Cristiane Magela de Freitas Santos

ESTUDO DA ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA NERVOSA

TRANSCUTÂNEA NA NOCICEPÇÃO E NO EDEMA INDUZIDOS

PELA ADMINISTRAÇÃO DE SEROTONINA INTRADÉRMICA.

Belo Horizonte

Escola de Educação Física, Fisioterapia e Terapia Ocupacional

2010

Cristiane Magela de Freitas Santos

ESTUDO DA ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA NERVOSA TRANSCUTÂNEA NA

NOCICEPÇÃO E NO EDEMA INDUZIDOS PELA ADMINISTRAÇÃO DE

SEROTONINA INTRADÉRMICA

Belo Horizonte

Escola de Educação Física, Fisioterapia e Terapia Ocupacional

2010

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências da Reabilitação, nível mestrado, da Escola de Educação

Física, Fisioterapia e Terapia Ocupacional da Universidade

Federal de Minas Gerais (UFMG), como requisito parcial para

obtenção do Título de Mestre em Ciências da Reabilitação.

Orientador: Prof. Dr. Marcos Antônio de Resende

Co-orientadora: Profª Drª Janetti Nogueira de Francischi

S237e

2010

Santos, Cristiane Magela de Freitas Estudo da estimulação elétrica nervosa transcutânea na nocicepção e no edema induzidos pela administração de serotonina intradérmica.. [manuscrito] / Cristiane Magela de Freitas Santos – 2010. 75f. Orientador: Marcos Antônio de Resende Co-orientadora: Janetti Nogueira de Francischi

Mestrado (dissertação) – Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Educação Física, Fisioterapia e Terapia Ocupacional.

Bibliografia: f. 60-63

1. Serotonina - Teses. 2. Analgesia - Teses. 3. Opióides – Teses. 4. Estimulação elétrica nervosa transcutânea – Teses. I. Resende, Marcos Antônio de. II. Francischi, Janetti Nogueira de. III.Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Educação Física, Fisioterapia e Terapia Ocupacional. IV. Título.

CDU: 612.76 Ficha catalográfica elaborada pela equipe de bibliotecários da Biblioteca da Escola de Educação Física, Fisioterapia e Terapia Ocupacional da Universidade Federal de Minas Gerais.

Dedico esta dissertação aos meus pais e ao grande amor da minha vida,

motivos pelos quais procuro me superar a cada dia...

AGRADECIMENTOS

Agradecimento é a expressão de um ser humano quando sente gratidão por um ato.

É muito satisfatório ter a quem agradecer neste momento. Sou imensamente grata a

todos aqueles, que mesmo na correria do dia-a-dia, reservaram momentos do seu

precioso tempo para me ajudar na elaboração deste trabalho.

Agradeço a Deus por iluminar sempre os meus caminhos e pela força para

ultrapassar barreiras ou optar por novos caminhos. Aos meus pais, aos quais devo a

vida e o incentivo para tornar-me uma pessoa cada vez melhor, em meus atos como

ser humano e em meu desempenho profissional.

Ao Professor Doutor Marcos Antônio de Resende, por acreditar na minha

capacidade de realizar este trabalho e também por me guiar no caminho científico. À

Professora Doutora Janetti Nogueira de Francischi, o meu muito obrigada pelos

esclarecimentos farmacológicos, apoio crítico e construtivo que em muito

engrandeceu minha caminhada. À Professora Doutora Ligia de Loiola Cisneros, por

me direcionar no caminho à docência, ajudando-me a superar limitações e a

acreditar no meu desejo de ser Mestre.

Aos colegas do laboratório, Patrícia, Webster, Rafael, Rinaldo e Débora, pelo apoio

nos experimentos e companheirismo.

E, claro, a você, Joel, pelo apoio, carinho e amor. Por todos os finais de semana e

feriados dos quais você abdicou para estar ao meu lado, seja no laboratório, me

auxiliando nos experimentos, seja em casa analisando dados e elaborando textos.

Sem você, esta jornada teria sido árdua. Amo você. Muito obrigada!

RESUMO

A estimulação elétrica nervosa transcutânea (TENS) é definida como a

aplicação de corrente elétrica por meio de eletrodos na pele para alívio da

dor. Diferentes teorias são propostas para explicar o mecanismo de ação

analgésica da TENS. Estudos recentes mostraram que parte dessa analgesia

pode, também, ser mediada por ação de neurotransmissores em receptores

periféricos. O objetivo desse estudo foi investigar o efeito da TENS de baixa

(BF: 10HZ) e alta (AF: 130HZ) freqüência na nocicepção e no edema

induzidos por serotonina (5-HT) administrada intradermicamente na pata do

rato (10µg/0,1ml). TENS de Baixa e alta frequência foram aplicadas na pata

direita durante 20 minutos e, imediatamente após, a 5-HT foi administrada. A

nocicepção foi medida pelo método Hargreaves e o edema pelo

hidropletismômetro (Ugo Basile). A TENS de BF inibiu em 100% a

hiperalgesia da 5-HT, mas não a de AF. TENS de AF e BF não inibiram o

edema induzido por 5-HT. O pré-tratamento com naltrexona (Nx: 50µg; I.pl.),

reverteu o efeito antinociceptivo da TENS de BF. A TENS de BF ao longo do

tempo foi capaz de inibir a nocicepção induzida por 5-HT por até 30 minutos

após o término de sua aplicação. Nossos resultados confirmaram a ausência

de efeito anti-inflamatório pela TENS e a participação de opioide endógeno

periférico na analgesia da TENS de baixa freqüência.

ABSTRACT

Transcutaneuous electrical nerve stimulation (TENS) is defined as the application of

an electrical current to the skin through electrodes for pain relief. Various theories

have been proposed in order to explain the analgesic mechanism of TENS. Recent

studies have demonstrated that part of this analgesia can also be mediated through

neurotransmitters found in peripheral receptors. The present study aims to

investigate the effects of low frequency (LF: 10 HZ) TENS as well as high

frequency (HF: 130 HZ) TENS in nociception and edema induced by

intradermally administered serotonin (5-HT), injected into rat paw (10µg/0.1

ml). LF and HF TENS were applied to the right paw for 20 min, and 5-TH was

administered immediately after. The Hargreaves method was used to measure

nociception, and the hydroplethysmometer (Ugo Basile) was used to measure

edema. The LF TENS reduced by about 100% 5-TH hyperalgesia, but the same

did not happen with the HF TENS. HF and LF TENS did not inhibit 5-HT-induced

edema. Pre-treatment with naltrexone (Nx: 50µg; I.pl.) reversed the

antinociceptive effects of LF TENS. LF TENS application could inhibit

nociception 5-HT-induced edema for 30 min maximum after the end of its

application. Our results have confirmed the lack of an antiinflammatory effect

through the use of TENS as well as the participation of a peripheral endogenous

opioid in LF TENS analgesia.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-HT – 5-hidroxitriptamina

AF – Alta frequência

ANOVA – analysis of variance

APTA – American Physical Therapy Association

ATP - Adenosina Trifosfato

BF – Baixa frequência

CEBIO - Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas

CETEA – Comitê de Ética em Experimentação Animal

CGRP – Calcitonin gene related peptide

EPM – erro padrão da média

g – grama

Hz – Hertz

i.d. – intradérmica

i.pl. – intraplantar

Kg - kilogramas

LIF- Leukemia inhibitory factor

m/s – metros por segundo

mg - miligrama

ml – mililitros

NaCl – Cloreto de Sódio

NGF – Nerve growth factor

Nx – Naltrexona

s.c.- subcutânea

SNC – Sistema Nervoso Central

TENS – Estimulação Elétrica Nervosa Transcutânea

TNF-α – Factor de necrose tumoral alfa

µg – microgramas

µl – microlitros

SUMÁRIO

Capítulo 1- INTRODUÇÃO............................................................................... ...... 11

1.1 Considerações iniciais ...................................................................................... 11

1.2 Dor inflamatória ................................................................................................ 13

1.3 Serotonina ........................................................................................................ 15

1.4 Mecanismos endógenos de controle da dor ..................................................... 17

1.5 Estimulação Elétrica Nervosa Transcutânea (TENS) ....................................... 20

1.6 Objetivos do estudo .......................................................................................... 24

1.6.1 Objetivo geral ................................................................................................ 24

1.6.2 Objetivos específicos..................................................................................... 24

Capítulo 2 - MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 25

2.1 Animais............................................................................................................. 25

2.2 Ambientalização dos animais ........................................................................... 26

2.3 Substâncias utilizadas ...................................................................................... 26

2.4 Administração das substâncias ........................................................................ 27

2.5 Teste nocipeptivo – Algesímetro ...................................................................... 27

2.5.1 Descrição do teste de hiperalgesia térmica .................................................. 28

2.5.2 Avaliação do edema inflamatório – Hidropletismômetro ............................... 29

2.6 Aparelho de Estimulação Elétrica Nervosa Transcutânea (TENS) ................... 30

2.7 Procedimento experimental .............................................................................. 32

2.7.1 Curva dose resposta da serotonina injetada perifericamente ........................ 32

2.7.2 Pré-tratamento dos animais com antagonistas de serotonina ....................... 32

2.7.2.1 Mensuração do volume da pata dos ratos após pré-tratamento com

antagonistas de serotonina.......................................................................................33

2.8 Aplicação da TENS .......................................................................................... 33

2.8.1 Efeito da TENS sobre a hiperalgesia e o edema induzidos por serotonina ... 33

2.9 Pré-tratamento intraplantar com naltrexona ..................................................... 34

2.10 Estudo do tempo de efeito da Tens de baixa frequência................................ 35

2.11 Análise estatística .......................................................................................... 35

Capítulo 3 - REFERÊNCIAS .................................................................................. 36 Capítulo 4 – ARTIGO: Estudo da estimulação elétrica nervosa transcutânea na 42 nocicepção e no edema induzidos pela administração de serotonina intradérmica. Capítulo 5 – CONSIDERAÇÃOES FINAIS................................................................74

ANEXOS ................................................................................................................ .75

11

Capítulo 1 - INTRODUÇÃO

1.1 Considerações iniciais

A dor é um fenômeno complexo que envolve não somente a transmissão do

estímulo nocivo da periferia ao córtex, mas, também, todo o processo cognitivo e

emocional que ocorre no cérebro (JULIUS et al., 2001).

A relação entre a percepção da dor e o estímulo nocivo não é proporcional,

segundo Melzack e Wall (1965), isto é, a intensidade da dor percebida não está

diretamente relacionada ao tamanho da lesão sofrida, pois pode ser modulada em

seu trajeto ascendente. Tipicamente ela ocorre em resposta a um estímulo lesivo,

mas, por vezes, também na ausência deste. Assim, a Associação Internacional para

o Estudo da Dor (IASP) definiu a dor como uma experiência sensorial e emocional

desagradável, associada à lesão tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de

tal lesão (IASP, 2008). Esta variação na percepção da dor está relacionada aos

aspectos cognitivos, emocionais, motores, bem como aos mecanismos

descendentes, inibitórios da dor, que participam de sua modulação (CASEY, 1999).

