Estudo Eletroquímico e Eletroanalítico da Microcistina ... · Estudo Eletroquímico e...

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Tese de Doutorado

Estudo Eletroquímico e Eletroanalítico da

Microcistina-LR e Avaliação in situ da sua

Interação com DNA

Ilanna Campelo Lopes

João Pessoa – PB – Brasil

2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Tese de Doutorado

Estudo Eletroquímico e Eletroanalítico da

Microcistina-LR e Avaliação in situ da sua

Interação com DNA

Ilanna Campelo Lopes*

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Química da

Universidade Federal da Paraíba,

como requisito para obtenção do

título de Doutor em Química.

Orientador: Prof. Dr. Mário César Ugulino de Araújo

Co-Orientador: Prof. Dr. Auro Atsushi Tanaka

* Bolsista CAPES

João Pessoa – PB – Brasil

2011

L864e Lopes, Ilanna Campelo. Estudo eletroquímico e eletroanalítico da microcistina-LR

e avaliação in situ da sua interação com DNA / Ilana Campelo Lopes.- João Pessoa, 2011.

126f. : il. Orientador: Mário César Ugulino de Araújo Co-orientador: Auro Atsushi Tanaka Tese (Doutorado) – UFPB/CCEN 1. Química. 2. Microcistina-LR (MC-LR). 3. Microcistina –

estudo eletroquímico. 4. Microcistina – estudo eletroanalítico. 5. MC-LR – interação – DNA.

UFPB/BC CDU: 54(043)

“Bem aventurado o homem que encontra a

sabedoria, e o homem que adquire conhecimento,

pois ela é mais proveitosa do que a prata, e dá mais

lucro do que o ouro.”

(Provérbios 3:13 e 14)

Dedico este trabalho, em especial, a minha querida

mãe Iolanda, pelo seu amor incondicional e

dedicação dispensada, a quem tenho espelhado-me

por seus exemplos de coragem e perseverança.

Ao meu pai Walter e irmãos Dirceu e Danilo, pelo

seu amor, carinho e compreensão.

E ao meu namorado Luís, pelo seu amor,

companheirismo e apoio durante essa jornada.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, grande orientador da minha vida, por permitir que eu continuasse a

minha caminhada com fé e coragem, concedendo-me a capacidade de superar os obstáculos,

por tudo o que Ele fez até aqui e ainda fará.

A minha família, pelo seu amor incondicional, apoio e incentivo na realização deste

trabalho.

A prima Silvânia e ao Márcio pelo acolhimento e atenção dispensada em João Pessoa.

Ao meu namorado Luís pelo seu seu amor, compreensão e paciência durante essa

jornada.

Ao professor Dr. Mário César Ugulino de Araújo, meu especial agradecimento pela

oportunidade concedida, amizade, incentivo e orientação no decorrer do trabalho.

Ao professor Dr. Auro Atsushi Tanaka, pela amizade, colaboração e co-orientação

dispensada neste trabalho.

Aos amigos do LAQA-UFPB, Daniel, Edilene, Fátima, Flaviana, Francisco, Paulo

Henrique, Pablo, Renato Allan e Wellington pelas amizades construídas, incentivo mútuo e

companheirismo durante todos estes anos de convivência.

Ao amigo Williame, em especial, pela amizade, companheirismo e colaboração nas

discussões durante a elaboração desta tese.

À professora Dra. Ana Maria Oliveira Brett, pelo apoio, confiança creditada e co-

orientação dispensada no período de desenvolvimento da parte experimental deste trabalho,

realizada no Laboratório de Electroanálise e Corrosão da Universidade de Coimbra,

Coimbra, Portugal.

Aos amigos do LEC-UC-Portugal, Adrian, Ana Maria, Dora, Isabel, Sara e Tati,

pela receptividade, interação científica, amizades construídas e companheirismo durante

todo o período de estágio. Em especial, ao Carlos, Paulina e Victor.

À FAPEMA, CAPES e BIID pelas bolsas concedidas, ao CNPq e FCT pelos auxílios

cedidos ao laboratórios envolvidos.

E a todos os alunos, professores e funcionários da Pós-Graduação em Química da

UFPB.

vii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ........................................................................ x

LISTA DE TABELAS ....................................................................... xv

LISTA DE SÍMBOLOS .................................................................... xvi

LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................... xvii

RESUMO....................................................................................... xix

ABSTRACT .................................................................................... xx

1 INTRODUÇÃO.............................................................................. 2

1.1 Objetivos ................................................................................ 5

1.1.1 Geral ................................................................................. 5

1.1.2 Específicos ......................................................................... 5

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................ 7

2.1 Considerações gerais sobre cianobactérias .................................. 7

2.1.1 Cianotoxinas ...................................................................... 8

2.1.1.1 Microcistinas ................................................................. 9

2.1.1.1.1 Microcistina-LR ....................................................... 11

2.2 Métodos analíticos aplicados à análise de microcistina-LR ............. 15

2.3 Ácido desoxirribonucléico ......................................................... 19

2.3.1 Danos ao DNA ................................................................... 21

2.3.2 Eletroquímica do DNA......................................................... 24

2.3.2.1 Propriedades eletroquímicas do DNA............................... 24

2.3.2.1 Biossensores eletroquímicos de DNA ............................... 26

2.4 Técnicas voltamétricas ............................................................. 31

2.4.1 Voltametria cíclica.............................................................. 32

2.4.2 Voltametria de pulso diferencial ........................................... 34

2.4.3 Voltametria de onda quadrada ............................................ 36

3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................. 39

3.1 Reagentes e soluções .............................................................. 39

3.2 Instrumentação ...................................................................... 41

3.3 Parâmetros experimentais das medidas voltamétricas .................. 42

viii

3.4 Tratamento dos dados voltamétricos ......................................... 43

3.5 Preparação da superfície do ECV ............................................... 43

3.6 Teste de adsorção dos compostos ............................................. 44

3.7 Detecção dos centros eletroativos da microcistina-LR................... 44

3.7.1 Teste dos aminoácidos Leu, Arg, Ala, Glu e Asp ..................... 45

3.7.2 Teste dos compostos 2-AAA e SA ......................................... 45

3.8 Construção da curva analítica ................................................... 46

3.8.1 Limites de detecção e quantificação ..................................... 46

3.9 Condições experimentais para a investigação voltamétrica in situ da

interação da microcistina-LR com dsDNA ......................................... 48

3.9.1 Preparação do biossensor eletroquímico de dsDNA e

procedimento de incubação ......................................................... 48

3.9.2 Preparação das soluções de dsDNA incubadas ....................... 50

3.10 Condições experimentais para a investigação espectrofotométrica

in situ da interação da microcistina-LR com dsDNA ........................... 51

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................... 53

4.1 Comportamento eletroquímico da microcistina-LR ....................... 53




4.2 Comportamento eletroquímico de oxidação da microcistina-LR

degradada ................................................................................... 60




4.3 Análise cromatográfica da microcistina-LR .................................. 73

4.4. Estudo voltamétrico dos aminoácidos Leu, Arg, Ala, Glu e Asp ..... 74

4.5 Estudo voltamétrico do ácido 2-acetamidoacrílico ........................ 75



4.6 Estudo voltamétrico do ácido sórbico ......................................... 81



ix

4.6.3 Estudo voltamétrico do ácido sórbico degradado .................... 85

4.6.3.1 Voltametria de pulso diferencial ..................................... 85

4.6.3.2 Voltametria de onda quadrada ....................................... 91

4.6.3.3 Mecanismos de oxidação do ácido sórbico e dos seus

produtos de degradação ........................................................... 92

4.7 Mecanismo de oxidação da MC-LR e dos seus produtos de

degradação .................................................................................. 94

4.8 Estudo eletroanalítico da microcistina-LR .................................... 99

4.8.1 Curva analítica .................................................................. 99

4.8.2 Figuras de mérito ............................................................ 101

4.9 Interação da microcistina-LR com DNA .................................... 102

4.9.1 Avaliação voltamétrica in situ da interação da microcistina-LR

com dsDNA utlizando biossensores de dsDNA .............................. 102

4.9.2 Avaliação voltamétrica in situ da interação da microcistina-LR

com dsDNA utilizando soluções de dsDNA incubadas .................... 104

4.9.3 Avaliação espectrofotométrica in situ da interação da

microcistina-LR com dsDNA ....................................................... 107

5 CONCLUSÕES ........................................................................... 110

5.1 Perspectivas futuras .............................................................. 111

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................. 113

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1. Estrutura molecular da MC-LR. ........................................ 11

Figura 2.2. Representações da dupla hélice do DNA. .......................... 20

Figura 2.3. Estrutura química do DNA. Ligações de hidrogênio entre bases complementares em um fragmento de uma molécula de DNA. ..... 20

Figura 2.4. Voltamogramas de pulso diferencial obtidos sobre um

eletrodo de carbono vítreo em solução tampão acetato 0,1 mol L-1 pH 4,5 com: 60 µg mL-1 de ssDNA (•••) 1ª e (—) 10ª varredura, e 60 µg mL-1 de

dsDNA (•••) 1ª e (—) 40ª varredura de potencial. ................................ 24

Figura 2.5. Imagens topográficas de dsDNA sobre HOPG obtidas por AFM.

A) Filme fino de dsDNA obtido aplicando um E = + 0,30 mV (vs. fio de Ag) durante 3 min, numa solução de dsDNA 60 µg mL-1 e B) Filme espesso de

dsDNA preparado por evaporação a partir de uma solução de 37,5 µg mL-1 . .................................................................................................... 28

Figura 2.6. Orientação de uma dupla hélice de DNA na superfície de um

eletrodo conforme o potencial aplicado. .............................................. 29

Figura 2.7. VC. (A) Esquema de aplicação de potencial. (B) Resposta típica para um sistema reversível. . ................................................... 32

Figura 2.8. Variação da corrente faradáica e corrente capacitiva com o tempo, em técnicas de pulso. ............................................................ 34

Figura 2. 9. VPD. (A) Esquema de aplicação de potenciais e (B) Resposta

típica. ............................................................................................ 35

Figura 2. 10. VOQ. (A) Esquema de aplicação de potenciais; B) Resposta típica para um sistema reversível e C) para um sistema irreversível. ...... 36

Figura 3.1. Sistema eletroquímico de trabalho: (A)

Potenciostato/Galvanostato e (B) célula eletroquímica e eletrodos. ........ 41

Figura 3.2. Estrutura química: (A) ácido 2-acetamidoacrílico e (B) ácido sórbico. .......................................................................................... 45

Figura 3.3. Intervalo linear de um método analítico ............................ 47

Figura 3.4. (A) Preparação do biossensor eletroquímico de dsDNA. (B) Incubação do bissosensor de dsDNA na solução de MC-LR. ................... 49

xi

Figura 3.5. Preparação das soluções de dsDNA incubadas com MC-LR. . 50

Figura 4.1. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos imediatamente após a adição de uma solução de MC-LR 60 µmol L-1 em tampão fosfato

pH 7,0, na ausência (—) e presença de MC-LR (—). ∆Es = 2 mV e v = 200 mV s-1. ........................................................................................... 53

Figura 4.2. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos imediatamente

após a adição de uma solução de MC-LR 50 µmol L-1 em tampão acetato

pH 3,4: (—) 1ª, (—) 2ª e () 3ª varreduras. ∆Es = 2 mV e v = 100 mV s-

1. ................................................................................................... 54

Figura 4.3. (A) Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base

corrigida da 1ª varredura sobre ECV obtidos imediatamente após a adição de uma solução de MC-LR 30 µmol L-1 no tampão em função do pH. (B)

Relação dos Ep () e Ip () do pico 1a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1................................................................................. 57

Figura 4.4. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base

corrigida sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução

de MC-LR 30 µmol L-1 em tampão pH 5,3. (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª varredura após transferência do eletrodo ao tampão.

∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1............................................. 58

Figura 4.5. Voltamogramas de onda quadrada sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução de MC-LR 30 µmol L-1 em

tampão acetato pH 5,3: 1ª varredura; It – corrente total, If – corrente direta, Ib – corrente reversa. f = 50 Hz, ∆Es = 2 mV, ∆Ep = 50 mV, veff =

100 mV s-1. .................................................................................... 60

Figura 4.6. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos após 96 h de incubação de MC-LR 50 µmol L-1 em tampão acetato pH 3,4. (—) 1ª e (—)

2ª varreduras entre + 0,25 V e 1,35 V. ∆Es = 2 mV e v = 100 mV s-1. ... 61

Figura 4.7. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos após 96 h de

incubação de MC-LR 50 µmol L-1 em tampão acetato pH 3,4. (—) 1ª e (—) 2ª varreduras entre + 0,25 V e 1,10 V. ∆Es = 2 mV e v = 100 mV s-1. ... 62


corrigida sobre ECV obtidos em solução de MC-LR 30 µmol L-1 incubada em tampão: (A) pH 3,4, (B) pH 4,4, (C) pH 5,3 e (D) pH 6,1. (—) 1ª

varredura imediatamente após adição de MC-LR ao tampão e após (—) 5 h, (—) 24 h e (—) 29 h de incubação. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5

mV s-1. ........................................................................................... 64

Figura 4.9. Variação da corrente do pico 1a para 0, 5, 24 e 29 h de incubação em tampão em função do pH. ............................................ 65

xii

Figura 4.10. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos após 29 h de incubação de MC-LR 30 µmol L-1

em tampão: (A) pH 3,4, (B) pH 5,3 e (C) pH 6,1. (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª varredura após transferência do eletrodo ao tampão.

∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1............................................. 66

Figura 4.11. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos após 29 h de incubação de MC-LR 30 µmol L-1

em tampão: (A) pH 3,4 e (B) pH 6,1: (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras.

∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1............................................. 67

Figura 4.12. (A) Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida da 1ª varredura sobre ECV obtidos em solução de MC-LR 30

µmol L-1 em diferentes eletrólitos, após 29 h de incubação, em função do pH. (B) Relação do () Ep do pico 2a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e

v = 5 mV s-1. .................................................................................. 69

Figura 4.13. Variação da corrente do pico 2a para 5 h, 24 h e 29 h de incubação em tampão em função do pH. ............................................ 70

Figura 4.14. (A) Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida da 2ª varredura sobre ECV obtidos em solução de MC-LR 30

µmol L-1 em diferentes eletrólitos, após 29 h de incubação, em função do pH. (B) Relação do Ep dos picos () 3a e (▲) 4a e Ip dos picos () 3a e (∆)

4a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1. ......................... 71

Figura 4.15. Voltamogramas de onda quadrada sobre ECV obtidos em

solução de MC-LR 30 µmol L-1 incubada após 53 h em tampão pH 5,3: (A) 1ª e (B) 2ª varreduras; It – corrente total, If – corrente direta, Ib –

corrente reversa. f = 50 Hz, ∆Es = 2 mV, ∆Ep = 50 mV, veff = 100 mV s-1. ..................................................................................................... 72

Figura 4.16. Cromatogramas da solução de MC-LR 6,3 x 10-7 µmol L-1 em tampão acetato pH 3,4: (—) imediatamente após a adição da MC-LR no

tampão e (—) após 1 mês de incubação no tampão. ............................ 74

Figura 4.17. Voltamogramas cíclicos com linha de base corrigida sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução de 2-AAA 750

µmol L-1 em tampão fosfato pH 7,0: (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras. ∆Es = 2 mV e v = 50 mV s-1. ............................................................. 76


corrigida da 1ª varredura, sobre ECV, obtidos imediatamente após a adição de uma solução de 2-AAA 60 µmol L-1 no tampão em função do pH.

(B) Relação dos () Ep e () Ip do pico 1a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70

ms e v = 5 mV s-1. .......................................................................... 77

xiii

Figura 4.19. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução

de 2-AAA 60 µmol L-1 em tampão pH 4,5. (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª varredura após transferência do eletrodo ao tampão.

∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1............................................. 79

Figura 4.20. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos em solução de 2-AAA 60 µmol L-1 incubada

em tampão: (A) pH 3,5, (B) pH 4,5, (C) pH 5,3 e (D) pH 6,0. (—) 1ª

varredura imediatamente após adição de 2-AAA ao tampão e após (—) 24 h e (—) 48 h de incubação. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1. .... 80

Figura 4.21. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos imediatamente

após adição de uma solução de SA 750 µmol L-1 em tampão fosfato pH 7,0: (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras. ∆Es = 2 mV e v = 50 mV s-1. .. 82


corrigida da 1ª varredura sobre ECV obtidos imediatamente após a adição de uma solução de SA 150 µmol L-1 no tampão em função do pH. (B)

Relação dos () Ep e () Ip do pico 1a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms

e v = 5 mV s-1................................................................................. 83

Figura 4.23. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução

de SA 150 µmol L-1 em tampão pH 4,2. (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª varredura após transferência do eletrodo ao tampão.

∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1............................................. 84

Figura 4.24. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos em solução de SA 30 µmol L-1 incubada em

tampão: (A) pH 3,4 e (B) pH 5,3. (—) 1ª varredura imediatamente após adição de SA ao tampão e após (—) 5 h, (—) 48 h e (—) 14 dias de

incubação. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1. ............................ 86


corrigida sobre ECV obtidos após 14 dias de incubação de SA 30 µmol L-1 em tampão pH 3,4: (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª

varredura após transferência do eletrodo ao tampão. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1. ...................................................................... 87


corrigida da 1ª varredura sobre ECV obtidos em solução de SA 30 µmol L-1 em diferentes eletrólitos, após 14 dias de incubação, em função do pH.

(B) Relação do () Ep do pico 2a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1. ........................................................................................ 89

xiv

Figura 4.27. Variação da corrente do pico 2a para 24 h, 7 e 14 dias de incubação em tampão em função do pH. ............................................ 90

Figura 4.28. Voltamogramas de onda quadrada sobre ECV obtidos em

solução de SA 30 µmol L-1 incubada após 20 dias em tampão pH 3,4: (A) 1ª e (B) 2ª varreduras; It – corrente total, If – corrente direta, Ib –

corrente reversa. f = 50 Hz, ∆Es = 2 mV, ∆Ep = 50 mV, veff = 100 mV s-1. ..................................................................................................... 91

Figura 4.29. Mecanismo de oxidação proposto para o ácido sórbico. ..... 92

Figura 4.30. Mecanismo de oxidação proposto para os produtos de degradação do ácido sórbico: crotonaldeído (R é C = CH2), malonaldeído

(R é C = O). ................................................................................... 94

Figura 4.31. Mecanismos de oxidação propostos para a MC-LR: Oxidação nos aminoácidos Mdha (A) e Adda (B). ............................................... 95

Figura 4.32. (A) Esquema proposto para a degradação química da MC-LR

e (B) Mecanismo de oxidação proposto para os seus produtos de degradação em solução. ................................................................... 98


corrigida para oxidação da MC-LR, sobre ECV, em tampão pH 1,3, numa

faixa linear de concentração de 5 à 25 µmol L-1. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1. (B) Relação da Ip com a concentração da MC-LR nas

mesmas condições. ........................................................................ 100

Figura 4.34. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida obtidos para o biossensor de dsDNA 50 µg mL-1 de controle (—)

e incubado durante 10 (—) e 20 minutos (—) numa solução de MC-LR em tampão acetato pH 4,5: (A) 30 e (B) 100 µmol L-1. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70

ms e v = 5 mV s-1. ........................................................................ 104

Figura 4.35. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida de uma mistura de dsDNA 50 µg mL-1 e MC-LR 30 µmol L-1 em

tampão acetato pH 4,5, obtidos em um ECV: (A) (—) dsDNA de controle, (—) 0 h; (—) 2 h e (—) 6 h de incubação; (B) (—) dsDNA de controle, (—)

24 h e (—) 48 h de incubação. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

................................................................................................... 105

Figura 4.36. Espectros de absorção de: (—) dsDNA de controle 50 µg mL-

1; (—) MC-LR 25 µmol L-1 e (—) solução de dsDNA 50 µg mL-1 obtida

imediatamente após a adição da MC-LR 25 µmol L-1, em tampão pH 4,5. Inserção: espectro de absorção da mistura dsDNA/MC-LR entre 210 e 350

nm. ............................................................................................. 108

xv

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1. Testes diagnósticos em VC para processos reversíveis,

irreversíveis e quase-reversíveis ........................................................ 33

Tabela 3.1. Tampões para eletrólitos suporte com diluição para 100 mL

de água. ......................................................................................... 40

xvi

LISTA DE SÍMBOLOS

Unidades

Tempo s

Coeficiente de transferência de carga -

Ep Amplitude de pulso mV

Es Incremento de potencial mV

Et Largura de pulso ms

Epa Potencial de pico anódico V

Epc Potencial de pico catódico V

Ep/2 Potencial de meia altura de pico mV

Ei Potencial inicial V

Ef Potencial final V

E1/2 Potencial de meia onda mV

Emax Potencial mínimo V

Emin Potencial máximo V

f Frequência de pulso Hz

Ib Corrente reversa (do inglês backward current) A

If Corrente direta (do inglês forward current) A

Ipa Corrente de pico anódica A

Ipc Corrente de pico catódica A

It Corrente total (do inglês total current) A

n Número de elétrons transferidos -

t Tempo s

v Velocidade de varredura mV s-1

xvii

LISTA DE ABREVIATURAS

2,8-DHA 2-8-dihidroxiadenina

2-AAA Ácido 2-acetamidoacrílico

8-oxoG 8-oxoguanina

Adda 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienóico

Ala Alanina

Arg Arginina monohidroclorada

Asp Ácido aspártico

CG Cromatografia gasosa

CL Cromatografia líquida

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

dAdo Desoxiadenosina

dGuo Desoxiguanosina

DNA Ácido desoxirribonucléico (do inglês Desoxyribonucleic

Acid)

dsDNA Ácido desoxirribonucléico de cadeia dupla (do inglês

double stranded Desoxyribonucleic Acid)

E Eletroforese

ECV Eletrodo de carbono vítreo

ELISA do inglês Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ERO Espécies reativas de oxigênio

Glu Ácido glutâmico

HOPG do inglês High Oriented Pyrolytic Graphite

LD Limite de detecção

LL Limite de linearidade

LQ Limite de quantificação

MC-LF Microcistina-LF

MC-LR Microcistina-LR

MC-LW Microcistina-LW

xviii

MC-RR Microcistina-RR

MCs Microcistinas

Mdha N-metildehidroalanina

MeAsp Ácido metilaspártico

MFA Microscopia de força atômica

pdMC-LR Produto(s) de degradação da microcistina-LR

pdSA Produto(s) de degradação do ácido sórbico

POA’s processos oxidativos avançados

PP1A Proteína fosfatase tipo 1A

PP2A Proteína fosfatase tipo 2A

RMN Ressonânica magnética nuclear

SA Ácido sórbico

ssDNA Ácido desoxirribonucléico de cadeia simples (do inglês

single stranded Desoxyribonucleic Acid)

VC Voltametria cíclica

VOQ Voltamteria de onda quadrada

VPD Voltametria de pulso diferencial

xix

RESUMO

―Estudo Eletroquímico e Eletroanalítico da Microcistina-LR e

Avaliação in situ da sua Interação com DNA‖

Ilanna C. Lopes; Mário C. U. de Araújo; Auro A. Tanaka

A Microcistina-LR (MC-LR) é a hepatotoxina heptapeptídica cíclica mais

tóxica à saúde dos humanos e animais e a mais comumente encontrada

em florações de cianobactérias. Além disso, ela é capaz de induzir danos

oxidativos ao DNA, levando possivelmente à carcinogenicidade em

humanos. Neste trabalho, a MC-LR foi investigada sobre um eletrodo de

carbono vítreo utilizando técnicas voltamétricas. Um processo irreversível,

controlado por difusão e independente do pH foi observado para a

oxidação da MC-LR. Essa toxina sofreu degradação química em solução

tampão ao longo do tempo, com a formação homogênea de dois produtos

de degradação eletroativos. Esses produtos de degradação sofreram

oxidação em um processo irreversível e dependente do pH levando à

formação de dois produtos de oxidação, os quais sofreram reações

reversíveis em um processo dependente do pH. Com isso, mecanismos de

reação de oxidação da MC-LR e dos seus produtos de degradação foram

propostos. Um estudo eletroanalítico para a determinação da MC-LR foi

realizado utilizando DPV. Para isso, foi construída uma curva analítica na

faixa linear de concentração de 5 a 25 µmol L-1. Com base nessa curva,

limites de detecção e quantificação foram estimados em 0,0014 µmol L-1

(1,39 µg L-1) e 0,0046 µmol L-1 (4,57 µg L-1), respectivamente. Além

disso, uma avaliação in situ da interação da MC-LR com dsDNA foi

investigada e mostrou que essa toxina interage e se liga às cadeias do

dsDNA, induzindo à modificações conformacionais na estrutura da dupla

hélice ao longo do tempo de incubação.

