ESTUDO DAS PROJEÇÕES NEUROANATÔMICAS DOS NÚCLEOS CAUDAIS DA RAFE PARA A ÁREA

PRESSORA CAUDAL

Marcio Vinicius Moreira Vianna

Dissertação de Mestrado em Ciências Fisiológicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas Universidade Federal do Espírito Santo

Vitória, setembro de 2007.

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ESTUDO DAS PROJEÇÕES NEUROANATÔMICAS DOS NÚCLEOS CAUDAIS DA RAFE PARA A ÁREA

PRESSORA CAUDAL.

Marcio Vinicius Moreira Vianna

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da

Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do grau de

Mestre em Ciências Fisiológicas.

Aprovada em 18/09/2007 por:

___________________________________________________ Prof. Dr. Henrique de Azevedo Futuro Neto - Orientador, UFES.

_____________________________________________ Prof. Dr. Nyam Florencio da Silva – Co-orientador, UFES.

_______________________________________________

Profa. Dra. Maria das Graças Corrêa de Faria, EMESCAM.

Universidade Federal do Espírito Santo

Vitória, setembro de 2007.

Vianna, Marcio Vinicius Moreira, 1976. Estudo das projeções neuroanatômicas dos núcleos caudais da rafe para a área pressora caudal. [Vitória] 2007 Viii, 71p., 29,7 cm (UFES, M. Sc., Ciências Fisiológicas, 2007) Dissertação, Universidade Federal do Espírito Santo, PPGCF.

Agradeço a Deus, por ser a fonte de

minhas forças nos momentos mais difíceis.

E dedico este trabalho a minha mãe Olga

Moreira Vianna, a memória de meu pai

Dirley Rody Vianna, minha irmã Márcia e

minhas sobrinhas, que através do amor e

carinho, me incentivaram e me apoiaram

na busca do meu crescimento pessoal e

profissional.

AGRADECIMENTOS

A Deus por sua proteção divina em cada momento de minha vida.

A minha mãe Olga Moreira Vianna, que sempre me apoiou e incentivou, e que

sempre acreditou em mim, fazendo-me crer na minha capacidade e competência.

Agradeço minha irmã Márcia Moreira Vianna da Costa que, apesar da distância que

nos separa, esteve presente nas decisões mais importantes da minha vida. Sempre

com amizade e carinho com seu irmão que tanto te ama.

Ao Prof. Henrique de Azevedo Futuro Neto, ao qual admiro por sua competência e

amizade, e pela oportunidade para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. José Guilherme Pinheiro Pires, pelo seu apoio e amizade, e pela atenção

demonstrada sempre que sua ajuda era solicitada, sendo no desenvolvimento deste

trabalho ou não.

Ao Prof. Nyam Florencio da Silva, companheiro de Laboratório, pela valiosa

colaboração na realização deste trabalho e por superar minhas “teimosias” com

paciência e respeito, sendo capaz de me orientar tanto nos assuntos profissionais

quanto em questões pessoais que levarei comigo por toda a minha vida.

Aos amigos do laboratório de Neurofisiologia com os quais passei importantes

momentos de alegria e descontração e, pela confiança e compreensão que recebi

de cada um.

A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas,

pela orientação e incentivo dedicado aos alunos, determinando uma boa formação.

Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação, amigos, colaborando para o êxito

deste trabalho.

SUMÁRIO

• FOLHA DE ROSTO i

• FICHA CATALOGRÁFICA ii

• DEDICATÓRIA iii

• AGRADECIMENTOS iv

• SUMÁRIO v

• RESUMO vi

• ABSTRACT viii

• INTRODUÇÃO 10

• 1.1 ÁREA ROSTROVENTROLATERAL BULBAR (RVLM) 11

• 1.2 ÁREA CAUDOVENTROLATERAL BULBAR (CVLM) 13

• 1.3 ÁREA PRESSORA CAUDAL (CPA) 14

• 1.4 NÚCLEOS DA RAFE 16

• 1.5 DESCRIÇÃO DA TÉCNICA DE MARCAÇÃO COM HORSERADISH

PEROXIDASE (HRP) 25

• 2. OBJETIVOS 27

• 2.1. OBJETIVO GERAL 27

• 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27

• 3. MATERIAL E MÉTODOS 28

• 4. RESULTADOS 32

•••• 5. DISCUSSÃO 45

•••• 6. CONCLUSÃO 51

•••• 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFIAS 53

RESUMO

ESTUDO DAS PROJEÇÕES NEUROANATÔMICAS DOS NÚCLEOS CAUDAIS

DA RAFE PARA A ÁREA PRESSORA CAUDAL BULBAR.

Objetivos: Estudos prévios demonstram que as respostas cardiovasculares

induzidas por estimulação de núcleos caudais da rafe são em parte mediadas pela

área pressora caudal (CPA). O presente estudo visa identificar a existência de

projeções eferentes dos núcleos caudais da rafe; Magno (RMg), Pálido (RPa) e

Obscuro (NRO), para a CPA.

Métodos: Seis ratos Wistar machos (270-300 g), anestesiados com cloral hidratado

(0,4g/kg, i.p.), foram posicionados no aparelho estereotáxico para microinjeções

unilaterais na CPA (1,0mm caudal e 1,7mm lateral ao óbex; 2,0mm da superfície

encefálica) do traçador axonal retrogrado horseradish peroxidase (HRP; 20%;

dissolvido em salina; 50nl). Os animais foram mantidos vivos durante dois a três

dias, tempo necessário para permitir o deslocamento retrogrado intraneuronal do

traçador. Em seguida os ratos foram profundamente anestesiados e perfundidos

transcardiacamente com 500 ml de solução salina; 500 ml de paraformaldeido 1% e

glutaraldeído 1,25% em tampão fosfato 0,1M (pH 7,6). O tronco cerebral foi retirado

e seccionado (micrótomo de congelamento) com uma espessura de 40 µm e tratado

com Diaminobenzidina a 0,05%. Esta reação promoveu uma coloração marrom no

pericário dos neurônios marcados. As secções foram coradas com vermelho neutro

e os neurônios marcados visualizados com o auxílio do microscópio óptico, sendo

suas coordenadas analisadas de acordo com o atlas estereotáxico (Paxinos e

Watson, Acadamic Press, 1986).

Resultados: Foram encontrados neurônios marcados em todos os três núcleos da

rafe caudal. A distribuição dos neurônios marcados nos 6 ratos estudados foi a

seguinte:

No RMg foram vistos neurônios marcados nos ratos 1, 2 e 3. Totalizando 10

neurônios marcados.

No RPa foram vistos neurônios marcados nos ratos 1, 3, 4 e 5. Totalizando 14

neurônios marcados nestes animais.

No NRO foram visto neurônios marcados nos ratos 2, 3, 4, 5 e 6. Totalizando 11

neurônios marcados.

No RMg, os neurônios marcados estavam situados de -11,30 mm a -11,60 mm

caudal ao Bregma (10 neurônios), estando a maioria (7 neurônios) em -11,60 mm,

com profundidade entre 10,4 mm e 10,7 mm da superfície externa do crânio. O RMg

foi a região de menor dispersão dos neurônios marcados rostro-caudalmente, visto

que num total de 10 neurônios marcados, 7 estavam a -11,60 mm caudais ao

Bregma. No RPa os neurônios foram encontrados entre -11,30 mm e -12,80 mm

caudal (14 neurônios), com profundidade de 10,8 mm a 11,1 mm, estando o maior

numero a -11,60 do Bregma (5 neurônios). No NRO os neurônios foram marcados

entre -11,60 mm a -12,72 mm caudal ao Bregma (11neurônios), 8 destes entre

-11,60 mm e -11,80 mm, e profundidade variando entre 10,0 mm a 10,8 mm dorso-

ventral. Apenas um neurônio foi encontrado na profundidade de 10,8 mm no NRO a

-11,96 mm do Bregma.

Conclusão: O estudo demonstra a presença de projeções eferentes

monossinapticas dos núcleos RMg, NRO e RPa para a CPA. E que a grande maioria

destas projeções, possuem suas origens entre -11,60 mm a -11,80 mm do Bregma.

Com base nestas evidencias é possível sugerir que estas projeções estejam

relacionadas, pelo menos em parte, com o controle das atividades cardiovasculares

em ratos.

ABSTRACT

NEUROANATOMICAL PROJECTIONS FROM THE CAUDAL RAPHE NUCLEI TO

THE CAUDAL PRESSOR AREA IN THE RAT

Objective: Previous studies have shown that cardiovascular effects induced by

stimulation of caudal raphe nuclei are partially mediated by the caudal pressor area

(CPA). The present study demonstrates the existence of projections from the magnus

(RMg), pallidus (RPa) and obscurus (ROb) raphe nuclei to the CPA.

Methods and Results: 6 Male Wistar rats (270-300 g), anesthetized with chloral

hydrate (0.04 g/kg, i.p.), were put in the estereotaxic set for unilateral microinjections

of horseradish peroxidase (HRP) into the CPA (1.0 mm caudal and 1.7 mm lateral to

the Óbex; 2.0 mm from brain surface). HRP, an retrograde axonal tracer, was

dissolved in saline to 20% and the microinjection volume was 50 nL. The animals

were kept alive for 2-3 days, to allow the intraneuronal retrograde diffusion of the

tracer. The rats were deeply anesthetized and perfused through the left ventricle with

500 mL saline + 500 mL paraformaldehyde 1% plus glutaraldehyde 1.25% in

phosphate tampão 0.1 M (pH 7.6). The brainstem was taken out and sectioned

(freezing microtome) with a thickness of 40 µm and treated with diaminobenzydine

0.05%. This reaction promoted a brown color in the pericarium of the marked

neurons. The sections have been colored with neutral red and the marked neurons

were visualized by optical microscopy. The coordinates were according to the

estereotaxic atlas of Paxinos and Watson. Marked neurons have been found in all

three studied raphe nuclei. In a total of 6 rats, 3 showed markings in the RMg, 4 in

the RPa and 5 in the ROb. In the RMg, the marked neurons were allocated from

-11.30 mm to -11.60 mm caudal to Bregma (10 neurons), being most (7 neurons) in

-11.60 mm, with depth between 10.4 mm and 10.7 mm of the external brain surface.

