Estudo da Hemocompatibilidade de Conjugados dos ...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUBÁ – UNIFEI

INSTITUTO DE FÍSICA E QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MATERIAIS PARA

ENGENHARIA

GILZA CARLA RIBEIRO

Estudo da Hemocompatibilidade de Conjugados dos

Dendrímeros de Poliglicerol com Fármacos para

Tratamento da Artrite Reumatoide

Itajubá/MG

2016

14

GILZA CARLA RIBEIRO




Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação

em Materiais para Engenharia como parte dos

requisitos para a obtenção do título de Mestre em

Ciências em Engenharia de Materiais.

Área de Concentração: Não-Metais

Orientadora: Profa. Dr

a. Daniela Sachs

Co-orientador: Prof. Dr. Alvaro Antonio Alencar de

Queiroz

Itajubá/MG

2016




ENGENHARIA

14




ENGENHARIA

Gilza Carla Ribeiro




Dissertação aprovada por banca examinadora em 24

de Junho de 2016, conferindo a Gilza Carla Ribeiro o

título de Mestre em Ciências em Engenharia de

Materiais.

Itajubá/MG

2016

Banca Examinadora:

Profª. Drª. Daniela Sachs (UNIFEI)

Prof. Dr. Maurício Frota Saraiva (UNIFEI)

Prof. Dr. Nilo Cesar do Vale Baracho (FMIt)

javascript:abreDetalhe('K4798137A4','Nilo_Cesar_do_Vale_Baracho',7535486)

À minha família por sua

fortaleza e coragem, e

por ser sempre meu

alicerce, dedico...

Agradecimentos

Agradeço em primeiro lugar a Deus e a Nossa Senhora Aparecida pela conquista de

mais uma etapa e por todas as realizações que Eles me permitem.

À Professora Doutora Daniela Sachs, não só pela orientação e grande ajuda técnica para

conclusão deste trabalho, mas por todo carinho, paciência e compreensão dedicados

durante esse tempo. “Muito obrigada por sempre me incentivar a seguir em frente...”.

Ao Professor Doutor Álvaro Antônio Alencar de Queiroz pela atenção, orientação e por

compartilhar seus conhecimentos, que me proporcionaram crescimento científico e

pessoal.

À Amanda por todo apoio, amizade, ajuda e incentivo.

Amigo a gente não faz... Reconhece-se... (Vinícius de Moraes)

Aos amigos do Labclin pela grande ajuda técnica, pelas conversas divertidas e

encorajadoras, por compartilharem suas experiências e acreditarem em mim, me

incentivando sempre.

À Secretaria de Saúde de Piranguinho, em especial minhas grandes amigas Ana Maria,

Eliana, Marilei e Cecília por torcerem por mim e sempre me apoiarem.

Ao povo de Piranguinho, que diariamente me ensina a ser uma pessoa melhor.

Agradeço aos meus pais Maria e Alcides pelo bom exemplo, apoio, compreensão, pela

ajuda e incentivo incondicional que sempre me deram.

Ao meu esposo Joeber pelo apoio e por compreender meus momentos de ausência.

Ao meu filho Vinícius, razão do meu viver.

E a todos que de alguma forma, contribuíram para tornar este trabalho uma realidade.

“Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, que já tem a forma do

nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos mesmos

lugares. É o tempo da travessia: e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para

sempre, à margem de nós mesmos.”

Fernando Pessoa

http://pensador.uol.com.br/autor/fernando_pessoa/

Resumo

A artrite reumatoide (AR) é uma doença crônica autoimune que leva à deformidade e

destruição das articulações por erosão óssea e da cartilagem. De acordo com o último

Consenso da Sociedade Brasileira de Reumatologia para o tratamento da AR, em 2012,

as terapias medicamentosas incluem o uso de anti-inflamatórios não hormonais

(AINHs), corticoides, medicamentos modificadores do curso da doença (MMCD)

sintéticos e biológicos. O tratamento medicamentoso prolongado da AR com AINH,

corticoides e MMCD sintéticos, como o meloxican, prednisona e metotrexato, causam

diferentes e variados efeitos adversos aos pacientes com AR. A nanomedicina, um ramo

da nanotecnologia, se refere à intervenção médica em escala nanométrica que é

altamente específica para o tratamento de doenças ou reparo de tecidos danificados. A

síntese de nanopartículas dendríticas de poliglicerol (PGLD), embora recente, tem

várias aplicações na medicina, em especial para a produção de sistemas carreadores de

fármacos. De fato, o encapsulamento ou associação aos fármacos com PGLD resulta na

diminuição da toxicidade, das interações medicamentosas e maior tempo de

permanência do fármaco na circulação. Apesar de décadas de pesquisas farmacêuticas e

clínicas, ainda há muitas necessidades não contempladas no tratamento da AR. Dessa

forma, a utilização de dendrímeros do tipo gliceróis densamente ramificados com

propriedades biocompatíveis, pode ser uma alternativa promissora para a obtenção de

carreadores dos fármacos (meloxicam, prednisona e metotrexato) para o tratamento

sistêmico ou intra-articular da AR. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo

avaliar a hemocompatibilidade de diferentes nanofármacos com estrutura dendrítica

para o tratamento da artrite reumatoide. Para tanto, foram utilizadas técnicas físico-

químicas para a caracterização dos conjugados PGLD-prednisona, PGLD-meloxicam e

PGLD-metotrexato. Para avaliar a Hemocompatibilidade foram utilizados os testes de

tempo de protrombina (TP), tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), teste de

adesão plaquetária e o ensaio de hemólise dos fármacos puros, do PGLD isolado e dos

conjugados PGLD-prednisona, PGLD-meloxicam e PGLD-metotrexato. Em suma, os

dados obtidos utilizando as técnicas físico-químicas nos permitem sugerir que ocorreu a

conjugação dos fármacos estudados com os dendrímeros de poliglicerol de segunda

geração (G2) e quarta geração (G4). Os testes de hemocompatibilidade mostraram que

os fármacos puros, dendrímeros puros e os fármacos conjugados aos dendrímeros são

hemocompatíveis indicando que estes nanofármacos são promissores para o tratamento

da AR.

Palavras-chave: Hemocompatibilidade, artrite reumatoide, meloxican, prednisona,

metotrexato e dendrímeros de poliglicerol.

Abstract

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune disease that leads to deformity and

destruction of joints in bone and cartilage erosion. According to the latest Consensus of

the Brazilian Society of Rheumatology for the treatment of RA in 2012, drug therapies

include the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), corticosteroids,

modifying drugs in the disease course (MMCD) synthetic and biological. Prolonged

drug treatment of RA with NSAIDs, corticosteroids and synthetic MMCD as

meloxicam, prednisone and methotrexate, cause different and varied adverse effects to

patients with RA. Nanomedicine, a nanotechnology industry, medical intervention

refers to the nanoscale is highly specific for the treatment of diseases or repair damaged

tissues. The synthesis of dendritic nanoparticles polyglycerol (PGLD), although

recently it has several applications in medicine, in particular for the production of drug

carrier systems. In fact, encapsulation or association with dru gs with PGLD results in

decreased toxicity, drug interactions and longer stay of the drug in circulation. Despite

decades of pharmaceutical and clinical research, there are still many needs not included

in the treatment of RA. Thus, the use of dendrimers of glycerols with densely branched

type biocompatible properties, may be a promising alternative to obtain carriers of drugs

(meloxicam, methotrexate and prednisone) for systemic or intraarticular treatment of

RA. Therefore, this study aims to evaluate the hemocompatibility of different

nanofármacos with dendritic structure for the treatment of rheumatoid arthritis.

Therefore, we used physico-chemical techniques for the characterization of conjugated

PGLD-prednisone, PGLD-meloxicam and PGLD methotrexate. To evaluate the

hemocompatibility were used for prothrombin time tests (PT), activated partial

thromboplastin time (APTT), platelet adhesion test and the hemolysis assay of pure

drugs isolated and conjugates PGLD-PGLD prednisone, PGLD- PGLD meloxicam and

methotrexate. In short, the data obtained using the physico-chemical techniques allow

us to suggest that the combination of drugs was studied dendrimers polyglycerol second

generation (G2) and fourth generation (G4). hemocompatibility tests showed that the

pure drug and pure dendrimers and dendrimers are conjugated to drugs

hemocompatíveis indicating that these are promising nanofarmacos for the treatment of

RA.

Keywords: hemocompatibility, rheumatoid arthritis, meloxicam, prednisone,

methotrexate and polyglycerol dendrimers.

Lista de abreviaturas

ABAT: Abatacepte

ACPA: Anticorpos antiproteínas citrulinadas

ACR: American College of Rheumatology (ACR)

AINHs: Anti-inflamatórios não hormonais

Anti-CCP: Anticorpos antipeptideos citrulinados cíclicos

AR: Artrite reumatoide

COX-1: ciclooxigenase 1

COX-2: ciclooxigenase 2

DSC: Calorimetria exploratória diferencial

Eular: European League Against

FDA: Food and Drug administration

FR/ RF: fator reumatoide

FT: Fator tecidual

FTIR: Espectroscopia de absorção na região do infravermelho por transformada de

Fourier

FX: Fator X

ICAM-1: Molécula de adesão intracelular-1

Ig: Imunoglobulinas

INR: Razão normalizada internacional

IVAM-1: Molécula de adesão celular-vascular-1

MMCD: Medicamentos modificadores do curso da doença

MTX: metotrexato

PADI: Peptidilarginina deiminase

PAMANs: Poliamidoaminas

PGLD: Dendrímero de poliglicerol

RTX: rituximabe

TP: Tempo de protrombina

TGA: Análise termogravimétrica

TNF: Fator de necrose tumoral

TOCI: tocilizumabe

TTPA: Tempo de tromboplastina parcial ativada

Lista de Figuras

Capítulo 1

Figura 1.1 Articulação normal (A) e articulação com artrite reumatoide

(B)....................................................................................................................................16

Figura 1.2 Deiminação da arginina pela enzima peptidilarginina deiminase. ................17

Figura 1.3 Prevalência da artrite reumatoide na população adulta de várias regiões do

mundo. ............................................................................................................................18

Figura 1.4 Patogênese da artrite reumatoide. Os anticorpos anti fator reumatóide (FR) e

antiproteínas citrulinadas (ACPAs) são dois auto anticorpos mais importantes na

patogênese da AR. Ativação de células T resulta na produção de citocinas pró-

inflamatórias, incluindo TNF-, IL-1 e IL-6 por macrófagos. Estas citocinas pró-

inflamatórias tem a capacidade de ativar o ligante do receptor ativador do fator nuclear

(RANKL), que é o principal regulador da osteoclastogênese. A produção de fator de

crescimento endotelial vascular (VEGF) por fibroblastos sinoviais também estimula a

angiogênese que por sua vez mantém o processo inflamatório através do recrutamento

de leucócitos. Todos estes componentes tem um papel importante no progresso

inflamatório na degradação da cartilagem e no processo de destruição de óssea...........22

Figura 1.5 Fluxograma para a primeira linha do tratamento medicamentoso da artrite

reumatoide: AINH: anti-inflamatório não hormonal; MMCD: Medicamentos

modificadores do curso da doença; MTX: metotrexato. ................................................24

Figura 1.6 Fluxograma para o tratamento medicamentoso da artrite reumatoide com

MMCD biológicos. ABAT: abatacepte; MMCD: medicamento modificador do curso da

doença; MTX: metotrexato; RTX: rituximabe; TOCI:tocilizumabe. .............................29

Figura 1.7 Nanopartículas (NP) para tratamento da artrite reumatoide. Diferentes tipos

de nanopartículas tem sido utilizados para o tratamento RA. Fármacos e fragmentos de

RNA são transportados por nanopartículas e impedem a expressão de citocinas pró-

inflamatórias e como consequência ocorre a inibição do processo inflamatório e da

degeneração da cartilagem articular................................................................................32

Figura 1.8 Dendrímeros disponíveis comercialmente. (A) Dendrímero de Polipropileno

imina (G5) e (B) dendrímero de poliamido amina (G3). Cada geração é marcada com

um círculo........................................................................................................................33

Figura 1.9 Síntese dendrímero (esquematicamente representado). (A) Estratégia

divergente e (B) estratégia convergente. ........................................................................34

Figura 1.10 Propriedades dos grupos internos e externos do dendrímero utilizado como

sistema de liberação/transporte de fármacos...................................................................35

Figura 1.11. Esquema da cascata da coagulação com a divisão do sistema de coagulação

em duas vias. CAPM: cininogênio de alto peso molecular; PK: pré-calicreína..............39

Capítulo 3

Figura 3.1 Espectro do FTIR dos dendrímeros G2 e G4. ...............................................49

Figura 3.2 Estrutura química da prednisona ...................................................................50

Figura 3.3 Espectro do FTIR de Prednisona ...................................................................51

Figura 3.4 Estrutura química do meloxicam ..................................................................51

Figura 3.5 Espectro do FTIR do Meloxicam ..................................................................52

Figura 3.6 Estrutura química do metotrexato .................................................................52

Figura 3.7 Espectro do FTIR de Metotrexato .................................................................53

Figura 3.8 Espectro do FTIR de prednisona associado ao dendrímero G2 ....................54

Figura 3.9 Espectro do FTIR da meloxicam associado ao dendrímero G2 ....................55

Figura 3.10 Espectro do FTIR do metotrexato associado ao dendrímero G2 ................56

Figura 3.11 Espectro de FTIR de prednisona associado ao dendrímero G2 ..................57

Figura 3.12 Espectro de FTIR de meloxicam associado ao dendrímero G4 ..................58

Figura 3.13 Espectro de FTIR de metotrexato associado ao dendrímero G4 .................59

Figura 3.14 Curvas termogravimétricas de G2 e G4 puros .........................................60

Figura 3.15 Curvas termogravimétricas de G2 puro, prednisona pura e prednisona

associada ao G2...............................................................................................................61

Figura 3.16 Curvas termogravimétricas de G2 puro, meloxicam puro e meloxicam

associado ao G2 ..............................................................................................................62

Figura 3.17 Curvas termogravimétricas de G2 puro, metotrexato puro e do metotrexato

associado ao G2 .......................................................................................................... 63

Figura 3.18 Curvas termogravimétricas de G4 puro, prednisona pura e a prednisona

associada ao G4. ...........................................................................................................64

