















46

























47






quadrado (χ2)











mesmo foi de 480 nm




laser em 355 nm


48















∆

∆

∆∆ Φ=Φτ

τRef

Ref

RefI

I







49










3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3




50

















51
















52












53

)101(tI

nabs

s

























54




congeladas






















55
























56



















lipossomal misto







57













Newman-Keuls


58

















59


















(500 micromolL-1)


60








61


74










62














polietileno glicol)




63

10

08

06

04

02

00

Abs

orbacirc

ncia

800700600500400300















64




























65









esperado


analisadas



66



Vazio 66

ZnPC 78

Ru-tpy 72

ZnPCRu-tpy 82












67

20x106

15

10

05

00

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scecircn

cia

800780760740720700680660640















68
















69















70




















71













72













excitado singlete








1999)


73







exc

F

fN





















74






padratildeo

amostra

padratildeo

amostra

padratildeo

padratildeo

amostraamostra x

n

nx

aAbsorbacircnci

aAbsorbacircncix

Area

Areaφφ =











Amostra

ΦΦΦΦf



ZnPCRu-tpy em

lipossoma

005



75

























76
















77






78



Ru-tpy























79
























80





O2 bull minus + O2

























81















82









83





ZnPCRu-tpy 027











vitro








84


fotodinacircmico






















85



Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065


ZnPCRu-tpy 016





















86
















87



de 0 s a 150 s


88















fotoacutelise


89



10J de potecircncia














Fotodinacircmica


90





















91


















92













93







(05 mmolL-

77plusmn1







misto





de 05 Jcm2


94















95










96

V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















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neoplaacutesicas


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109



48 1998















p517-32 1998





110











Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


3








4








5

DEDICATOacuteRIA















conquistas


6

AGRADECIMENTOS

A Deus




7

AGRADECIMENTOS









de alegria





Amo vocecirc





doida







8









infacircncia






demonstrou por mim





realizado

9

SUMAacuteRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi


I1 Cacircncer 1






II OBJETIVOS18


III1 Materiais 19


III3 Aparelhagem 22







partiacuteculas 27






10






31


32


675 nm 33








lipossomal misto 41






48




11









(Φ∆) 68


675 nm 70





misto 77




12

LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



36




45



46



47



51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

53






55


13





61










66




71





72



73






76





----------------------------------------------------------------------------

78


14

LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




tpy ----------------------------------------------------------------

67



69



77


15








HpD Hematoporfirina



















16

























17







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RESUMO



















19

ABSTRACT



















20


I1 Cacircncer

























21


Lier 1999)






cacircncer

















22




























23






(Figura 1)






24





























25

















0F rarr 1F rarr 3F


26




substrato









0F rarr 1F rarr 3F




substrato









27



























28

















29





























30







al 1993)






Stuehr 1993)














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Ignarro 2000)

















32

[Ru(terpy)(L)NO+]3+

HN

HN

COOH

NHNHq

RuIIL

N

NN

NO+

L

L=














et al 2005)






33



















34

















35

II OBJETIVOS






36


III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























38






















III3 Aparelhagem




39





caminho oacuteptico























40





























41
















III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





em 610 nm






2004)









microLh)


43










partiacuteculas










44





















45









onda fixo de 610 nm
















46

























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quadrado (χ2)











mesmo foi de 480 nm




laser em 355 nm


48















∆

∆

∆∆ Φ=Φτ

τRef

Ref

RefI

I







49










3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3




50

















51
















52












53

)101(tI

nabs

s

























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congeladas






















55
























56



















lipossomal misto







57













Newman-Keuls


58

















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(500 micromolL-1)


60








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74










62














polietileno glicol)




63

10

08

06

04

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00

Abs

orbacirc

ncia

800700600500400300















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esperado


analisadas



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Vazio 66

ZnPC 78

Ru-tpy 72

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67

20x106

15

10

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Inte

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ade

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cia

800780760740720700680660640















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1999)