The RMg has been the region of smaller dispersion of the neurons rostro-caudally

marked, once in a total of 10 neurons marked, 7 were -11.60 mm caudal to the

Bregma. In the RPa the neurons have been found between -11.30 mm and -12.80

mm caudal (14 neurons), with profundity from 10.80 mm to 11.1 mm, being the

biggest number -11.60 mm of the Bregma (5 neurons). In the ROb the neurons

have been marked between -11.60 mm and -12.72 mm caudal to Bregma

(11 neurons), 8 of them between -11.60 mm and -11.80 mm and depth varying from

10.0 mm to 10.80 mm ventral-dorsally.

Conclusion: The study shows the presence of efferent projections from the nuclei

RMg, ROb and RPa to the PCA. Based on these evidences it is possible to suggest

that these projections were related to the cardiovascular effects elicited by stimulation

of these caudal raphe nuclei in rats.

10

1. INTRODUÇÃO

A perfusão sanguínea apropriada é garantida pela manutenção da força

motriz da circulação, ou seja, a pressão arterial em níveis adequados e

razoavelmente constantes ao longo da vida. Desde o final do século XIX, busca-se

demonstrar a localização da(s) estrutura(s) neurais responsáveis pelo controle

cardiovascular e conseqüentemente a manutenção adequada da pressão arterial. Ao

constatar que secção da porção cervical da medula espinhal promovia uma resposta

depressora nos parâmetros cardiovasculares, Claude Bernard em 1863 (apud

Gebber, 1990) relatou a importância do sistema nervoso central no controle

cardiovascular.

Entretanto, somente dez anos depois, Dittmar em 1873 (apud Gebber, 1990)

realizando experimentos com transecções coronais sucessivas do eixo neural,

conseguiu demonstrar pela primeira vez, a participação do bulbo na manutenção da

pressão arterial (PA). Realizando transecções do tronco cerebral em níveis

sucessivamente mais caudais em coelhos curarizados, Dittmar observou que a

integridade do bulbo era fundamental para manutenção PA. Além disso, demonstrou

ainda que a destruição da região ventral bulbar era capaz de produzir hipotensão

arterial, e que o mesmo não ocorria quando se destruía a região dorsal do bulbo.

Estes achados sugeriam que as estruturas responsáveis pela manutenção da PA

estavam localizadas na face ventral do bulbo introduzindo, na época, o conceito de

centro vasomotor.

Em 1901, Bayliss, lançou a hipótese da existência de um centro vasomotor,

constituído de áreas pressoras e depressoras que atuariam reciprocamente na

manutenção da PA. Wang & Ranson (1939), com o advento da técnica

estereotáxica, identificaram regiões pressoras e depressoras, esparsamente

situadas em toda formação reticular bulbar, que se estendiam desde a região dorsal

até a ventral do bulbo, resultado posteriormente confirmado por Alexander (1946).

Tais resultados, no entanto, foram obtidos através de estimulação elétrica,

que interferem não somente em corpos celulares como também em fibras de

passagem, não sendo possível, portanto, a afirmação que os neurônios

responsáveis pela manutenção e regulação da PA estavam realmente localizados

nas regiões onde a estimulação havia sido efetuada.

11

Schlaefhe & Loeschke em 1967, estudando o controle da respiração realizado

através da participação do bulbo, observaram que o congelamento de áreas

bastante restritas da superfície ventral bulbar produzia não somente alterações

respiratórias, como também queda da PA. Entretanto, a utilização do congelamento

nestes experimentos não permitiu ainda concluir se a hipotensão observada era

resultante da inativação de células ou de fibras de passagem.

Graças aos experimentos pioneiros de Feldberg & Guertzenstein em 1972,

onde, utilizando substâncias que atuam preferencialmente em corpos celulares

neuronais (não interferem nas fibras de passagem), foi possível observar alterações

da pressão arterial nas áreas descritas anteriormente por Schlaefke & Loeschke.

Estes autores demonstraram que a aplicação de pentobarbital sódico, GABA (ácido

gama-aminobutírico) e glicina, em uma região bastante delimitada da superfície

ventrolateral do bulbo de gatos, produzia queda da PA a níveis semelhantes ao

observados em animais espinais agudos. Tendo a glicina e o GABA uma ação pós-

sináptica, a hipotensão observada durante a aplicação tópica desses aminoácidos

na região rostroventrolateral do bulbo indicava que as células responsáveis pela

manutenção da PA estavam situadas nesta região. Guertzenstein (1973)

demonstrou também que a aplicação de drogas excitatórias como o leptazol e

estricnina nos mesmos sítios produziam aumento da PA.

1.1 ÁREA ROSTROVENTROLATERAL BULBAR (RVLM):

Está região, atualmente conhecida como área rostroventrolateral bulbar (RVLM,

rostroventrolateral medulla), foi caracterizada funcionalmente por Feldberg e

Guertzenstein (1972) e Guertzenstein (1973), localiza-se em uma área restrita,

caudal aos corpos trapezóides e bilaterais à linha média na superfície ventral do

bulbo.

A partir destes estudos, diversos grupos de pesquisadores começaram a

desenvolver pesquisas, buscando entender a participação do RVLM na geração e

manutenção da atividade cardiovascular e as possíveis conexões desta área para

outros centros moduladores da atividade autonômica em diversas espécies.

Posteriormente foi demonstrado que neurônios adrenérgicos do RVLM exerciam

influência excitatória sobre as fibras simpáticas vasomotoras (Ross et al., 1984;

12

Schreihofer et al., 2000). Em ratos, a microinjeção de glutamato (L-Glu) nesta região,

é capaz de evocar respostas pressoras e taquicárdicas (Willette et al., 1982).

A atividade tônica do RVLM foi ainda avaliada em estudos eletrofisiológicos,

onde era possível registrar a atividade espontânea de neurônios do RVLM ou as

modificações em sua atividade pela modificação dos níveis pressóricos (Brown &

Guyenet, 1985; Campos Jr. & McAllen, 1999).

Outros pesquisadores relataram que a inibição do RVLM causava significativa

queda na pressão arterial, demonstrando mais uma vez, como sugerido por

Guertzenstein (1973), a participação desta estrutura no controle tônico da pressão

arterial (Ross et al., 1983; Ruggiero et al., 1985; Guyenet, 1990; Dampney, 1994;

Gordon & Sved, 2002).

Os axônios da maioria dos neurônios do RVLM projetam-se diretamente para a

medula espinhal, em especial para a coluna IML, onde exercem importante

influência tônica sobre os neurônios pré-ganglionares simpáticos (Amendt et al.,

1978; Blessing et al., 1981; Ross et al., 1984; Milner et al., 1988; Jansen et al.,

1995a). Acredita-se que a atividade tônica simpática seja dependente de neurônios

glutamatérgicos. Tais conclusões provêm de estudos, que demonstraram que a

reposta à estimulação elétrica ou química da RVLM era abolida quando se aplicava

antagonista de receptores glutamatérgicos na medula espinhal (Mills et al., 1988;

Bazil & Gordon, 1991, 1993).

Desta forma, o RVLM pode ser considerado um importante centro gerador e

uma estação sináptica para vias descendentes de diferentes respostas autonômicas

(Guertzenstein & Silver, 1974), para respostas viscerais de alerta (Guertzenstein et

al., 1977; McAllen, 1984), para o reflexo baroreceptor (McKitrick & Calaresu, 1996;

Schreihofer & Guynet, 2002) e para a resposta pressora do núcleo fastigial (Chida et

al., 1990). A RVLM é tida como via comum nos ajustes cardiovasculares, pois sua

inibição bloqueia uma série de respostas cardiovasculares centralmente mediadas,

como: as respostas cardiovasculares típicas do comportamento de alerta e a

resposta pressora à estimulação elétrica de núcleos da rafe bulbares (Hilton et al.,

1983; Chida et al., 1990; Campos Jr et al., 1993; Silva et al., 2002).

Diferentes tipos e subtipos de receptores são citados na literatura científica,

atuando na modulação dos neurônios pré-ganglionares simpáticos no RVLM, dentre

os quais vale citar os receptores de endotelina (Mosqueta-Garcia et al., 1995; Ouchi

et al, 1989), aminoácidos excitatórios (Tingley et al., 1990; Hay et al., 1999; Sapru,

13

2002; Sved et al., 2002) e aminoácidos inibitórios (Willette et al., 1984; Araújo et al.,

1999). Adicionalmente, receptores opióides podem ser encontrados em células pré e

pós-sinápticas do RVLM, sendo ativados por hipotensão hemorrágica (Guyenet,

2000; Aicher, 2001; Guyenet et al., 2002) e modulando respostas cardiovasculares à

estimulação muscular (Caringi et al., 1998; Ally et al., 2002).

1.2 ÁREA CAUDOVENTROLATERAL BULBAR (CVLM):

Estes autores, Feldberg & Guertzenstein em 1976, também demonstraram uma

região da superfície ventral bulbar, localizada entre o núcleo ambíguo e o núcleo

reticular lateral (Willette et al., 1983; Li & Blessing, 1990; Masuda et al., 1991), hoje

conhecida como CVLM (Caudal ventrolateral medulla), que quando estimulada pela

nicotina apresentava uma resposta hipotensora. O CVLM é, assim, considerado um

centro simpatoinibitório que contribui para a manutenção da pressão arterial em

níveis normais (Willette et al., 1983; Chalmers & Pilowsky, 1991; Blessing, 1991;

Cravo & Morrison, 1993; Aicher et al., 2000; Schreihofer & Guyenet, 2002).

Estudos das vias neurais relacionadas com o CVLM, com a aplicação de

marcadores anterógrados (biocitina) e retrógrados (horseradish peroxidase)

confirmaram que as células A1 das conexões do CVLM para o RVLM, provenientes

do NTS (Aicher et al., 1995), estão envolvidas no barorreflexo e, por conseguinte, na

modulação do controle tônico da pressão arterial (Cravo et al., 1991; 1993).

Projeções descendentes de diferentes áreas do hipotálamo (Saper et al., 1976;

Badoer et al., 1993; Lovick, 1993), córtex (Ally, 1998) e diversas outras áreas

(Ciriello et al., 1986; Krukoff et al., 1993; Ally et al., 2002) também podem modular a

atividade dos neurônios do CVLM, responsáveis pelo controle tônico da pressão

arterial, modificando a atividade simpática em situações de estresse, contração

muscular e outros estímulos comportamentais.