Figura 3.19 Curvas termogravimétricas de G4 puro, meloxicam puro e o meloxicam

associado ao G4. ............................................................................................................65

Figura 3.20 Curvas termogravimétricas de G4 puro, metotrexato e G4 associado ao

metotrexato .....................................................................................................................66

Figura 3.21 Curvas DSC normalizadas de segundo aquecimento de G2 e G4...............67

Figura 3.22 Curvas DSC normalizadas de segundo aquecimento dos fármacos puros ..68

Figura 3.23 Curvas DSC normalizadas de segundo aquecimento dos fármacos

associados ao G2 .................................................................................................69

Figura 3.24 Curvas DSC normalizadas de segundo aquecimento dos fármacos

associados ao G4 .................................................................................................70

Figura 3.25 Gráfico do TP para os fármacos puros, G2 puro e ambos associados (A) e

gráfico do TP para fármacos puros, G4 puro e associações(B). .....................................73

Figura 3.26 Gráfico do TTPA para os fármacos puros, G2 puro e ambos associados (A)

e gráfico do TP para fármacos puros, G4 puro e associações(B). ..................................75

Figura 3.27 Gráfico das plaquetas/mm³ de sangue dos fármacos puros, G2 puro e

associações (A) e gráfico dos fármacos puros, G4 puro e suas associações (B). ...........77

Lista de Tabelas

Capítulo 1

Tabela 1.1 Frequência de auto anticorpos associados à artrite reumatoide ....................20

Capítulo 3

Tabela 3.1 Valores de INR. ............................................................................................76

Tabela 3.2 Valores de porcentagem de hemólise após exposição aos compostos

estudados ........................................................................................................................78

Lista de Quadros

Capítulo 2

Quadro 2.1 Grupos participantes dos ensaios de caracterização química e biológica ....42

Quadro 2.2 Relação entre PGLD e fármacos .................................................................43

Sumário

1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .......................................................................... 15

1.1 Artrite reumatoide ........................................................................................................... 15

1.2 Fisiopatologia da artrite reumatoide .......................................................................... 19

1.2.1 Fatores ambientais .......................................................................................... 19

1.2.2 Resposta autoimune .................................................................................. 19

1.2.3 Processo inflamatório na artrite reumatoide ............................................. 21

1.3 Tratamento da artrite reumatoide ............................................................................... 23

1.3.1 Medidas educativas ........................................................................................ 24

1.3.2 Anti-inflamatórios não hormonais (AINHs) ............................................ 25

1.3.3 Corticoides ................................................................................................ 25

1.3.4 Medicamentos modificadores do curso da doença (MMCD). ....................... 27

1.3.4.1 MMCD sintéticas: metotrexato (MTX)............................................. 27

1.3.4.2 MMCD biológicas .................................................................................. 28

1.4 Sistemas de transporte e liberação de fármacos para o tratamento da AR. ............... 30

1.4.1 Nanopartículas .......................................................................................... 30

1.5 Dendrímeros como sistemas transportadores de fármacos ............................................. 32

1.6 Hemocompatibilidade ..................................................................................................... 37

1.6.1 Efeito sobre a coagulação ......................................................................... 37

1.6.2 Ativação plaquetária ................................................................................. 37

1.6.3 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) ................................... 38

1.6.4 Tempo de protrombina (TP) ..................................................................... 38

1.6.5 Hemólise ................................................................................................... 39

1.7 Objetivo: ......................................................................................................................... 41

1.7.1 Objetivos específicos: .................................................................................... 41

2 MÉTODOS E DESCRIÇÃO DA PESQUISA ............................................................ 43

2.1 Materiais ......................................................................................................................... 43

2.2 Imobilizações da prednisona, meloxicam ou metotrexato nos dendrímeros .................. 44

2.3 Caracterização físico-química ......................................................................................... 45

2.3.1 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho por transformada de

Fourier (FTIR) ......................................................................................................... 45

2.3.2 Análise termogravimétrica (TGA) ................................................................. 45

2.3.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) .................................................. 46

2.4 Testes de hemocompatibilidade ...................................................................................... 46

2.4.1 Tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial

ativada(TTPA) ......................................................................................................... 47

2.4.2 Tempo de protrombina (TP) ........................................................................... 47

2.4.3 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) ......................................... 48

2.4.4 Adesão plaquetária ......................................................................................... 48

2.4.5 Ensaio de hemólise ......................................................................................... 49

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 51

3.1 Espectro de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) .................................. 51

3.2 Análise termogravimétrica (TGA) .................................................................................. 61

3.3 Calorimetria diferencial exploratória (DSC) .................................................................. 68

3.4 Hemocompatibilidade ..................................................................................................... 73

3.4.1 Tempo de protrombina, INR e Tempo de tromboplastina parcial ativada ............ 73

3.4.2 Adesão plaquetária ................................................................................................ 78

3.4.3 Ensaio de hemólise ......................................................................................... 80

4 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 83

4.1 Perspectivas futuras ................................................................................................... 83

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 84

14

Capítulo 1

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

15

1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

1.1 Artrite reumatoide

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune, inflamatória sistêmica,

crônica e progressiva que afeta as articulações do corpo revestidas pela membrana

sinovial e que pode levar a destruição de cartilagens e ossos (MOTA et al., 2012,

STRAND et al., 2007). Esta doença está relacionada ao desenvolvimento de

deformidades e incapacitação, gerando diminuição da qualidade de vida (VAZ et al.,

2013). A inflamação causa dor nas articulações, aumento do volume e rigidez, além de

problemas sistêmicos como cansaço e perda de peso. De fato, é a inflamação da

membrana sinovial, a sinovite, que resulta na destruição articular e que, se não tratada,

pode levar a uma lesão articular grave com a perda da capacidade funcional

(OLIVEIRA et al., 2015). A articulação normal compreende dois tipos de células,

macrófagos e sinoviócitos semelhantes aos fibroblastos. Na AR a membrana sinovial é

invadida por células T e B e células inflamatórias e como consequência os sinoviócitos

proliferam. Com a progressão da doença o tecido sinovial se torna hiperplásico

invadindo e destruindo a cartilagem articular e osso subjacente (STRAND et al., 2007,

Figura 1.1).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Strand%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17195034


16

Figura 1.1 Articulação normal (A) e articulação com artrite reumatoide (B) (fonte: adaptado de

STRAND et al., 2007).

Historicamente as doenças reumáticas são conhecidas desde a época de

Hipócrates, entretanto a AR foi primeiramente nomeada no século XVII por Garrod e

sua descrição clínica somente aconteceu em 1957, publicada por Charles Short. A AR é

considerada uma doença autoimune devido à identificação do fator reumatoide no soro

dos pacientes com AR e a posterior caracterização desse fator como anticorpo.

Atualmente o diagnóstico da AR é baseado em critérios clínicos e exames laboratoriais

(ARNETT et al., 1988). Os anticorpos antiproteínas citrulinadas (ACPA) mostram alta

especificidade para a AR. A enzima peptidilarginina deiminase (PADI) converte

arginina a citrulina. A PADI foi descrita pela primeira vez em 1977 (ROGERS et al.,

1977) e catalisa a conversão de resíduos de arginina em resíduos de citrulina nas

proteínas (Figura 1.2).


17

Figura 1.2 Deiminação da arginina pela enzima peptidilarginina deiminase (fonte: ALARCON

& ANDRADE, 2007).

O teste de ACPA tornou-se um componente substancial dos atuais critérios de

classificação para a AR do American College of Rheumatology (ACR)-European

League Against Rheumatism (Eular) (ALETAHA et al., 2010). Quando a AR se

apresenta em sua forma bem definida, o reconhecimento é simples. O diagnóstico na

fase precoce da doença, entretanto, é difícil, já que alterações sorológicas e radiológicas

características muitas vezes não estão presentes. Os exames utilizados atualmente para

diagnóstico da AR são radiologia convencional, cintilografia óssea, tomografia

computadorizada, ressonância magnética e densitometria óssea (MOTA et al., 2012).

Embora a doença possa ocorrer em qualquer idade, a AR afeta mais frequentemente as

mulheres do que os homens e é diagnosticada principalmente entre os 40 e 60 anos,

embora ainda não seja claro o mecanismo pelo qual o gênero influencie na

susceptibilidade a AR (CASTRO-SANTOS & DÍAZ-PENÃ, 2016).

Dados epidemiológicos sobre a AR mostram variações na incidência e

prevalência da doença entre as populações. A maior parte dos estudos foi feita em

países desenvolvidos do norte da Europa e da América do Norte e estimou prevalências

entre 0,5 e 1,1% (TOBON et al., 2010). Outros estudos realizados em países do sul da

Europa relataram uma prevalência menor, em torno de 0,3 a 0,7% (CARMONA et al.,

2002, GUILLEMIN et al., 2005, ANDRIANAKOS et al., 2006). Estima-se que a

prevalência da AR no Brasil seja de 0,46% da população, representando

aproximadamente um milhão de pessoas acometidas pela doença (COSTA, 2014).

18

Figura 1.3 Prevalência da artrite reumatoide na população adulta de várias regiões do mundo

(fonte: SHAPIRA et al., 2010).

A prevalência de AR na população adulta de várias regiões do mundo pode ser

verificada na figura 1.3 (adaptada de SHAPIRA et al., 2010). Na Austrália e Jamaica a

prevalência de AR é alta e na África, esta doença é rara. Dentro de várias regiões do

mundo, o risco de AR difere entre grupos étnicos distintos que residem no mesmo país,

o que pode indicar diferenças na predisposição genética para esta doença. Por exemplo,

em comparação com a etnia branca dos Estados Unidos da América tribos americanas

nativas demostram alto risco para o desenvolvimento da AR. Por outro lado, aborígines

australianos são muito mais resistentes à doença do que a população australiana de etnia

branca (SYMMONS et al., 2000; MINAUR et al., 2004; SILMAN , 1993). Estas

diferenças podem refletir a variabilidade étnica na prevalência de genes de

susceptibilidade a doença.

19

1.2 Fisiopatologia da artrite reumatoide

1.2.1 Fatores ambientais

O desenvolvimento de AR está associado a fatores ambientais que incluem o

tabagismo (KLARESKOG et al., 2008; MILLAR et al., 2013), baixos níveis

socioeconômicos e baixa escolaridade (MILLAR et al., 2013; CALLAHAN &

PINCUS, 1997). A AR também é associada à doença periodontal, embora a causalidade

e natureza dessa relação ainda não esteja bem definida (SCHER et al., 2016). Uma

hipótese proposta é que Porphyromonas gingivalis, bactéria frequentemente encontrada

na periodontite, poderia induzir a citrulinação exacerbada. Como consequência causaria

brechas na tolerância para citrulinados via expressão endógena de peptidilarginina

deiminase (PADI-4, enzima que converte arginina a citrulina), (WEGNER et al., 2010).

Outros agentes infecciosos, como por exemplo, Proteus mirabilis, Escherichia coli e

Epstein-Barr vírus também tem sido sugeridos como fatores capazes de induzir a AR

(EBRINGER&WILSON, 2000), geralmente através de mimetismo molecular. Contudo

estes mecanismos propostos ainda não foram completamente elucidados.

Assim como em outras doenças autoimunes, existe considerável interesse no

efeito da microbiota sobre o risco e progressão da AR (SCHER et al., 2016; HONDA &

LITTMAN, 2012). Dados obtidos com modelo de artrite reumatoide em animais de

experimentação sugerem um papel essencial da microbiota intestinal em doenças

inflamatórias (HONDA et al., 2012). Em humanos, estudos iniciais relatam um

desequilíbrio na microbiota intestinal (disbiose) relacionado a AR (SCHER et al.,

2016).

1.2.2 Resposta autoimune

Os auto anticorpos são imunoglobulinas (Ig) que reagem contra antígenos

próprios de tecido autólogo. A existência de uma variedade de auto anticorpos no soro e

no líquido sinovial de pacientes com AR tem sido descrita (Tabela 1.1). Dados da

literatura demonstram que a família de auto anticorpos mais específica para AR é a

direcionada contra proteínas citrulinadas (RAMIRO et al., 2014, ALARCON &

ANDRADE, 2007). Esses anticorpos podem ser detectados em aproximadamente 80%

dos soros de pacientes com AR com especificidade de 95% a 99% (STOFFER et al,.

20

2016). Além disso, aparecem precocemente durante a evolução da enfermidade,

portanto sua detecção apresenta-se bastante útil para auxiliar no diagnóstico da doença,

especialmente na fase inicial da AR.

Tabela 1.1 Frequência de auto anticorpos associados à artrite reumatoide.

Auto anticorpo Frequência

ACPA 70-80%

Fator reumatoide IgM 75%

Anticolágeno tipo II 60%

Anti-BiP 64%

Anti-GPI 64%

Anticalpastatina 45%

Anti-HGM-1 e anti-HGM-2 40%

Anti-As 40%

Anti-RA-33 36%

Antiprofilagrina 70-90%

Antifilagrina 35-60%

Antifibronectina 14%

RA-33 = auto-antígeno de 33 kDa associado à artrite reumatoide; HGM = high group mobility;

Sa = auto-antígeno de placenta humana associado à artrite reumatoide; BiP = heavy chain

binding protein p68; GPI = glucose-6-phosphatase isomerase; ACPA=anticorpos anti-proteínas

citrulinadas (fonte: adaptado de ALARCON & ANDRADE, 2007).

De fato, a presença de auto anticorpos (soro-positividade) é associada com

sintomas mais graves, lesões articulares e aumento da morbidade na AR (HONDA &

LITTMAN, 2012; SCHER et al., 2015; ALETAHA et al., 2015; GONZALEZ et al.,

2018; van GAALEN et al., 2004). Isto ocorre devido à formação de complexos imunes

de ACPAs com antígenos contendo citrulina e subsequente ligação de RF, que pode

resultar em ativação do complemento (ZHAO et al., 2008; SABHARWAL et al., 1982;

ANQUETIL et al., 2015). O tecido em que estas respostas são ativadas é incerto, mas o

pulmão é um candidato, o que é consistente com o papel do tabagismo na AR e com a

presença de peptídeos citrulinados compartilhados no pulmão e no tecido sinovial

(REYNISDOTTIR et al., 2005) . Os ACPAs circulantes podem ser detectados até 10

anos antes do diagnóstico, doença denominada de pré-AR (NIELEN et al., 2004).