Palavras-chave: Microcistina-LR, degradação, voltametria, DNA.

xx

ABSTRACT

―Electrochemical and Electroanalytical Study of Microcistin-LR and

in situ Evaluation of its interaction with DNA‖

Ilanna C. Lopes; Mário C. U. de Araújo; Auro A. Tanaka

The Microcystin-LR (MC-LR) is a cyclic heptapeptidic hepatotoxin most

toxic to the human and animal health and is the most commonly found in

cyanobacteria blooms. Moreover, it can induce oxidative damage to DNA,

leading possibly to the carcinogenicity in humans. In this study, MC-LR

was investigated on glassy carbon electrode using voltammetric

techniques. It was observed that the oxidation of MC-LR is an irreversible,

diffusion controlled and pH-independent process. This toxin was

chemically degradated in buffer solution along the time, with

homogeneous formation of two electroactive degradation products. These

degradation products have undergone an irreversible and pH-dependent

oxidation process, leading to the formation of two oxidation products,

which have undergone reversible and pH-dependent reactions. Thus,

oxidation reaction mecanisms of MC-LR and its degradation products were

proposed. An electroanalytical study for the determination of MC-LR was

carried out using DPV. For this, an analytical curve was built in a linear

concentration range from 5 to 25 µmol L-1. Based on this curve, detection

and quantification limits were estimated at 0.0014 µmol L-1 (1.39 µg L-1)

and 0.0046 µmol L-1 (4.57 µg L-1), respectively. In addition, an in situ

evaluation of MC-LR-dsDNA interaction was investigated and showed that

this toxin interacts and binds to dsDNA chains, inducing conformational

changes in the double helix structure along the incubation time.

Keywords: Microcistyn-LR, degradation, voltammetry, DNA.

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

Introdução

2

Lopes, I. C.

1 INTRODUÇÃO

As cianobactérias, também conhecidas como algas azuis, são

bactérias Gram-negativas procariontes fotossintéticas que são

encontradas em uma variedade de habitats, colonizando biótopos

aquáticos e terrestres (MANKIEWICZ et al., 2003; BRIAND et al., 2003).

Seu domínio sobre as demais espécies do ecossistema é uma indicação de

que elas possuem algumas capacidades fisiológicas específicas que lhes

permitem competir de forma muito eficiente (JAYARAJ, ANAND e RAO,

2006).

As cianobactérias produtoras de toxinas são uma ameaça mundial

para os seres humanos e animais, devido à sua ocorrência ampla em

águas potável e recreacional (HITZFELD, HOGER e DIETRICH, 2000; RAO,

2004). Doenças humanas atribuídas às toxinas de cianobactérias podem

ser categorizadas em gastroenterite e doenças associadas, reações

alérgicas e irritação, e doenças hepáticas (HITZFELD, HOGER e DIETRICH,

2000; CHORUS, 2000).

Certas espécies de cianobactérias são capazes de produzir uma

variedade de toxinas potentes, incluindo um grupo de hepatotoxinas,

especialmente as microcistinas (MCs) (SIVONEN e JONES, 1999). As MCs

são referidas como hepatotoxinas, uma vez que o fígado é o alvo primário

em casos de envenenamento de animais e humanos (CODD, MORRISON e

METCALF, 2005). Elas são as mais frequentemente encontradas na água e

mais comumente responsáveis por envenenamento de seres humanos e

outros animais que entram em contato com florações tóxicas e água

contaminadas (CODD, BELL e BROKS, 1989).

Entre um grupo de cerca de 90 variantes de MCs relatadas até agora

(SIVONEN e JONES, 1999; WELKER e VON DOHREN, 2006), a

microcistina-LR (MC-LR) se destaca como a mais tóxica e a mais

comumente encontrada em florações de cianobactérias (CÀMPAS et al.,

2007). Essa toxina é uma potente inibidora de proteínas fosfatase 1 e 2A,

Introdução

3

Lopes, I. C.

conhecidas como PP1 e PP2A, de células eucariontes, respectivamente.

Também é reconhecida como promotora de tumores hepáticos

(HONKANENER et al., 1990; NISHIWAKI-MATSUSHIMA et al., 1992).

Hemorragia aguda no fígado e morte ocorrem com altas doses de MC-LR

(BISCHOFF, 2001).

A alta toxicidade das cianotoxinas gera impacto sobre os aspectos

ambiental, social e econômico da sociedade moderna (ANTONIOU et al.,

2008a). Devido ao forte efeito tóxico e a grande presença dessas

cianobactérias em águas naturais, as MCs continuam representando um

risco à saúde dos seres humanos através da água potável (MERILUOTO,

1997). Porém, essas toxinas peptídicas decompõem-se rapidamente

quando expostas a pigmentos de cianobactérias e devido à degradação

bacteriana, dentre outras causas (DAWSON, 1998; HARADA e TSUJI,

1998; WATANABE et al., 1992). A degradação total das MCs é dependente

da sua concentração inicial, dos microorganismos presentes, da

temperatura da água, do pH e das disponibilidades de outras fontes de

carbono orgânico (ROBERTSON, LAWTON e CORNISH, 1999; PARK et al.,

2001). Diante disso, vários estudos têm sido citados na literatura sobre a

degradação da MC-LR, como meios de investigação e inativação dessa

toxina (ANTONIOU et al., 2008a; ANTONIOU et al., 2008b; DAVID et al.,

1996; MOMANI, SMITH e EL-DIN, 2008).

Muitos métodos analíticos e bioquímicos/biológicos têm sido

empregados na detecção, caracterização e/ou deteminação de MCs e seus

produtos de degradação em água. Dentre os métodos empregados,

constam a cromatografia líquida (CL), cromatografia gasosa (CG),

eletroforese (E), ressonância magnética nuclear (RMN), microscopia de

força atômica (MFA) e imunoensaios (MSAGATI, SIAME e SHUSHU, 2006).

Abordagens eletroquímicas para o estudo dessas toxinas de

cianobactérias em soluções aquosas têm sido menos frequentemente

relatadas (CÀMPAS, OLTEANU e MARTY, 2008; HUMBLE, GADD e CODD,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Msagati%20TA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Siame%20BA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shushu%20DD%22%5BAuthor%5D

Introdução

4

Lopes, I. C.

1997; YAN, OZSOZ e SADIK, 2000; MERILUOTO et al., 1998). Até o

momento, a literatura nada relata sobre um processo redox direto para a

detecção e determinação de MC-LR, bem como a caracterização de seus

produtos formados.

A MC-LR foi relatada também por induzir danos oxidativos ao DNA

(ácido desoxirribonucléico) in vitro e in vivo, e sua genotoxicidade parece

ser mediada por espécies reativas de oxigênio (ERO) (ZEGURA, LAH e

FILIPIC, 2004; GAUDIN et al., 2008; ZEGURA, SEDMAK e FILIPIC, 2003).

Embora a MC-LR cause grave hepatotoxicidade em mamíferos (HOOSER

et al., 1989; RAO et al., 1995; BHATTACHARYA et al., 1996), podendo

atuar como um iniciador de câncer hepático (ZEGURA, SEDMAK e FILIPIC,

2003), a sua genotoxicidade e carcinogenicidade ainda são inconclusivas.

Assim, segundo a Agência Internacional para Pesquisa sobre Câncer, essa

toxina é classificada como, possivelmente, carcinogênica para humanos

(IARC, 2006). Em decorrência disso, vários estudos têm sido

desenvolvidos na intenção de investigar a ação danosa dessa toxina ao

DNA (GAUDIN et al., 2008; MAATOUK et al., 2004; ZEGURA, SEDMAK e

FILIPIC, 2003).

Biossensores eletroquímicos de DNA têm sido utilizados com sucesso

na investigação da interação de várias moléculas com o DNA. Comparando

com outros métodos, eles mostram uma grande sensibilidade para

detectar pequenas perturbações na estrutura de dupla hélice (OLIVEIRA,

CORDUNEANU e OLIVEIRA-BRETT, 2008), bem como investigar o

mecanismo de ação dos danos oxidativos causados ao DNA. Entretanto,

nada tem sido descrito na literatura sobre o desenvolvimento de

biossensores eletroquímicos de DNA para investigação direta da interação

da MC-LR com o ácido nucléico.

Este trabalho realizou um estudo sobre o comportamento

eletroquímico da MC-LR e da sua degradação em meio aquoso, assim

Introdução

5

Lopes, I. C.

como um estudo eletroanalítico dessa toxina e investigação in situ da sua

interação com o DNA.

1.1 Objetivos

1.1.1 Geral

Este trabalho teve o propósito de estudar o comportamento

eletroquímico da MC-LR e de seus produtos de degradação em solução

aquosa, desenvolver um método eletroanalítico de determinação dessa

toxina e investigar in situ a sua interação com DNA.

1.1.2 Específicos

Investigar as propriedades eletroquímicas da MC-LR, utilizando as

técnicas de voltametria cíclica (VC), voltametria de pulso diferencial

(VPD) e voltametria de onda quadrada (VOQ);

Estudar as propriedades eletroquímicas da MC-LR degradada

utilizando VC, VPD e VOQ;

Investigar a ocorrência da degradação da MC-LR por cromatografia

líquida de alta eficiência;

Detectar os sítios eletroativos da MC-LR;

Propor os mecanismos de oxidação da MC-LR e dos seus produtos

de degradação;

Propor um método eletroanalítico para determinação da MC-LR,

estabelecendo os limites de detecção e quantificação;

Investigar a interação in situ da MC-LR com DNA utilizando

biossensores eletroquímicos de dsDNA e soluções incubadas dessa

toxina com dsDNA.

CAPÍTULO 2

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Fundamentação Teórica

7

Lopes, I. C.

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 Considerações gerais sobre cianobactérias

As cianobactérias ou "algas azuis" constituem um grupo

diversificado de bactérias fotossintéticas oxigênicas que habitam uma

grande variedade de ambientes aquáticos e terrestres, e mostram grande

diversidade morfológica (PEARSON et al., 2010). Pertencem a um antigo

grupo de microorganismos presentes no planeta há três bilhões de anos e

apresentam uma combinação de características encontradas tanto em

algas como em bactérias.

Em condições naturais, as cianobactérias vivem em equilíbrio com

os demais grupos de algas. No entanto, em situações de enriquecimentos

nutricionais, ou seja, eutrofização do corpo d’água e condições

hidrológicas estáveis, pode ocorrer o aumento de abundância das espécies

de cianobactérias, dando origem à florações.

As florações das cianobactérias causam impactos sociais,

econômicos e ambientais, não apenas por sua biomassa contribuir para

problemas estéticos como alterações na coloração da água (as ―natas‖

verdes na superfície) e odor desagradável, mas também, por alterar o

sabor da água tratada para abastecimento. A decomposição das florações

de algas leva a desoxigenação, alterando a química da água e afetando a

capacidade de sobrevivência dos organismos aquáticos. As florações de

cianobactérias tóxicas comprometem a disponibilidade hídrica para os

usos mais nobres como abastecimento público, dessedentação animal,

recreação de contato primário, irrigação de hortaliças, aquicultura e

pesca, dentre outros (DEBERDT, NETO e AGUJARO, 2001).

Atualmente, há cerca de 150 gêneros de cianobactérias, das quais

40 são conhecidas como produtoras de toxinas – as cianotoxinas (SAKER,

THOMAS e NORTON, 1999). No Brasil, os gêneros mais comuns de

cianobactérias formadoras de florações são Microcystis, Nodularia,


8

Lopes, I. C.

Cilindrospermopsis, Anabaena, Aphanizomenon e Planktothrix

(SANT’ANNA e AZEVEDO, 2000).

2.1.1 Cianotoxinas

As cianotoxinas são conhecidas como toxinas produzidas por

cianobactérias. Constituem um amplo grupo de produtos naturais tóxicos.

Em ambientes aquáticos, as cianotoxinas normalmente permanecem

contidas nas células de cianobactérias e são liberadas em quantidade

considerável após a lise celular, que ocorre durante a fase de senescência

(morte natural), estresse celular ou uso de algicidas, como sulfato de

cobre ou cloração (MAGALHÃES, SOARES e AZEVEDO, 2001).

A produção desses metabólitos secundários bioativos, com altas

propriedades tóxicas pode afetar direta ou indiretamente a saúde de

muitos animais, inclusive a do homem (DEBERDT, NETO e AGUJARO,

2001).

As toxinas de cianobactérias constituem um grupo quimicamente

heterogêneo, apresentando assim, diferentes propriedades toxicológicas.