Dentre as muitas funções fisiológicas atribuídas ao CVLM está a modulação do

arco reflexo ativado pelos baroreceptores (Jeske et al., 1993; Dampney, 1994;

Spyer, 1994; Aicher et al., 2000) e pelo reflexo de Bezold-Jarisch, estimulado por

quimiorreceptores (Vardhan et al., 1993; Gireoba et al., 1995). Estes reflexos,

quando ativados perifericamente, causam primeiramente a liberação de aminoácidos

excitatórios em sinapses de neurônios no NTS (Vardhan et al., 1993; Sved &

14

Gordon, 1994; Ohta et al., 1996; Sapru, 2002), ativando neurônios glutamatérgicos

que se projetam monossinapticamente para o CVLM (Urbanski & Sapru, 1988;

Aicher et al., 1995; Gordon & Sved, 2002). Do CVLM, saem neurônios gabaérgicos

responsáveis pela modulação da atividade das células pré-ganglionares simpáticas

do RVLM (Willette et al., 1984; Sun & Guyenet, 1986; Blessing & Li, 1989; Sapru,

2002), sem, no entanto, projetar-se diretamente para a medula espinhal (Loewi &

McKellar, S., 1981; Ross et al., 1984; Jansen et al., 1995; Gordon & Sved, 2002).

Adicionalmente, existem projeções diretas do CVLM para o núcleo ambíguo

(McKitrick & Calaresu, 1997), que participam do controle da atividade parassimpática

para o coração, demonstrando que as conexões do CVLM não se limitam ao RVLM.

Conexões da área cinzenta periaquedutal para o CVLM (Hilton, 1975; Chen &

Aston-Jones, 1996), podem, por sua vez, estar envolvidas na modulação das

respostas cardiorrespiratórias evocadas por alterações comportamentais de luta e

fuga.

1.3 ÁREA PRESSORA CAUDAL (CPA):

Esta região situada caudal a CVLM na transição bulbo-espinal, com atividade

pressora semelhante a RVLM foi descoberta em animais profundamente

anestesiados após a aplicação tópica de leptazol na superfície ventral caudal bulbar

de gatos (Feldberg & Guertzenstein, 1986). Estes autores propuseram uma relação

funcional entre esta área, conhecida como área pressora caudal (CPA) e o RVLM,

uma vez que as respostas hipertensoras produzidas após a aplicação tópica de

leptazol na CPA não ocorriam durante a inibição com injeção de pentobarbital sódico

previamente na RVLM.

Os primeiros a estudarem esta região mais caudal na superfície bulbar de

ratos foram Gordon & McCam em 1988. Seus achados confirmaram o trabalho de

Fedberg & Guertzestein 1986, pois em seus resultados estes autores encontraram

uma resposta hipertensora após a aplicação de glutamato nesta mesma região

caudal a CVLM, além de demonstrarem que esta resposta era abolida tanto pela

inibição do RVLM quanto por bloqueio ganglionar, demonstrando que a elevação da

pressão arterial era obtida via aumento da atividade simpática. Estas observações

15

foram confirmadas por Campos Jr. & McAllen (1999), com o registro unitário da

atividade elétrica de células da RVLM, acompanhado da estimulação ou inibição da

CPA. Neste trabalho, ficou comprovado que as variações da CPA alteram a

freqüência de despolarização das células pré-ganglionares simpáticas responsáveis

pela manutenção do tono vasomotor simpático. Recentemente foi proposto que as

vias da CPA para o RVLM envolvem uma ativação de neurônios simpatoexcitatorios

glutamatérgicos na vizinhança da CVLM (Natarajan & norrison, 2000).

Silva (2001) obteve respostas hipertensoras semelhantes às descritas acima

com a aplicação tópica de glutamato na CPA, porem, seus experimentos foram

realizados com animais acordados eliminando assim qualquer influencia que os

anestésicos pudessem causar.

A localização da CPA foi relatada no trabalho de Sun & Panneton em 2002,

através de um mapeamento com a utilização de microinjeções de glutamato na

superfície ventral bulbar, na qual definiram que a CPA está situada em uma região

lateral ao ponto mais caudal do núcleo reticular lateral e ventromedial ao corno

dorsal bulbar no nível da ducussação das pirâmides. Estes autores confirmaram a

existência das projeções da CPA tanto para o RVLM quanto para a CVLM. Horiuchi

& Dampney (2002) propuseram a desinibição indireta dos neurônios

simpatoexcitatórios do RVLM pela CPA, de acordo com o seguinte modelo:

neurônios inibitórios da CPA fariam conexões com neurônios inibitórios da CVLM e

interneuronios inibitórios no proprio RVLM. Desta forma, quando ativada, a CPA

atuaria retirando os potenciais inibitórios sobre o RVLM, aumentando a atividade

pré-ganglionar simpática (figura 1). Entretanto, ainda faltam informações a respeito

de quais as regiões enviam suas eferências para CPA e participam de sua

modulação no controle neural da pressão arterial.

16

Figura 1. RVLM, bulbo rostroventrolateral; CVLM, bulbo caudoventrolateral; CPA, área pressora caudal; IML, coluna intermediolateral; NTS, núcleo do trato solitário; NCR, Núcleos caudais da rafe. Figura modificada de Horiuchi & Dampney (2002).

Silva, 2002 demonstrou que o bloqueio dos receptores aminoácido excitatório

feito pelo ácido quinurênico dentro da CPA reduz a pressão arterial e a freqüência

cardíaca, além de praticamente abolir a resposta pressora gerada pela estimulação

do núcleo da rafe obscuro, demonstrando uma suposta projeção eferente entre um

dos importantes núcleos caudais da rafe com a CPA.

1.4 NÚCLEOS DA RAFE:

Além dessas três áreas relevantes no controle cardiovascular, sabe-se que os

núcleos da rafe são de extrema importância no controle da PA (Coote, 1990). Este

termo “núcleos da rafe” indica grupos de neurônios localizados na região

mediossagital do tronco encefálico, que possui um aspecto morfológico de linha ou

sutura, e se estendem desde a parte caudal do bulbo até o mesencéfalo, passando

pela ponte. Esses grupos de neurônios estão organizados de formas distintas em

Inibitório Excitatório

CPA

17

dois blocos, o rostral (constituído pelos núcleos linear rostral, linear intermédio,

dorsal, mediano e pontino) e o caudal, que se encontram situados na região bulbar

(constituído pelos núcleos magno, obscuro e pálido) (Brodal et al., 1960 a, b), (fig. 2).

Os núcleos da rafe contêm a maior densidade de neurônios serotonérgicos do

sistema nervoso central (Jacobs et al., 2002), fato este que foi inicialmente

observado por Dahlstrom e Fuxe em 1964. Foram descritos sete tipos de receptores

para serotonina (5-HT1 - 5-HT7) e seus subtipos 5-HT1A-1F (exceto 5-HT1C) e 5-

HT1P, 5-HT2A-2C, 5-HT3A-3E, 5-HT4A-4D, 5-HT5A-5B (Côté et al., 2004), que

podem ser encontrados em diversas regiões do sistema nervoso central (Siegel et

al., 1999) ou em tecidos periféricos (Futuro-Neto et al., 1993). Apesar de a

serotonina ser o principal neurotransmissor, existem outros tipos, tais como, as

encefalinas (Bowker et al., 1983; Milhorn et al., 1989), GABA (McCall et al., 1988),

catecolaminas, neuropeptídeos e acetilcolina (Bowker et al., 1983; Fort et al. 1989,

1990; Li et al., 1996; Parent, 1996), que podem ser expressos isoladamente ou em

associação com a serotonina (Bowker et al., 1983; Kachidian et al., 1991; Stamp e

Semba, 1995).

Essa gama de neurotransmissores, adicionada ao fato de que existem vários

subtipos de receptores para serotonina, sugere a participação dos núcleos da rafe

em diferentes atividades fisiológicas, tais como termorregulação (Arancibia et al.,

1996), modulação do sistema digestivo (Ribeiro do Vale, 1997), respiração (Gilbey et

al., 1995), regulação cardiovascular (Coote, 1990) e ciclo sono-vigília (Jacobs &

Fornal, 1991). Como previamente dito, esses núcleos estão agrupados em dois

blocos distintos: o rostral e o caudal. Essa não é simplesmente uma conveniência

anatômica, mas uma classificação morfofuncional que deriva de projeções eferentes

diferentes (Jacobs et al., 2002).

GRUPO ROSTRAL DOS NÚCLEOS DA RAFE:

O grupo rostral dos núcleos da rafe compreende o núcleo linear rostral, linear

intermédio, dorsal, mediano ou central superior e núcleo pontino da rafe (Brodal et

al., 1960 a, b). Os neurônios destes núcleos localizam-se principalmente na sua

parte central, porém aqueles situados à margem, fundem-se com outros

grupamentos nervosos, dificultando, a exata delimitação lateral (Taber et al., 1960).

18

Esses núcleos do grupo rostral são formados principalmente por neurônios de

tamanho médio, fusiformes, com dendritos de orientação dorso-ventral (Zagon,

1993), que se projetam para áreas suprassegmentares (Brodal et al., 1960 a, b).

Dentre suas projeções, podemos citar o hipotálamo e o núcleo amigdalóide

(Sawchenko et al., 1983), projeções do núcleo pontino para o cerebelo (Taber et al.,

1960), para o córtex frontal (Graeff et al., 1996), além de projeções para a

substância cinzenta periaquedutal (PAG), hipocampo e gânglios da base (Compan

et al. 1996).

Figura 2. Organização anatômica (esquema) dos núcleos da rafe e das projeções serotoninérgicas no cérebro de um rato (vista lateral). O maior número de projeções desses núcleos (em azul) parte: dos núcleos caudais (magno, pálido e obscuro) para a medula espinhal, do núcleo pontino para o cerebelo e dos núcleos rostrais (mediano, paramediano, dorsal e linear) para o prosencéfalo, e há um feixe dorsal específico (em vermelho) que vai dos núcleos mediano e dorsal para o prosencéfalo.