Ao longo do tempo, a concentração de ACPAs aumenta, assim como

concentrações séricas de citocinas pró-inflamatórias, especialmente antes do início do

21

comprometimento articular. ACPAs podem ser do tipo IgG, IgA, IgM ou isotipo, e são

indicativos da presença de células T (ROMBOUTS et al., 2006; ROMBOUTS et al.,

2015). ACPA induz a produção de células B que estão presentes na membrana sinovial

e na circulação (ROMBOUTS et al., 2006; KERKMAN et al., 2014). ACPAs por si só

podem ser patogênicos, quer através da ativação de macrófagos ou por ativação de

osteoclastos através de formação do complexo imunitário e envolvimento do receptor

Fc ou ainda, através da ligação a membrana citrulinada (HARRE et al., 2012), e dessa

maneira promovendo a perda óssea. Com a terapia efetiva, ocorre a redução das

concentrações de RF e ACPA, entretanto, raramente os pacientes se tornam ACPA

negativo, enquanto RF diminui mais profundamente e mais frequentemente, podendo os

pacientes se tornarem RF negativo (BOHLE et al., 2013).

1.2.3 Processo inflamatório na artrite reumatoide

Na AR o processo inflamatório tem origem na membrana sinovial onde o tecido

sinovial mostra hiperplasia do seu revestimento, como resultado do acúmulo de

fibroblastos e macrófagos. Estes macrófagos e fibroblastos promovem o processo

inflamatório através da produção de mediadores pró-inflamatórios como citocinas fator

de necrose tumoral-alfa (TNF-) e interleucina 1 (IL-1) (DA COSTA MOURA,

2013). O TNF- e a IL-1, duas citocinas pró-inflamatórias, induzem as células

sinoviais a libertar metaloproteinases (MMPs) e TNF- que estimulam o

desenvolvimento de osteoclastos, responsáveis pela reabsorção óssea.

Consequentemente, mais macrófagos, linfócitos e fibroblastos são ativados e o processo

inflamatório na AR é continuadamente sustentado (PHAM, 2011; DA COSTA

MOURA, 2013).

Estudos também mostraram que o TNF- e a interleucina 17 (IL-17) tem efeito

sinérgico na ativação e expressão de interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6) e

interleucina 8 (IL-8), do fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) e

MMPs, que em conjunto tem um papel importante no progresso do processo

inflamatório e na degradação da cartilagem articular (PAULISSEN et al., 2015; ROY et

al., 2015; SACHS et al., 2011; COSTA et al., 2015). Estes mediadores inflamatórios são

encontrados na membrana sinovial e no fluido sinovial de pacientes com AR, os quais

tem a potente capacidade de induzir a ativação do ligante do receptor ativador do fator

22

nuclear (RANKL, principal regulador da osteoclastogênese nos fibroblastos sinoviais

e nas células estromais derivadas de tecido ósseo) afetando a sinalização de

osteoclastos, causando processo de destruição do osso (Figura 1.4, DANKS &

TAKAYANAGI, 2009; SANAM et al., 2016).

Figura 1.4 Patogênese da artrite reumatoide. Os anticorpos anti fator reumatoide (FR) e antiproteínas

citrulinadas (ACPAs) são os dois auto anticorpos mais importantes na patogênese da AR. A ativação de

células T resulta na produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-, IL-1 e IL-6 por

macrófagos. Estas citocinas pró-inflamatórias tem a capacidade de ativar o ligante do receptor ativador do

fator nuclear (RANKL), que é o principal regulador da osteoclastogênese. A produção do fator de

crescimento endotelial vascular (VEGF) por fibroblastos sinoviais também estimula a angiogênese que

por sua vez mantém o processo inflamatório através do recrutamento de leucócitos. Todos estes

componentes tem um papel importante no progresso inflamatório, na degradação da cartilagem e no

processo de destruição óssea (fonte: adaptado de SANAM et al., 2016).

A angiogênese é o passo inicial na sinóvia inflamada na AR. A regulação positiva

de fatores pró-antigênico e regulação negativa de fatores anti-antigênicos na AR

aumentam a proliferação de células endoteliais e o processo da angiogênese

(SZEKANECZ & KOCH, 2009; SZEKANECZ et al., 2010; ZHOU et al., 2012). Vários

fatores pró-angiogênicos como fatores de crescimento (VEGF, TGF, FGF, EGF,

PDGF), citocinas (TNF-, IL-1, IL-6, IL-17, IL-18), quimiocinas (CXCL8, CXCL12,

23

CCL2, CXC3L1), proteases (metaloproteases, MMPs) e moléculas de adesão

(integrinas, VCAM-1 e ICAM-1) estão envolvidos na angiogênese durante AR (DA

COSTA MOURA, 2013).

1.3 Tratamento da artrite reumatoide

O custo relacionado a AR é elevado devido tanto a fatores diretos (gastos com

diversos medicamentos, despesas médicas e hospitalares) quanto indiretos como perda

da produtividade pessoal ou perda total da capacidade laboral (DE AZEVEDO et al.,

2008). Mesmo não apresentando risco de morte a AR resulta na redução da qualidade de

vida do paciente e danos econômicos graves a sociedade (ALMEIDA, 2014). Segundo

dados de internação hospitalar do SUS, no ano de 2011 houve 19978 internações devido

a AR e outras poliartropatias inflamatórias, totalizando um gasto de R$13.830.164,88,

dos quais R$12.215.908,93 são referentes a serviços hospitalares e R$1.614.255,95

referentes a serviços profissionais (DATASUS, 2012). Esses gastos não incluem os

medicamentos dispensados nos ambulatórios pelo SUS. O gasto anual mundial com o

tratamento AR é de aproximadamente U$16 bilhões incluindo as despesas

socioeconômicas diretas, como custos com despesas médicas, e custos indiretos, como a

queda de produtividade e redução da qualidade de vida do paciente (DUNLOP et al.,

2003).

Em 2012, foi elaborado o último consenso da Sociedade Brasileira de

Reumatologia para o tratamento da artrite reumatoide. O consenso tem o objetivo de

elaborar recomendações para o manejo da AR, com enfoque no tratamento da doença,

considerando os aspectos peculiares da realidade socioeconômica brasileira. Dessa

forma, o consenso sintetiza a posição da Sociedade Brasileira de Reumatologia (SBR)

sobre o tema, com o objetivo de orientar os médicos brasileiros, em especial os

reumatologistas, sobre o tratamento da AR no Brasil (DA MOTA et al, 2012). De

acordo com o consenso de 2012, o tratamento da AR inclui educação do paciente e de

sua família, terapia medicamentosa, fisioterapia, apoio psicossocial, terapia ocupacional

e abordagens cirúrgicas. As terapias medicamentosas incluem uso de anti-inflamatórios

não hormonais (AINHs), corticoides, medicamentos modificadores do curso da doença

24

(MMCD) sintéticos e biológicos e drogas imunossupressoras (DA MOTA et al, 2012,

COSTA et al, 2015).

O objetivo principal do tratamento é o controle imediato da inflamação a fim de

evitar lesões estruturais progressivas, maximizar a qualidade de vida através do controle

dos sintomas, otimizar a função articular e melhorar a inclusão social. O tratamento da

AR envolve o uso de várias classes de fármacos com diferentes mecanismo de ação

(NEGREI et al, 2016). A primeira linha de tratamento da AR está sumarizada na figura

1.5 e inclui AINHs (anti-inflamatórios não hormonais), corticoides e medicamentos

modificadores do curso da doença (MMCD) (DEVINE et al., 2011).

Figura 1.5 Fluxograma para a primeira linha do tratamento medicamentoso da artrite

reumatoide: AINH: anti-inflamatório não hormonal; MMCD: Medicamentos modificadores do

curso da doença; MTX: metotrexato (Fonte: adaptado de DA MOTA et al, 2012).

1.3.1 Medidas educativas

Antes de iniciar qualquer forma de tratamento, o paciente deve ser esclarecido

sobre sua enfermidade e, particularmente, quanto às possibilidades evolutivas,

terapêuticas e de prognóstico. É preciso alertar sobre informações inadequadas

veiculadas pelos meios de comunicação, em especial a internet (ABOURAZZAK et al.,

25

2009; LOVISI NETO et al., 2009, DA MOTA et al, 2012). Atividades educativas são

essenciais para que se obtenha a colaboração do paciente. Ele tem o direito de saber

sobre suas condições e sobre as opções terapêuticas disponíveis, e de participar

ativamente das escolhas. O paciente que entende sua condição e compreende a ação dos

medicamentos, os métodos de prevenção de deformidades e o processo de reabilitação

apresenta melhor evolução clínica (MASIERO et al., 2007; DA MOTA et al, 2012).

1.3.2 Anti-inflamatórios não hormonais (AINHs)

Os anti-inflamatórios não hormonais (AINHs) são muito utilizados para a

redução do processo inflamatório por inibirem a síntese de prostanóides, através da

inibição da enzima ciclo-oxigenase (COX), e consequentemente reduzirem a dor e o

edema. Os AINHs diminuem o processo inflamatório e a dor, principalmente no início

da doença, pois os MMCD não tem ação imediata. Dessa forma, são usados para

controlar a dor e inchaço nas articulações, mas não são eficazes na prevenção de danos

estruturais e não alteram o curso da doença (MALOTTKI et al.,2011). Meloxicam é um

AINH derivado do oxicam que possui efeitos analgésicos, antipiréticos e anti-

inflamatórios com menor irritação gástrica quando comparado com outras drogas

AINHs. O meloxicam é aprovado pelo FDA para tratamento da osteoartrite. Nas doses

recomendadas é equivalente ao ácido acetilsalicílico e a indometacina para o tratamento

prolongado da AR. Sua principal vantagem é possuir meia vida longa, o que permite

uma única administração por dia ao paciente (GOODMAN&GILMAN, 2010). Os

mecanismos de ação são baseados na inibição da ciclooxigenase (COX-1 e 2) e

consequente redução da produção de prostaglandinas. Seu uso deve ser em conjunto

com medicamentos que promovem a remissão da doença. O uso por longo prazo pode

estar associado a efeitos adversos tais como náusea, azia, dor abdominal e gastrite,

devendo ser evitado em pacientes com úlceras (NEGREI, 2016).

1.3.3 Corticoides

A maioria dos estudos sobre o uso de corticoides no tratamento da AR sugere a

utilização da prednisona ou prednisolona em doses baixas. Não há estudos comparativos

que permitam indicar preferencialmente doses mais altas no início do tratamento (VAN

26

EVERDINGEN et al., 2002; SMOLEN et al., 2011). Na AR, devido aos efeitos

adversos graves e debilitantes associados ao seu uso crônico, os corticoides são usados

como agentes contemporizadores para a doença progressiva que não responde ao

tratamento com fisioterapia e AINHs. Nesse caso eles proporcionam alívio até que

outros fármacos antirreumáticos de ação lenta exerçam seus efeitos (GOODMAN,

2010). Devido aos efeitos adversos o tempo de uso de corticoides deve ser abreviado ao

mínimo possível. Se a previsão for de três ou mais meses de uso, deve-se fazer

suplementação de cálcio e de vitamina D. Dependendo do resultado de densitometria

óssea, e em pacientes com fatores de risco para fraturas, a utilização de drogas

antirreabsortivas, como os bisfosfonatos, pode ser considerada (HOES et al., 2009). Em

pacientes com a doença ativa restrita a poucas articulações pode-se usar o corticoide

intra-articular, porém, uma mesma articulação não deve ser infiltrada mais de três a

quatro vezes ao ano (DERNIS et al., 2010). De fato, a prednisona é um medicamento

muito utilizado para aliviar os sintomas da AR, sendo importante a administração intra-

articular em casos de sintomatologia limitada a uma ou apenas algumas articulações.

Para pacientes em uso concomitante de corticoide e AINH, recomenda-se proteção

gástrica com inibidor de bomba de próton (DERNIS et al., 2010).

Os corticoides tem efeito rápido e em associação com os medicamentos que

promovem a remissão da doença evita danos estruturais da AR inicial. A sua utilização

é indicada em vasculite reumatoide (inflamação do vaso sanguíneo) ou outras

manifestações sistêmicas da AR (NEGREI et al, 2016). Também tem importantes

efeitos no controle dos sintomas e na redução da taxa de progressão da doença

(KIRWANet al., 2007). Corticoides podem ser usados de forma intermitente,

principalmente em pacientes com doença de difícil controle ou enquanto se aguarda a

ação das drogas modificadoras da doença, mas não como monoterapia (KUMAR e

BANIK, 2013). Seu uso sistêmico, utilizado no início do tratamento da AR reduz os

sintomas e a progressão radiográfica, mesmo depois da suspensão do seu uso. A

prednisolona é o metabólito ativo da prednisona após sua ativação hepática. Em

qualquer das etapas pode-se usar prednisona ou prednisolona (até 0,3 mg/KG/ dia, via

oral).

27

1.3.4 Medicamentos modificadores do curso da doença (MMCD)

Os MMCD devem ser indicados ao paciente a partir da definição do diagnóstico

de AR (FURST et al., 2011). A utilização de MMCD em pacientes com artrite

indiferenciada e biomarcadores preditores de AR, como positividade dos anticorpos

antipeptideos citrulinados cíclicos (anti-CCP) e/ou fator reumatoide (FR), pode ser

considerada (LUKAS et al., 2011). MMCD é uma classe heterogênea de medicamentos

capazes de reduzir a progressão da doença e da inflamação sistêmica. Dessa forma, o

uso de MMCD deve ser iniciado o mais rápido possível, a partir do diagnóstico. Os

MMCD são classificados em sintéticos e biológicos (NEGREI et al, 2016). De acordo

com a portaria SAS/MS, 996 de 30 de setembro de 2015 a administração de fármacos

que modificam o curso da doença deve ser iniciada no momento do diagnóstico da AR.

Avaliações clínicas frequentes, a cada 30 a 90 dias são recomendadas. Entre os MMCD

sintéticos para o tratamento de AR, o metotrexato é o medicamento padrão, devendo ser

iniciado tão logo o diagnóstico seja definido. A terapia de primeira linha inclui o uso

precoce do MMCD sintético, o MTX, que é o fármaco de escolha, no entanto, apenas 20

a 40 % em monoterapia apresentam resposta clínica satisfatória (COSTA et al, 2015).