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exc

F

fN





















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padratildeo

amostra

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amostra

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n

nx

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Amostra

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005



75

























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77






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Ru-tpy























79
























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O2 bull minus + O2

























81















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ZnPCRu-tpy 027











vitro








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fotodinacircmico






















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Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065


ZnPCRu-tpy 016





















86
















87



de 0 s a 150 s


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fotoacutelise


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Fotodinacircmica


90





















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77plusmn1







misto





de 05 Jcm2


94















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V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















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neoplaacutesicas


98






p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


v95 p11 1991






FMRP-USP 2007






99








2005



p1075-79 2001


p1862-65 1992









100













Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


101














1986






102



v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




103













Pigments v72 n2 p267-70 2007




v293 p293-97 2005





104





1983












p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


105


















2007





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1998







Academic Press 1984











Press 1992


107














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109



48 1998















p517-32 1998





110











Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


4








5

DEDICATOacuteRIA















conquistas


6

AGRADECIMENTOS

A Deus




7

AGRADECIMENTOS









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Amo vocecirc





doida







8









infacircncia






demonstrou por mim





realizado

9

SUMAacuteRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi


I1 Cacircncer 1






II OBJETIVOS18


III1 Materiais 19


III3 Aparelhagem 22







partiacuteculas 27






10






31


32


675 nm 33








lipossomal misto 41






48




11









(Φ∆) 68


675 nm 70





misto 77




12

LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



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45



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47



51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

53






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13





61










66




71





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LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




tpy ----------------------------------------------------------------

67



69



77


15








HpD Hematoporfirina



















16

























17







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RESUMO



















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ABSTRACT



















20


I1 Cacircncer

























21


Lier 1999)






cacircncer

















22




























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(Figura 1)






24





























25

















0F rarr 1F rarr 3F


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substrato









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substrato









27



























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29





























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Stuehr 1993)














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Ignarro 2000)

















32

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HN

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L

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et al 2005)






33



















34

















35

II OBJETIVOS






36


III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























38






















III3 Aparelhagem




39





caminho oacuteptico























40





























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III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





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2004)









microLh)


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partiacuteculas










44





















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I







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50

















51
















52












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congeladas






















55
























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lipossomal misto







57













Newman-Keuls


58

















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(500 micromolL-1)


60








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74










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polietileno glicol)




63

10

08

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Abs

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ncia

800700600500400300















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esperado


analisadas



66



Vazio 66

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67

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15

10

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fotodinacircmico






















85



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86
















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V CONCLUSOtildeES







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p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


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FMRP-USP 2007






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p1075-79 2001


p1862-65 1992









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Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


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1986






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v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




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Pigments v72 n2 p267-70 2007




v293 p293-97 2005





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p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


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Academic Press 1984











Press 1992


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v8 p3208-15 2008

















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p517-32 1998





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Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


5

DEDICATOacuteRIA















conquistas


6

AGRADECIMENTOS

A Deus




7

AGRADECIMENTOS









de alegria





Amo vocecirc





doida







8









infacircncia






demonstrou por mim





realizado

9

SUMAacuteRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi


I1 Cacircncer 1






II OBJETIVOS18


III1 Materiais 19


III3 Aparelhagem 22







partiacuteculas 27






10






31


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675 nm 33








lipossomal misto 41






48




11









(Φ∆) 68


675 nm 70





misto 77




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LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



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45



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47



51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

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LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




tpy ----------------------------------------------------------------

67



69



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HpD Hematoporfirina



















16

























17







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RESUMO



















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ABSTRACT



















20


I1 Cacircncer

























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Lier 1999)






cacircncer

















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(Figura 1)






24





























25

















0F rarr 1F rarr 3F


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substrato









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substrato









27



























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Stuehr 1993)














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Ignarro 2000)

















32

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HN

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COOH

NHNHq

RuIIL

N

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NO+

L

L=














et al 2005)