GRUPO CAUDAL DOS NÚCLEOS DA RAFE:

O grupo caudal é constituído pelos núcleos rafe magno (RMg), rafe obscuro

(NRO) e rafe pálido (RPa) com disposição rostral, mediana e caudal no bulbo,

respectivamente. Os neurônios dos núcleos bulbares da rafe são fusiformes,

triangulares, quadripolares e às vezes piriformes, com dendritos uni, bi ou

19

multipolares, de orientação dorso-ventral (Zagon, 1993). Suas projeções evidenciam

uma rede interneural complexa, com ligações tanto para a medula espinhal quanto

para centros supramedulares (Jacobs et al., 2002). Brodal et al. (1960 a, b), através

de secções obtidas na medula espinhal e tronco cerebral de gato, provocaram

degeneração neuronais nos núcleos da rafe. Dähsltrom & Fluxe (1965), combinando

a técnica de secção da medula com a de fluorescência em ratos, demonstraram a

participação dos núcleos caudais nas eferências noradrenérgicas e serotonérgicas

para a medula espinhal, confirmando assim os resultados de Brodal et al. (1960a, b)

no gato. Demonstraram ainda que a maioria das eferências dos núcleos caudais é

enviada para a medula espinhal, enquanto que os neurônios dos demais núcleos

suprasegmentares projetam seus axônios principalmente para as regiões cerebrais

superiores.

Outros pesquisadores também identificaram importantes projeções de

neurônios serotonérgicos dos núcleos bulbares para o corno dorsal e para a coluna

intermédio-lateral da medula espinhal (IML) (Loewy, 1981; Loewy & Mckella, 1981;

Bacon et al., 1990; Gilbey et al., 1995), fazendo sinapse, respectivamente, com

neurônios da lâmina I, II e V e com grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos

(Amendt et al., 1978, 1979; Antal et al., 1996; Li et al., 1996). A conexão dos núcleos

bulbares da rafe com grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula

espinhal, fornece a base anatômica de sua participação na regulação simpática

(Loewy, 1981; Jones, 1996; Helke et al., 1997; Skinner et al., 1997). Por outro lado,

a importância de cada um dos núcleos bulbares da rafe no controle e modulações de

vários componentes fisiológicos também pode ser sugerida pelas conexões

suprassegmentares. Sim & Joseph (1992); Lovick (1993a, b); Hudson & Lumb

(1996), Lebars et al. (1980); Schenberg & Lovick (1995) observaram aferências e

eferências para áreas da PAG, que possivelmente estariam envolvidas em

mecanismos supraespinhais de modulação da nocicepção, analgesia e reação de

defesa.

Outros centros cerebrais que também enviam eferências para os núcleos

caudais da rafe são os núcleos paraventricular hipotalâmico, o núcleo pré-óptico

(Nogueira et al., 1996), a área bulbar rostroventrolateral (Zagon, 1995), o núcleo

amigdalóide e o hipotálamo posterior (Hermann et al., 1996). Estas e outras

conexões confirmam a implicação dos núcleos da rafe em processos de modulação

do sistema digestivo (Curzon, 1990; Krowicki & Hornby, 1996; Ribeiro do Valle,

20

1997), respiração (Hosogai et al., 1993; Gilbey et al., 1995; Al-Zubaid et al., 1996),

termorregulação (Aracibia et al., 1996), regulação cardiovascular (Coote, 1990;

Saxena & Villalón, 1990), ciclo sono-vigília (Jouvet, 1967; Dugovic et al., 1989),

atividade da musculatura mastigatória (Ribeiro do Valle, 1997) e em ritmos

circadianos (Morin et al., 1990).

NÚCLEO RAFE MAGNO (NRg):

Este grupo pode ser considerado como um prolongamento rostral da porção

ventral do núcleo rafe obscuro, sua parte rostral estende-se para o nível do pólo

rostral da oliva superior e a região ventral faz limite com a margem do corpo

trapezóide, enquanto a região dorsal apresenta limitações arbitrárias com as bordas

laterais do núcleo pontino da rafe. Em cortes sagitais, observa-se que dorsalmente o

núcleo apresenta-se mais afilado em sua trajetória compreendida entre o corpo

trapezóide e o teto do quarto ventrículo, o núcleo se torna bem mais desenvolvido a

partir da metade ventral desta trajetória. Apesar de apresentar bordas laterais pouco

definidas e citoarquitetura semelhante à formação reticular, a individualização do

núcleo rafe magno pode ser determinada pela organização de suas células, seus

neurônios apresentam-se em vários pontos densamente aglomerados (Taber et al.,

1960).

Utilizando a técnica de traçado anterógrado, Bacon et. al. (1990) demonstraram

que existe uma conexão monossináptica entre os núcleos magno e pálido da rafe e

os neurônios pré-ganglionares simpáticos que irão formar a inervação da adrenal,

demonstrando ainda que os neurônios do núcleo da rafe obscuro não se projetam

para essa região. As vias serotonérgicas do núcleo rafe magno estão relacionadas

com processo de transmissão e modulação dos estímulos nocioceptivos da medula

espinhal (LeBars at al., 1980). A estimulação elétrica desta área produz analgesia

que é parcialmente revertida por naloxone (Oliveras et al., 1975, 1977) e tal

estimulação resulta na inibição de neurônios nocioceptivos no corno dorsal (Beall et

al., 1979; Fields et al., 1977; Gerhart et al., 1981; Rivot et al., 1980). Injeção de

opióides nesta região também produz antinociocepção que está envolvida com

mecanismo serotonérgicos (Dickenson et al., 1979; Liu et al., 1988).

21

NÚCLEO DA RAFE PÁLIDO (RPa):

Ventralmente ao núcleo da rafe obscuro encontra-se um grupo de células do

núcleo rafe pálido. A parte caudal deste núcleo é bem definida e inicia-se na porção

mais medial do núcleo rafe obscuro, com um grupo de células entre as margens

dorso mediais das pirâmides, que ao nível médio olivar, funde-se com grupos

celulares dorsais formando uma massa única que se encaminha para a direção

rostral, enquanto que sua porção mais rostral encontra-se pobremente definida

(Taber et al. 1960). Segundo Taber (1960), na porção mais rostral, os núcleos

reticulares gigantocelulares bulbares aproximam-se da borda dorso laterais do

núcleo rafe pálido. Aproximadamente a um terço da porção rostral do núcleo ocorre

fusão com o núcleo rafe magno. Em muitos pontos as bordas dos dois núcleos

afastam-se, quando então suas células se apresentam densamente agrupadas, o

que dá um contraste com as células bastante dispersa do núcleo rafe magno.

Luppi et. al. (1986) utilizando uma técnica onde combinava a

imunohistoquímica com a técnica de traçado retrógrado, determinaram que o núcleo

rafe pálido recebe aferentes hipotalâmicos que se originam na região peri e

paraventricular das áreas hipotalâmicas anterior e posterior. Três grupos de células

serotonérgicos da linha mediana do tronco cerebral foram identificados e

denominados de B1, B2 e B3, que corresponde aos núcleos rafe pálido, obscuro e

magno respectivamente Dahlstrom e Fuxe (1964). A demonstração de que estes

núcleos pareciam ser os principais centros que continham neurônios serotonérgicos,

levaram as intensas investigações na tentativa de determinar a ação fisiológica

desses núcleos.

NÚCLEO DA RAFE OBSCURO (NRO):

A denominação obscuro decorre do fato de que em muitos níveis do núcleo,

em especial em sua porção dorsal, apresenta uma densidade celular muito pequena

conferindo-lhe um aspecto não muito visível (Taber et al., 1960). Ele ocupa a linha

média da rafe bulbar, estendendo do pólo caudal da oliva inferior ao nível do núcleo

do nervo hipoglosso até a porção cervical da medula espinhal (Brodal et al., 1960).

22

Apesar de o NRO fazer algumas projeções para a coluna dorsal da medula espinhal,

nas lâminas I, II e V (Dahlstrom e Fuxe, 1964; Basbaum e Fields, 1976; Jacobs et

al., 2002), a maioria de suas projeções vão para a coluna intermediolateral (Loewy,

1981; Gilbey et al., 1995) e para o corno ventral da medula (Brodal et al., 1960;

Martín-Cora et al., 2000). As eferências para o corno ventral terminam

principalmente em motoneurônios somáticos (Brodal et al., 1960; Martín-Cora et al.,

2000) e respiratórios (Holtman et al., 1990). Essas projeções podem ser

serotonérgicas e não-serotonérgicas (Skagerberg e Bjorklund, 1985; Martin et al.,

1990).

Zagon (1995) descreveu importante interconexões entre NRO e o RVLM.

Existem também projeções descritas para o núcleo motor dorsal do vago (Maneker

et al., 1995; Hornby et al., 1990), para o núcleo do hipoglosso (Manaker et al., 1992),

para o núcleo do trigêmio e facial (Fort et al., 1989, 1990) e para o colículo superior

(Parent, 1996).

Outras áreas sensoriais do tronco cerebral, como o núcleo do trato solitário

(Palkovits et al., 1986) e núcleo do trigêmio (Li et al., 1996) também recebem

projeções do NRO.

Foi muito explorada a participação desse núcleo nas funções autonômicas,

com especial interesse a modulação simpática, devido a extensas projeções para a

coluna intermediolateral (Loewy, 1981; Coote et. al., 1985).

A atividade simpática pode ser distribuída de forma diferente para cada

regiões especifica do corpo como foi demonstrado durante o período do sono

desincronizado (Futuro-Neto e Coote, 1982 a, b). Neste trabalho pode-se observar

que, durante este período a atividade simpática vasocostritora para o músculo

esquelético estava aumentada, enquanto que, em outros leitos do sistema vascular

estavam inibidas.

Além da possibilidade do NRO participar nas respostas autonômicas através

de projeções espinhais, existem ainda importantes conexões em diversos centros do

tronco cerebral que impedem uma análise simplória do envolvimento deste núcleo

no controle de muitas funções. Existem evidências de que o NRO está envolvido na

modulação central da analgesia, nocicepção e reação de defesa (Schenberg &

Lovick, 1995; Lovick, 1996). Isso explicaria a importância das projeções para o corno

dorsal (Basbaum et al., 1976) e as interconexões entre a substância cinzenta

periaquedutal (Lovick, 1993a).

