Estudo do papel da enzima fosfatidilinositol-3-cinase-γ

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO EM BIOLOGIA CELULAR

Estudo do papel da enzima fosfatidilinositol-3-cinase-γ

na encefalomielite auto-imune experimental

David Henrique Rodrigues

2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO EM BIOLOGIA CELULAR

Estudo do papel da enzima fosfatidilinositol-3-cinase-γ

na encefalomielite auto-imune experimental

Dissertação apresentada no programa de pós-graduação em Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Biologia Celular

David Henrique Rodrigues

AGRADECIMENTOS

Aos colegas do programa de pós-graduação em Biologia Celular , Jaqueline, Érika,

André, Ralph, Pedro, Fabrício, George, Bruno, Fernanda, Paula e Soraya que conviveram

comigo durante todo o mestrado, em especial à Fúlvia, que me deu dicas importantes para

escrever a dissertação e à Sarah, que me ensinou uma técnica que utilizei neste trabalho. Ao

professor Ari, que ajudou inúmeras vezes durante os experimentos de microscopia intravital.

Também não posso deixar de mencionar a professora Elizabeth, e o técnico Carlos, do

laboratório de Neurobiologia, pelo apoio na fase final deste trabalho.

À equipe do laboratório de Imunofarmacologia: David (meu xará), que não pôde

estar me ajudando por muito tempo, mas participou ativamente de alguns experimentos;

Flávio Lopes, cujo senso de humor me confunde e me prega algumas peças de vez em

quando, mas que levo na esportiva; Flávio Amaral, que me recomendou os primeiros artigos

que li no laboratório e tentou me ajudar em alguns experimentos de dor; Dani Sachs, cuja

participação nos experimentos de dor foi essencial; Caio, sempre com bastante paciência, que

quebrou um galho nas culturas de células; Daniel Cisalpino, pela ajuda “emergencial” na

avaliação clínica um dia depois do natal, além das inúmeras prosas filosóficas; Landa, pelas

dicas em alguns experimentos; Angélica, que foi uma das minhas tutoras de EAE; Vivian,

pela simpatia constante no laboratório; Cris, companheira de bandejão e de congressos, além

dos fins-de-semana de experimento no laboratório; Remo, principalmente em suas fases de

hipomania, nas quais dá inúmeras idéias e “viaja” pensando em mecanismos imunológicos;

Rodrigo, cúmplice do Daniel nas prosas filosóficas, e que me ajudou principalmente em

encontrar vários reagentes no laboratório, além de ter me dado dois discos do Pink Floyd;

Dani Glória, que sempre chega com um sorriso no laboratório, e também ajudou bastante em

meu período inicial de mestrado; Valdinéria, a “Val”, que sempre dá um jeito de arrumar os

equipamentos que preciso; Ilma, essencial na “reciclagem” dos equipamentos da laboratório;

Mila, com quem tive pouco contato, mas troquei idéias sobre o manejo dos animais; Rafael,

também companheiro de bandejão e um dos supostos “autistas” do laboratório; Marina, que

me deu dicas importantes na coloração de lâminas; Fernando, que entrou no meio da história,

mas também participou de alguns experimentos; Kátia; Thales, que também entrou no meio

da história, mas acabou acompanhando alguns experimentos de intravital; Tiça, que, apesar do

mau humor, foi importante em me dar informações sobre o processamento histopatológico;

Larissa, que entrou quase no fim da história, mas já está “mandando ver” em várias técnicas;

Adriano, que mesmo na Suíça teve um papel fundamental na dissertação, pelas inúmeras dicas

e pelo fornecimento dos reagentes; Adriana (mais conhecida como Adriana EAE), a minha

primeira tutora, que me ensinou a teoria e a prática da técnica que é o esqueleto deste

trabalho; Letícia, que foi extremamente importante no início, com dicas fundamentais para o

manejo dos animais de laboratório; Ildeu, cuja companhia era maior nos experimentos de fim-

de-semana; Michele (in memorian), também uma de minhas tutoras de EAE e de retirada de

tecidos dos animais; Vanessa Mendonça; Ester, outra pessoa que foi fundamental no período

inicial do mestrado; Aline Fortunato, que também esteve presente em alguns de meus

experimentos; Carol; Gabriel, que não é do laboratório, mas que colaborou na tentativa de se

fazer os testes de comportamento, além de ter feito algumas digitalizações; Aline Teixeira,

que entrou aos 45 do segundo tempo, mas que me ajudou a mostrar que ainda tenho muito a

aprender sobre o que faço; Sílvio, de Ribeirão Preto (ou melhor, de Manaus), que me ajudou

na tentativa de fazer uma análise histológica praticamente inviável.

Em especial: à Fernanda, que me ajudou bastante no início de meu mestrado,

quando eu ainda não conhecia ninguém no laboratório; à Norinne, que foi uma das “revisoras”

deste trabalho, além de ter ajudado em vários experimentos; à Débora, “IC VIP”, ou

“Iniciação Científica de Luxo”, que foi essencial na dinâmica dos experimentos nos meses

finais de trabalho; e à Marcinha que participou de quase todos os experimentos deste estudo,

praticamente uma co-autora.

Ao Mauro, “big boss” pela confiança que me depositou em muitos experimentos à

parte deste trabalho.

À Vanessa pela recepção inicial, ajuda constante durante a dissertação e por estar

sempre à disposição para dúvidas e esclarecimentos.

E principalmente ao Antônio Lúcio, meu orientador, que apostou suas fichas

numa pessoa que conhecia há pouco tempo.

À minha família, meu irmão (mesmo sem saber), minha mãe, minha irmã, e meu

pai, que nunca deixaram de apoiar, mesmo estando fisicamente distantes.

A todos que, de uma forma ou de outra, contribuíram para a realização deste

trabalho e que por descuido eu não tenha mencionado aqui.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ANOVA – Análise de variância

BHE – barreira hematoencefálica

CETEA – Comitê de Ética em Experimentação Animal

CCL2/MCP-1 – proteína quimioatraente de macrófagos e monócitos (monocyte-chemotactic

protein-1)

CCL5/RANTES – proteína quimioatraente de linfócitos T ativados e eosinófilos (regulated

upon activation, normal T cell expressed and secreted)

CXCL1/Kc – proteína quimioatraente de neutrófilos

CCR – receptor de quimiocina tipo CC

d.p.i. – dias pós-indução

ELISA – Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked immunosorbent assay)

HE – coloração Hematoxilina-Eosina

IASP – International Association for the Study of Pain

i.p. – intraperitoneal

Kg – Quilograma

MHC – Complexo principal de histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex)

PBS – tampão fosfato (Phosphate buffered saline)

r.p.m. – rotações por minuto

SNC – Sistema Nervoso Central

Δ= delta, diferença entre pressão inicial e pressão final

γ= gama

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Evolução clínica dos grupos WT e PI3Kγ-/- após indução de EAE.........................48 Gráfico 2 Evolução da massa dos grupos WT controle, PI3Kγ-/- controle, WT após a indução de EAE e PI3Kγ-/- após a indução de EAE...............................................................................48 Gráfico 3 Teste de pressão crescente na pata do camundongo................................................49 Gráfico 4 Quantificação de rolamento de leucócitos na microcirculação cerebral por microscopia intravital ...............................................................................................................50 Gráfico 5 Quantificação de rolamento de leucócitos na microcirculação cerebral por microscopia intravital após administração de inibidor de PI3Kγ .............................................51 Gráfico 6 Quantificação de adesão de leucócitos na microcirculação cerebral por microscopia intravital....................................................................................................................................52 Gráfico 7 Quantificação de adesão de leucócitos na microcirculação cerebral por microscopia intravital após administração de inibidor de PI3Kγ..................................................................52 Gráfico 8 Quantificação de MCP1/CCL2 por ELISA.............................................................56 Gráfico 9 Quantificação de RANTES/CCL5 por ELISA........................................................57 Gráfico 10 Quantificação de Kc/CXCL1 por ELISA..............................................................57

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Histologia de animais WT EAE e PI3Kγ-/- EAE com 14 dias de indução. ................54 Figura 2 Histologia de animais WT EAE e PI3Kγ-/- EAE com 28 dias de indução .................55

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Modelos de EAE ativa. .........................................................................................21 TABELA 2 Método de avaliação clínica proposto por Guan et al. .........................................37 TABELA 3 Método de avaliação clínica proposto por Weaver...............................................38 TABELA 4 Análise semiquantitativa do SNC nos camundongos WT e PI3Kγ-/- ...................55

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Ilustração 1 Recrutamento, rolamento, adesão e transmigração celular...................................25 Ilustração 2 Estruturas das diferentes classes de quimiocinas, células nas quais elas agem e exemplos...................................................................................................................................27 Ilustração 3 Organograma simplificado listando as isoformas de PI3K e suas respectivas subunidades catalíticas. ............................................................................................................30 Ilustração 4 Estrutura do fosfatidilinositol ...............................................................................31 Ilustração 5 Reação catalisada pela fosfatidilinositol-3-cinase. ...............................................31 Ilustração 6 Esquema da estrutura da PI3K classe IB, subunidade p110γ. ..............................32 Ilustração 7 Esquema representativo da craniotomia ..............................................................40 Ilustração 8 Foto do equipamento utilizado no teste de nocicepção.. ......................................44 Ilustração 9 Foto no momento do teste de nocicepção.............................................................45

RESUMO

A encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é um modelo animal para o

estudo de inflamação no sistema nervoso central. É de extrema importância para as pesquisas

em neuro-inflamação, uma vez que este processo ainda é bastante desconhecido e constitui o

cerne de diversas doenças, como a esclerose múltipla. Assim, a EAE é usada como uma

ferramenta na busca pelo desenvolvimento de terapias para as doenças envolvendo neuro-

inflamação, podendo, desse modo, ser utilizada como um modelo experimental para a

esclerose múltipla.

Um dos estágios do processo neuro-inflamatório é a migração de leucócitos para o

sistema nervoso central. A enzima fosfatidilinositol-3-cinase γ (PI3Kγ) tem sido intensamente

pesquisada nos últimos anos pelo seu envolvimento na mobilidade celular, especialmente de

leucócitos. No entanto, não se encontram estudos que investiguem o papel dessa enzima no

modelo de EAE.

Portanto, neste trabalho, objetivou-se pesquisar os efeitos da enzima PI3Kγ na

encefalomielite auto-imune experimental. Para tanto, foram utilizados camundongos

deficientes do gene para a enzima PI3Kγ (animais PI3Kγ-/-) e um inibidor desta enzima.

Avaliaram-se, nestes animais: a manifestação clínica, a perda de massa e a resposta

nociceptiva pós-indução (p.i.) de EAE; parâmetros de rolamento e adesão de leucócitos na

microvasculatura cerebral da pia-máter através da microscopia intravital; condições

histopatológicas para verificar a presença de infiltrados perivasculares no sistema nervoso

central (SNC); e a produção de quimiocinas no SNC por enzyme linked immuno sorbent assay

(ELISA).

Constatou-se: alteração no curso clínico da EAE nos animais PI3Kγ-/-, com escore

clínico inferior aos animais selvagens (WT) EAE e maior perda de massa nos animais WT

EAE que nos animais PI3Kγ-/- EAE; resposta nociceptiva alterada, com hipernocicepção no

grupo WT EAE, mas não no grupo PI3Kγ-/- EAE; aumento de rolamento e adesão nos animais

PI3Kγ-/- EAE (p<0,05) em relação aos animais não induzidos; ausência de infiltrados

perivasculares em animais PI3Kγ-/- EAE, em contraste com os animais WT EAE que

apresentavam infiltrados perivasculares no tecido cerebral; e diminuição da concentração de

quimiocinas pró-inflamatórias como MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 (p<0,05) nos animais

PI3Kγ-/- EAE em relação aos animais WT EAE.

Assim, este estudo sugere que há participação relevante da PI3Kγ no processo de

inflamação do SNC. Entretanto, são necessários mais estudos para o estabelecimento da

função específica desta enzima na neuroinflamação, pois um maior entendimento de seu papel

neste processo pode ser importante para a compreensão das causas de doenças como a

esclerose múltipla e, talvez, tornar a PI3Kγ um alvo terapêutico nessas doenças.