Isto explica fenômenos como um soldado com grandes feridas no campo de batalha

não relatar dor (MELZACK et al., 1965; MELZACK, 1999).

A nocicepção é uma forma especializada de sinalização sensorial, que

converte informação sobre o dano tecidual iminente (ou atual) (BARANAUSKAS et

al., 1998). Tal sensação é determinada pela estimulação das fibras aferentes

primárias do tipo Aδ e C, que transmitem o impulso nociceptivo até a medula

espinhal.

12

Existe uma diferença conceitual entre os termos nocicepção e dor. O primeiro

refere-se às manifestações neurofisiológicas geradas pelo estímulo lesivo enquanto

o segundo envolve a percepção de um estímulo aversivo e exige a capacidade de

abstração e elaboração dos impulsos sensoriais (MILLAN, 1999; ALMEIDA et al.,

2004).

A transmissão do estímulo doloroso, assim como sua inibição, envolve

múltiplos mecanismos. Os estímulos nociceptivos chegam de maneira

altamente organizada no corno dorsal da medula espinhal, com as fibras Aδ

terminando principalmente nas lâminas I e V e as fibras C na lâmina II. A

partir destas regiões, são acionados neurônios de projeção e interneurônios

de segunda ordem na medula espinhal, sendo que alguns são ativados

somente por estímulos nocivos (específicos para nocicepção) e outros

respondem a diferentes estímulos de alta ou baixa intensidade (largo

espectro). Esta conexão sináptica entre as fibras aferentes primárias e os

neurônios do corno dorsal envolve neurotransmissores como o glutamato e a

substância P, que são responsáveis pela produção de potenciais pós-

sinápticos excitatórios rápidos e lentos respectivamente (MILLAN, 2002).

A neuroanatomia e a organização das vias ascendentes da dor são

altamente complexas. Neuroanatomicamente dois tipos de vias ascendentes

podem ser identificados, monossinápticas e polissinápticas (MILLAN, 2002).

As primeiras projetam diretamente para centros cerebrais superiores e

incluem os tratos espino-mesencefálico, espino-braquial, espino-talâmico e

espino-reticular. Já as vias polissinápticas possuem uma estação relé de

neurônios de segunda ordem antes de se projetarem aos centros cerebrais

13

superiores, as duas principais são espino-cervical e sistema lemniscal

(MILLAN, 2002). Nos centros superiores do sistema nervoso central a

informação é finalmente processada para produzir a percepção da dor

(GRUBB, 1998).

Durante o processo inflamatório, os nociceptores que estão localizados no

tecido danificado, são excitados por estímulos não dolorosos (alodínia) ou

apresentam uma resposta intensificada ao estímulo nociceptivo (hiperalgesia). Essa

alteração nos nociceptores pode ser produzida por mudanças físicas no tecido

lesado (edema) e por mediadores inflamatórios que alteram o limiar das terminações

nervosas aos estímulos térmicos e mecânico (GRUBB, 1998).

1.2 Dor inflamatória

Ao sofrer uma lesão tecidual, o organismo aciona mecanismos cujo propósito

é limitar o dano e facilitar a regeneração. Esses mecanismos fazem parte da

resposta inflamatória, que é caracterizada pelos quatro sinais cardinais: dor, rubor,

calor, tumor e, também, por um quinto sinal que é a perda da função (GALLIN et al.

1992).

O papel da dor inflamatória é alertar o organismo sobre a presença de um

dano e prevenir traumas futuros ao tecido anteriormente lesado (RIEDEL et al.,

2001).

As células danificadas após o comprometimento tecidual liberam, no local da

lesão, ATP e prótons que, juntamente com a bradicinina derivada do plasma, vão

produzir efeitos excitatórios. Simultaneamente, os mastócitos, que estão

14

normalmente presentes nos tecidos, liberam aminas (5-hidroxitriptamina e histamina)

e metabólitos do ácido araquidônico, incluindo as prostaglandinas (COUTAUX et al.,

2005). Essas substâncias alteram o limiar das terminações nervosas ao estímulo

térmico e mecânico (GRUBB, 1998). Assim como os mastócitos, os macrófagos

também já se encontram nos tecidos e migram para o local da lesão onde liberam

citocinas (Interleucinas 1 e 6 e Fator de Necrose Tumoral alfa – TNF-α), e fatores de

crescimento (NGF – Fator de Crescimento do Nervo e LIF – Fator Inibitório da

Leucemia) (COSTIGAN et al., 2000). Já as fibras aferentes primárias contribuem

com o processo inflamatório liberando neuropeptídeos, tais como a substância P e

peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) (COSTIGAN et al., 2000;

COUTAUX et al. 2005). Tais mediadores químicos, dentre outros, agem

principalmente através da sensibilização dos nociceptores (JULIUS et al., 2001).

Muitos dos receptores de alto limiar respondem a uma variedade de estímulos

térmico, químico e mecânico e são definidos como nociceptores polimodais (KIDD et

al., 2001).

Os nociceptores distinguem-se de outros tipos de receptores com base em

sua morfologia, velocidade de condução e limiar de ativação (BESSON, 1999). Eles

são terminais diferenciados com velocidade de condução lenta (fibras C < 2,5 m/s e

fibras Aδ 2,5 a 20,0 m/s), e são normalmente ativados por estímulos de intensidade

nociva (GRUBB, 1998). Os estímulos nocivos que resultam em uma sensação de

dor rápida, aguda e bem localizada, em geral refletem a ativação das fibras Aδ, que

são minimamente mielinizadas e conduzem a dor primária; e a sensação de dor

lenta, crônica e em queimação, em geral, é conduzida por fibras do tipo C, que não

15

são mielinizadas, e participam da condução da dor secundária (GALLIN et al. 1992;

BESSON, 1999; JULIUS et al., 2001).

Um dos mediadores químicos liberados no tecido lesado e inflamado é a

serotonina. Ela é capaz de facilitar a saída de proteínas do plasma e de provocar

hiperalgesia em ratos e humanos (OKAMOTO et al., 2002).

1.3 Serotonina

A serotonina (5-HT) é encontrada em neurônios, plaquetas, mastócitos

cutâneos de roedores e basófilos (TOKUNAGA et al., 1998). No sistema nervoso

central (SNC), está associada com o processamento e modulação da dor

(SOMMER, 2004). Vários estudos mostraram que, na medula espinhal, a 5-HT

liberada de estruturas do tronco cerebral exerce uma ação analgésica (MILLAN,

2002; SOMMER, 2004).

As fibras descendentes serotoninérgicas surgem de núcleos localizados no

bulbo ventromedial rostral, sendo que o núcleo magno da rafe é a principal fonte de

fibras serotoninérgicas que se projetam para a medula espinhal (YOSHIMURA et al.,

2006). Já em tecidos periféricos, a aplicação de 5-HT produz dor em humanos e

nocicepção em roedores (SUFKA et al., 1992; TAMBELLI et al., 2006).

Os receptores 5-HT podem ser classificados em, no mínimo, três, e no

máximo sete classes. Elas incluem 5-HT1, 5-HT2 e 5-HT3, bem como o receptor “não

clonado” 5-HT4. Os genes dos receptores 5-HT5, 5-HT6 e 5-HT7 foram clonados

recentemente, mas ainda têm que ser caracterizados operacional e

transducionalmente em tecidos intactos (HOYER et al., 1994).

16

Os efeitos fisiológicos da serotonina nos tecidos, como um agente pro -

inflamatório e pro-nociceptivo, podem ser descritos em termos da heterogeneidade

de seus receptores identificados na periferia (TAIWO et al., 1992; TAMBELLI et al.,

2006). Possíveis mecanismos de ação, diretos e indiretos, foram propostos

(SOMMER, 2004). Uma possibilidade é a de que a 5-HT periférica age nos

receptores 5-HT1 e 5-HT2 para potencializar mudanças vasculares e, de forma

indireta, pode provocar o fluxo de outros elementos pro-nociceptivos e pro-

inflamatórios (bradicinina e eicosanóides) do sangue. Alternativamente, a serotonina

do plasma e/ou derivada dos tecidos pode ter ação direta nos receptores 5-HT3,

localizados nas fibras aferentes Aδ/C, produzindo nocicepção (GIORDANO et al.,

1989; SUFKA et al., 1992; TOKUNAGA et al., 1998; SOMMER, 2004; TAMBELLI et

al., 2006). Dessa forma, a serotonina liberada no tecido lesado ou inflamado

contribui para a sensibilização das fibras nervosas. Estudos realizados para

determinar os mecanismos envolvidos em outros componentes da inflamação, tais

como o edema induzido por 5-HT (extravasamento de plasma), foram focados

primariamente na inflamação cutânea na pata de ratos (PIERSE, 1995). Os subtipos

de receptores que mediam o extravasamento de plasma no tecido cutâneo induzido

por 5-HT não foram determinados (PIERSE,1995).

Tanto a administração local, quanto sistêmica de antagonista 5-HT,

metisergida, inibiu o edema induzido por 5-HT na pata do rato (SUFKA, 1991). A

serotonina injetada por via intra-articular aumentou substancialmente o

extravasamento de plasma no tecido sinovial. O receptor 5-HT2A foi identificado nos

terminais eferentes simpáticos do tecido sinovial e sugerido como principal mediador

do edema nesse tecido (PIERSE, 1995).

17

1.4 Mecanismos endógenos de controle da dor

Em 1965, Melzack e Wall sugeriram a existência de uma espécie de comporta

no corno dorsal da medula. De acordo com essa teoria, alguns neurônios teriam a

capacidade de suprimir a transmissão do sinal doloroso do corno dorsal da medula,

fechando, então, um portão hipotético, e inibindo a passagem do impulso doloroso

(Teoria da Comporta Espinhal) (MELZACK et al., 1965). As células da lâmina II do

corno posterior (substância gelatinosa) são principalmente interneurônios inibitórios

curtos que se projetam às lâminas I e V, e regulam a transmissão na primeira

sinapse da via nociceptiva entre as fibras aferentes primárias e os neurônios de

transmissão do trato espino-talâmico. Assim, as células da substância gelatinosa

respondem tanto à atividade das fibras aferentes que entram na medula quanto à

atividade das vias descendentes (RANG et al., 2008).