33



















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II OBJETIVOS






36


III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























38






















III3 Aparelhagem




39





caminho oacuteptico























40





























41
















III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





em 610 nm






2004)









microLh)


43










partiacuteculas










44





















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onda fixo de 610 nm
















46

























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quadrado (χ2)











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∆

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τRef

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I







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3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3




50

















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54




congeladas






















55
























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lipossomal misto







57













Newman-Keuls


58

















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(500 micromolL-1)


60








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74










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polietileno glicol)




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Abs

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800700600500400300















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esperado


analisadas



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86
















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94















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V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















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p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


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FMRP-USP 2007






99








2005



p1075-79 2001


p1862-65 1992









100













Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


101














1986






102



v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




103













Pigments v72 n2 p267-70 2007




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104





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p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


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Academic Press 1984











Press 1992


107














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v8 p3208-15 2008

















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p517-32 1998





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Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


6

AGRADECIMENTOS

A Deus




7

AGRADECIMENTOS









de alegria





Amo vocecirc





doida







8









infacircncia






demonstrou por mim





realizado

9

SUMAacuteRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi


I1 Cacircncer 1






II OBJETIVOS18


III1 Materiais 19


III3 Aparelhagem 22







partiacuteculas 27






10






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lipossomal misto 41






48




11









(Φ∆) 68


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LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



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34



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45



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micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

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LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

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HpD Hematoporfirina



















16

























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RESUMO



















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I1 Cacircncer

























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Lier 1999)






cacircncer

















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(Figura 1)






24





























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0F rarr 1F rarr 3F


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substrato









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substrato









27



























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II OBJETIVOS






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III3 Aparelhagem




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40





























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III4 Meacutetodos









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partiacuteculas










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Amostra

ΦΦΦΦf



ZnPCRu-tpy em

lipossoma

005



75

























76
















77






78



Ru-tpy























79
























80





O2 bull minus + O2

























81















82









83





ZnPCRu-tpy 027











vitro








84


fotodinacircmico






















85



Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065


ZnPCRu-tpy 016





















86
















87



de 0 s a 150 s


88















fotoacutelise


89



10J de potecircncia














Fotodinacircmica


90





















91


















92













93







(05 mmolL-

77plusmn1







misto





de 05 Jcm2


94















95










96

V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















97










neoplaacutesicas


98






p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


v95 p11 1991






FMRP-USP 2007






99








2005



p1075-79 2001


p1862-65 1992









100













Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


101














1986






102



v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




103













Pigments v72 n2 p267-70 2007




v293 p293-97 2005





104





1983












p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


105


















2007





106



1998







Academic Press 1984











Press 1992


107














2005b








108







v8 p3208-15 2008

















109



48 1998















p517-32 1998





110











Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


7

AGRADECIMENTOS









de alegria





Amo vocecirc





doida







8









infacircncia






demonstrou por mim





realizado

9

SUMAacuteRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi


I1 Cacircncer 1






II OBJETIVOS18


III1 Materiais 19


III3 Aparelhagem 22







partiacuteculas 27






10






31


32


675 nm 33








lipossomal misto 41






48




11









(Φ∆) 68


675 nm 70





misto 77




12

LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



36




45



46



47



51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

53






55


13





61










66




71





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73






76





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78


14

LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




tpy ----------------------------------------------------------------

67



69



77


15








HpD Hematoporfirina



















16

























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RESUMO



















19

ABSTRACT



















20


I1 Cacircncer

























21


Lier 1999)






cacircncer

















22




























23






(Figura 1)






24





























25

















0F rarr 1F rarr 3F


26




substrato









0F rarr 1F rarr 3F




substrato









27



























28

















29





























30







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Stuehr 1993)














31










Ignarro 2000)

















32

[Ru(terpy)(L)NO+]3+

HN

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COOH

NHNHq

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N

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NO+

L

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et al 2005)