ABSTRACT

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model for the

study of inflammation in the central nervous system. It is extremely important for the research

in neuroinflammation, as long as this process remains largely unknown and constitutes the

core of many diseases, including multiple sclerosis. Thus, EAE is used as a tool in the

development of therapies to diseases involving neuroinflammation, which allows EAE to be

an experimental model of multiple sclerosis.

One of the stages of the neuroinflammatory process is the leukocytes’ migration

into the central nervous system. The enzyme phosphatidylinositol-3-kinase γ (PI3Kγ) has

been intensively studied in the last years due to its involvement in cellular mobility, especially

of leukocytes. However, no studies concerning the role of this enzyme in the EAE model can

be found.

Therefore, in this work, the effects of PI3Kγ on experimental autoimmune

encephalomyelitis are investigated. For this aim, PI3Kγ knock out (PI3Kγ-/-) mice and a

PI3Kγ inhibitor were used. The evaluated parameters included: clinical signs, weight loss and

nociception post-EAE induction; rolling and adhesion of leukocytes in brain microvasculature

of pia-mater analyzed by intravital microscopy; histopathology of central nervous system

(CNS) to find perivascular cuffs; and production of chemokines of the CNS using enzyme

linked immuno sorbent assay (ELISA) technique.

There was a significant decrease in PI3Kγ-/- EAE score as compared with WT

EAE mice (p<0,05) and increased weight loss in WT EAE mice as compared with PI3Kγ-/-

EAE (p<0,05); altered nociceptive response, hypernociception in WT EAE, but not in PI3Kγ-/-

EAE (p<0,05); increase of rolling and adhesion in PI3Kγ-/- EAE (p<0,05) as compared with

non-induced animals; absence of perivascular cuffs in PI3Kγ-/- EAE animals after 14 days of

induction, but not in WT EAE mice which presented perivascular cuffs in brain tissue and

occurrence of perivascular cuffs in PI3Kγ-/- EAE animals after 28 days of induction; and

decrease of proinflammatory chemokine synthesis like MCP-1/CCL2 (p<0,05) and

RANTES/CCL5 (p<0,05) in PI3Kγ-/- EAE as compared with WT EAE mice.

Thus, there may be a relevant role for PI3Kγ in the inflammatory process in CNS.

Further studies are needed to establish the specific role of this enzyme in neuroinflammation,

because a better comprehension of its function in this process may be important for the

understanding of the underlying causes of diseases like multiple sclerosis. Hence, PI3Kγ may

become a therapeutic target in neuroinflammatory diseases of the CNS.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................18 1.1 Esclerose Múltipla ............................................................................................................18 1.2 Modelo de encefalomielite auto-imune experimental (EAE)........................................20 1.2.1 Introdução.......................................................................................................................20 1.2.2 História da EAE..............................................................................................................20 1.2.3 Modelos de EAE .............................................................................................................20 1.2.4 Modelo de EAE induzido por MOG: vantagens e limitações .......................................22 1.3 Microscopia intravital ......................................................................................................24 1.4 Recrutamento de leucócitos para o sistema nervoso central e o papel das quimiocinas no processo ..............................................................................................................................25 1.5 A barreira hematoencefálica ...........................................................................................28 1.6 Nocicepção e o modelo de encefalomielite auto-imune experimental ..........................29 1.7 Fosfatidilinositol-3-cinase ................................................................................................29 2 OBJETIVOS ........................................................................................................................34 2.1 Objetivo geral....................................................................................................................34 2.2 Objetivos específicos.........................................................................................................34 3 MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................................36 3.1 Animais ..............................................................................................................................36 3.2 Reagentes e indução da EAE ...........................................................................................36 3.3 Avaliação clínica da EAE.................................................................................................37 3.4 Microscopia intravital no cérebro do camundongo.......................................................39 3.5 Preparo de homogenato de cérebro de camundongo ....................................................40 3.6 Determinação de citocinas por ELISA ...........................................................................40 3.7 Histologia...........................................................................................................................41 3.7.1 Fixação do tecido e recorte dos órgãos..........................................................................41 3.7.2 Desidratação, diafanização e inclusão em parafina .....................................................42 3.7.3 Microtomia......................................................................................................................42 3.7.4 Coloração Hematoxilina-Eosina ...................................................................................42 3.7.5 Análise Histopatológica..................................................................................................43 3.8 Teste de pressão crescente na pata de camundongo......................................................43 3.9 Análise estatística..............................................................................................................45 4 RESULTADOS ....................................................................................................................47 4.1 Evolução clínica ................................................................................................................47 4.2 Interação leucócito-endotélio...........................................................................................50 4.3 Análise histopatológica.....................................................................................................53 4.4 Análise de quimiocinas.....................................................................................................56 5 DISCUSSÃO ........................................................................................................................59 6 CONCLUSÕES....................................................................................................................66 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................68 ANEXO A – RESULTADOS.................................................................................................80

17

INTRODUÇÃO

18

1 INTRODUÇÃO

1.1 Esclerose Múltipla

A esclerose múltipla é a doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC)

mais comum e para a qual os tratamentos atuais têm efetividade limitada. Em média, a idade

de acometimento é aos 30 anos e, com exceção de traumas, a esclerose múltipla permanece

sendo a mais freqüente causa de incapacidade neurológica em adultos jovens de países

desenvolvidos (AL-OMAISHI et al., 1999). Caracteriza-se pela ocorrência de lesões

desmielinizantes inflamatórias focais na substância branca encefálica ou na medula espinhal,

que são responsáveis pela determinação dos sintomas clínicos observados nos pacientes

(RAINE et al., 1997; COMPSTON et al., 2005). Os sintomas mais comuns incluem déficits

motores (paralisias) e sensitivos (hipo ou anestesias), alterações visuais e esfincterianas.

Todos esses sintomas, ao gerarem incapacidade funcional, têm impacto significativo na

qualidade de vida do indivíduo.

A doença foi descrita pela primeira vez em 1868 por Jean Martin Charcot, que

notou o acúmulo de células inflamatórias em uma distribuição perivascular na substância

branca do cérebro e da medula espinhal de pacientes com episódios intermitentes de disfunção

neurológica (CHARCOT, 1868 citado por HAFLER, 2004). Desde então, a doença é

tradicionalmente descrita como sendo auto-imune por duas razões: a presença de inflamação e

a ausência de outros fatores (como vírus ou bactérias) relacionados ao surgimento da doença

(HAFLER, 2004).

No Brasil, a esclerose múltipla é considerada uma doença de média prevalência

(OLIVEIRA et al, 1999). Em um estudo de Callegaro et al (1997), constatou-se prevalência de

15 casos por 100 000 habitantes na cidade de São Paulo, sendo a prevalência mais de 2 vezes

maior em mulheres que em homens. Em outro estudo em Belo Horizonte de Lana-Peixoto et

al. (2002), constatou-se prevalência de 18 em 100 000 habitantes.

O curso clínico da esclerose múltipla pode variar, sendo categorizada em três

formas: surto-remissão, secundariamente-progressiva e primariamente progressiva. Em

aproximadamente 85% dos pacientes, a doença inicia-se com episódios de surtos alternados

com subseqüente remissão completa ou parcial. Na maioria dos pacientes, contudo, esse curso

inicial é seguido de uma fase secundariamente progressiva na qual há evolução contínua dos

déficits neurológicos. Parte dos pacientes (15%) exibe características primariamente

19

progressivas, em que há uma piora contínua e irreversível dos sinais clínicos desde o início da

doença. Ressalta-se, portanto, a importância do desenvolvimento de novas, seguras e efetivas

terapias para tratar o curso progressivo da esclerose múltipla (VIRLEY, 2005).

Os sintomas da esclerose múltipla podem ser avaliados de acordo com algumas

escalas que avaliam as funções piramidais, cerebelares, de tronco encefálico, sensitivas, de

bexiga e de intestino, ópticas e mentais. Duas escalas comumente utilizadas são a EDSS

(Expanded Disability Status Scale, KURTZKE, 1983) e a NRS (Neurologic Rating Scale,

HAUSER et al., 1983).

Embora os eventos que ocasionem a doença não estejam totalmente

compreendidos, a maior parte das evidências leva a crer numa etiologia auto-imune associada

a fatores ambientais e a predisposições genéticas ainda incertas. A esclerose múltipla é

caracterizada essencialmente por inflamação no SNC, sobretudo na substância branca. Esse

processo inflamatório está associado ao influxo de células mononucleares através da barreira

hematoencefálica (BHE) em resposta a uma variedade de estímulos teciduais, que incluem

citocinas inflamatórias e quimiocinas. As células inflamatórias levam à perda da mielina,

disfunção da integridade dos oligodendrócitos e, posteriormente, perda axonal. Esses eventos

são, em última instância, os responsáveis pelos sintomas e pela incapacidade funcional

relacionada à doença. Portanto, o entendimento do processo inflamatório, especialmente da

migração de células para o SNC, é fundamental na compreensão da esclerose múltipla (AL-

OMAISHI et al., 1999).

20

1.2 Modelo de encefalomielite auto-imune experimental (EAE)

1.2.1 Introdução

Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) mostra-se eficaz ao reproduzir os

principais sintomas e sinais da esclerose múltipla e, por isso, além de ser um modelo de

neuro-inflamação, é considerado um modelo animal para o estudo da esclerose múltipla.

Existem diferentes métodos para a indução de EAE, mas em comum está o fato de se

estimularem células T encefalitogênicas a migrarem para o SNC, provocando inflamação.

1.2.2 História da EAE

O modelo foi utilizado pela primeira vez em 1933 por Thomas Rivers (EPPS,

2005), que administrou extratos de cérebro de coelho em macacos Rhesus. Rivers percebeu

que os animais desenvolviam paralisia e esta condição era dependente da quantidade de

mielina que havia no extrato aplicado no animal. A indução era bastante trabalhosa, pois

Rivers fazia cerca de 80 aplicações de extrato de cérebro por animal, durante um período de

um ano. Alguns anos depois, Kabat et al. (1946) utilizaram um adjuvante recentemente

desenvolvido por Jules Freund. A partir daí, era necessária apenas uma injeção de extrato de

cérebro para que a indução acontecesse (EPPS, 2005).

1.2.3 Modelos de EAE

Após a incorporação dos adjuvantes à indução, muitos modelos de EAE foram

desenvolvidos em roedores por uma sensibilização ativa com antígenos de mielina, como o

MOG (do inglês: “myelin oligodendrocyte glycoprotein”) ou o PLP (proteo lipid protein) ou

pela transferência passiva de células T CD4+ de perfil Th1 reativas à mielina (STROMNES &

GOVERMAN, 2006). Exemplos de modelos de EAE em roedores são mostrados na tabela da

página seguinte.

21

TABELA 1

Modelos de EAE ativa. Linhagem do

camundongo

Peptídeo Seqüência do peptídeo Origem do peptídeo

PL/J MBPAc1-11 Ac-ASQKRPSQRHG Rato

B10.PL MBPAc1-9 Ac-ASQKRPSQR Rato/camundongo

SJL/J PLP139-151 HCLGKWLGHPDKF Humano/camundongo

PLP178-191 NTWTTCQSIAFPSK Humano/camundongo

MBP84-104b VHFFKNIVTPRTPPPSQGKGR Camundongo

MOG92-106d DEGGYTCFFRDHSYQ Rato

C57BL/6 MOG35-55 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK Rato/camundongo

MOG35-55 MEVGWYRPPFSRVVHLYRNGK Humano

NOD MOG35-55 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK Rato/camundongo

PLP48-70 TYFSKNYQDYEYLINIHAFQYV Humano/camundongo

C3H.SW MOG35-55 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK Rato/camundongo

ABH (Biozzi) PLP56-70 DYEYLINVIHAFQYV Camundongo

MOG8-22 PGYPIRALVGDEQED Rato

A.SW MOG92-106d DEGGYTCFFRDHSYQ Rato

C3H/HeJ PLP190-209 SKTSASIGSLCADARMYGVL Humano/camundongo

PLP215-232 PGKVCGSNLLSICKTAEFQ Humano/camundongo

CBA/J PLP190-209 SKTSASIGSLCADARMYGVL Humano/camundongo

PLP215-232 PGKVCGSNLLSICKTAEFQ Humano/camundongo

DBA/1 MOG79-96d GKVALRIONVRFSDHGGY Rato

Fonte: Stromnes e Goverman (2006) com modificações.