Elas podem ser divididas em três grupos principais, com base na

estrutura química: peptídeos cíclicos, alcalóides e lipopolissacarídeos

(SIVONEN e JONES, 1999).

Comumente, as cianotoxinas são classificadas em categorias

distintas relacionadas aos efeitos tóxicos provocados nos organismos

afetados. Do ponto de vista toxicológico, as cianotoxinas abrangem quatro

classes principais, as quais são bastante diversificadas estruturalmente:

neurotoxinas, hepatotoxinas, citotoxinas e dermatoxinas (toxinas

irritantes) (PEARSON et al., 2010).

As principais e mais perigosas toxinas produzidas pelos gêneros de

cianobactérias mais comuns são: microcistinas, nodularinas,

cilindrospermopsinas e saxitoxinas (PEARSON et al., 2010).


9

Lopes, I. C.

Grande parte dos envenenamentos por cianobactérias envolve

hepatotoxicidade aguda causada por hepatotoxinas, que apresentam uma

ação mais lenta, podendo causar mortes num intervalo de poucas horas a

poucos dias (CARMICHAEL, 1994).

Dentre essas hepatotoxinas, as MCs constituem o grupo mais

comum e com maior incidência de acidentes por contaminação de

humanos e animais.

2.1.1.1 Microcistinas

As MCs foram as primeiras hepatotoxinas identificadas, isoladas do

gênero Microcystis aeruginosa (BISHOP, ANET e GORHAM, 1959). São as

cianotoxinas mais largamente encontradas nas florações de cianobactérias

de água doce (CARMICHAEL, 1994), usualmente encontradas em lagos,

reservatórios de água e áreas recreacionais (YAN, OZSOZ e SADIK, 2000).

As hepatotoxinas MCs são as toxinas mais comuns produzidas por

alguns gêneros de cianobactérias tais como, Microcystis, Anabaena,

Oscillatoria e Nostoc (FERRÃO-FILHO, KOZLOWSKY-SUZUKI e AZEVEDO,

2002). Constituem uma família de toxinas que têm recebido atenção

considerável, devido a sua potente atividade hepatotóxica (HUMBLE,

GADD e CODD, 1997). Essa forte toxicidade implica graves problemas

ecológicos e um risco à saúde dos seres humanos e animais (VELA et al.,

2008).

As MCs são de particular preocupação, uma vez que casos agudos

de intoxicação por essas toxinas podem causar morte rápida em humanos

e outros animais (JOCHIMSEN et al., 1998). Elas têm causado mortalidade

em animais domésticos e selvagens, doenças em seres humanos

(CARMICHAEL, 1994; CARMICHAEL e FALCONER, 1993), e quando

expostos por meio de hemodiálise, até mesmo a morte (JOCHIMSEN et

al., 1998).


10

Lopes, I. C.

Tem sido relatado que as MCs são as toxinas específicas do fígado

em condições in vitro e in vivo (MIRURA et al., 1989; PACE et al., 1991).

Essas toxinas agem por inibição das proteínas fosfatases 1 (PP1A) e 2A

(PP2A), o que leva a fosforilação de proteínas (MACKINTOSH et al., 1990;

CARMICHAEL, 1994). As consequências são a lesão do citoesqueleto,

necrose hepática e hemorragia no fígado (HOOSER et al., 1989;

CARMICHAEL, 1994). Mais importante, as MCs são potentes promotoras

de tumor no fígado (NISHIWAKI-MATSUSHIMA, 1992) e há uma indicação

de que elas também podem agir como iniciadores do tumor (ITO et al.,

1997).

A revelação de que hepatotoxinas de cianobactérias causam a

inibição de proteínas fosfatases levantou a possibilidade inquietante de

que a exposição humana a doses não letais desses compostos podem

contribuir para o desenvolvimento do câncer (YOSHIAWA et al., 1990;

NISHIWAKI et al., 1991). Vários estudos laboratoriais indicaram que a

exposição crônica à microcistina pode realmente promover tumores na

pele e fígado de ratos e camundongos (FALCONER, 1991; NISHIWAKI-

MATSUSHIMA, 1992). Dados epidemiológicos sugerem que os mesmos

efeitos a longo prazo, podem ocasionar carcinoma hepatocelular em seres

humanos (YU, 1995; YU, 1989).

Assim, as MCs são um grupo de toxinas melhor conhecido e mais

extensivamente estudado (FALCONER, 1999; FASTNER et al., 1999). As

MCs compõem o maior grupo de toxinas de cianobactérias e o mais

diverso estruturalmente. Há cerca de 90 isoformas de MCs identificadas

(SIVONEN e JONES, 1999; WELKER e VON DOHREN, 2006), as quais

compartilham a mesma estrutura, ciclo (D-Alanina-X-D-MeAsp-Y-Adda-D-

Glu-Mdha), onde X e Y são os L-aminoácidos variáveis, MeAsp é o ácido

metilaspártico, Glu é o ácido glutâmico, Adda e Mdha são os aminoácidos

incomuns (3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienóico) e

N-metildehidroalanina, respectivamente. As MCs são nomeadas de acordo


11

Lopes, I. C.

com os L-aminoácidos variáveis que elas contêm, formando uma série de

variantes da molécula. A mais comum, mais tóxica e, consequentemente,

mais amplamente estudada é a MC-LR que apresenta os L-aminoácidos

leucina (L) e arginina (R) nas posições variáveis (LAWTON e ROBERTSON,

1999). Consequentemente, esforços significativos de investigação têm

sido dirigidos para a identificação e erradicação das MCs em águas

naturais, principalmente, a MC-LR, objeto de estudo desse trabalho.

2.1.1.1.1 Microcistina-LR

A MC-LR, com estrutura química cíclica (D-Alanina-L-Leucina-D-

MeAsp-L-Arginina-Adda-D-Glu-Mdha), Figura 2.1, é uma hepatotoxina

produzida principalmente pela espécie Microcystis aeruginosa, mas

também pelas Anabaena flos-aquae, Oscillatoria agardhii e Nostoc sp

(SHORT e EDWARDS, 1990; HARADA e TSUJI, 1998).

OCH3

NH

HN

O

OHO

N

O

NH

O

HN

O

HN

HN

OO

OHO

O

NH

H2N

NH

Ácido glutâmicoGlu

N-metildehidroalaninaMdha

AlaninaAla

LeucinaLeu

ArgininaArg

Adda

ácido metilaspárticoMeAsp

12

3

4

7

568910

Figura 2.1. Estrutura molecular da MC-LR.


12

Lopes, I. C.

Essa hepatotoxina é altamente solúvel em água (HARADA e TSUJI,

1998), é a toxina peptídica mais investigada, pois está frequentemente

presente em florações de cianobactérias e é a mais tóxica das MCs

(CÀMPAS et al., 2007). Essas florações ocorrem em rios, lagos, lagoas e

reservatórios no mundo inteiro e estão associadas a estagnação de água,

temperatura e eutrofização das águas (SHORT e EDWARDS, 1990;

DAWSON, 1998; HARADA e TSUJI, 1998; WATANABE et al., 1992).

Causas antropogênicas do aumento da concentração de nutrientes na

água incluem os esgotos, poluição industrial, utilização de detergentes e

escoamento de fertilizantes e resíduos animais (DAWSON, 1998).

A MC-LR é liberada quando as cianobactérias morrem ou são

destruídas. As pessoas são expostas a essas toxinas com mais freqüência

através da ingestão de água potável ou durante atividades de lazer,

quando a água é ingerida (GROSSE et al., 2006).

A toxicidade da MC-LR tem como órgão alvo o fígado, devido à

presença do sistema de transporte de ácidos biliares. A MC-LR liga-se e

inibe as fosfatases protéicas serina/treonina tipos 1A e 2A, que estão

presentes em todos os tecidos de mamíferos. A carbonila alfa, beta-

insaturadas do resíduo Mdha da microcistina liga-se covalentemente a

cisteína-273 da fosfatase tipo 1A. A inibição da fosfatase é mediada pela

cadeia lateral Adda e o grupo carboxila glutamil (BISCHOFF, 2001).

A hiperfosforilação que ocorre na intoxicação por microcistina devido

à inibição de proteínas fosfatases causa desmontagem de proteínas do

citoesqueleto, incluindo os filamentos intermediários, especialmente

citoqueratinas 8, 9 e 13 de microfilamentos de actina e microtúbulos.

Danos no citoesqueleto levam a bolhas e arredondamento dos

hepatócitos. Os danos estruturais nos hepatócitos e a consequente perda

de adesão célula-célula provoca danos à estrutura hepática e colapso das

sinusóides hepáticas. O fígado torna-se cheio de sangue. Na intoxicação


13

Lopes, I. C.

aguda por microcistina, a morte é devido ao choque hemorrágico

(BISCHOFF, 2001).

O fígado também é o órgão alvo para a promoção de tumor pelos

efeitos da MC-LR. A inibição das PP1A e PP2A é uma via de promoção de

tumor. A formação de tumores está provavelmente associada com as

mudanças morfológicas nos hepatócitos, devido à hiperfosforilação de

citoqueratinas e de outras proteínas estruturais (BISCHOFF, 2001).

Recentemente, um estudo relatou que a MC-LR é capaz de induzir

citotoxicidade nas células renais, apoiando a idéia de que outros órgãos,

além do fígado, também podem ser afetados por essa toxina (ALVERCA et

al., 2009).

Os efeitos da toxicidade das MCs em humanos são diversos, entre

eles estão: gastroenterites, náuseas, vômitos, febre, sintomas de gripe,

dor de garganta, irritação nos ouvidos e olhos, erupções, mialgias, dores

abdominais incluindo dores causadas por hepatomegalia, consolidação

pulmonar, distúrbios visuais, cianose, danos hepáticos e hemorragias

internas, convulsões e até morte (COOD, 2000; DUY et al., 2000).

Embora a MC-LR cause grave hepatotoxicidade em mamíferos

(HOOSER et al., 1989; RAO et al., 1995; BHATTACHARYA et al., 1996), a

sua genotoxicidade e carcinogenicidade são inconclusivas. Ding et al.

(1999) relataram que extratos de cianobactérias derivados de Microcystins

induziram significativamente mutações genéticas, independentemente de

ativação metabólica, embora a MC-LR pura, não. Tsuji et al. (1995) e

Tsuji et al. (1997) também não conseguiram demonstrar a genotoxicidade

da MC-LR. Por outro lado, a MC-LR tem alguns efeitos genotóxicos em

células mamíferas. Ding et al. (1999) observaram danos no DNA dos

hepatócitos primários de ratos e Rao e Bhattacharya (1996) descobriram

que a MC-LR poderia induzir fragmentação do DNA e quebras de fitas do

DNA no fígado de rato in vivo. Dois estudos relataram a indução de

aberrações cromossômicas e mutações genéticas em células de mamíferos


14

Lopes, I. C.

(SUZUKI et al., 1998; REPAVICH et al., 1990). Assim, segundo a Agência

Internacional para Pesquisa sobre Câncer, essa toxina é classificada como,

possivelmente, carcinogênica para humanos (IARC, 2006).

Vários estudos têm sido desenvolvidos na intenção de investigar a

ação danosa dessa toxina ao DNA (GAUDIN, et al., 2008; MAATOUKA et

al., 2004; ZEGURA, SEDMAK e FILIPIC, 2003).

Relatos têm mostrado o aumento da incidência de câncer de fígado

em humanos (UENO et al., 1996) e envenenamentos de animais

(HALDEREN et al., 1995) em diferentes países, quando as pessoas ou o

gado haviam consumido água contaminada com MCs.

No Brasil, ocorreram dois casos graves de envenenamentos

atribuídos a cianobactéria. No primeiro caso, uma floração de Anabaena e

Microcystins ocorrida na Represa de Itaparica-BA foi responsável por 2000

gastroenterites, resultando em 88 mortes, a maioria de crianças

(TEIXEIRA et al., 1993). O segundo caso ocorreu no Instituto de Doenças

Renais em Caruaru-PE, em 1996, causando a morte de 55 pacientes por

intoxicação hepática devido à contaminação da água utilizada para

hemodiálise com microcistina (JOCHIMSEN et al., 1998).

Em algumas regiões do país, a situação é bastante alarmante, pois

vários reservatórios e açudes utilizados para o abastecimento público

apresentam freqüentes florações de algas tóxicas (MAGALHÃES, SOARES

e AZEVEDO, 2001).

