ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS PARVOVÍRUS DE …§ão de Mestrado... · MEV Vírus da...
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO-SENSU EM
MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA APLICADAS
CINTHYA FONSECA DOMINGUES
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS PARVOVÍRUS
DE FELINOS DOMÉSTICOS DO ESTADO
DO RIO DE JANEIRO (2008-2017)
Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia
Co-orientadora: Profa. Dra. Tatiana Xavier de Castro
NITERÓI
2018
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CINTHYA FONSECA DOMINGUES
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS PARVOVÍRUS DE FELINOS
DOMÉSTICOS DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO (2008-2017)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia e Parasitologia.
Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia
Coorientadora: Profa. Dra. Tatiana Xavier de Castro
Niterói, RJ
2018
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CINTHYA FONSECA DOMINGUES
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS PARVOVÍRUS DE FELINOS
DOMÉSTICOS DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO (2008-2017)
Aprovada em março de 2018.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________
Prof. Dr. Rafael Brandão Varella (UFF)
_______________________________________________________________
Dra. Marcelle Figueira Marques da Silva (Fiocruz)
_______________________________________________________________
Dra. Bárbara Vieira do Lago (Fiocruz)
Niterói, RJ
2018
Dissertação de mestrado apresentada ao curso de Pós-
Graduação Stricto Sensu em Microbiologia e Parasitologia
Aplicadas da Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em
Microbiologia e Parasitologia.
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AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar gostaria de agradecer a Deus, pois sem ele não estaria
concluindo mais essa etapa da minha vida. Agradeço a Deus também pela força que
me deu durante esse percurso, a Ele toda honra e Toda Glória.
À minha família, namorado e amigos por todo o amor, carinho e compreensão
ao longo desta etapa da minha vida.
À minha orientadora, profa. Dra. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia pelo
apoio e presença marcante desde o início da minha carreira científica.
À minha querida coorientadora, profa. Dra. Tatiana Castro (Tati) por toda
paciência, carinho e atenção.
Aos grandes amigos e parceiros que conquistei durante o Mestrado (Joylson,
Juliana, Magda e Robson), sem dúvida vocês foram a melhor parte do mestrado pra
mim, jamais esquecerei nossos almoços e bate-papos na copa, amo todos vocês.
À todos as alunas de PIBIC que participaram junto comigo, seja nas coletas
ou nos experimentos (Ana Carolina, Sarah e Letícia).
Aos colegas de laboratório da UFF e aos professores da Disciplina de
Virologia pela ajuda e convivência durante a realização deste trabalho.
Ao Laboratório Multisuários de Microbiologia e Parasitologia, em especial ao
técnico André Victor Barbosa pela enorme ajuda que deu no sequenciamento das
minhas amostras.
Ao Curso de Pós-Graduação da Microbiologia e Parasitologia Aplicadas da
UFF.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo
auxílio financeiro durante a elaboração do projeto.
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RESUMO
O Parvovírus Felino (FPV) apresenta uma similaridade genômica de aproximadamente 98% com o Parvovírus Canino (CPV) o qual é considerado uma variante do FPV. As novas variantes de CPV (2a/2b/2c) adquiriram a habilidade de replicar em gatos e até o momento não existem evidências de que o CPV infecte gatos no Brasil. Este trabalho teve como objetivo analisar a diversidade genética das variantes de parvovírus circulantes em felinos domésticos com gastrenterite no Estado do Rio de Janeiro, no período de 2008-2017. Um total de 75 amostras fecais de gatos com até um ano de idade com diarreia foram testadas por PCR convencional e 30 foram positivas. Destas, 25 foram selecionadas para sequenciamento e análise filogenética. Outras 15 sequências de CPV detectadas em amostras de cães com diarreia, no mesmo período, também foram analisadas para comparação com as sequências de gatos deste estudo. Além disso, análises de sítios de seleção positiva e eventos de recombinação genética foram realizadas utilizando o Datamonkey e programas RDP4/Simplot, respectivamente. Para amplificar a sequência completa do gene que codifica a proteína de capsídeo VP2 (1755pb), a PCR convencional foi realizada com cinco diferentes pares de iniciadores, sendo três desenhados neste estudo. Pôde-se observar mudanças de nucleotídeos em 48 posições ao longo do fragmento amplificado, sendo 32 sinônimas e 16 não sinônimas. Com base nos aminoácidos importantes para definição do espectro de hospedeiro, oito sequências foram caracterizadas como FPV, sendo cinco “FPV clássicas e 16 como CPV (sete CPV-2a e nove CPV-2b). Uma sequência (RJ1085/11) não pode ser caracterizada, no entanto, apresentou nos resíduos 80, 93, 103, 300 e 323 aa típicos de CPV-2. Algumas sequências
felinas e caninas deste estudo apresentaram alterações nos resíduos 297 (SerAsn
e SerAla) e 324 (TyrLeu), esta última descrita pela primeira vez em gatos e estes sítios apresentaram sob seleção positiva. Na análise filogenética, as 25 sequências felinas formaram dois grandes clados, um contendo as oito sequências de FPV e outro com as 16 sequências de CPV. Entre os FPVs, as cinco sequências consideradas “FPV clássicas” formaram um clado separado das demais. As sequências caracterizadas como CPV (2a/2b/2c) deste estudo com alteração no resíduo Leu324, tanto de origem felina como canina formaram um clado separado das demais sequências de CPV. De acordo com a presença de aa característicos de
FPV ou CPV nas posições 564 (AsnSer) e 568 (AlaGly), pode-se observar subdivisão deste clado. A sequência RJ1085/11 que não pôde ser caracterizada (FPV/CPV), formou um clado próximo à sequências de CPV-2 (tipo antigo), e um potencial evento de recombinação foi identificado com a sequência protótipo de CPV-2 disponível no GenBanK (número de acesso M38245). Este estudo é a primeira descrição das novas variantes de CPV em gatos no Brasil, e nos faz refletir se este hospedeiro poderia atuar como reservatório ou fonte de novas variantes de parvovírus. Uma avaliação contínua e mais detalhada destes vírus possibilitará uma melhor compreensão dos mecanismos que impulsionam a evolução do FPV/CPV no Brasil e sua importância epidemiológica.
Palavras–chave: Parvovírus Felino (FPV), Parvovírus Canino (CPV), gatos, análise filogenética, Rio de Janeiro
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ABSTRACT
Feline parvovirus (FPV) and canine parvovirus (CPV) are over 98% identical in their DNA sequences and CPV is clearly a host range variant of FPV. The new variants of CPV (2a/2b/2c) have gained the ability to infect and replicate in cats. Until now, there have been no reports of CPV infection in cats in Brazil. The purpose of this study was to evaluate the genetic diversity in the VP2 gene of parvovirus strains circulating in domestic cats in Rio de Janeiro State in the period of 2008-2017. A total of 75 fecal samples, collected from up to one year old cats with diarrhea, were screened for the presence of parvovirus by conventional PCR. Parvovirus DNA was detected in 30 samples and 25 were chosen for sequence and phylogenetic analysis. In addition, 15 CPV sequences obtained from fecal samples of diarrheic during the study period were also analyzed. To detect positive selection at amino acid sites as well the occurrence of possible recombination events, Datamonkey and RDP4/Simplot programs were used, respectively. For sequence analysis, five different primer pairs that amplify fragments encompassing the entire VP2 gene sequence (1755bp), which three was specifically designed for this study, were used. Considering all the nucleotide changes encountered in the VP2 sequences, 32 were synonymous and 16 were non-synonymous substitutions. Analysis of the deduced amino acid (aa) residues at critical positions that determine feline/canine host range allowed the identification of the parvoviruses: eight sequences were FPV, five of which were named “classical FPV”, while 16 were CPV (seven CPV-2a and nine CPV-2b). A single sequence (RJ1085/11) with aa changes characteristic of CPV at positions 80, 93, 103, 300 and 323 could not be classified. Non-synonymous substitutions were
found at residues 297 (SerAsn e SerAla) and 324 (TyrLeu), the latter had not been found in cats yet and these sites presented with positive selection. The phylogenetic tree revealed two well-supported clades: one containing the eight FPV and the other comprising the 16 CPV sequences. Inside the FPV clade, the five “classical FPV” sequences formed a separated group. The CPV (2a/2b/2c) sequences from cats and dogs containing the 324Leu non-synonymous mutation formed an individual subgroup within the CPV clade. According to the aa changes at
residues 564 (AsnSer) and 568 (AlaGly), a subdivision inside this 324 Leu subgroup could be observed. The strain RJ1085/11 was an outlier between the two main clades and was closely related to the old CPV-2 strains. A potential recombinant event between RJ1085/11 and the CPV-2 reference strain available in GenBank (accession number M38245) was identified. This is the first report of CPV-2a/2b in domestic cats in Brazil, and raises the question if cats may act as a reservoir or could potentially be a risk factor for infecting other dogs and cats with parvoviruses. Given the results obtained in our current study, the continuous surveillance of parvoviruses will help to elucidate the mechanisms that drive FPV/CPV evolution in Brazil and its epidemiological importance. Key words: feline parvovirus, canine parvovirus, cats, phylogenetic analysis, Rio de Janeiro
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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
µg Micrograma
µl Microlitros
µM Micromolar
% Porcentagem
Å Angstrons
aa Aminoácidos
AS Ácido siálico
ß barrel-motif
BLAST Basic Local Aligment Search Tool
BFPV Parvovírus da raposa azul do ártico (do inglês blue fox parvovirus)
Ca2+ Cálcio
CCoV Coronavírus Canino
cDNA DNA complementar (do inglês complementary DNA)
CPV Parvovírus canino
CRFK Células de rim de gato (do inglês Crandell-Rees Feline Kidney)
DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês deoxyribose nucleic acid)
dsDNA DNA fita simples (do inglês double strand DNA)
DTT Ditiotreitol (do inglês dithiothreitol)
DXTP Deoxinucleotídeo
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês Ethylenediamine
Tetraacetic Acid).
ELISA Ensaio imunoenzimático ( do inglês Enzyme Linked Imunno Sorbent Assay)
FCV Calicivírus Felino
FeCoV Coronavírus Felino
FPV Parvovírus Felino
For Dianteiro (do inglês Forward)
g Gramas
h Hora
H2O Água
HA Reação de hemaglutinação
Ig Imunoglobulina
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Kb Kilobases
kDa Kilodaltons
LMMP Laboratório Multiusuário de Microbiologia e Parasitologia
M Molar
MAbs Anticorpos monoclonais
ME Microscopia eletrônica
MEME Mixed Effects Model of Episodic Diversifying Selection
MEV Vírus da Enterite das martas (do inglês Mink Enteritis Virus)
MgCl2 Cloreto de magnésio
min Minuto
mL Mililitro
mRNA RNA mensageiro (do inglês messenger RNA)
NCBI National Center for Biotechnology Information
ng Nanograma
nm Nanômetros
NS1/ NS2 Proteínas não estruturais 1 e 2
nt Nucleotídeo
ºC Graus Celsius
ORF Sequências abertas de leitura (do inglês Open Reading Frames)
pb Pares de base
PCR Reação em cadeia pela polimerase (do inglês Polimerase Chain
Reaction)
pH Potencial hidrogeniônico
PI Pós- infecção
pmol Picomol
qPCR PCR em tempo real (do inglês quantitative real-time PCR)
RPV Parvovírus dos mãos-peladas (do inglês Raccoon parvovirus)
RDP Recombination Detection Program
RdRp
RNA polimerase RNA dependente (do inglês RNA-dependent RNA
polymerase dependent RNA)
RNA Ácido ribonucleico (do inglês ribonucleic acid)
rpm Rotações por minuto
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RT-PCR Reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa
(do inglês Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction)
Rev Reverso (do inglês Reverse)
SRD Sem raça definida
ssDNA DNA simples fita (do inglês single strand DNA)
ssRNA RNA simples fita (do inglês single strand RNA)
TCID50 Dose Infecciosa Média em cultura de tecido
TBE Tampão Tris/ácido bórico/EDTA
Tf Transferrina
TfR Receptor de transferrina tipo-1
Tm Temperatura de Melting
TRIS Tris (hidroximetil) aminometano
VP1/VP2 Proteínas do capsídeo viral 1 e 2
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Fig. 1 Fotomicrografia eletrônica de partículas de parvovírus canino em
amostra fecal de um cão com gastrenterite, p.21.
Fig. 2 (A)Estrutura do capsídeo do CPV determinada por cristalografia de raio-X mostrando as quatro regiões morfológicas do capsídeo (B) Estrutura tridimensional do capsídeo do CPV, p.22.
Fig. 3 Proteína de capsídeo do CPV, p.23.
Fig. 4 Organização genômica e mapa de transcrição do parvovírus canino, p.24.
Fig. 5 Esquema do ciclo replicativo dos parvovírus, p.26.
Fig. 6 (A)Inclusões nucleares em células (CRFK) infectadas com FPV; (B) Imunofluorescências nuclear de células infectadas (CRFK) com FPV, p.27.
Fig. 7 Relação filogenética entre os parvovírus de carnívoros baseada no gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2, p.31.
Fig. 8 Representação de uma unidade do capsídeo viral mostrando as posições dos resíduos que alteraram durante a evolução do parvovírus canino (CPV), p.32.
Fig. 9 Esquema da patogenia da infecção pelo FPV, p.38.
Fig. 10
Localização da sequência dos iniciadores de cadeia utilizados na detecção do genoma e caracterização molecular dos parvovírus, p.48.
Fig. 11 Fluxograma das amostras positivas para parvovírus submetidas ao sequenciamento genômico, p.52.
Fig. 12 Imagem da estrutura da VP2 do CPV mostrando em vermelho a região de α-hélice, em amarelo a região β-pregueada e verde a região hipervariável “Loops”, p. 66.
Fig.13 (A)Imagem da estrutura do Loop 3 com destaque em azul para região do aa 297 (Ser), mostrando através do círculo azul sua proximidade ao resíduo 300, importante na definição do espectro hospedeiro felino-canino (B) Região do Loop 3 e em laranja a região 297 após a mutação para Asn, mostrando através do círculo sua proximidade ao resíduo 300, p.66. .
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Fig.14 (A)Região do Loop 3 e em rosa a região 324 sem a mutação (Tyr),
evidenciando a formação do anel aromático e no círculo (rosa) mostrando sua proximidade ao resíduo 323, importante na definição do espectro hospedeiro fel-can (B) em magenta a região 324 após a mutação (Leu), onde houve a perda do anel aromático após a mutação, p.66.
Fig.15
Árvore filogenética da sequência completa (1755pb) do gene que codifica a proteína VP2 dos parvovírus, p.68.
Fig.16
Representação gráfica do evento de recombinação da sequência RJ1085/11 obtida através do programa RDP4, p.70.
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Distribuição das amostras testadas neste estudo de acordo
com o sexo, faixa etária, raça, histórico de vacinação e origem dos gatos e cães, p.46.
TABELA 2 - Descrição dos iniciadores utilizados na reação em cadeia pela polimerase (PCR) para a detecção do genoma e caracterização molecular dos parvovírus com o tamanho em pares de bases (pb) de seus respectivos produtos, p.49.
TABELA 3 - Condições da PCR com os pares de iniciadores utilizados neste estudo, p.51.
TABELA 4 - Distribuição das 25 amostras fecais de gatos domésticos utilizadas neste estudo conforme a idade, local de coleta, histórico de vacinação e sinais clínicos, p.56.
TABELA 5 -
Substituições sinônimas encontradas a partir do alinhamento do produto amplificado de 1755pb do gene que codifica a proteína VP2 das 25 amostras de parvovírus de gatos do estado do Rio de Janeiro no período de 2008-2017, p.59.
TABELA 6 -
Diferenças de aminoácidos encontradas no fragmento de 1755 pb do gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 dos parvovírus detectados nas 25 amostras felinas e 15 amostras caninas no período de 2008-2017, p.63.
TABELA 7 - Distribuição dos animais estudados de acordo com a detecção de Parvovírus e outras viroses entéricas e sinais clínicos, p.71.
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LISTA DE QUADROS QUADRO 1 - Mutações no genoma do CPV durante a evolução do vírus em
cães, p.34.
QUADRO 2 - Infecção pelo Vírus da Panleucopenia Felina com suas consequências patológicas e manifestações clínicas, p.39.
QUADRO 3 - Reagentes utilizados na reação em cadeia pela polimerase para detecção do genoma dos Parvovírus, p.50.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO, p.16
2 REVISÃO DE LITERATURA, p.20
2.1 Parvovírus Felino (FPV), p.20
2.1.1 Classificação, p.20
2.2 Características do vírus, p.20
2.2.1 Propriedades gerais, p.20
2.2.2 Estrutura do capsídeo, p.21
2.2.3 Organização do genoma, p.23
2.3 Replicação do vírus, p.25
2.4 Evolução e Variabilidade Genética do Parvovírus Felino, p.27
2.5 Epidemiologia, p.35
2.6 Patogenia e Manifestações Clínicas, p.36
2.7 Diagnóstico Laboratorial, p.41
2.8 Imunidade e profilaxia, p.42
3 OBJETIVOS
3.1 Geral, p.44
3.2 Específicos, p.44
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Considerações sobre os aspectos éticos, p.45
4.2 Amostras clínicas, p.45
4.3 Processamento das amostras clínicas, p.47
4.3.1 Suspensão Fecal a 20%, p.47
4.3.2 Extração do genoma viral, p.47
4.4 Análise do genoma dos Parvovírus, p.47
4.4.1 Iniciadores de cadeia utilizados na PCR para detecção e
caracterização molecular dos parvovírus, p.47
4.4.2 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção do
genoma dos Parvovírus, p.49
4.4.3 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) para sequenciamento
completo do gene que codifica a proteína de capsídeo viral VP2, p.50
15
4.4.4 Sequenciamento do gene da proteína VP2, p.53
4.4.5 Análise de seleção positiva, p.53
4.4.6 Análise estrutural da proteína VP2 do CPV, p.53
4.4.7 Análise Filogenética, p.53
4.4.8 Análise de eventos de recombinação genética, p.54
4.5 Detecção de outros vírus entéricos, p.54
5 RESULTADOS
5.1 Detecção de parvovírus em amostras fecais de gatos com diarreia
a partir da amplificação parcial do gene que codifica a proteína de
capsídeo VP2, p.56
5.2 Sequenciamento completo do gene que codifica a proteína de
capsídeo viral VP2, p.57
5.3 Caracterização molecular dos Parvovírus em amostras fecais de
gatos domésticos, p.57
5.4 Análise filogenética do gene completo que codifica a proteína VP2
do capsídeo viral, p.67
5.5 Análise de eventos de recombinação genética, p.69
5.6 Codetecção de outros vírus entéricos, p.70
6 DISCUSSÃO, p.72
7 CONCLUSÃO, p.81
8 REFERÊNCIAS, p.82
9 APÊNDICE, p.94
9.1 Apêndice I – Ficha clínica para coleta de dados, p.94
10 ANEXOS, p.95
10.1 Anexo I - Reagentes e Soluções, p.95
10.2 Anexo II - Certificados do Comitê de Ética, p.97
10.3 Anexo III - Lista das sequências de Parvovírus utilizadas neste
estudo, de acordo com o número do GenBank, nome do isolado, ano
do isolamento e origem, p.99
10.4 Anexo IV - Protótipos utilizados na construção da árvore
filogenética, p.111
10.5 Anexo V - Tabelas de Nucleotídeos e Aminoácidos, p.112
16
1 INTRODUÇÃO
A evolução viral contínua pode gerar importantes variações fenotípicas,
incluindo mudanças no espectro de hospedeiro, nos mecanismos de transmissão, no
tropismo tecidual, antigenicidade, e / ou virulência (SHI et al., 2009). Essas novas
funções biológicas muitas vezes exigem mudanças genômicas múltiplas e a
compreensão desses processos pode ser fundamental para melhorar o prognóstico,
prevenção e estratégias de controle das doenças virais emergentes (STUCKER et
al., 2012).
Um dos mecanismos responsáveis pelo aparecimento de uma virose
emergente resulta da capacidade de determinados vírus em ampliar seu espectro de
hospedeiro (transposição da barreira de espécie), no qual adquire a habilidade de se
replicar e disseminar eficientemente neste novo hospedeiro, podendo gerar uma
endemia ou mesmo pandemia já que a população é imunologicamente suscetível ao
novo agente, como é o caso do Vírus Influenza A, Vírus da Zika e do Parvovírus em
cães (PARRISH & KAWAOKA, 2005; WIKAN & SMITH, 2016; PAULES &
SUBARAU, 2017).