22

1.2.4 Modelo de EAE induzido por MOG: vantagens e limitações

O modelo utilizado neste trabalho envolve a proteína MOG. Suspeita-se do

envolvimento dessa proteína em EAE desde 1976 quando Lebar e colaboradores

argumentavam que a desmielinização observada em animais induzidos era mediada por

anticorpos com reatividade para um componente da mielina, na época denominado M2

(LEBAR et al., 1976). Em 1984, Linington e colaboradores identificaram a proteína pela

primeira vez, e logo ela foi associada aos anticorpos relatados pelo trabalho de Lebar

(LININGTON et al., 1984). Em 1995, Johns e colaboradores induziram EAE em ratos Lewis

utilizando pela primeira vez a proteína MOG purificada, ao invés do extrato de cérebro. No

mesmo ano, Adelmann e colaboradores descobriram que um dos epítopos reconhecidos pelo

sistema imune correspondia aos 21 aminoácidos da posição 35 a 55 da proteína MOG,

consolidando, assim, a indução através do peptídeo MOG35-55.

Semelhanças entre EAE e esclerose múltipla incluem lesões com desmielinização

que ocorre no SNC, principalmente na substância branca, a presença de linfócitos T CD4+ e T

CD8+, além de moléculas do complemento nessas lesões. Tal similaridade entre os dois

quadros patológicos faz da EAE um modelo útil no estudo dos mecanismos fisiopatológicos

da esclerose múltipla e, não obstante, valida a EAE como um modelo para o desenvolvimento

de terapias.

No entanto, não é uma unanimidade considerar EAE como um modelo de

esclerose múltipla. Isso porque, apesar de muitas semelhanças com aquela doença, a EAE

possui diferenças importantes. Do ponto de vista farmacológico, dois medicamentos testados

com sucesso em EAE falharam no tratamento de esclerose múltipla. Um deles é um

bloqueador da integrina α4β1. Este medicamento foi eficiente no tratamento dos modelos de

EAE e também foi bastante eficaz em alguns pacientes, porém houve dois casos de

desenvolvimento de leucoencefalopatia multifocal progressiva que vieram a óbito (BART,

2006). Por outro lado, algumas terapias para esclerose múltipla presentes no mercado foram

desenvolvidas devido a seu êxito em atenuar a EAE, dentre as quais é importante citar o

acetato de glatiramer (SCHREMPF e ZIEMSSEN, 2007).

Neste trabalho, optou-se por considerar EAE como modelo de esclerose múltipla,

uma vez que os parâmetros de neuroinflamação investigados neste trabalho têm suma

importância na etiopatogênese desta doença.

23

Kuchroo et al. (2002) apresentaram uma proposta do mecanismo fisiopatológico

que desencadearia a EAE. O papel de células T CD4+ auto-reativas é fundamental neste

processo. A maior parte destas células seria eliminada durante o desenvolvimento no timo,

mesmo aquelas que expressam antígenos de mielina. No entanto, algumas células auto-

reativas escapariam da seleção tímica e constituiriam o repertório periférico de células T.

Estas células seriam ativadas a partir do contato com o epítopo antigênico, contato este

mediado por complexo de histocompatibilidade principal (MHC – main histocompatibility

complex) em conjunto com sinais coestimulatórios apropriados. Após este evento, células T

migrariam pela barreira hematoencefálica e, no SNC, precisariam ser reativadas por células

apresentadoras de antígeno locais, também expressando moléculas coestimulatórias, para que

se inicie a inflamação e o dano ao tecido. Embora as células Th1 sejam necessárias para

iniciar a doença, muitas das células vistas em lesões de EAE são recrutadas

inespecificamente. Estas células infiltradas consistem principalmente de células T e

macrófagos e, numa menor extensão, células B. Macrófagos ativados destroem mielina dos

axônios e secretam inúmeras citocinas, incluindo IL-1 e TNF-α, o que perpetuaria reações

inflamatórias não específicas e contribuiria para o dano tecidual. Assim, após a saída do timo,

células T auto-reativas têm que passar por diversos pequenos estágios para mediar uma

doença auto-imune: elas devem ser ativadas no compartimento imune, diferenciar-se para

assumir um fenótipo efetor patogênico, expressar moléculas de adesão apropriadas, migrar

para o órgão efetor e ser reativadas para recrutar outras células que participarão do dano

tecidual e do desenvolvimento da doença auto-imune.

24

1.3 Microscopia intravital

Microscopia de fluorescência intravital é uma técnica estabelecida para a análise

da microcirculação de órgãos. Ela possibilita a avaliação de parâmetros microhemodinâmicos

e interação entre leucócitos e endotélio in vivo. Usando esta técnica, novas informações têm

sido obtidas sobre os mecanismos patológicos de várias desordens imunológicas e a influência

de drogas em parâmetros de perfusão microvascular (MENGER e LEHR, 1993; MENGER e

VOLLMAR, 1996).

Na inflamação aguda, a microscopia de fluorescência intravital tem fornecido

dados relevantes sobre os primeiros momentos da interação endotélio-leucócitos in vivo.

Além disso, informações sobre o papel das moléculas de adesão nos fenômenos de rolamento

de leucócitos, adesão e migração pelo endotélio inflamado foram obtidas em estudos in vivo

(GRANGER e KUBES, 1994; HARRIS et al., 1996; JOHNSTON et al. 1995). Vajkoczy et al.

(2001), por exemplo, utilizaram microscopia intravital em medula espinhal de camundongos

SJL para verificar a participação de integrina α4 e VCAM na adesão e rolamento de leucócitos

no endotélio dos vasos no SNC. Em outro estudo, Piccio et al. (2005) analisaram parâmetros

de rolamento e adesão por microscopia intravital com o intuito de verificar a dependência de

fucosiltransferase-VII e CLA (cutaneous limphocyte antigen) no processo.

A avaliação de parâmetros de rolamento e adesão de leucócitos também foi

utilizada em alguns trabalhos envolvendo EAE. Kerfoot et al. (2006) observaram que o duplo

bloqueio de PSGL-1 (ligante de leucócitos para P-selectina) e integrina α4 diminuía adesão e

rolamento na microvasculatura cerebral de camundongos e resultava em atraso no início dos

sinais clínicos de EAE, além de recuperação significativa após o primeiro surto. Dos Santos et

al. (2005) investigaram os efeitos de MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 em diferentes

momentos da EAE, correlacionando os níveis destas quimiocinas com adesão e rolamento na

microvasculatura cerebral em camundongos. Ni et al. (2004) usaram a microscopia intravital

para investigar o mecanismo pelo qual o agonista do receptor canabinóide Win 55212-2

atenuava EAE.

25

1.4 Recrutamento de leucócitos para o sistema nervoso central e o papel das quimiocinas

no processo

O recrutamento de leucócitos na EAE depende de uma gama de quimiocinas

liberadas por diversas células do SNC, do endotélio vascular e do sistema imune. Nesse

contexto, as quimiocinas são mediadores críticos da migração celular que se ligam a

receptores acoplados a proteína G (ALLEN et al., 2007).

Podem-se listar três rotas de entrada de leucócitos no SNC. Migração do sangue

para o fluido cerebrospinal através do plexo coróide ou através dos vasos das meninges para o

espaço subaracnóideo; migração do sangue para o parênquima perivascular do cérebro; e

migração do sangue para o parênquima perivascular da medula espinhal (REBENKO-MOLL et

al., 2006).

A migração de leucócitos do sangue para o parênquima perivascular do cérebro é

um processo que se inicia pela interação da célula com o endotélio do vaso, interação esta

estimulada por quimiocinas, como dito anteriormente. A figura a seguir resume o processo.

Ilustração 1 Recrutamento, rolamento, adesão e transmigração celular. Fonte: Queiroz (2007).

Quimiocinas, termo resultante da fusão de “citocinas quimiotáticas”, são uma

grande família de pequenas proteínas básicas que exercem um amplo espectro de funções

26

biológicas e patológicas. A demonstração in vitro de que uma molécula é uma quimiocina

consiste no estímulo quimiotático de leucócitos de uma forma dependente da concentração da

suposta quimiocina (SAVARIN-VUAILLAT & RANSOHOFF, 2007). É comum a todas as

quimiocinas descritas até o momento o fato de sua ação efetora depender da ligação da

molécula a receptores de membrana acoplados à proteína G.

A subfamília CC é caracterizada pela presença de dois resíduos de cisteína

sucessivos. Os membros desta que é a maior subfamília têm espectro de ação amplo e podem

atrair monócitos, eosinófilos, basófilos, linfócitos T, células “natural killer” (NK) e células

dendríticas. As quimiocinas da subfamília CXC recebem esta denominação pela interposição

de um aminoácido (X) entre seus dois primeiros resíduos de cisteína e subdividem-se entre

aquelas que possuem o motivo glutamato-leucina-arginina (ELR) e aquelas que não possuem.

São utilizadas na quimiotaxia para neutrófilos (se também contiverem o motivo ELR) e para

linfócitos e monócitos (se não apresentarem o motivo ELR). As quimiocinas C apresentam

apenas dois dos quatro resíduos que ocorrem nas outras subfamílias e podem agir em

linfócitos, mas não em neutrófilos ou monócitos. A quimiocina da família CX3CL possui três

aminoácidos entre os dois primeiros resíduos de cisteína e um domínio semelhante a mucina

em sua extremidade C-terminal. Age como molécula de adesão ou quimioatraente para células

T, células NK e fagócitos mononucleares (SAVARIN-VUAILLAT & RANSOHOFF, 2007).

27

Ilustração 2 Estruturas das diferentes classes de quimiocinas, células nas quais elas agem e exemplos. Fonte: Savarin-Vuaillat & Ransohoff (2007) com modificações.

28

1.5 A barreira hematoencefálica

A entrada de moléculas ou células no sistema nervoso central está condicionada à

ação da barreira hematoencefálica (BHE), que consiste principalmente de células endoteliais

unidas por tight junctions. As tight junctions impedem a entrada de moléculas no parênquima

cerebral, o que confere a menor permeabilidade intercelular no endotélio capilar do sistema

nervoso central. Além disso, as células endoteliais possuem taxa diminuída de endocitose, o

que limita também o tráfego de moléculas intracelular (BELLAVANCE et al., 2008)

Para que uma molécula consiga atravessar a BHE, ela deve pesar menos de 180Da

e apresentar uma lipossolubilidade compatível (KROLL e NEUWELT, 1998; PARDRIDGE, 2005).

Essas são as propriedades essenciais, mas, além delas, o grau de ionização, a ligação a

proteínas do plasma, o fluxo sangüíneo local e a afinidade por carreadores também podem

influenciar na permeabilidade da BHE (KEMPER et al., 2004). Poucas moléculas apresentam

essas características, e mesmo que as apresente, ainda assim a entrada ao sistema nervoso

central não está garantida (GHOSE et al., 1999; LIPINSKI, 2000). Bombas de efluxo ativas, tal

como a glicoproteína P, oferecem uma barreira protetora adicional ao sistema nervoso central,

por agir lançando moléculas danosas de volta à corrente sangüínea (JULIANO E LING, 1976;

CORDON-CARDO et al., 1990). Em conseqüência, 98% das pequenas moléculas e todas as

moléculas de alto peso molecular são excluídas do compartimento do sistema nervoso central

(PARDRIGDE, 2005). Assim, a BHE regula a homeostase cerebral por controlar a composição

do CSF e o compartimento dos fluidos extracelulares, via entrada e retirada de compostos

específicos da interface sangue-cérebro.

Segundo Persidsky et al. (2006):

“A barreira hematoencefálica (BHE) é estruturalmente formada pelo endotélio

microvascular, astrócitos, membrana basal e pericitos, além dos neurônios que

estão em proximidade física com o endotélio. Todos estes elementos são parte da

unidade neurovascular. Sob condições fisiológicas, a BHE garante o suprimento

constante de nutrientes (oxigênio, glicose e outras substâncias) para as células do

cérebro e direciona as células inflamatórias.”

Assim, além de ser responsável por tráfego reduzido de células do sistema imune

para o SNC (ENGELHARDT, 2006), a BHE também é importante para que ocorra a entrada de

células inflamatórias, principalmente células T ativadas (HICKEY et al., 1991) no SNC.

29

No modelo de EAE, a invasão de células T através da BHE é considerada um dos

acontecimentos que antecedem a manifestação da patologia auto-imune (SMORODCHENKO et

al., 2007). Exemplos de alterações da BHE na EAE são mostrados no trabalho de Floris et al.