33



















34

















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II OBJETIVOS






36


III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























38






















III3 Aparelhagem




39





caminho oacuteptico























40





























41
















III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





em 610 nm






2004)









microLh)


43










partiacuteculas










44





















45









onda fixo de 610 nm
















46

























47






quadrado (χ2)











mesmo foi de 480 nm




laser em 355 nm


48















∆

∆

∆∆ Φ=Φτ

τRef

Ref

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I







49










3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3




50

















51
















52












53

)101(tI

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s

























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congeladas






















55
























56



















lipossomal misto







57













Newman-Keuls


58

















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(500 micromolL-1)


60








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74










62














polietileno glicol)




63

10

08

06

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00

Abs

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800700600500400300















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65









esperado


analisadas



66



Vazio 66

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Ru-tpy 72

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15

10

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73







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F

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amostra

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n

nx

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005



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77






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Ru-tpy























79
























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84


fotodinacircmico






















85



Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065


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87



de 0 s a 150 s


88















fotoacutelise


89



10J de potecircncia














Fotodinacircmica


90





















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92













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misto





de 05 Jcm2


94















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V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















97










neoplaacutesicas


98






p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


v95 p11 1991






FMRP-USP 2007






99








2005



p1075-79 2001


p1862-65 1992









100













Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


101














1986






102



v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




103













Pigments v72 n2 p267-70 2007




v293 p293-97 2005





104





1983












p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


105


















2007





106



1998







Academic Press 1984











Press 1992


107














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108







v8 p3208-15 2008

















109



48 1998















p517-32 1998





110











Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


8









infacircncia






demonstrou por mim





realizado

9

SUMAacuteRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi


I1 Cacircncer 1






II OBJETIVOS18


III1 Materiais 19


III3 Aparelhagem 22







partiacuteculas 27






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31


32


675 nm 33








lipossomal misto 41






48




11









(Φ∆) 68


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12

LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



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45



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51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



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53






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13





61










66




71





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76





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78


14

LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




tpy ----------------------------------------------------------------

67



69



77


15








HpD Hematoporfirina



















16

























17







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RESUMO



















19

ABSTRACT



















20


I1 Cacircncer

























21


Lier 1999)






cacircncer

















22




























23






(Figura 1)






24





























25

















0F rarr 1F rarr 3F


26




substrato









0F rarr 1F rarr 3F




substrato









27



























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30







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32

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HN

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L

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et al 2005)






33



















34

















35

II OBJETIVOS






36


III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























38






















III3 Aparelhagem




39





caminho oacuteptico























40





























41
















III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





em 610 nm






2004)









microLh)


43










partiacuteculas










44





















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46

























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48















∆

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55
























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lipossomal misto







57













Newman-Keuls


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(500 micromolL-1)


60








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74










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65









esperado


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66



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005



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Ru-tpy























79
























80





O2 bull minus + O2

























81















82









83





ZnPCRu-tpy 027











vitro








84


fotodinacircmico






















85



Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065


ZnPCRu-tpy 016





















86
















87



de 0 s a 150 s


88















fotoacutelise


89



10J de potecircncia














Fotodinacircmica


90





















91


















92













93







(05 mmolL-

77plusmn1







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de 05 Jcm2


94















95










96

V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















97










neoplaacutesicas


98






p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


v95 p11 1991






FMRP-USP 2007






99








2005



p1075-79 2001


p1862-65 1992









100













Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


101














1986






102



v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




103













Pigments v72 n2 p267-70 2007




v293 p293-97 2005





104





1983












p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


105


















2007





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1998







Academic Press 1984











Press 1992


107














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v8 p3208-15 2008

















109



48 1998















p517-32 1998





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Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