A sensação de dor pode ser modificada pelos sistemas endógenos inibitórios

da dor, predominantemente através das vias descendentes de noradrenalina,

serotonina e opióides endógenos, tais como β-endorfina e dinorfina (YOSHIMURA et

al., 2006). Essas vias descendentes constituem um dos mecanismos de controle da

comporta que controlam a transmissão de impulsos dolorosos (relacionados com a

sensação de dor) no corno posterior da medula espinhal. Muitas classes de

neurônios do corno dorsal, as próprias fibras aferentes primárias e as fibras

descendentes do cérebro exercem uma potente influência modulatória sobre a

transferência de informação nociceptiva que chega da periferia para a medula

espinhal e da medula para o cérebro (MILLAN et al., 2002).

As células noradrenérgicas são classificadas de A1 a A7 e estão amplamente

distribuídas no mesencéfalo, das quais um número substancial de neurônios está

18

em A5-A7 (locus coeruleus) e tem uma significante projeção descendente para a

medula espinhal (JONES, 1991; PERTOVAARA, 2006; YOSHIMURA et al., 2006).

Estudos farmacológicos evidenciaram a ação antinociceptiva da noradrenalina no

sistema inibitório descendente (JASMIN et al., 2002; TANABE et al., 2005).

Os receptores de catecolaminas são classicamente divididos em duas

categorias principais: alfa e beta-adrenoceptores, sendo o efeito antinociceptivo da

noradrenalina mediado principalmente pelos α-2-adrenoceptores (FAIRBANKS et al.,

1999).

Muitos estudos têm relacionado a serotonina (5-HT) na modulação

descendente da transmissão nociceptiva (ZHAO et al., 2007). De maneira

semelhante ao sistema noradrenérgico, as fibras descendentes serotoninérgicas

surgem de núcleos localizados no bulbo ventromedial rostral, sendo que o núcleo

magno da rafe é a principal fonte de fibras serotoninérgicas que se projetam para a

medula espinhal (YOSHIMURA et al., 2006; RANG et al., 2007).

Os opióides estão envolvidos tanto em componentes ascendentes quanto

descendentes da modulação da dor (STAMFORD, 1995). Existem três tipos

principais de receptores: opióides µ (mu), κ (kappa) e δ (delta) que estão presentes

no hipotálamo, substância cinzenta periaquedutal, corno dorsal da medula e nos

nervos aferentes periféricos (STAMFORD, 1995; HOLDEN et al., 2005). O receptor µ

opióide é foco nos estudos de dor, pois sua ativação é necessária para a ação da

maioria dos analgésicos potentes (FIELDS, 2004). Os opióides promovem a

analgesia através de diversos mecanismos, dentre eles a ativação das vias

descendentes e a inibição da transmissão no corno dorsal (DELEO, 2006). Tanto os

terminais aferentes primários quanto os neurônios de segunda ordem, no corno

dorsal da medula, apresentam receptores µ e δ opióides. A aplicação de agonistas µ

19

opióides reduz a liberação de neurotransmissores excitatórios pelos terminais

aferentes primários através da inibição dos canais de cálcio voltagem-dependentes

(FIELDS, 2007). Segundo a revisão de Fields (2007) outro controle ocorre através

da ação direta na despolarização de neurônios de segunda ordem, no corno dorsal,

pela abertura de canais de potássio. Essas ações dos opióides no corno dorsal

contribuem para eficácia clínica de agonistas µ opióide tais como a morfina.

Há, também, evidências de que os opióides inibem a descarga de

terminações aferentes nociceptivas na periferia, particularmente sob condições de

inflamação, nas quais aumenta a expressão dos receptores opióides pelos

neurônios sensitivos (OBARA et al., 2007; RANG et al., 2008). Os opióides podem

inibir a liberação de neurotransmissores excitatórios (ex: substância P) das

terminações nervosas sensoriais (MACHELSKA et al., 2002).

Existem diferentes ligantes endógenos, da classe dos peptídeos opióides,

como as endorfinas, encefalinas e dinorfinas, que exibem diferentes afinidades e

seletividades pelos três receptores opióides µ (endorfinas e encefalinas), δ

(encefalinas e endorfinas) e κ (dinorfinas) (MACHELSKA et al., 2002; STEIN et al.,

2009). Esses peptídeos opióides endógenos são identificados na pele, em tecidos

subcutâneos e particularmente em células inflamatórias (STEIN et al., 2009).

Stein et al. (1993) verificaram em seu estudo que a naloxona, um antagonista

opióide, injetada por via intra-articular, intensificou a sensação de dor após cirurgia

de artroscopia no joelho, sugerindo a participação de receptores opióides na

analgesia pós-operatória.

Semelhante aos estudos realizados para verificar a participação dos

receptores opióides na analgesia periférica, Gentili et al. (1996) demonstraram que a

20

administração de clonidina, um agonista α2- adrenérgico, por via intra-articular

reduziu a dor no período pós-operatório de artroscopia do joelho.

É bem descrito na literatura que a interação sinérgica entre receptores

opióides e α2-adrenérgicos, quando co-administradas morfina e clonidina no SNC,

resultam em uma intensificação da analgesia (STEIN et al., 2009). Buerkle et al.

(2000) concluíram que, a co-administração de um opióide e um agonista α2-

adrenérgico, por via intra-articular, resultou em alívio intensificado da dor no pós-

operatório de cirurgia de joelho, quando comparado com cada um administrado

isoladamente, o que sugere que essa sinergia pode ocorrer também na periferia

(BUERKLE et al., 2000).

Além da utilização da farmacologia clássica, outros recursos podem ser

utilizados como coadjuvantes no tratamento da dor e evitar os efeitos colaterais

advindos do uso frequente dessas drogas. Um recurso não farmacológico, não

invasivo, sem efeitos colaterais, com poucas contra-indicações e comum na prática

clínica do fisioterapeuta é a estimulação elétrica nervosa transcutânea (TENS)

(JOHNSON, 2001; SLUKA, 2003).

1.5 Estimulação Elétrica Nervosa Transcutânea (TEN S)

A estimulação elétrica nervosa transcutânea é definida, pela American

Physical Therapy Association (APTA), como a aplicação de corrente elétrica, por

meio de eletrodos de superfície, na pele para alívio da dor (APTA, 1997; SLUKA et

al., 2006). Dois tipos de TENS são usados clinicamente, TENS de baixa frequência

21

(frequência de estimulação < 10 Hz) e TENS de alta frequência (frequência > 50 Hz)

(AINSWORTH et al., 2006; SLUKA et al., 2006).

Diferentes teorias são propostas para explicar o mecanismo de ação da TENS

(RADHAKRISHNAN et al., 2003). A mais conhecida foi descrita no estudo de Wall e

Sweet (1967) pautada na teoria da comporta espinhal da dor introduzida por

Melzack e Wall, em 1965. Essa teoria forneceu uma explicação convincente sobre a

natureza da dor, e forneceu uma base teórica para a efetividade da TENS no

tratamento da dor (KING et al., 2001). Assim, a informação nociceptiva das fibras

aferentes de pequeno diâmetro (Aδ e C) é inibida pela estimulação das fibras de

grande diâmetro Aβ e o estímulo doloroso é impedido de alcançar os centros supra-

espinhais (MELZACK et al., 1965). Então, a TENS utilizada clinicamente seria capaz

de estimular fibras de grande diâmetro e promover o controle da dor (KING et al.,

2001). Além disso, estudos neurofarmacológicos sugeriram a ação de mecanismos

espinhal e supra-espinhal relacionados a neurotransmissores, na analgesia induzida

pela TENS (RADHAKRISHNAN et al., 2003).

Opióides endógenos liberados no sistema nervoso central estão envolvidos

no mecanismo analgésico da TENS (SLUKA et al., 1999) que abrange,

predominantemente, mecanismos centrais (espinhal e supra-espinhal) (SLUKA et

al., 1999, 2003; AINSWORTH et al., 2006) e, mais recentemente, também periféricos

(SABINO et al., 2008).

A naloxona administrada no corno dorsal na medula espinhal, em ratos

artríticos, impediu o efeito antinociceptivo da aplicação da TENS, confirmando a

teoria que a TENS exerce seu efeito através da liberação de opióides a nível

espinhal (SLUKA et al., 1999).

22

Ainda em relação ao envolvimento de neurotransmissores centrais nos

mecanismos de ação da TENS, Radhakrishnan et al. (2003) investigaram o papel

dos receptores serotoninérgicos e noradrenérgicos no mecanismo anti-hiperalgésico

da TENS. Neste estudo eles demonstraram que subtipos de receptor 5-HT2A e 5-HT3

espinhais estão envolvidos na anti-hiperalgesia induzida pela TENS de baixa

frequência, mas não na de alta frequência, sugerindo um importante papel do

sistema serotoninérgico central em mediar a antinocicepção da TENS

(RADHAKRISHNAN et al., 2003). Neste mesmo estudo, a administração intratecal

de antagonista α2-adrenoceptor (yohimbina) não afetou o efeito analgésico da TENS

de baixa e alta frequência, mostrando que o mecanismo analgésico da TENS não

envolve ativação de α2-adrenoceptor espinhal (RADHAKRISHNAN et al., 2003;

KING et al., 2005).

Evidências em estudos recentes sugerem que parte do efeito analgésico da

TENS pode ser mediado por ação de neurotransmissores em receptores periféricos

(SLUKA et al., 2003). A administração periférica de um antagonista seletivo de α2-

adrenoceptor bloqueou o efeito anti-hiperalgésico mediado pela TENS, sugerindo

que esses receptores são ativados pela liberação endógena de noradrenalina em

resposta à TENS, e exógena pela administração de clonidina, um agonista α2-

adrenérgico (KING et al., 2005).

Estudos desenvolvidos por Sabino et al. (2008) mostraram que a TENS de

baixa e alta frequência induzem efeito anti-hiperalgésico através de diferentes

mecanismos de ação: a TENS de baixa frequência através da liberação de opióides

e a TENS de alta frequência por mecanismos não opióides. Esse mesmo estudo

sugere que a antinocicepção induzida pela TENS de baixa frequência é devido à

liberação local de opióides endógenos (SABINO et al., 2008).

23

A literatura mostra que o mecanismo de analgesia da TENS envolve outros

sistemas além dos mencionados na teoria do portal espinhal. Além da teoria do

portão, outras vias anatômicas, neurotransmissores e seus receptores e tipos de

neurônios, estão envolvidos no mecanismo de analgesia induzida pela TENS

(SLUKA et al., 2006) .

Porém, apesar de muitos esforços em elucidar os mecanismos pelos quais a

TENS exerce seu efeito anti-hiperalgésico, pouco se conhece a respeito de suas

ações nos tecidos periféricos.

Poucos estudos na literatura associam o uso da TENS com a atividade

antiinflamatória. Investigações sugerem a não efetividade da TENS de alta e de

baixa frequência em prevenir o edema inflamatório (RESENDE et al., 2004).