(2003), no qual ficou demonstrado aumento da permeabilidade da BHE em ratos Lewis pouco

antes do surgimento de infiltrados de monócitos no sistema nervoso central; e no trabalho de

Wuerfel et al. (2007), no qual, utilizando ressonância magnética, foram detectadas alterações

na BHE de camundongos antes das manifestações clínicas da EAE.

1.6 Nocicepção e o modelo de encefalomielite auto-imune experimental

Dor é definida como “uma experiência sensorial e emocional desagradável

associada a um dano atual ou potencial ao tecido, ou descrita em termos de tal dano”

(International Association for the Study of Pain, IASP, 2007).

Embora a ocorrência de sintomas álgicos e disestésicos seja elevada na esclerose

múltipla (NOSEWORTHY et al., 2000), existe apenas um trabalho abordando nocicepção em

modelos de esclerose múltipla. Aicher et al. (2004) avaliaram nocicepção por estímulo com

calor em camundongos SJL induzidos com o peptídeo PLP. Encontrou-se uma diferença na

nocicepção entre camundongos machos e fêmeas. Neste estudo, pouco antes do início dos

sinais clínicos, os animais apresentaram hipoalgesia, seguida de uma persistente hiperalgesia

durante a fase crônica da doença, tanto em machos quanto fêmeas.

No presente trabalho, o método utilizado para análise de nocicepção é baseado nos

filamentos de von Frey (VON FREY, 1896). Originalmente, o método era utilizado em humanos

e consistia em pressionar filamentos com espessura da ordem de 10-1mm de diâmetro sobre a

pele. Variando o diâmetro do filamento, podia-se determinar o limite mínimo de pressão

necessário para que houvesse a sensação de toque (PEARCE, 2005). Em 1998, o método foi

adaptado para ratos por Möller et al. (1998), e em 2004 foi adaptado para camundongos por

Cunha et al.(2004).

1.7 Fosfatidilinositol-3-cinase

Fosfatidilinositol-3-cinases (PI3K), também conhecidas como fosfoinositídeo-3-

cinases, são enzimas que fosforilam o grupo inositol na posição D3, formando, por exemplo,

fosfatidilinositol 3,4,5-bisfosfato [PtdIns(3,4,5)P2] (Ilustração 4).

http://www.iasp-pain.org/AM/Template.cfm?Section=General_Resource_Links&Template=/CM/HTMLDisplay.cfm&ContentID=3058#Pain

30

PI3Ks são proteínas filogeneticamente conservadas presentes de leveduras aos

mamíferos superiores e são divididas em classes I, II e III, de acordo com sua estrutura

molecular, regulação celular e especificidades do substrato in vivo (ROMMEL et al., 2007). As

PI3Ks, que incluem a classe IA (contendo as isoformas PI3Kα, PI3Kβ e PI3Kδ) e classe IB

(contendo apenas a PI3Kγ), controlam muitas funções celulares como crescimento e

proliferação, sobrevivência e apoptose, bem como adesão e migração (ROMMEL et al., 2007).

Todas as isoformas têm como subunidade catalítica a p110; as isoformas p110α e p110β são

sintetizadas em vários tecidos e as isoformas p110δ e p110γ são sintetizadas em maior

proporção nos leucócitos (COSTA et al., 2007).

Ilustração 3 Organograma simplificado listando as isoformas de PI3K e suas respectivas subunidades catalíticas.

31

Ilustração 4 Estrutura do fosfatidilinositol (Ptdins). Ptdins é um glicerofosfolipídeo. Em células animais, R é tipicamente um ácido graxo de cadeia saturada, como o estearato (C18), enquanto R’ é tipicamente um ácido graxo de cadeia longa poli-insaturada, como o araquidonato (C20). Fosfoinositídeos são gerados quando a cabeça do grupo, o anel de inositol com seis carbonos, é fosforilado em várias posições. Fonte: Thorner (2001) com modificações.

Ilustração 5 Reação catalisada pela fosfatidilinositol-3-cinase. Fonte: Ross et al. (2001) com modificações.

32

Ilustração 6 Esquema da estrutura da PI3K classe IB, subunidade p110γ. Fonte: Deane e Fruman (2004) com modificações.

Há relatos de que a isoforma PI3K p110γ (PI3Kγ) esteja envolvida em processos

inflamatórios. Em modelos de artrite reumatóide, Camps et al. (2005) mostraram que

camundongos knock out para essa isoforma eram resistentes à doença, assim como eram

camundongos selvagens que recebiam um inibidor de PI3Kγ. Ferrandi et al. (2007)

mostraram que a PI3Kγ tem um papel fundamental no recrutamento de neutrófilos dependente

de RANTES/CCL5 durante os eventos iniciais da inflamação num modelo de artrite

reumatóide.

Verificou-se que a migração in vitro de células CD4+ e CD8+ deficientes de PI3Kγ

para um gradiente de CCL9, CXCL12 e CCL21 é significativamente menor que em células de

animais selvagens. Esse efeito depende exclusivamente da forma γ da enzima já que a

deficiência de PI3Kδ não teve nenhum efeito na migração de células T (REIF et al., 2004). Em

outro estudo, Liu et al. (2007) investigaram os efeitos das isoformas δ e γ tanto no

recrutamento quanto na migração de neutrófilos. Constatou-se que a migração dos neutrófilos

dependia das duas isoformas, em momentos distintos do processo de migração.

FERGUSON et al. (2007) mostraram que a migração de neutrófilos in vitro

estimulada por quimiocinas depende de PI3Ks, particularmente PI3Kγ, sendo que o efeito da

enzima depende da superfície e do contexto de quimiotaxia do neutrófilo.

SMITH et al. (2007) utilizaram inibidores de várias isoformas de PI3K além de

siRNA e concluíram que a PI3Kγ é a isoforma dominante na resposta migratória ex vivo em

linfócitos T de humanos.

Portanto, baseando-se em diversos relatos da literatura demonstrando o

envolvimento da PI3Kγ em processos inflamatórios, justifica-se a investigação do papel da

PI3Kγ na EAE.

33

OBJETIVOS

34

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Investigar os efeitos da indução de modelo de neuroinflamação – encefalomielite

auto-imune experimental – em camundongos deficientes para o gene da enzima PI3Kγ.

2.2 Objetivos específicos

Estudar a resposta clínica de camundongos selvagens e deficientes para o gene da

enzima PI3Kγ submetidos à EAE;

Avaliar a resposta nociceptiva de camundongos selvagens e deficientes para o

gene da enzima PI3Kγ submetidos à EAE;

Realizar análise histopatológica do tecido cerebral de camundongos selvagens e

deficientes para o gene da enzima PI3Kγ submetidos à EAE;

Investigar a dinâmica de rolamento e adesão de leucócitos na circulação cerebral

de camundongos selvagens, camundongos selvagens que receberam administração de um

inibidor da PI3Kγ e camundongos deficientes para o gene da enzima PI3Kγ submetidos à

EAE;

Verificar a produção de quimiocinas do tecido cerebral dos animais selvagens e

deficientes para o gene da enzima PI3Kγ submetidos à EAE.

35

MATERIAIS E MÉTODOS

36

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais

Animais C57BL/6 fêmeas com idade entre 8 e 12 semanas foram obtidos do

Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas

Gerais (CEBIO-ICB-UFMG). Os animais PI3Kγ-/- com a mesma idade foram gentilmente

doados por Josef M. Penninger, então pesquisador do Instituto Amgen, Toronto, Canadá

(SASAKI et al., 2000). Os animais foram mantidos com água e ração ad libitum. O projeto foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de

Minas Gerais (CETEA - UFMG), sob o número de protocolo 129/06.

3.2 Reagentes e indução da EAE

O peptídeo MOG (MOG35-55), de seqüência 35-55

(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK), e adjuvante completo de Freund (CFA) foram obtidos

da Sigma Chemical Co. EAE foi induzida por imunização subcutânea na base da cauda com

uma emulsão contendo 100µg do peptídeo MOG35-55 e CFA suplementado com 4mg/mL de

uma cepa atenuada H37 RA de Mycobacterium tuberculosis (Laboratórios Difco) macerado

com o auxílio de um cadinho. O animal foi anestesiado (anestésico descrito no item 3.4) antes

da imunização cuja administração ocorria em duas doses de 50mg nas laterais da base da

cauda do animal. A emulsão foi preparada utilizando-se duas seringas acopladas a um

threeway; após cerca de 10 min de mistura, a solução atinge a consistência necessária para a

injeção subcutânea.

Injetou-se toxina pertussis (Sigma Chemical Co.) em duas doses de 300ng por

animal intraperitonealmente no dia da imunização e 48h depois. Os animais foram

monitorados diariamente e os sinais neurológicos foram quantificados com escalas clínicas

descritas a seguir. O monitoramento dos animais incluiu, além da quantificação dos sinais

clínicos, a medida da massa de cada animal.

37

3.3 Avaliação clínica da EAE

O estado clínico dos animais foi monitorado diariamente por dois métodos. O

método descrito por Weaver et al. (2005) consiste na avaliação isolada da cauda, dos

membros posteriores, dos membros anteriores e da bexiga do animal. Cada membro recebe

uma pontuação de acordo com os critérios estabelecidos e a soma de todos os pontos é

definida como a condição clínica do animal (TABELA 3). O outro método, descrito por Guan

et al. (2006), é baseado na avaliação de cauda, membros posteriores e membros anteriores

(TABELA 2)

TABELA 2 Método de avaliação clínica proposto por Guan et al. (2006). Escala

0 nenhum sinal clínico

0,5 paralisia parcial de cauda

1 paralisia de cauda ou marcha alterada*

1,5 paralisia parcial de cauda e marcha desengonçada

2 paralisia de cauda e marcha desengonçada

2,5 paralisia parcial de membros inferiores

3 paralisia de um dos membros inferiores

3,5 paralisia de um dos membros inferiores e paralisia parcial do outro membro inferior

4 paralisia de dois membros inferiores

4,5 paralisia de dois membros inferiores e fraqueza nos membros superiores

5 moribundo ou morto

*Marcha em que o animal movimenta-se cambaleando, sem a postura firme exibida por um

animal saudável.

38

TABELA 3 Método descrito por Weaver (2005). Cauda

0 Um camundongo normal mantém sua cauda ereta enquanto se move. 1 Se a extremidade da cauda está flácida, com tendência a cair. 2 Se a cauda está completamente flácida e arrasta na superfície.

Membros inferiores 0 Um camundongo normal tem uma marcha precisa e não arrasta suas patas. 1 Um dos dois testes seguintes é positivo:

a) Teste da virada: enquanto mantém a cauda entre o polegar e o indicador, vire o animal de barriga para cima e observe o tempo que ele leva para consertar a postura. Um camundongo saudável se vira imediatamente. Uma demora sugere fraqueza nas patas traseiras;

b) Posicione o camundongo na parte externa da gaiola e observe sua movimentação à medida que ele atravessa de uma extremidade à outra da gaiola. Se uma ou ambas as patas traseiras freqüentemente atravessam as barras da gaiola, consideramos que há uma paralisia parcial.

2 Ambos os testes anteriores são positivos. 3 Uma ou ambas as patas traseiras mostram sinais de paralisia, mas algum

movimento é preservado, por exemplo: o animal pode agarrar e se manter na parte interna da gaiola por um curto momento antes de se soltar.

4 Quando ambas as patas traseiras estão paralisadas e o camundongo as arrasta enquanto se move.

Patas dianteiras 0 Um camundongo normal usa suas patas dianteiras ativamente para se agarrar e

andar e mantém sua cabeça ereta. 1 Andar é possível mas difícil, devido à fraqueza em uma ou ambas as patas; por

exemplo, as patas dianteiras são consideradas fracas quando o camundongo tem dificuldade em se agarrar na parte interior da gaiola. Outro sinal de fraqueza é falta de tônus no pescoço.

2 Quando uma pata dianteira está paralisada (impossibilidade de agarrar) e o camundongo fica dando voltas em torno da pata paralisada. Nesse momento, o pescoço também já perdeu muito de seu tônus muscular.