Entre os vírus com essas características e que possui genoma de DNA fita
simples, o Parvovírus Canino (CPV) é um exemplo de sucesso na transposição da
barreira de hospedeiro (PARRISH & KAWAOKA, 2005; HOELZER & PARRISH,
2010), já que é considerado uma variante do parvovírus felino (FPV) que adquiriu a
capacidade de replicação em cães após a passagem em um hospedeiro carnívoro
selvagem (HORIUCHI et al., 1998; TRUYEN et al., 1998; STEINEL et al., 2001;
IKEDA et al., 2002).
O Parvovírus Felino (FPV) é o agente etiológico da Panleucopenia Felina,
doença conhecida desde o início do século XX, por causar leucopenia e
gastrenterite em gatos domésticos (Felis catus). Em 1947, uma epidemia ocorreu no
Zoológico de Londres e vários felídeos selvagens foram infectados, e atualmente
sabe-se que todos os membros da família Felidae são suscetíveis à infecção pelo
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FPV e podem desenvolver a doença (STEINEL et al., 2001). Inicialmente acreditava-
se que a infecção por este vírus era restrita aos felídeos, até que em 1947, uma
variante morfologicamente e antigenicamente semelhante a este vírus foi detectada
causando doença em martas (Mustela vison) no Canadá e este novo vírus foi
denominado de Vírus da Enterite das Martas (MEV) (PARRISH, 1994; TRUYEN &
PARRISH, 1995).
A partir de 1978, com a emergência do CPV como um novo patógeno, surtos
de doença fatal em que os sinais clínicos em cães eram similares aos observados
na infecção pelo FPV em gatos, e do MEV em martas foram descritos (APPEL et al.,
1979; MANN et al., 1980). A associação entre o CPV e o FPV foi logo reconhecida, e
alguns estudos demonstraram que o CPV é antigênica e geneticamente similar ao
FPV e MEV, sendo, portanto considerado uma variante do FPV (PARRISH et al.,
1988). O FPV e CPV apresentam uma homologia de genoma de aproximadamente
98% e diferem em cerca de 8-10 aminoácidos na proteína de capsídeo VP2
(PARRISH, 1994; 1999).
À medida que se disseminava na população canina, novas variantes (CPV-2a,
CPV-2b) surgiram em 1980 e 1984, respectivamente, e substituíram o tipo original
(CPV-2) em circulação (PARRISH et al., 1988). Em 2001, um novo tipo denominado
CPV-2c foi descrito na Itália (BUONAVOGLIA et al., 2001). As novas variantes de
CPV são detectadas, em diferentes proporções, na população canina ao redor do
mundo (STEINEL et al., 1998), e estenderam o espectro de hospedeiro deste vírus
que adquiriu a capacidade de infectar a espécie felina (PARRISH & KAWAOKA,
2005; HOELZER & PARRISH, 2010; ALLISON et al., 2014).
Um estudo realizado no final da década de 80, utilizando anticorpos
monoclonais e mapeamento do genoma com enzimas de restrição demonstrou que
três dos oitos isolados de parvovírus a partir de amostra fecal de gatos não
diarreicos, no período de 1987-1990, eram mais relacionados ao CPV-2a do que
FPV, sugerindo uma possibilidade de transmissão do CPV-2a de cão para gato
(MOCHIZUKI et al., 1993). A seguir, este grupo, utilizando sequenciamento
genômico, relatou a detecção de CPV-2a (isolado FPV-314/1993) a partir do swab
retal de um gato com panleucopenia felina. Naquela época, CPV-2a era a variante
de parvovírus prevalente na população canina do Japão (MOCHIZUKI et al., 1996).
No mesmo ano, Truyen e colaboradores (1996), utilizando anticorpos monoclonais,
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detectaram os tipos antigênicos CPV-2a CPV-2b em aproximadamente 5% dos
isolados de parvovírus de gatos na Alemanha e EUA.
A seguir, Ikeda e colaboradores (2000) relataram a detecção de CPV-2a ou
CPV-2b em 15/18 isolados de parvovírus de gatos domésticos e leopardos
(Panthera pardus) aparentemente saudáveis no Vietnam e Taiwan no período de
1995-1998. Sequências geneticamente relacionadas às variantes CPV-2a/CPV-2b
também foram detectadas em amostra fecal de tigre siberiano (Panthera tigris
altaica) de um Zoológico na Alemanha e em amostras de fezes e/ou tecidos de
guepardos (Acinonyx jubatus) na África e zoológico dos EUA (STEINEL et al., 2000).
Logo, esses estudos demonstraram que as novas variantes do CPV também são
capazes de infectar os felinos selvagens.
O CPV tem sido isolado de fezes de gatos clinicamente saudáveis, sugerindo
que este vírus possa causar infecção subclínica ou branda nesta espécie (CLEGG et
al., 2012). Entretanto, o isolamento de CPV a partir de células mononucleares do
sangue periférico de gatos sugere que este vírus possa infectar persistentemente
essas células em gatos mesmo na presença de anticorpos neutralizantes
(MIYAZAWA et al., 1999).
Na tentativa de esclarecer o potencial patogênico das novas variantes de CPV
na população felina, vários estudos de infecção experimental em gatos domésticos
foram realizados, os quais demonstraram que estes vírus são capazes de infectar,
replicar e causar doença nesta espécie, e o quadro clínico pode variar desde
assintomático até grave com evolução a óbito (CHALMERS et al., 1999;
NAKAMURA et al., 2001; IKEDA et al., 2002; GAMOH et al., 2003). Portanto, a
patogenicidade das variantes de CPV em gatos ainda é controversa.
Em 2013, Battillani e colaboradores utilizando técnicas de clonagem e
sequenciamento genômico, descreveram a coinfecção de FPV/CPV-2a em um gato
doméstico de três meses que apresentava sinais clínicos graves (diarreia
hemorrágica, vomito, anorexia e panleucopenia), com evolução a óbito. Os autores
sugeriram que neste caso a coinfecção tenha alterado o curso clínico da infecção
por FPV, uma vez que CPV representa um novo patógeno para gatos.
A detecção de sequências de parvovírus canino em gatos com mutações
características de sequências caninas sugere a possibilidade de transmissão
interespécie (cão ↔ gato) (MOCHIZUKI, HARASAWA; NAKATANI, 1993;
MOCHIZUKI et al., 1996; NAKAMURA et al., 2001; IKEDA et al., 2002;
19
BRINDHALAKSHMI et al., 2016). Estudos realizados em abrigos com gatos
assintomáticos, demonstraram que 45% destes animais são capazes de disseminar
o CPV no ambiente por até seis semanas (CLEGG et al., 2012), tornando os gatos
potencialmente um fator de risco para infectar outros gatos e cachorros. Portanto, o
papel epidemiológico dos gatos domésticos precisa ser melhor investigado, como
são suscetíveis a infecção por ambos os vírus (FPV e CPV), podem atuar como
reservatórios e assim como contribuir para emergência de novos vírus.
No Brasil, até o momento não existem evidências de que o CPV infecte gatos,
já que o sequenciamento de amostras de parvovírus detectadas nas fezes de gatos
com diarreia confirmou a presença do FPV (CUBEL GARCIA et al., 2011).
Entretanto, pôde-se observar neste estudo que a sequência de uma amostra
(DQ658146) apresentava no resíduo 426, o aa Asp característico de CPV-2b.
Como o CPV e FPV circulam na população canina e felina no Rio de Janeiro
(CASTRO et al., 2007; SILVA, 2010), a caracterização molecular dos parvovírus em
gatos domésticos no Estado do Rio de Janeiro é necessário para identificar
possíveis mudanças genéticas, bem como proporcionar uma melhor compreensão
dos mecanismos que impulsionam a evolução dos parvovírus felino e canino em
gatos domésticos no Brasil.
20
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Parvovírus Felino (FPV)
2.1.1 Classificação
Os parvovírus patogênicos de animais estão classificados na família
Parvoviridae, subfamília Parvovirinae, gênero Protoparvovirus, sendo que o
parvovírus felino (FPV), parvovírus canino (CPV), vírus da enterite das martas (MEV
- martas enteritis virus) e parvovírus dos mãos-peladas (RPV - racoon parvovirus)
compõe a espécie protoparvovírus dos carnívoros 1 (Carnivore protoparvovirus 1)
(COTMORE et al., 2014).
O FPV infecta gatos domésticos e outros felídeos bem como espécies das
famílias: Canidae, Mustelidae, Procyonidae e Viverridae (incluindo raposa,
bassarisco, guaxinim e visão) (STUETZER & HARTMANN, 2014).
2.2 Características do vírus
2.2.1 Propriedades Gerais
As partículas de parvovírus quando visualizadas ao microscópio eletrônico
são esféricas, destituídas de envelope, com diâmetro variando de 18 a 26 nm e
capsídeo de simetria icosaédrica (Figura 1). A massa molecular da partícula viral
completa é de 5,0 a 6,2 X 106 Da e a densidade do vírion em gradiente de cloreto de
césio é de 1,39 a 1,42 g/cm3. Partículas vazias apresentam peso molecular de 4.2 x
106 Da e são consideradas não infecciosas (MORAES & COSTA, 2012).
GORDON e ANGRICK (1986) demonstraram que o CPV pode manter-se
infeccioso por até cinco meses no ambiente. A partícula infecciosa é bastante
resistente, sendo estável em pH variando de 3 a 9, porém é inativada à temperatura
21
de 560C por 60 minutos e ao tratamento por solventes orgânicos, agentes oxidantes,
com formalina ou propionolactona ou quando submetida à radiações gama (SIEGL
et al., 1984).
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de partículas de parvovírus canino em amostra fecal de
um cão com gastrenterite (Willi, 1998).
2.2.2 Estrutura do Capsídeo
A estrutura molecular tridimensional do CPV, avaliada por cristalografia com
raios-X, demonstrou que o capsídeo tem um diâmetro de aproximadamente 255
angstrons (Å), sendo constituído por 60 subunidades das proteínas estruturais: VP1
(5-6 cópias) e VP2 (54-55 cópias), que compõe cerca de 90% do capsídeo. A VP1
(80 kDa) é idêntica à VP2 (65kDa) com adição de 143 aminoácidos na região amino-
terminal (TSAO et al., 1991; CHAPMAN & ROSSMANN, 1996; BERNS & PARRISH,
2013).
Nas partículas infecciosas, a clivagem de 15-20 aminoácidos na região amino
terminal de VP2 gera a proteína VP3 de 63 kDa (PARADISE; RHODE; SINGER,
1982; TSAO et al., 1991). Esta clivagem parece ser essencial à infectividade do
vírus porque expõem sequências ricas em Glicina, importantes na interação com a
membrana celular (WU & ROSSMAN, 1993). A proteína VP2 além de ser o sítio de
ligação ao receptor confere ao vírus a propriedade hemaglutinante e contém os
epítopos responsáveis pela indução de anticorpos neutralizantes (LOPEZ DE
TURISO et al., 1991).
A superfície do capsídeo apresenta um canal cilíndrico ao redor do eixo de
simetria rotacional 5x, rodeado por estreitas depressões do tipo canyon, pequenas
projeções, espículas (spikes) ao redor do eixo de simetria 3x e depressões do tipo
22
dimple, no eixo 2x (TSAO et al., 1991). Estas estruturas apresentam funções
biológicas importantes (PARRISH et al., 1991; LANGEVELD et al., 1993) (Figura
2A/B).
Os canyons seriam possíveis candidatos a sítios de ligação para receptores
celulares, pois correspondem às regiões mais conservadas dos genes estruturais
VP1/VP2 e ao mesmo tempo são inacessíveis aos anticorpos neutralizantes. Por
outro lado, as espículas e depressões estão associadas a propriedades antigênicas,
seleção de hospedeiros e de aglutinação (TSAO et al.,1991; CHAPMAN &
ROSSMAN, 1993).
A B
Figura 2. (A) Estrutura do capsídeo do CPV determinada por cristalografia de raio-X
mostrando as quatro regiões morfológicas do capsídeo (Adaptado de Allison et al., 2016) (B)
Estrutura tridimensional do capsídeo do CPV. Os canyons estão representados em verde,
ao redor do eixo de simetria 5x. As espículas correspondem às regiões em azul claro, ao
redor do eixo de simetria 3x. Os dimples estão representados em azul escuro, ao redor do
eixo de simetria 2x (TSAO et al., 1991).
O capsídeo apresenta um core central constituído por oito fitas antiparalelas
(B-I), com configuração espacial do tipo folhas beta (ß) (ß-barrel-motif) com
projeções (loops) flexíveis 1 a 4, entre estas fitas, que correspondem às principais
regiões expostas da superfície viral (TSAO et al., 1991) (Figura 3). A estrutura (β-
barrel) está localizada principalmente abaixo da superfície do capsídeo enquanto os
loops interagem para formar a maior parte da superfície do capsídeo e
correspondem às regiões hipervariadas de VP2 (AGBANJE, PARRISH,
ROSSMANN, 1995; TSAO et al., 1991; XIE & CHAPMAN, 1996).
Dois sítios antigênicos neutralizantes principais, denominados A e B, foram
mapeados e associados às espículas na superfície do CPV por análises com
anticorpos monoclonais (MAbs) e sequenciamento do DNA. O sítio antigênico A está
23
localizado na extremidade da espícula (threefold spike) e corresponde aos loops 1, 2
e 4 da VP2, por outro lado o sítio B está localizado na base da estrutura (shoulder) e
é formado pelo loop 3 (TSAO et al., 1991; STRASSHEIM et al.,1994).
Figura 3. Proteína de capsídeo do CPV: os Loops 1 a 4 são projetados a partir das oito
fitas antiparalelas (ß- barrel em azul), são formadas por 36 resíduos entre as fitas B e C
formando loop 1, 74 resíduos entre as fitas E e F formando loop 2 e 223 resíduos entre as
fitas G e H formando os loops 3 e 4. Em conjunto compõem as espículas virais e possuem
aminoácidos determinantes de diversas propriedades biológicas dos parvovírus. Esferas
mostram as posições dos resíduos nos sítios antigênicos A (vermelho) e B (azul)
(Hafenstein et al., 2009).
Os resíduos de maior importância para os Parvovírus relacionados tanto a
mudança de hospedeiro felino - canino como de caracterização das variantes
(CPV/FPV) estão localizados principalmente nos loops: 1 (resíduos 80, 91, 93, 101 e
103), 2 (232), 3 (299, 300, 323, 324), e 4 (426). O resíduo 426 está localizado na
região three-fold spike (eixo de simetria 3x), considerada a mais antigênica do
capsídeo sendo alvo de ligação de anticorpos neutralizantes (AGBANDJE,
PARRISH, ROSSMANN, 1995).
2.2.3 Organização do Genoma
O genoma viral consiste em um filamento de ácido desoxirribonucleico (DNA)
linear de 5.124 nucleotídeos, contendo nas extremidades 3’ e 5’ sequências
palindrômicas de aproximadamente 150 nucleotídeos (nt) (Figura 4) (REED;
JONES; MILLER, 1988).
24
O genoma dos parvovírus possuem apenas duas ORFs, que codificam quatro
proteínas: duas proteínas não estruturais (NS1 e NS2) e duas ou três proteínas
estruturais (VP1 e VP2/VP3) (Figura 4) (MORAES & COSTA, 2012).
As proteínas não estruturais (NS1 e NS2) são produzidas pela tradução de
mRNAs que sofrem splicing alternativo. A NS1 (87kDa) é essencial para a
replicação do genoma viral, e a NS2 (25kDa), está associada com a formação dos
capsídeos, controle da expressão gênica e também participa da replicação do
genoma. As proteínas produzidas a partir da outra ORF (VP1 e VP2) fazem parte da
estrutura do capsídeo. As proteínas VP1 e VP2 são traduzidas a partir de um
mesmo mRNA, após splicing, e compartilham a maior parte de sua sequência de
aminoácidos. A diferença entre a VP1 e VP2 resulta da utilização de diferentes
códons de iniciação pelos ribossomos. A VP3 é composta por uma sequência de
aminoácidos da região amino-terminal da VP2. Os mRNAs, produzidos pela
transcrição do genoma, possuem 5’ cap e são poliadenilados na extremidade 3’
(MORAES & COSTA, 2012).
Além disso, o genoma dos parvovírus canino e felino contém dois promotores
(P4 e P38), que dirigem a síntese das proteínas não estruturais e estruturais,
respectivamente (REED; JONES; MILLER, 1988). As proteínas estruturais são
codificadas por sequências de leitura aberta (ORF) que se sobrepõem: nt 2285-4786
para VP1 e nt 2786-4786 para VP2 (REED; JONES; MILLER, 1988; AGBANDJE,
PARRISH, ROSSMANN, 1995) (Figura 4).
Figura 4. Organização genômica e mapa de transcrição do parvovírus canino. O genoma do
CPV é representado na orientação 3 '- 5'. A posição dos promotores P4/P38 e dos sítios de
iniciação da transcrição das proteínas VP1/VP2 estão indicados por setas pontilhadas e
preenchidas, respectivamente. As linhas contínuas representam a cadeia de RNA, e os
25
retângulos representam as ORFs codificantes das respectivas proteínas: NS1 e NS2 (não
estruturais); VP1 e VP2 (estruturais) (Adaptado de REED; JONES; MILLER, 1988).
2.3 Replicação do vírus
A infecção pelos parvovírus canino e felino está associada à habilidade do
capsídeo viral adsorver-se ao receptor de transferrina (Tf), uma glicoproteína de
superfície celular expressa na maioria das células do organismo, responsável pelo
transporte de ferro para o interior da célula (HUEFFER & PARRISH, 2003; PARRISH
& KAWAOKA, 2005).
Em células com intensa atividade mitótica estes receptores podem ser
encontrados em níveis elevados, representando os principais alvos do CPV e FPV
nos animais. A idade de um animal infectado é muito importante para o
estabelecimento dos principais alvos da infecção pelo parvovírus, sendo os tecidos
fetais ou de recém-nascidos uma rica fonte de células em atividade mitótica. Em
animais jovens o tecido linfoide e particularmente o epitélio do intestino delgado
apresentam intensa proliferação celular (STEINEL et al., 2001).
Os tipos novos de CPV são capazes de se ligar tanto ao receptor de Tf canino
como felino, enquanto que o FPV apenas a receptores de Tf felinos. Por essa razão
o FPV não é capaz de infectar cães e de se replicar em cultura de células caninas
(HUEFFER & PARRISH, 2003; PARRISH & KAWAOKA, 2005).
Após a ligação destes vírus ao receptor de Tf ocorre a formação de um
complexo (vírus-receptor) que é rapidamente transportado para um sistema
endossomal no interior da célula. A penetração ocorre por via endocítica, e os
vírions são transportados rapidamente até as proximidades do núcleo celular.
Durante esse trajeto, as partículas virais são expostas a pH progressivamente mais
baixo no interior do endossomo, o que induz alterações na conformação das
proteínas do capsídeo. No interior dos endossomos, as partículas virais sofrem três
alterações importantes: exposição da região amino-terminal da VP1, clivagem da
região amino-terminal da VP2 e, finalmente, desnudamento do genoma (Figura 5)
(MORAES & COSTA, 2012).
26
Figura 5. Esquema do ciclo replicativo dos parvovírus (Adaptado Moraes & Costa, 2007).
Ao contrário da maioria dos outros vírus de DNA, os parvovírus são
incapazes de ativar a síntese do DNA nas células hospedeiras. Sua replicação está
no núcleo (Figura 5) e as células infectadas devem ser ativamente mitóticas
(HARTMANN, 2015). Isso acontece porque o genoma dos parvovírus não codifica a
enzima necessária para a etapa inicial da replicação do DNA, a DNA polimerase,
que é responsável pela síntese da fita de DNA complementar ao DNA viral simples
fita. Como a DNA polimerase celular é somente expressa durante a mitose, a
primeira e crucial etapa da replicação viral, portanto, requer a divisão celular (fase S
tardia ou G2 do ciclo mitótico) (TSAO et al., 1991).
No núcleo, o genoma DNA de fita simples (ssDNA) é, inicialmente,
convertido em DNA de fita dupla (dsDNA) por enzimas celulares, seguido da
expressão (transcrição, transdução) das proteínas NS1 e NS2. Com a produção das
proteínas não estruturais (NS1/NS2) e uma vez completada a primeira cadeia de
dsDNA, a polimerização continuaria produzindo uma cópia linear dupla que
corresponderia a quatro cópias do genoma viral (duas polaridade positiva e duas
negativas). Essa macromólecula composta por múltiplas cópias do genoma seria,
então, separada e individualizada pela atividade endonuclease da NS1, que clivaria
Transcrição
Liberação da partícula viral: Lise celular
Proteínas estruturais e não
estruturais
Desnudamento Núcleo
Montagem
- DNA
Infecta células em atividade
mitótica
Endocitose mediada
por receptor
27
o multímero em unidades genômicas de polaridade positiva e negativa. Em geral, as
moléculas de DNA de polaridade negativa são preferencialmente encapsidadas. A
síntese das proteínas estruturais ocorre no citoplasma da célula e os genomas
recém-replicados são encapsidados pelas proteínas estruturais VP1 e VP2 no
núcleo, originando as novas partículas víricas, que são liberadas da célula por lise
celular (MORAES & COSTA, 2012).