1.3.4.1 MMCD sintéticas: metotrexato (MTX)

O MTX é um agente imunomodulador cuja ação consiste na inibição da síntese

de DNA, RNA, timidinato e proteínas. Os efeitos anti-inflamatórios do MTX na AR

parecem estar relacionados, pelo menos em parte, com a modulação do metabolismo da

adenosina e com os efeitos possíveis nas vias do fator de necrose tumoral (TNF, do

ingles, tumor necrosis factor). Os efeitos imunossupressivos e tóxicos do MTX são

devido à inibição da diidrofolato redutase, enzima envolvida no metabolismo do ácido

fólico, o que evita a redução do diidrofolato a tetraidrofolato ativo. O tempo até a

concentração máxima é de 1–5 horas por via oral (VO) e de 30–60 minutos por via

intramuscular (IM) ou subcutânea (SC). Elimina-se por via renal entre 40% e 90% de

forma inalterada (CRONSTEIN, 2010, DA MOTA et al., 2012). O MTX é atualmente

considerado o fármaco padrão no tratamento da AR (PINCUS et al., 2010, DA MOTA

et al, 2012). O MTX é capaz de reduzir sinais e sintomas de atividade da AR e de

melhorar o estado funcional do paciente (O’DELL et al., 1996, DA MOTA et al, 2012).

O MTX também reduz a progressão das lesões radiográficas.

28

A dose inicial recomendada é de 10 a 15 mg/semana por via oral (VO) ou

parenteral (intramuscular ou subcutânea). Caso não ocorra melhora ou controle da

doença com a dose de 10-15 mg por semana deve-se aumentar a dose progressivamente

a cada 2 ou 4 semanas até a dose de 20 mg por semana. Para pacientes com intolerância

gastrintestinal ou com resposta inadequada a formulação oral de MTX, pode-se utilizar

a formulação parenteral. Os efeitos adversos mais frequentemente observados são

anemia, neutropenia, náuseas e vômitos, mucosite e elevação de enzimas hepáticas. A

pneumonia intersticial é uma manifestação menos frequente. Sem dúvida nenhuma o

MTX é o padrão ouro no tratamento e seu uso prolongado é bem tolerado e seguro

(NEGREI et al, 2016).

1.3.4.2 MMCD biológicas

Um dos mais relevantes avanços na terapia da AR foi o desenvolvimento das

MMCD biológicas (CAPORALI et al., 2011). Embora essas medicações sejam eficazes

no controle da AR, sua segurança a longo prazo ainda não esta completamente

estabelecida (FAVALLI et al., 2011). De acordo com DA MOTA (2012), encontram-se

aprovadas pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para uso no Brasil

os seguintes MMCD biológicos:

a) Anti-TNF: adalimumabe, certolizumabe, etanercepte, infliximabe e

golimumabe;

b) Depletor de linfócito B: rituximabe;

c) Bloqueador da co-estimulação do linfócito T: abatacepte;

d) Bloqueador do receptor de interleucina-6 (IL-6): tocilizumabe.

A Figura 1.6 mostra o Fluxograma para a segunda e terceira linha de tratamento

da AR no Brasil com MMCD sintéticos e biológicos, proposto pela Comissão de Artrite

Reumatoide da Sociedade Brasileira de Reumatologia (DA MOTA, 2012).

29

Figura 1.6 Fluxograma para o tratamento medicamentoso da artrite reumatoide com MMCD

biológicos. ABAT: abatacepte; MMCD: medicamento modificador do curso da doença; MTX:

metotrexato; RTX: rituximabe; TOCI:tocilizumabe (Fonte: adaptado de DA MOTA et al, 2012).

Os MMCD biológicos estão indicados para pacientes em que a atividade da

doença persiste apesar do tratamento com dois esquemas de MMCD sintéticos, dos

quais pelo menos um deles seja combinações de MMCD. O uso de agentes biológicos

deve ser feito associado a um MMCD sintético, preferencialmente o MTX. Apenas em

casos excepcionais um MMCD biológico pode ser prescrito para tratamento precoce da

AR, que neste caso é caracterizada pela combinação de sinais de pior prognóstico como:

elevado número de articulações acometidas, erosões radiográficas na fase inicial da

doença, FR e/ou anti-CCP presentes em altos títulos (LINEKER et al., 2011; SMOLEN

et al. 2010; MARKATSELI et al., 2010; VISSER et al., 2010; SMOLEN et al., 2010;

VISSER et al., 2009; DA MOTA et al, 2012). Alguns fatores podem determinar a

escolha de um ou outro MMCD biológico como a dificuldade de aplicação de

medicação por via subcutânea (SC) por alguns pacientes e seus familiares, bem como a

inexistência de centros de infusão para aplicação de medicação intravenosa (IV) em

certos locais. Os centros de dispensação/infusão das drogas, públicos ou privados,

devem informar o adequado acondicionamento de cada medicação ou encaminhar os

pacientes para o local de infusão, para evitar perda de eficácia do tratamento.

Recomenda-se que o uso desses fármacos seja indicado e monitorado por um

30

reumatologista (MOMOHARA et al., 2010). Os MMCD biológicos mais utilizados são

os anti-TNF, mas há evidencias de que os demais MMCD biológicos também

promovam o controle de sinais e sintomas da AR e a inibição da progressão radiográfica

(DA MOTA et al, 2012).

No Brasil, no Sistema Único de Saúde (SUS), o acesso aos MMCD biológicos

para o tratamento da artrite reumatoide é feito pelo Componente Especializado da

Assistência Farmacêutica (CEAF), anteriormente denominado Programa de

Medicamentos de Dispensação Excepcional/Alto Custo (PMAC, MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2009). O infliximabe foi o primeiro MMCD biológico padronizado para o

tratamento da artrite reumatoide e está disponível desde 2002 (SECRETARIA DE

ASSISTÊNCIA À SAÚDE, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). Em 2006, o etanercepte

e o adalimumabe foram incorporados como opções de tratamento (SECRETARIA DE

CIÊNCIA, TECNOLOGIA E INSUMOS ESTRATÉGICOS, MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2006). Desses, o infliximabe correspondeu entre 16% e 40% das prescrições

em estudos brasileiros efetuados em 2010 (WIENS et al., 2012; TITTON et al., 2011).

Os gastos do Ministério da Saúde com medicamentos desse programa cresceram aproxi-

madamente 106% no período de 2000 a 2007 (CARIAS et al., 2011). Entre 2000 e

2004, as doenças do sistema osteomuscular e do tecido conjuntivo representaram cerca

de 22% dos diagnósticos dos pacientes atendidos no programa (ACURCIO et al., 2009).

Nesse mesmo período, o infliximabe ocupou a segunda posição do maior gasto mensal

médio per capita, no valor de R$ 5.945,58 (BRANDÃO et al., 2011). Em 2007, a artrite

reumatoide foi a quarta doença de maior impacto orçamentário, consumindo 10,4% dos

recursos (CARIAS et al., 2011). De fato, o tratamento com MMCD biológicos tem

custo elevado. O ciclo de tratamento de 48 meses com esquema terapêutico

convencional seguido de biológico custou R$ 1.701.286,76 (MONTEIRO & ZANINI,

2008) e o custo de seis meses de tratamento com infliximabe é de R$ 19.698,00

(VENSON et al., 2011).

1.4 Sistemas de transporte e liberação de fármacos para o

tratamento da AR

1.4.1 Nanopartículas

31

A nanotecnologia e as nanopartículas tem uma vasta aplicação na área biológica.

A nanomedicina, um ramo da nanotecnologia que se refere à intervenção médica em

escala molecular altamente específica para o tratamento de doenças ou reparo de tecidos

danificados. Nos últimos anos, a nanomedicina baseada em polímeros tem recebido

atenção crescente devido à sua habilidade em aperfeiçoar a eficiência terapêutica de

alguns fármacos (PARK et al.,2008). De fato, nanopartículas podem melhorar a

cinética, biodistribuição e a liberação de um fármaco, vacinas, proteínas recombinantes

ou oligonucleotídeos. A nanotecnologia possibilita a confecção de dispositivos na

mesma escala que as células e biomoléculas, ou seja, em escala nanométrica o que

propicia uma abordagem única para a criação de sistemas de liberação de fármacos

(Figura 1.7). Portanto, o desenvolvimento de nanoestruturas moleculares, com tamanho

e forma de partículas bem definidas, é de grande interesse para o desenvolvimento de

sistemas transportadores de fármacos. Os sistemas utilizados como carreadores de

fármacos que possuem escala nanométrica e tamanho uniforme tem capacidade maior

de atravessar membranas celulares (SVENSON&TOMALIA, 2005).

Os lipossomas, micelas, nanopartículas metálicas e nanopartículas poliméricas

são os sistemas transportadores em escala nanométrica mais utilizados em sistemas de

liberação de fármacos (BADER, 2012). As nanopartículas são capazes de: (a)

encapsular e proteger os fármacos da degradação, (b) melhorar o alvo para entrega e

liberação do fármaco, (c) propiciar o controle da liberação de fármacos e d) de serem

produzidas em grande escala (ANSELMO & MITRAGOTRI, 2014).

As nanopartículas poliméricas, confeccionadas a partir de polímeros

biocompatíveis e biodegradáveis tem sido amplamente estudadas como veículos

terapêuticos. As nanopartículas poliméricas são formuladas por meio de copolímeros de

hidrofobicidade diferente. Estes copolímeros formam espontaneamente micelas em

meio aquoso (TORCHILIN, 2017; GROBMYER et al., 2010). As nanopartículas

poliméricas podem encapsular fármacos hidrofílicos e/ou pequenas moléculas de

fármacos hidrofóbicos, proteínas e ácidos nucleicos (WANG & WANG, 2014). A

utilização de polímeros como transportadores de fármacos, especialmente os que

possuem baixa solubilidade em água, em pH fisiológico e alta toxicidade, tornou-se

evidente na última década (MALIK et al., 2006; SVENSON,2009; KESHARWANI et

al., 2013). Uma das primeiras abordagens utilizando nanocarreadores para a AR teve

como alvo os macrófagos. Na AR ocorre aumento de macrófagos nas articulações

32

inflamadas e as nanopartículas são facilmente fagocitadas pelos macrófagos sem a

necessidade de modificações na superfície das mesmas (PHAM, 2011).

Figura 1.7 Nanopartículas (NP) para tratamento da artrite reumatoide. Diferentes tipos de

nanopartículas tem sido utilizadas para o tratamento da AR. Fármacos e fragmentos de RNA são

transportados por nanopartículas e impedem a expressão de citocinas pró-inflamatórias e como

consequência ocorre a inibição do processo inflamatório e da degeneração da cartilagem

articular (fonte: adaptado de SANAM et al., 2016).

Os dendrímeros são nanopartículas poliméricas com estrutura ramificada feita a

partir de elementos sintéticos ou naturais (MEDINA & EL-SAYED, 2009). Em

contraste com os lipossomas, os sistemas transportadores de fármacos feitos com

nanopartículas poliméricas liberam os fármacos de maneira mais lenta e, portanto,

requerem uma administração menos frequente (SANAM et al., 2016).

1.5 Dendrímeros como sistemas transportadores de fármacos

Os dendrímeros são uma classe de polímeros que apresenta estruturas

ramificadas. Os dendrímeros de poliamidoamina, ou PAMAMs, foram os primeiros a

serem sintetizados e tem grande potencial para sistemas de liberação de fármacos. As

estruturas dendríticas foram descritas primeiramente em 1978 (BUHLEIER et al.,

1978). O desenvolvimento das estruturas dessas moléculas, assim como o

desenvolvimento de novas técnicas sintéticas originou as grandes estruturas dendríticas

33

(DENKEWALTER et al, 1983; TOMALIA et al., 1985; BRABRANDER VAN DEN

BERG & MEIJER, 1993) e esta classe foi denominada de dendrímeros. A palavra

dendrímero tem origem do grego “dendron” e “meros” que significam “árvore” e

“parte”, respectivamente (DYKES, 2001).

Figura 1.8 Dendrímeros disponíveis comercialmente. (A) Dendrímero de Polipropileno imina

(G5) e (B) dendrímero de poliamido amina (G3). Cada geração é marcada com um círculo

(fonte: adaptado de Boas & Heegaard, 2004).

Os dendrímeros ramificados resultam em estruturas semiglobulares ou

globulares, na maioria das vezes com alta densidade funcional na superfície. As

estruturas são caracterizadas por “camadas” entre cada ponto focal denominado de

geração (figura 1.8). O numero de gerações é definido pelo numero de pontos focais do

núcleo a superfície. O núcleo é denominado de geração 0 (G0), sem ramificações.

Os dendrímeros podem ser sintetizados quimicamente por duas formas

diferentes, divergente ou convergente (figura 1.9).

34

Figura 1.9 Síntese dendrímero (esquematicamente representado). (A) Estratégia divergente e

(B) estratégia convergente (fonte: adaptado de Boas & Heegaard, 2004).

Na estratégia divergente (Figura 1.9A) os dendrímeros são sintetizados a partir

do núcleo aumentando geração por geração. A estratégia convergente (Hawker &

Frekche, 1990) (Figura 1.9B) inicia a síntese pelos grupos terminais em direção ao

núcleo onde os segmentos de dendrímeros, dendron, são ligados entre si.

Para a confecção de sistemas carreadores de fármacos ou sistemas

transportadores de fármacos os dendrímeros podem ser sintetizados de acordo com a

aplicação específica, o que é uma grande vantagem. A arquitetura dos dendrímeros

possibilita a sua interação com fármacos muito ou pouco solúveis em água, formando

complexos via encapsulamento do fármaco, com ligações covalentes ou não covalentes.

As cavidades internas dos dendrímeros podem ser utilizadas para transportar e

armazenar uma grande variedade de fármacos e outras moléculas (JENSEN et al.,

2005). Ao mesmo tempo é possível fazer modificações de grupos funcionais externos

fornecendo propriedades flexíveis ao dendrímero. Por exemplo, o êxito da preparação

de conjugados multivalentes de dendrímeros com o ácido fólico ou fármacos para o

tratamento do câncer tem importantes implicações quando direcionados para células

tumorais. Além disso, o caráter multivalente dos dendrímeros facilita a fixação de várias

moléculas úteis para o diagnóstico e tratamento de várias doenças, bem como

combinações destes agentes (KHOPADEET al., 2002; QUINTANA et bal., 2002;

SUDIMACK & LEE, 2000). A Figura 1.10 mostra as funções dos grupos internos e

externos do dendrímero utilizado como sistema de liberação/transporte de fármacos

(BAI et al., 2006).