23

A grande maioria dos estudos de mapeamento dos núcleos da rafe, e sua

participação na regulação cardiovascular foram realizados com a utilização de

técnicas de estimulação elétrica. No gato, a estimulação elétrica promoveu

principalmente respostas depressoras (Adair et al., 1977; Yen et al., 1983). No rato

(Smits et al., 1978; Kuhn et al., 1980; Futuro Neto et al., 1990; Silva et al., 2002), no

cobaio (Almada, 1995; Futuro-Neto et al., 1997) e no hamster (Faria, 1992; Faria et

al., 1996) as respostas foram predominantemente pressoras, enquanto que no

coelho ocorreu quase que um equilíbrio entre respostas pressoras e hipotensoras,

com pequena predominância da primeira (Futuro Neto et al., 1990). Com a utilização

de microinjeções de L-glutamato nos mesmos sítios do NRO, foram observadas

respostas pressoras semelhantes, o que evidencia a ativação de corpos celulares no

núcleo estudado (Dreteler et al., 1991; Faria et al., 1996). Damico et al. (1996)

também observaram que a microinjeção de L-glutamato e agonistas de receptores

glutamatérgicos ionotrópicos no NRO causava elevação da pressão arterial.

A intensa rede interneuronal do NRO para os demais núcleos bulbares

poderia ser a justificativa dos resultados de trabalhos que demonstram o

envolvimento deste núcleo na modulação tônica da atividade simpática (Adair et al.,

1977; Có et al., 1990), na regulação central da respiração (Hotmam et al., 1990;

Lalley et al., 1997) e cardiovascular (Futuro Neto et al., 1990; 1996; Dreteler et al.,

1991, Campos Jr. et al., 1993, Silva et al., 2002). Outros autores partilham desta

idéia onde a regulação cardiovascular e respiratória pode ser sugerida pelas

projeções NRO para a superfície ventral bulbar (Chan et al., 1986; Van Bockstaele et

al., 1989; Nicolas & Hancock, 1990; Zagon, 1993, 1995), onde existem importantes

“centros” integradores das respostas cardiovasculares e respiratórias.

A participação funcional da porção rostral da superfície ventrolateral bulbar na

modulação das respostas pressoras evocadas pela estimulação no NRO foi

demonstrada por Campos Jr. et al. (1993). Estes autores observaram que tanto a

lesão eletrolítica quanto a aplicação tópica de glicina na RVLM, causava o bloqueio

das respostas pressoras obtidas pela estimulação elétrica no NRO, concluindo que a

integridade da RVLM era essencial para a manutenção daquelas respostas

pressoras. Futuro Neto et al. (1996), obtiveram resultados semelhantes com a

microinjeção de glicina na RVLM, mas não conseguiram bloquear as respostas

cardiovasculares e simpáticas com a aplicação de antagonistas serotonérgicos,

sugerindo que os receptores 5-HT1 (com seus subtipos), 5-HT2 e 5-HT3 da RVLM

24

não estariam envolvidos nestas respostas. Alguns estudos sugerem que a CPA pode

estar envolvida no controle das respostas à estimulação elétrica no núcleo rafe

obscuro, podendo-se, a partir daí, supor que a CPA poderia estar relacionada aos

núcleos caudais da rafe no controle de diferentes respostas, comportamentais ou

autonômicas. (Silva et al., 2002).

Os achados existentes até o momento colocam os núcleos caudais da rafe

como importantes participantes dos processos centrais no controle das atividades

autonômicas e somáticas. O esclarecimento sobre suas projeções eferentes, sendo

ou não enviadas para a CPA, assume fundamental importância para o entendimento

deste nível de modulação neural da pressão arterial. Ainda faltam informações a

respeito da função da CPA, e o controle aferente exercido sobre ela por outras áreas

envolvidas na regulação neural da PA como, por exemplo, os núcleos caudais da

rafe. Esta hipótese complementaria as conexões das regiões bulbares sugerida por

Horiuchi & Dampney (2002), nas quais as projeções aferentes para a CPA não foram

demonstradas. Portanto, o mapeamento dos núcleos caudais da rafe no rato vem

adicionar dados que poderão ser comparados aos já existentes e ajudar a

compreender melhor suas participação na manutenção da pressão arterial.

25

1.5 DESCRIÇAO DA TÉCNICA DE MARCAÇÃO HISTOQUIMICA COM A

UTILIZAÇÃO DO HORSERADISH PEROXIDASE (HRP):

A técnica Histoquímica com a utilização do Horseradish Peroxidase (HRP) foi

introduzida por Straus, 1957 (apud Mesulan, 1978) e aplicada para o sistema

nervoso periférico por Kristensson e Olsson, 1971 (apud Mesulan, 1978) e

posteriormente para o sistema nervoso central por LaVail e LaVail, 1972. Desde

então, a técnica neurohistoquimica tornou-se um dos mais frequentes métodos para

tracejamento neuronal conectivo dentro do SNC.

Os estágios sucessivos da técnica neurohistoquimica consistem de: injeção

intracerebral do HRP, endocitose neuronal (uptake neuronal), transporte

axoplasmatico e visualização histoquímica da enzima. O Processo de visualização

histoquímico é alcançado através da incubação e fixação do tecido em um meio

contendo H2O2 e um cromogem amina aromática (percussor de um pigmento). Esse

cromogem polimeriza e assume uma coloração intensa quando oxidado. Portanto,

no local do HRP ativado, ou seja, o complexo [HRP. H2O2], oxida o cromogem e

resulta na precipitação do produto dessa reação que, atua como um marcador, pela

ativação da enzima HRP como demonstrada na fotomicrografia da figura 3

(mesulam, 1978; Mesulam, 1976).

O sucesso de um experimento histoquímico com HRP depende de um grande

numero de variáveis. Essas podem ser classificadas em dois grandes grupos:

Variáveis Dinâmicas e Variáveis histoquímicas. As dinâmicas incluem a endocitose

e o transporte do HRP e a histoquímicas incluem parâmetros como o tipo de fixação,

a escolha do cromogem e a composição do meio de incubação. Além disso, ao

contrario da maioria das variáveis dinâmicas, que usualmente independem da

manipulação, quase todos os parâmetros histoquímicos podem facilmente ser

regulados pelo experimentador. Na verdade, este segundo grupo de variáveis

determina não apenas a visibilidade do produto da reação, mas também, a

sensibilidade que o transportador (HRP) pode ser detectado. Em outras palavras,

uma conexão neural que é prontamente visualizada quando ótimos parâmetros

histoquímicos estão envolvidos, pode ser perdida em experimentos que utilizam

excessiva fixação, cromogem de inferior visibilidade (Mesulam & Rosene, 1977) ou

parâmetros de incubação inapropriados (Mesulam, 1976).

26

A utilização do HRP no presente trabalho nos permite buscar uma conexão

direta, para tentarmos esclarecer a existência ou não de projeções eferentes

enviadas pelos núcleos caudais da rafe para a área pressora caudal.

Figura 3. As setas indicam as células marcadas. A) Três células marcadas na substância inonimata com o produto da reação do HRP, visível com uma objetiva 20x, após aplicação de HRP no córtex motor. B) Duas células marcadas com HRP no núcleo dorsolateral talâmico de macaco, seguido à aplicação prévia de HRP no hipocampo. Duas células não marcadas também são vistas no quanto superior direito da imagem, Objetiva 40x. C) uma célula marcada no lobo parietal inferior após uma injeção de HRP no lobo parietal inferior contralateral, objetiva 100x. D) Duas células marcadas na substância inonimada de um macaco após a injeção de HRP no córtex premotor. (Mesulam, 1976).

27

2. OBJETIVOS:

2.1. OBJETIVO GERAL:

• Investigar através da técnica histoquímica de transporte axonal retrogrado

(horseradish peroxidase, HRP), a existência de projeções neuronais

eferentes, formando uma via direta, entre os núcleos caudais da rafe e a área

pressora caudal.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Além da existência destas vias dos núcleos caudais da rafe para a CPA,

identificar a exata localização rostro-caudal dos neurônios marcados com

HRP dentro dos núcleos caudais da rafe que estão se projetando para a CPA.

• Avaliar em que profundidades da superfície do crânio encontram-se os

neurônios dos núcleos caudais da rafe que se projetam para a CPA.

28

3. MATERIAIS E MÉTODOS:

ANIMAIS

No experimento foram utilizados ratos Wistar machos adultos (270 – 300

gramas), fornecidos pelo biotério do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo os quais eram mantidos em

gaiolas de polietileno e alimentados com ração comercial e água ad libitum. O

controle de luminosidade era próximo às condições naturais, com ciclo de 12 horas.

ANESTESIA E PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS INICIAIS

Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, os animais eram

anestesiados com hidrato de cloral (0,4g/kg i.p.). A temperatura retal foi mantida a

37C utilizando para tanto uma manta aquecida. Foi necessário encontrar um ato

cirúrgico adequado e pouco traumático que nos apresentasse um bom prognostico

pós-operatório, permitindo assim a sobrevivência dos animais por dois a três dias

após os procedimentos. Além do ato cirúrgico, as coordenadas para atingir

precisamente a CPA também tiveram que ser adequadas. Após a anestesia os

animais foram posicionados em decúbito ventral em um aparelho estereotáxico para

pequenos animais (Stoelting), com a barra incisiva 11 mm abaixo da linha interaural.

O Óbex foi utilizado como ponto de referência para as coordenadas

estereotáxicas, sua exposição foi realizada através de procedimento cirúrgico onde

se fazia uma incisão na região posterior da cabeça do animal promovendo a

visualização e o afastamento da musculatura que se sobrepunha a está região,

permitindo assim uma visualização completa do óbex e acesso à CPA. Foram

utilizados treze animais até que o melhor procedimento fosse encontrado.

As coordenadas foram confirmadas através de registros hemodinâmicos após

a aplicação do aminoácido excitatório (Glutamato, 20nmol/50 nl), através de uma

cânula de metal (agulha gengival tamanho 30G curta) conectada via cânula de

polietileno PE-10 a uma microseringa Hamilton introduzida unilateral no bulbo.

29

Associado ao Glutamato foi utilizado um marcador (Pontamine Sky Blue, 2%) que

permitiu uma visualização macro e microscópica da região aplicada.