Até o presente momento, nas bases de dados consultadas, não foram

encontradas investigações que mostrem a capacidade da TENS em bloquear

estímulo nociceptivo e edema induzido por uma amina biogênica, como a

serotonina, encontrada nos tecidos periféricos em condições inflamatórias agudas.

Assim, há também a necessidade de pesquisa básica para compreender o

mecanismo de analgesia, induzida pela estimulação elétrica nervosa transcutânea,

tem motivado estudos na área.

Os trabalhos em modelos animais minimizam o efeito placebo da TENS,

permitem melhor controle sobre a extensão e tempo de injúria, os parâmetros são

melhor controlados, além de facilitar a análise da posição dos eletrodos e possibilitar

a realização de exames neurobiológicos.

Clinicamente, a TENS é raramente administrada de forma isolada.

Combinações de tratamentos farmacológicos e não-farmacológicos para controle da

dor são frequentes. O entendimento do mecanismo de ação desse recurso permite

24

aos profissionais que o utilizam serem capazes de intensificar os efeitos de diversos

tipos de analgésicos e reduzir os efeitos colaterais dos agentes farmacológicos

produzindo um melhor alívio da dor.

Diante do exposto, a investigação dos mecanismos de ação da TENS se faz

importante, para que sua indicação seja realizada com maior precisão, observando-

se as diferentes situações clínicas e parâmetros para sua aplicação.

1.6 Objetivos do estudo

1.6.1 Objetivo geral

Verificar o efeito da TENS de baixa e alta frequência na nocicepção e edema

induzidos por serotonina administrada perifericamente, na pata de ratos.

1.6.2 Objetivos específicos

• Verificar se a administração periférica por injeção intraplantar de

naltrexona, um antagonista opióide específico, antes da aplicação da

TENS, restaura o efeito nociceptivo da serotonina.

• Verificar o tempo de efeito da TENS aplicada antes da indução da

nocicepção, no pico de hiperalgesia da serotonina injetada

perifericamente.

25

Capítulo 2 - MATERIAIS E MÉTODOS

O presente estudo faz parte de um projeto de pesquisa intitulado “Estudo da

participação da via serotoninérgica e noradrenérgica na modulação da dor

inflamatória após estimulação elétrica nervosa transcutânea de baixa e alta

frequência”, sob orientação do Prof. Dr. Marcos Antonio de Resende foi aprovado

pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG - CETEA (Parecer n°

237/08) (Anexo 1) e, somente após a sua aprovação, foi iniciado o estudo.

2.1 Animais

Foram utilizados ratos Holtzman machos com peso entre 280 e 310 gramas

(para os experimentos no teste algesimétrico de Hargreaves , e de 160 a 200g (para

experimentos no hidropletismômetro). Os animais foram fornecidos pelo CEBIO –

Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. A variação de

peso dos animais para os dois testes deveu-se a limitações dos métodos. Em nosso

estudo-piloto, pudemos observar que animais menores apresentavam um

comportamento exploratório duradouro, provavelmente devido às dimensões do

compartimento na caixa de acrílico utilizada para colocar os animais durante o teste

(18 cm x 29 cm x 12.5 cm), o que inviabilizou medidas em intervalos menores de

tempo. Optamos, então, por utilizar animais maiores, segundo Hargreaves et al.

(1988), que utilizaram animais com peso entre 250 e 300g. Os experimentos foram

realizados com grupos de 4 a 10 animais, perfazendo um total de 161 animais

utilizados em todo o estudo.

26

2.2 Ambientalização dos animais

Os animais permaneceram no biotério em caixas de plástico (seis por gaiola), com

forração de maravalha, com livre acesso à água e comida. No dia anterior aos

experimentos, os animais foram privados de alimento e levados para a sala de

experimento, com ciclo claro-escuro de 12 horas e temperatura controlada (de 22 a

24°C). Foi realizada a adaptação ao aparelho algesí metro por 30 minutos, para que

os animais se habituassem às caixas de teste, à manipulação imposta pelo

pesquisador e aos procedimentos de teste. Essa metodologia assemelha-se aos

padrões pré-estabelecidos em estudos similares (RESENDE et al., 2006; SABINO et

al., 2008).

2.3 Substâncias utilizadas

As substâncias utilizadas nesse estudo foram: serotonina (Serotonin, Sigma®,

E.U.A), maleato de metisergida (Methysergide maleate, Sigma®, E.U.A), pizotifeno

(Pizotifen, Sandoz®, Brasil), cloridrato de ondansetrona (Ondansetron, Glaxo®,

Brasil), naltrexona (Naltrexone hydrochloride, Sigma®, E.U.A) e solução salina

fisiológica estéril (NaCl 0,9%).

2.4 Administração das substâncias

Todas as substâncias foram preparadas em solução salina estéril, momentos

antes do experimento. Elas foram administradas após as medidas do limiar de

retirada ou do volume da pata no baseline.

27

Para indução da nocicepção, os animais receberam injeção intradérmica (i.d.)

de serotonina (10µg) ou salina na pata direita. Um volume total de 0,1ml foi

administrado. A pata contralateral desses animais não recebeu nenhuma

administração. A injeção intradérmica de serotonina (10µg) também foi utilizada para

induzir edema. O mesmo volume final (0,1ml) foi administrado na pata direita dos

animais; já a pata contralateral recebeu igual volume de salina.

Injeção subcutânea (s.c.) foi administrada no dorso dos animais próximo à

região cervical para administração dos antagonistas de serotonina (pizotifeno,

metisergida e ondansetrona) ou salina.

Naltrexona (50µg/0,1ml) ou salina (0,1ml) foram injetadas na pata direita por

via intraplantar (i.pl.), sendo que nenhuma substância foi administrada na pata

contralateral durante esses experimentos.

2.5 Teste nociceptivo - Algesímetro

Para a medida do tempo de latência de retirada da pata foi utilizado o

aparelho Plantar test da Ugo Basile® (modelo 7370, Itália), que é um algesímetro

térmico descrito originalmente por Hargreaves et al. (1988). Essa técnica avalia a

resposta nociceptiva a estímulos térmicos em animais não restritos.

2.5.1 Descrição do teste de hiperalgesia térmica

Para o teste, o animal foi cuidadosamente colocado em compartimento de

acrílico individual (18 cm x 29 cm x 12.5 cm), posicionado sobre uma superfície de

vidro especial, que permitiu a passagem de forma homogênea da luz e do calor. Foi

28

realizado um período de ambientalização (± 5 minutos), suficiente para que o animal

terminasse a exploração do ambiente. Após esse tempo, a fonte de luz

infravermelha era colocada sob cada uma das patas traseiras do animal. O teste foi

iniciado por um interruptor que ativou a fonte de calor e disparou o cronômetro

eletrônico. Quando o animal retirava a pata, a fonte de luz e o relógio eram

interrompidos automaticamente, e o tempo de retirada, em segundos, era registrado.

Um tempo máximo de 30 segundos foi utilizado como tempo de corte para impedir

dano tecidual.

A latência de retirada da pata foi considerada como resposta ao calor, quando

o animal realizava movimentos de sacudir, lamber ou erguer a pata traseira. Duas

medidas de cada pata foram realizadas com um curto intervalo de tempo entre as

mesmas. A média das duas medidas foi utilizada para calcular o delta (∆) da

latência de retirada, obtido através da diferença entre a pata direita (inflamada) e a

pata esquerda (controle), em segundos. Todas as medidas foram realizadas pelo

mesmo avaliador e no mesmo período do dia. As aferições foram realizadas no

tempo zero e após 5, 15, 30, 60 e 120 minutos da administração de serotonina

intradérmica na região plantar.

FIGURA 1: Método Hargreaves – Aparelho Ugo Basile® (modelo 7370)

29

2.5.2 Avaliação do edema inflamatório – Hidropleti smômetro

Para aferir o aumento de volume das patas traseiras, causado pelo estímulo

pró-inflamatório, foi utilizado um hidropletismômetro da Ugo Basile® (modelo 1750,

Itália), composto por duas câmaras transparentes, uma contendo o fluido que seria

deslocado e a outra contendo um transdutor de sinal elétrico, ligadas por um sistema

de vasos comunicantes.

O método consistiu na imersão da pata do animal até a articulação tíbio-

társica, em uma solução salina e detergente dentro da cubeta do aparelho. O

deslocamento de fluido, assim provocado, acionou um transdutor cujo sinal foi

transformado em mililitros e pôde ser lido em um mostrador digital, colocado ao lado

na bancada. O sinal elétrico produzido foi proporcional ao volume deslocado pelas

patas avaliadas.

O cálculo do edema da pata foi obtido através dos valores de variação entre

o volume da pata inflamada (direita) e o volume da pata contralateral (esquerda) (∆,

em ml), nos mesmos tempos utilizados para medida do limiar nociceptivo, isto é,

tempo zero e após 5, 15, 30, 60 e 120 minutos do estímulo pró-inflamatório. As

medidas foram realizadas por um mesmo examinador previamente treinado

(Doutoranda Patrícia Paiva Lima) e os valores expressos como média ± EPM, por

grupo, da diferença do volume (ml) entre as patas traseiras, em cada tempo.

30

(A) (B)

FIGURA 2: Medida pletismométrica do volume das patas posteriores dos ratos (Hidropletismômetro Ugo Basile, modelo 1750)

2.6 Aparelho de Estimulação Elétrica Nervosa Trans cutânea (TENS)

O aparelho de TENS utilizado para induzir antinocicepção foi o Neurodyn

III/Ibramed®. O aparelho foi devidamente calibrado e os parâmetros de estimulação

administrados foram: baixa (BF:10 Hz) e alta frequência (AF: 130 Hz), com duração

de pulso de 130 µs. A intensidade para todos os grupos foi considerada no limiar

sensorial, isto é, a intensidade foi aumentada até o limiar motor com contração

muscular visível e, em seguida, reduzida para o nível sensorial, conforme descrito

por Sluka et al. (1998); (Sluka, 2001), e realizado em experimentos prévios do nosso

laboratório (RESENDE et al., 2004; SABINO et al., 2006, 2008).

A intensidade do estímulo foi determinada no início da aplicação da TENS

para cada animal. A duração da estimulação elétrica nervosa transcutânea foi de 20

minutos. A escolha dos parâmetros relativos à frequência, a duração do pulso, o

31

tempo de aplicação e a determinação da intensidade escolhidos para este estudo

experimental foram semelhantes aos utilizados na clínica fisioterapêutica

(JOHNSON, 2001; SLUKA et al., 2003). Eletrodos com 1 cm² foram especialmente

construídos para os experimentos e fixados na face plantar e dorsal da pata

posterior direita do animal com fita adesiva, não sendo utilizado gel acoplador. Antes

de iniciar a estimulação aguardou-se um curto período de tempo para que os

animais cessassem a exploração do ambiente e se adaptassem à condição

experimental. Ao início da passagem de corrente elétrica pela pata dos animais eles

apresentaram comportamento de fuga e agitação que cessou após

aproximadamente 3 minutos da aplicação da TENS.