3 O camundongo não pode se mover e não consegue beber água ou se alimentar. Bexiga

0 Um camundongo normal tem total controle sobre sua bexiga. 1 Um camundongo é considerado incontinente quando a porção posterior de seu

corpo está encharcada de urina. Morte: 15* *Neste trabalho, não se utilizou esta pontuação de modo que os animais mortos eram excluídos do grupo experimental. Assim, os gráficos que ilustram a evolução da gravidade clínica não consideram os animais que morreram durante o experimento.

39

3.4 Microscopia intravital no cérebro do camundongo

A microscopia intravital na microvasculatura cerebral do camundongo foi

executada como descrita anteriormente por Carvalho-Tavares et al. (2000).

Os camundongos foram anestesiados por uma injeção intraperitoneal de uma

mistura de 150mg/kg de ketamina e 10mg/kg de xylazina e a veia da cauda foi canulada para

a administração de corantes fluorescentes. A craniotomia foi realizada usando uma broca de

alta velocidade (Dremel, EUA) e removeu-se a dura-máter para expor a vasculatura da pia-

máter. Durante o experimento, o camundongo foi mantido em 37ºC com um aquecedor (Fine

Science Tools Inc., Canadá) e o cérebro exposto foi continuamente superfundido com líquor

tamponado, cuja composição é a seguinte em mmol/L: NaCl 132; KCl 2,95; CaCl2 1,71;

MgCl2 0,64; NaHCO3 24,6; dextrose 3,71 e uréia 6,7, pH 7,4 a 37ºC.

Para observar as interações entre os leucócitos e o endotélio, os leucócitos foram

marcados por administração intravenosa de rodamina 6G (Sigma, 0,5mg/kg de peso corporal).

A rodamina 6G é um corante fluorescente, com a habilidade de marcar mitocôndrias

seletivamente. Devido a esta propriedade, o corante é usado para o estudo de leucócitos em

ensaios de microscopia intravital, com o objetivo de examinar a cinética in vivo destas células,

mesmo na presença da alta velocidade do fluxo sangüíneo (BAATZ et al., 1995).

Um microscópio (Olympus BX40), com objetiva 10X, foi utilizado para observar

os eventos microcirculatórios nos vasos cerebrais. A fluorescência associada à rodamina 6G

foi visualizada com epi-iluminação a 510-560nm, usando um filtro de emissão de 590nm.

Uma câmera de vídeo (Optronics) projetou as imagens que foram gravadas em vídeo-cassete

(VHS, Semp Toshiba, modelo x685) para uma posterior análise. O número de leucócitos em

rolamento e adesão foi determinado através de análise no dia do experimento e análise

posterior dos vídeos. O rolamento de leucócitos foi definido como células movendo a uma

velocidade menor que o fluxo sanguíneo. Leucócitos foram considerados aderidos ao

endotélio se permaneceram estacionários por um período superior a 30s. O rolamento, por ser

um processo dinâmico, foi expresso como número de células /minuto. A adesão leucocitária

foi expressa como células aderidas ao endotélio vascular Os vasos considerados para a

contagem mediam de 30µm a 70µm de diâmetro e 100µm de comprimento. A contagem foi

realizada pela mesma pessoa em todos os experimentos, e ela não sabia a qual grupo pertencia

o animal submetido à contagem.

40

Após a microscopia intravital, os animais foram sacrificados, por dose excessiva

do anestésico, e o tecido cerebral foi retirado para análise histológica e determinação de

quimiocinas.

Ilustração 7 Esquema representativo da craniotomia realizada para exposição da microcirculação cerebral. 3.5 Preparo de homogenato de cérebro de camundongo

O cérebro dos animais selvagens e de animais PI3Kγ-/- foi retirado, devidamente

acondicionado e estocado em –20ºC. As amostras foram pesadas e imersas em solução

inibidora de proteases (NaCl 0,4M; Tween 20 0,05%; Albumina de soro bovino 0,5%;

Fluoreto de fenilmetilsufonila 0,1mM; cloreto de benzetônio 0,1 mM; EDTA 10 mM; 20UI de

aprotinina), preparada a partir de uma solução de tampão fosfato (NaCl 8g, KCl 0,2g e

Na2HPO4.12H2O 2,89g diluídos em 1L), numa relação de 1mL de solução para cada 100mg

de tecido. Os tecidos foram macerados por um homogeneizador de tecidos (Ultra-Turrax) e a

solução resultante foi centrifugada a 10 000rpm/10min em 4oC. O sobrenadante foi recolhido,

aliquotado e estocado em uma temperatura de –20oC até o uso (DOS SANTOS et al., 2005).

3.6 Determinação de citocinas por ELISA

Os kits para ELISA de camundongo para Kc/CXCL1, MCP-1/CCL2 e

RANTES/CCL5 foram obtidos da R&D Systems (DuoSet) e utilizados de acordo com os

procedimentos descritos pelo fabricante. As concentrações das quimiocinas MCP-1/CCL2,

RANTES/CCL5 e Kc/CXCL1 foram avaliadas no sobrenadante em diluição 1:3 em solução

PBS:BSA 1%.

41

Em placas de 96 poços (Nunc. Immunosorb, Naperville), foram adicionados 100

µL/poço do anticorpo de captura, sendo este específico para cada molécula e em concentração

adequada. Esta solução permaneceu em contato com a placa durante 18 h a 4oC e foi,

posteriormente, lavada cinco vezes com PBS/Tween 0,1%, utilizando um lavador de placas

automático (ELX50, Bio-Tet Instruments, INC). Logo após, foram adicionados 200 µL/poço

de solução de bloqueio (PBS/BSA 1%). O tempo de bloqueio foi de duas horas sob agitação.

Transcorrido este tempo, houve nova lavagem das placas e 100µL de cada amostra foram

adicionados à placa. Paralelamente, para o estabelecimento de cada curva padrão, foram

utilizadas diferentes diluições das quimiocinas, a partir das seguintes concentrações iniciais:

Kc/CXCL1, 1000pg/mL; MCP-1/CCL2, 500pg/mL; RANTES/CCL5, 2000pg/mL. As placas

foram incubadas por mais 18 h a 4ºC. As placas foram lavadas e foram adicionados 100

µL/poço de solução de anticorpo de detecção, biotinilado e específico para cada molécula. As

placas foram incubadas por uma hora e foram lavadas em seguida. Transcorrida esta etapa,

foram adicionadas a cada placa uma solução contendo estreptavidina ligada à peroxidase

(HRP, Pharmingen). Após 30 minutos, a placa foi novamente lavada, foi adicionado o tampão

substrato contendo o-fenilenodiamina (OPD, Sigma) e H2O2 (Merck). Após cerca de 30

minutos, a reação foi interrompida com 50 µL de ácido sulfúrico (H2SO4) 1M. O produto da

oxidação do OPD foi detectado por colorimetria em leitor de placas a 492 nm (Molecular

Devices, USA). A concentração referente a cada amostra foi calculada a partir da curva

padrão correspondente.

3.7 Histologia

3.7.1 Fixação do tecido e recorte dos órgãos

Os camundongos foram sacrificados por excesso de administração do anestésico.

O cérebro foi coletado e fixado por imersão em solução de formol tamponado a 10%, pH 7,0,

com o objetivo de preservar a morfologia e a composição do tecido. Após o período de

fixação, os tecidos foram recortados e seccionados transversalmente. A cada animal foi dado

um código que apenas foi revelado ao final de todas as análises.

42

3.7.2 Desidratação, diafanização e inclusão em parafina

Os tecidos foram submetidos à desidratação em concentrações crescentes de

álcool (70%, 80%, 90%, todos uma vez e álcool absoluto três vezes) sendo que os fragmentos

permaneceram imersos por um período de 20 minutos em cada álcool.

Após a etapa de desidratação, foi realizado o processo de diafanização, que tem

como objetivo tornar o tecido translúcido. A diafanização consistiu em submeter os

fragmentos a dois banhos de xilol com duração de 20 minutos cada. Posteriormente, os

tecidos foram impregnados e incluídos em parafina.

3.7.3 Microtomia

Os blocos de parafina, contendo o fragmento do órgão, foram submetidos à

microtomia, sendo obtidos dois cortes seriados com 4µm de espessura. Cada corte foi

colocado em banho-maria para que as fitas fossem esticadas e logo depois as lâminas foram

colocadas na estufa para secarem em temperatura de 60oC.

3.7.4 Coloração Hematoxilina-Eosina

A coloração de rotina HE (hematoxilina-eosina) foi realizada nas lâminas com

cortes do tecido cerebral para uma observação geral das alterações histopatológicas.

O processo de coloração se iniciou com a imersão das lâminas em dois banhos de

xilol, de duração de 15 minutos cada, para desparafinização. Em seguida estas lâminas foram

imersas em banhos de álcool absoluto, álcool 90%, álcool 80%, álcool 70%, e água sendo

cada um dos banhos de 5 minutos para hidratação. Após a hidratação, as lâminas foram

imersas no corante Hematoxilina (corante ácido) por 10 minutos, em seguida lavadas em água

corrente por 5 minutos. A seguir, foi feita a diferenciação com a passagem rápida das lâminas

em álcool-acidulado. Novamente as lâminas foram lavadas em água corrente por 5 minutos.

Finalizada esta etapa, as lâminas foram imersas no corante Eosina (corante básico), por 30

segundos, e em seguida lavadas em água corrente por 1 minuto. Logo após, as lâminas foram

imersas em três banhos de álcool absoluto rapidamente e levadas à estufa a 60oC por alguns

minutos para secagem. Depois de secas, as lâminas foram imersas em xilol e montadas com

Entellan (Merck) e lamínula.

43

3.7.5 Análise Histopatológica

As lâminas coradas pela HE foram avaliadas utilizando-se a objetiva de 20X e

40X. Nos cortes histológicos o processo inflamatório foi avaliado de forma qualitativa na

meninge (pia-mater) e nas regiões perivasculares e caracterizado como: ausente (0), leve (1 -

pequeno número de células inflamatórias ou apresentando degeneração – até 10 células por

campo), moderado (2 - moderado número de células inflamatórias ou apresentando

degeneração – entre 10 e 50 células por campo) ou intenso (3 - acentuado número de células

inflamatórias ou apresentando degeneração – mais de 50 células por campo).

A captação de imagens foi realizada com microscópio AxioPlan 2 e software KS

400-3.0

3.8 Teste de pressão crescente na pata de camundongo

Os experimentos foram realizados utilizando o teste de pressão com um

anestesiômetro eletrônico (Insight Equipamentos, São Paulo, Brasil), que consiste em um

transdutor de pressão conectado a um contador digital de força expressa em gramas (g). A

precisão do aparelho é de 0,1g. O aparelho é calibrado para registrar uma força máxima de

150g, mantendo a precisão de 0,1g até a força de 80g. O contato do transdutor de pressão à

pata é realizado através de uma ponteira descartável de polipropileno com 0.5 ou 4,15mm2 de

diâmetro adaptada a esse.

Os animais são colocados em caixas de acrílico, medindo 12x10x17cm cujo

assoalho é uma rede de malha igual a 5mm2 constituída de arame não maleável de 1mm de

espessura, durante 15 minutos antes do experimento para adaptação ao ambiente. Espelhos

são posicionados 25cm abaixo das caixas de experimentação para facilitar a visualização das

plantas das patas dos animais.

O experimentador deve aplicar, por entre as malhas da rede, uma pressão

linearmente crescente no centro da planta da pata do camundongo até que o animal produza

uma resposta caracterizada como sacudida (“flinch”) da pata estimulada. Os estímulos são

repetidos por até seis vezes, em geral até o animal apresentar 3 medidas similares com uma

clara resposta de “flinch” após a retirada da pata. A intensidade de hipernocicepção foi

quantificada como a variação na pressão (Δ de reação em gramas) obtida subtraindo-se a

média de três valores expressos em gramas (força) observados antes do procedimento

44

experimental (0 hora) da média de três valores em gramas (força) após a administração dos

estímulos que variaram conforme o protocolo experimental. Os testes nociceptivos foram

realizados entre 8h e 16h. Todos os experimentos seguiram as normas e éticas estabelecidas

para experimentação com animais conscientes, recomendadas pelo IASP (ZIMMERMANN,

1983).

Ilustração 8 Foto do equipamento utilizado no teste de pressão crescente na pata de camundongo. A foto apresenta o anestesiômetro eletrônico (Insight Equipamentos, São Paulo, Brasil), constituído por transdutor de pressão (1) conectado a um contador digital de força (2), as caixas de acrílico (12x10x17cm de altura) e os espelhos inclinados (4), abaixo do assoalho que forneceu uma vista desobstruída das patas traseiras dos animais, utilizados no teste de pressão crescente na pata de camundongos. Fonte: Coelho (2007).