35

Figura 1.10 Propriedades dos grupos internos e externos do dendrímero utilizado como sistema

de liberação/transporte de fármacos (fonte: adaptado de BAI et al., 2006).

A síntese de estruturas dendríticas do poliglicerol (PGLD), embora recente, tem

várias aplicações na medicina e são muito promissoras. O fármaco encapsulado poderá

levar a diminuição da toxicidade e das interações medicamentosas, maior tempo de

permanência na circulação e um mínimo de reações inflamatórias locais. Estudos

utilizando dendrímeros de PGLD para o encapsulamento de quimioterápicos

antitumorais sugerem que esse é um sistema transportador ideal para vetorização de

medicamentos. A alta densidade da superfície externa funcional torna a superfície do

dendrímero apropriada como nanoarcabouço. Por outro lado, o interior é apropriado

para o encapsulamento de moléculas bioativas (SVENSON & TOMALIA, 2005;

SVENSON, 2009). A capacidade para fixar moléculas de forma definida e controlada

sobre a superfície dendrítica diferencia claramente os dendrímeros de outros

36

carreadores, como micelas, lipossomas, gotículas de emulsão e engenharia de partículas

(SVENSON& TOMALIA, 2005).

O dendrímero de poliglicerol (PGLD) é um polímero solúvel em água com baixa

citotoxicidade. Com a aprovação do poliglicerol (PGL) pelo FDA (Food and Drug

Admistration), como emulsificante na indústria farmacêutica e alimentícia, este

dendrímero se tornou um promissor candidato para uso no campo biomédico.

O dendrímero PGLD possui um esqueleto baseado na função éter, onde cada

ramificação termina em uma função hidroxila, o que o torna altamente funcional. Além

disso, é fato reconhecido na literatura que poliéteres alifáticos tendem a ser

biocompatíveis, o que torna o PGLD um dendrímero adequado para aplicações como

um agente de entrega de compostos biologicamente ativos (KESHARWANI et al.,

2013).

Apesar de décadas de pesquisas farmacêuticas e clínicas, ainda há muitas

necessidades não contempladas no tratamento da AR. Os fármacos utilizados para o

tratamento estão disponíveis para a administração oral ou por via intra-articular, com

eficácias comparáveis (STEINMEYERAND& KONTTINEN, 2006; ABRAMSON,

2006; GERWIN et al., 2006). Entretanto, a administração por via oral é relacionada

frequentemente com reações adversas severas, principalmente gastrintestinais, além de

outras complicações (GERWIN et al., 2006). Dessa forma, a utilização de dendrímeros

do tipo gliceróis densamente ramificados com propriedades biocompatíveis, pode ser

uma alternativa promissora para a obtenção de carreadores dos fármacos (prednisona,

meloxicam e metotrexato) para o tratamento sistêmico ou intra-articular da AR.

Espera-se que o fármaco encapsulado apresente diminuição da toxicidade, maior

tempo de permanência na circulação e reações adversas sistêmicas e locais mínimas.

Outra vantagem de usar dendrímeros como carreadores de fármacos para tratamento de

doenças inflamatórias é o fato deste polímero já possuir um efeito anti-inflamatório.

Como exemplo pode-se citar seus derivados sulfatados para aplicações como inibidores

de inflamação (DERNEDDE et al., 2010; GRÖGER et al., 2013).

37

1.6 Hemocompatibilidade

1.6.1 Efeito sobre a coagulação

O processo da hemostasia sanguínea envolve a participação de vasos sanguíneos,

plaquetas e fatores da cascata da coagulação (SIQUEIRA, 2001). Mediante lesão do

endotélio vascular, as plaquetas são ativadas e formam um tampão plaquetário no local

da lesão, evitando a perda de sangue. Ao mesmo tempo, a cascata da coagulação é

ativada, promovendo a formação de um coágulo de fibrina, que resulta em maior

retenção das plaquetas e formação de um coágulo estável (SIQUEIRA, 2001; RIDDEL

et al., 2007). Para fins didáticos, o processo da atividade da cascata da coagulação é

dividido em duas etapas. Uma etapa é representada pela avaliação da atividade da via

intrínseca, e a outra é representada pela avaliação da atividade da via denominada

extrínseca. As duas vias são convergentes e culminam com a formação de um coágulo

estável de fibrina (SIQUEIRA 2001).

Ao considerar que as formulações nanoestruturadas são administradas por via

endovenosa, é importante avaliar se as mesmas interagem com os componentes da

hemostasia sanguínea (OLIVEIRA, 1993; ADLER-MOORE & PROFFITT, 2003;

RATH et al, 2003; SCHETTINI et al., 2005; SCHETTINI, 2006; DOBROVOLSKAIA

& MCNEIL, 2007; KUZNETSOVA et al., 2012). Ao interagir tanto com plaquetas

quanto com fatores da coagulação e células envolvidas neste mecanismo, as

formulações nanoestruturadas poderiam promover a formação do coágulo sanguíneo.

Essas características dependem diretamente da constituição dos componentes desses

sistemas carreadores e de sua interação com os componentes envolvidos na cascata da

coagulação (WASSEF, 1995; GALÁN et al., 2002; DOBROVOLSKAIA & NEUN,

2009; DOBROVOLSKAIA & NEUN, 2011; KUZNETSOVA et al., 2012).

1.6.2 Ativação plaquetária

As plaquetas possuem uma importante função hemostática que resulta na

formação de um tampão plaquetário no local da lesão do vaso sanguíneo. As plaquetas

também podem ativar mecanismos da coagulação por expor em sua superfície

fosfolipídios carregados negativamente que irão auxiliar na consolidação do coágulo de

38

fibrina que está sendo formado (SIQUEIRA, 2001). Após a lesão vascular ocorre a

adesão das plaquetas às macromoléculas presentes no tecido subendotelial (BEVERS et

al., 1991; SIQUEIRA, 2001; RIDDEL JR, 2007).

1.6.3 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA)

Outra forma de avaliar laboratorialmente a atividade de uma das vias da cascata

da coagulação sanguínea é por meio do teste do Tempo de Tromboplastina Parcial

ativada (TTPA). Esse teste é baseado no modelo da cascata da coagulação, o qual

analisa qual o tempo necessário para que ocorra a formação do coágulo de fibrina. Os

fatores que atuam nessa via estão em estado inativo (zimogênios), mas assim que

recebem um estímulo, são ativados em forma de cascata de reações enzimáticas que por

fim irão provocar a formação de um coágulo de fibrina (FRANCO, 2001; FERREIRA

et al., 2010). O esquema da cascata de coagulação pode ser visto na Figura 1.11, que

relaciona as vias envolvidas na coagulação (BOON, 1993; CARVALHO, 2008; ZAGO,

2005; FRANCO, 2001; FERREIRA et al., 2010).

1.6.4 Tempo de protrombina (TP)

A avaliação realizada através da determinação do Tempo de Protrombina (TP)

baseia-se na ativação das vias extrínseca e comum da cascata da coagulação

(FERREIRA et al., 2010). Vale lembrar que o termo extrínseco é usado para designar

uma proteína que não está presente no sangue circulante, o Fator Tecidual (FT) que

também é chamado de Fator III ou tromboplastina. Esse fator torna-se exposto quando

há uma lesão no vaso sanguíneo (BOON, 1993; FRANCO, 2001; RIDDEL et al., 2007;

FERREIRA et al., 2010). De maneira semelhante ao que acontece na via intrínseca da

coagulação, a injúria vascular faz com que o FT sofra uma modificação estrutural

expondo o domínio de ligação ao Fator VII (FVII), que na presença de íons Ca2+

, forma

um complexo tri-molecular, FT- Ca2+

-FVII. A formação desse complexo torna o FVII

ativo (FVII a) o qual, na presença de Ca2+

e fosfolípides, irá ativar o Fator X (FX).

Tanto a via intrínseca quanto a via extrínseca da coagulação convergem para uma via

comum, como pode ser observado na figura 1.11.

39

Figura 1.11 Esquema da cascata da coagulação com a divisão do sistema de coagulação em duas vias.

CAPM: cininogênio de alto peso molecular; PK: pré-calicreína (fonte: adaptado de FRANCO, 2001).

1.6.5 Hemólise

O sangue é composto pelo plasma e pela porção celular. O plasma corresponde a

55% do sangue, formado por 91,5% de água, 7% de proteínas e 1,5% de sais e

substâncias orgânicas. A porção celular é composta por três linhagens, onde as

hemácias, chamadas também de glóbulos vermelhos ou eritrócitos, são mais abundantes

quando comparadas às outras linhagens celulares, leucócitos e plaquetas. Seu número

pode variar entre 4,5 – 6,0 milhões por microlitro de sangue (CARVALHO, W. F.,

2008). No ser humano, as hemácias têm uma vida média de aproximadamente 120 dias

e uma baixa taxa de destruição fisiológica. Diariamente, 0,06% a 0,4% das hemácias

são fisiologicamente retiradas da circulação (MCPHEE & GANONG, 2007).

As hemácias, por serem as células encontradas em maior quantidade na corrente

sanguínea e por sua provável interação com formulações farmacêuticas administradas

por via parenteral, como os nanocarreadores, são alvos de pesquisas para testes de

40

toxicidade (DOBROVOLSKAIA et al., 2008; DASH et al., 2010; BENDER et al.,

2012). Assim, uma forma de avaliar a ocorrência de reações adversas devido à interação

entre as formulações farmacêuticas, fármacos e componentes celulares do sangue é

avaliar o grau de hemólise que tais formulações ou fármacos podem causar. A indução

de hemólise por sistemas nanoestruturados pode ser um fator de risco à saúde, uma vez

que o resultado dessa interação pode levar a um quadro de anemia

(DOBROVOLSKAIA et al., 2008; BERTRAND & LEROUX, 2012;

DOBROVOLSKAIA & MCNEIL, 2013). Nesse sentido, o teste de hemólise é de

fundamental importância para estabelecer o grau de interação que novos materiais

podem ter com as células vermelhas e se essa interação pode comprometer a sua

estrutura, e consequentemente acarretar a lise e liberação de seu conteúdo

citoplasmático no plasma sanguíneo. O valor máximo de hemólise permitido e

preconizado pelo protocolo internacional E2524-08 (2013) - Standard Test Method for

Analysis of Hemolytic Properties of Nanoparticles da ASTM (American Society for

Testing and Materials) para o estudo das propriedades hemolíticas de nanopartículas é

2% (DOBROVOLSKAIA & MCNEIL, 2013).

Portanto, baseado em todos os dados descritos, o presente trabalho tem como

objetivo avaliar a hemocompatibilidade de diferentes nanofármacos com estrutura

dendrítica para o tratamento da artrite reumatoide. Para tanto, serão utilizadas técnicas

físico-químicas para a caracterização dos conjugados PGLD-prednisona, PGLD-

meloxicam e PGLD-metotrexato. Para avaliar a Hemocompatibilidade serão utilizados

os testes de tempo de protrombina (TP), tempo de tromboplastina parcial ativada

(TTPA), teste de adesão plaquetária e o ensaio de hemólise dos fármacos puros, do

PGLD isolado e dos conjugados PGLD-prednisona, PGLD-meloxicam e PGLD-

metotrexato.

41

1.7 Objetivo:

Avaliar a hemocompatibilidade de diferentes nanofármacos com estrutura dendrítica

para o tratamento da artrite reumatoide.

1.7.1 Objetivos específicos:

Caracterizar por técnicas físico-químicas os conjugados PGLD-prednisona,

PGLD-meloxicam e PGLD-metotrexato;

Estudar as propriedades de hemocompatibilidade dos fármacos puros, do PGLD

isolado e dos conjugados PGLD-prednisona, PGLD-meloxicam e PGLD-metotrexato,

utilizando o tempo de protrombina (TP), tempo de tromboplastina parcial ativada

(TTPA), teste de adesão plaquetária e o ensaio de hemólise.

42

Capítulo 2

MÉTODOS E DESCRIÇÃO DA PESQUISA

43

2 MÉTODOS E DESCRIÇÃO DA PESQUISA

2.1 Materiais

1. Prednisona: Sigma‐Aldrich

2. Meloxicam: Sigma‐Aldrich

3. Metotrexato: Sigma‐Aldrich

4. Anticoagulante citrato de sódio 0,38%: VACUETTE ®

5. Anticoagulante EDTA: VACUETTE ®

6. PGLD de segunda geração (G2)

7. PGLD de quarta geração (G4)

8. Cefalina+ Ácido elágico: WAMA diagnóstica

9. Cloreto de cálcio: WAMA diagnóstica

10. Saponina: Dinâmica

Os experimentos de caracterização físico-química e de hemocompatibilidade foram

realizados nos seguintes grupos listados no quadro 2.1:

Quadro 2.1 Grupos participantes dos ensaios de caracterização química e biológica

GRUPO Dendrímero Fármaco

G2 G2 --------------

G4 G4 --------------

Prednisona ------------- Prednisona

Meloxicam ------------- Meloxicam

Metotrexato ------------- Metotrexato

G2 Pred G2 Prednisona

G2 Melox G2 Meloxicam

G2 Metot G2 Metotrexato

G4 Pred G4 Prednisona

G4 Melox G4 Meloxicam

G4 Metot G4 Metotrexato

44

2.2 Imobilizações da prednisona, meloxicam ou metotrexato

nos dendrímeros

Os poligliceróis dendríticos, derivados do glicerol utilizados nesse trabalho foram

sintetizados via rota divergente através de reação de eterificação do glicerol segundo os

trabalhos de Esdras (PASSOS et al., 2015; Patente: Privilégio de Inovação. Número do

registro: BR1020150316771). As amostras foram cedidas pelo professor Álvaro

Antônio Alencar de Queiroz do Centro de Estudos e Inovação em Materiais Funcionais

Avançados da UNIFEI.

A síntese dos conjugados PGLD-Prednisona, PGLD-Meloxicam e PGLD-

Metotrexato foi efetuada de acordo com trabalhos anteriores do grupo de Polímeros

Bioativos e Biomiméticos da UNIFEI. O PGLD foi sintetizado a partir da síntese de

Williamsom modificada pela utilização de um catalisador de transferência de fase. Após

purificação por diálise, a reação de acoplamento entre o PGLD e os fármacos foi

catalisada após reação com uma mistura de dimetilaminopiridina (DMAP) e

diciclolcarbodiimida (DCC). O solvente utilizado na reação de acoplamento foi o

dimetilsulfóxido (DMSO).