A replicação viral em cultura de células pode ser observada pela presença
de corpúsculos de inclusão intranucleares (Figura 6) corados pelo método de May
Grunwald Giemsa (APPEL; SCOTT; CARMICHAEL,1979).
Figura 6. (A)Inclusões nucleares em células (CRFK) infectadas com FPV (B)
Imunofluorescências nuclear de células infectadas (CRFK) com FPV (Adaptado Hartmann,
2015).
Alguns aspectos do processo de replicação do vírus, incluindo a ausência de
algumas subunidades da DNA polimerase da célula hospedeira, a rápida replicação
do genoma e a natureza fita simples do genoma viral resultam em uma baixa
fidelidade de replicação dos parvovírus, facilitando a fixação de mutações
(HOELZER, SHACKELTON, PARRISH, 2008; HOELZER & PARRISH, 2010).
2.4 Evolução e Variabilidade Genética do Parvovírus Felino
A compreensão dos eventos envolvidos na evolução viral é importante, pois
tal variação pode levar a alterações na antigenicidade, no espectro de hospedeiros
ou no potencial patogênico, podendo determinar o sucesso da infecção viral em
novos hospedeiros ou sua resistência no ambiente (TRUYEN et al., 1995).
A B
28
O FPV já era reconhecido há muitos anos quando o CPV surgiu em 1978 e
tornou-se um vírus pandêmico. O CPV e FPV apresentam uma similaridade
genômica de aproximadamente 98% e diferem em cerca de 8-10 aminoácidos na
proteína de capsídeo VP2 (SIEGL, 1984; CHANG, SGRO, PARRISH, 1992;
PARRISH, 1995).
O CPV adquiriu a capacidade de infectar os cães através de mutações nos
resíduos 93 (Lys→Asn), 300 (AspGly) e 323 (Asp→Asn) de VP2 que se
encontram expostos na superfície do capsídeo, e permitiram ao CPV se ligar ao
receptor de transferrina tipo-1 (TfR) da célula canina (CHANG, SGRO, PARRISH,
1992; PARKER & PARRISH, 1997; PARKER et al., 2001).
O receptor de Tf é uma glicoproteína tipo II expressa na membrana da célula
como um homodímero e cada monômero consiste de três domínios:
carboxipeptidase-like, helicoidal e apical, e a interação do FPV e CPV com o
receptor ocorre por meio do domínio apical. A especificidade da ligação de cada
vírus ao receptor é determinada por um único sítio de glicosilação no domínio apical
do TfR, ou seja, uma mutação no resíduo 384 (KN) do TfR canino foi determinante
para impedir a infecção de cães, coiotes e lobos pelo FPV até a emergência do CPV
(PALERMO, HAFENSTEIN, PARRISH, 2006; ALLISON et al., 2012; 2014).
O aparecimento do CPV várias décadas após a descrição do FPV em gatos
(Felis catus) e MEV em martas (Mustela vison), levantou a hipótese de que outro
carnívoro possa ter albergado o ancestral do CPV-2. Apesar da disseminação global
do CPV ter ocorrido em 1978, amostras de soro obtidas de cães em 1974 na Grécia,
em 1976 na Bélgica e em 1977 nos Países Baixos, já apresentavam anticorpos para
este vírus (TRUYEN et al., 1998).
De modo a elucidar a alteração do espectro de hospedeiros destes vírus,
vários estudos de análise de sequências do genoma dos parvovírus de animais
domésticos e selvagens foram realizados (TRUYEN et al., 1995; 1998; HORIUCHI
et al., 1998; IKEDA et al., 2000; STEINEL et al., 2000; ALLISON et al., 2012; 2013).
Em 1983, a sequência de DNA de um parvovírus (Blue Fox Parvovirus –
BFPV) isolado de uma raposa azul (Alopex lagopus) na Finlândia, parecia ser um
intermediário entre o FPV e o CPV, porém, a sequência de aminoácido
correspondente agrupava este vírus com o FPV (TRUYEN et al., 1995).
A sequência parcial do gene da VP2 de um parvovírus isolado de uma raposa
vermelha (Vulpes vulpes) na Alemanha apresentou características intermediárias
29
entre o FPV e CPV, já que continha os aminoácidos 93 e 323 característicos do
CPV. Este achado, associado aos dados de um estudo sorológico que mostrou que
13% das raposas vermelhas da Alemanha apresentavam anticorpos para CPV pelo
teste de inibição da hemaglutinação, apoiou a hipótese de que o parvovírus de
raposa seja um possível ancestral do CPV (TRUYEN et al., 1998).
A seguir, a análise filogenética da sequência do gene da VP2 de parvovírus
de vários animais selvagens: onça parda (Puma concolor), coiote (Canis latrans),
lobo (Canis lupus), bobcat (Lynx rufus), guaxinim (Procyon lotor), cangambá
(Mephitis mephitis), mostrou que os diferentes isolados se organizam em dois
grupos maiores, um relacionado ao parvovírus felino (FPV-like) e outro ao parvovírus
canino (CPV-like) (ALLISON et al., 2013). Entretanto, as sequências de VP2 dos
isolados de guaxinim revelaram que estes vírus (Raccoon parvovirus - RPV) são
intermediários entre o CPV-2 e CPV-2a, já que RPV e CPV-2a partilham as mesmas
mutações nos resíduos 87 e 101 de VP2, sugerindo que estes hospedeiros podem
ter portado isolados intermediários no processo evolutivo do CPV, e com isso,
contribuído para a evolução do CPV-2a (ALLISON et al., 2012) (Figura 7).
Sendo assim, a capacidade de replicar em uma gama de hospedeiros é uma
propriedade chave dos parvovírus, o que reflete a diversidade de espécies (Canidae,
Felidae, Procyonidae, Mustelidae e Viverridae) que o vírus pode infectar
naturalmente (PARRISH et al., 1988). No entanto, o espectro de hospedeiros é
muitas vezes difícil de definir e outros fatores precisam ser associados, tais como a
susceptibilidade do hospedeiro à infecção, bem como a capacidade do vírus para
sofrer transmissão sustentada no novo hospedeiro (PARRISH & KAWAOKA, 2005).
O FPV não é único parvovirus que infecta gatos. Além do MEV, as novas
variantes de CPV-2 (2a, 2b e 2c) são capazes de replicar em gatos, causando
doenças indistinguíveis da panleucopenia felina (STEINEL et al., 2001).
Em consequência do deslocamento do espectro de hospedeiro do CPV de
cão para gatos, infecções naturais de gatos e felinos selvagens com CPV foram
relatadas (STEINEL et al., 2000), mas o FPV permanece a espécie mais prevalente
de parvovírus causadores de doenças em gatos naturalmente infectados
(BATTILANI et al., 2006; 2011; DECARO et al., 2008). Com isso, vem se observando
que o CPV iniciou um novo processo de readaptação em hospedeiros felinos,
confirmando a importância da evolução viral na mudança de tropismo/ infecção de
30
novos hospedeiros, como mecanismo para o surgimento de novos vírus (BATTILANI
et al., 2011).
Além disso, uma vez que os gatos são suscetíveis tanto ao CPV como FPV,
superinfecção e coinfecção podem ocorrer com múltiplas variantes de parvovírus,
facilitando a recombinação e heterogeneidade levando a evolução de novas
variantes e a um aumento na virulência (BRINDHALAKSHMI et al., 2016).
Diante disso, as variantes CPV-2a e CPV-2b provavelmente atuariam como
novos vírus emergentes em gatos, em que algumas seleções positivas específicas
de gato, poderiam operar como uma força motriz da evolução do CPV (IKEDA et al.,
2002). O relato de uma infecção mista com duas variantes de CPV (2a e 2c) em um
mesmo gato (BATTILANI et al., 2011) e a detecção de uma coinfecção de CPV-2a e
FPV em 2013, pelo mesmo grupo de estudo, em uma amostra fecal de um gato
sintomático de 3 meses de idade, geraram um questionamento sobre o papel
epidemiológico dos gatos, em que eles poderiam estar atuando como: (a)
reservatórios, uma vez que são suscetíveis tanto para o CPV como para o FPV ou
como (b) fontes de novas variantes de parvovírus (BATTILANI et al., 2013).
31
Figura 7. Relação filogenética entre os parvovírus de carnívoros baseada no gene
que codifica para a proteína de capsídeo VP2 (Adaptado Allison et al., 2012).
Em vermelho representa os isolados dos mãos-peladas; azul: CPV-2a/2b/2c; verde:
FPV; preto: CPV-2.
CPV-2a
CPV-2b
CPV-2c
Intermediário
Isolados dos mãos-peladas
Variantes dos Parvovírus: FPV CPV-2 Isolados dos mãos-peladas
CPV-2a/2b/2c
32
A definição do espectro de hospedeiro felino e canino do FPV e CPV está
relacionada basicamente à diferença de aminoácidos em VP2. Mudanças nos
nucleotídeos (nt) 3065 e 3753 que correspondem à sequência de aminoácidos nas
posições 93 (FPV: Lisina-Lys para CPV-2: Asparagina-Asn) e 323 (FPV: Ácido
aspártico-Asp para CPV-2: Asparagina-Asn) de VP2 conferiram ao CPV-2 a
capacidade de se ligar ao receptor de Tf canino e com isso infectar células caninas,
mas o vírus perdeu a capacidade de infectar células felinas (PARRISH et al., 1991;
TRUYEN & PARRISH, 1992; CHANG, SGRO, PARRISH, 1992; AGBANDJE,
PARRISH, ROSSMANN, 1995; HUEFFER & PARRISH, 2003) (Figura 8).
Além destes resíduos, a sequência do aminoácido na posição 103, nt 3094
(FPV: Valina-Val para CPV-2: Alanina-Ala), parece ser crítica para a habilidade do
CPV replicar em cães, enquanto que outras sequências influenciam o espectro de
hospedeiro felino do FPV, incluindo as diferenças nos nucleotídeos 3025, 4477 e
4489 que correspondem aos aminoácidos 80 (FPV: Lys e CPV-2: Arginina-Arg), 564
(FPV: Asn e CPV: Serina-Ser) e 568 (FPV: Ala e CPV: Glicina-Gly) (PARRISH et al.,
1991; TRUYEN & PARRISH, 1992; CHANG, SGRO, PARRISH, 1992; AGBANDJE,
PARRISH, ROSSMANN, 1995; HUEFFER & PARRISH, 2003).
Figura 8. Representação de uma unidade do capsídeo viral mostrando as posições dos
resíduos que alteraram durante a evolução do parvovírus canino (CPV). Resíduos que
variaram entre: FPV e CPV em azul, CPV-2 e CPV-2a em verde, CPV-2a em CPV-2b/2c em
amarelo (Adaptado de Hueffer & Parrish, 2003; Parrish & Kawaoka, 2005).
33
O tipo antigênico 2a que surgiu em 1979 e rapidamente substituiu o tipo
original (CPV-2) em circulação, difere do tipo original em apenas cinco substituições
de nucleotídeos (nt 3045, nt 3088, nt 3685, nt 3699, e nt 4499) que correspondem às
mudanças na sequência de aa nas posições: 87, 101, 300, 305 e 555 de VP2
(PARRISH et al., 1991; TRUYEN & PARRISH, 1992) (Quadro 1). Estas
substituições proporcionaram ao novo tipo de CPV ampliar seu espectro hospedeiro
aos felinos, contudo esta mudança na sequência de nucleotídeos não representou
uma reversão à sequência do FPV original (PARRISH & KAWAOKA, 2005).
O genoma dos CPV-2a e CPV-2b diferem em apenas dois nucleotídeos (nt
que o aa 555 do CPV-2b é idêntico ao do CPV-2, a mudança no aa 426 de Asn para
Asp foi determinante para o aparecimento do tipo 2b (PARRISH et al., 1991;
STEINEL et al., 2000).
Após 1990, os novos tipos em circulação (CPV-2a e 2b) passaram a
apresentar uma mutação no gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 (aa
297 Ser → Ala). Esta mutação representou uma vantagem evolutiva, e se fez
presente em mais de 90% dos isolados de CPV até o ano 2000 (TRUYEN, 1999;
HOELZER & PARRISH, 2010). Estas variantes (297 Ser→Ala) foram inicialmente
denominadas de “Novo CPV-2a” e “Novo CPV-2b”, entretanto esta nova
nomenclatura não é adotada por todos os autores (CASTRO et al., 2010; 2011)
(Quadro 1).
Em 2001, mais um tipo de CPV (CPV-2c) que apresenta uma mudança de aa
na posição 426 (Asp→Glu) da proteína VP2, foi relatado na Itália e já se disseminou
na população canina de vários países da Europa, Ásia, Oceania, Américas, inclusive
no Brasil (NAKAMURA et al., 2004; DECARO et al., 2006; HONG et al., 2007;
MEERS et al., 2007; PÉREZ et al., 2007; VIEIRA et al., 2008; CALDERON et al.,
2009; STRECK et al., 2009; CASTRO et al., 2010).
Embora as diferenças de nucleotídeos entre o CPV-2 e as variantes 2a/ 2b/2c
tenham ocasionado mudanças em epítopos neutralizantes definidos por anticorpos
monoclonais (TRUYEN, 1996), elas não foram capazes de alterar a
imunogenicidade conferida pelo vírus original (LARSON & SCHULTZ, 2008).
Algumas características do genoma viral dos parvovírus como tamanho e tipo
do genoma viral (único filamento de DNA), ocorrência de metilação em algumas
regiões do genoma (DUFFY; SHACKLETON; HOLMES, 2008; HOELZER;
SHACKELTON; PARRISH, 2008), a co-circulação de diferentes tipos de parvovírus
34
em uma mesma população canina e felina (STEINEL et al., 1998; HOELZER &
PARRISH, 2010) e a coinfecção de diferentes tipos em um mesmo indivíduo
(BATTILANI et al., 2007; VIEIRA et al., 2008) são fatores que podem modular o
processo evolutivo.
Quadro 1. Mutações no genoma do CPV durante a evolução do vírus em cães
(Adaptado de Hoelzer & Parrish, 2010).
Mutações (resíduo VP2)
Vírus Ano Prevalência relativa
Posição AA
80 Arg Lys FPV CPV Associado com mudança do espectro de hospedeiro de
gatos para cães alteração na ligação ao receptor de
transferrina
91
93
Ala Ser
Lys Asn
103 Val Ala
232 Val Ile
323 Asp Asn
375 Asn Asp
564 Asn Ser
568 Ala Gly
87 Met Leu CPV- 2 → CPV-2a 1979 1980: 100%
101 Ile Thr
300 Ala Gly
305 Asp Tyr
426 Asn Asp CPV-2a → CPV-2b 1984 30- 80% entre 1984 - 2005
297 Ser Ala “Novo” CPV-2a e 2b 1990 >90% em 2000
555
Ile → Val
CPV-2a e 2b
2001
Não estimada
426 Asp Glu CPV-2c 2001 Distribuição mundial
440 Thr Ala ~2005 Encontrado em vários países
Estudos demostram que o CPV está evoluindo significativamente mais rápido
que o FPV, com uma taxa de substituição de nucleotídeos para a proteína de
capsídeo VP2 em torno de 1,7x10-4 substituições sítio por ano, enquanto o FPV de
9,4x10-5 substituições sítio por ano, valores comparáveis aos observados em vírus
35
de genoma RNA (PARRISH & KAWAOKA, 2005; SHACKELTON et al., 2005;
DUFFY, SHACKLETON, HOLMES, 2008).
Um estudo realizado com isolados brasileiros de CPV-2a e 2b apresentaram
valores ainda maiores, de 2,4x10-4 substituições/ sítio/ ano para os genes que
codificam para as proteínas de capsídeo VP1 e VP2 (PEREIRA, LEAL, DURIGON,
2007).
Para outras proteínas não estruturais (NS1 e NS2) as taxas de mutações do
CPV e FPV são idênticas (7,9x10-5 substituições/ sítio/ ano), sugerindo que os genes
que codificam para estas proteínas estão sujeitos a uma menor pressão seletiva
(SHACKELTON et al., 2005).
2.5 Epidemiologia
O FPV é um vírus disseminado na natureza, epizoonótico e relatado em
quase todos os países do mundo, principalmente em áreas de grandes populações
de gato, como abrigos e residências com múltiplos animais (TUZIO, 2009).
Nos últimos 20 anos, com o uso de vacinas como medida de profilaxia contra
o FPV, a panleucopenia tornou-se menos prevalente na rotina clínica (GREENE,
2012). Em contrapartida, a situação parece bastante diferente em abrigos de
animais, que são locais de um influxo contínuo de gatos com histórico vacinal
desconhecido (PATTERSON et al., 2007; TRUYEN et al., 2009). Um estudo com 61
gatos selvagens na Flórida demonstrou que apenas 33% da população
apresentavam anticorpos para o vírus (FISCHER et al., 2007). Na Costa Rica, a
prevalência de anticorpos em gatos domésticos jovens foi de 92,8% (BLANCO et
al.,2009).
A faixa etária de maior incidência da doença é de animais menores de seis
meses de idade e não vacinados, embora os filhotes vacinados também possam
desenvolver a enfermidade. Isso ocorre pela interferência da imunidade materna
com a resposta vacinal (KRUSE et al., 2010).
A mortalidade varia de 25% a 90% em gatos não vacinados que apresentam
a forma aguda da doença e até 100% nas infecções mais graves. No entanto, a
prevalência de infecções subclínicas é desconhecida. Animais com até 12 meses de
36
idade e não vacinados foram os que apresentaram maior morbidade e mortalidade
(ADDIE et al., 1998; CAVE et al., 2002).
A transmissão ocorre pelo contato direto ou indireto dos animais suscetíveis
com os animais infectados, sendo o vírus mais encontrado nas fezes diarreicas
(HARTMANN et al., 2015). Portanto, a rota fecal-oral é a principal forma de
transmissão. Pela alta resistência do FPV no ambiente, a transmissão por fômites
contaminados pode desempenhar um importante papel na propagação da infecção.
A sobrevivência do vírus no ambiente pode chegar a até um ano em material
orgânico infectado (POOLE, 1972). Dessa forma, é possível que proprietários
transportem o vírus altamente contagioso para a casa em suas mãos, sapatos ou
roupas, infectando dessa forma os gatos que residem dentro de casa sem acesso a
outros animais (SCOTT, 1987).
O CPV tem sido isolado em uma variedade de gatos domésticos, bem como
em outros carnívoros (IKEDA et al., 1999; IKEDA et al., 2000; STEINEL et al., 2000).
Com isso, vem se observando que o CPV iniciou um novo processo de readaptação
em hospedeiros felinos e confirmado a importância da mudança de hospedeiro como
mecanismo para o surgimento de novos vírus (BATTILANI et al., 2011).
A prevalência de CPV em gatos com panleucopenia, ainda permanece
desconhecida. Em um estudo conduzido na Alemanha, cerca de 10% dos vírus
isolados de gatos que apresentavam panleucopenia foi diagnosticado como CPV-2a
ou uma variante derivada de CPV-2a (TRUYEN; PLATZER; PARRISH, 1996). No
Reino Unido, o CPV foi identificado em 33% das amostras fecais de gatos
clinicamente saudáveis em um estudo transversal com 50 gatos de um abrigo e em
34% das amostras fecais em um estudo longitudinal de 74 gatos em um abrigo misto
(canino e felino). Embora muitos gatos disseminassem CPV, a panleucopenia clínica
não foi diagnosticada, e amostras fecais de cães do abrigo misto foram negativas
para o vírus (CLEGG et al., 2012).
2.6 Patogenia e Manifestações Clínicas
O FPV causa a panleucopenia felina, uma infecção sistêmica caracterizada por
redução grave na contagem de glóbulos brancos circulantes (menos de 4000
células/µL) (AUGUST et al., 1989) (valor de referência normal para felinos: 5500 a
19500 células/µL – KANEKO; HARVEY; BRUSS, 2008).
37
Além disso, o FPV pode provocar uma enterite com degeneração das
vilosidades intestinais. No entanto, nem todos os gatos infectados com FPV
desenvolvem sinais clínicos e a gravidade depende da idade, do estado imunológico
e das infecções simultâneas (FOLEY et al., 1999).