A alta toxicidade das cianotoxinas gera impacto sobre os aspectos

ambiental, social e econômico da sociedade moderna (ANTONIOU et al.,

2008a). Devido ao forte efeito tóxico e a grande presença dessas

cianobactérias em águas naturais, as MCs continuam representando um

risco à saúde dos seres humanos através da água potável (MERILUOTO,

1997). Diante disso, a Organização Mundial da Saúde estabeleceu o valor

limite para MC-LR total em água potável como sendo de 1 µg L-1 (WHO,

1998).


15

Lopes, I. C.

Essas toxinas peptídicas podem sofrer degradação em água, elas

decompõem-se rapidamente quando expostas a pigmentos de

cianobactérias e devido à degradação bacteriana, dentre outras causas

(DAWSON, 1998; HARADA e TSUJI, 1998; WATANABE et al., 1992).

Diluição e adsorção também contribuem para a detoxificação da MC-LR in

natura (HARADA e TSUJI, 1998). A degradação total das microcistinas é

dependente da sua concentração inicial, dos microorganismos presentes,

da temperatura da água, do pH e das disponibilidades de outras fontes de

carbono orgânico (ROBERTSON, LAWTON e CORNISH, 1999; PARK et al.,

2001). Assim, vários estudos têm sido citados na literatura sobre a

degradação da MC-LR, como meios de investigação e inativação dessa

toxina (ANTONIOU et al., 2008a; ANTONIOU et al., 2008b; DAVID et al.,

1996; MOMANI, SMITH e EL-DIN, 2008).

Uma vez que, a MC-LR constitui uma ameaça considerável para a

saúde humana, torna-se de fundamental importância a aplicação de

técnicas analíticas precisas e sensíveis para a sua investigação e

monitoramento.

2.2 Métodos analíticos aplicados à análise de MC-LR

Dois métodos são geralmente empregados na análise de

hepatotoxinas de cianobactérias: ensaios bioquímicos/biológicos e

métodos físico-químicos (métodos analíticos) (MSAGATI, SIAME e

SHUSHU, 2006).

Dentre os métodos bioquímicos/biológicos utilizados na detecção e

identificação da MC-LR, os mais comuns são: ensaios in vivo e ELISA (do

inglês Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (SHENG, HE e SHI, 2007;

LONG et al., 2009).

Os métodos analíticos comumente utilizados na detecção,

caracterização e/ou determinação da MC-LR, bem como na análise de

seus produtos de degradação em água e na sua investigação com DNA,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Long%20F%22%5BAuthor%5D


16

Lopes, I. C.

constam a cromatografia líquida (CL) (ANTONIOU et al., 2008a;

ANTONIOU et al., 2008b; SONG et al., 2006; SHI et al., 2005; MOMANI,

SMITH e EL-DIN, 2008; DAVID et al., 1996; SANCHES et al., 2007; VELA

et al., 2008; DAI et al., 2008; PYO et al., 2005; SENGPRACHA,

SUVANNACHAI e PHUTDHAWONG, 2006), cromatografia gasosa (CG)

(TANAKA et al., 1993; TSUJI et al., 2001), eletroforese (E) (ZEGURA,

SEDMAK e FILIPIC, 2003; GAUDIN et al., 2008; BATEMAN et al., 1995;

GÁBOR et al., 2006), ressonância magnética nuclear (RMN) (HARADA et

al., 1990; SANO et al., 2005) e microscopia de força atômica (MFA)

(ETCHEGARAY, BUENO e TESCHKE, 2010). No entanto, o método

convencional de análise e detecção da MC-LR é a cromatografia líquida de

alta eficiência (CLAE) de fase reversa com detecção UV-Vis em 238 nm

(MERILUOTO et al., 1998).

Alguns desses estudos com a MC-LR são mencionados abaixo:

Bourne et al. (1996) ao investigarem a ação de enzimas hidrolíticas

das Sphingomonas na degradação da MC-LR encontraram,

identificaram e quantificaram dois produtos intermediários de

degradação, utilizando CL com espectrometria de massa;

Al Momani et al. (2005) verificaram a degradação eficaz da MC-LR e

MC-RR em solução aquosa por processos oxidativos avançados

(POA’s) baseados em ozônio (O3/H2O2, O3/Fe(II), e tratamento

Fenton), utlizando CL com detector UV-Vis;

Song et al. (2006) analisaram os produtos de degradação da MC-LR

e MC-RR formados durante a degradação induzida por ultrassom,

utilizando CL com espectrometria de massa, e elucidaram os

prováveis mecanismos de degradação dessas toxinas;

Antoniou et al. (2008a, 2008b) observaram a degradação da MC-LR

e identificaram estruturalmente os produtos intermediários de

reação formados durante a degradação fotocatalítica da MC-LR com

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=RedirectURL&_method=outwardLink&_partnerName=27983&_origin=article&_zone=art_page&_linkType=scopusAuthorDocuments&_targetURL=http%3A%2F%2Fwww.scopus.com%2Fscopus%2Finward%2Fauthor.url%3FpartnerID%3D10%26rel%3D3.0.0%26sortField%3Dcited%26sortOrder%3Dasc%26author%3DDai,%2520Ming%26authorID%3D35315434500%26md5%3D280136f9e27bff7739a57401024065f5&_acct=C000037638&_version=1&_userid=686465&md5=d2735e1bb2a79e7aec37cb4438376a60

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sano%20T%22%5BAuthor%5D


17

Lopes, I. C.

fotocatálise de TiO2 imobilizado, utilizando CL com espectrometria

de massa;

Sengpracha, Suvannachai e Phutdhawong (2006) desenvolveram

um método utilizando CLAE de fase reversa com detector UV-Vis

para determinação de MC-LR em águas naturais;

Sanches et al. (2007) desenvolveram e validaram um método

analítico utilizando CL com detector UV-Vis para a determinação da

MC-LR em água utilizada para hemodiálise;

Dai et al. (2008) desenvolveram e validaram um método por CL com

espectrometria de massa para determinação quantitativa simultânea

da MC-LR e seus conjugados de glutationa (MC-LR-GSH) nos tecidos

dos peixes;

Long et al. (2009) desenvolveram um método de detecção para MC-

LR em amostras de água utilizando o método ELISA de

fluorescência;

Zegura, Sedmak e Filipic (2003) investigaram a capacidade da MC-

LR em induzir danos ao DNA em célula de hepatoma humano

(HepG2) e os mecanismos moleculares desses danos, utilizando

eletroforese de gel de célula única (teste do cometa). Foi observado

que a MC-LR induziu a formação de espécies reativas de oxigênio

que causaram danos ao DNA, pela quebra das cadeias da dupla

hélice originada da excisão de adutos oxidativos ao DNA;

Vela et al. (2008) ao estudar em in vitro a interação da MC-LR com

DNA utilizando CLAE, revelaram que essa hepatotoxina não

apresentou afinidade por DNA nas condições experimentais

testadas;

Gaudin et al. (2008) investigaram os efeitos da MC-LR sobre o DNA

em vários órgãos utilizando o teste do cometa in vivo em

camundongos e revelaram que essa toxina causou danos oxidativos



18

Lopes, I. C.

ao DNA principalmente no fígado, mas também foram relatados

lesões nos rins, intestino e cólon intestinal.

Em geral, os métodos acima mencionados requerem um longo

tempo nas etapas iniciais de preparação das amostras, utilizam grandes

quantidades de reagentes e a instrumentação é geralmente dispendiosa, o

que eleva o custo das análises. Assim, há necessidade de se disponibilizar

métodos analíticos mais acessíveis e com baixos custos de manutenção e

operação, proporcionando desta forma condições para o estabelecimento

de métodos práticos para a análise de cianotoxinas. Uma boa alternativa

para superar os inconvenientes das outras técnicas é o uso de métodos

baseados em medidas eletroquímicas (SADIK e EMON, 1996).

Os métodos eletroquímicos permitem que se desenvolvam processos

de medição simples, rápidos, seletivos e de baixo custo, além de

demonstrarem ser um dos métodos de detecção mais sensíveis na análise

de compostos orgânicos. Outra grande vantagem consiste na possibilidade

de miniaturização dos eletrodos e células, assim como portabilidade do

potenciostato (CÀMPAS, OLTEANU e MARTY, 2008). Todavia, até o

momento, a literatura nada relata sobre um processo redox direto para a

detecção e determinação de MC-LR, bem como a caracterização de seus

produtos formados em água e sua interação com DNA. Assim, os métodos

eletroquímicos para o estudo dessa toxina de cianobactéria em soluções

aquosas têm sido menos frequentemente relatados (HUMBLE, GADD e

CODD, 1997; MERILUOTO et al., 1998; YAN, OZSOZ e SADIK, 2000; YAN

et al., 2001; FENG et al., 2005; CÀMPAS et al., 2007; CÀMPAS, OLTEANU

e MARTY, 2008).

Alguns desses estudos voltamétricos da MC-LR, descritos na

literatura, são relatados a seguir:

Humble, Gadd e Codd (1997) investigaram de forma indireta as

toxinas MC-LR, MC-LW e MC-LF em meio aquoso através da


19

Lopes, I. C.

complexação com cobre e zinco, utilizando palarografia de pulso

diferencial;

Meriluoto et al. (1998) desenvolveram um método de detecção da

MC-LR através da CLAE com detector eletroquímico e relataram que

nenhuma onda ou pico de oxidação pôde ser detectado por VC,

indicando que uma baixa ou irreversível reação de transferência de

carga tenha ocorrido. Resultados similares foram observados por

Yan, Ozsoz e Sadik (2000) ao estudar a oxidação da MC-LR por VC.

Em contrapartida, uma detecção indireta dessa toxina foi possível

através da complexação com Hg2+ em eletrodo de ouro, utilizando

voltametria de redissolução de pulso diferencial;

Feng et al. (2005) estudaram o efeito da corrente sobre a taxa de

degradação da MC-LR ao investigar a sua oxidação eletroquímica e

sugeriram que a toxina pode ser decomposta completamente pela

oxidação indireta durante a oxidação eletroquímica;

Yan et al. (2001) desenvolveram um biossensor eletroquímico de

ssDNA para detecção das espécies Microcystis spp. em solução

usando azul de metileno e bipiridina de rutênio como indicadores

eletroquímicos, utilizando VC.

2.3 Ácido desoxirribonucléico

O DNA é a molécula da hereditariedade, pois ela contém e transmite

a informação genética às gerações seguintes (BRETT e SERRANO, 1995).

A sua descoberta ocorreu em 1869 pelo médico suíço Johann Friedrich

Miescher (CLARKE, 2003).

Essa molécula tem uma estrutura tridimensional de dupla hélice

constituída por duas cadeias (fitas) polinucleotídicas, dispostas em

direções opostas, enroladas em torno de um eixo comum, Figura 2.2.


20

Lopes, I. C.

Figura 2.2. Representações da dupla hélice do DNA (Adaptado de GRIFFITHS et

al., 1999).

A estrutura da cadeia é formada por grupos fosfato e pentoses,

alternadamente ligados por pontes de fosfodiéster, as cadeias da dupla

hélice são mantidas juntas por ligações de hidrogênio entre as bases

nitrogenadas purínicas, adenina (A) e guanina (G), e pirimidínicas,

citosina (C) e timina (T), Figura 2.3.

Figura 2.3. Estrutura química do DNA. Ligações de hidrogênio entre bases complementares em um fragmento de uma molécula de DNA (Fonte: BRETT e

SERRANO, 1995).


21

Lopes, I. C.

Essas bases, adenina - timina e guanina - citosina, através da sua

sequência e emparelhamento carregam toda a informação genética,

enquanto o açúcar e o fosfato constituem apenas a espinha dorsal

estrutural do DNA. Embora as duas cadeias do DNA sejam

complementares, elas não são idênticas e são anti-paralelas. No entanto,

as bases de purina e pirimidina estão no interior da hélice e os planos das

bases são perpendiculares ao eixo da hélice (BRETT e SERRANO, 1995).

2.3.1 Danos ao DNA

O termo "dano ao DNA" refere-se a qualquer alteração na estrutura

química do material genético resultante de interações com agentes físicos

ou químicos externos (FOJTA, 2005). Esse dano também ocorre devido a

ataques ao DNA pelas espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas in

vivo (OLIVEIRA-BRETT e DICULESCU, 2004b).

Os principais tipos de danos ao DNA incluem interrupções no

esqueleto açúcar-fosfato (quebras de fita), liberação de bases devido à

hidrólise de ligações N-glicosil (depurinação e depirimidinação) e uma

variedade de lesões nas bases (adutos), resultantes de reações de DNA

com uma ampla variedade de oxidantes, agentes alquilantes, etc.