Adicionou-se a 0,2 mols de PGLD uma massa de 50 mg de DCC e 5,0 mg de

DMAP previamente dissolvidos em 10 mL de DMSO em balão tribulado sob atmosfera

inerte (nitrogênio). O sistema reacional foi mantido sob agitação constante por 48 horas

a - 4 oC.

Após a reação de acoplamento a mistura reacional foi dialisada em solução

tampão PBS pH=7,4 por membrana com massa molar de corte entre 14 kDa e 16 kDa

durante 3 dias. Após purificação o conjugado foi previamente congelado e liofilizado

durante aproximadamente 10 horas. O rendimento do processo de conjugação, calculado

pela razão entre a massa do fármaco adicionado e do imobilizado e determinado por

HPLC foi de 95%. As imobilizações dos fármacos nos dendrímeros foram realizadas em

triplicata. A relação entre PGLD e fármacos está representada no quadro 2.2.

Quadro 2.2 Relação entre PGLD e fármacos

Prednisona/ PGLD-G2=1:23 Prednisona/PGLD-G4= 1:22

Meloxicam/PGLD-G2 = 1:302 Meloxicam/PGLD-G4 = 1:228

Metotrexato/ PGLD-G2 = 1:25 Metrotexato/PGLD-G4 = 1:21

45

2.3 Caracterização físico-química

Para a caracterização físico-química foram utilizadas as técnicas de

Espectroscopia vibracional na região do Infra-Vermelho com Transformada de Fourier

(FTIR), Análise Termogravimétrica (TGA) e Calorimetria Exploratória Diferencial

(DSC) dos fármacos (prednisona, meloxicam e metotrexato), dendrímeros (G2 e G4) e

associação dos fármacos com os dendrímeros.

2.3.1 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho por

transformada de Fourier (FTIR)

A Espectroscopia na região do Infra-Vermelho com Transformada de Fourier

(FTIR) é uma ferramenta analítica usada para a detecção de espectros vibracionais de

moléculas orgânicas. Esta técnica baseia-se no fato de que as ligações químicas das

moléculas possuem frequências vibracionais específicas (GARCIA, 2014). A

espectroscopia vibracional é uma ferramenta importante para a caracterização de

estruturas dendríticas, uma vez que a análise dos espectros fornece informações acerca

da caracterização e confirmação da estrutura dendrítica do material (GIAROLA, 2007).

Os espectros foram obtidos pelo equipamento do modelo Spectrum 100, Perkin Elmer,

por reflectância atenuada, com cristal de seleneto de zinco. As amostras foram

colocadas diretamente sobre o cristal do aparelho. Foram realizadas 16 varreduras com

resolução de 4 cm-1

a temperatura ambiente. O intervalo de absorção foi de 4000 a 650

cm-1

. Todas as amostras foram analisadas sobre o cristal e a leitura do branco com

mesma varredura e resolução.

2.3.2 Análise termogravimétrica (TGA)

A termogravimetria foi obtida por equipamento METTLER TG-50, utilizando

cadinho de porcelana. A temperatura de trabalho foi de 25 a 800 °C, com taxa de

aquecimento de 10 °C/min, gás nitrogênio como atmosfera à 30 mL/min. Esses

parâmetros coincidem para todas as amostras.

46

2.3.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)

As curvas da calorimetria diferencial exploratória foram obtidas por equipamento

DSC-60, SHIMADZU, utilizando o cadinho de alumina. As amostras foram de

aproximadamente 5 mg e os testes realizados em temperatura de -100 à 180 °C, com

taxa de aquecimento de 10 °C/min e em atmosfera de nitrogênio com fluxo de 50

mL/min. Todas as amostras foram inicialmente aquecidas e depois resfriadas na mesma

velocidade (10°C) para eliminar a história térmica do material. Para a interpretação da

Tg, considerou-se a segunda corrida do experimento. Os parâmetros foram os mesmos

para todas as amostras.

2.4 Testes de hemocompatibilidade

Para avaliar a hemocompatibilidade dos fármacos, dendrímeros e dos fármacos

associados aos dendrímeros foram realizados os seguintes testes in vitro: Tempo de

Protrombina (TP), Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA), Adesão

Plaquetária e Hemólise.

Estes testes são sensíveis, reproduzíveis e quantificáveis e são utilizados para

verificar a compatibilidade do sangue com fármacos e novos materiais. Apresentam

como vantagem a obtenção de informações do comportamento biológico em curto

período de tempo, sem a necessidade de uso de animais de experimentação (GARCIA et

al., 2009). Inicialmente foram feitos os cálculos para o preparo das soluções e diluições

dos fármacos em solução salina (0,9%) estéril para a realização dos testes. As soluções

dos dendrímeros e dendrímeros associados com os fármacos passaram por um processo

de liofilização para retirada de água. Para realizar os estudos de ativação da coagulação

do plasma foram utilizadas concentrações dos fármacos iguais às encontradas no plasma

de pacientes tratados com prednisona, meloxicam e metotrexato com artrite reumatoide.

Dessa forma, as soluções foram preparadas como segue:

47

Após dose oral única de 7,5 mg de Meloxicam a concentração máxima de

Meloxicam plasmática varia entre 0,4 a 1,0 µG/mL. Dessa forma, a concentração

escolha foi 1,0 µg/mL de Meloxicam nos ensaios de coagulação in vitro (BULÁRIO

ANVISA);

Após injeção subcutânea única de 7,5 mg de Metotrexato a concentração

máxima de Metotrexato plasmática é de 1,1 ± 0,2 µM. Dessa forma, a concentração de

1,3 µM de Metotrexato foi utilizada nos ensaios de coagulação in vitro (GOODMAN

2004);

Após dose oral única de 10 mg de Prednisona a concentração máxima de

Prednisona plasmática varia entre 62 e 81 nG/mL. Dessa forma, a concentração de 80

ng/mL de Prednisona foi utilizada nos ensaios de coagulação in vitro (GOODMAN

2004).

2.4.1 Tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial

ativada (TTPA)

Para avaliar o Tempo de Protrombina (TP) e o Tempo de Tromboplastina

Parcial Ativada (TTPA) foi utilizado um equipamento analisador de coagulação

microprocessado (STAR 4STAGO) e plasma sanguíneo na presença de reagentes

comerciais de acordo com o ensaio realizado. Para a realização dos testes foi coletado

sangue de indivíduo saudável em anticoagulante citrato de sódio 0,38% na proporção de

nove (09) partes de sangue para uma (01) de anticoagulante em tubos de ensaio. Os

tubos foram centrifugados a 3500 rpm por 5 minutos para separar o plasma das células

sanguíneas.

2.4.2 Tempo de protrombina (TP)

No teste TP, na cubeta com o volume máximo de 350μL foi adicionado 100μL

de plasma, 50 μL de solução salina (controle) seguida de incubação a 37°C por 3

minutos. Após este procedimento foram adicionados 200 μL do reagente (cefalina +

ácido elágico) e o tempo necessário para ocorrer a formação do coágulo foi registrado.

Nos testes com os fármacos, dendrímeros PGLD e conjugados PGLD-fármacos foram

adicionados a cubeta 100 μL do plasma, 50 μL do fármaco, dendrímero ou conjugado

PGLD-fármaco que foram previamente diluídos em solução salina (0,9%), com a

48

concentração do fármaco igual à efetiva na circulação sanguínea (descrito anteriormente

no item 2.4) e incubada a 37°C por 3 minutos. Posteriormente foram adicionados 200

μL do reagente (cefalina + ácido elágico) e o tempo necessário para ocorrer a

coagulação foi registrado. Após a obtenção dos valores de TP o equipamento fornece

automaticamente a correlação para obter os dados referente ao INR. Os valores de

referência do TP variam de 11 a 15 segundos e o INR entre 0,9 e 1,2 (TERRA, 2004).

Os valores para os três grupos foram anotados e comparados com os valores de

referência para indivíduos normais.

2.4.3 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA)

Para TTPA foram adicionados na cubeta 100L do plasma, 100L de cefalina

+ácido elágico e 50L de solução salina (controle), fármacos, dendrímeros PGLD e

conjugados PGLD-fármacos. Após este procedimento as cubetas foram incubadas a

37°C por 3 minutos seguido da adição de 100 L de cloreto de cálcio. Foi feita a leitura

dos tempos e os resultados comparados com os valores de referência de indivíduos

normais. Os valores de referência são 30-45 segundos (TERRA, 2004). Para valores

anormais, consideram-se tempos maiores ou ainda menores de 6 segundos dos valores

de referência.

2.4.4 Adesão plaquetária

A adesão plaquetária foi avaliada utilizado equipamento COULTER (modelo

T890) que faz a contagem automatizada das plaquetas no sangue por bioimpedância.

Para a realização deste ensaio o sangue foi coletado em sistema para coleta a vácuo de

indivíduos saudáveis em tubos de ensaio contendo anticoagulante EDTA. Essa técnica

foi descrita em 1956 por Wallace Coulter e baseia-se no fato dos glóbulos vermelhos,

leucócitos e plaquetas serem pobres condutores de eletricidade, enquanto os diluentes

são bons condutores. Essa diferença é à base desse sistema de contagem. Tem-se dois

49

eletrodos de platina mergulhados e separados por um orifício que varia de 60 a 100

micrometros de diâmetro, um no interior do aparelho e o outro no líquido que contém as

partículas que serão contadas. Esse sistema permite que cada partícula que passe pelo

orifício desloque o volume do líquido, modificando a impedância do sistema. Esses

pulsos são amplificados e contados num volume de sangue predeterminado (BACAL,

2009).

2.4.5 Ensaio de hemólise

A hemotoxicidade in vitro foi avaliada utilizando a taxa de hemólise causada

pelos fármacos, dendrímeros, e dendrímeros associados aos fármacos ás hemácias

humanas. O teste foi realizado de acordo com (KHURANA et al., 2013). O sangue foi

coletado de voluntários saudáveis com anticoagulante citrato de sódio 0,38% na

proporção de nove (09) partes de sangue para uma (01) de anticoagulante em tubos de

ensaio. O sangue foi posteriormente centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos e o

sobrenadante descartado. Os eritrócitos (sedimento) foram lavados em solução salina

(0,9%) por 3 vezes para remoção de debris e diluídos em PBS (Phosphate-buffered

saline pH=7,4) com uma concentração final de 2% v/v (solução de uso). As amostras a

serem testadas (fármacos, dendrímeros e dendrímeros + fármacos) foram diluídas em

PBS (pH=7,4) em três concentrações sanguíneas diferentes dos fármacos. Como

controle negativo foi utilizado PBS (pH=7,4) e como controle positivo solução de

saponina a 2mg/mL. Foram adicionados 100µL da suspensão de eritrócitos a 1 mL de

cada amostra a ser testada e seguidas de incubação a 37°C por 1 hora. Após a incubação

a mistura foi centrifugada a 1500g por 10 minutos. O sobrenadante foi analisado em

espectrofotômetro (MICROLAB 100, MERC) em um comprimento de onda de 546 nm.

50

Capítulo3

RESULTADOS E DISCUSSÃO

51

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Espectro de infravermelho com transformada de Fourier

(FTIR)

As figuras apresentadas a seguir mostram as bandas de absorção de FTIR

relativas às vibrações das ligações químicas características dos dendrímeros (Figura

3.1), dos fármacos puros (Figuras 3.3, 3.5 e 3.7) e dos fármacos associados aos

dendrímeros G2 e G4 (Figuras 3.8-3.13). As bandas de absorção dos fármacos

Metotrexato e Prednisona, associados aos dendrímeros G2 e G4, são de baixa

intensidade, provavelmente devido à baixa concentração do fármaco quando comparado

com a quantidade de dendrímero (razão dendrímero: fármaco de aproximadamente

20:1). Nos espectros de FTIR dos dendrímeros G2 e G4 associados com os fármacos

Meloxicam não foram observadas as bandas características do fármaco devido à sua

reduzida concentração quando comparado com a quantidade de dendrímero (razão

dendrímero: fármaco aproximadamente de 302:1 para o G2:fármaco e 228:1 para

G4:fármaco).

52

Figura 3.1 Espectro do FTIR dos dendrímeros G2 e G4

De acordo com a figura 3.1 observa-se que os dendrímeros puros de PGLD, tanto

de segunda geração (G2) como de quarta geração (G4), apresentaram vibrações

importantes características de poliéteres. Entre 3590- 3200 cm-1, a banda corresponde a

vibrações de ligações O-H terminais, as bandas entre 3000-2850 cm-1correspondem a

vibrações assimétricas de CH e entre 1300-1000 cm-1 equivale a estiramento e

deformação axial de C-O (GIAROLA, 2007).

A estrutura química da prednisona e seu espectro de infravermelho estão

representados nas figuras 3.2 e 3.3, respectivamente.

53

Figura 3.2 Estrutura química da prednisona

Figura 3.3 Espectro do FTIR de Prednisona

No espectro de FTIR do fármaco prednisona (Figura 3.3) observa-se, entre

3590- 3200 cm-1

, a banda de vibração de estiramento da ligação O-H, aproximadamente

em 2957 cm-1

aparecem vibrações correspondentes ao estiramento das ligações C-H,

relativas a -CH2, -CH3. O espectro FTIR mostra também duas bandas características de

C=C em 1606 cm-1e 1623 cm-1

e três bandas características de ligações C=O em 1721,

1709 e 1668 cm-1. Abaixo de 1000 cm-1

tem-se a deformação angular de C-H (LI et al,

2009; TOEHWÉ, 2013).

54

Figura 3.4 Estrutura química do meloxicam

Figura 3.5 Espectro do FTIR do Meloxicam

A figura 3.5 representa o espectro FTIR do fármaco Meloxicam puro. A banda

de vibração próxima a 3500 cm-1

é atribuída ao estiramento da ligação N-H, a banda

próxima a 3250 cm-1

corresponde à vibração de estiramento da ligação O-H. A vibração

de estiramento da ligação C=O é observada próxima a 1700 cm-1

. Em 1317 cm-1

se

observa a absorção relativa à vibração da ligação C-N do fármaco. A banda de absorção

em 1154 cm-1

é atribuída às vibrações simétricas de S=O, a banda em 759 cm-1

é

atribuída à vibração da ligação C-S (SHENDE et al, 2015).