Experimentos com o aparelho desligado foram conduzidos a fim de controle.

Os eletrodos foram fixados na pata direita tratada com 5-HT da mesma forma que no

grupo que recebeu a estimulação elétrica, porém o aparelho de TENS foi mantido

desligado da tomada, durante os 20 minutos correspondentes à aplicação da TENS.

FIGURA 3: Aparelho de TENS Neurodyn III/Ibramed®

32

FIGURA 4: Técnica de aplicação da TENS

2.7 Procedimento experimental

2.7.1 Curva dose-resposta da serotonina injetada p erifericamente

Para o estudo da serotonina (5-HT), diferentes doses dessa substância (0,1;

1,0 e 10 µg) (OLIVEIRA et al., 2007) foram administradas em grupos distintos de

animais (n=5 em todos os experimentos), na pata traseira direita. Nenhuma

administração foi feita na pata esquerda. As medidas foram obtidas nos tempos zero

e após 5, 15, 30, 60 e 120 minutos da injeção de serotonina. A dose de escolha para

indução da nocicepção foi de 10 µg de serotonina.

2.7.2 Pré-tratamento dos animais com antagonistas de serotonina

Todas as drogas utilizadas foram administradas por injeção subcutânea no

dorso da região cervical dos animais meia hora antes da administração de

serotonina (10µg/0,1ml i.d) (ABBOTT et al., 1997). As medidas foram obtidas nos

mesmos tempos dos experimentos anteriores. Os seguintes antagonistas foram

33

utilizados: metisergida (2mg/kg) (ZARRINDAST et al., 1995), ondansetrona (2mg/Kg)

e pizotifeno (2mg/kg) (FRANCISCHI et al.,1996). Os animais do grupo controle

receberam salina meia hora antes da injeção de serotonina. O efeito nociceptivo da

serotonina após o pré-tratamento com seus antagonistas foi, então, avaliado.

2.7.2.1 Mensuração do volume da pata dos ratos após pré-tratamento com

antagonistas de serotonina

Grupos de animais distintos dos anteriores foram também tratados com as

mesmas concentrações de antagonistas ou salina, meia hora antes da

administração intradérmica de 5-HT, para mensurar seu efeito sobre o edema na

pata traseira direita. Todos os animais receberam salina por injeção intradérmica

(0,1ml) na pata esquerda. As medidas foram obtidas no tempo zero e nos 5, 15, 30,

60 e 120 minutos seguintes à aplicação de serotonina.

2.8 Aplicação da TENS

2.8.1 Efeito da TENS sobre a hiperalgesia e o edem a induzidos por serotonina

TENS de baixa e de alta frequências foram aplicadas na pata direita, em

grupos distintos de 5 a 10 animais, 30 minutos antes de os animais receberem a

injeção de serotonina intradérmica na região plantar (10µg/100µl). Durante a

aplicação da TENS, os ratos moviam-se “livremente”, em caixas especialmente

construídas para experimentos com animais (30x20 cm).

34

A fim de evitar que eles provocassem algum dano aos eletrodos

confeccionou-se, em cartolina, um colar “elizabetano” preso por fita adesiva ao redor

da cabeça dos animais. Os ratos utilizaram o colar durante os 20 minutos de

aplicação da TENS.

Dois estudos em grupos distintos foram realizados: um para avaliar o efeito da

TENS de baixa e alta frequências sobre a hiperalgesia provocada pela serotonina e

o outro experimento para avaliar a ação da TENS sobre o edema induzido pela 5-

HT.

2.9 Pré-tratamento intraplantar com naltrexona

A fim de estudar o mecanismo de ação da TENS de baixa frequência, sobre a

hiperalgesia provocada por serotonina perifericamente, foi utilizada naltrexona, um

antagonista opióide, por via intraplantar (50 µg/100µl), preparado em solução salina.

Essa substância foi administrada 30 minutos antes da aplicação da TENS de baixa

frequência. A dose escolhida foi baseada no estudo de Rodrigues et al. (2005).

Esses autores demonstraram em seu estudo que esta dose de 50 µg injetada na

pata contralateral, não tinha efeito sobre a hiperalgesia da pata inflamada. Sabino et

al. (2008) também utilizaram essa mesma dose em seu estudo que investigou os

mecanismos envolvidos no efeito antinociceptivo da TENS de alta e baixa

frequência.

35

2.10 Estudo do tempo de efeito da TENS de baixa fr equência

Para estudo da duração do tempo de ação da TENS, os animais receberam

TENS de baixa frequência (10 Hz), com tempo de pulso de 130 µs, por 20 minutos.

Ela foi aplicada no tempo zero. Nos ratos controle a TENS foi utilizada desligada por

igual período. Grupos, com quatro animais cada, receberam injeção intradérmica

plantar de serotonina (10µg) nos diferentes tempos após aplicação da TENS de BF,

ou seja, 5, 25, 55 e 115 minutos após a TENS ter sido retirada. As medidas do

tempo de retirada da pata foram realizadas no Hargreaves, sempre cinco minutos

após a injeção de 5-HT, aos 10 ,30, 60 ou 120 minutos após a aplicação da TENS

na pata direita.

2.11 Análise estatística

A preparação do banco de dados, assim como a análise estatística, foram

realizadas por meio do programa GraphPad Prism 4.00, instalado em ambiente

Windows®.

Os resultados estão representados como a média ± erro padrão da média. As

comparações estatísticas das diferenças entre os grupos nos diversos tempos de

medidas foram feitas utilizando-se análise de variância (One-way ANOVA), com

correção post hoc pelo teste de Bonferroni. Para os experimentos com apenas dois

grupos, foi utilizado para verificar diferenças entre dois grupos nos diversos tempos

a Two-way ANOVA. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente

significativo.

36

Capítulo 3 - REFERÊNCIAS ABBOTT, F. V.; HONG, Y.; BLIER, P. Persisting sensitization of the behavioural response to formalin-induced injury in the rat through activation of serotonin receptors. Neuroscience , v. 77, n. 2, p. 575-584, 1997. AINSWORTH, L.; BUDELIER, K.; CLINESMITH, M.; FIEDLER, A.; LANDSTRON, R.; LEEPER, B. J.; MOELLER, L.; MUTCH, S.; O’DELL, K.; ROSS, J.; RADHAKRISHNAN, R.; SLUKA, K. A. Transcutaneous electrical nerve stimulation (tens) reduces chronic hiperalgesia induced by muscle inflammation. Pain , v. 120, p. 182-187, 2006. ALMEIDA, R. F.; ROIZENBLATT, S.; TUFIK, S. Afferent pain pathways: a neuroanatomical review. Brain research, v. 1000, p. 504-510, 2000. APTA. American physical therapy association, guide to physical therapy practice. Physical Therapy , v. 77, p. 1171-1624, 1997. BARANAUSKAS, G.; NISTRI, A. Sensitizations of pain pathways in the spinal cord: cellular mechanisms. Progress in Neurobiology, v. 54, p. 349-365, 1998. BESSON, J. M. The Neurology of pain. The Lancet , v. 353, p. 1610-1615, 1999. BUERKLE, H.; HUGE, V.; WOLFGART, M.; STEINBECK, J.; MERTES, N.; VAN AKEN, H.; PRIEN, T. Intra-articular clonidine analgesia after knee arthroscopy. European Journal of Anaesthesiology , v. 17, p. 295-299, 2000. CASEY, K. L. Forebrain mechanisms of nociception and pain: Analysis through imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , v. 96, p. 7668-7674, 1999. COSTIGAN, M.; WOOLF, C. J. Pain: molecular mechanisms. The Journal of Pain , v. 1, n. 3, supplement 1, p. 35-44, 2000. COUTAUX, A.; ADAM, F.; WILLER, J. C.; BARS, D.L. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine , v. 72, p. 359-371, 2005. DELEO, J. A. Basic science of pain. The Journal of Bone and Joint Surgery , v. 88-A, supplement 2, p. 58-62, 2006.

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42

Capítulo 4 – ARTIGO: Estudo da estimulação elétrica nervosa transcutânea na

nocicepção e no edema induzidos pela administração de serotonina

intradérmica

Cristiane Magela de Freitas Santos1, Marcos Antônio de Resende2, Patrícia Paiva

Lima3, Janetti Nogueira de Francischi4

1Mestranda em Ciências da Reabilitação, Universidade Federal de Minas Gerais –

UFMG, Belo Horizonte, MG, Brasil.

2Professor Doutor, Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de Minas

Gerais – UFMG, Belo Horizonte, MG, Brasil.

3Doutoranda, Departamento de farmacologia do instituto de ciências biológicas,

Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG, Belo Horizonte, MG, Brasil.

4Professora Doutora, Departamento de farmacologia do instituto de ciências

biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG, Belo Horizonte, MG,

Brasil.

Correspondência para Marcos Antônio de Resende: Avenida Antônio Carlos, 6637.

Departamento de Fisioterapia. CEP: 31.270-901. Belo Horizonte - MG. Tel:

(31)34097412. mresende@eeffto.ufmg.br

Título para as páginas do artigo: Estudo da TENS na nocicepção e edema da 5-HT.

Palavras-chave: TENS, Sistema nervoso periférico, Serotonina, Opióides

endógenos, Nocicepção,

43

RESUMO

A estimulação elétrica nervosa transcutânea (TENS) é definida como a

aplicação de corrente elétrica por meio de eletrodos na pele, para alívio da

dor. Diferentes teorias são propostas para explicar o mecanismo de ação

analgésica da TENS. Estudos recentes mostraram que parte dessa analgesia

pode, também, ser mediada por ação de neurotransmissores localizados em

receptores periféricos. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da TENS

de baixa (BF: 10 Hz) e alta (AF: 130 Hz) frequência na nocicepção e no

edema induzidos por serotonina (5-HT) administrada intradermicamente na

pata do rato (10µg/0,1ml). TENS de BF e de AF foram aplicadas na pata

direita durante 20 minutos e, imediatamente após, a 5-HT foi administrada. A

nocicepção foi medida pelo método Hargreaves e o edema, pelo

hidropletismômetro (Ugo Basile). A TENS de BF inibiu em 100% a

hiperalgesia da 5-HT, mas não a de AF. TENS de AF e BF não inibiram o

edema induzido por 5-HT. O pré-tratamento com naltrexona (Nx: 50µg; I.pl.)

reverteu o efeito antinociceptivo da TENS de BF. A TENS de BF foi capaz de

inibir a nocicepção induzida por 5-HT por até 30 minutos após o término de

sua aplicação. Nossos resultados confirmaram a ausência de efeito anti-

inflamatório pela TENS e a participação de opióides endógenos periféricos na

analgesia da TENS de baixa frequência.