9

SUMAacuteRIO

RESUMO x

ABSTRACT xi


I1 Cacircncer 1






II OBJETIVOS18


III1 Materiais 19


III3 Aparelhagem 22







partiacuteculas 27






10






31


32


675 nm 33








lipossomal misto 41






48




11









(Φ∆) 68


675 nm 70





misto 77




12

LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



36




45



46



47



51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

53






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13





61










66




71





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LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




tpy ----------------------------------------------------------------

67



69



77


15








HpD Hematoporfirina



















16

























17







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RESUMO



















19

ABSTRACT



















20


I1 Cacircncer

























21


Lier 1999)






cacircncer

















22




























23






(Figura 1)






24





























25

















0F rarr 1F rarr 3F


26




substrato









0F rarr 1F rarr 3F




substrato









27



























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Stuehr 1993)














31










Ignarro 2000)

















32

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HN

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et al 2005)






33



















34

















35

II OBJETIVOS






36


III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























38






















III3 Aparelhagem




39





caminho oacuteptico























40





























41
















III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





em 610 nm






2004)









microLh)


43










partiacuteculas










44





















45









onda fixo de 610 nm
















46

























47






quadrado (χ2)











mesmo foi de 480 nm




laser em 355 nm


48















∆

∆

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I







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50

















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congeladas






















55
























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lipossomal misto







57













Newman-Keuls


58

















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(500 micromolL-1)


60








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74










62














polietileno glicol)




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Abs

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65









esperado


analisadas



66



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79
























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ZnPCRu-tpy 027











vitro








84


fotodinacircmico






















85



Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065


ZnPCRu-tpy 016





















86
















87



de 0 s a 150 s


88















fotoacutelise


89



10J de potecircncia














Fotodinacircmica


90





















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(05 mmolL-

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de 05 Jcm2


94















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V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















97










neoplaacutesicas


98






p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


v95 p11 1991






FMRP-USP 2007






99








2005



p1075-79 2001


p1862-65 1992









100













Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


101














1986






102



v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




103













Pigments v72 n2 p267-70 2007




v293 p293-97 2005





104





1983












p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


105


















2007





106



1998







Academic Press 1984











Press 1992


107














2005b








108







v8 p3208-15 2008

















109



48 1998















p517-32 1998





110











Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


10






31


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675 nm 33








lipossomal misto 41






48




11









(Φ∆) 68


675 nm 70





misto 77




12

LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



36




45



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47



51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

53






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13





61










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71





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LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




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HpD Hematoporfirina



















16

























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RESUMO



















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I1 Cacircncer

























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Lier 1999)






cacircncer

















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(Figura 1)






24





























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0F rarr 1F rarr 3F


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substrato









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substrato









27



























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et al 2005)






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II OBJETIVOS






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III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























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III3 Aparelhagem




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caminho oacuteptico























40





























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III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





em 610 nm






2004)









microLh)


43










partiacuteculas










44





















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onda fixo de 610 nm
















46

























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quadrado (χ2)











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laser em 355 nm


48















∆

∆

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I







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3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3




50

















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54




congeladas






















55
























56



















lipossomal misto







57













Newman-Keuls


58

















59


















(500 micromolL-1)


60








61


74










62














polietileno glicol)




63

10

08

06

04

02

00

Abs

orbacirc

ncia

800700600500400300















64




























65









esperado


analisadas



66



Vazio 66

ZnPC 78

Ru-tpy 72

ZnPCRu-tpy 82












67

20x106

15

10

05

00

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scecircn

cia

800780760740720700680660640















68
















69















70




















71













72













excitado singlete








1999)