55

Figura 3.6 Estrutura química do metotrexato

Figura 3.7 Espectro do FTIR de Metotrexato

O Espectro FTIR do fármaco metotrexato puro (Figura 3.7) apresenta as

seguintes bandas: a banda entre 3500-3300 cm-1

atribuída à vibração da ligação de N-H,

uma banda larga de 3300-3000 cm-1

relativa ao grupamento O-H do ácido carboxílico e

uma banda em 1643 cm-1

relativa à vibração C=O. O anel aromático caracteriza-se por

três bandas em 1491 cm-1

, 1520 cm-1

e 1601 cm-1

.

56

Figura 3.8 Espectro do FTIR de prednisona associado ao dendrímero G2

A figura 3.8 mostra o espectro FTIR do fármaco prednisona associado ao PGLD

de segunda geração (G2). Podemos conferir no espectro FTIR que as bandas de

vibrações em 1721 cm-1

, 1709 cm-1

, 1668 cm-1

, que correspondem a ligações de C=O da

prednisona não sofreram alteração na associação do fármaco com o dendrímero.

(LEONARDI et al, 2007). O perfil do espectro FTIR do G2 permaneceu após a

associação.

57

Figura 3.9 Espectro do FTIR da meloxicam associado ao dendrímero G2

A figura 3.9 mostra o espectro FTIR do meloxicam associado ao dendrímero G2.

Não são observadas diferenças entre o espetro do dendrímero puro e o dendrímero

contendo o fármaco. As bandas de absorção das vibrações características do meloxicam

não foram observadas no espectro FITR devido à baixa concentração do fármaco.

58

Figura 3.10 Espectro do FTIR do metotrexato associado ao dendrímero G2

A figura 3.10 mostra o FTIR do metotrexato associado ao dendrímero G2. No

espectro do dendrímero contendo o metotrexato encontramos as bandas de vibração do

fármaco em 1643 cm-1, que corresponde à ligação C=O, e as vibrações correspondentes

ao anel aromático (1513, 1562 e 1606 cm-1

) que no fármaco puro, aparecem em

menores valores de número de onda (1491 cm-1

, 1520 cm-1

e 1601 cm-1

,

respectivamente). O deslocamento das bandas de vibração deve estar associado à

interação entre o fármaco e o dendrímero G2. Esta interação é confirmada no ligeiro

deslocamento das bandas de vibração da ligação C-O do dendrímero, entre 1300 – 1000

cm-1

.

59

Figura 3.11 Espectro de FTIR de prednisona associado ao dendrímero G2

A seguir discutimos os espectros de FTIR dos fármacos associados no dendrímero

G4. A figura 3.11 mostra o espectro FTIR da prednisona imobilizada no dendrímero G4.

Semelhante aos resultados obtidos para o dendrímero G2 as bandas de absorção de

vibração características do fármaco não mudaram com relação ao espetro de FTIR do

fármaco puro.

60

Figura 3.12 Espectro de FTIR de meloxicam associado ao dendrímero G4

A figura 3.12 mostra o espectro FTIR do fármaco meloxicam associado no

dendrímero G4. Assim como no dendrímero G2 não foram observadas mudanças no

espectro FTIR do dendrímero G4 associado quando comparado com o dendrímero G4

puro.

61

Figura 3.13 Espectro de FTIR de metotrexato associado ao dendrímero G4

A figura 3.13 mostra o espectro FTIR do fármaco metotrexato associado no

dendrímero G4. No espectro a banda de absorção da ligação C=O do fármaco aparece

sobreposta à banda de absorção do G4 nesta região. A banda de absorção em 1520 cm-1

,

de pequena intensidade, pode ser atribuída ao fármaco como pode ser conferido no

espectro FTIR do metotrexato puro (Figura 3.7).

3.2 Análise termogravimétrica (TGA)

O PGLD apresenta grupos OH tanto na periferia (primários), como no interior

(secundários) da macromolécula. A densidade dos grupos OH secundários aumenta

proporcionalmente ao número de geração do PGLD, resultando em um maior número de

ligações de hidrogênio intramolecular, o que poderia conferir maior estabilidade térmica a

estrutura dendrítica (CARNEIRO, 2014). Os resultados da análise termogravimétrica dos

dendrímeros puros, fármacos puros e fármacos associados aos dendrímeros são

apresentados e discutidos a seguir:

62

Figura 3.14 Curvas termogravimétricas de G2 e G4 puros

A figura 3.14 mostra que existe um aumento da estabilidade térmica do PGLD,

uma diminuição no número de etapas de decomposição e um maior teor de resíduo

(material não degradado) à medida que aumenta o número de gerações da macromolécula

de G2 a G4. O dendrímero G2 permanece estável até aproximadamente 74°C. A partir

dessa temperatura apresenta perda de cerca de 65% da massa inicial até 233°C, com maior

velocidade de perda em 227°C como mostra o pico da curva de DTGA. Analisando a

curva termogravimétrica, observamos que permanece estável até 256°C, onde se inicia

uma nova perda com velocidade máxima em 262°C que se estende até 340°C onde se tem

uma perda de aproximadamente 33% da massa e um resíduo de 2% ao final do

experimento.

Observamos na curva termogravimétrica do dendrímero G4 que este mantém sua

estabilidade térmica até aproximadamente 126°C, a partir daí perde 92% da massa inicial

63

até 380°C apresentando dois eventos com velocidades máximas de perda em 256°C e

353°C como mostram os picos da curva de DTGA. Finalmente, observamos que a curva

de TGA do dendrímero G4 apresenta um resíduo de 8% estável até 800°C.

Figura 3.15 Curvas termogravimétricas de G2 puro, prednisona pura e prednisona associada ao

G2.

Na curva TGA da Prednisona pura (Figura 3.15), observamos que esta permanece

estável até aproximadamente 250°C, onde começa sua degradação. A curva mostra que

até 505°C a amostra perde 92,5% de sua massa inicial, ficando um resíduo de 7,5% até

800°C. A curva termogravimétrica do dendrímero G2 associado com a prednisona inicia

sua perda de massa em 85°C, sendo mais estável quando comparado a G2 puro (74°C).

Também se observa que o perfil da curva de degradação muda significativamente, pois, a

degradação do dendrímero G2 puro que acontecia em três estágios, ocorre quase

completamente até 250ºC, apresentando um evento importante com velocidade máxima

de perda de massa em 220°C, como mostra o pico da curva DTGA. A segunda etapa de

degradação aparece na mesma faixa de temperatura do G2 puro, entre 250ºC e 350ºC.

Finalmente a curva termogravimétrica da prednisona associada ao G2 mostra que até

800°C a degradação é completa, pois não há resíduo. Os resultados obtidos sugerem que

64

existe uma forte interação entre a prednisona e o G2. Podemos concluir que a prednisona

influencia consideravelmente o mecanismo de degradação do dendrímero G2. A

degradação da prednisona associada ao G2 não é observada de maneira independente na

curva termogravimétrica devido à sua baixa concentração.

Figura 3.16 Curvas termogravimétricas de G2 puro, meloxicam puro e meloxicam associado ao

G2.

A análise termogravimétrica do meloxicam puro mostra estabilidade térmica até

70°C, a partir daí ocorre perda de 10% da massa inicial até 100°C, provavelmente pela

perda de água da molécula. Esse evento apresenta maior velocidade de perda em 98°C,

visualizado através do pico da curva DTGA. Após a primeira perda de massa a curva de

TGA apresenta uma estabilidade até 207°C, quando se inicia uma perda que vai até 400°C

correspondendo a 60% da massa. Finalmente, o meloxicam continua degradando até

800ºC e perde 20% de massa, ficando um resíduo de 10% a 800ºC. A curva

termogravimétrica do meloxicam associado com o G2 mostra um perfil de degradação

semelhante ao da prednisona associada ao G2. Porém, podemos afirmar que o meloxicam

65

confere uma maior estabilidade, pois a temperatura que corresponde a maior velocidade

de perda de massa é mais alta para a associação com meloxicam (240°C) do que para a

associação com prednisona (220°C). Pode-se dizer que existe uma forte interação entre o

meloxicam e o G2 que se manifesta na maior estabilidade térmica da associação quando

comparado com G2 puro. A estrutura química de ambos os fármacos apresentam grupos

estabilizadores de radicais livres, o que poderia explicar a estabilidade que ambos

conferem ao G2.

Figura 3.17 Curvas termogravimétricas de G2 puro, metotrexato puro e do metotrexato associado

ao G2.

Na figura 3.17 se observa que o metotrexato puro tem uma perda de massa de 10%

referente à perda de água da molécula até 70°C. Depois manteve certa estabilidade até

250°C, onde teve início sua maior perda de massa, com maior velocidade em 256°C. Até

500ºC se observa uma perda de 60% da massa inicial, após esta temperatura a degradação

continua até 800ºC, perdendo-se aproximadamente um 77,5% da massa inicial. A 800ºC a

curva de TGA mostra um resíduo de 22,5%. Quando o fármaco metotrexato é associado

ao G2 se observa um comportamento semelhante ao observado com os fármacos

anteriormente estudados. Porém, pela análise da curva termogravimétrica podemos

66

afirmar que a estabilização térmica do G2 na presença do metotrexato é ainda maior que a

observada com os outros fármacos. A curva DTGA mostra uma maior velocidade de

degradação a uma temperatura mais alta, aproximadamente em 250ºC.

Figura 3.18 Curvas termogravimétricas de G4 puro, prednisona pura e a prednisona associada ao

G4.

Como tínhamos concluído anteriormente o dendrímero G4 apresenta maior

estabilidade térmica se comparado ao G2. Isto é explicado pela maior densidade de grupos

OH secundários, no G4, que aumentam a interação intramolecular. Esta maior interação

deve também ser a causa da menor associação do fármaco prednisona na matriz do

dendrímero. Pois a curva termogravimétrica da prednisona associada ao G4, como mostra

a Figura 18, não muda significativamente o perfil de degradação do dendrímero G4 puro.

67

Figura 3.19 Curvas termogravimétricas de G4 puro, meloxicam puro e o meloxicam associado ao

G4.

A figura 3.19 mostra a curva termogravimétrica do meloxicam associado com o

G4. A curva de TGA mostra um perfil de degradação semelhante ao da prednisona

associada ao G4, indicando que a presença do meloxicam não influencia na degradação

térmica do dendrímero G4.

68

Figura 3.20 Curvas termogravimétricas de G4 puro, metotrexato e G4 associado ao metotrexato

A figura 3.20 apresenta os dados termogravimétricos do metotrexato associado ao

dendrímero G4. Semelhante ao ocorrido com os fármacos anteriores pode-se concluir a

partir da curva de TGA que o perfil de degradação do metotrexato associado ao G4 não

muda quando comparado ao dendrímero G4 puro, sugerindo que o metotrexato não

influencia na degradação térmica do dendrímero G4.

3.3 Calorimetria diferencial exploratória (DSC)

A calorimetria diferencial exploratória é uma técnica de analise térmica que

permite obter experimentalmente as temperaturas e o fluxo de calor associado com as

transições dos materiais em função da temperatura e do tempo. Estas transições podem

estar associadas a alterações físicas e químicas, como transição de fase de primeira ordem

(fusão, cristalização) ou segunda ordem (transição vítrea - borrachosa) e reações químicas

de reticulação, decomposição, desidratação ou dissociação (MOTHÉ, 2009).

69

Nesse trabalho, a análise DSC foi feita com o objetivo de encontrar a temperatura

de transição vítrea (Tg) dos dendrímeros de poliglicerol e avaliar sua mudança após a

associação do PGLD de segunda geração (G2) e quarta geração (G4) com os fármacos

utilizados no estudo. Os resultados obtidos são apresentados e discutidos a seguir:

Figura 3.21 Curvas DSC normalizadas de segundo aquecimento de G2 e G4

A partir da figura 3.21 podemos obter os valores da temperatura de transição vítrea

– borrachosa (Tg) dos dendrímeros puros. A Tg é uma transição endotérmica de segunda

ordem que se caracteriza por uma mudança de inclinação na curva fluxo de calor versus

temperatura, a Tg de G2 é de -69°C e a Tg de G4 é -55°C. Observamos que com o

aumento do número de gerações da macromolécula ocorre um aumento significativo da

Tg. Como tínhamos discutido na análise termogravimétrica, o aumento da geração

acarreta o aumento da densidade de grupo OH secundários, aumentando assim a

magnitude das interações intramoleculares e, portanto dificultando a mobilidade

molecular da macromolécula. Assim a Tg (relacionada macrocospicamente com a

70

temperatura na qual a macromolécula passa de um estado vítreo a uma mobilidade

restringida a segmentos de até 12 átomos de carbono) aumenta de acordo com o número

de gerações do dendrímero (de G2 a G4), onde existe maior rigidez devido ao maior grau

de interações intramoleculares.

Figura 3.22 Curvas DSC normalizadas de segundo aquecimento dos fármacos puros

Os fármacos puros não apresentam temperatura de transição vítrea – borrachosa

(Tg) por serem substâncias simples de baixa massa molecular. Mas como são substâncias

cristalinas apresentam transição de primeira ordem, relacionada à fusão da fase cristalina

(Tf). A Tf é uma transição endotérmica e se caracteriza por um pico na curva de fluxo de

calor versus temperatura. As curvas de DSC da figura 3.22 foram conduzidas até 180ºC

para evitar a degradação dos fármacos e dos dendrímeros, que como foi observado nas

curvas de TGA começa próximo a 200ºC.

71

Figura 3.23 Curvas DSC normalizadas de segundo aquecimento dos fármacos associados ao G2.

A figura 3.23 apresenta as curvas de DSC dos compostos formados a partir da

associação dos fármacos (prednisona, meloxicam e metotrexato) com o PGLD de segunda

geração (G2). A transição vítrea – borrachosa é observada em todos os dendrímeros G2,

podendo-se comprovar que independentemente do fármaco a Tg não muda de maneira

significativa se comparado ao G2 puro. Isto sugere que no G2, estrutura com menor

densidade de grupos OH secundários, a interação fármaco-G2 (comprovada por TGA) não

afeta a mobilidade da cadeia macromolecular do G2.