Normalmente, os animais infectam-se pela via oral, com replicação inicial do
vírus nos tecidos linfoides da orofaringe dois dias pós-infecção (PI). Em seguida
ocorre uma intensa viremia 3 a 5 dias PI, levando à disseminação do vírus para
outros tecidos linfoides, tais como linfonodos, baço, timo e placas de Peyer, assim
como outros sistemas, incluindo medula óssea, animal prenhe e os fetos. Após a
fase virêmica, o vírus dissemina-se das placas de Peyer para as células do epitélio
germinativo das criptas do intestino delgado que se encontra em intensa atividade
mitótica. A infecção lítica destas células pode provocar a perda considerável do
epitélio intestinal responsável pelos sintomas de gastroenterite hemorrágica,
característicos da parvovirose (Figura 9). Quando ocorre a atrofia das vilosidades, o
intestino delgado perde a capacidade de absorção, pois o epitélio germinativo
responsável por substituir o epitélio maduro foi destruído. Devido à reposição celular,
que ocorre em 1-3 dias, esta perda normalmente é limitada (CSIZA et al., 1971;
MACARTNEY et al., 1984; POLLOCK & COYNE, 1993; SMITH-CARR, MACINTIRE,
SWANGO, 1997).
O vírus pode ser detectado nas fezes a partir do 3o e 4o dias PI, antes do
aparecimento dos sinais clínicos. A maior concentração do vírus nas fezes (109
partículas infecciosas por grama de fezes) é observada entre o 4o e 6o dias PI pelo
teste reação de hemaglutinação (HA), sendo raramente detectado a partir do 10º até
12o dia PI (APPEL & PARRISH, 1987; POLLOCK & COYNE, 1993).
Nos tecidos linfoides, o FPV pode causar uma depleção celular, gerando uma
imunossupressão funcional. A linfopenia pode aparecer como um resultado direto de
uma linfocitólise, mas também indiretamente, através de um recrutamento de
linfócitos para o interior dos tecidos (PARRISH, 1995). A medula óssea também é
afetada e a replicação do vírus tem sido descrita de forma precoce em células
progenitoras, justificando o efeito devastador sobre a população de células
mielóides. Isso é refletido pela definição da Panleucopenia que é observada em
gatos infectados (TRUYEN & PARRISH, 2000).
38
Figura 9. Esquema da patogenia da infecção pelo FPV (Adaptado Hoelzer, Shackelton,
Parrish, 2008).
As manifestações clínicas dependem do período em que a infecção ocorre. A
infecção intrauterina ou perinatal pode afetar o sistema nervoso central dos fetos,
levando a ataxia cerebelar e tremores, devido a replicação lítica do vírus nas células
de Purkinje (CSIZA et al., 1971) (Quadro 2). Em cães, uma relação entre miocardite
e infecção neonatal foi descrita quando o CPV surgiu. Em gatos, a miocardite
relacionada ao parvovírus não foi comprovada e o miocárdio não mostrou ser um
sítio de replicação do FPV. No entanto, o genoma viral foi identificado em um
número significativo de gatos adultos que morreram de cardiomiopatia (MIYAZAWA
et al., 1999; MEURS et al., 2000). Recentemente, McEndaffer e colaboradores
(2017) concluíram que a endomiocardite e a fibrose endomiocardial do ventrículo
esquerdo de gatos pode ser de etiologia infecciosa, porém, não encontraram
associação com a infecção por FPV ou CPV.
A infecção por FPV em filhotes de gatos com mais de seis semanas de idade
é caracterizada por anorexia, febre, vômito, diarreia hemorrágica e leucopenia
(JOHNSON, MARGOLIS, KILHAM, 1967; CARPENTER, 1971). A diarreia é causada
pelo encurtamento da vilosidade intestinal devido à perda - às vezes completa - das
células epiteliais. O vírus replica em células que se dividem rápido como as células
Tonsilas e linfonodos
Porta de entrada do FPV
VIREMIA
Baço Dia 1
p.i
Timo
Dia 1 PI
Intestino
Dia 3 PI
Medula óssea
Dia 3 PI
Disseminação viral do FPV
Dia 4-9 PI
39
da cripta de Lieberkühn, prejudicando a regeneração do epitélio intestinal
(PARRISH, 2006).
Quadro 2. Infecção pelo Vírus da Panleucopenia Felina com suas consequências
patológicas e manifestações clínicas (Adaptado Chandler EA, Gaskell RM, Gaskell CJ,
eds. Feline Medicine and therapeutics. 3rd edn. Oxford: Blackwell Publishing, 2004).
Células afetadas Consequências Manifestações clínicas
Epitélio da cripta
intestinal Colapso de vilosidade e enterite Diarreia
Nódulos linfáticos e timo
Depleção do centro germinativo,
apoptose de linfócitos e
atrofia do timo
Linfopenia
Medula óssea Depleção de células
Neutropenia
(seguida de
trombocitopenia e
anemia)
Células fetais Morte fetal Perda da gestação
Desenvolvimento do
cerebelo Hipoplasia cerebelar Ataxia cerebelar
Embora o FPV afete gatos de todas as idades, os filhotes são mais
suscetíveis, podendo chegar numa taxa de mortalidade de 90% nessa idade
(TRUYEN et al., 2009). A mortalidade nas infecções por FPV parece estar
estritamente relacionada às condições gerais dos animais antes da infecção e a
gravidade da infecção é aumentada quando há coinfecção com outras viroses
entéricas, como o Coronavírus Felino (CSIZA et al., 1971).
Um estudo de infecção experimental demonstrou que gatos livres de
patógenos específicos (specific pathogen free-SPF) ou livres de germes (germ free)
inoculados com FPV apresentaram leucopenia ou ausência de sinais clínicos
durante o período de observação, enquanto que gatos convencionais apresentaram
depressão, vômito, diarreia e leucopenia grave, chegando a óbito em quatro dias
após a inoculação. A observação de poucas lesões intestinais ou ausência destas
nos gatos SPF sugere que as lesões intestinais sejam causadas mais
provavelmente por infecção bacteriana secundária do que infecção viral primária
(CARLSON, SCOTT, DUNCAN, 1977). Os gatos normalmente morrem de
a
(a) Haemorrhagic enteritis is a common feature of feline panleukopenia, leading to the hallmark clinical manifestation of haemorrhagic diarrhoea. Courtesy of (a) Marian C Horzinek; (b) Albert Lloret
40
complicações associadas à septicemia, desidratação e coagulação intravascular
disseminada (CID) (TUZIO, 2009).
Em gatos de abrigo, os sinais clínicos mais observados são anorexia,
desidratação, febre e diarreia. Em gatos com infecções fatais, a morte é precedida
por sinais clínicos de choque séptico (LITSTER & BENJANIRUTL, 2013).
A infecção subclínica atua de forma significativa na epidemiologia da doença,
visto que animais infectados assintomáticos eliminam partículas virais nas fezes e,
como não se apresentam doentes, são mantidos em contato direto ou indireto com
animais suscetíveis. Nesses casos, a transmissão é facilitada principalmente em
locais onde há grandes concentrações de animais, como: canis e gatis de criação,
exposições zootécnicas ou clínicas veterinárias, possibilitando a infecção de cães e
gatos suscetíveis (POLLOCK & CARMICHAEL, 1990; COYNE, 1996). Esta forma da
doença pode ser observada em filhotes com idade superior a seis meses
(GLICKMAN et al., 1985) e adultos (POLLOCK & COYNE, 1993; BERGMANN et al.,
2017).
Apesar dos tipos CPV-2a e CPV-2b terem sido isolados de gatos com
sintomatologia clínica compatível com parvovirose, a patogenicidade destes vírus
em felinos domésticos ainda é discutida (MOCHIZUKI; HARASAWA; NAKATANI,
1993; MOCHIZUKI et al., 1996). Estudos de infecção experimental demonstraram
que CPV-2a e 2b eram capazes de infectar felinos, mas não causavam
manifestações clínicas claras, apenas uma leucopenia transitória (CHALMERS et al.,
1999; SAKAMOTO, ISHIGURO, MOCHIZUKI, 1999); outros observaram óbito em
2/3 animais inoculados com uma amostra de CPV-2b isolada de um gato com
infecção pelo parvovírus (GAMOH et al., 2003).
Da mesma forma, DECARO e colaboradores (2010) detectaram CPV-2c em
uma amostra fecal de um filhote de gato que veio a óbito após um quadro grave de
gastrenterite hemorrágica. Por esta razão, a circulação dos novos tipos de CPV em
felinos domésticos, principalmente associada à doença clínica, deve ser monitorada.
41
2.7 Diagnóstico Laboratorial
O diagnóstico da infecção pelo FPV na rotina clínica geralmente é realizado
usando uma combinação do histórico, sinais clínicos e exames laboratoriais
(hemograma completo e teste de antígeno de amostra fecal) (GREENE, 2012;
TRUYEN, 2009).
O diagnóstico laboratorial baseia-se na detecção ou isolamento do FPV a partir
de amostras fecais de animais com diarreia, principalmente dos casos agudos, pois
neste estágio a quantidade de vírus eliminada pelo animal infectado pode alcançar
até 109 TCID50/g de fezes ou sangue total nos casos não diarreicos (CARMICHAEL,
JOUBERT; POLLOCK, 1980; APPEL & PARRISH, 1987; MOCHIZUKI; HARASAWA;
NAKATANI, 1993; HIRASAWA, KANESHIGE, MIKAZUKI, 1994). Entre os métodos
de diagnóstico citam-se: (a) isolamento do vírus em culturas de células de rim de
gato (Crandell feline kidney – CRFK, (b) reação de hemaglutinação (HA) com
eritrócitos suínos, (c) testes rápidos baseados no ensaio imunoenzimático ou
imunocromatográfico e (d) detecção do genoma viral por PCR e/ou PCR em tempo
real (qPCR) (APPEL & PARRISH, 1987; GOTO, 1975; MIYAZAWA et al., 1999;
STRECK et al., 2013).
Os testes mais utilizados na rotina clínica são os testes rápidos e a estreita
relação estrutural e antigênica entre FPV e CPVs (MOCHIZUKI & AKABOSHI, 1988;
PARRISH, 1991) oferece o potencial de testar gatos para FPV usando kits de teste
caninos (CPV). Esses testes têm um valor aceitável de sensibilidade (até 60%) e
especificidade (até 100%) em comparação com os métodos clássicos (NEUERER et
al., 2008).
A caracterização das amostras de parvovírus em FPV ou CPV só pode ser
realizada por meio do sequenciamento genômico. A determinação da sequência de
nucleotídeos do gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 permite definir o
tipo de parvovírus presente na amostra e a análise da relação de homologia de nt e
aa do recente isolado com as amostras de parvovírus disponíveis em bancos de
dados (GenBank) (IKEDA et al., 2000; STEINEL et al., 2000; BATTILANI et al., 2002;
NAKAMURA et al., 2004; SHACKELTON et al., 2005; WANG et al., 2005; DECARO
et al., 2008; DECARO et al., 2009; DECARO et al., 2010).
Os testes imunológicos baseados na detecção de anticorpos de FPV, tais como
o ensaio imunoenzimático (ELISA indireto), são considerados de valor diagnóstico
42
limitado, pois não diferenciam entre infecção e anticorpos induzidos pela vacinação
(FISCUS et al.,1985; HOFMANN et al.,1996).
2.8 Imunidade e Profilaxia
A resposta imune duradoura ocorre após a infecção natural em que o animal
desenvolve os anticorpos neutralizantes que podem ser detectados a partir do 5º a
6º dias PI. Os anticorpos maternos representam a principal proteção contra a
infecção por FPV em filhotes de gatos com poucas semanas de idade e podem ser
transferidos via transplacentária (em torno de 10%) e principalmente através do
colostro (90%), apresentando meia vida de 9,7 dias (POLLOCK & CARMICHAEL,
1982; MOORE, 1983; MURPHY et al., 1999).
A prevenção da panleucopenia felina em gatos domésticos também é
realizada pela vacinação com vírus atenuados ou inativados (PATTERSON et al.,
2007). Enquanto a vacina de FPV atenuada parece ser eficiente na proteção da
infecção por CPV (CHALMERS et al., 1999), Steinel et al. (2000) relataram que
vacinas de FPV inativadas não são sempre eficazes contra a infecção por CPV em
felinos selvagens.
Em filhotes, uma das causas mais comuns de falha vacinal é a interferência
pelos anticorpos maternos. Alguns estudos mostram que existe um período (até a
12ª semana de idade) de suscetibilidade em que o título de anticorpos maternos
interfere na resposta à vacinação, mas não protege o filhote da infecção pelo vírus
selvagem (POLLOCK & CARMICHAEL, 1982; JACKEL et al., 2012).
O protocolo vacinal para gatos sugere um mínimo de duas doses - uma com 8
a 9 semanas de idade e a segunda após 3-4 semanas (com no mínimo 12 semanas
de idade) a ser administrado em gatos que vivem em situações de baixo risco. Em
situações de maior risco, recomenda-se uma terceira vacinação às 16 semanas. Os
anticorpos maternos podem persistir além da 12ª semana em alguns gatos, como
sugerem os dados de campo, de modo que a vacinação na 12ª semana não induz
proteção. Portanto, uma terceira vacinação na 16ª semana de vida deve ser dada a
filhotes que convivem com outros gatos ou animais de abrigo. A vacinação na 16ª
semana também deve ser considerada para filhotes nascidos de gatas com títulos
elevados de anticorpos, pois é provável que transmitam altos níveis de anticorpos
maternos que podem persistir por mais de 12 semanas em seus filhotes (por
43
exemplo, fêmeas que se recuperaram de doenças, que viveram em um ambiente de
alta exposição ou que receberam vacinas antes ou durante a gestação) (DAWSON
et al., 2001; KRUSE et al., 2010; JAKEL et al., 2012; SQUIRES, 2018).
Os gatos que respondem à vacinação com FPV mantêm uma imunidade sólida
durante pelo menos sete anos. No entanto, é recomendada a revacinação. Todos os
gatos devem receber o 1º reforço 12 meses após a conclusão da primovacinação
(isto assegurará imunidade induzida por vacina adequada para gatos que podem
não ter adequadamente respondido a primovacinação). Seguindo este primeiro
reforço, as revacinações subsequentes são recomendadas em intervalos de três
anos ou mais, a menos que se apliquem condições especiais (SCOTT &
GEISSINGER, 1999; LAPPIN et al., 2002).
Mesmo assim é importante isolar os filhotes, principalmente em canis e gatis,
de maneira que eles não entrem em contato com animais infectados antes de
completarem o protocolo de vacinação (POLLOCK & COYNE, 1993; HOSKINS,
1998; MURPHY et al., 1999).
Apesar de a vacina ser uma medida de profilaxia à infecção pelo FPV, um
recente estudo de campo na Alemanha demonstrou que 40% dos 244 gatos com
panleucopenia felina tinham recebido pelo menos uma dose de vacina (KRUSE et
al., 2010). Hoffmann e colaborabores (2010) relataram vários surtos de
panleucopenia felina em gatos domésticos no período de 2008/2009 na Alemanha e
em um estudo de campo subsequente revelou que 36,7% dos filhotes não
desenvolveram anticorpos, apesar de terem recebido três doses de vacinas na idade
de 8, 12 e 16 semanas.
Atualmente, com a detecção de variantes de CPV na espécie felina, surgiu o
debate sobre a eficácia das vacinas baseadas em FPV contra a infecção pelas
novas variantes de CPV-2 (2a/ 2b e 2c) e ressaltando a necessidade de intensificar
a vigilância na infecção por CPV em gatos (DECARO et al., 2010; BATTILANI et al.,
2011).
44
3 OBJETIVOS
3.1 Geral:
Analisar a diversidade genética das variantes de parvovírus circulantes em
felinos domésticos com gastrenterite no Estado do Rio de Janeiro.
3.2 Específicos:
Realizar o diagnóstico molecular dos parvovírus em amostras fecais de gatos
com diarreia no período de 2008 a 2017.
Verificar a variabilidade genética dos parvovírus de gatos por meio do
sequenciamento e análise filogenética do gene da proteína de capsídeo viral
VP2.
Investigar a associação da infecção por parvovírus e outros vírus entéricos
(coronavírus felino, calicivírus entérico felino, norovírus felino, astrovírus felino,
rotavírus grupo A) com a gravidade dos sinais clínicos.
45
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Considerações sobre os aspectos éticos
Este projeto obteve a aprovação do COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
ANIMAL (PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO) sob o número os
protocolos 653 e 654 de agosto de 2015 (Anexo II).
4.2 Amostras clínicas
Para a realização deste estudo, foram utilizadas amostras fecais diarreicas de
75 gatos com até um ano de idade coletadas no período de janeiro de 2008 a junho
de 2017, de abrigos, residências, clínicas e hospitais veterinários no Estado do Rio
de Janeiro. Das 75 amostras, 54 já pertenciam ao banco de amostras do Laboratório
de Gastrenterites Virais e Parvovírus do Departamento de Microbiologia e
Parasitologia da UFF. Outras 21 amostras foram coletadas no decorrer deste estudo
(março de 2016 a junho de 2017).
As amostras foram coletadas após defecação espontânea e mantidas a –20ºC
até o envio ao laboratório onde ficavam estocadas nas mesmas condições até o
processamento. Cada amostra foi acompanhada de uma ficha preenchida pelo
responsável pela coleta, contendo dados de identificação do animal, data de coleta,
sinais clínicos e histórico vacinal. Cada amostra foi identificada com a sigla do
estado de origem (RJ), seguido pelo número da amostra no laboratório e pelo ano
de coleta.
Outras 15 amostras fecais de cães com até um ano de idade, coletadas no
mesmo período deste estudo (2008 - 2017), pertencentes à coleção do Laboratório,
positivas para CPV por PCR, e que possuíam a região de VP2 parcialmente
sequenciadas (985bp) de estudos anteriores (CASTRO et al., 2007; 2010;
DOMINGUES, 2015) também foram analisadas a fim de comparar com as
sequências de gatos do estudo
Conforme demonstrado na Tabela 1, dos 75 gatos, 72 eram sem raça
definida (SRD) e os outros três eram de raça pura. Em relação à faixa etária, 53
(70,6%) animais tinham entre um e seis meses de idade, enquanto 22 (29,3%) entre
seis e doze meses. O histórico vacinal de 59 animais era conhecido, sendo que
10/59 receberam pelo menos uma dose de vacina quádrupla/ quíntupla contra vírus
46
da rinotraqueíte felina, calicivírus felino e vírus da panleucopenia felina, Chlamydia
psittaci e vírus da leucemia felina (quíntupla). Os demais 49 animais não receberam
nenhuma dose de vacina. Todos os gatos estudados eram do Estado do Rio de
Janeiro: Guaratiba (8), Magé (5), Niterói (37), Sepetiba (2), cidade do Rio de Janeiro
(17) e Rio Bonito (6).
Tabela 1. Distribuição das amostras testadas neste estudo de acordo com o sexo,
faixa etária, raça, histórico de vacinação e origem dos gatos e cães.
a SRD = Sem Raça Definida
b Pêlo curto brasileiro (PcB)
Gatos Cães
Sexo
Fêmea 33 4
Macho 28 10
Sem dados 14 1
Faixa etária (meses)
≤6 53 13
7-12 21 1
Sem dados 1 1
Raça
SRDa 72 4
Pura b,c 3b 10c
Sem dados - 1
Vacinação
Sim 10 6
Não 49 3
Sem dados 16 6
Origem
Abrigo 18 -
Domicílio 21 1
Clínica 24 13
Resgate 12 -
Sem dados - 1
47
c Bulldog Francês (1), Golden retriever (1) , Pit Bull Terrier (1) , Poodle (1), Pug (1), Rottweiller (6) e
Shih- tzu (1).
4.3 Processamento das amostras clínicas
4.3.1 Suspensão fecal a 20%
Inicialmente foi preparada uma suspensão a 20% de cada amostra fecal em
solução Tris-Ca++ 0,01M pH 7,2 (Anexo I). A seguir adicionou-se igual volume de
clorofórmio e após agitação em vórtex por 1 minuto, as suspensões foram
centrifugadas a 1000 rpm por 15 minutos, os sobrenadantes foram acondicionados
em tubo plástico de 1,5 mL até o momento da análise (CARMICHAEL; JOUBERT;
POLLOCK, 1980).
4.3.2 Extração do genoma viral
Após o preparo da suspensão fecal a 20%, procedeu-se a extração do
genoma viral com o uso do kit PureLink RNA/DNA kit (Invitrogen®), conforme
instruções do fabricante.