Os danos ao DNA podem afetar as funções celulares cruciais e

podem, quando não reparados, dar origem a mutações, ou seja,

modificações permanentes na estrutura do DNA que produzem falhas de

informação genética durante a replicação do mesmo (LABUDA et al.,

2010).

Os danos ao DNA podem ser provocados diretamente através da sua

interação com várias moléculas. Existem três tipos principais de interação

entre as moléculas em geral e o DNA: atração eletrostática, ligação

covalente de uma molécula em qualquer um dos sulcos do DNA e

intercalação dos anéis aromáticos de uma molécula entre os pares de

base do DNA. Enquanto os dois primeiros tipos de interação não


22

Lopes, I. C.

modificam a estrutura do DNA, a intercalação poderá induzir torções no

esqueleto fosfato-açúcar de modo que os pares de bases adjacentes

sejam separados. Os agentes que podem danificar o DNA podem atuar

diretamente ou necessitar de ativação metabólica (POIRIER, WESTON e

JOSEPH, 2002).

Acredita-se que a modificação do DNA (lesão do DNA) leva à

carcinogênese (OLIVEIRA-BRETT e DICULESCU, 2004a). Muitas das

doenças hereditárias, que apresentam consequências letais, mutagênicas

ou carcinogênicas, são oriundas de algum dano irreversível ao DNA

(SÉQUARIS e VALENTA, 1987). O processo de carcinogênese é

compreendido como decorrente de múltiplas mutações em genes críticos,

e o risco de câncer é reduzido quando o dano potencialmente mutagênico

é removido pelo processo de reparação do DNA (POIRIER, WESTON e

JOSEPH, 2002).

Esses danos ocorrem principalmente nas bases purínicas e com

maior frequência nos resíduos de guanina. A guanina é de todas as bases

a mais facilmente oxidável, sendo por isso o alvo principal dos danos

causados por oxidação do DNA dentro da célula, quer por agentes

endógenos como as espécies reativas de oxigênio resultantes do

metabolismo, quer por agentes exógenos como alguns antibióticos,

cátions metálicos e fármacos com ação antineoplásica (HALLIWELL e

GUTTERIDG, 1999).

O principal produto da oxidação da guanina é a 8-oxoguanina (8-

oxoG). A formação de 8-oxoG no interior da dupla hélice de DNA origina

mutações pontuais significativas, uma vez que, caso o dano não seja

reparado por uma das enzimas reparadoras específicas, ocorre a

incorporação errada de desoxiadenosina em vez de desoxicitidina no lado

oposto ao dano oxidativo durante a replicação do material genético

(HALLIWELL e GUTTERIDG, 1999; SHIBUTANI, TAKESHITA e GROLLMAN,

1991).


23

Lopes, I. C.

A modificação química de cada uma das bases do DNA provoca

perturbação molecular para o material genético, levando à disfunção e,

consequentemente, morte celular. Por exemplo, dano oxidativo no DNA

por radicais livres e exposição à radiação ionizante gera dentro da dupla

hélice, além da 8-oxo-G, outros produtos mutagênicos tais como, 2,8-

oxoadenina, 5-formiluracil, 5-hidroxicitosina e 5,6-dihidroxitimina

(OLIVEIRA-BRETT et al., 2004). Esses produtos são considerados

biomarcadores importantes dos danos oxidativos ao DNA, todos esses

danos causam quebra nas fitas tanto do DNA de cadeia simples (ssDNA)

como do DNA de cadeia dupla (dsDNA) e são letais para as células

(PIEDADE et al., 2006). Diante disso, foi estabelecido que a oxidação do

DNA é uma importante fonte de instabilidade genômica, já que há

evidências de que os produtos de oxidação das bases do DNA

desempenham papéis importantes na mutagênese, carcinogênese,

envelhecimento e doenças relacionadas à idade (OLIVEIRA-BRETT et al.,

2004).

A reatividade do DNA e os danos ao DNA são importantes do ponto

de vista químico tanto quanto médico (OLIVEIRA-BRETT e DICULESCU,

2004a). Assim, torna-se evidente a importância em desenvolver

tecnologias e metodologias para efetuar análises de investigação da

interação do DNA com diferentes moléculas e dos seus danos. A

necessidade de utilização de ferramentas analíticas capazes de investigar

esses danos causados no DNA de uma forma simples e menos dispendiosa

tem impulsionado o desenvolvimento de diversos sensores eletroquímicos

à base de DNA.


24

Lopes, I. C.

2.3.2 Eletroquímica do DNA

2.3.2.1 Propriedades eletroquímicas do DNA

A eletroquímica dos ácidos nucléicos foi descoberta há

aproximadamente 40 anos. Durante os 15 primeiros anos a eletroquímica

trouxe as primeiras evidências do polimorfimo da dupla hélice do DNA

(PALECEK, 2002).

O DNA ao ser estudado eletroquimicamente sobre eletrodo de

carbono vítreo apresentou dois picos de oxidação, Figura 2.4, os quais

podem ser usados como sondas individuais dos pares de bases guanina-

citosina e adenina-timina na dupla hélice do DNA (BRETT, SERRANO e

PIEDADE, 1999; BRETT, 2005).

Figura 2.4. Voltamogramas de pulso diferencial obtidos sobre um eletrodo de

carbono vítreo em solução tampão acetato 0,1 mol L-1 pH 4,5 com: 60 µg mL-1 de ssDNA (•••) 1ª e (—) 10ª varredura, e 60 µg mL-1 de dsDNA (•••) 1ª e (—) 40ª

varredura de potencial (Fonte: DICULESCU, 2004).


25

Lopes, I. C.

O primeiro pico em E1pa ≈ + 0,85 V está associado à oxidação de

resíduos de guanina, enquanto que o segundo pico em E2pa ≈ + 1,15 V é

devido à oxidação de resíduos de adenina, Figura 2.4. Uma diferença nos

sinais analíticos registrados para o DNA evidenciaram uma maior

dificuldade da transferência de carga dos grupos adenina e guanina, que

se encontram no interior da dupla hélice do dsDNA (forma mais rígida),

em comparação com os sinais obtidos para o ssDNA (forma mais flexível),

onde os resíduos de guanina e adenina se encontram nas proximidades da

superfície do eletrodo (BRETT, SERRANO e PIEDADE, 1999; BRETT e

SERRANO, 1994).

Conforme já mencionado, como consequência da lesão oxidativa do

DNA, a 8-oxoGua (base mais frequentemente alterada no DNA) é formada

pela oxidação da guanina na posição C8 (BRETT, PIEDADE e SERRANO,

2000). No entanto, já foi sugerido que outras lesões podem ser tão

importantes quanto a 8 oxoGua (KAMIYA, 2003). A oxidação da base

adenina leva à formação de 2-8-dihidroxiadenina (2,8-DHA), o principal

produto de oxidação da adenina (GOYAL, KUMAR e MITTAL, 1991).

Por VPD, foi possível identificar a presença da 8-oxoG (BRETT,

PIEDADE e SERRANO, 2000) e/ou 2,8-DHA (DICULESCU, PIEDADE e

BRETT, 2007) no DNA, Figura 2.4, após a sua oxidação prolongada. Isto

indica que é possível detectar simultaneamente em um único ensaio

voltamétrico se o DNA se encontra em cadeia simples ou dupla e se sofreu

danos oxidativos. Em consequência, o estudo da eletroxidação do DNA

sobre eletrodos de carbono está baseado no monitoramento de variações

nas correntes das bases purínicas ou na detecção dos seus produtos de

oxidação principais, 8-oxoGua (BRETT, PIEDADE e SERRANO, 2000) e/ou

2,8-DHA (BRETT, SERRANO e PIEDADE, 1999; DICULESCU, PIEDADE e

BRETT, 2007), indicadores biológicos de danos oxidativos ao DNA

(GRIFFITHS et al., 1999; BRETT, SERRANO e PIEDADE, 1999).


26

Lopes, I. C.

O fato dos ácidos nucléicos poderem sofrer reações de oxidação e

serem facilmente observados por técnicas eletroquímicas torna possível a

determinação da interação do DNA e dos seus danos oxidativos

provocados por vários tipos de agentes endógenos e exógenos (OLIVEIRA-

BRETT et al., 2006).

O uso de técnicas eletroquímicas em conjunto com novos materiais

de eletrodo, como por exemplo, carbono vítreo, pasta de carbono ou

grafite pirolítico possibilitou o desenvolvimento de novos métodos

voltamétricos com maior sensibilidade, assim como o desenvolvimento

dos biossensores de DNA. Esses tipos de eletrodos modificados permitem

o estudo do mecanismo de interação do DNA com metais, fármacos e

poluentes, e consequentemente, uma vasta gama de aplicações analíticas

e biotecnológicas podem ser desenvolvidas.

2.3.2.1 Biossensores eletroquímicos de DNA

O DNA é uma molécula extremamente estável e com uma

adaptabilidade elevada, sendo uma molécula de reconhecimento biológico

para a construção de dispositivos em nanotecnologia, tais como os

biossensores de DNA (SEEMAN, 1998; FOJTA, 2002).

O biossensor eletroquímico de DNA é um bom modelo para avaliar

os danos causados no ácido nucléico, bem como verificar o seu

mecanismo de ação. Assim, a detecção eletroquímica é um método

sensível e seletivo para a investigação de interações específicas entre DNA

e variados tipos de compostos.

Quando as moléculas de DNA nativo ou sintético interagem com a

superfície de um eletrodo ocorre um processo de adsorção (BRETT, et al.,

2007; PALECEK, 2002). O estudo da adsorção do DNA na superfície dos

eletrodos é de interesse fundamental, uma vez que a interação do DNA

com superfícies carregadas ocorre em sistemas biológicos.


27

Lopes, I. C.

O biossensor eletroquímico de DNA consiste em um transdutor

eletroquímico (o eletrodo) com um filme de ácido nucléico, como elemento

de reconhecimento biológico, imobilizado na sua superfície (a sonda)

(BRETT e CHIORCEA, 2003a), que permite detectar simultaneamente os

danos no DNA e os agentes causadores desses danos. A interação do DNA

com o agente prejudicial é convertida, através de mudanças nas

propriedades eletroquímicas do filme de DNA, em sinais elétricos

mensuráveis (OLIVEIRA-BRETT et al., 2006).

Geralmente, existem dois modos de ligação bem caracterizados para

pequenas moléculas com dsDNA: ligação covalente (modificação química

de vários componentes do DNA) e não-covalente (ligação eletrostática

externa ou intercalação) (LABUDA et al., 2010).

A interação do composto com DNA pode ser irreversível, por causa

de intercalação no DNA (BRETT et al., 1997), causando desestabilização

subsequente, quebra das ligações de hidrogênio e abertura da dupla

hélice. Isto levará à exposição das bases purínicas do DNA, guanina e

adenina. A quantificação desse processo permite a avaliação de danos no

DNA (BRETT, BRETT e SERRANO, 1994).

O primeiro e o mais importante passo na preparação de

biossensores de DNA consiste na imobilização e estabilização de moléculas

de DNA na superfície do eletrodo. As diferentes estruturas e conformações

que as moléculas de DNA podem assumir na superfície do eletrodo levam

à diferentes tipos de interação e à modificação da acessibilidade dos

compostos químicos aos sulcos do DNA (OLIVEIRA-BRETT et al., 2006).

As características do filme de DNA, a resposta eletroquímica ótima

do biossensor de DNA, assim como uma investigação satisfatória da sua

interação com várias moléculas dependem do pH, composição do tampão,

força iônica, procedimento de imobilização, tempo de adsorção, condições

de pré-tratamento e concentração do DNA (BRETT e CHIORCEA, 2003b).


28

Lopes, I. C.

Estudos realizados por microscopia de força atômica mostraram

claramente as características morfológicas da superfície dos biossensores

eletroquímicos de DNA, cujo substrato ulilizado foi o HOPG (do inglês High

Oriented Pyrolytic Graphite) (BRETT e CHIORCEA, 2003a; BRETT et al.,

2005; BRETT e CHIORCEA, 2003b; CHIORCEA e BRETT, 2004). Assim, na

superfície do eletrodo de HOPG foi possível verificar as alterações

topográficas após a modificação da sua superfície com filmes de DNA de

várias espessuras, Figura 2.5, evidenciando que a metodologia de

imobilização conduz à diferenças estruturais no filme molecular, e

consequentemente, às diferenças na resposta do sensor.