Perspectivas : Este estudo fornece informações relevantes sobre os

mecanismos de ação analgésicos da TENS nos tecidos periféricos. Uma

melhor compreensão a respeito desse recurso não invasivo, sem efeitos

44

colaterais e de baixo custo para alívio da dor, é de grande importância para

fisioterapeutas, cientistas e população em geral.

ABSTRACT

Transcutaneuous electrical nerve stimulation (TENS) is defined as the application of

an electrical current to the skin through electrodes for pain relief. Various theories

have been proposed in order to explain the analgesic mechanism of TENS. Recent

studies have demonstrated that part of this analgesia can also be mediated through

neurotransmitters found in peripheral receptors. The present study aims to

investigate the effects of low frequency (LF: 10 HZ) TENS as well as high

frequency (HF: 130 HZ) TENS in nociception and edema induced by

intradermally administered serotonin (5-HT), injected into rat paw (10µg/0.1

ml). LF and HF TENS were applied to the right paw for 20 min, and 5-TH was

administered immediately after. The Hargreaves method was used to measure

nociception, and the hydroplethysmometer (Ugo Basile) was used to measure

edema. The LF TENS reduced by about 100% 5-TH hyperalgesia, but the same

did not happen with the HF TENS. HF and LF TENS did not inhibit 5-HT-induced

edema. Pre-treatment with naltrexone (Nx: 50µg; I.pl.) reversed the

antinociceptive effects of LF TENS. LF TENS application could inhibit

nociception 5-HT-induced edema for 30 min maximum after the end of its

application. Our results have confirmed the lack of an antiinflammatory effect

through the use of TENS as well as the participation of a peripheral endogenous

opioid in LF TENS analgesia. Perspectives : This study provides relevant

information about the analgesic mechanisms of TENS in peripheral tissues. A

better understanding of this noninvasive treatment, which has low costs and

45

no side-effects for the relief of pain, represents an important issue to physical

therapists, to scientists and to the general population.

Short title: Study of TENS on nociception and edema induced by 5-HT

Key words: TENS, Pheripheral nervous system, Serotonin, Endogenous

opioids, Nociception, Analgesia.

46

INTRODUÇÃO

A estimulação elétrica nervosa transcutânea (TENS) é definida, pela American

Physical Therapy Association (APTA), como a aplicação de corrente elétrica por

meio de eletrodos de superfície na pele para alívio da dor.2,28 O tratamento da dor

aguda normalmente é realizado com drogas e alguns agentes não farmacológicos,

sendo um deles, a TENS, utilizada frequentemente na clínica de Fisioterapia.40 Dois

tipos de TENS são usadas clinicamente, TENS de baixa (< 10 Hz) frequência (TENS

de BF) e TENS de alta (> 50 Hz) frequência (TENS de AF).1,28

Diferentes mecanismos são propostos para explicar a ação analgésica da TENS.21

Estudos neurofarmacológicos sugerem a participação de mecanismos espinhais e

supraespinhais relacionados a neurotransmissores para explicar a analgesia

provocada pela TENS.21,28,29 Alguns estudos têm verificado o envolvimento de

opióides endógenos liberados no sistema nervoso central após aplicação da

TENS1,27,29 e, mais recentemente, nosso grupo mostrou evidências da participação

de vias opioidérgicas periféricas.25 Além disso, subtipos de receptor 5-HT2A e 5-HT3

espinhais parecem estar envolvidos na anti-hiperalgesia induzida pela TENS de BF,

mas não na de AF, sugerindo um importante papel do sistema serotoninérgico

central em mediar a antinocicepção da TENS21. No entanto, outros estudos

mostraram que o mecanismo analgésico da TENS não envolve a participação de α2-

adrenoceptor espinhal13,21 e que parte da analgesia da TENS pode ser mediada por

ação de neurotransmissores em receptores periféricos.29

A 5-HT liberada de estruturas do tronco cerebral exerce uma ação analgésica15,30 e,

em tecidos periféricos, a aplicação dessa substância produz edema e dor em

47

humanos e nocicepção em roedores.36,38 Provavelmente, a 5-HT periférica age nos

receptores 5-HT1 e 5-HT2 provocando mudanças vasculares e, de forma indireta,

alterar o fluxo de outros elementos pro-nociceptivos e pró-inflamatórios como a

bradicinina e eicosanóides do sangue. Alternativamente, a serotonina do plasma

e/ou derivada dos tecidos pode ter ação direta sobre os receptores 5-HT3,

localizados nas fibras aferentes Aδ/C, produzindo nocicepção.30,36,38,39

Na literatura consultada, os estudos não mostraram a efetividade da TENS em

bloquear a dor e edema induzidos por uma amina biogênica, como a serotonina, que

pode ser encontrada nos tecidos periféricos em condições inflamatórias agudas.

Além disso, poucos estudos associaram o uso da TENS como agente não

farmacológico para reduzir o edema inflamatório.23 No presente estudo, foi

investigado o mecanismo analgésico da TENS de BF e de AF na hiperalgesia e

edema induzidos por serotonina administrada perifericamente. Investigação do

tempo de efeito da TENS, no pico de hiperalgesia da serotonina injetada

perifericamente, também foi conduzida.

48

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais

Foram utilizados ratos Holtzman machos com peso entre 280 e 310 gramas para os

experimentos no teste algesimétrico de Hargreaves (1988)6 e 160 a 200g para

experimentos no instrumento hidropletismômetro. Os animais foram fornecidos pelo

CEBIO – Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. Os

experimentos foram realizados em grupos de 4 a 10 animais, perfazendo um total de

161 animais utilizados em todo o estudo. O desenho experimental foi previamente

aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG - CETEA

(Parecer n° 237/08).

Ambientalização dos animais

Os animais permaneceram no biotério em caixas de plástico (seis por gaiola) com

forração de maravalha com livre acesso à água e comida. No dia anterior aos

experimentos, os animais foram privados de alimento e levados para a sala de

experimento, com ciclo claro-escuro de 12 horas e temperatura controlada (22 a

24°C). Foi realizada a adaptação ao aparelho algesí metro por 30 minutos, para que

os animais se habituassem às caixas de teste, à manipulação imposta pelo

pesquisador e aos procedimentos de teste.22,25

Substâncias utilizadas

As substâncias utilizadas neste estudo foram: serotonina (Serotonin, Sigma®, E.U.A),

maleato de metisergida (Methysergide maleate, Sigma®, E.U.A), pizotifeno (Pizotifen,

49

Sandoz®, Brasil), cloridrato de ondansetrona (Ondansetron, Glaxo®, Brasil),

naltrexona (Naltrexone hydrochloride, Sigma®, E.U.A) e solução salina fisiológica

estéril (NaCl 0,9%).

Administração das substâncias

Todas as substâncias foram preparadas em solução salina estéril momentos antes

do experimento. Elas foram administradas após as medidas do limiar de retirada ou

do volume da pata no baseline. Para indução da nocicepção um volume de 0,1 ml de

serotonina (10µg) por via intradérmica (i.d.), foi administrada na pata direita. A pata

contralateral desses animais não recebeu nenhuma substância. A injeção

intradérmica de serotonina (10µg) também foi utilizada para induzir edema e o

mesmo volume final (0,1ml) foi administrado na pata direita dos animais; já a pata

contralateral recebeu igual volume de salina. Injeção subcutânea (s.c.) dos

antagonistas de serotonina - pizotifeno (2 mg/Kg), metisergida (2 mg/Kg) e

ondansetrona (2 mg/Kg) ou salina (0,1 ml) foram administradas no dorso dos

animais próximo à região cervical. Naltrexona (50µg/0,1ml) ou salina (0,1ml) foram

injetadas na pata direita por via intraplantar (i.pl.), sendo que nenhuma substância foi

administrada na pata contralateral durante esses experimentos.

Teste nociceptivo – Algesímetro

Para a medida do tempo de latência de retirada da pata, foi utilizado o aparelho

Plantar test da Ugo Basile® (modelo 7370, Itália), que permite o registro de medidas

de hiperalgesia ao calor na pata de ratos, descrito originalmente por Hargreaves, K.

(1988).6 Para o teste, o animal foi colocado em compartimento de acrílico individual

50

(18 cm x 29 cm x 12.5 cm), posicionado sobre uma superfície de vidro especial, que

permitiu a passagem de forma homogênea da luz e do calor. Foi realizado um

período de ambientalização (± 5 minutos). Após esse tempo, a fonte de luz

infravermelha foi colocada sob cada uma das patas traseiras do animal. Um tempo

máximo de 30 segundos de aplicação foi utilizado como tempo de corte para impedir

dano tecidual. Duas medidas de cada pata foram obtidas. A média das duas

medidas foi utilizada para calcular o delta (∆) da latência de retirada da pata, obtido

através da diferença entre a pata direita (inflamada) e a pata esquerda (controle), em

segundos. Todas as medidas foram realizadas pelo mesmo avaliador e no mesmo

período do dia. As aferições foram realizadas no tempo zero e após 5, 15, 30, 60 e

120 minutos da administração de serotonina intradérmica na região plantar.

Avaliação do edema inflamatório – Hidropletismômetr o

Para aferir o aumento de volume das patas traseiras causado pela serotonina, foi

utilizado um hidropletismômetro da Ugo Basile® (modelo 1750, Itália). O cálculo do

edema da pata foi obtido através dos valores de variação entre o volume da pata

inflamada (direita) e o volume da pata contralateral (esquerda) (∆, em ml) nos

mesmos tempos utilizados para medida do limiar nociceptivo, isto é, tempo zero e

após 5, 15, 30, 60 e 120 minutos do estímulo pró-inflamatório. As medidas foram

realizadas por um mesmo examinador, previamente treinado, e os valores expressos

como média ± EPM, por grupo, da diferença do volume (ml) entre as patas traseiras,

em cada tempo.

51

Aparelho de Estimulação Elétrica Nervosa Transcutân ea (TENS)

O aparelho de TENS utilizado para induzir antinocicepção foi o Neurodyn

III/Ibramed®. O aparelho foi devidamente calibrado e os parâmetros de estimulação

administrados foram: baixa (BF: 10 Hz) e alta frequência (AF: 130 Hz), com duração

de pulso de 130 µs e tempo de aplicação de 20 minutos. O limite de intensidade

sensorial foi considerado imediatamente abaixo do limiar motor. Eletrodos com 1 cm²

foram especialmente construídos para os experimentos e fixados na face plantar e

dorsal da pata posterior direita do animal com fita adesiva. A fim de evitar que eles

provocassem algum dano aos eletrodos, confeccionou-se, em cartolina, um colar

Elizabetano, que foi preso por fita adesiva ao redor da cabeça dos animais.