45

Ilustração 9 Foto no momento do teste de pressão crescente na pata de camundongo. A foto apresenta a ponteira de polipropileno (1) acoplada ao transdutor de força (2) em contato com a pata do animal (círculo vermelho). O experimentador deve aplicar, por entre as malhas da rede do assoalho (3), uma pressão linearmente crescente no centro da planta da pata até que o animal produza uma resposta caracterizada como “sacudida” (“flinch”). Fonte: Coelho (2007).

3.9 Análise estatística

Os dados foram apresentados com média+SEM (erro padrão da média). Os testes

t-student e análise de variância (ANOVA) foram utilizados para comparações envolvendo,

respectivamente, dois e três ou mais grupos. O nível de significância estatística foi

estabelecido em p<0,05.

46

RESULTADOS

47

4 RESULTADOS

4.1 Evolução clínica

A partir de 10 a 11 dias após a indução da EAE, os animais começam a apresentar

os primeiros sinais clínicos da encefalomielite como, por exemplo, fraqueza de cauda. Após

14 a 16 dias (fase aguda), a doença atinge a gravidade máxima, momento em que vários

animais apresentam paralisia nos membros posteriores. Essa condição é mantida por três ou

quatro dias e, nos dias que seguem, os animais iniciam o período de remissão, no qual

começam a recuperar sua massa corporal e os movimentos dos membros paralisados (fase

crônica). Raramente há animais que não se recuperam da fase de paralisia, assim como é

incomum o animal recuperar totalmente seus movimentos. Na maioria das vezes, há

recuperação dos movimentos dos membros posteriores, mas permanece uma deambulação

anormal, além de fraqueza de cauda. O período máximo de observação destes animais após a

indução de EAE foi de 34 dias.

Como pode ser verificado nos Gráficos 1 e 2, há uma alteração na evolução

clínica dos animais deficientes para o gene da PI3Kγ, que se traduz nos baixos valores de

severidade clínica deste grupo nos dias em que se estabelece a fase aguda da EAE nos animais

selvagens (WT). Adicionalmente, o grupo de animais PI3Kγ-/- não apresentou a perda de

massa que se observa nos animais selvagens.

48

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300

1

2

3

4

5

6

7

WT EAE

PI3Kγ-/- EAE

**

**

Dias p.i.

Esca

la d

e se

verid

ade

clín

ica

Gráfico 1 Evolução clínica dos grupos WT e PI3Kγ-/- após indução de EAE. A avaliação clínica foi realizada diariamente utilizando a escala da tabela 3. Cada valor representa média±SEM para o grupo de animais. Houve diferença significativa (p<0,05) nos dias 15 e 16 entre os grupos WT (dia 15=5±1; dia 16=5,3±0,7) e PI3Kγ-/-(dia 15=0,9±0,9; dia 16=0,9±0,9). Número de animais por grupo: WT EAE=3; PI3Kγ-/- EAE=7. Resultado representativo de 2 experimentos.

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 3010

13

16

19

22

25

WT controleWT EAE

PI3Kγ-/- controlePI3Kγ-/- EAE

****

**

** ** **

Dias p.i.

Mas

sa (g

)

Gráfico 2 Evolução da massa dos grupos WT controle, PI3Kγ-/- controle, WT após a indução de EAE e PI3Kγ-/- após a indução de EAE. A massa foi medida diariamente utilizando balança analítica. Cada valor representa média±SEM para o grupo de animais. Houve diferença significativa (p<0,05) nos dias 14, 15 e 16 entre o grupo WT (dia 14=16,9±1,1; dia 15=15,9±0,5; dia 16=16,3±0,9; valores em gramas) e PI3Kγ-/-(dia 14=22,1±0,7; dia 15=22,0±0,8; dia 16=21,9±0,8; valores em gramas). Número de animais por grupo: WT EAE=3; PI3Kγ-/- EAE=7; WT controle=5; PI3Kγ-/- controle=6. Resultado representativo de 2 experimentos.

49

O mesmo experimento foi repetido e apresentou resultados similares tanto para a

evolução da severidade clínica quanto para evolução da massa corporal dos animais (ver

anexos).

A medida de nocicepção nos camundongos no período em que não há sinais

clínicos (até o décimo segundo dia pós-indução) é apresentada no Gráfico 3. A avaliação

nociceptiva foi interrompida após o décimo segundo dia, pois todos os animais WT EAE

apresentavam algum tipo de fraqueza , o que impossibilitava o teste nociceptivo.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

1

2

3

4

5WT EAEWT controle

PI3Kγ-/- EAEPI3Kγ-/- Controle

*

*

Dias pós-indução de EAE

Inte

nsid

ade

de h

iper

noci

cepç

ãoΔ

rea

ção

(g)

Gráfico 3 Teste de pressão crescente na pata do camundongo. O teste foi realizado antes e após indução de EAE, diariamente até o início da manifestação dos sinais clínicos. Houve diferença significativa (p<0,05) na intensidade de hipernocicepção (média Δreação (g)±SEM) entre os grupos WT EAE (3,03±0,35) e PI3Kγ-/- EAE (1,68±0,43). Número de animais em cada grupo: WT EAE=9; PI3Kγ-/- EAE=7; WT controle=5; PI3Kγ-/- controle=5.

O grupo WT EAE apresenta aumento de intensidade de hipernocicepção em

comparação ao grupo PI3Kγ-/- EAE no décimo dia pós-indução (p<0,05), dia em que

normalmente ocorre o início da manifestação dos sinais clínicos em alguns animais.

50

4.2 Interação leucócito-endotélio

Como mencionado anteriormente, alguns animais com 10, 14 e 28 dias de indução

foram utilizados para análise de microscopia intravital.

WT PI3K-/- WT PI3K-/- WT PI3K-/- WT PI3K-/-0

20

40

60

Fase crônica(28 dias p.i.)

Fase aguda(14 dias p.i.)

EAE início do sinais(10 dias p.i.)

controles

núm

ero

de c

élul

as p

or m

inut

o e

m 1

00µm

de

vaso

Gráfico 4 Quantificação de rolamento de leucócitos na microcirculação cerebral por microscopia intravital nos grupos WT controle, PI3Kγ-/- controle, WT após indução de EAE e PI3K-/- após indução de EAE com 10, 14 e 28 dias de indução. Não houve diferença significativa entre os grupos WT e PI3Kγ-/- induzidos com EAE nos dias 10, 14 e 28 pós-indução. Número de animais por grupo: controles, WT=10 e PI3Kγ-/-=12; grupo EAE 10 d.p.i, WT=6 e PI3Kγ-/-=3; grupo EAE 14 d.p.i, WT=11 e PI3Kγ-/-=11; grupo EAE 28 d.p.i., WT=9 e PI3Kγ-/-=12.

Apesar de haver um aumento do rolamento celular em todos os grupos que

receberam indução de EAE em relação aos grupos controles (p<0,01 para as comparações

entre WT EAE e WT controle e para as comparações PI3Kγ-/- EAE e PI3Kγ-/- controle), não

se encontrou nenhuma diferença significativa entre os grupos induzidos (GRÁF. 4). Em todos

eles, ocorrem níveis semelhantes de rolamento celular. O mesmo ocorreu entre os animais que

receberam o inibidor específico da PI3Kγ, AS605420 (GRÁF. 5).

51

controle EAE EAE+AS6054200

5

10

15

20

25

30

35

núm

ero

de c

élul

as p

or m

inut

oem

100

µm d

e va

so

Gráfico 5 Quantificação de rolamento de leucócitos na microcirculação cerebral por microscopia intravital após administração de inibidor de PI3Kγ. A quantificação foi realizada após 14 dias de indução, e o grupo EAE+AS605420 recebeu o inibidor 1h antes da contagem na microscopia intravital. Não houve diferença significativa entre os grupos WT EAE e WT EAE + AS605420. Número de animais em cada grupo: EAE=6; EAE+AS605420=6; Controle=5.

A adesão celular nos animais induzidos por EAE também foi significativamente

elevada em relação aos controles no décimo dia pós-indução (p<0,001). Entretanto, nos dias

dez, quatorze e vinte e oito pós-indução, não houve diferença significativa entre os grupos

WT e PI3Kγ-/- (GRÁF. 6).

Nos animais WT induzidos que receberam o inibidor da PI3Kγ após 14 dias de

indução, não foi verificada nenhuma alteração nos parâmetros de adesão.

52

WT PI3K-/- WT PI3K-/- WT PI3K-/- WT PI3K-/-0

5

10

15

20



EAE início do sinais(10 dias p.i.)

controles

núm

ero

de c

élul

aspo

r 10

0µm

de

vaso

Gráfico 6 Quantificação de adesão de leucócitos na microcirculação cerebral por microscopia intravital nos grupos WT controle, PI3Kγ-/- controle, WT após indução de EAE e PI3Kγ-/- após indução de EAE com 10, 14 e 28 dias de indução. Não houve diferença significativa entre os grupos WT e PI3Kγ-/- induzidos com EAE nos dias 10, 14 e 28 pós-indução. Número de animais por grupo: controles, WT=9 e PI3Kγ-/-=12; grupo EAE 10 d.p.i, WT=6 e PI3Kγ-/-

=3; grupo EAE 14 d.p.i, WT=11 e PI3Kγ-/-=11; grupo EAE 28 d.p.i., WT=9 e PI3Kγ-/-=13.

controle EAE EAE+AS6054200

1

2

3

4

5

núm

ero

de c

élul

aspo

r 100μ m

de

vaso

Gráfico 7 Quantificação de adesão de leucócitos na microcirculação cerebral por microscopia intravital após administração de inibidor de PI3Kγ. A quantificação foi realizada após 14 dias de indução, e grupo EAE+AS605420 recebeu o inibidor 1h antes da contagem na microscopia intravital. Não houve diferença significativa entre os grupos WT EAE e WT EAE + AS605420. Número de animais em cada grupo: EAE=6; EAE+AS605420=6; Controle=5.

53

4.3 Análise histopatológica

A análise histopatológica revelou presença de infiltrados perivasculares no

cérebro dos animais WT EAE após 14 dias de indução (FIG. 1, A e B). No entanto, os

animais PI3Kγ-/- EAE raramente apresentaram sinais de infiltrado perivascular (FIG. 1, C e

D).

54

Figura 1 Histologia de animais controles, WT EAE e PI3Kγ-/- EAE com 14 dias de indução. A) Corte de cérebro de animal WT controle. B) Corte de cérebro de animal PI3Kγ-/- controle. C e E) Corte de cérebro de animais WT após 14 dias de indução de EAE. D e F) Corte de cérebro de animais PI3Kγ-/- após 14 dias de indução de EAE. As fotos são representativas de 3 animais. Aumento: 200X. Não ocorrem infiltrados inflamatórios de meninge e perivasculares nos animais PI3Kγ-/- após 14 dias de indução de EAE. Cortes corados com hematoxilina e eosina. Aumento: 200X.

55

Nos animais com 28 dias de indução de EAE, a análise histopatológica revelou

que havia infiltrados perivasculares nos animais PI3Kγ-/-, enquanto nos animais WT tais

infiltrados eram muito raros, como pode ser evidenciado pela Figura 2.

Figura 2 Histologia de animais WT EAE e PI3Kγ-/- EAE com 28 dias de indução. A) Corte de cérebro de animais WT após 28 dias de indução de EAE, corado com hematoxilina e eosina. B) Corte de cérebro de animais PI3Kγ-/- após 28 dias de indução de EAE, corado com hematoxilina e eosina. Aumento: 200X. Fotos A e B representativas de 3 animais WT EAE e 2 animais PI3K EAE respectivamente. Não houve diferença significativa entre os grupos.

TABELA 4 Análise semiquantitativa do SNC nos camundongos WT e PI3Kγ-/-.

Parâmetros Reatividade perivascular

Infiltrado de mononuclear na

meninge Grupos Controles WT e PI3Kγ-/-

0 (6/6) 0(6/6)

WT EAE 14 d.p.i.

0 – 1/3 * – 1/3 *** – 1/3

* – 1/3 *** – 2/3

PI3Kγ-/- EAE 14 d.p.i.