4.4 Análise do genoma dos Parvovírus
4.4.1 Iniciadores de cadeia utilizados na PCR para detecção e caracterização
molecular dos parvovírus
O par de iniciadores 555For/555Rev (4003-4585) que amplifica um fragmento
de 583pb do gene que codifica a proteína de capsídeo viral VP2 (BUONAVOGLIA et
al., 2001) foi utilizado na PCR para triagem das amostras para parvovírus (Figura
10, Tabela 2)
Para sequenciamento completo do gene que codifica a proteína VP2 (1755pb)
as reações de amplificação foram realizadas com os seguintes pares de iniciadores:
HFor/HRev e 555For/555Rev, já descritos na literatura (BUONAVOGLIA et al.,
2001) e que amplificam uma região do genoma (3556-4585) que contém alguns
aminoácidos importantes para definição do espectro de hospedeiros (297, 300, 305,
323, 564 e 568) e caracterização dos novos tipos de CPV (426 e 555).
CPV-4For/Rev (2951-3578), CPV-8For/Rev (2948-3582) e CPV-5For/Rev
(2307-2970) desenhados para este estudo por meio do programa Primer-BLAST
48
disponível no site http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, com base nas sequências
protótipos de parvovírus felino FPV-b (M38246) e canino CPV-d (M38245). As
sequências forward e reverse dos respectivos iniciadores foram alinhadas pelo
método CLUSTAL W contido no programa BioEdit® (HALL et al., 1999), com
protótipos de FPV e CPV que possuíam as sequências completas do genoma
disponíveis no GenBank. A confirmação da especificidade dos iniciadores foi feita
mediante o uso da ferramenta BLAST também disponível no site
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Através dessa ferramenta foram observados
100% de similaridade entre as sequências dos iniciadores desenhados e as
sequências disponíveis no banco de dados do GenBank de FPV, MEV e CPV-2
(CPV-2a, 2b, 2c).
Estes iniciadores (CPV-4For/Rev, CPV-8For/Rev e CPV-5For/Rev) foram
utilizados para amplificar a região do gene de VP2 (2787-3555) que contém outros
resíduos importantes para caracterização dos parvovírus (80, 87, 93, 101 e 103).
Figura 10. Localização da sequência dos iniciadores de cadeia utilizados na detecção do
genoma e caracterização molecular dos parvovírus.
VP1 (80kDa)
VP2 (65kDa)
4786
4786
ATG (nt 2285)
ATG (nt 2786)
2970 2307 CPV-5For/Rev
2948 3582 CPV-8For/Rev
3578 2951 CPV-4For/Rev
3556 4166 HFor/Rev
4585 4003 555For/Rev
49
Tabela 2. Descrição dos iniciadores utilizados na reação em cadeia pela polimerase
(PCR) para a detecção do genoma e caracterização molecular dos parvovírus com o
tamanho em pares de bases (pb) de seus respectivos produtos.
Iniciadores Posição (DNA) Sequência (5’- 3’) Produto (pb)
CPV-5Fora
CPV-5Rev
(2307-2326)
(2951-2970)
GCCAGGAGAGGTAAGGGTGT
TGATTTCCACCCACCCGTTT 664
CPV-8Fora
CPV-8Rev
(2948-2967)
(3559-3582)
GGAAAACGGGTGGGTGGAAA
TGTTCCTGTAGCAAATTCATCACC 634
CPV-4Fora
CPV-4Rev
(2951-2970)
(3555-3578)
AAAC GGGTGGGTGGAAATCA
CCTGTAGCAAATTCATCACCTGT 627
HForb
HRev
(3556-3575)
(4183-4166)
CAGGTGATGAATTTGCTACA
CATTTGGATAAACTGGTGGT 610
555Forb
555Rev
(4003-4022)
(4561-4585)
CAGGAAGATATCCAGAAGGA
GGTGCTAGTTGATATGTAATAAACA 583
a Iniciadores desenhados neste estudo
b Buonavoglia et al., 2001
4.4.2 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção do genoma
Para a detecção do genoma viral, a PCR foi realizada em termociclador
automático em um volume final de 50 µL (40 µL da mistura de reação contendo os
iniciadores 555For/555Rev e 10µL do DNA extraído) (Quadro 3 e Tabela 3) nas
seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por 10 minutos, seguida de 35
ciclos a 94ºC por 30 segundos, 50ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto e extensão
final de 72ºC por 10 minutos (BUONAVOGLIA et al., 2001, CASTRO et al., 2010).
Todos os cuidados e precauções para o trabalho com métodos de amplificação
genômica foram seguidos, sendo cada etapa realizada em uma área distinta. Como
controle positivo foi utilizado à vacina para FPV disponível no Brasil (Felocell CVR®-
C) e como controles negativos: água Nuclease-Free water (IDT®) e suspensão fecal
felina PCR negativa (Figura 11 e Quadro 3).
Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a
1,2% em tampão TBE 0,5X (Anexo I). Utilizou-se como padrão de corrida o 100bp
DNA Ladder (Invitrogen® Life Technologies, U.S. A). O gel foi corado em solução de
brometo de etídio a 0,5µg/mL (Anexo I) e os produtos amplificados foram
visualizados através de fotodocumentador L-Pix Ex (Loccus Biotecnologia).
50
Quadro 3. Reagentes utilizados na reação em cadeia pela polimerase para
detecção do genoma dos Parvovírus.
Reagentes Volume por Reação (1x)
H2O Nuclease free water (IDT®) 27 µL
10X PCR Buffer (Invitrogen®) 5,0µL
dXTP (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) 2,5mM (Invitrogen®) 4,0 µL
MgCl2 50mM (Invitrogen®) 1,5 µL
555F 20 pmol (IDT®) 1,0 µL
555R 20 pmol (IDT®) 1,0 µL
Platinum Taq DNA Polymerase II (5U/µL) (Invitrogen®) 0,5 µL
Volume final 40 µL
4.4.3 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) para sequenciamento completo
do gene que codifica a proteína de capsídeo viral VP2
Para sequenciamento, as amostras positivas com os iniciadores
555For/555Rev, foram submetidas a novas reações com diferentes pares de
iniciadores a fim de amplificar a região de 1755pb do gene da VP2: CPV-5For/CPV-
5Rev (2307-2970), CPV-8For /CPV-8Rev (2948-3582), CPV-4For /CPV-4Rev (2951-
3578), HFor/HRev (3556-4183) e 555For/555Rev (4003-4585) (BUONAVOGLIA et
al., 2001; CASTRO et al., 2010; 2011) (Figura 11 e Tabela 3).
A reação com os iniciadores 555For/555Rev foi realizada conforme descrito
no item 4.4.2. A PCR com os iniciadores HFor/HRev foi realizada com as mesmas
concentrações de reagentes e condições da PCR que os iniciadores
555For/555Rev, exceto no número de ciclagem (40 ciclos) e na temperatura de
anelamento (52ºC) (Tabela 3).
Para os iniciadores desenhados neste estudo CPV-5, CPV-8 e CPV-4, foi
necessário estabelecer as condições das PCRs. As misturas das reações foram
preparadas com um volume final de 25µL, contendo 10mM de tampão de enzima
(10X) (Invitrogen®), 1,5mM MgCl2 (Invitrogen®), 2,5,mM de cada dNTP (Invitrogen®),
20pM de cada iniciador (IDT®), 0,5U de Platinum Taq DNA Polymerase II
(Invitrogen®) e 5 µL do DNA extraído das amostras. Inicialmente, a temperatura de
Melting (Tm) dos iniciadores foi calculada por meio do programa Tm da Thermo
Fisher Scientific, disponível no site https://www.thermofisher.com.br. A partir da Tm
51
de cada par de iniciador (CPV-5: 53,6°C, CPV-4: 51,2°C e CPV-8: 51,7°C), as
reações de amplificação foram realizadas variando-se a temperatura de anelamento:
CPV-4 e CPV-8: 50ºC–54ºC, CPV-5: 52ºC-56ºC (Tabela 3).
Tabela 3. Condições da PCR com os pares de iniciadores utilizados neste estudo
No
de Ciclos Iniciadores Etapa da Reação Temperatura Tempo
1x desnaturação 94oC 10 minutos
35 x
555For/Rev
anelamento
50 oC
CPV-5 55 ºC
CPV-4 51 ºC 1 minuto
CPV-8 51 ºC
40 x HFor/HRev anelamento 52°C 1 minuto
1 x extensão 72 oC 1 minuto
1 x extensão final 72 oC 10 minutos
4 oC ∞
Nas reações utilizou-se DNA viral extraído das seguintes amostras: vacina
para cães Vanguard® e para gatos Felocell CVR®-C, como controles positivos, além
de suspensões fecais PCR-positivas de origem felina (RJ1064/11) e canina
(RJ006/95), suspensão fecal felina PCR-negativa (RJ1246/16), além de água
DNAse/RNAse free, como controle negativo.
52
Figura 11. Fluxograma das amostras positivas para parvovírus submetidas ao
sequenciamento genômico.
CPV-8For/Rev 634pb
CPV-5For/Rev 664pb
555For/555Rev 583pb
CPV-4For/Rev 627pb
HFor/HRev 610pb
Sequenciamento BigDye terminator cycle sequencing kit.
Purificação das amostras High Pure PCR Purification Kit (Roche
®)
PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare
®)
Alinhamento de Sequências Programa BioEdit Sequence Alignment Editor 7.2.1
Comparação com sequências do GenBank Ferramenta BLAST
Árvore filogenética Programa MEGA v.7.0.2
Amostras fecais felinas 2008-2017
Amostras fecais caninas 2008-2017
53
4.4.4 Sequenciamento do gene da proteína VP2
Os produtos das reações de amplificação foram purificados utilizando o kit
comercial GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare®) ou High
Pure PCR Purification Kit (Roche), seguindo recomendações do fabricante. A reação
de sequenciamento foi realizada utilizando o kit comercial Big Dye Terminator® v 3.1
Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems®, CA, USA), conforme orientação do
fabricante.
Os cromatogramas das sequências foram obtidos a partir do sequenciador
automático ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA) do Laboratório Multiusuário de Microbiologia e Parasitologia (LMMP) da UFF,
conforme OTTO et al., 2008. Todas as amostras foram sequenciadas nas duas
direções (5’→3’e 3’→5’). Após o alinhamento com as sequências protótipos, as
regiões correspondentes aos iniciadores foram retiradas e um fragmento de 1755pb
foi utilizado na análise filogenética.
4.4.5 Análise de seleção positiva
As sequências foram submetidas à análise de seleção por meio do servidor
de domínio público Datamonkey (www.datamonkey.org) (DELPORT et al., 2010). A
partir deste servidor, o método MEME (Mixed Effects Modelo of Episodic Diversifying
Selection), foi utilizado (MURRELL et al., 2012).
4.4.6 Análise estrutural da proteína VP2 do CPV
A fim de avaliar se mutações poderiam causar impacto na estrutura da
proteína VP2, foi realizado a análise da estrutura da proteína VP2 do Parvovírus
Canino, a partir da estrutura do capsídeo vazio da VP2 descrita em WU &
ROSSMANN (1993), disponível na base de dados “Protein Data Bank” (PDB code
2CAS) (NEU et al., 2012) utilizando o software PyMol Molecular Graphics Systems
versão 3.3.0 (https://sourceforge.net/projects/pymol/).
4.4.7 Análise filogenética
A fim de comparar as sequências deste estudo com as descritas na literatura,
buscou-se no GenBank as sequências de FPV e CPV que possuíam a região
completa da proteína de capsídeo viral VP2. As sequências cujo ano de isolamento
da amostra não constava no GenBank ou no artigo publicado também foram
54
excluídas. As 176 sequências protótipos de FPV e 815 de CPV (CPV-2, 2a, 2b e 2c)
foram alinhadas usando o método CLUSTAL W, contido no programa BioEdit ® 7.2.1
(HALL et al., 1999) e analisadas no DAMBE (XIA & XIE, 2001) a fim de excluir as
sequências idêntica, restando então 85 sequências de FPV e 296 de CPV (Anexo
III).
Para determinar o melhor modelo a ser usado para calcular as distâncias
evolutivas foi usado o programa MEGA v.7.0.2 (TAMURA et al., 2018), que
determinou o modelo T92 + G + I seria o melhor a ser utilizado neste estudo. A
significância estatística das diferentes filogenias foi obtida pelo método Maximum
Likelihood (ML) através de 2.000 réplicas de bootstrap.
4.4.8 Análise dos eventos de recombinação genética
A detecção de possíveis eventos de recombinação, identificação de
sequências recombinantes e localização de pontos de quebra foram investigados
pelos métodos (Similarity Plot, Boot Scan e Find Sites) implementados no programa
SimPlot v 3.5.1 (LOLE et al., 1999) e os métodos (RDP, GENECONV, Bootscan,
MaxChi, Chimaera, SiScan e 3Seq) implementados no programa Recombination
Detection Program (RDP4) (MARTIN et al., 2015).
4.5 Detecção de outros vírus entéricos
As amostras fecais de felinos foram também testadas para a presença de
outros agentes virais associados à gastrenterites por RT-PCR e sequenciamento
(CASTRO et al., 2015).
A detecção de coronavírus (CoV) por RT-PCR foi realizada no decorrer deste
estudo, utilizando os iniciadores CCV1/CCV2, que amplificam o fragmento de 410pb
do gene que codifica para proteína M do envelope viral (PRATELLI et al., 1999).
Os resultados relativos à detecção de calicivírus entérico felino (FCV),
Norovírus felino (FeNoV), astrovírus (AstV) e rotavírus do grupo-A (RV-A) foram
obtidos de estudos anteriores do grupo (Castro et al., 2015). Para a detecção de
FCV e FeNoV foram utilizados os iniciadores P289 /P290 (FARKAS et al., 2004) e
FNoV-F9/FNoV-R15 (PINTO et al., 2012), que amplificam, respectivamente,
fragmentos de 300pb e 550pb do gene que codifica a RNA polimerase RNA
dependente (RdRp). Os iniciadores FN4D/RN4D que amplificam um fragmento de
55
673pb da NSP4 viral foram utilizados para detecção de Rotavírus do grupo A (RV-A)
(GÓMEZ et al., 2011), enquanto que para a detecção de Astrovirus (AstV) foram
utilizados três iniciadores: PanAstroF1, PanAstroF2 e PanAstroR, que amplificam um
fragmento de 422pb da RdRp (CHU et al., 2008).
56
5. RESULTADOS
5.1 Detecção de parvovírus em amostras fecais de gatos com diarreia a partir
da amplificação parcial do gene que codifica a proteína de capsídeo VP2
Das 75 amostras fecais de gatos domésticos coletadas no período de 2008-
2017, 30 foram positivas por PCR com os iniciadores 555For/555Rev, entretanto, 25
foram selecionadas para sequenciamento com base na intensidade do produto da
PCR em gel de agarose.
Entre as 25 amostras, 24 (96%) eram de animais até seis meses de idade. De
acordo com os sinais clínicos, 21 apresentaram diarreia não hemorrágica sendo que
quatro com vômito. Em relação ao histórico de vacinação, somente dois animais
receberam uma ou duas doses de vacina. A maioria das amostras (44%) foi coletada
em clínicas das cidades de Niterói e Rio de Janeiro e aproximadamente 30% (7/25)
foram provenientes de animais de abrigo ou resgate (Tabela 4). De acordo com a
ficha clínica os animais atendidos nas clínicas eram domiciliados.
.
Tabela 4. Distribuição das 25 amostras fecais de gatos domésticos utilizadas neste
estudo conforme a idade, local de coleta, histórico de vacinação e sinais clínicos.
Idade
(meses)
No de
animais
Local de coleta Vacinação Sinais clínicos
Abrigo Resgate Domicílio Clínica
Sim Não Sem
dados
DH DNH
V,
DNH
1 2 - 2 - - - 2 - - 2a -
2 13 2 1 6 4 - 9 4 - 9b 4
b
3 3 - - - 3 - 3 - - 3 -
5 1 - - - 1 - - 1 - 1 -
6 5 2 - - 3 2 2 1 4 1 -
9 1 - - 1 - - 1 - - 1 -
Total 25 4 3 7 11 2 17 6 4 17 4
DH = diarreia hemorrágica; DNH = diarreia não hemorrágica; V= vômito a dois evoluíram
a óbito
b um evolui a óbito
57
5.2 Sequenciamento completo do gene que codifica a proteína de capsídeo
viral VP2
Com a finalidade de amplificar o fragmento de 1755pb do gene da VP2, foi
preciso otimizar no laboratório as condições das reações de amplificação com os
pares de iniciadores desenhados neste estudo (CPV-5, CPV-8 e CPV-4). Foi
possível observar amplificação do fragmento esperado (CPV-5 = 664pb, CPV-8 =
634pb, CPV-4 = 627pb) nas amostras positivas (vacinas e suspensão fecal) com os
três pares de iniciadores em todas as temperaturas testadas, sendo que nas
temperaturas próximas ao Tm de cada iniciador observou-se uma maior intensidade
nas bandas após eletroforese em gel de agarose. Portanto, as PCRs foram
realizadas com as seguintes temperaturas de anelamento: 51ºC para os iniciadores
CPV-4 e CPV-8 e 55ºC para o CPV-5.
Foi possível observar diferenças na amplificação de amostras felinas com os
pares de iniciadores CPV-4 e 8, sendo que a reação com CPV-4 produziu
fragmentos com bandas de maior intensidade no gel de agarose e este iniciador foi
escolhido para amplificação desta região para sequenciamento.
Em relação a amostras caninas, a intensidade das bandas no gel com estes
pares de iniciadores (CPV-4 e CPV-8) foi a mesma, entretanto, os fragmentos
obtidos após amplificação com CPV-8 apresentaram após sequenciamento,
eletroferogramas com melhor qualidade para análise das sequências e filogenia.
5.3 Caracterização molecular dos Parvovírus em amostras fecais de gatos
domésticos
De modo a analisar as substituições de nucleotídeos nos fragmentos de
1755pb amplificados e as mudanças de aa, as 25 sequências de parvovírus obtidas
de amostras fecais de gatos domésticos em um período de nove anos (2008-2017)
foram comparadas com 381 sequências (85 gatos e 296 cães) obtidas do GenBank
(Anexo III). Além disso, quinze sequências de CPV obtidas de amostras fecais de
cães no mesmo período também foram analisadas.
As principais diferenças observadas entre as 25 sequências do gene que
codifica para a proteína VP2 geradas neste estudo e as sequências obtidas do
GenBank estão descritas nas Tabelas 5 e 6. Pôde-se observar mudanças de
58
nucleotídeos em 48 posições ao longo do fragmento amplificado sendo 32 sinônimas
(Tabela 5) e 16 não sinônimas (Tabela 6).
Das 32 alterações sinônimas, 29 ocorreram no 3º códon. As mudanças nas
posições 3657 (TTA → CTA), 4077 (CTA → TTA), 4533 (TTA → CTA) ocorreram no
1º códon, mas não alteraram o aminoácido: Leu (Anexo V).
Conforme destacado na Tabela 5, doze amostras felinas apresentaram
substituições sinônimas ainda não descritas RJ872/08, RJ874/08 (nt 2990, T → C; nt
3419, T C e nt 3458, A G), RJ1047/11, RJ1063/11, RJ1064/11, RJ1065/11( nt
3281,T → C), RJ922/08, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1161/12, RJ1198/13 (nt 3389, A
G; nt 3419, T C e nt 3890, A G ) e RJ1096/11 (nt 3419, TC). Além disso,
16/32 mudanças também foram descritas em sequências de parvovírus de cães.