REGISTROS HEMODINÂMICOS:

A pressão arterial foi registrada apenas com o objetivo de auxiliar na confirmação da

localização exata da APC. Através de uma pequena incisão na região femoral

ventral, dissecava-se a artéria femoral esquerda para inserção de cateteres de

polietileno PE-50, preenchidos com solução salina-heparina (0,09%, 100:1UI,

respectivamente) e tendo uma de suas extremidades obstruída com um pino de

metal. A pressão arterial era monitorada pelo cateter, conectado a um transdutor de

pressão (Statham-Spectramed, P23XL) e a um amplificador (Pressure Processor,

Gould 20-4615), sendo registrada em um polígrafo (Gould RS3400), previamente

calibrado. A freqüência cardíaca medida com um frequencímetro (Biotach, Gould 13-

64615) a partir da onda de pulso da pressão arterial. Os registros da pressão arterial

pulsátil, pressão arterial média e frequência cardíaca eram digitalizados (Biopac

MP100) e armazenados no disco rígido de um computador PC (Digital). A aplicação

da droga (Glutamato) nas coordenadas adequadas permitia visualizar uma resposta

pressora no momento de sua aplicação. Estas respostas associadas à análise

histológica nos permitiram confirmar a exata localização da APC, que se

assemelham às existentes na literatura científica e escolher o melhor sitio para a

aplicação do HRP.

As coordenadas testadas variaram de 0,5 a 1,5 mm caudal ao Óbex e de 1,5

a 2,0 mm lateral à linha média, com uma profundidade de 2,0 mm da superfície

dorsal do tronco cerebral do animal, sendo do escolhido como sitio de aplicação do

HRP, aquele que demonstrou uma melhor resposta pressora (1,0 mm caudal ao

Óbex e 1,7 mm lateral à linha média) como observado na figura 4.

30

Figura 4. Representação esquemática indicando o local da microinjeção do HRP dentro da CPA. O circulo em vermelho representado pela letra F representa o ponto de injeção do HRP, com 1,0 mm caudal ao Óbex, 1,7 mm lateral a linha medial e 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do rato. Figura modificada de Sun W. and Panneton W. M.

MICROINJEÇÃO DO HORSERADISH PEROXIDASE (HRP):

Uma vez definido o melhor procedimento cirúrgico e as coordenadas

adequadas para atingir a CPA o experimento com a utilização do HRP foi iniciado.

Para a utilização do HRP como marcador neuronal retrogrado, desde sua aplicação

até o ponto de ser revelado, corado e analisado no microscópio, nos levou a tentar

adequar esta técnica aos materiais já existentes e utilizados rotineiramente em

nosso laboratório, até chegar-mos à sua adequada utilização. Diferentes formas de

perfusões, concentrações variadas de HRP, tentativa de utilização do formaldeido

para fixação do tecido (freqüentemente utilizado em nosso laboratório), ou seja,

vários experimentos tiveram que ser realizados com o objetivo de adequar a técnica

de revelação do HRP com as drogas e os equipamentos já utilizados em nosso

laboratório. Para estes experimentos foram necessários à utilização de onze animais

até que a revelação do tecido com HRP pudesse ser realizada com sucesso, e

consequentemente, boa visualização dos grânulos de HRP no pericário do neurônio

pudesse ser observada como será descrito no decorrer do texto.

Com o mesmo procedimento utilizado na aplicação do glutamato e o

marcador para confirmar as coordenadas estereotáxicas adequadas, era aplicado na

CPA unilateral, um volume de 50nl de solução contendo o traçador horseradish

peroxidase a 20% (SIGMA-ALDRICH, Switzerland), diluído em água destilada

(Mesulam, 1978). Após a injeção do HRP a cânula permanecia no local alvo por 20

min para evitar perda do traçador no trajeto da cânula durante a retirada.

31

Realizado este procedimento a incisão cirúrgica era suturada e o animal

mantido vivo durante dois a três dias no biotério da instituição, tempo necessários

para permitir o deslocamento retrogrado intraneuronal do traçador. Após este

período, o animal era profundamente anestesiado com cloral hidratado (0,4g/kg, i.p.),

seguindo-se a uma abertura da região torácica para exposição do coração e

perfusão via artéria aorta com 500ml de solução salina, seguida por 500ml de

paraformaldeido a 1% e 1,25% de glutaraldeido em tampão fosfato 0,1M. O tronco

cerebral era removido, fixado por 24h à 4oC em uma solução de sacarose a 10% e

então seccionado coronalmente com espessura de 40 micrometros utilizando um

micrótomo de congelamento.

As secções foram colocadas em uma solução com 250ml de tampão fosfato (pH 7,6)

e tratadas com Diaminobenzidina a 0,05%. As secções permaneciam nesta solução

sendo agitados por dez minutos, após este tempo, era adicionado à solução H2O2

numa concentração de 0,01% e agitado por mais dez minutos. O produto desta

reação promove uma coloração escura no ponto de injeção da droga e no interior do

corpo celular dos neurônios marcados retrogradamente. O local da microinjeção do

HRP foi examinado microscopicamente para verificar a localização exata dentro da

CPA. Em seguida as secções foram organizadas em lâminas histológicas e coradas

com o corante vermelho neutro, permitindo assim uma melhor visualização do corpo

celular dos neurônios marcados com o HRP dentro dos núcleos caudais da rafe.

Estes neurônios foram visualizados com o auxílio do microscópio óptico, sendo suas

coordenadas analisadas de acordo com o atlas estereotáxico (Paxinos e Watson,

Acadamic Press, 1986).

Um total de seis ratos com marcações positivas de HRP dentro da CPA foram

utilizados para determinar os objetivos deste trabalho.

As imagens dos neurônios marcados foram capturadas através de uma

câmera de vídeo acoplada ao microscópio, digitalizadas e armazenadas no

computador. Os dados dos animais em que não foi possível a visualização

histológica positiva para a CPA foram desconsiderados e descartados.

32

4. RESULTADOS:

Dois a três dias após a microinjeção de HRP na CPA, foram observados

neurônios marcados em todos os três núcleos caudais da rafe, estando distribuídos

de forma dispersa em cada um deles. Ao ser aplicada, a solução contendo o HRP se

espalha pelo tecido do sistema nervoso e, após ser revelado, produz uma coloração

marrom por toda extensão em que se difundiu. O pequeno volume da solução de

HRP aplicado (50nl) permitiu que apenas o núcleo estudado (CPA) fosse circundado

com a droga, como demonstrado na fotomicrografia abaixo (figura 5). Com isto

evitando encontrar corpos neuronais marcados retrogradamente cuja seus botões

terminais não estejam presentes nesta região.

De uma maneira geral, os neurônios marcados com HRP nos núcleos caudais

da rafe, nos seis ratos estudados, estavam distribuídos da seguinte maneira: Foram

encontradas marcações com HRP dentro do núcleo RMg nos ratos 1, 2 e 3,

somando um total dez neurônios marcados nestes animais. Para o núcleo RPa,

foram vistas marcações nos ratos 1, 3, 4, e 5, totalizando quatorze neurônios

marcados. E por ultimo, neurônios com HRP no núcleo NRO estavam presente nos

ratos 2, 3, 4, 5 e 6, representando um somatório de onze neurônios marcados nestes

animais.

Figura 5. A) fotomicrografia demonstra o local de aplicação do HRP dentro da CPA do rato, secção de 40 µm; objetiva 10x.

A

CPA

33

As coordenadas de acesso a CPA utilizadas para aplicação do HRP, demonstraram

um aumento da pressão arterial e freqüência cardíaca quando estimuladas pela

aplicação do glutamato. A figua seis representa os registros hemodinâmicos antes e

após a microinjeção do L-glu.

Figura 6. Respostas cardiovasculares da microinjeção unilateral de L-glutamato (L-glu; 20 nmol/50nL)

na área pressora caudal (CPA), (A) Registros de pressão arterial (PA), pressão arterial média (PAM)

e frequência cardíaca (FC); (B) cortes coronal e sagital representativos do sítio de microinjeção. O

triângulo representa a microinjeção.

L-glu

A

900 950 1000 1050 1100 seconds

0

50

100

150

200

mmHg

PA

0

50

100

150

200

mmHg

PAM

0

100

200

300

400

bpm

FC

34

Na análise estatística dos registros de cinco animais, observou-se um aumento na

PAM após a microinjeção de L-glu (102 ± 2,3 mmHg), significativamente maior que

os registros controle (80 ± 3 mmHg; p< 0,01), como demonstrado na figura 7, nas

coordenadas 1,0 mm caudal ao Óbex e 1,7 mm lateral à linha média, com uma

profundidade de 2,0 mm da superfície dorsal do tronco cerebral do animal. Sendo

este o sítio escolhido para a aplicação do HRP.

Variação da pressão arterial médiaapós a microinjeção de L-glu na APC

Cont L-glu0

25

50

75

100

125ContL-glu**

PAM

mm Hg

Figura 7. Efeitos da microinjeção unilateral de L-glutamato (L-glu; 20 nmol/50nL) na CPA, sobre as

respostas de pressão arterial média (PAM) em ratos. Cont, controle antes da microinjeção do L-glu

nos ratos *P

35

Neurônios marcados retrogradamente no RMg após microinjeção de HRP na

CPA:

Neste núcleo observou-se a menor dispersão celular no sentido rostro-caudal

dos neurônios marcados com HRP, estas células estavam situadas entre -11,30 mm

e -11,60 mm caudais ao Bregma (fig. 8).

Figura 8. A) Fotomicrografia mostrando dois neurônios densamente marcados com HRP dentro do RMg a -11,30 mm do Bregma, com profundidade de 10,60 mm da superfície do crânio, objetiva 4x. B) Maior aumento da foto A mostrando os grânulos de HRP no neurônio, objetiva 10x.

Dos dez neurônios encontrados marcados no núcleo RMg, três estavam a

exatamente -11,30 mm, e os outros sete neurônios a -11,60 mm caudais ao Bregma.

Estes últimos neurônios estavam situados com profundidade variando apenas entre

10,4 mm a 10,7 mm em relação à superfície dorsal do crânio (fig. 9).

Figura 9. Rato 1, dois neurônios marcados com HRP dentro do núcleo RMg a -11,60 mm do Bregma, com 10,60 mm e 10,70 mm de profundidade; canto superior esquerdo (seta). A) Demonstra os dois neurônios com um aumento numa objetiva 4x. B) Maior aumento de A, objetiva 10x. Pode ser observado também um neurônio marcado no RPa, canto inferior direito.

A

RMg

B

RMg

A

RMg

B

RMg

36

A quantidade total de neurônios encontrados marcados com grânulos de HRP dentro

do RMg e seus respectivos posicionamentos tanto rostro-caudais quanto a

profundidade da superfície do crânio são demonstrados na tabela abaixo (tab. 1).

Tabela 1. Total de neurônios marcadas com HRP no RMg e suas respectivas localizações rostro-caudais e profundidades da superfície do crânio.