0 – 3/3 0 – 3/3

WT EAE 28 d.p.i. * – 3/3 0 – 1/3 * – 2/3

PI3Kγ-/- EAE 28 d.p.i. * – 2/3 ** – 1/3

0 – 1/3 * –2/3

Os critérios de avaliação histopatólogica para a análise foram baseados em observações realizadas no tecido cerebral coletadas de cada grupo. 0= ausencia de alterações ; *leve , **moderada e ***alteração intensa.

56

4.4 Análise de quimiocinas

A análise de quimiocinas foi realizada nos dias 14 e 28 p.i. Os resultados estão

resumidos nos Gráficos 8, 9 e 10. A quantificação de MCP-1/CCL2 revelou aumento desta

quimiocina no cérebro de animais WT EAE em relação aos animais controles (p<0,05) com

14 dias de indução. Também entre os animais PI3Kγ-/- EAE e PI3Kγ-/- controle houve

diferença estatisticamente significativa (p<0,05) na quantidade de MCP-1/CCL2 com 14 dias

e com 28 dias de indução. Situação semelhante ocorreu com RANTES/CCL5, pois foi

detectado aumento significativo desta quimiocina no dia 14 p.i. nos animais WT EAE em

relação aos controles (p<0,001). Os animais PI3Kγ-/- EAE também tiveram aumento

significativo desta quimiocina em relação aos controles (p<0,001), mas a quantidade de

quimiocina produzida foi significativamente menor que nos animais WT EAE (p<0,001). No

dia 28 p.i., não há diferenças na produção de RANTES/CCL5 entre os dois grupos induzidos.

WT PI3Kγ-/- WT PI3Kγ-/- WT PI3Kγ-/-0

100

200

300



controles

*

*

pg/ 1

00m

g de

teci

do

Gráfico 8 Quantificação de MCP1/CCL2 por ELISA após 14 e 28 dias de indução de EAE nos animais WT e PI3Kγ-/-. Após a microscopia intravital, os animais foram sacrificados e tiveram o cérebro removido. Cada valor representa média±SEM (em pg / 100mg de tecido) para o grupo de animais. Houve diferença significativa entre os grupos WT (251,6±21,4) e PI3Kγ-/-(56,7±5,2) no dia 14 pós-indução (* = p<0,05). Número de animais por grupo: controles, WT=5 e PI3Kγ-/-=3; grupo EAE 14 d.p.i, WT=3 e PI3Kγ-/-=7; grupo EAE 28 d.p.i., WT=3 e PI3γK-/-=7.

57


250

500

750

1000

1250



controles

***

***

pg/ 1

00m

g de

teci

do

Gráfico 9 Quantificação de RANTES/CCL5 por ELISA após 14 e 28 dias de indução de EAE nos animais WT e PI3Kγ-/-. Após a microscopia intravital, os animais foram sacrificados e tiveram o cérebro removido. Cada valor representa média±SEM (em pg / 100mg de tecido) para o grupo de animais. Houve diferença significativa entre os grupos WT (1038±35,9) e PI3Kγ-/-(475,2±58,2) no dia 14 pós-indução (*** = p<0,001). Número de animais por grupo: controles, WT=5 e PI3Kγ-/-=3; grupo EAE 14 d.p.i, WT=3 e PI3Kγ-/-=7; grupo EAE 28 d.p.i., WT=3 e PI3Kγ-/-=7.

Houve diferença significativa na produção de Kc/CXCL1 entre os animais

induzidos e controles (p<0,05), mas não houve diferenças entre os grupos induzidos.


50100150200250300350400450



controles

pg/1

00m

g de

teci

do

Gráfico 10 Quantificação de Kc/CXCL1 por ELISA após 14 e 28 dias de indução de EAE nos animais WT e PI3Kγ-/-. Após a microscopia intravital, os animais foram sacrificados e tiveram o cérebro removido. Cada valor representa média±SEM para o grupo de animais. Não houve diferença significativa entre os grupos WT EAE e PI3Kγ-/- EAE nos dias 14 e 28 pós-indução. Número de animais por grupo: controles, WT=5 e PI3Kγ-/-=3; grupo EAE 14 d.p.i, WT=3 e PI3Kγ-/-=7; grupo EAE 28 d.p.i., WT=3 e PI3Kγ-/-=7.

58

DISCUSSÃO

59

5 DISCUSSÃO

A evolução clínica da EAE nos animais selvagens (WT) é similar a outros

trabalhos que utilizaram o mesmo método como dos Santos et al. (2005), Forte et al. (2007) e

Korn et al. (2007). Analisando os resultados clínicos, representados pelos Gráficos 1, 2 e 3,

nota-se diferença no desenvolvimento da doença entre os animais WT e PI3Kγ-/-, diferença

que é estatisticamente significativa nos dias 14 e 15 para os valores de severidade clínica. Os

animais que não expressam a enzima PI3Kγ sofrem um atraso tanto no início das

manifestações clínicas quanto na perda de massa em relação aos animais WT. Além disso, a

cinética do desenvolvimento clínico também é alterada, ou seja, não há um dia específico no

qual todos, ou a maioria dos animais PI3Kγ-/- EAE estão com a forma mais grave da doença.

Entre os animais PI3Kγ-/- EAE, 14% (1 entre 7) começaram a desenvolver a doença no

décimo quarto dia, e 43% (3 entre 7) não apresentaram nenhum sinal clínico durante os 28

dias de experimento. Dentre os animais que apresentaram fraqueza, 43% (3 entre 7) dos

animais PI3Kγ-/- EAE chegaram a ter paralisia (nenhum no dia 14 p.i.), em contraste com os

animais WT, dos quais 100% apresentaram paralisia de patas posteriores em algum momento

da doença (83% no dia 14 p.i.).

Na análise de nocicepção, constatou-se aumento (hiperalgesia) nos animais WT

EAE no dia 10 p.i. em relação aos animais PI3Kγ-/- EAE, um dia antes do início dos sinais

clínicos. O resultado não corrobora o trabalho de Aicher et al. (2004) no qual se encontrou

hipoalgesia um dia antes do início dos sinais clínicos nos animais induzidos com EAE. É

possível que tal contradição de resultados se deva à diferença no método de análise, uma vez

que o trabalho de Aicher utiliza um método baseado em temperatura, enquanto o método

deste trabalho baseia-se num estímulo por contato mecânico. Além disso, no método de

Aicher, a elevação da cauda do camundongo é uma das respostas utilizadas para a medida de

nocicepção. Uma vez que a elevação de cauda é um fenômeno precocemente abolido na EAE,

devido à fraqueza, é possível que a hipoalgesia constatada no trabalho de Aicher seja, na

verdade, conseqüência do início da manifestação clínica. No entanto, é importante salientar

que houve diferença entre os animais WT e os animais PI3Kγ-/-. Ou seja, dias antes do início

dos sinais clínicos já existem diferenças fisiológicas entre os dois grupos de animais.

Isso pode significar que a PI3Kγ altera a fisiopatologia da EAE bem antes do

estabelecimento dos sinais clínicos, possivelmente durante a ativação de células T auto-

reativas para a MOG do camundongo. Segundo alguns relatos sobre influência de PI3Kγ em

60

antinocicepção (NARITA, 2002 e 2004), a atuação desta enzima pode levar à ativação de

receptores μ e δ opióides causando diminuição de nocicepção. Tais estudos contradizem o

resultado deste trabalho, uma vez que a PI3Kγ estava presente nos animais WT e, no entanto,

eles apresentaram hipernocicepção. Também é possível que a resposta das células dos animais

PI3Kγ-/- a estímulos de recrutamento esteja dificultada, justificando o atraso do início da

resposta hipernociceptiva e do início da manifestação dos sinais clínicos nestes animais. Num

estudo de Del Prete et al. (2004) verificou-se que células dendríticas de camundongos PI3Kγ-/-

apresentavam diminuição na capacidade de migração para linfonodos em resposta às mesmas

concentrações de quimiocinas que células provenientes de camundongos WT. No mesmo

estudo, constatou-se que células dendríticas de animais WT, quando transferidas para animais

PI3Kγ-/- apresentavam alterações semelhantes na migração. Portanto, além de haver alteração

na resposta das células dendríticas a um estímulo quimiotático, também o próprio

camundongo PI3Kγ-/- apresenta alterações que comprometem a migração de células.

No entanto, no mesmo décimo dia pós-indução em que se encontraram diferenças

de nocicepção, não houve diferenças nos parâmetros de rolamento e adesão de leucócitos. Ao

contrário dos resultados de hipernocicepção, este sugere que, pelo menos na fase inicial de

recrutamento de leucócitos, ou seja, na fase de rolamento e adesão, não há diferenças entre os

grupos WT e PI3Kγ-/- (GRÁF. 4 e GRÁF.5). A correlação entre adesão e nocicepção foi

investigada por Machelska et al. (2002), que avaliaram a influência de ICAM (intercellular

adhesion molecule – uma integrina envolvida no processo de adesão) na dor inflamatória em

ratos. Nesse estudo, o bloqueio de ICAM diminuiu a analgesia mediada por opióides, o que

provocou aumento de nocicepção nos animais. Uma vez que não houve diferenças de

rolamento e adesão, mas sim de nocicepção no presente trabalho, é razoável supor que há uma

via alternativa que provoca hipernocicepção durante a EAE. É importante verificar a origem

desta dor, uma vez que também ocorre em pacientes com esclerose múltipla, e, assim, torna-

se relevante o estudo de possíveis vias que possam gerar a hipernocicepção em EAE.

Também no trabalho de dos Santos et al. (2005) verificou-se aumento tanto no

rolamento quanto na adesão de leucócitos em camundongos no curso clínico da EAE, como

pode ser verificado nos Gráficos 4 e 5, comparados aos animais que não foram induzidos

(p<0,01, valor não apresentado nos gráficos). Foi no décimo dia em que ocorreu a maior

quantidade de células rolando e aderidas, em contraste com o trabalho de dos Santos et al.

(2005) no qual o pico de células fora no décimo quarto dia pós-indução. No entanto, naquele

trabalho, foram analisados os dias 7, 14 e 21 pós-indução, assim é possível que a quantidade

61

de células rolando e aderidas atinja um ápice no décimo dia, diminuindo no décimo quarto dia

pós-indução.

No décimo quarto dia pós-indução, diferenças relevantes surgem entre os dois

grupos. Exceto pelo número de células rolando e aderidas, os animais PI3Kγ-/- apresentam

vários dos fatores que sinalizam ausência de inflamação: não há perda de massa, nem

aumento de severidade clínica; os níveis de quimiocinas pró-inflamatórias MCP-1/CCL2 e

RANTES/CCL5 estão baixos; e não há presença de infiltrados perivasculares. Tais resultados

sugerem um papel crucial da PI3Kγ no estabelecimento da neuroinflamação. Como adesão e

rolamento de leucócitos estão altos tanto no décimo quanto no décimo-quarto dia pós-indução

nos animais PI3Kγ-/-, e, ainda assim, eles não apresentam sinais de neuroinflamação, é de se

especular que a influência da PI3Kγ esteja relacionada à transmigração, etapa seguinte dos

leucócitos na migração para o SNC dos animais. Fortalecendo essa hipótese, verifica-se que a

administração do inibidor específico da PI3Kγ AS605420, não influenciou de maneira

significativa a adesão e o rolamento em animais WT (GRÁF. 5 e GRÁF. 7). Segundo Ley et

al. (2007), há diferenças importantes entre os processos de rolamento, adesão e migração para

o tecido. Assim, células que rolam e aderem não necessariamente migrarão para o tecido, uma

vez que são necessários sinais específicos para ocorrer a transmigração. É possível sugerir que

os leucócitos que causariam a neuroinflamação, de alguma forma, não estão ultrapassando a

barreira hematoencefálica, ou o fazem muito mais lentamente nos animais PI3Kγ-/-. Assim,

pode-se especular que a enzima PI3Kγ não tenha participação decisiva na fase inicial de

recrutamento envolvendo rolamento, mas possivelmente está envolvida numa fase posterior

ao rolamento, já que há alteração em todos os outros parâmetros avaliados. Não há como

afirmar, com os resultados obtidos, se a ausência de infiltrados deve-se à ausência da PI3Kγ

nos leucócitos, ou nas células que formam o endotélio. Para resolver esta questão, propõe-se

experimento de irradiação de animais WT e PI3Kγ-/- para destruição das células progenitoras

do sistema imunológico e recuperação do sistema com células trocadas, animais WT

recebendo células PI3Kγ-/- e animais PI3Kγ-/- recebendo células WT.