A

B

Figura 2.5. Imagens topográficas de dsDNA sobre HOPG obtidas por AFM. A) Filme fino de dsDNA obtido aplicando um E = + 0,30 mV (vs. fio de Ag) durante

3 min, numa solução de dsDNA 60 µg mL-1 e B) Filme espesso de dsDNA preparado por evaporação a partir de uma solução de 37,5 µg mL-1 (Adaptado de (A) BRETT e CHIORCEA, 2003a e (B) CHIORCEA e BRETT, 2004.

O filme fino de DNA adsorvido na superfície do HOPG encontra-se

numa estrutura de rede, com poros que deixam à vista partes da

superfície do eletrodo, enquanto que um filme espesso de DNA cobre

completamente o eletrodo com uma multicamada uniforme e apresenta

uma estrutura mais rugosa, Figura 2.5. A rede formada no eletrodo pela

adsorção do filme fino de DNA separa diferentes áreas reativas da


29

Lopes, I. C.

superfície, que podem assim atuar como um sistema de micro e

nanoeletrodos, no entanto, permitindo a difusão de moléculas a partir da

solução e a adsorção não-específica das mesmas na superfície do

eletrodo.

Para o estudo da interação de vários compostos com DNA é preciso

evitar a adsorção não-específica, que conduz à dificuldade em discriminar

o sinal eletroquímico proveniente do DNA modificado pela interação e o

sinal da molécula adsorvida diretamente na superfície do eletrodo (BRETT

et al., 2002). Uma cobertura completa da superfície do eletrodo, como no

caso do filme de multicamada de DNA, garante que a contribuição no sinal

eletroquímico é devido apenas ao DNA modificado pela interação com a

molécula de interesse.

Na construção de biossensores eletroquímicos com DNA geralmente

são utilizados diferentes tipos de eletrodos de carbono, por exemplo,

carbono vítreo ou pasta de carbono. Verificou-se nesses eletrodos que a

interação, adsorção e o grau de cobertura da superfície por DNA são

semelhantes ao HOPG. Como o DNA é um poli-ânion, a adsorção na

superfície de um eletrodo é condicionada pela carga deste, ou seja, pelo

potencial aplicado, Figura 2.6.

Figura 2.6. Orientação de uma dupla hélice de DNA na superfície de um eletrodo conforme o potencial aplicado (Adaptado de KELLEY et al., 1998).


30

Lopes, I. C.

Verificou-se experimentalmente que o DNA adsorve reversivelmente

na superfície de um eletrodo carregado positivamente e pode sofrer

transições conformacionais consoante o potencial aplicado (BRETT,

SERRANO e PIEDADE, 1999; BRETT, BRETT e SERRANO, 1994; KELLEY et

al., 1998).

Em um eletrodo de carbono vítreo sendo operado num intervalo de

potencial positivo, o DNA está adsorvido de forma que o eixo maior da

hélice encontra-se orientado numa posição paralela à superfície do

eletrodo, Figura 2.6. Os pares de bases estão orientados

perpendicularmente à superfície de eletrodo, assim a espessura de uma

monocamada de DNA em hélice dupla é de cerca de 2 nm (HUMPHREYS e

PARSONS, 1977; IKEDA, SHIROTA e SAKURAI, 1990). A possibilidade de

controlar a cobertura da superfície do eletrodo e de selecionar a

orientação do DNA, através de pequenas variações no potencial aplicado,

abre novas perspectivas para o desenvolvimento e aplicações de

biossensores eletroquímicos com DNA.

Os biossensores eletroquímicos de DNA têm a vantagem de

representar uma alternativa rápida, sensível, simples e de baixo custo na

investigação de interações de moléculas com DNA. A vantagem mais

importante de se utilizar biossensores eletroquímicos de DNA é a

possibilidade da geração in situ de radicais intermediários reativos e a

detecção da interação dos mesmos com o DNA. Esses biossensores têm

contribuído de forma promissora para a compreensão da interação do DNA

com inúmeras moléculas, principalmente carcinogências, ou íons, bem

como a investigação do mecanismo de ação dos danos oxidativos ao DNA.

Particularmente, os biossensores eletroquímicos de DNA são

utilizados nos estudos de interação cinética entre compostos

biologicamente ativos e o DNA, através de técnicas tais como VC, VPD,

VOQ, entre outras (OLIVEIRA-BRETT e SERRANO, 1995; OLIVEIRA-BRETT

et al., 1998; LA-SCALEA, SERRANO e GUTZ, 1999).


31

Lopes, I. C.

Entre os estudos mais recentes, citam-se a investigação da

interação do complexo paládio-ácido lipóico com o dsDNA e os seus danos

oxidativos sobre eletrodo de carbono vítreo, utilizando VPD

(CORDUNEANU et al., 2009). Ao investigar a interação do dsDNA

imobilizado na superfície do eletrodo de carbono vítreo com a talidomida,

Oliveira et al. (2009) observaram uma condensação da estrutura do

dsDNA e o surgimento do pico da 8-oxoGua e/ou 2,8 DHA nos

voltamogramas de pulso diferencial obtidos, indicativo de danos ao

dsDNA. Corduneanu et al. (2010) investigaram a interação de quelatos de

paládio com poliaminas biogênicas espermina e espermidina com dsDNA,

sobre eletrodos de carbono vítreo, e revelaram que a estrutura da dupla

hélice tornou-se condensada após interagir com os compostos em estudo,

utilizando VPD.

2.4 Técnicas voltamétricas

As técnicas voltamétricas encontram larga aplicação em estudos nas

mais diversas áreas do conhecimento como medicina, bioquímica, biologia

molecular, química ambiental, físico-química e química analítica,

objetivando tanto a obtenção de informações fundamentais sobre

propriedades intrínsecas das substâncias orgânicas e inorgânicas, quanto

o desenvolvimento de métodos eletroanalíticos (SOUZA, MACHADO e

AVACA, 2003).

A voltametria compreende um grupo de técnicas eletroquímicas, nas

quais as informações sobre o analito se baseiam na medição da corrente

resultante de uma oxidação ou redução na superfície de um eletrodo

indicador ou de trabalho, durante a aplicação de uma diferença de

potencial na célula eletroquímica (SOUZA, MACHADO e AVACA, 2003;

SKOOG, HOLLER e NIEMAN, 2002; BRETT e BRETT, 1996).

Desde sua invenção em 1922 por Jaroslav Heyrovsky, a

polarografia, que é um tipo particular de voltametria, chegou a ser a


32

Lopes, I. C.

primeira técnica eletroquímica a ser utilizada em análise química e, nos

anos trinta e início dos anos quarenta a única técnica automática (SOUZA,

MACHADO e AVACA, 2003; SKOOG, HOLLER e NIEMAN, 2002; BARD e

FAULKNER, 2001.; BRETT e BRETT, 1996).

Dentre as técnicas voltamétricas mais aplicadas em estudos

eletroquímicos e desenvolvimento de métodos eletroanalíticos, destacam-

se a VC, VPD e VOQ.

2.4.1 Voltametria cíclica

A VC é uma técnica muito usada para estudos eletroquímicos

iniciais, cuja principal utilização tem sido para diagnosticar mecanismos de

reação, para a identificação de espécies presentes em solução e para a

análise semiquantitativa de velocidades de reações (BRETT e BRETT,

1996; BARD e FAULKNER, 2001).

Nesta técnica, o potencial aplicado ao eletrodo varia de forma linear

a uma velocidade de varredura constante, v = |dE/dt|, entre um potencial

inicial (Ei) e um potencial final (Ef), previamente escolhidos, Figura 2.7A.

A

B

Figura 2.7. VC. (A) Esquema de aplicação de potencial. (B) Resposta típica para um sistema reversível. (Adaptado de BRETT e BRETT, 1996).

Após o início da varredura de potencial e ao atingir t = t1, a direção

da varredura é invertida e variada até Emin, e depois invertida e variada


33

Lopes, I. C.

para Emax, Figura 2.7A, e assim sucessivamente, de uma forma cíclica. O

sentido da varredura pode ser positivo ou negativo (BRETT e BRETT,

1996). Obtém-se, como resposta a essa perturbação, por exemplo, um

par de picos (catódicos e anódicos), cujos parâmetros eletroquímicos mais

importantes são os potenciais de pico catódico e anódico (Epc e Epa), as

correntes de pico catódico e anódico (Ipc e Ipa) e o potencial de meia altura

(Ep/2) ou potencial de meia onda (E1/2), essenciais para caracterizar o

processo eletródico ocorrido (BRETT e BRETT, 1996; BARD e FAULKNER,

2001; SKOOG, HOLLER e NIEMAN, 2002). A Figura 2.7B ilustra a resposta

típica para a VC de um sistema reversível (quando há picos direto e

reverso). Para um sistema irreversível nenhum pico reverso aparece ao

inverter a direção da varredura.

A dependência do potencial e da corrente de pico com a variação da

velocidade de varredura, observada a partir de análise baseada em testes

diagnóstico, permite obter informações importantes como reversibilidade

e irreversibilidade do processo de transferência de elétrons, presença de

reações químicas acopladas, adsorção e fenômenos catalíticos, além de

poder caracterizar o fenômeno que controla a corrente de pico (GREEF et

al., 1985). Os testes diagnósticos para caracterização de cada tipo de

processo redox estão descritos na Tabela 2.1.

Tabela 2.1. Testes diagnósticos em VC para processos reversíveis, irreversíveis e quase-

reversíveis (Adaptado de BRETT e BRETT, 1996 e BARD e FAULKNER, 2001).

Reversíveis Irreversíveis Quase-reversíveis

Ip v1/2 Ipc v1/2 Ipc aumenta com v

|Ipa/Ipc| = 1 Ausência de pico reverso |Ipa/Ipc| = 1 se

= 0,5

ΔEp = |Epa – Epc| = 57/n

(mV)

|dEp/d lg v| = 29,6/(n’)(mV) Ep = 58/n (mV) e

aumenta com v

|Ep – Ep/2| = 56,6/n (mV) |Ep – Ep/2| = 47,7/(n’) (mV) -

Ep independente de v Epc dependente de v Epc desloca negativamente

com o aumento de v


34

Lopes, I. C.

2.4.2 Voltametria de pulso diferencial

A possibilidade de interfaciamento com equipamentos eletroquímicos

para o controle digital da perturbação imposta ao eletrodo de trabalho,

assim como da medida do sinal resultante, possibilitou o desenvolvimento

das técnicas voltamétricas, em especial das técnicas de pulso que, na

década de 50, começaram a substituir as técnicas polarográficas até então

utilizadas (SOUZA, MACHADO e AVACA, 2003). As técnicas de pulso são

amplamente adotadas em química analítica para a determinação de

espécies eletroativas devido às altas sensibilidades obtidas,

particularmente na presença de correntes com ruídos de fundo, tal como

aquelas que podem resultar da redução do oxigênio dissolvido. Nestas

técnicas, a corrente capacitiva é proporcional a e-t/RC, onde t é o tempo, R

a resistência da solução e C a capacitância da dupla camada elétrica, e a

corrente faradáica é aproximadamente proporcional a t-1/2, o decaimento

da primeira, após a aplicação do pulso de potencial, é muito mais rápido

que o da última (SOUZA, MACHADO e AVACA, 2003). Assim, as medidas

de corrente somente são realizadas após a contribuição da corrente

capacitiva ter sido minimizada, conforme, Figura 2.8.

Figura 2.8. Variação da corrente faradáica e corrente capacitiva com o tempo,

em técnicas de pulso (Fonte: SOUZA, MACHADO e AVACA, 2003).


35

Lopes, I. C.

A Figura 2.9A apresenta o tipo de onda de potencial aplicado ao

eletrodo de trabalho em VPD e a Figura 2.9B, um voltamograma típico de

pulso diferencial.

Figura 2. 9. VPD. (A) Esquema de aplicação de potenciais e (B) Resposta típica

(Adaptado de BRETT e BRETT, 1996).

Em VPD aplicam-se pulsos de potencial sucessivos com uma

amplitude Ep (amplitude de pulso) em intervalos periódicos de tempo t,

sobre uma rampa ou escada de potencial com incremento de Es. As

medições de corrente são efetuadas em um certo tempo antes (I1) e

depois (I2) da aplicação de pulso, Figura 2.9A. A diferença entre estas

correntes é o valor de corrente registrado num voltamograma de pulso

diferencial, Figura 2.9B.

O tempo durante o qual o pulso de potencial é aplicado define a

largura do pulso. O tempo ’ é o intervalo entre duas aplicações

sucessivas de pulso, e determina conjuntamente com o valor de Es a

velocidade de varredura = Es. Em VPD a v varia normalmente entre 1

e 10 mV s-1.