73







exc

F

fN





















74






padratildeo

amostra

padratildeo

amostra

padratildeo

padratildeo

amostraamostra x

n

nx

aAbsorbacircnci

aAbsorbacircncix

Area

Areaφφ =











Amostra

ΦΦΦΦf



ZnPCRu-tpy em

lipossoma

005



75

























76
















77






78



Ru-tpy























79
























80





O2 bull minus + O2

























81















82









83





ZnPCRu-tpy 027











vitro








84


fotodinacircmico






















85



Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065


ZnPCRu-tpy 016





















86
















87



de 0 s a 150 s


88















fotoacutelise


89



10J de potecircncia














Fotodinacircmica


90





















91


















92













93







(05 mmolL-

77plusmn1







misto





de 05 Jcm2


94















95










96

V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















97










neoplaacutesicas


98






p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


v95 p11 1991






FMRP-USP 2007






99








2005



p1075-79 2001


p1862-65 1992









100













Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


101














1986






102



v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




103













Pigments v72 n2 p267-70 2007




v293 p293-97 2005





104





1983












p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


105


















2007





106



1998







Academic Press 1984











Press 1992


107














2005b








108







v8 p3208-15 2008

















109



48 1998















p517-32 1998





110











Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


11









(Φ∆) 68


675 nm 70





misto 77




12

LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



36




45



46



47



51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

53






55


13





61










66




71





72



73






76





----------------------------------------------------------------------------

78


14

LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




tpy ----------------------------------------------------------------

67



69



77


15








HpD Hematoporfirina



















16

























17







18

RESUMO



















19

ABSTRACT



















20


I1 Cacircncer

























21


Lier 1999)






cacircncer

















22




























23






(Figura 1)






24





























25

















0F rarr 1F rarr 3F


26




substrato









0F rarr 1F rarr 3F




substrato









27



























28

















29





























30







al 1993)






Stuehr 1993)














31










Ignarro 2000)

















32

[Ru(terpy)(L)NO+]3+

HN

HN

COOH

NHNHq

RuIIL

N

NN

NO+

L

L=














et al 2005)






33



















34

















35

II OBJETIVOS






36


III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























38






















III3 Aparelhagem




39





caminho oacuteptico























40





























41
















III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





em 610 nm






2004)









microLh)


43










partiacuteculas










44





















45









onda fixo de 610 nm
















46

























47






quadrado (χ2)











mesmo foi de 480 nm




laser em 355 nm


48















∆

∆

∆∆ Φ=Φτ

τRef

Ref

RefI

I







49










3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3




50

















51
















52












53

)101(tI

nabs

s

























54




congeladas






















55
























56



















lipossomal misto







57













Newman-Keuls


58

















59


















(500 micromolL-1)


60








61


74










62














polietileno glicol)




63

10

08

06

04

02

00

Abs

orbacirc

ncia

800700600500400300















64




























65









esperado


analisadas



66



Vazio 66

ZnPC 78

Ru-tpy 72

ZnPCRu-tpy 82












67

20x106

15

10

05

00

Inte

nsid

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de fl

uore

scecircn

cia

800780760740720700680660640















68
















69















70




















71













72













excitado singlete








1999)


73







exc

F

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74






padratildeo

amostra

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amostra

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amostraamostra x

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aAbsorbacircnci

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Area

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Amostra

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ZnPCRu-tpy em

lipossoma

005



75

























76
















77






78



Ru-tpy























79
























80





O2 bull minus + O2

























81















82









83





ZnPCRu-tpy 027











vitro








84


fotodinacircmico






















85



Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065


ZnPCRu-tpy 016





















86
















87



de 0 s a 150 s


88















fotoacutelise


89



10J de potecircncia














Fotodinacircmica


90





















91


















92













93







(05 mmolL-

77plusmn1







misto





de 05 Jcm2


94















95










96

V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















97










neoplaacutesicas


98






p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


v95 p11 1991






FMRP-USP 2007






99








2005



p1075-79 2001


p1862-65 1992









100













Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


101














1986






102



v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




103













Pigments v72 n2 p267-70 2007




v293 p293-97 2005





104





1983












p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


105


















2007





106



1998







Academic Press 1984











Press 1992


107














2005b








108







v8 p3208-15 2008

















109



48 1998















p517-32 1998





110











Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


12

LISTA DE FIGURAS





tpy) --

15



16



gasoso -------------------------------------------------------------------

34



36




45



46



47



51




micromolL-1) ----------------------------------------------------------------

52



(R2 = 0982964 Y = 10448 + 57934 X) --------------------------

53






55


13





61










66




71





72



73






76





----------------------------------------------------------------------------

78


14

LISTA DE TABELAS






Ru-tpy ------------------------------------------------------------

62




tpy ----------------------------------------------------------------

67



69



77


15








HpD Hematoporfirina



















16

























17







18

RESUMO



















19

ABSTRACT



















20


I1 Cacircncer

























21


Lier 1999)






cacircncer

















22




























23






(Figura 1)