10,40 – 10,70 -11,30 / -11,60 10 Geral

10,40 – 10,70 -11,60 7 Marcações

10,60 -11,30 3 Marcações

Profundidade do crânio (mm)

Rostro-caudal ao Bregma (mm)

Número de Neurônios

RMg

37

Neurônios marcados retrogradamente no RPa após microinjeção de HRP na

CPA:

Os quatorze neurônios marcados dentro do núcleo RPa nos animais

estudados estavam distribuídos rostro-caudalmente entre -11,30 mm a -12,80 mm

caudais ao Bregma, com uma profundidade variando entre 10,80 mm a 11,10 mm

em relação à superfície dorsal do crânio. No rato 1 foram encontrados três neurônios

marcados a aproximadamente -11,30 mm do Bregma, dois deles com profundidades

de 10,80 mm e um a 10,90 mm da superfície craniana (figura 10).

Figura 10: Rato1, neurônios marcados a aproximadamente -11,30 mm caudais ao Bregma. A) apresenta um neurônio marcado dentro do RPa com uma profundidade de 10,80 mm da superfície do crânio, objetiva 10x. B) outro neurônio marcado no RPa com 10,80 mm de profundidade (seta), além de outros dois no núcleo RMg, objetiva 10x. C) um único neurônio a 10,90 mm de profundidade no RPa, objetiva 10x.

A aproximadamente -11,60 mm do Bregma, mais cinco neurônios foram marcados

com HRP no núcleo da RPa, dois deles são demonstrado na figura abaixo com

profundidade de 10,80 mm e 11,00 mm da superfície dorsal. Puderam ser

observados também na parte superior esquerda da figura, neurônios marcados no

núcleo RMg (figura 11). Dos outros três neurônios encontrados no Núcleo RPa,

Núcleo RPa

A

RPa

B

RPa

C

RPa

38

porém não visualizados aqui, dois estavam com profundidade igual a 11,00 mm e

um com 10,90 mm da superfície dorsal.

Figura 11. Rato 1; Neurônio marcado com HRP no núcleo RPa a -11,60 mm do Bregma, objetiva 10x. A) A seta indica uma célula marcada com profundidade de 10,80 mm dorso-ventral no RPa. Duas células marcadas podem ser observadas no canto superior esquerdo, núcleo RMg. B) Um neurônio marcado a 11,00 mm de profundidade no núcleo RPa, a -11,60 mm do Bregma. Quatro neurônios marcados com HRP foram encontrados a -11,80 mm do Bregma, com profundidade variando entre 10,80 mm e 11,00 mm dorso-ventral. O nível mais caudal do núcleo RPa onde foi encontrado neurônio marcado foi a -12,80 mm caudal ao Bregma, nesta região foram encontrados apenas dois neurônios marcados com HRP, estando estas células localizadas a 10,80 mm da superfície dorsal do crânio (figura 12). Figura 12. Rato 5; A) neurônio marcado com HRP no núcleo RPa, a -12,80 mm do Bregma com 10,80 mm de profundidade da superfície craniana, objetiva 4x. B) Outro neurônio com HRP no núcleo RPa, a -12,80 mm do Bregma e 10,80 mm de profundidade, objetiva 10x.

B

RPa

A

RPa

B

RPa

A

RPa

39

O total de neurônios encontrados com grânulos de HRP dentro do RPa e seus

respectivos posicionamentos, tanto rostro-caudais quanto a profundidade da

superfície do crânio, são demonstrados na tabela abaixo (tab. 2).

Tabela 2. Total de neurônios marcadas com HRP no RPa e suas respectivas localizações rostro-caudais e profundidades da superfície do crânio.

10,80 a 11,10 -11,30 a -12,80 14 Geral

10,80 -12,80 2 Marcações

10,80 - 10,90 -11,80 4 Marcações

10,80 - 11,00 -11,60 5 Marcações

10,80 - 10,90 -11,30 3 Marcações

Profundidade do crânio (mm)

Rostro-caudal ao Bregma(mm)

Número de neurônios

RPa

40

Neurônios marcados retrogradamente no NRO após microinjeção de HRP na

CPA:

Quatro dos onze neurônios contendo grânulos de HRP encontrados nos NRO

nos animais estudados, estavam a uma distancia de -11,60 mm do Bregma (figura

13) e outros quatro a -11,80 mm do Bregma, com a profundidade destes oito

neurônios em relação à superfície do crânio variando apenas entre 10,00 mm a

10,60 mm. Apenas um único neurônio foi encontrado com distancia dorso-caudal do

Bregma de -11,96 mm. Porém, sua profundidade foi a maior encontrada de todos os

neurônios marcados com HRP dentro do NRO, sendo ela de 10,80 mm da superfície

craniana.

D Figura 13. Fotomicrografias demonstram a presença de neurônios marcados com HRP dentro do NRO à -11,60 mm do Bregma. A) Dois neurônios marcados situados a -11,60 mm caudais ao Bregma no rato 2, com 10,00 mm e 10,10 mm da superfície do crânio; objetiva 4x. B) Maior aumento da foto A mostrando os grânulos de HRP dentro do neurônio; objetiva 10x. C) Marcação com HRP em dois neurônios no NRO a -11,60 mm do Bregma com profundidade de 10,10 mm e 10,20 mm do crânio; objetiva 4x. D) Maior aumento de C mostrando densos grânulos de HRP no interior dos neurônios; objetiva de 10x.

Nesta mesma região, ou seja, a -11,96 mm caudal ao Bregma, pode-se

observar a presença de dois outros neurônios marcados dentro do núcleo reticular

D

NRO

A

NRO

B

NRO

C

NRO

41

gigantocelular ventral (GiV), com profundidade semelhante à do neurônio

encontrado no NRO (figura 14), ambos com 10,80 mm da superfície craniana.

Figura 14. A) Neurônio impregnado com grânulos de HRP no NRO a -11,96 mm do Bregma com 10,80 mm de profundidade dois dias após ser injetado na CPA, (seta preta). Alem do neurônio marcado no NRO podem-se observar outros dois neurônios (seta azul) sitiados no GiV a 10,70 mm de profundidade, com presença do marcador HRP; objetiva 4x. B) Maior aumento do neurônio no NRO da foto A; objetiva 10x.

B

NRO

A

NRO

A

42

A região mais caudal do NRO que pôde ser observado a presença de

neurônios marcados após a aplicação do HRP na área pressora caudal foi a -12,72

mm do Bregma, neste nível foi encontrado um neurônio marcado no rato 3 e um

neurônio marcado no rato 5 com profundidades de 10,40 mm e 10,50 mm

respectivamente da superfície do crânio (figura 15).

Figura 15. A) Neurônio marcado no NRO a -12,72 mm do Bregma e 10,40 mm de profundidade; objetiva 4x. B) Fotomicrografia de um neurônio marcado com HRP dentro do NRO a -12,75 mm do Bregma com 10,50 mm de profundidade, objetiva 4x.

A

NRO

B

NRO

43

A quantidade total de neurônios encontrados marcados com grânulos de HRP dentro

do NRO e seus respectivos posicionamentos, tanto rostro-caudais quanto à

profundidade da superfície do crânio, são demonstrados na tabela abaixo (tab. 3).

Tabela 3. Total de neurônios marcadas com HRP no NRO e suas respectivas localizações rostro-caudais e profundidades da superfície do crânio. Neurônios marcados com HRP em outras regiões bulbares:

Além dos neurônios marcados dentro dos núcleos caudais da rafe, outras

regiões bulbares como núcleo oliva inferior dorsal (IOD), núcleo oliva inferior medial

(IOM), núcleo reticular gigantocelular (Gi), núcleo reticular gigantocelular alfa (GiA),

núcleo reticular gigantocelular ventral (GiV) e tracto piramidal (Py) também

demonstraram neurônios marcados retrogradamente com HRP após a microinjeção

na CPA (figura 16). Quase todos os neurônios encontrados nestes núcleos estavam

situados a uma distancia caudal ao Bregma entre -11,60 mm e -11,80 mm. Porem

três neurônios com marcações de HRP foram encontrados a -11,96 mm caudal ao

Bregma, sendo um deles encontrado no núcleo Gi, com profundidade de 10,30 mm

da superfície craniana, e dois no núcleo GiV, com 10,60 mm de profundidade da

superfície do crânio. Apenas um neurônio foi encontrado no núcleo IOD situado a

-11,80 mm caudal ao Bregma com 10,60 mm de profundidade e dois no núcleo IOM

com -11,60 mm e -11,80 mm do Bregma, e profundidade de 11,00 mm da superfície

craniana. Quatro neurônios com HRP intracelular foram encontrados no núcleo GiA,

três estavam -11,30 mm e um -11,60 mm caudais ao Bregma. A profundidade em

relação à superfície do crânio era de 10,70 mm aproximadamente, ou seja, na

superfície ventral bulbar.

Outros quatro neurônios foram observados no núcleo GiV entre -11,80 mm e

-11,96 mm do Bregma estando com aproximadamente 10,50 mm de profundidade

da superfície craniana. Por ultimo dois neurônios marcados com HRP foram

10,00 - 10,80 -11,30 a -12,80 11 Geral

10,40 - 10,50 -12,72 2 Marcações

10,80 -11,96 1 Marcações

10,10 - 10,60 -11,80 4 Marcações

10,00 - 10,20 -11,60 4 Marcações

Profundidade do crânio (mm)

Rostro-caudal ao Bregma(mm)

Número de Neurônios

NRO

44

observados dentro do tracto piramidal bulbar, ambos a -11,60 mm caudais ao

Bregma, com 11,10 mm e 11,20 mm de profundidade do crânio.

Figura 16. Neurônios marcados com HRP em varias regiões bulbares. Neurônios marcados no núcleo IOM são demonstrados nas fotomicrografias A e B, objetiva 4x. C) Uma única célula foi encontrada no núcleo Gi, objetiva 10x. Em D, E e F neurônios marcados com HRP no núcleo GiA, objetiva 4x. Em G um maior aumento de F, objetiva 10x. F) Dois neurônios marcados no tracto piramidal (seta), objetiva 10x.