Protocolo experimental

Para a escolha da dose de serotonina a ser utilizada no estudo, diferentes doses

dessa substância (0,1; 1,0 e 10 µg)19 foram administradas em grupos distintos de

animais na pata traseira direita. Em seguida, outro estudo foi realizado com a

administração por via subcutânea no dorso dos animais dos antagonistas

metisergida,5,41 ondansetrona e pizotifeno5 meia hora antes da administração de

serotonina (10µg/0,1ml i.d). Para verificar o efeito da TENS de BF e de AF na

hiperalgesia e edema provocados pela serotonina, a estimulação elétrica de baixa e

alta frequência foi aplicada na pata direita 30 minutos antes dos animais receberem

a injeção de serotonina intradérmica na região plantar (10µg/100µl). Foi realizado um

experimento como controle com a TENS desligada para avaliar o nível de analgesia

provocado pela manipulação dos animais. Em um outro experimento, naltrexona (50

µg/100µl)24, um antagonista opióide, foi administrado por via intraplantar 30 minutos

52

antes da aplicação da TENS de BF. Para verificar duração do tempo de efeito da

TENS, outro experimento foi conduzido. Grupos com 4 animais cada receberam

injeção intradérmica plantar de serotonina (10µg) nos diferentes tempos após

aplicação da TENS de BF. As medidas do tempo de retirada da pata foram

realizadas no Hargreaves, sempre 5 minutos após a injeção de 10 µg de 5-HT, aos

10 ou 30 ou 60 ou 120 minutos após a aplicação da TENS na pata direita.

Análise estatística

A preparação do banco de dados, assim como a análise estatística, foram

realizadas por meio do programa GraphPad Prism 4.00, instalado em ambiente

Windows®.

Os resultados estão representados como a média ± erro padrão da média. As

comparações estatísticas das diferenças entre os grupos nos diversos tempos de

medidas foram feitas utilizando-se análise de variância (One-way ANOVA), com

correção post hoc pelo teste de Bonferroni. Para os experimentos com apenas dois

grupos, foi utilizado para verificar diferenças entre dois grupos nos diversos tempos

a Two-way ANOVA. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente

significativo.

53

RESULTADOS

Nocicepção induzida por serotonina

Conforme mostrado na FIG. 1A, a injeção intradérmica (i.d.) de 5-HT (0,1; 1,0 e 10

µg), na pata traseira de ratos, provocou uma diminuição na latência de retirada da

pata nas três doses empregadas quando comparadas com o controle (salina). O

efeito e duração máximos da 5-HT ocorreram aos 5 e 30 minutos, respectivamente,

com a maior dose utilizada de 5-HT.

Edema induzido por serotonina

De acordo com a FIG. 1B, a injeção intraplantar de 5-HT (0,1; 1,0 e 10 µg), na

pata traseira de ratos, provocou um aumento no volume da pata nas três doses

empregadas quando comparadas com o controle (salina). A maior dose utilizada (10

µg) foi a dose de escolha

Administração de antagonistas da 5-HT na nocicepção e edema

Para identificar os principais receptores envolvidos, nos efeitos nociceptivo e

edematogênico da 5-HT, antagonistas específicos de receptores da 5-HT foram

administrados. As FIG. 2A e 2B mostraram que, nos animais pré-tratados com

pizotifeno e metisergida, respectivamente, ocorreu um completo bloqueio do efeito

nociceptivo e do edema induzidos pela maior dose de serotonina utilizada (10µg). Já

o pré-tratamento com ondansetrona não alterou os efeitos nociceptivo e

edematogênico induzidos pela 5-HT.

54

Efeito da aplicação da TENS de baixa (BF) e alta fr equência (AF) na nocicepção

e edema provocados por serotonina

O pré-tratamento do animal com a TENS de BF reverteu completamente o efeito

nociceptivo provocado pela injeção local de serotonina quando comparado ao

controle (FIG. 3A). Já na FIG. 3B, podemos observar que a TENS de AF não

reverteu o efeito da 5-HT. Entretanto, nem a TENS de BF nem a de AF modificaram

a resposta de edema provocado pela serotonina, quando comparadas ao controle,

conforme mostrado na FIG. 3C.

Efeito da naltrexona na antinocicepção induzida pel a TENS de baixa frequência

no modelo de administração periférica da serotonina

Como o tratamento com a TENS foi efetivo apenas quando a baixa frequência foi

utilizada, procuraram-se verificar possíveis mecanismos endógenos envolvidos.

Conforme mostrado na FIG. 4, o pré-tratamento com naltrexona, um antagonista

opióide, reverteu o efeito analgésico da TENS de BF na hiperalgesia da serotonina.

Tempo de duração do efeito analgésico da TENS de BF

Para verificar a duração do efeito antinociceptivo da TENS de BF, variou-se o

período após o término de aplicação da mesma antes da administração da

serotonina. A TENS de BF mostrou-se eficaz em inibir o efeito da serotonina por até

30 minutos após o término de sua aplicação (FIG. 5).

55

DISCUSSÃO

Nossos dados confirmam estudos prévios sobre o efeito hiperalgésico da serotonina

em tecidos periféricos.17,36 Inclusive, a injeção de 5-HT por via intradérmica plantar

provocou nocicepção térmica dose-dependente, resultado que está de acordo com

dados de Oliveira et al. (2007)19, que verificaram nocicepção mecânica induzida pela

5-HT na pata de ratos. De forma semelhante a 5-HT administrada intraplantarmente

induziu edema dose-dependente, resultado que concorda com os obtidos por Sufka

et al., (1991)36.

Os efeitos dos antagonistas de receptor 5-HT na resposta de retirada ao estímulo

térmico e no edema foram analisados utilizando-se injeção intradérmica plantar de

serotonina. Como mostrado nas FIG. 2A e 2B, a metisergida, um antagonista de

receptores 5-HT2/5-HT1, e o pizotifeno, antagonista 5-HT2,3,8,35,36 foram capazes de

antagonizar o efeito nociceptivo e edematogênico da serotonina. Já a ondansetrona,

antagonista 5-HT3,8,26,36 não inibiu os efeitos da 5-HT. Embora estudos tenham

demonstrado a participação de receptores 5-HT1, 5HT2 e 5-HT3 no efeito

hiperalgésico da serotonina na periferia.17,36,37,42 , nossos resultados confirmam os

obtidos por Tokunaga et al. (1998),39 nos quais a administração de antagonista de 5-

HT2, mas não de 5-HT3, antagonizou a hiperalgesia induzida pela injeção de 5-HT. A

variação encontrada na ativação de receptores 5 HT3 pode ser devido a diferenças

de métodos de avaliação, espécies de animais e doses das drogas utilizadas nos

diferentes estudos. Entretanto, outros estudos sugerem o não envolvimento do

receptor 5-HT3 no edema obtido pela 5-HT.5,11,20,42 . Tal achado foi confirmado neste

estudo, uma vez que a ondansetrona falhou em suprimir o edema induzido pela 5-

HT. Por outro lado, o receptor 5-HT2 parece ser o principal responsável por tal

56

efeito,11,20 o que está de acordo com os nossos dados, pois a metisergida e

pizotifeno inibiram em quase 100% a formação de edema pela serotonina na pata

dos ratos.

A utilização da TENS como coadjuvante eficaz no tratamento de condições

inflamatórias agudas e crônicas ainda não está totalmente confirmada. Nossos

resultados demonstraram uma completa inibição do efeito nociceptivo da serotonina

administrada perifericamente pela TENS de BF (10 Hz), mas não pela de AF (130

Hz). No entanto, nenhuma das duas frequências foi capaz de inibir o edema induzido

pela 5-HT, confirmando achados prévios de nosso laboratório.23 nos quais não foi

encontrada atividade antiedematogênica da TENS em modelo de inflamação

induzido por carragenina. A sequência de mecanismos pelos quais a 5-HT influencia

a inflamação e a nocicepção não é clara. Os diversos tipos de receptores podem

diferentemente mediar as ações inflamatórias e nociceptivas da serotonina nos

tecidos periféricos.36

É descrito na literatura que a TENS utiliza diferentes mecanismos para exercer seu

efeito analgésico.22,25,28 e que a analgesia da TENS de BF e de AF envolvem a

liberação endógena de opióides,9,12 sendo a analgesia da TENS de BF, mas não da

AF, revertida por uma baixa dose de naloxona23, um antagonista opioide

específico.4 Além disso, em estudo prévio realizado por Rodrigues et al. (2000),24 foi

demonstrado que a dose de 50 µg de naltrexona, administrada na pata do rato,

antagonizou o efeito antinociceptivo induzido pela morfina, no local da lesão, quando

administrado ipsilateralmente, mas não contralateralmente, confirmando sua ação

em receptores opióides locais. A partir dessas informações, um experimento foi

conduzido para verificar a ação analgésica periférica da TENS. Conforme foi

57

verificado, o pré-tratamento com a TENS de BF provavelmente resultou na liberação

local de opióides e impediu o efeito nociceptivo induzido pela posterior administração

de 5-HT. É possível que os agonistas de receptores µ opióides ajam por inibir a

ativação da adenilato ciclase por mediadores inflamatórios, tais como a serotonina e

prostaglandina E2 em neurônios aferentes periféricos, enquanto os agonistas de

receptor δ e κ opióides inibem a secreção de substâncias pró-inflamatorias por

neurônios eferentes simpáticos.7

Alguns estudos mostraram que os opióides podem produzir potente analgesia por

ativação de receptores em neurônios sensoriais periféricos.18,32,33 Esses receptores

opióides estão localizados em neurônios sensoriais na periferia e centralmente33, em

animais33,34 e humanos.16 A ativação desses receptores por opióides pode inibir os

canais iônicos excitatórios como TRPV1, canais de Ca2+ e também a liberação de

neuropeptídeos pró-inflamatórios como substância P e peptídeo relacionado ao gene

da calcitonina (CGRP), das terminações nervosas sensoriais periféricas, resultando

em efeito antinociceptivo.33 A administração de 50 µg de naltrexona por via

intraplantar, 30 minutos antes da TENS de BF, reverteu o efeito analgésico da TENS

no modelo de nocicepção da serotonina.

Os dados desta pesquisa estão de acordo com os obtidos por Sabino et al. (2008),25

que sugeriram a participação opióide local na analgesia da TENS de BF no modelo

da carragenina. De acordo com Stein (1993)32, os agonistas µ opióides são mais

potentes que os agonistas δ e κ em induzir efeito antinociceptivo periférico. Um

estudo recente descreveu a presença de β-endorfina imunoreativa em queratinócitos

na pele de ratos.10 A liberação de β-endorfina pelos queratinócitos produziu

antinocicepção por agir nos receptores µ opióides nos neurônios aferentes

58

primários.10 Alterações nas membranas dos queratinócitos pela aplicação da TENS

de BF podem induzir à liberação de β-endorfina e contribuir para o efeito anti-

hiperalgesico.25 Estudos imunohistoquímicos posteriores são necessários para

investigar essa contribuição.