59
Tabela 5. Substituições sinônimas encontradas a partir do alinhamento do produto
amplificado de 1755pb do gene que codifica a proteína VP2 das 25 amostras de
parvovírus de gatos do estado do Rio de Janeiro no período de 2008-2017.
posição nt
mudança de nt
aa Amostras
2804b GTT → GTA Val RJ872/08, RJ1018/10, RJ1063/11, RJ1129/12, RJ1217/14
2990a CTT → CTC Leu RJ872/08, RJ874/08
3032b GTA → GTG Val RJ872/08, RJ874/08, RJ990/10, RJ1047/11, RJ1048/11,
RJ1063/11, RJ1064, RJ1065/11, RJ1085/11, RJ1095/11,
RJ1129/12, RJ1213/15, RJ1217/14, RJ1218/14, RJ1219/14,
RJ1230/16, RJ1256/17
3191b GAG → GAA Glu RJ1047/11, RJ1048/11, RJ1063/11, RJ1064/11, RJ1065/11
3224 TTT → TTC Phe RJ1047/11, RJ1063/11, RJ1064/11, RJ1065/11
3281a,b
TAT → TAC Tyr RJ1129/12, RJ1217/14, RJ1218/14, RJ1219/14, RJ1213/15,
RJ1230/16, RJ1256/17
3377 TTT →TTC Phe RJ922/08, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1161/12, RJ1198/13
3389a AAA → AAG Lys RJ922/08, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1161/12, RJ1198/13
3416 TAT → TAC Tyr RJ872/08, RJ874/08
3419a TAT → TAC Tyr RJ922/08, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1096/11, RJ1161/12,
RJ1198/13
3446b CCA → CCG Pro RJ1095/11
3458a GGA → GGG Gly RJ872/08, RJ874/08
3485b TAT → TAC Tyr RJ872/08, RJ874/08, RJ990/10, RJ1018/10, RJ1047/11,
RJ1048/11, RJ1063/11, RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1085/11,
RJ1095/11, RJ1129/12, RJ1217/14, RJ1218/14, RJ1219/14,
RJ1213/15, RJ1230/16, RJ1256/17
3518 TAT → TAC Tyr RJ922/08, RJ1018/10, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1096/11,
RJ1161/12, RJ1189/13, RJ1198/13
3545 CAC → CAT His RJ872/08
3596b TGC → TGT Cys RJ872/08, RJ874/08, RJ922/08, RJ1018/11, RJ1047/11,
RJ1063/11, RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1085/11, RJ1095/11,
RJ1096/11, RJ1129/12, RJ1159/13, RJ1160/12, RJ1161/12,
RJ1189/13, RJ1217/14, RJ1218/14, RJ1219/14, RJ1213/15,
RJ1230/16, RJ1256/17
3617b CAT → CAC His RJ1129/12, RJ1217/14, RJ1218/14, RJ1219/14, RJ1213/15,
RJ1230/16, RJ1256/17
60
3657b TTA → CTA Leu RJ872/08, RJ874/08, RJ990/10, RJ1047/11, RJ1048/11,
RJ1063/11, RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1085/11, RJ1095/11,
RJ1129/12, RJ1189/13, RJ1217/14, RJ1217/14, RJ1218/14,
RJ1219/14, RJ1230/16, RJ1256/17
3722 AAA → AAG Lys RJ872/08, RJ874/08
3824b GAA →GAG Glu RJ872/08, RJ874/08, RJ990/10, RJ1047/11, RJ1048/11,
RJ1063/11, RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1085/11, RJ1095/11,
RJ1096/11, RJ1129/12, RJ1189/13, RJ1217/14, RJ1218/14,
RJ1219/14, RJ1213/15, RJ1230/16, RJ1256/17
3875 GGA →GGG Gly RJ922/08, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1161/12, RJ1198/13
3890a GAA →GAG Glu RJ922/08, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1161/12, RJ1198/13
3953b ACT → ACC Thr RJ872/08, RJ874/08, RJ990/10, RJ1018/10, RJ1047/11,
RJ1048/11, RJ1063/11, RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1085/11,
RJ1095/11, RJ1096/11, RJ1129/12, RJ1189/13, RJ1217/14,
RJ1218/14, RJ1219/14, RJ1213/15, RJ1230/16, RJ1256/17
4013b TAT → TAC Tyr RJ990/10, RJ1047/11, RJ1048/11, RJ1063/11, RJ1064/11,
RJ1065/11, RJ1129/12, RJ1217/14, RJ1218/14, RJ1219/14,
RJ1213/15, RJ1230/16, RJ1256/17
4077b CTA → TTA Leu RJ922/08, RJ1085/11, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1161/12,
RJ1189/13, RJ1198/13, RJ1218/14, RJ1213/15
4202 AAA → AAG Lys RJ872/08, RJ874/08
4307b ACG → ACA Thr RJ872/08, RJ874/08, RJ922/08, RJ990/10, RJ1018/10,
RJ1047/11, RJ1048/11, RJ1063/11, RJ1064/11, RJ1065/11,
RJ1085/11, RJ1095/11, RJ1096/11, RJ1129/12, RJ1159/12,
RJ1160/12, RJ1161/12, RJ1189/13, RJ1198/13, RJ1217/14,
RJ1218/14, RJ1219/14, RJ1213/15, RJ1230/16, RJ1256/17
4358b TAT → TAC Tyr RJ872/08, RJ874/08, RJ990/10, RJ1018/10, RJ1063/11,
RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1095/11, RJ1096/11, RJ1129/12,
RJ1217/14, RJ1256/17
4388 GTA → GTT Val RJ1064/11, RJ1065/11
4409b GCA → GCC Ala RJ872/08, RJ874/08, RJ990/10, RJ1018/10, RJ1063/11,
RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1095/11, RJ1096/11, RJ1129/12,
RJ1217/14, RJ1256/17
4508b GAA → GAG Glu RJ872/08, RJ874/08
4533b TTA → CTA Leu RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1217/14, RJ1256/17
a mudanças sinônimas não descritas em outros estudos
b mudanças sinônimas descritas também em sequências de parvovírus de cães deste estudo
61
As diferenças de aminoácidos observadas entre as sequências de amostras
felinas do estudo e os isolados de FPV obtidos no GenBank, estão descritas na
Tabela 6.
De acordo com os aa importantes para definição do espectro de hospedeiro
felino (80, 93, 103, 300, 323, 564 e 568), oito sequências foram caracterizadas como
FPV, sendo cinco “FPV clássicas (RJ922/08, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1161/12,
RJ1198/13). As três sequências (RJ1018/10, RJ1096/11, RJ1189/1) contendo aa
típicos de CPV nos resíduos 80, 564 ou 568, mas com Val e Ala nos resíduos 103 e
300, característicos de FPV, foram consideradas “FPV não clássicas”. Outras 16
sequências (RJ872/08, RJ874/08, RJ990/10, RJ1047/11, RJ1048/11, RJ1063/11,
RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1095/11, RJ1129/12, RJ1213/15, RJ1217/14, RJ1218/14,
RJ1219/14, RJ1230/16, RJ1256/17) foram caracterizadas como CPV. Uma
sequência (RJ1085/11) não pode ser caracterizada neste momento, no entanto,
apresentou nos resíduos 80, 93, 103, 300 e 323 aa típicos de CPV-2 (Tabela 6).
As sequências de FPV (n=8) e as de CPV (n=16) do Rio de Janeiro
apresentaram alta identidade nucleotídica dentro de cada grupo, 99,0%-100% para
FPV e 98,5%-100% para CPV, respectivamente. Duas sequências de FPV
(RJ1159/12 e RJ1160/12) e duas de CPV (RJ1064/11 e RJ1065/11) eram 100%
idênticas entre elas. As sequências de FPV e de CPV deste estudo também
apresentaram alta similaridade nucleotídica quando comparadas aos seus
respectivos protótipos do Genbank (FPV = 98,7% - 99,7%; CPV = 97,8% - 99,8%).
Conforme demonstrado na Tabela 6, todas as sequências felinas, com
exceção da RJ1085/11, apresentaram alteração no resíduo lle101Thr, a qual já é
descrita desde meados da década de 1960 (HORIUCHI et al., 1998; DECARO et
al.,2008; HOELZER; SHACKELTON; PARRISH, 2008). Outras alterações descritas
em isolados de FPV a partir de 2005 como nos resíduos 14 (AlaThr) e 91 (Ala
Ser) também foram observadas nas sequências deste estudo.
Com base nos aa utilizados para caracterização dos diferentes tipos de CPV
(87, 101, 297, 300, 305, 426 e 555), sete sequências felinas foram classificadas
como CPV-2a (RJ872/08, RJ874/08, RJ990/10, RJ1095/11, RJ1213/15, RJ1218/14,
RJ1219/14) e outras nove como CPV-2b (RJ1047/11, RJ1048/11, RJ1063/11,
RJ1064/11, RJ1065/11, RJ1129/12, RJ1217/14, RJ1230/16, RJ1256/17).
Das 15 sequências obtidas de amostras fecais de cães diarreicos no período
deste estudo, cinco foram caracterizadas como CPV-2a (RJ1108/12, RJ1156/13,
62
RJ1164/13, RJ1211/14, RJ1214/15), sete como CPV-2b (RJ936/08, RJ1127/12,
RJ1145/12, RJ1215/14, RJ1216/14, RJ1226/16, RJ1234/16) e três CPV-2c
(RJ1003/10, RJ1086/11, RJ1249/17).
Pôde-se observar uma alteração sinônima, ainda não descrita na literatura em
sequências de parvovírus canino do tipo 2c, no resíduo 426 (GAAGAG) da
sequência RJ1249/17 obtida de um cão com cinco meses apresentando vômito e
diarreia hemorrágica líquida, sem histórico de vacinação conhecido. Este resultado
foi confirmado em duas reações de sequenciamento.
Conforme destacado na Tabela 6, outras mudanças de aa foram observadas
nas sequências de parvovírus de gatos e cães neste estudo: (i) no resíduo 297, a
alteração de SerAsn foi detectada em 13/25 sequências felinas e 13/15
sequências caninas, enquanto a de SerAla em apenas duas sequências de gatos
e duas de cão, (ii) no resíduo 324, a alteração TyrLeu estava presente em 7/25
sequências de gatos e 12/15 de cães obtidas de amostras fecais coletadas a partir
de 2012. A análise das sequências por meio do método MEME revelou a presença
de dois sítios de seleção positiva nos resíduos 297 (nt 3675-3676-3677) e 324 (nt
3756-3757-3758).
No intuito de avaliar se as mutações não sinônimas que ocorreram nos aa
297 e 324 alterariam a estrutura da proteína de capsídeo viral VP2, realizou-se a
análise dessas alterações na estrutura da proteína utilizando o software PyMOL
(versão 3.3.0). Os aas 297 e 324 estão localizados no loop 3 na região de simetria
3x (threefold spike) (Figuras 12-14).
63
Tabela 6. Diferenças de aminoácidos encontradas no fragmento de 1755 pb do gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2
dos parvovírus detectados nas 25 amostras felinas e 15 amostras caninas no período de 2008-2017.
Posições dos aminoácidos / nucleotídeos
14 80 87 91 93 101 103 232 297 300 305 323 324 426 555 564 568
2826 3025 3045 3057 3065 3088 3094 3480 3675-6 3685 3699 3753 3757-8 4062 4449 4477 4489
ProtótIpos GenBank Tipo de
Parvovírus
M38246 FPV Ala Lys Met Ala Lys Ile Val Val Ser Ala Asp Asp Tyr Asn Val Asn Ala
AB054225 FPV . . . . . Thr . . . . . Asn . . . . .
EU360959 FPV . . . Ser . Thr . . . . . . . . . Ser Gly
EU498711 FPV Thr . . . . Thr . . . . . . . . . . .
FJ231389 FPV . . . . . . . Ile . . . Asn . . . Ser .
JN867593 FPV . . . . . Thr . . Ala . . . . . . . .
DQ658146 (RJ606/04) FPV - . . Ser Asn Thr . . . . . . . Asp . . .
DQ658147 (RJ616/04) FPV - . . Ser Asn Thr . . . . . . . . . . .
M38245 CPV-2 . Arg . . Asn . Ala Ile . . . Asn . . . Ser Gly
DQ340430 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . . . Ser Gly
EF011664 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn Ile . . Ser Gly
FJ998133 (RJ001/95) CPV-2a - - - - - - - - Ala Gly Tyr . . . . . .
GU569946 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn Ile . . . Gly
JF346754 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . . . Ser Gly
GU362932 (gato) CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn . . . . .
AB120722 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn . Asp . Ser Gly
DQ340409 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile . Gly Tyr Asn . Asp . Ser Gly
KR002796 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn Ile Asp . Ser Gly
JF414817 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . Asp . Ser Gly
FJ222821 CPV-2c . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . Glu . Ser Gly
GU380303 CPV-2c . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Ile Glu . Ser Gly
64
KM457118 CPV-2c Thr Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . Glu . Ser Gly
GU362935 (gato) CPV-2c . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn Ile Glu . Ser Gly
Amostras felinas
RJ922/08 FPV . . . Ser . Thr . . . . . . . . . . .
RJ1161/12 FPV . . . Ser . Thr . . . . . . . . . . .
RJ1198/13 FPV . . . Ser . Thr . . . . . . . . . . .
RJ1159/12 FPV Thr . . Ser . Thr . . . . . . . . . . .
RJ1160/12 FPV Thr . . Ser . Thr . . . . . . . . . . .
RJ1096/11 FPV . . . . . Thr . . . . . . . . . Ser Gly
RJ1018/10 FPV . . . . . Thr . . . . . . . . . Ser Gly
RJ1189/13 FPV . Arg . . . Thr . . . . . . . . . . .
RJ1085/11 ? . Arg . . Asn . Ala Ile . . . Asn . . . . .
RJ1095/11 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile . Gly Tyr Asn . . . Ser Gly
RJ872/08 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn . . . Ser Gly
RJ874/08 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn . . . Ser Gly
RJ990/10 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . . . Ser Gly
RJ1218/14 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu . . . .
RJ1219/14 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu . . . .
RJ1213/15 CPV-2a . Arg Leu . . Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu . . . .
RJ1047/11 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . Asp . . .
RJ1048/11 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . Asp . . .
RJ1063/11 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . Asp . Ser Gly
RJ1064/11 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . Asp . Ser Gly
RJ1065/11 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . Asp . Ser Gly
RJ1129/12 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . . Gly
RJ1217/14 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . Ser Gly
RJ1230/16 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . . .
RJ1256/17 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . Ser Gly
65
Amostras caninas
RJ1108/12 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu . . . .
RJ1164/13 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu . . . .
RJ1211/14 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu . . . .
RJ1214/15 CPV-2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu . . . .
RJ1156/13 CPV 2a . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu . . Ser Gly
RJ936/08 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn . Asp . Ser Gly
RJ1127/12 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . Ser Gly
RJ1145/12 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . Ser Gly
RJ1215/14 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . Ser Gly
RJ1216/14 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . Ser Gly
RJ1226/16 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . Ser Gly
RJ1234/16 CPV-2b . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Asp . Ser Gly
RJ1249/17 CPV-2c . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Asn Gly Tyr Asn Leu Glu . Ser Gly
RJ1003/10 CPV-2c . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn . Glu . Ser Gly
RJ1086/11 CPV-2c . Arg Leu . Asn Thr Ala Ile Ala Gly Tyr Asn . Glu . Ser Gly
(a) Em vermelho: aa importantes para definição do espectro de hospedeiro felino; (b) Em azul: aa que determinam os diferentes tipos de CPV; (c) Negrito: alteração nos resíduos 297 e 324.
66
Figura 12. Imagem da estrutura da VP2 do CPV mostrando em vermelho a região de α-
hélice, em amarelo a região β-pregueada e verde a região hipervariável “Loops”.
Figura 13.(A) Imagem da estrutura do Loop 3 com destaque em azul para região do aa 297
(Ser), mostrando através do círculo azul sua proximidade ao resíduo 300, importante na
definição do espectro hospedeiro felino-canino (B) em laranja a região 297 após a mutação
para Asn.
Figura 14.(A) Região do Loop 3 e em rosa a região 324 sem a mutação (Tyr), evidenciando
a formação do anel aromático e no círculo (rosa) mostrando sua proximidade ao resíduo
323, importante na definição do espectro hospedeiro fel-can (B) em magenta a região 324
após a mutação (Leu), onde houve a perda do anel aromático após a mutação.
B A
A B
67
5.4 Análise filogenética do gene completo que codifica a proteína VP2 do
capsídeo viral
A análise filogenética foi realizada a partir da sequência do gene completo
que codifica a proteína VP2 do capsídeo viral. Para construção da árvore utilizou-se,
como protótipos, 77 sequências do GenBanK (Anexo IV).
As 25 sequências felinas deste estudo formaram dois grandes grupos, um
com os isolados felinos e outro com os caninos (Figura 15). As oito sequências
felinas (RJ922/08, RJ1018/10, RJ1096/11, RJ1159/12, RJ1160/12, RJ1161/12,
RJ1189/13, RJ1198/13) caracterizadas como FPV, com base nos aa importantes
para definição do espectro de hospedeiro, agruparam com os protótipos de FPV,
MEV e BFPV, sendo que as sequências consideradas “FPV clássicas” formaram um
clado separado das demais. Outras 16 sequências caracterizadas como CPV-2a/2b
agruparam com as sequências de cães deste estudo e protótipos de CPV.
As duas sequências CPV-2a de origem felina (RJ872/08, RJ874/08) com
alteração no resíduo 297Ala agruparam com o isolado brasileiro (DQ340431) de cão
de 1995, que apresenta a mesma alteração nesse resíduo.
As sequências caracterizadas como CPV (2a/2b/2c) deste estudo com
alteração no resíduo 324Leu, tanto de origem felina (RJ1129/12, RJ1213/15,
RJ1217/14, RJ1218/14, RJ1219/14, RJ1230/16, RJ1256/17) como canina
(RJ1108/12, RJ1127/12, RJ1145/12, RJ1156/13, RJ1164/13, RJ1211/14,
RJ1214/15, RJ1215/14, RJ1216/14, RJ1226/16, RJ1234/16, RJ1249/17), formaram
um clado separado das demais sequências de CPV. De acordo com a presença de
aa característicos de FPV ou CPV nas posições 564 (AsnSer) e 568 (AlaGly),
pode-se observar subdivisão deste clado (Tabela 6 , Figura 15).
68
Figura 15. Árvore filogenética da sequência completa (1755pb) do gene que codifica a proteína VP2
dos parvovírus construída pelo método de máxima verossimilhança (ML) baseado no modelo
evolutivo de Tamura -3 parâmetros (T92+G+I) com 2.000 réplicas de bootstrap (valores menores que
50% não estão representados). Os círculos e quadrados cheios representam sequências de FPV e
324Leu
Asn564 Ala568
564Ser 568Gly
FPV
CPV-2b
CPV
297Ala
69
CPV deste estudo (FPV: rosa, CPV- like: laranja, CPV-2a: vermelho, CPV-2b: azul, CPV-2c: verde).
Os círculos e quadrados vazios representam as sequências de FPV e CPV do GenBank (FPV: rosa,
CPV- 2: preto, CPV-2a: vermelho, CPV-2b: azul, CPV-2c: verde).
De acordo com as fichas clínicas somente dois animais (RJ1085/11,
RJ1129/12) receberam uma ou duas doses de vacina contra FPV e o intervalo entre
a vacinação e o aparecimento dos sinais clínicos não era conhecido. A análise do
fragmento de 1755pb destas sequências revelou elevada similaridade nucleotídica
com a sequência da vacina Felocell®CVR (98,5 - 99,2%). Entretanto, as demais
sequências de FPV e CPV de gatos também apresentam identidade de 98,4% a
99,0% com a sequência da vacina. A sequência RJ1129/12 foi caracterizada como
CPV-2b excluindo a possibilidade de detecção de vírus vacinal. A sequência
RJ1085/11 apresentou identidade de 99% a 99,2% com a vacina atenuada contra
CPV que é constituída do tipo “antigo” de CPV-2.
5.5 Análise de eventos de recombinação genética
Nenhum evento de recombinação foi detectado após a análise das
sequências RJ1018/10, RJ1085/11, RJ1096/11 e RJ1189/13 com as sequências de
referência de FPV (FJ231389, FJ440712; EU360959, EU498687, M38246), CPV
(DQ340409, DQ340430, FJ005251, FJ435342, JX660690, GU363932, GU363935,
M38245) e MEV (U22191) utilizando o Simplot.
Com base no RDP4, um potencial evento de recombinação foi identificado
por dois métodos MaxChi e 3Seq, na sequência RJ1085/11 com a sequência de
referência de CPV-2 (M38245) nas regiões correspondentes aos nt 3909 (aa 375) e
nt 4515 (aa577), ilustrado na Figura 16.
70
Figura 16. Representação gráfica do evento de recombinação da sequência RJ1085/11 obtida
através do programa RDP4. R= RDP; G= GENECONV; B= Bootscan; M= MaxChi; C= Chimaera; S=
SiScan e T= 3Seq.
5.6 Codetecção de outros vírus entéricos
Das 25 amostras fecais de gatos positivas para Parvovírus, 12 também foram
positivas para outras viroses entéricas por RT-PCR: Astrovírus Felino (FeAstV),
Calicivírus Entérico Felino (FCV), Coronavírus Felino (FeCoV), Norovírus Felino
(FeNoV) e Rotavírus (RV-A). Os sinais clínicos e a evolução clínica desses animais
são descritos na Tabela 7. Para outros 13 animais somente o parvovírus foi
detectado.
Entre os quatro animais que evoluíram a óbito (RJ1217/14, RJ1218/14 e
RJ1219/14), apenas um (RJ922/08) apresentou coinfecção (FCV + FeCoV + FPV)
com sintomatologia de vômito e diarreia não hemorrágica (Tabela 7).
71
Tabela 8. Distribuição dos animais estudados de acordo com a detecção de
Parvovírus e outras viroses entéricas e sinais clínicos.