D GiA

A

IOM

Gi

C

GiA

G

IOM

B

H Py

E

GiA

F

GiA

45

5. DISCUSSÃO:

Os resultados encontrados neste trabalho nos permitem visualizar uma

importante comunicação neuroanatômica entre os núcleos caudais da rafe, áreas

descritas como envolvidas no controle cardiovascular, e uma segunda região

também responsável por este controle, à área pressora caudal. A partir dos

trabalhos publicados por Guertzenstein et al. (1973, 1974, 1977), diferentes linhas

de pesquisas começaram a enfocar a participação de diversos grupos de neurônios

da superfície bulbar na manutenção dos níveis basais de atividade tônica simpática

para os vasos sanguíneos e coração, regulando a pressão arterial e a freqüência

cardíaca. Estes centros participam da modulação momento a momento da pressão

arterial, principalmente a partir de baro’ e quimiorreceptores, ligados por aferências

ao núcleo do trato solitário (NTS), que origina e recebe projeções tanto da superfície

ventral bulbar, quanto de regiões supra-bulbares, principalmente o hipotálamo

(Guyenet, 1990; Dampney, 1994 a; Dampney et al., 2002). Na superfície ventral

bulbar, estas projeções estariam ligadas a dois principais centros de controle

cardiovascular: a área simpatoexcitatória e a área simpatoinibitória (conhecidas

como RVLM e CVLM, respectivamente), principais responsáveis pela manutenção

do tono vasomotor.

Quando procuramos entender anatomofuncionalmente às áreas que

participam conjuntamente do controle cardiovascular, não podemos deixar de

mencionar a importância dos núcleos serotonérgicos da rafe, com atenção especial

neste trabalho, para os três núcleos caudais bulbares (Núcleo rafe magno, pálido e

obscuro). Ao analisar o sistema eferente dos núcleos da rafe, pode-se observar que

os núcleos caudais apresentam neurônios cuja maioria de seus axônios se projeta

para a medula espinhal, enquanto que os neurônios dos demais núcleos

suprasegmentares projetam seus axônios principalmente para as regiões cerebrais

superiores (Dahlstrom e Fuxe, 1965). Estes autores descreveram ainda que os

axônios dos núcleos caudais da rafe que descendem pelo tronco cerebral penetram

na medula espinhal, através do funículo dorso lateral encaminhando-se para o corno

dorsal e para a cadeia simpática intermédio lateral tóraco-lombar fazendo sinapses

com neurônios pré-ganglionares simpático. Essa conexão dos núcleos caudais da

rafe com grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula espinhal,

fortalecendo sua participação na regulação simpática, também foi relatada por outros

autores (Loewy, 1981; Jones, 1996; Helke et al., 1997; Skinner et al., 1997). Por

46

outro lado, a importância de cada um dos núcleos bulbares da rafe no controle e

modulações de vários componentes fisiológicos também pode ser sugerida pelas

conexões suprassegmentares. Alguns pesquisadores relatam que a participação na

regulação cardiovascular e respiratória destes núcleos pode ser parcialmente

explicada pelas projeções para a superfície ventral bulbar (Chan et al., 1986; Van

Bockstaele et al., 1989; Nicholas & Hancock, 1990; Zagon, 1993, 1995; Silva et al.,

2002), onde existem importantes centros integradores das respostas

cardiovasculares e respiratórias. A interconexão entre o NRO e o RVLM foi descrita

por Zagon em 1995. O bloqueio dos receptores de aminoácidos excitatórios no

RVLM e na CPA altera as respostas cardiovasculares à estimulação elétrica do

núcleo rafe obscuro, podendo-se a partir daí, supor uma relação entre estas áreas

no controle de diferentes respostas comportamentais ou autonômicas (Silva et al.,

2002).

No presente trabalho procurou-se entender as conexões anatomofuncionais

entre os núcleos caudais da rafe (núcleo magno, pálido e obscuro) com a CPA,

região descrita como fundamental integrante, entre os núcleos da superfície ventral

bulbar, para o controle cardiovascular. Como demonstrado nos resultados, foi

observada a existência de conexões eferentes monossinápticas entre todos os três

núcleos caudais da rafe com a área pressora caudal. Isto demonstra que os

neurônios dos núcleos caudais da rafe, além de se projetarem em direção à medula

espinha, com projeções destinadas à coluna IML como descrito por Dahlstrom e

Fuxe em 1965, pelo menos uma parte destes neurônios, também fazem sinapse

com a CPA. Horiuchi & Dampney em 2002, propuseram uma desinibição direta e

indireta dos neurônios simpatoexcitatórios do RVLM pela CPA como já relatado na

introdução. As marcações encontradas com HRP nos núcleos caudais da rafe

demonstram uma via eferente monossináptica destes núcleos sobre a CPA,

apontando uma ligação direta entre estas regiões, o que sugerem novas influencias

sobre a CPA e conseqüentemente no controle da pressão arterial, ampliando ainda

mais o circuito descrito por Horiuchi & Dampney, 2002. Neste circuito as aferências

para a CPA não foram relatadas por estes autores, sendo demonstradas em nossos

resultados, que pelo menos uma boa parte dessas, possui origem nos núcleos

caudais da rafe.

47

Provavelmente, parte desta via para a CPA (com origem no NRO) envie

projeções eferentes, cuja neurotransmissores responsáveis pela estimulação, sejam

aminoácidos excitatórios como sugerido por Silva et al. em 2002 quando relatou que

o bloqueio destes receptores na CPA impede a elevação da pressão arterial

decorrente da estimulação do NRO. Este mesmo autor demonstrou ainda que o

bloqueio destes receptores na RVLM também altera suas respostas

cardiovasculares. Futuro Neto et al. (1996), obtiveram resultados onde a

microinjeção de glicina na RVLM alteravam as respostas cardiovasculares, porem,

não conseguiram bloquear estas respostas com a aplicação de antagonistas

serotonérgicos, sugerindo que os receptores 5-HT1 (com seus subtipos), 5-HT2 e 5-

HT3 da RVLM não estariam envolvidos nestas respostas.

O núcleo rafe magno, o mais rostral dos três núcleos caudais da rafe, começa

a aparecer no tronco cerebral, de acordo com o Atlas de coordenadas estereotáxica

de Watson & Paxinos (1986), a partir de -9,16 mm caudal ao bregma, e se estende

rostro-caudalmente ate -11,60 mm desta região. Os resultados deste trabalho

demonstraram que os neurônios marcados retrogradamente com HRP no RMg, após

microinjeção desta droga na CPA, encontram-se numa área bastante restrita e com

a menor dispersão celular encontrada dos três núcleos da rafe estudados,

compreendida entre -11,30 mm a -11,60 mm do bregma. Sete, dos dez neurônios

marcados nesta região, foram encontrados no limite caudal deste núcleo, ou seja, a

-11,60 mm do bregma (figura 17). Isso nos mostra que apenas a porção mais caudal

do núcleo RMg projeta seus axônios para a CPA.

A profundidade em que foram encontrados os neurônios no núcleo rafe

magno também variou muito pouco, estando entre 10,40 mm e 10,70 mm da

superfície dorsal do crânio. Esta pequena variação, tanto no sentido rostro-caudal

quanto dorso-ventral, sugere a existência de subdivisões ou subnúcleos dentro do

núcleo rafe magno, enviando suas projeções axônais para diferentes regiões

encefálicas, para grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula

espinhal, e outras regiões do tronco cerebral fornecendo a base anatômica de sua

participação na regulação simpática, como demonstrado em trabalhos anteriores

(Loewy, 1981; Jones, 1996; Helke et al., 1997; Skinner et al., 1997).

A substancia cinzenta pereaquedutal está envolvida nas respostas

cardiovasculares à dor, e foi demonstrado, que o RMg serve como um rele para

estas alterações (Rachel et. al., 1997).

48

Foi observado que a ativação dos neurônios do NRO é semelhante à do RMg

após estimulo dolorosos cutâneos (Dantas et. al., 1990). Podemos sugerir que o

aumento da atividade nestes núcleos após estímulos dolorosos pode estar

relacionada, pelo menos em parte, com as alterações cardiovasculares encontradas

na presença da dor, através da ligação destes núcleos com a CPA.

O núcleo rafe pálido, quando comparado com os outros dois núcleos caudais

da rafe, é o que possui a localização mais ventral dentro do tronco cerebral. Ele se

encontra numa posição intermediaria rostro-caudalmente em relação ao núcleo rafe

magno e o núcleo rafe obscuro segundo o Atlas de Watson & Paxinos (1986), sua

localização está entre -9,80 mm e -14,08 mm caudal ao Bregma, o que nos mostra

uma extensão bem maior que a do núcleo da rafe magno descrito anteriormente. Os

neurônios contendo os grânulos de HRP dentro deste núcleo, com projeções

axônais para a CPA, estão distribuídos a uma distancia entre -11,30 mm a -12,80

mm caudais ao Bregma, com suas profundidades da superfície dorsal craniana

variando de 10,60 mm a 11,10 mm. Foi encontrado um total de 14 neurônios

contendo grânulos de HRP nesta área com projeções eferentes para a CPA, este foi

o maior numero de neurônios marcados com HRP em um mesmo núcleo quando

comparado com os outros dois núcleos estudados, sendo que, nove neurônios

estavam situados entre -11,60 mm e -11,80 mm do Bregma (figura 17). Este achado,

ou seja, um aglomerado de neurônios (nove neurônios), todas com praticamente a

mesma coordenada estereotáxica, e o fato de apresentar o maior numero de

neurônios marcados, reforça o trabalho de Taber (1960), que descreve o núcleo da

rafe pálido como sendo o que apresenta a maior densidade neuronal dos núcleos

caudais da rafe. Três neurônios com grânulos de HRP foram encontrados a -11,30

mm e apenas dois neurônios marcados com HRP foram encontrados mais

caudalmente a -12,80 mm de distancia do Bregma com 10,60 mm de profundidade.

Como descrito na introdução, o núcleo rafe pálido recebe aferentes

hipotalâmicos com origem na região peri e paraventricular da área hipotalâmica

anterior e posterior (Luppi et al. 1986). Esta interligação entre o hipotálamo e o

núcleo da rafe pálido e deste para a CPA, nos fornece uma forte base anatômica

para a atuação em conjunto destas áreas no controle cardiovascular. Além do

controle cardiovascular, a regulação da temperatura feita pelo hipotálamo também é

mediada por neurônios que passam pelo RPa e, portanto dependem de sua

integridade. Isto foi demonstrado por Cao et. al. (2004) após demonstrarem que a

49

inibição dos