24





























25

















0F rarr 1F rarr 3F


26




substrato









0F rarr 1F rarr 3F




substrato









27



























28

















29





























30







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Stuehr 1993)














31










Ignarro 2000)

















32

[Ru(terpy)(L)NO+]3+

HN

HN

COOH

NHNHq

RuIIL

N

NN

NO+

L

L=














et al 2005)






33



















34

















35

II OBJETIVOS






36


III1 Materiais

















isopropanol (Merck)







37

























38






















III3 Aparelhagem




39





caminho oacuteptico























40





























41
















III4 Meacutetodos









42




a 800 nm





em 610 nm






2004)









microLh)


43










partiacuteculas










44





















45









onda fixo de 610 nm
















46

























47






quadrado (χ2)











mesmo foi de 480 nm




laser em 355 nm


48















∆

∆

∆∆ Φ=Φτ

τRef

Ref

RefI

I







49










3Cu(s) + 8H+(aq) + 8NO3




50

















51
















52












53

)101(tI

nabs

s

























54




congeladas






















55
























56



















lipossomal misto







57













Newman-Keuls


58

















59


















(500 micromolL-1)


60








61


74










62














polietileno glicol)




63

10

08

06

04

02

00

Abs

orbacirc

ncia

800700600500400300















64




























65









esperado


analisadas



66



Vazio 66

ZnPC 78

Ru-tpy 72

ZnPCRu-tpy 82












67

20x106

15

10

05

00

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scecircn

cia

800780760740720700680660640















68
















69















70




















71













72













excitado singlete








1999)


73







exc

F

fN





















74






padratildeo

amostra

padratildeo

amostra

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amostraamostra x

n

nx

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Amostra

ΦΦΦΦf



ZnPCRu-tpy em

lipossoma

005



75

























76
















77






78



Ru-tpy























79
























80





O2 bull minus + O2

























81















82









83





ZnPCRu-tpy 027











vitro








84


fotodinacircmico






















85



Feoforbide-a 059

ZnPC em etanola 065


ZnPCRu-tpy 016





















86
















87



de 0 s a 150 s


88















fotoacutelise


89



10J de potecircncia














Fotodinacircmica


90





















91


















92













93







(05 mmolL-

77plusmn1







misto





de 05 Jcm2


94















95










96

V CONCLUSOtildeES







ZnPC


















97










neoplaacutesicas


98






p161-69 2001



Acta v981 p27-35 1989


v95 p11 1991






FMRP-USP 2007






99








2005



p1075-79 2001


p1862-65 1992









100













Compounds v344 n1-2 p27-31 2002


Research v38 p2628-35 1978




Biology v193 p313-28 1985


101














1986






102



v28 p189-96 1995


2000






B Biology v66 p89-106 2002






p3254-63 1971




103













Pigments v72 n2 p267-70 2007




v293 p293-97 2005





104





1983












p273-84 2004



B Biology v73 n1-2 p1-28 2004


105


















2007





106



1998







Academic Press 1984











Press 1992


107














2005b








108







v8 p3208-15 2008

















109



48 1998















p517-32 1998





110











Acta v1113 p171-99 1992




Chemistry v14 n41 p3728-39 2002



v16 n4 p591-97 2003


Estudo da associação de complexos nitrosilos de rutênio liberadores de NO com o ... · 2009. 9....

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