72

Figura 3.24 Curvas DSC normalizadas de segundo aquecimento dos fármacos associados ao G4

A partir da curva de DSC da figura 3.24, podemos concluir que a Tg do

dendrímero G4 associado com os fármacos prednisona e meloxicam não muda

significativamente, devido ao fato de que a interação que prevalece é a forte interação

entre os OH secundários da matriz do dendrímero. Porém, um ligeiro aumento na Tg é

observado na curva de DSC do dendrímero G4 associado ao fármaco metrotrexato. A Tg

aumenta de -55ºC no G4 puro a -51°C no G4 contendo metotrexato. Não podemos atribuir

este aumento de rigidez ao aumento na interação entre o fármaco e os grupos OH

secundários (internos) da estrutura do G4, pois os resultados de TGA mostraram que os

fármacos apresentam mais dificuldade de difundir para o interior do dendrímero quando

aumenta a densidade de grupos OH de acordo com o aumento da geração (de G2 a G4).

Mas, considerando que a Tg envolve mobilidade intra e intermolecular, podemos sugerir

que nos dendrímeros de maior geração a interação favorecida é entre o fármaco e os

grupos OH primários (exteriores) da estrutura dendrítica. Então, podemos concluir a partir

dos resultados, que o dendrímero G4 interage com maior intensidade com o fármaco

metotrexato, o que se manifesta em uma menor mobilidade do dendrímero e, portanto, um

ligeiro aumento na Tg.

73

3.4 Hemocompatibilidade

A hemostasia é um processo multifuncional, complexo e de regulação finamente

controlada, envolvendo a participação de diversos componentes fisiológicos celulares e

acelulares, incluindo a parede vascular e a membrana basal, microfibrilas e colágeno,

ativação plaquetária e as cascatas de coagulação da fibrinólise (BERGERet al., 2014).

Avaliações da interação do material com o sangue indicam respostas biológicas relevantes

como, por exemplo, a adesão e agregação plaquetária causadas pela adsorção de proteínas

à superfície do material, que pode vir a ocasionar a formação de trombos (BRAUNE,

2011).

Estudos recentes sobre a hemocompatibilidade de polímeros epoxídicos

demonstraram que esses materiais possuem boas propriedades de antitrombogenicidade

e adequada ausência de citotoxicicidade, sugerindo que tais materiais possuem

propriedades biológicas favoráveis para aplicações de revestimentos em dispositivos

cardiovasculares (GONZALES GARCIA et al., 2016).

3.4.1 Tempo de protrombina, INR e Tempo de tromboplastina parcial

ativada

As hemácias, os leucócitos e as plaquetas podem ser profundamente afetados pelo

contato com as superfícies dos dendrímeros sintéticos. Fenômenos como a adesão e a

agregação plaquetária (que regulam a homeostasia e a coagulação) podem ser

desencadeados, deprimindo significativamente a função das células sanguíneas.

A finalidade da coagulação sanguínea é formar um coágulo no local da lesão

vascular. Além da formação do coágulo, que funciona como um tampão para evitar a

hemorragia, esta ação pró-coagulante deve ser restrita ao local da lesão, ou seja, ela não

pode disseminar-se pelo sistema circulatório. Assim, no momento em que ocorre a lesão

vascular, também se desencadeia a ação do sistema fibrinolítico e dos inibidores

fisiológicos da coagulação.

O modelo proposto por Macfarlane e Davie&Ratnoff, em 1964, da “cascata”

para explicar a fisiologia da coagulação do sangue, usado ainda hoje por razões

didáticas, divide a coagulação em uma via extrínseca e uma via intrínseca que

74

convergem no ponto de ativação do fator X (início da via final ou comum). O TP avalia

a via extrínseca da coagulação, portanto avalia os fatores VII (via extrínseca) e X, V, II

e I (via comum). O TTPA avalia a via intrínseca da coagulação, portanto avalia os

fatores VIII, IX, XI e XII, bem como os fatores X, V, II e I da via comum. É o teste

indicado, juntamente com o TP, quando há queixas hemorrágicas e nas rotinas pré-

operatórias.

O resultado do Tempo de Protrombina é expresso em números de segundos

levados desde a adição do reagente TP até a formação do coágulo de fibrina. No

resultado pode-se incluir o Tempo de Protrombina (TP), e a Relação entre o Paciente e

um Controle Normal (obtido pela determinação do TP de um plasma ou “pool” de

plasma conhecidamente normal) e da Relação Internacional Normalizada ou INR da

sigla em inglês “International Normalized Ratio”. O cálculo é feito da seguinte forma:

O INR deve sempre ser informado, especialmente em pacientes submetidos à

terapia anticoagulante. Os valores de referência do TP são 11-15 s e INR entre 0,9 e 1,2.

O resultado do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado é expresso em números

de segundos levados desde a adição do reagente Cloreto de Cálcio até a formação do

coágulo de fibrina. Em geral, testes para TTPA com plasmas normais apresentarão tempos

de formação do coágulo que variam de30-45 segundos.

Foram realizados os ensaios de TP e TTPA com os fármacos puros, dendrímeros

G2 e G4 puros e para as associações de fármacos com dendrímeros. Os resultados

desses experimentos estão representados abaixo:

INR = __________TP do paciente___________

TP do “pool” de plasmas normais do dia

ISI

75

0

3

6

9

12

15

C PRED MEL MET G2 PRED MEL MET

G2

A

Te

mp

o (

s)

Limite de normalidade para o teste de TP

0

3

6

9

12

15

B


G4

Te

mp

o (

s)

Limite de normalidade para o teste de TP

Figura 3.25 Gráfico do TP para os fármacos puros, G2 puro e ambos associados (A) e gráfico

do TP para fármacos puros, G4 puro e associações(B).

A figura 3.25 (A) mostra que dos tempos obtidos para os fármacos puros, o

metotrexato apresentou valor igual ao limite normal superior (tempo médio 15,0

segundos), prednisona e meloxicam apresentaram valores normais. Já o tempo de

protrombina para G2 puro e associado com metotrexato apresentaram valores iguais ao

limite normal superior para TP (tempo médio de 15,0 segundos), prednisona e

meloxicam associados a G2 obtiveram valores dentro da normalidade. Esses dados

mostram que os dendrímeros de poliglicerol de segunda geração (G2), tanto isolados

quanto associados com os fármacos, não interferem no tempo de protrombina (TP) do

76

sangue, indicando que esse material pode ser usado com segurança, pois não induziu

alteração da via extrínseca da coagulação do sangue.

Na figura 3.25 (B) notamos que para o teste de protrombina (TP) de G4 puro e

suas associações todos os grupos apresentaram valores normais para o tempo de

protrombina. Dessa forma, os resultados apresentados mostram que a interação do

PGLD de quarta geração (G4) com os fármacos para tratamento da artrite reumatoide

não interferiram na via extrínseca da coagulação, indicando que o material estudado

pode ser utilizado com segurança em contato com a corrente sanguínea.

77

0

10

20

30

40


G2

AT

em

po

(s

)

Limite de normalidade para o teste de TTPA

0

10

20

30

40


G4

B

Te

mp

o (

s)

Limite de normalidade para o teste de TTPA

Figura 3.26 Gráfico do TTPA para os fármacos puros, G2 puro e ambos associados (A) e

gráfico do TP para fármacos puros, G4 puro e associações(B).

A figura 3.26 mostra que os tempos obtidos para os fármacos puros, G2 e G4

puros e as associações dos dendrímeros com os fármacos se encontram dentro dos

padrões de normalidade para o tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA). Esses

dados indicam que os dendrímeros de poliglicerol de segunda geração (G2) e quarta

geração(G4) e suas associações com os fármacos em estudo não interferem na via

intrínseca da coagulação avaliada no teste de TTPA. Todos os testes realizados

78

apresentaram valores dentro dos padrões de normalidade, indicando que o poliglicerol

com estrutura dendrítica pode ser usado com segurança, confirmando ser este um

material promissor como transportador de fármacos para utilização local ou sistêmica

para tratamento da artrite reumatoide.

O exame mais utilizado na prática clínica para controle da coagulação é o TP

com a razão de normatização internacional (INR). O INR é um método de calibração do

TP com o objetivo de reduzir a variação no resultado do TP, entre diferentes

laboratórios clínicos. As médias dos INR obtidas no experimento estão representadas

na tabela abaixo:

Tabela 3.1. Valores de INR.

COMPOSTO INR

(MÉDIA)

COMPOSTO INR

(MÉDIA)

COMPOSTO INR

(MÉDIA)

Dendrímero 1,05 G2 1,11 G4 1,05

Prednisona 1,05 G2+ Prednisona 1,11 G4+ Prednisona 1,05

Meloxicam 1,11 G2+Meloxicam 1,11 G4+Meloxicam 1,05

Metotrexato 1,11 G2+Metotrexato 1,11 G4+Metotrexato 1,05

A tabela 3.1 mostra que os valores de INR se encontram dentro dos padrões de

normalidade (de 0,9 a 1,2). Os dados indicam que G2 e G4 puros e os compostos

resultantes de suas associações não interferiram nos índices de INR quando em contato

com o sangue humano, confirmando que os dendrímeros de poliglicerol não interferem

na via extrínseca da coagulação, o que já foi demonstrado no teste de TP (Figura 3.25)

3.4.2 Adesão plaquetária

Os fatores da coagulação e as células envolvidas no processo podem interagir com os

materiais nanoestruturados e promover a formação de coágulo sanguíneo. Essas

características dependem diretamente da constituição dos componentes desses sistemas

e não são desejáveis quando se trata de materiais para serem utilizados em contato com

79

a corrente sanguínea. Por isso os dendrímeros de poliglicerol foram avaliados quanto á

sua capacidade de promover a adesão plaquetária em sua superfície.

Após a contagem automatizada das plaquetas realizada no controle, nas soluções

dos fármacos puros, dendrímeros de poliglicerol de segunda geração (G2) e quarta

geração (G4) puros e os compostos formados após associação os resultados obtidos

estão representados na figura 3.27.

0

100000

200000

300000

400000


G2

A

Limite de normalidade para o teste de Adesão Plaquetária

Pla

qu

eta

s/m

m3

0

100000

200000

300000

400000


G4

B

Limite de normalidade para o teste de Adesão Plaquetária

Pla

qu

eta

s/m

m3

Figura 3.27 Gráfico das plaquetas/mm³ de sangue dos fármacos puros, G2 puro e associações

(A) e gráfico dos fármacos puros, G4 puro e suas associações (B).

80

Na figura 3.27 observa-se que para os fármacos isolados, G2 e G4 puros e suas

associações o número de plaquetas por milímetro cúbico de sangue está dentro dos

valores normais que são de 150000 a 450000/mm³ de sangue. Esses dados indicam que

não ocorreu adesão plaquetária na superfície dos materiais estudados, o que nos leva a

concluir que o poliglicerol dendrítico é um sistema nanoestruturado com características

desejáveis para aplicação sistêmica por não induzir adesão plaquetária e

consequentemente não ocorrer formação de coágulos sanguíneos.

3.4.3 Ensaio de hemólise

A hemólise pode causar a liberação de hemoglobina assim como a liberação de

componentes intracelulares e substâncias tromboplásticas pela ruptura de eritrócitos,

que ativam o sistema de coagulação (MOHAN, 2013).

As porcentagens de hemólise resultantes das amostras em contato com o sangue

humano estão ilustradas na tabela abaixo:

Tabela 3.2 Valores de porcentagem de hemólise após exposição aos compostos estudados

Composto %Hemólise 1/3 X* %Hemólise X

* %Hemólise 3X

*

Prednisona 0,23 0,44 1,1

Metotrexato 1,7 1,5 1,9

Meloxicam 0 0 1,6

G2 Puro 1,2 0,8 1,7

G4 Puro 0,7 1,0 1,0

Prednisona+G2 0 0 0

Prednisona+G4 0 0,4 0

Metotrexato+G2 1,2 1,7 1,0

Metotrexato+G4 1,2 1,2 1,5

Meloxicam+G2 0,5 0 1,0

Meloxicam+G4 0 0 0

*X= Concentração que o fármaco atinge na circulação sanguínea

81

Os dados da tabela 3.2 mostram que a taxa de hemólise dos fármacos puros, G2

e G4 puros e suas associações podem ser classificados como não hemolíticos por

apresentarem taxas de hemólise abaixo de 2% segundo o protocolo internacional

E2524-08 de 2013, Standard Test Method for Analysis of Hemolytic Properties of

Nanoparticles da American Society for Testing and Materials para o estudo das

propriedades hemolíticas de nanopartículas (DOBROVOLSKAIA & MCNEIL, 2013).

Os testes de hemocompatibilidade mostraram que não houve alteração na

estabilidade do sangue quando em contato com os fármacos prednisona, meloxicam e

metotrexato, G2 e G4 e com os compostos formados após conjugação, uma vez que os

testes utilizados para avaliar a hemocompatibilidade permaneceram dentro dos padrões

de normalidade.

82

.

Capítulo 4

CONCLUSÃO

83

4 CONCLUSÃO

Os dados obtidos utilizando as técnicas físico-químicas nos permitem sugerir que

ocorreu a conjugação dos fármacos estudados com os dendrímeros de poliglicerol de

segunda geração (G2) e quarta geração (G4).

Os testes de hemocompatibilidade mostraram que os fármacos puros, dendrímeros

puros e os fármacos conjugados aos dendrímeros são hemocompatíveis.

4.1 Perspectivas futuras

Além da necessidade evidente do desenvolvimento de novos fármacos mais

eficazes e que trazem menos efeitos adversos aos pacientes ressalta-se que muitos

tratamentos são realizados com fármacos biológicos que muitas vezes são importados e

acabam por gerar gastos elevados por parte do Governo Brasileiro e da população.

Desta forma, observa-se uma enorme necessidade de desenvolvimento científico e

tecnológico brasileiro na área de nanofármacos que podem ser administrados localmente

no sítio da inflamação ou que podem ser dirigidos para liberação da droga no local

desejado. Futuramente, durante o doutorado será analisado o processo de interação dos

fármacos com o PGLD através da ressonância magnética nuclear (RMN) e ensaios in

vivo induzindo artrite em animais de experimentação para avaliação da citotoxicidade e

eficácia dos nanofármacos na redução do processo inflamatório, induzido na artrite

reumatoide.

84

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