Amostras Tipo de Parvovírus Outras viroses entéricas Sinais clínicos
RJ922/08 FPV FCV, FeCoV V, DNHa
RJ1159/12 FPV FCV, FeCoV DNH
RJ1160/12 FPV FCV, FeCoV DNH
RJ1161/12 FPV - DNH
RJ1198/13 FPV - V, DNH
RJ1018/10 FPV FCV, FeNoV DNH
RJ1096/11 FPV FCV, RV-A DNH
RJ1189/12 FPV - DNH
RJ872/08 CPV-2a FeCoV V, DNH
RJ874/08 CPV-2a FeCoV V, DNH
RJ1095/11 CPV-2a FeAstV DNH
RJ990/10 CPV-2a FCV DNH
RJ1218/14 CPV-2a - DNHa
RJ1219/14 CPV-2a - DNHa
RJ1063/11 CPV-2b - DNH
RJ1064/11 CPV-2b FCV DNH
RJ1065/11 CPV-2b - DNH
RJ1217/14 CPV-2b - DNHa
RJ1047/11 CPV-2b - DH
RJ1048/11 CPV-2b - DH
RJ1129/12 CPV-2b - DH
RJ1230/16 CPV-2b - DNH
RJ1256/17 CPV-2b - DNH
RJ1213/15 CPV-2b FeCoV DH
RJ1085/11 CPV- like FCV DNH
V, DNH= Vômito, Diarreia não hemorrágica, DH= Diarreia hemorrágica, DNH= Diarreia não hemorrágica. a Óbito.
72
6 DISCUSSÃO
O aparecimento de novos vírus com potencial patogênico constitui uma
ameaça importante tanto para seres humanos como animais (TRUYEN et al., 2009).
Inicialmente acreditava-se que o FPV era patogênico somente para gatos até que
em 1947 uma doença similar a panleucopenia felina foi observada em martas. No
final da década de 70 outro parvovírus emergiu, o CPV-2 em cães, o qual perdeu a
capacidade de infectar gatos. À medida que disseminava na população canina, o
CPV-2 foi logo substituído pelas variantes CPV-2a e CPV-2b, as quais são capazes
de infectar e causar doença em ambos, cães e gatos (HUEFFER & PARRISH,
2003).
Os primeiros relatos de isolamento de CPV a partir de gatos ocorreram no
Japão (MOCHIZUKI; HARASAWA; NAKATAMI, 1993) e posteriormente, este vírus
pôde ser detectado infectando felinos domésticos e selvagens em várias partes do
mundo (MOCHIZUKI et al., 1996; TRUYEN; PLATZER; PARRISH, 1996; IKEDA et
al., 2000; STEINEL et al., 2000; GAMOH et al., 2003). Como o CPV e FPV circulam
na população canina e felina no Rio de Janeiro, respectivamente (CASTRO et al.,
2007; SILVA, 2010), desde 2004 o nosso grupo investiga as sequências de
parvovírus a partir de amostras fecais de gatos domésticos. Uma sequência felina
(DQ658146) do ano de 2004 apresentou aa típicos das novas variantes de CPV.
Entretanto, neste estudo apenas um fragmento de 932pb do gene da proteína de
capsídeo VP2 foi analisado e esta sequência foi caracterizada como FPV (CUBEL
GARCIA et al., 2011).
Estes achados demonstraram que o contínuo monitoramento das amostras de
parvovírus que circulam na população felina é necessário a fim de identificar o
surgimento de novas variantes em gatos domésticos.
Aproximadamente 95% do capsídeo dos parvovírus é constituído de VP2,
sendo esta a principal proteína do capsídeo, pois contém o sítio de ligação ao
receptor, os epítopos responsáveis pela indução de anticorpos neutralizantes e os
aminoácidos importantes para mudança de espectro de hospedeiro (LOPEZ DE
73
TURISO et al., 1991; PARRISH & KAWAOKA, 2005). Além disso, a maioria (80%)
das sequências de parvovírus de gatos disponíveis no GenBank, corresponde ao
gene que codifica a VP2. Estes dados justificam porque neste estudo optou-se por
realizar o sequenciamento completo do gene da VP2 para caracterização molecular
dos parvovírus a partir de gatos domésticos.
Devido a capacidade de leitura do sequenciador de DNA do LMMP
(fragmentos até 800pb), para amplificação completa do gene (1755pb) foi necessário
utilizar cinco pares de iniciadores, dois já descritos na literatura (BUONAVOGLIA et
al., 2001) e outros três desenhados especialmente para este estudo. Com esta
metodologia foi possível amplificar mais de 80% (25/30) das amostras de parvovírus
a partir de gatos e 100% (15) de cães.
Considerando todas as mudanças de nucleotídeos nas 25 sequências de VP2
detectadas em amostras fecais de gatos, pode-se observar o predomínio de
substituições sinônimas, mas em resíduos não relacionados à mudança de espectro
de hospedeiro ou evolução destes vírus.
Apenas 32% (8/25) das sequências deste estudo foram caracterizadas como
FPV, sendo cinco nomeadas inicialmente “FPV clássicas” por apresentarem uma
identidade nucleotídica de 98,7%-99,7% com os protótipos de FPV e de 99,8% -
100% quando comparadas entre elas. As sequências 100% idênticas, RJ1159/12 e
RJ1160/12, foram obtidas simultaneamente de dois gatos de dois meses de idade
que viviam juntos no abrigo do Campo de Santana/RJ, confirmando a circulação
desta variante no local.
A análise filogenética confirmou como FPV, as sequências RJ1018/10,
RJ1096/11 e RJ1189/11 que apresentavam nas posições 80, 564 e 568, aa
característicos de CPV. Até o momento, alterações nos resíduos 564 e 568 só foram
descritas nas sequências obtidas a partir de amostras de tecido de uma civeta de
palmeira asiática (Paradoxurus hermaphroditus) e de dois gatos domésticos que
evoluíram a óbito por panleucopenia em 2007 na Malásia e Hungria respectivamente,
além de uma sequência de FPV, detectada em fezes de macaco durante um surto de
enterite hemorrágica em um centro de experimentação animal, em 2008, na China
(DEMETER et al., 2009; 2010; YANG et al., 2010).
As consequências biológicas das mutações não sinônimas detectadas nos
resíduos 14 e 91 não são claras. A mudança no aa 14Thr só foi descrita em duas
sequências de FPV de 2005 e 2006 da Itália (EU498695, EU498711) e outras duas
74
CPV-2c dos anos de 2007/2009 do Uruguai (KM457110, KM457118) (DECARO et
al., 2008; PÉREZ et ., 2014). A alteração do aa 91 (Ala→Ser) já foi detectada em
sequências de FPV a partir de 2006 da Itália, Argentina, Hungria e Coréia do Sul
(DECARO et al., 2008; DEMETER et al., 2009; YANG et al., 2010). A existência
destas mutações sugerem que as amostras de FPV podem estar sob pressão
seletiva constante, levando à sua evolução genética (MIRANDA et al., 2015).
Entretanto, desde a primeira identificação em 1920, o vírus não sofreu
alterações nas propriedades antigênicas e biológicas, uma vez que sua evolução
ocorre a uma velocidade lenta por derivação genética aleatória (genetic drift) sem
uma distribuição temporal ou geográfica clara (BATTILANI et al., 2006; 2011;
DECARO et al., 2008; YANG et al., 2010). Os estudos evolutivos do FPV indicam
que as sequências de FPV apresentam um alto grau de conservação de
nucleotídeos no gene VP2 mesmo após mais de 90 anos desde o seu surgimento
(DECARO et al., 2008, HOELZER ; SHACKELTON; PARRISH, 2008).
Historicamente, FPV e CPVs são isolados, preferencialmente, a partir de gatos
e cães domésticos, embora periodicamente também de carnívoros selvagens
(raposas, lobos, coiotes, mãos-peladas). Estes hospedeiros alternativos (animais de
vida livre ou de fazendas de produção de lã/carne) podem ter contribuído para a
emergência de ambos CPV-2 e CPV-2a em cães, já que um vírus intermediário entre
FPV e CPV-2 ou CPV-2 e CPV-2a ainda não foi isolado da população de cães e
gatos domésticos (ALLISON et al., 2012; 2013). Estudos de análises filogenética das
sequências do gene da VP2 de parvovírus de vários carnívoros (onça, coiote, lobo,
lince, cangambá) revelaram a existência de dois maiores grupos: um relacionado ao
FPV (“FPV-like”) e outro ao CPV (“CPV-like”) (ALLISON et al., 2013).
Uma das sequências descritas neste estudo (RJ1085/11), obtida de um gato
de seis meses de idade com diarreia pastosa e que recebeu uma dose de vacina
múltipla, apresentou aa característicos de CPV-2, com exceção dos resíduos 564 e
568, característicos de FPV. Estes resíduos (564 e 568) estão localizados na base
(shoulder) da região mais exposta do capsídeo (threefold spike) e são relacionados a
capacidade do vírus em replicar em células felinas (TRUYEN et al., 1994, TRUYEN;
PLATZER; PARRISH, 1996).
A ocorrência de mutações aleatórias, selecionadas pela pressão imunológica
parece ser o principal mecanismo de evolução dos parvovírus (SHACKELTON et al.,
2005; HOELTZER & PARRISH, 2010). Em 2008 foi descrito pela primeira vez a
75
detecção de amostras recombinantes de CPV (CPV-2/2a e CPV-2/2b) provenientes
de amostras clinicas de cães diarreicos que haviam recebido vacinas atenuadas
constituídas por CPV-2 (MOCHIZUKI et al., 2008). A seguir, o mesmo grupo
(OSHMINA & MOCHIZUKI, 2009) descreveu que a sequência de DNA do isolado XJ-
1 (EF988660) de fezes de um gato com panleucopenia na China era na verdade um
recombinante contendo o gene NS do CPV e VP1/VP2 do FPV.
Para que ocorra o evento de recombinação é fundamental que a célula
intestinal seja coinfectada por dois tipos de parvovírus. Ao estudarem a correlação
entre a infecção por parvovírus e lesões no sistema nervoso central de gatos, Url e
colaboradores (2003) detectaram sequências de CPV-2 no tecido neuronal de dois
animais e de CPV-2 + FPV em outro. Achados similares foram também relatados por
Battilani e colaboradores (2006) que mostraram a coexistência de CPV-2a e CPV-2b
em um único animal.
Sabe-se que a infecção por CPV é comum no Rio de Janeiro e no mercado
nacional existem vacinas atenuadas para prevenção da parvovirose em cães que
são constituídas por cepas isoladas no início da década de 80, ou seja, tipo antigo
CPV-2 (CASTRO et al., 2010; SILVA, 2010). Recentemente, Freisl e colaboradores
(2017) demonstraram que o DNA do CPV pode ser detectado nas fezes de animais
vacinados até 28 dias pós-vacinação por qPCR.
A detecção em uma amostra fecal de gato de uma sequência (RJ1085/11)
com aa característicos de CPV-2 nas regiões que controlam a interação do vírus
com o receptor de transferrina (aa 93 e 103) pode sugerir um evento de
recombinação na natureza entre amostra selvagem e vacinal. Além disso, a
convivência de cães e gatos no mesmo ambiente pode criar um ambiente propício
para a ocorrência de tais eventos. Os dados da ficha clínica sugerem que este
animal era domiciliado, pois a amostra fecal foi coletada em uma clínica veterinária,
e dois métodos (MaxChi e 3Seq) do programa de análise de recombinação RDP4
indicaram tal evento.
A análise das sequências de gatos domésticos deste estudo mostrou, pela
primeira vez no Brasil, a detecção das novas variantes de CPV (2a/2b) na espécie
felina. Já existem relatos de detecção de CPV em felinos selvagens e domésticos,
sintomáticos ou não, ao redor do mundo (MOCHIZUKI; HARASAWA; NAKATANI,
1993; MOCHIZUKI et al., 1996; TRUYEN; PLATZER; PARRISH, 1996, IKEDA et al.,
2000, STEINEL et al., 2000; GAMOH et al., 2003; 2005; BATTILLANI et al., 2006;
76
DUARTE et al., 2009; DECARO et al., 2010; MIRANDA et al., 2015;). No entanto, o
FPV ainda é o parvovírus mais prevalente associado a gastrenterite em gatos
(BATILLANI et al., 2006; DECARO et al., 2008; AN et al., 2011; MIRANDA et al.,
2015).
Mais de 60% (16/25) dos parvovírus associados a enterite em gatos
domésticos neste estudo foram caracterizados como CPV-2a/2b, que são as
variantes mais detectadas na população canina do Rio de Janeiro de 2008-2017. A
análise de sequências de FPV de gatos no período de 2004-2005 já demonstravam
a presença de aminoácidos típicos de CPV-2a/2b em resíduos importantes para
replicação (aa93) e tipagem dos CPV (aa 426), sugerindo que os novos FPVs
poderiam estar alterando suas propriedades biológicas (CUBEL GARCIA et al.,
2011).
A razão para uma maior ocorrência da infecção por CPV-2a/2b precisa ser
melhor elucidada, já que 72% dos animais deste estudo eram domiciliados. Em
locais com grande circulação de animais, como clínicas veterinárias, praças
públicas, abrigos, o risco de infecção para animais não vacinados é alto. Esse fato,
associado a resistência dos parvovírus no ambiente favorece a propagação da
infecção por meio de indivíduos/animais que podem atuar como carreadores do
vírus (STEINEL et al., 2000; GREENE, 2012).
A transmissão interespécie do CPV começou a ser estudada quando Steinel e
colaboradores (2000) detectaram sequências de CPV-2a/2b em amostras fecais
felinos selvagens com enterite da África e Ásia. A seguir, Ikeda e colaboradores
(2000) descreveram a detecção de CPV-2a/2b em 80% dos gatos domésticos e
selvagens assintomáticos, do Vietnã e Taiwan, com altos títulos de anticorpos para
FPV, sugerindo que as novas variantes de CPV, sob condições naturais, poderiam
disseminar mais eficientemente na população felina.
As sequências felinas do estudo apresentaram substituições nos aminoácidos
297 e 324, os quais estão localizados no loop 3, na região threefold spike da
proteína de capsídeo VP2. Estes aa são adjacentes aos resíduos 300 e 323,
respectivamente, implicados na ligação ao receptor de transferrina (TfR), e portanto
na definição do espectro de hospedeiro (HUEFFER et al., 2003; HOELZER &
PARRISH, 2010).
A alteração no aa 297 (Ser→Ala), já é descrita desde 1990 em sequências de
CPV de caninos e felinos domésticos e selvagens e se tornou predominante nos
77
tipos 2a e 2b em diferentes países, como Alemanha, EUA, Itália e Taiwan, Vietnã e
inclusive no Brasil (TRUYEN, 1999; BATTILANI et al., 2002; IKEDA et al., 2002;
NAKAMURA et al., 2004; SHACKELTON et al., 2005; PEREIRA; LEAL; DURIGON,
2007, CASTRO et al., 2010). Por outro lado, a mudança Ser→Asn só foi detectada,
até o momento, nas variantes de CPV-2a/2b obtidas a partir de amostras fecais de
cães domésticos com enterite no Brasil, Argentina e Uruguai (PEREIRA; LEAL;
DURIGON, 2007; CASTRO et al., 2010; CALDERON et al., 2012; MAYA et al.,
2013).
É possível que este sítio tenha uma função importante no processo de
adaptação local do vírus já que a alteração 297Asn só foi descrita na América do Sul
(PEREIRA; LEAL; DURIGON, 2007; CASTRO et al., 2010; CALDERON et al., 2012;
MAYA et al., 2013), e pela primeira vez em sequências de CPV obtidas de gatos
domésticos. Embora o resíduo 297 esteja localizado em um sítio antigênico menor
(B), substituições nesta posição podem alterar a antigenicidade e talvez a
patogenicidade das variantes de CPV (TRUYEN, 2006). Além disso, nossos
resultados corroboram achados anteriores de que este sítio está sob forte seleção
positiva (PEREIRA; LEAL; DURIGON, 2007; CALDERON et al., 2012).
Dados da literatura tem demonstrado que o resíduo 324 também está sob
forte pressão positiva nos parvovírus de todos os carnívoros (HOELZER;
SHACKELTON; PARRISH, 2008). Desde 2004, sequências de CPV-2a obtidas a
partir de amostra fecal de cães diarreicos na China e Coréia do Sul apresentaram
neste resíduo a alteração TyrIle, a qual se tornou predominante entre os isolados
de CPV-2a nesta região (JEOUNG et al., 2008; ZHANG et al., 2010; ZHOU et al.,
2017). A partir de 2010, a mesma alteração foi detectada em sequências CPV-2a do
Uruguai (PÉREZ et al., 2011).
No presente estudo, as novas variantes de CPV (2a/2b/2c) detectadas em
gatos (7/25) e cães (12/15) a partir de 2012, apresentaram a mudança de aa
TyrLeu. A mesma alteração só foi detectada, até momento, em sequências de
CPV-2b/CPV-2a, obtidas de amostra fecal de cães diarreicos nos anos de 2014-
2015 em Belém/PA e de 2016-2017 da Itália, respectivamente (SILVA et al., 2017;
Mira et al., 2018). Esta é a primeira descrição desta variante Tyr324Leu em gatos.
A real importância desta alteração não está clara, mas nossos resultados
sugerem que possa ter conferido alguma vantagem ao vírus, ou seja, um melhor
fitness viral, já que também foi detectada em sequências CPV-2a/2b de gatos. A
78
análise estrutural da VP2 do CPV revelou que a mudança de TyrLeu causou a
perda de um anel aromático, o que poderia alterar as estruturas secundária e
terciária da proteína. Logo, a substituição de um aminoácido polar (Tyr) por um
hidrofóbico (Leu) pode ter afetado a interação do vírus ao receptor celular, uma vez
que o componente aromático é essencial para garantir estabilidade à proteína
(MAKWANA & MAHALAKSHMI, 2015; LYONS & LAURING, 2017).
Ao comparar as sequências de VP2 dos parvovírus de várias espécies de
carnívoros (gato, cão, coiote, raposa, lobo, leopardo, mão-pelada, panda, martas)
Allison e colaboradores (2014) mostraram que o resíduo 300 é altamente polimórfico
na natureza (Ala, Asp, Gly, Ile, Leu, Pro, Ser e Val), sendo o mais variável no
capsídeo dos parvovírus e é crítico em determinar se um hospedeiro é suscetível ou
refratário a infecção viral (ALLISON et al., 2014; 2016; HAFENSTEIN et al., 2009).
Todos os isolados de FPV de gatos e o CPV-2 contém o resíduo Ala no 300,
enquanto todos os isolados recentes de CPV (2a/2b/2c) de cães contém o resíduo
Gly300 sugerindo que este fornece ótima interação com o receptor TfR de cão
(TRUYEN & PARRISH,1992; PARKER et al., 2001; HUEFFER et al., 2003; ALLISON
et al., 2014). Estudos in vitro, mostraram que a mudança no resíduo 300 foi a única
necessária para o vírus adquirir a habilidade de infectar células de cão (ALLISON et
al., 2014). O aa Gly no resíduo 300 está presente em todas as sequências de
CPV2a/2b de gatos deste estudo.
O potencial patogênico das novas variantes de CPV em gatos ainda é
discutível, pois a infecção pode cursar desde quadros assintomáticos até casos
graves com evolução a óbito (MOCHIZUKI et al., 1996; GAMOH et al., 2003;
DECARO et al., 2010; NAKAMURA et al., 2001; 2004; MUZ et al., 2012; MIRANDA
et al., 2015). Como estes vírus foram também isolados de animais clinicamente
saudáveis, alguns autores sugerem que a patogenicidade seja baixa (IKEDA et al.,
2000; STEINEL et al., 2001; CLEGG et al., 2012). Por outro lado, com os relatos de
casos fatais de panleucopenia por CPV-2a/2b/2c, questiona-se a eficácia das
vacinas FPV, se esta poderia proteger os gatos da infecção pelas variantes de CPV
(CHALMERS et al.,1999; NAKAMURA et al., 2001; IKEDA et al., 2002; GAMOH et
al., 2005; DECARO et al., 2010; JAKEL et al., 2012).
Embora o FPV afete gatos de todas as idades, a faixa etária de maior
incidência da doença é de animais menores de seis meses de idade e não
vacinados, podendo chegar numa taxa de mortalidade de 90% nesses animais
79
(TRUYEN et al., 2009; KRUSE et al., 2010). Quase a totalidade dos animais desse
estudo (96%) possuía idade até seis meses, no entanto, apenas quatro animais
evoluíram a óbito.