O tempo de analgesia obtido com a TENS de BF, aplicada anteriormente à

administração da serotonina, foi de 30 minutos. No estudo de Resende et al.

(2004)23, a TENS foi aplicada após a carragenina, obtendo uma analgesia de uma

hora e 30 minutos. Essa diferença na duração da analgesia provavelmente se deu

pela diferença no momento de aplicação da TENS, indicando que a analgesia obtida

com a aplicação da TENS após a instalação do processo inflamatório torna-se mais

duradoura. É provável que, após a indução da inflamação periférica, o transporte

axonal de receptores opióides para as terminações nervosas sensitivas seja

intensificado.14 Células imunes presentes no tecido inflamado ou que migram até o

local da lesão como granulócitos, monócitos/macrófagos e linfócitos de roedores e

humanos são também uma fonte de peptídeos opióides, que podem induzir

analgesia no tecido lesado.31 Esses fatores podem ter contribuído para uma

analgesia mais duradoura quando a TENS foi aplicada após a indução da

inflamação pela carragenina do que pela serotonina na pata do rato.23

Uma limitação deste estudo foi provavelmente a indução de algum estresse

provocado pela manipulação dos animais, uma vez que os experimentos foram

conduzidos com os animais acordados. No entanto, para controlar a interferência do

estresse nos resultados, um grupo controle de animais foi exposto a todas as

manipulações, bem como ao TENS desligado. Além disso, algumas pequenas

diferenças no índice da latência de retirada da pata foram encontradas em alguns

59

experimentos, o que se justifica pelas diferentes épocas do ano em que os

experimentos foram conduzidos, mesmo com temperatura ambiente e outros

parâmetros do estudo mantidos constantes.

Uma vez que a TENS de BF inibiu a nocicepção induzida pela serotonina através de

seu efeito analgésico local, clinicamente ela pode ser útil para estimular mecanismos

analgésicos de ação local, atuando de forma periférica e central no controle da dor

aguda e/ou crônica. Mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos

de ação analgésica da TENS e fundamentar seu uso como uma opção de

tratamento não invasivo e não farmacológico da dor, resguardando o paciente dos

efeitos colaterais advindos do uso frequente de drogas analgésicas.

60

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64

A-

-60 -30

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

5-HT 1,0µg n = 5

5-HT 10,0µg n = 5

SAL n = 5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

5-HT 0,1µg n = 5

Tempo (min)

*

*

*

*

*

60 90 120

5-HT

∆∆ ∆∆ L

atên

cia

de r

etir

ada

da p

ata

(seg

)

FIGURA 1

65

B-

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 550.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00 SAL n = 50.1mg 5-HT n = 51.0mg 5-HT n = 510.0mg 5-HT n = 5

60 90 120

**

*

**

*

**

5-HT

Time (min)

∆∆ ∆∆ H

ind

paw

vol

ume

(ml)

FIGURA 1

66

A-

-60 -30

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

SAL + 5HT n = 10

PIZO + 5HT n = 5

METIS + 5HT n = 5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

ONDA + 5HT n = 5

SAL + SAL n = 4

***

60 90 120

PIZOONDAMETIS

5-HT

Tempo (min)

∆∆ ∆∆ L

atên

cia

de r

etir

ada

da p

ata

(seg

)

FIGURA 2

67

B-

-60 -30

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

SAL + 5-HT n = 7PIZO + 5-HT n = 5

METIS + 5-HT n = 5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

ONDA + 5-HT n = 5

** * **

60 90 120

PIZOMETISONDA

5-HT

Tempo (min)

∆∆ ∆∆ v

olum

e da

s pa

tas

tras

eira

s (m

l)

FIGURA 2

68

A-

-60 -30

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

TENS de BF + 5-HT n = 8TENS de BF + SAL n = 6TENS desligado + 5-HT n = 10

0 5 10 15 20 25 30 35

**

*

*

40 50 60 70

TENS 5-HT

Tempo ( min)

∆∆ ∆∆ L

aten

cia

de r

etir

ada

da p

ata

(seg

)

FIGURA 3

69

B-

-60 -30

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

TENS de AF +5-HT n = 8TENS de AF + SAL n = 8TENS desligado + 5-HT n = 10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 50 60 70

TENS 5-HT

Tempo (min)

∆∆ ∆∆ L

atên

cia

de r

etir

ada

da p

ata

(seg

)

FIGURA 3

70

C-

-60 -30

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

TENS desligado + 5-HT n = 10

TENS de BF + 5-HT n = 8TENS de AF + 5-HT n = 8

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

5-HT

60 90 120

TENS

Tempo (min)

∆∆ ∆∆

volu

me

das

pata

s tr

asei

ras

(ml)

FIGURA 3

71

-60 -30

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

SAL + TENS de BF + 5-HT n = 6

Nx + TENS de BF + 5-HT n = 6

0 5 10 15 20 25 30 35

*

*

**

40 50 60 70

Nx TENS 5-HT

Tempo (min)

∆∆ ∆∆ L

atên

cia

de r

etir

ada

da p

ata

(seg

)

FIGURA 4

72

-30 -20 -10

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6 TENS de BF + 5-HT n = 4

TENS desligado + 5-HT n = 4

0 10 20 30 40 50

*

*

TENS Tempo após retirada da TENS (mi n)

60 90 120

5-HT 5-HT 5-HT 5-HT

∆∆ ∆∆ L

atên

cia

de r

etir

ada

da p

ata

(seg

)

FIGURA 5

73

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1A- Efeito dose-dependente de 5-HT na latência de retir ada da pata

seguido a um estímulo térmico. A serotonina (5-HT) foi diluída em salina e injetada

intradermicamente na superfície plantar da pata traseira direita dos animais, sendo

que a pata contralateral não foi tratada. Um volume final de 0,1ml foi administrado.

Cada ponto indica média ± EPM de 5 animais/grupo * indica uma diferença

estatisticamente significativa (p < 0,05).

Figura 1A- Edema dose-dependente de 5-HT intraplantar. Administração

intraplantar de serotonina (5-HT) foi realizada na superfície plantar da pata traseira

direita dos animais, sendo que a pata contralateral foi tratada com o mesmo volume

de salina. Um volume final de 0,1ml foi administrado. Cada ponto indica média ±

EPM de 5 animais/grupo * indica uma diferença estatisticamente significativa (p <

0,05).

Figura 2 – Efeito dos antagonistas de receptores 5-HT, pizotif eno, metisergida,

ondansetrona, na latência de retirada da pata (2A) e no edema (2B) induzidos

por serotonina. Os antagonistas de receptores 5-HT ou salina foram administrados

por injeção subcutânea (s.c.), no dorso dos animais, meia hora antes da

administração intradérmica (i.d.) de serotonina.

A 5-HT (10µg/0,1ml) ou a salina (0,1ml) foram injetadas intradermicamente na

superfície plantar da pata traseira direita dos animais no tempo zero. Todas as

substâncias foram diluídas em salina. As patas contralaterais não foram tratadas na

nocicepção, nem nos experimentos de edema. Cada ponto indica média ± EPM de 4

a 10 animais/grupo. * indica uma diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).

74

Figura 3 – Efeitos da TENS de BF e de AF na nocicep ção (A e B) e no edema

(C) induzidos por 5-HT.

A TENS de BF (10 Hz) foi aplicada, na pata traseira direita dos animais, meia hora

antes da injeção intradérmica de 5-HT, por um período de 20 minutos. A pata

contralateral não foi tratada (na nocicepção).

A serotonina foi diluída em salina e administrada em um volume total de 0,1 ml.

Cada ponto indica média ± EPM de 6 a 12 animais/grupo. * indica uma diferença

estatisticamente significativa (p < 0,05).

Figura 4 – Efeito da naltrexona na antinocicepção i nduzida pela TENS de BF.

Naltrexona (50µg/0,1ml) ou a salina (0,1 ml) foram administradas 30 minutos antes

da aplicação da TENS de BF, por injeção intraplantar na pata direita traseira dos

animais. A TENS de BF foi aplicada por 20 minutos e a serotonina, injetada no

tempo zero (30 minutos após início da aplicação da TENS). A pata contralateral não

recebeu tratamento. Cada ponto indica média ± EPM de 6 animais/grupo. * indica

uma diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).

Figura 5 - Duração do efeito analgésico da TENS de BF. Grupos com 4 animais

cada receberam injeção intradérmica plantar de serotonina (10µg) nos

diferentes tempos após aplicação da TENS de BF. As medidas da latência de

retirada da pata foram realizadas sempre 5 minutos após a injeção de 5-HT,

nos tempos indicados após a aplicação da TENS na pata direita. A pata

contralateral não recebeu tratamento. * indica uma diferença estatisticamente

significativa (p < 0,05).

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Capítulo 5- CONSIDERAÇÕES FINAIS

A TENS é um recurso não farmacológico, não invasivo, sem efeitos colaterais,

com poucas contra-indicações e comum na prática clínica do fisioterapeuta.

Clinicamente a TENS é raramente administrada de forma isolada. Combinações de

tratamentos farmacológicos e não-farmacológicos para controle da dor são

freqüentes. O entendimento do mecanismo de ação deste recurso permite aos

profissionais que o utilizam serem capazes de intensificar os efeitos de diversos

tipos de analgésicos e reduzir os efeitos colaterais dos agentes farmacológicos

produzindo um melhor alívio da dor.

Nossos resultados demonstraram uma completa inibição do efeito nociceptivo

da serotonina pela TENS de baixa (10 Hz), mas não pela de alta (130 Hz)

frequência. No entanto, nenhuma das duas freqüências foi capaz de inibir o edema

induzido pela 5-HT, sugerindo que a TENS apresenta eficácia decorrente de ação

analgésica e não anti-inflamatória. Nossos dados sugerem a participação opióide

local na analgesia da TENS de BF também em modelo de nocicepção induzido por

serotonina.

Uma vez que a TENS de BF inibe a nocicepção induzida por serotonina

através de seu efeito analgésico local, clinicamente ela pode ser utilizada para tratar

dor de origem periférica de forma mais eficaz.

Finalmente, esperamos que o nosso estudo tenha contribuído para uma maior

compreensão dos mecanismos analgésicos da TENS e assim tornar fundamentado

seu uso no tratamento da dor inflamatória aguda e crônica.

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ANEXO 1: Aprovação do estudo pelo Comitê de Ética e m Experimentação Animal da UFMG