A análise histológica qualitativa do cérebro de animais WT doentes no dia 14 p.i.

revelou a presença de infiltrados perivasculares como pode ser observado na Figura 1. A

presença de infiltrados perivasculares nesta fase aguda da EAE foi encontrada por vários

autores, por Aguado-Llera et al. (2007) em ratos Lewis; por O’Neill et al. (2006) em

camundongos C57BL/6; por Greenwood (2003) em ratos Lewis induzida por MBP; por Chen

e Brosnan (2006) em camundongos C57BL/6 induzidos por MOG; por Izikson et al. (2000)

62

em camundongos C57BL/6 induzidos por MOG; por Heneka et al. (2001) em camundongos

C57BL/6 induzidos por MOG. O infiltrado perivascular, segundo os autores acima, é uma das

evidências histopatológicas de que há a presença de inflamação e, de fato, a presença de

infiltrado perivascular e a alta severidade clínica estão correlacionadas no tempo. Em

contraste com os animais WT, os animais PI3Kγ-/- não apresentaram infiltrados perivasculares

no cérebro com 14 d.p.i., dia em que nenhum dos animais apresentava manifestações clínicas

da EAE. Este resultado, em conjunto com o grau de severidade clínica reduzido, é um forte

indício da ausência de inflamação nesses animais com 14 dias de indução. No entanto, a

quantificação da inflamação nos animais pelo parâmetro histopatológico utilizando o cérebro

é limitada pela quantidade de infiltrados inflamatórios perivasculares, que é reduzida em

relação à área total do tecido. Tal dificuldade não anula a importância dessa análise no

cérebro, pois os infiltrados perivasculares neste órgão foram observados em outros estudos

(MORENO et al. 2006; SUN et al., 2000) e, portanto, são provavelmente relevantes para o

estabelecimento da EAE. Além disso, existe dano cortical na neuroinflamação que ocorre na

esclerose múltipla (UCCELLI et al., 2005; KUTZELNIGG et al., 2005), o que justifica o estudo

de alterações histopatológicas no cérebro de camundongos induzidos por EAE. Mesmo assim,

a medula espinhal é bastante afetada no curso da EAE (BUDDE et al., 2005), portanto planeja-

se para experimentos futuros análises histopatológicas medulares.

Outro indício relevante da ausência de inflamação significativa no dia 14 p.i nos

animais PI3Kγ-/- foi obtido a partir da análise de produção de quimiocinas no SNC. Como

pode ser observado no Gráfico 8, os níveis de MCP-1/CCL2 no homogenato do tecido

cerebral dos animais PI3Kγ-/- foram significativamente menores que os níveis desta

quimiocina no homogenato do tecido cerebral dos animais WT, no dia 14 p.i (p<0,001),

correlacionando com a ausência de sinais clínicos naqueles animais. A quimiocina MCP-

1/CCL2 é um potente quimioatraente para monócitos estimulando, entre outros fatores, a

expressão de moléculas de integrinas na membrana celular (ROLLINS, 1997). O aumento da

expressão de MCP-1/CCL2 em EAE foi verificado por diversos autores em modelos em ratos

(GLABINSKI et al. 1995; JEE et al., 2002) e murinos (GLABINSKI et al., 1997; DOS SANTOS et

al., 2005), principalmente no cérebro e na medula espinhal dos animais. HUANG et al. (2001),

utilizando camundongos C57Bl/6, investigaram MCP-1/CCL2 em camundongos deficientes

do gene para esta quimiocina e constataram um atraso no início dos sinais clínicos nos

camundongos CCL2-/- (MCP-1-/-) com EAE, além da menor gravidade da doença. Em

camundongos knock out para um dos receptores de MCP-1/CCL2, o CCR2, não houve

manifestação da doença como ocorreu em camundongos C57Bl/6 selvagens (IZIKSON et al.,

63

2000). Assim, corroborando dados da literatura, verificamos que os níveis de MCP-1

correlacionam com a gravidade da EAE.

A quantificação de RANTES/CCL5 (GRÁF. 9) também revelou menores níveis

desta quimiocina em animais PI3Kγ-/- no dia 14 p.i. (p<0,001). Li et al. (2006) verificou

diminuição da expressão de RANTES/CCL5 em células de baço e linfonodo no dia 14 p.i. em

animais que receberam peptídeo vasointestinal (um hormônio sintetizado no intestino,

pâncreas e hipotálamo) e apresentavam menor severidade clínica. Szalai et al. (2002)

encontrou níveis diminuídos de RANTES/CCL5 após estimular células T encefalitogênicas

em animais tratados com proteína C reativa (uma proteína que tem papel na defesa do

organismo contra micróbios) cujo grau de severidade clínica estava menor em relação aos não

tratados. Adicionalmente, a correlação entre menor nível de severidade clínica e menor

expressão de RANTES/CCL5 foi verificada por Heneka et al. (2001). Segundo Glabinski et

al. (1998), assim como MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5 também é descrita como uma

quimiocina cujos níveis aumentam proporcionalmente ao grau de severidade clínica de EAE.

Portanto, a correlação encontrada neste trabalho entre níveis de MCP-1/CCL2 e

RANTES/CCL5 e gravidade clínica tem o suporte de diversos outros estudos. Assim como no

caso da quimiocina MCP-1/CCL2, a diminuição de RANTES/CCL5 no SNC dos animais

PI3Kγ-/- pode ser um dos fatores para o atraso e baixo valor de severidade clínica neste grupo

de animais.

No vigésimo – oitavo dia pós-indução, os animais WT estão na fase de remissão

da EAE, enquanto alguns dos animais PI3Kγ-/- apresentam os sinais clínicos de fase aguda da

EAE. Neste momento, a média dos graus de severidade clínica dos dois grupos se iguala, o

mesmo ocorre com a média das massas. Porém, na análise histopatológica, já não se

encontram infiltrados perivasculares nos animais WT, mas sim nos animais PI3Kγ-/-, o que

sinaliza a ocorrência de inflamação nestes animais. Também os níveis de MCP-1/CCL2 e

RANTES/CCL5 não estão diferentes nestes dois grupos de animais. No entanto, é interessante

notar que não há aumento significativo de nenhuma das quimiocinas analisadas nos animais

PI3Kγ-/- EAE nos dias 14 e 28 pós-indução. Assim como houve atraso no início dos sinais

clínicos e na presença de infiltrados perivasculares, esperar-se-ia um atraso no aumento de

produção de quimiocinas no SNC dos animais PI3Kγ-/- EAE. Este suposto pico de

quimiocinas pode ter ocorrido entre os dias 14 e 28 pós-indução, assim são necessárias

análises futuras para se verificar se realmente existe um aumento de quimiocinas nos animais

PI3Kγ-/- EAE semelhante ao que ocorre nos animais WT EAE. No entanto, também é possível

que a ausência da enzima PI3Kγ altere a cinética de produção de quimiocinas, mantendo a

64

produção de quimiocinas pró-inflamatórias como MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 em

pequenas quantidades, o que também pode explicar o atraso no início dos sinais clínicos, já

que o estímulo inflamatório é constantemente menor. Mais uma vez, são necessários mais

estudos para avaliar os efeitos da PI3Kγ sobre estas quimiocinas pró-inflamatórias durante a

EAE.

Das quimiocinas analisadas, apenas as quantidades de Kc/CXCL1 não foram

significativamente distintas entre os animais WT EAE e PI3Kγ-/- EAE nos dias 14 e 28 pós-

indução. No entanto, houve diferença estatística entre os grupos WT EAE e WT controle no

dia 14 p.i. (p<0,05) e entre os grupos PI3Kγ-/- EAE e PI3Kγ-/- controle no mesmo dia

(p<0,01). Kc/CXCL1 é uma molécula envolvida na quimiotaxia de neutrófilos (ROVAI et al.,

1998), e o aumento em sua concentração ainda é uma incógnita em EAE, pois o recrutamento

de neutrófilos nesse modelo é incomum (LUO et al., 2000). Mesmo assim, é interessante notar

que, no dia 28 p.i., não há diferença estatística entre o grupo WT EAE e WT controle,

enquanto os níveis de Kc/CXCL1 nos animais PI3Kγ-/- EAE estão elevados nesse dia. Em

todas as três quimiocinas analisadas, não se observou nenhuma diminuição de suas

quantidades no tecido cerebral dos animais PI3Kγ-/- EAE. Esta observação pode ser mais uma

evidência de que há sinais de recrutamento nos animais PI3Kγ-/- EAE pela síntese de

quimiocinas, porém este recrutamento não tem a mesma eficácia que nos animais WT EAE.

As razões para esse fato devem ser apuradas em estudos futuros.

Em síntese, este estudo dá fortes evidências de que há influência da enzima PI3Kγ

no processo de neuroinflamação. Uma vez que esta enzima também é expressa em humanos, é

de suma importância aprofundar os conhecimentos sobre o papel dela na inflamação do SNC.

Futuramente, esta enzima pode ser alvo terapêutico para o tratamento de diversas doenças que

causam neuroinflamação, especialmente aquela cujo mecanismo inflamatório mais se

assemelha ao modelo animal utilizado neste trabalho: a esclerose múltipla.

65

CONCLUSÕES

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6 CONCLUSÕES

√ Camundongos PI3Kγ-/- apresentam alterações no desenvolvimento da EAE,

clinicamente expressas pela menor gravidade clínica após 14 dias de indução,

menor perda de massa após 14 dias de indução e ausência de hipernocicepção após

10 dias de indução;

√ Não ocorrem infiltrados perivasculares no cérebro de animais PI3Kγ-/- induzidos

com EAE após 14 dias de indução, em contraste com os animais WT. Porém, após

28 dias de indução, é possível encontrar infiltrados perivasculares no cérebro de

animais PI3K-/-;

√ Os parâmetros de rolamento e adesão permanecem altos após 10 e 14 dias de

indução nos animais PI3Kγ-/-. O inibidor AS605420 da PI3Kγ não tem efeito

significativo sobre rolamento e adesão de leucócitos após 14 dias de indução de

EAE;

√ Diferente de camundongos WT, camundongos PI3Kγ-/- não apresentam níveis

elevados de MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 no tecido cerebral nos dias 14 e 28

pós-indução de EAE;

√ A enzima PI3Kγ é relevante no processo de neuroinflamação desencadeado pelo

modelo de encefalomielite auto-imune experimental.

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Bibliografia

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ANEXOS

80

ANEXO A – RESULTADOS

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 340

1

2

3

4

WT EAEPI3Kγ-/- EAE

Dias p.i.

Esca

la d

e se

veri

dade

clín

ica

Anexo A. 1 Evolução clínica dos grupos WT e PI3Kγ-/- após indução de EAE. A avaliação clínica foi realizada diariamente utilizando a escala da tabela 2. O número de animais em cada grupo foi de no mínimo 6.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 340

1

2

3

4

5

6

7

WT EAE

PI3Kγ-/- EAE

Dias p.i.

Esca

la d

e se

veri

dade

clín

ica

Anexo A. 2 Evolução clínica dos grupos WT e PI3Kγ-/- após indução de EAE. A avaliação clínica foi realizada diariamente utilizando a escala da tabela 3. O número de animais em cada grupo foi de no mínimo 6.

81

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 3410.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

WT controleWT EAEPI3Kγ -/- controlePI3Kγ -/-EAE

Dias p.i.

Mas

sa (g

)

Anexo A. 3 Evolução da massa dos grupos WT controle, PI3Kγ-/- controle, WT após a indução de EAE e PI3Kγ-/- após a indução de EAE. A massa foi medida diariamente utilizando balança analítica. Cada valor representa média±SEM para o grupo de animais. Houve diferença significativa (p<0,05) nos dias 14, 15 e 16 entre o grupo WT (14=16,9±1,1; 15=15,9±0,5; 16=16,3±0,9; valores em gramas) e PI3Kγ-/-(14=22,1±0,7; 15=22,0±0,8; 16=21,9±0,8; valores em gramas). O número de animais em cada grupo foi de no mínimo 6.

Estudo do papel da enzima fosfatidilinositol-3-cinase-γ

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