Em relação à sintomatologia clínica, a maioria dos gatos desse estudo
apresentou sinais clínicos brandos (diarreia não hemorrágica) e os quatro que
evoluíram a óbito tinham de 1-2 meses de idade, não eram vacinados, e três destes
animais (RJ1217/14, RJ1218/14, RJ1219/14) que estavam infectados somente por
CPV-2a ou 2b possuíam origem de resgate de rua. Em concordância com outros
estudos, estes dados indicam que a gravidade da infecção por CPV-2a / 2b depende
muito da condição geral do animal no momento da infecção (NAKAMURA et al.,
2001; IKEDA et al., 2002; DECARO et al., 2010).
Em relação às coinfecções, apesar de um animal ter evoluído a óbito (FPV+
FeCoV + FCV), os outros 11 não apresentaram agravamento nos sinais clínicos,
evidenciando que nesses animais não houve associação de um quadro clínico mais
grave na presença de outro agente entérico viral. O agravamento do quadro clínico
frente à coinfecções é bastante conhecido nas gastrenterites associadas à CPV+
CCoV em cães (CSIZA et al., 1971; APPEL et al., 1988). Entretanto, para felinos o
papel dos demais vírus entéricos na patogenia da gastrenterite viral ainda não foi
completamente esclarecido, uma vez que, apesar de frequentes, esses agentes
foram detectados em um grande número de animais assintomáticos (NG et al., 2014;
PARIS et al., 2014; CASTRO et al., 2015).
A dinâmica evolutiva da infecção por CPV em gatos mostra que o vírus iniciou
um novo processo de readaptação no hospedeiro felino e confirma a importância da
mudança do espectro de hospedeiro como um mecanismo para a emergência de
novos vírus. Os achados de CPV em gatos nos faz refletir sobre a necessidade de
conduzir mais estudos a fim de esclarecer o papel epidemiológico dessa espécie, se
poderiam atuar como reservatórios ou fonte de novas variantes de parvovírus, por
serem suscetíveis a ambos os vírus (FPV/CPV) (BATTILANI et al., 2011; 2013;
CLEGG et al., 2012).
Elucidar como os parvovírus felinos estão evoluindo e o comportamento das
suas novas variantes pode ajudar a prevenir um possível surto dessa nova variante
(IKEDA et al., 2002). Análises recentes revelam que a maioria das sequências de
parvovírus em carnívoros selvagens nos EUA são “CPV-like” (ALLISON et al., 2013),
80
e discute-se atualmente se as novas variantes de CPV podem vir a substituir o FPV
na população felina.
Estes achados indicam que uma avaliação contínua e mais detalhada das
amostras de parvovirus circulantes na população felina é necessária para esclarecer
o padrão de evolução destes vírus no Rio de Janeiro, bem como proporcionar uma
melhor compreensão dos mecanismos que impulsionam a evolução do FPV/CPV no
Brasil e sua importância epidemiológica.
81
7 CONCLUSÕES
Este estudo representa a primeira descrição das novas variantes de CPV em
gatos domésticos no Brasil.
De um total de 75 amostras fecais de gatos diarreicos entre 2008-2017
testadas para a detecção de parvovírus, 40% (30/75) foram consideradas
positivas por PCR, sendo que 25 foram sequenciadas para análise da
diversidade genética dos isolados circulantes.
Das 25 sequências analisadas, oito foram caracterizadas como FPV e 16
como CPV (sete CPV-2a e nove CPV-2b).
A sequência (RJ1085/11) que não pode ser caracterizada como FPV ou CPV
apresentou um potencial evento de recombinação com a sequência protótipo
de CPV-2 (M38245) no programa RDP4.
Algumas sequências de parvovírus de gatos e cães deste estudo
apresentaram alterações nos resíduos Ser297Asn e Tyr324Leu, ambos
considerados sítios de seleção positiva pelo método MEME.
Na análise filogenética, as sequências de FPV deste estudo formaram um
subgrupo distinto dos demais protótipos disponíveis no GenBank. As
sequências felinas e caninas caracterizadas como CPV (2a/2b/2c) com
alteração no resíduo 324Leu, formaram um subgrupo separado das demais
sequências de CPV. Outra subdivisão foi observada neste clado de acordo
com a presença de aa característicos de FPV ou CPV nas posições 564 e
568.
Não foi observada associação entre a presença de outros agentes virais
entéricos e a gravidade dos sinais clínicos nos animais estudados.
82
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94
9 APÊNDICES
9.1- Apêndice I FICHA DE IDENTIFICAÇÃO DO ANIMAL
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
Protocolo de Parvovirose Canina Registro Data de coleta
/ /
1 – CLÍNICA
Nome: ______________________________________ Local: _________________
2 – PROPRIETÁRIO DO ANIMAL
Nome: ______________________________________________________________
Endereço: ______________________________________ Bairro: ______________
Cidade: _______________________ Estado: _____ Telefone: _______________
3 – ANIMAL CÃO ( ) GATO ( )
Nome: _________________ Idade (meses): ______ Sexo: ____ Raça_________
Moradia: ( ) casa ( )apto Finalidade: ( ) guarda ( ) companhia ( ) outros
Local predominante de passeio: ( )rua ( )praia ( )praça ( )outros ( )Não passeia
4 – VACINAÇÃO
Nome da vacina Data Nome da vacina Data
/ / / /
/ / / /
/ / / /
/ / / /
5 – SINAIS CLÍNICOS
OCORRÊNCIA EM DIAS: TEMPERATURA: OC
VÔMITO ANOREXIA APATIA
( ) sim ( ) não ( ) sim ( ) não ( ) sim ( ) não
DIARREIA CONSISTÊNCIA DAS FEZES
( ) Ausente ( ) Hemorrágica ( ) Outra ( ) Líquida ( ) Pastosa
6 – RESULTADO
Data: / / ( ) negativo ( ) positivo
7 – OBSERVAÇÕES
95
10 ANEXOS
Anexo I REAGENTES E SOLUÇÕES
1. Tampão Tris-Ca++ 0,01M pH 7,2
Tris-base
(Invitrogen®).........................................................................................1,21 g
Cloreto de Cálcio (Vetec®) 0,0015M....................................................0,02 g
Água destilada q.s.p.....................................................................1000,00 mL
Em um béquer de 2000mL os reagentes foram adicionados e homogeneizados com
agitador magnético. O pH 7,2 foi ajustado com ácido clorídrico P.A. (Merck®) antes
de completar o volume final em proveta de 1000mL. A solução foi transferida para
frasco com vedação, autoclavada a 121ºC por 20 min e foi estocada em geladeira a
4ºC.
2. NaOH 10N
Hidróxido de Sódio (Merck®) ..........................................................10,0 g
Água destilada q.s.p......................................................................200,0 mL
Os reagentes foram homogeneizados em béquer de 250mL. O volume final foi
ajustado em proveta de 250 mL. A solução foi mantida a temperatura ambiente.
3. Etanol 70%
Etanol P.A. (Merck®).......................................................................70,0 mL
Água destilada q.s.p. ......................................................................30,0 mL
Os regentes foram homogeneizados em béquer de 250mL. O volume final foi
ajustado em proveta de 250 mL. A solução foi mantida a -20ºC.
4. EDTA 0,5M pH 8,8
Ácido etilenodiamino tetra-acético (Sigma®)....................................146,1 g
Água destilada q.s.p. .....................................................................1000,0 mL
Em um béquer de 1000 ml foram adicionados EDTA e 300 mL de água destilada. O
pH 8,8 foi ajustado com hidróxido de Sódio (Merck®) e a solução foi homogeneizada
com agitador magnético. A solução foi transferida para proveta de 1000 mL e o
volume final ajustado. A solução foi aliquotada em frascos com tampa e autoclavado
a 121ºC por 20 min. Os frascos foram mantidos em geladeira a 4ºC.
96
5. Agarose a 1,5%
Agarose.........................................................................................1,5 g
Tampão TBE 0,5 X pH 8,4........................................................100,0 mL
Misturar e dissolver por aquecimento no forno de microondas. Deixar esfriar até
50oC e verter na cuba de eletroforese, evitando a formação de bolhas.
6. Solução de brometo de etídio
Brometo de etídio 10 mg/mL (Invitrogen®)..................................15,0 μL
Água destilada q.s.p .................................................................300,0 mL
Adicionar o brometo de etídio à água destilada e homogeinizar até a dissolução.
7. Tampão corante azul de Bromofenol
Azul de Bromofenol (Shandom So)...............................................0,1 g
Xylene Cyanol FF (Sigma®)..........................................................0,1 g
EDTA 0,2 M pH 8 (Sigma®).........................................................10,0 mL
Glicerol P.A. (Sigma®).................................................................50,0 mL
Água destilada q.s.p. .................................................................100,0 mL
Os reagentes foram gentilmente homogeneizados em um béquer de 250 mL até a
completa dissolução. Alíquotas de 10 ml foram acondicionadas em frascos âmbar e
mantidas em temperatura ambiente.
97
10.2 Anexo II – Certificados do Comitê de Ética
Aprovação do Comitê de Ética
98
Aprovação do Comitê de Ética
99
10.3 Anexo III - Lista das sequências de Parvovírus utilizadas neste estudo, de
acordo com o número do GenBank, nome do isolado, ano do isolamento e origem.
Número
GenBank
Isolado Ano de
isolamento
Origem Referência
AB000050 94-1 1994 Japão Horiuchi,M., 1998
AB000052 AO1 1994 Japão Horiuchi,M., 1998
AB000054 Fukagawa 1993 Japão Horiuchi,M., 1998
AB000056 Obihiro 1974 Japão Horiuchi,M., 1998
AB000061 Som4 1995 Japão Horiuchi,M., 1998
AB000064 TU12 1978/90 Japão Horiuchi,M., 1998
AB000066 TU2 1975 Japão Horiuchi,M., 1998
AB000068 TU4 1975 Japão Horiuchi,M., 1998
AB000070 TU8 1976/77 Japão Horiuchi,M., 1998
AB054225 V142 1997 Vietnã Ikeda,Y et al., 2000
AB054226 V208 1997 Vietnã Ikeda,Y et al., 2000
AB054227 V211 1997 Vietnã Ikeda,Y et al., 2000
D88286 483 1990 Japão Horiuchi,M. et al., 1996
D88287 PLI-IV 1968 Japão Horiuchi,M. et al., 1996
EF418568 FPLV/Tiger/PT06 2006 Portugal Duarte,M. et al., 2009
EU221280 cat/39897/PT06 2005 Portugal Duarte,M. et al.,2009
EU252145 KF001 2003-2006 Coréia do
Sul
Jeoung,S.-Y. et al., 2008
EU252146 KF002 2003-2006 Coréia do
Sul
Jeoung,S.-Y. et al., 2008
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JN403045 Shanaxi 2011 China Han,S. et al., 2011
JN867597 CPV/Raccoon/NY/94742/10
2010 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867598 CPV/Bobcat/KS/44/10
2010 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867600 CPV/Raccoon/KY/33817/09
2009 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867601 CPV/Raccoon/NJ/76836/10
2010 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867602
CPV-2b/Dog/CA/148743/08
2008
EUA
Allison,A.B. et al., 2012
JN867603 CPV-
2b/Dog/KS/81213/09
2009 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867604 CPV-
2b/Dog/IL/137654/08
2008 EUA
Allison,A.B. et al., 2012
JN867605 CPV-
2b/Dog/US/142805/09
2009 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867606 CPV-
2b/Dog/US/19923/09
2009 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867610 CPV/Raccoon/VA/1
18-A/07 2007 EUA
Allison,A.B. et al., 2012
JN867611 CPV/Raccoon/KY/3
58-B/09 2009 EUA
Allison,A.B. et al., 2012
JN867612 CPV/Raccoon/TN/3
51/09 2009 EUA
Allison,A.B. et al., 2012
JN867613 CPV/Raccoon/FL/38
1/09 2009 EUA
Allison,A.B. et al., 2012
JN867614 CPV/Raccoon/VA/278-A/09
2009 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867615 CPV/Raccoon/GA/287/08
2009 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867616 CPV/Raccoon/GA/289/08
2008 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867617 CPV/Raccoon/349/08
2008 EUA Allison,A.B. et al., 2012
JN867618 CPV/Raccoon/WI/37/10
2010 EUA Allison,A.B. et al., 2012
107
JQ268283 CPV-LZ1 2011 China Han,S.C. et al., 2015
JQ268284 CPV-LZ2 2011 China Han,S.C. et al., 2015
JQ686671 CPV-2a 2011 China Han,S.C. et al., 2015
JX475237 CT/372/11 2010 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475238 GA/11/11 2011 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475240 AZ/16382-01/99 1999 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475242 WI/18268/02 2002 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475243 ID/22772/09 2009 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475244 CO/1269/11 2011 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475247 CO/1246/10 2010 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475249 CO/898/10 2010 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475250 CO/728/10 2010 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475251 CO/2235/09 2009 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475252 CO/1316/10 2010 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475257 CO/1237/10 2010 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475260 CO/704/10 2010 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475269 CO/422/12 2012 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475272 AL/362/12 2012 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475273 MT/909/12 2012 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475275 MT/914/12 2012 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475277 AL/361/12 2012 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475278 AR/1069/12 2012 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475279 TN/1/11 2011 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475280 TN/4/11 2011 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475283 TN/18/11 2011 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX475284 TN/26/11 2011 EUA Allison,A.B. et al., 2013
JX660690 SC02/2011 2011 China Ju,C. et al., 2012
KC196079 M181 2009 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196080 M101 2007 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196081 M95 2007 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196083 M82 2007 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196085 M57 2007 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196086 M55 2006 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196087 M52 2006 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196090 M346 2011 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196091 M326 2011 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196094 M269 2010 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196095 M258 2010 Uruguai Maya,L. et al., 2013
108
KC196096 M247 2010 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196097 M242 2010 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196098 M235 2010 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196099 M21 2006 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196101 M187 2009 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196102 M185 2009 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196103 M173 2009 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196104 M169 2008 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196105 M152 2008 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196107 M129 2008 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KC196108 M124 2008 Uruguai Maya,L. et al., 2013
KF149962 2c_ME1_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149963 2c_ME10_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149964 2c_ME23_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149965 2c_ME25_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149966 2c_ME26_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149968 2c_ME29_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149969 2c_ME31_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149970 2c_ME34_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149971 2c_ME32_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149974 2a_ME42_ECU2012
2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149984 2c_ME28_ECU2012 2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF149985 2b_ME20_ECU2012
2012 Equador Aldaz,J. et al., 2013
KF539789 H-Erd 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539790 H-Illatos 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539791 H-Halmai 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539792 H-Szentgothard 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539793 H-5 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539794 H-7 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539795 H-8 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539796 H-9 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539797 H-11 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539798 H-31 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539799 H-39 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539800 H-27 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539801 H-25 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539802 H-41 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539803 H-2 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
109
KF539804 H-212 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF539805 H-36 2012 Hungria Cságola A. et al., 2014
KF638400 s5 2010 China Zhu,Y. et al., 2014
KF676668 CPV-JS2 2009 - 2012 China Zhao,Y. et al., 2013
KM457103 UY12 2006 Uruguai Perez,R. et al., 2014
KM457104 UY47 2006 Uruguai Perez,R. et al., 2014
KM457107 UY72 2007 Uruguai Perez,R. et al., 2014
KM457118 UY190 2009 Uruguai Perez,R. et al., 2014
KM457126 UY318 2010 Uruguai Perez,R. et al., 2014
KM457131 UY368 2011 Uruguai Perez,R. et al., 2014
KM457132 UY245 2010 Uruguai Perez,R. et al., 2014
KM457143 UY364 2011 Uruguai Perez,R. et al., 2014
KR002792 CPV/CN/SH1/ 2013
2013 China Wang,H.L. et al., 2016
KR002793 CPV/CN/HB1/2013 2013 China Wang,H.L. et al., 2016
KR002795 CPV/CN/JL1/2013 2013 China Wang,H.L. et al., 2016
KR002796 CPV/CN/JL3/2013 2013 China Wang,H.L. et al., 2016
KR002798 CPV/CN/JL5/2013 2013 China Wang,H.L. et al., 2016
KR002801 CPV/CN/SD6/2014 2013 China Wang,H.L. et al., 2016
KR559891 PT032/12 2012 Portugal Miranda,C. et al., 2016
KR559892 PT174/12 2012 Portugal Miranda,C. et al., 2016
KR559893 PT178/12 2012 Portugal Miranda,C. et al., 2016
KR559895 PT077/13 2013 Portugal Miranda,C. et al., 2016
KR559896 PT267/14 2014 Portugal Miranda,C. et al., 2016
KT162019 BJ14-37 2014 China Wang J. et al., 2016
KT162038 BJ14-28 2014 China Wang J. et al., 2016
KX774249 Bel2014-01 2014 Brasil Silva et al., 2017
KX774251 Bel2015-01 2015 Brasil Silva et al., 2017
KX774252 Bel2015-02 2015 Brasil Silva et al., 2017
M23255 CPV-d Cornell 1979 EUA Parrish, C.R. et al., 1988
M24000 CPV-31 1983 EUA Truyen et al., 1995
M24003 15 1984 EUA Truyen et al., 1995
M38245 CPV-d 1978 EUA Parrish, C.R., 1991
MF423125 CPV/Coyote/C67/NL_2014
2014 Canada Canuti, M et al., 2017
MG434738 CPV_IZSSI_PA43847/ 2016
2016 Itália Mira et al., 2018
MG434739 CPV_IZSSI_PA48686/ 2016
2016 Itália Mira et al., 2018
MG434740 CPV_IZSSI_PA3213/ 2017
2017 Itália Mira et al., 2018
110
MG434741 CPV_IZSSI_PA5610/ 2017
2017 Itália Mira et al., 2018
MG434742 CPV_IZSSI_PA10388/ 2017
2017 Itália Mira et al., 2018
MG434743 CPV_IZSSI_PA13577/ 2017
2017 Itália Mira et al., 2018
MG434744 CPV_IZSSI_PA13579id90/2017
2017 Itália Mira et al., 2018
MG434745 CPV_IZSSI_PA13579id93/2017
2017 Itália Mira et al., 2018
U22896 FPV-24 1990 EUA Truyen,U. et al., 1996
U72696 T10 1995 China Chang,W.L. et al., 1996
111
10.4 Anexo IV - Protótipos utilizados na construção da árvore filogenética:
Tipo Ano de isolamento País de origem N. de acesso no
GenBank
FPV 1997 Vietnã AB054225
FPV 1967 EUA EU659111
FPV 2008 China FJ405225
FPV 1990 EUA JN867594
FPV 2010 EUA JX475245
FPV 2006 Portugal KT240128
FPV 1967 EUA M38246
FPV 2015 Canadá MF069445
CPV-2a 2002 Itália FJ005252
CPV-2a 2008 Itália GU362932
CPV-2a 2014 Portugal KR559896
CPV-2a 2016 Itália MG434738
CPV-2a 2016 Itália MG434739
CPV-2a 2017 Itália MG434740
CPV-2a 2017 Itália MG434741
CPV-2a 2017 Itália MG434742
CPV-2a 2017 Itália MG434743
CPV-2a 2017 Itália MG434744
CPV-2a 2017 Itália MG434745
CPV-2b 1997 Vietnã AB120720
CPV-2b 2002 Vietnã AB120721
CPV-2b 1997 Tailândia AB054219
CPV-2b 1995 China AY742934
CPV-2b 1985 Brasil DQ340409
CPV-2b 1997 Alemanha FJ005261
CPV-2b 2008 EUA JN867604
CPV-2b 2002 EUA JX475242
CPV-2b 1990 EUA U22896
CPV-2c 2004 Itália FJ005212
CPV-2c 2008 Itália GU362935
CPV-2c 2009 Argentina JF414823
CPV-2c 2010 Argentina JF414824
CPV-2c 2010 EUA JX475252
CPV-2c 2008 Uruguai KC196105
CPV-2c 2008 Uruguai KC196107
CPV-2c 2012 Equador KF149966
CPV-2c 2012 Equador KF149971
CPV-2c 2012 Equador KF149984
CPV-2c 2006 Uruguai KM457104
CPV-2c 2010 Uruguai KM457126
112
10.5 Anexo V - Tabelas de Nucleotídeos e Aminoácidos
TABELA DE NUCLEOTÍDEOS
Símbolo Nome
A Adenina
T Timina
G Guanina
C Citosina
TABELA DE AMINOÁCIDOS
Símbolo (3 letras) Símbolo (1 letra) Nome
Gly G Glicina
Ala A Alanina
Leu L Leucina
Val V Valina
Ile I Isoleucina
Pro P Prolina
Phe F Fenilalanina
Ser S Serina
Thr T Treonina
Cys C Cisteína
Tyr Y Tirosina
Asn N Asparagina
Gln Q Glutamina
Asp D Ácido aspártico
Glu E Ácido glutâmico
Arg R Arginina
Lys K Lisina
His H Histidina
Met M Metionina