A amplitude escolhida para o pulso de potencial Ep, deve levar em

consideração a reação em estudo e a sensibilidade exigida, uma vez que,

grandes amplitudes geram correntes capacitivas residuais que podem

diminuir a possibilidade de detectar a corrente faradáica. Para pequenas

A

2

'

1

t

E

Ep

Es

+

W1/2

B

I = I2 - I

1

E

I


36

Lopes, I. C.

amplitudes de pulso, a largura a meia altura W1/2 do pico de corrente é

inversamente proporcional ao número de elétrons transferidos (90/n), o

que permite caracterizar o mecanismo da reação de transferência de

carga. A intensidade corrente de pico (Ip) é proporcional à concentração

do analito, mas também depende da velocidade da reação eletroquímica

(BRETT e BRETT, 1996).

2.4.3 Voltametria de onda quadrada

A VOQ foi inventada em 1952 por Barker, mas foi pouco usada

nesse tempo devido a dificuldades com a eletrônica de controle. Com os

progressos na instrumentação, tornou-se uma técnica analítica importante

(BRETT e BRETT, 1996).

Na VOQ, o potencial aplicado é constituído por uma onda quadrada

de amplitude constante (ΔEp) sobreposta a uma escada de potencial com

degraus de amplitude (ΔEs) num período . Esse esquema de aplicação de

potencial é representado na Figura 2.10A. Durante cada ciclo de

frequência f = -1, um pulso de potencial positivo é aplicado ao eletrodo

durante a metade do ciclo a que se segue, na metade restante é aplicado

um pulso de potencial negativo.

Figura 2. 10. VOQ. (A) Esquema de aplicação de potenciais; B) Resposta típica para um sistema reversível e C) para um sistema irreversível (Adaptado de

BRETT e BRETT, 1996; SOUZA, MACHADO e AVACA, 2003).


37

Lopes, I. C.

A corrente é medida antes do fim de ambos os pulsos, positivo e

negativo, em cada ciclo (1 e 2), Figura 2.10A. Nesta técnica o regime de

amostragem permite obter como resposta três tipos de curvas: a corrente

I1 registrada no final do pulso de potencial direto – corrente direta (If – do

inglês forward current), a corrente I2 registrada no final do pulso reverso

– corrente reversa (Ib – do inglês backward current) e a corrente total ou

resultante (ΔI ou It) que corresponde à diferença entre essas duas. A

corrente I2 possui sinal contrário a I1. Assim, para sistemas reversíveis, ΔI

= I1 – I2 é maior do que I1 (O’DEA, OSTERYOUNG e OSTERYOUNG, 1981;

OSTERYOUNG e OSTERYOUNG, 1985; O’DEA, RIBES e OSTERYOUNG,

1993). Esse sinal de forma diferencial obtido apresenta excelente

sensibilidade e alta rejeição a correntes capacitivas (SOUZA, MACHADO e

AVACA, 2003). As Figuras 2.10B e C representam os voltamogramas de

onda quadrada para sistemas reversíveis e irreversíveis, com a separação

das correntes direta, reversa e resultante.

Enquanto na VPD a v varia entre 1 e 10 mV s-1 na VOQ a mesma

pode alcançar até 1 V s-1. Este fato confere vantagens à VOQ como

técnica analítica em termos de rapidez de análise, menor consumo de

espécies eletroativas e diminuição de problemas associados ao bloqueio

da superfície do eletrodo. Outra vantagem é o fato de os resultados

experimentais obtidos por esta técnica apresentarem uma sensibilidade

maior, já que velocidades de varredura mais rápidas podem ser utilizadas.

E além disso, como a amostragem da corrente é feita em ambos os

pulsos, os picos correspondendo à oxidação ou à redução das espécies

eletroativas na superfície do eletrodo podem ser obtidos num mesmo

experimento (BRETT e BRETT, 1996).

CAPÍTULO 3

MATERIAIS E MÉTODOS

Metodologia Experimental

39

Lopes, I. C.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Reagentes e soluções

A MC-LR (pureza ≥ 95%) foi obtida da Alexis Biochemicals

(Lausen/Suíça). O ácido sórbico (SA, pureza ≥ 99%), ácido 2-

acetamidoacrílico (2-AAA, pureza ≥ 99%), dsDNA (Deoxyribonucleic acid,

sodium salt from calf thymus), acetonitrila (grau HPLC), ácido fórmico e

os aminoácidos L-Leucina (Leu), L-Arginina monohidroclorada (Arg), D-

Alanina (Ala), Ácido L-glutâmico (Glu) e Ácido L-aspártico (Asp) foram

adquiridos da Sigma. Todos os compostos foram utilizados sem qualquer

purificação adicional.

Para os experimentos eletroquímicos foram preparadas soluções

estoque de: MC-LR (100 µmol L-1), cada aminoácido (10 mmol L-1), SA

(100 µmol L-1) para VPD, SA (100 µmol L-1 e 1 mmol L-1) para VPD e SA

(5 mmol L-1) para VC. Para o 2-AAA, soluções estoque de 1 mmol L-1 e 1,5

mmol L-1 foram preparadas para os experimentos de VPD e VC,

respectivamente. Todas as soluções padrão foram preparadas com água

purificada obtida pelo sistema Millipore Milli-Q System, Millipore S.A.,

Molsheim, França (condutividade ≤ 0,1 µS cm-1) e mantidas a 4 ºC, exceto

as soluções padrão dos aminoácidos, até posterior utilização.

Após a realização das análises das soluções de MC-LR, SA e 2-AAA

durante o dia, as soluções foram transferidas da célula eletroquímica para

tubos de microcentrífuga de 0,65 mL (Costar®) e mantidas a 4ºC durante

a noite, até a realização dos próximos experimentos.

A solução padrão de dsDNA foi preparada pela dissolução de ≈ 1,3

mg do mesmo em 5 mL de água purificada em um microtubo de 1,5 mL

(Eppendorf®). A solução foi mantida a 4 ºC por 24 h para garantir a

homogeneização e para evitar a sua degradação. Em seguida, foi

determinada a concentração real dessa solução por espectrofotometria

UV-Vis, através da multiplicação da absorbância encontrada


40

Lopes, I. C.

experimentalmente pelo fator de conversão (1u A260nm = 50 μg mL-1 de

dsDNA) (FASMAN, 1975). As concentrações específicas utilizadas durante

as medidas voltamétricas estão referidas no texto.

As soluções tampão de eletrólitos suporte de diferentes pH’s foram

preparadas com água purificada e reagentes de grau analítico, conforme a

Tabela 3.1. As medidas de pH foram efetuadas utilizando um pH-metro

Crison micropH 2001, Crison Instruments S.A. (Barcelona/Espanha) com

um eletrodo de vidro combinado, Ingold.

Tabela 3.1. Tampões para eletrólitos suporte com diluição para 100 mL de água

(Adaptado de OLIVEIRA et al., 2007).

pH Composição (mL) Força

iônica

1,3 HCl 0,2 µmol L-1 (42,5) + KCl 0,2 µmol L-1 (25,0) 0,135

2,0 HCl 0,2 µmol L-1 (6,5) + KCl 0,2 µmol L-1 (25,0) 0,063

3,4 HAcO 0,2 µmol L-1 (46,3) + NaAcO 0,2 µmol L-1 (3,7) 0,100


4,5 HAcO 1 µmol L-1 (12,5) + NaAcO 1 µmol L-1 (7,2) 0,100


6,1 NaH2PO4 0,2 µmol L-1 (43,85) + Na2HPO4 0,2 µmol L-1 (6,15) 0,125



9,2 Na2B4O7 . 10 H2O 0,025 µmol L-1 (50,0) + NaOH 0,1 µmol L-1 (3,0) 0,040

10,3 Na2B4O7 . 10 H2O 0,025 µmol L-1 (50,0) + NaOH 0,1 µmol L-1 (22,7) 0,060

11,9 KCl 0,2 µmol L-1 (25,0) + NaOH 0,2 µmol L-1 (6,0) 0,062

Todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente

(25 ± 1 ºC).

As soluções saturadas com gás nitrogênio (N2) de elevada pureza

(Air Liquide, França) foram desoxigenadas pela passagem de um fluxo

constante desse gás durante 10 minutos, antes do início do ensaio

voltamétrico. Durante as varreduras, um fluxo constante de N2 foi


41

Lopes, I. C.

mantido sobre a superfície das soluções para evitar a presença de

oxigênio.

3.2 Instrumentação

As medidas voltamétricas foram realizadas utilizando-se um

potenciostato/galvanostato µAutolab Tipo II da Metrohm/Autolab, Utrecht,

Holanda, funcionando no modo potenciostático, Figura 3.1.

O controle dos parâmetros voltamétricos, a aquisição e o tratamento

dos dados obtidos, foram efetuados por intermédio do software GPES

(General Purpose Electrochemical System) versão 4.9, da Echo-Chemie,

Utrecht, Holanda.

Os ensaios voltamétricos foram realizados em uma célula

eletroquímica de compartimento único com capacidade volumétrica de 2

mL (Cypress System, Inc., USA). Um eletrodo de carbono vítreo (ECV, Ф=

1,5 mm) foi utilizado como eletrodo de trabalho, um eletrodo de Ag/AgCl

(Фeixo= 2,0 mm) como referência e um fio de platina (Ф = 0,5 mm) como

eletrodo auxiliar, todos da Cypress System, Inc., USA, Figura 3.1.

Figura 3.1. Sistema eletroquímico de trabalho: (A) Potenciostato/Galvanostato e

(B) célula eletroquímica e eletrodos (Adaptado de DICULESCU, 2004).


42

Lopes, I. C.

As medidas espectrofotométricas foram efetuadas utilizando um

espectrofotômetro UV-VIS SPECORD S100 da Analytik Jena GmbH, Jena,

Alemanha, interfaciado ao software Aspect Plus Version 1.5 (Analytik Jena

GmbH, Jena, Alemanha). As condições experimentais para a obtenção dos

espectros de absorção foram: tempo de integração de 41 ms e

acumulação de 10 pontos. Todos os espectros foram registrados numa

faixa compreendida entre 200 e 500 nm em uma cubeta de quartzo com 1

mm de caminho óptico.

Os experimentos cromatográficos por CLAE (Cromatografia Líquida

de Alta Eficiência) foram realizados empregando um cromatográfo

(Separations Module HPLC da Waters 2690 AllianceTM) acoplado a um

detector de arranjo de fotodiodos - Photodiode Array Detection (PDA 996)

- da Waters 996, Waters S.A. USA. Foi utilizada uma coluna C18 de fase

reversa Inertsil ODS-3V da Inertsil. A fase móvel utilizada foi

acetonitrila/água (35:65, v/v), com ácido fórmico 0,05% (v/v), pH ≈ 2,8,

método isocrático. Uma solução de MC-LR 6,3 x 10-7 mol L-1 foi preparada

em tampão acetato pH 3,4, uma vez que a MC-LR também degrada-se

facilmente nesse meio, e alíquotas dessa solução foram injetadas na fase

móvel. A absorbância UV-Vis foi monitorada em 239 nm e o volume da

amostra injetada foi de 50 µL.

3.3 Parâmetros experimentais das medidas voltamétricas

Os parâmetros experimentais para as medidas eletroquímicas

foram: incremento de potencial (∆Es) de 2 mV e velocidade de varredura

(v) de 100 mV s-1 para VC; amplitude de pulso (∆Ep) de 50 mV, largura de

pulso (∆Et) de 70 ms e velocidade de varredura (v) de 5 mV s-1 para VPD;

e frequência de pulso (f) de 50 Hz, incremento de potencial (∆Es) de 2 mV

e amplitude de pulso (∆Ep) de 50 mV para VOQ.


43

Lopes, I. C.

3.4 Tratamento dos dados voltamétricos

Os voltamogramas de pulso diferencial apresentados foram

suavizados através da função Savitsky-Golay smooth (level: 4), a fim de

eliminar o ruído de fundo sobreposto ao sinal voltamétrico, e em seguida,

corrigidos a linha de base através da função moving average com um step

window de 2 mV, ambas disponíveis no software GPES versão 4.9. Esse

tratamento matemático realizado nos voltamogramas melhorou a

visualização e identificação dos picos em relação à linha de base sem a

introdução de qualquer artefato, embora a corrente de pico em alguns

casos seja reduzida ( 10%) em relação a da curva voltamétrica não

tratada. Os valores das correntes de pico foram obtidos a partir dos

voltamogramas originais, utilizando-se somente a correção da linha de

base.

3.5 Preparação da superfície do ECV

Antes de cada medida voltamétrica a superfície do ECV foi limpa

mecanicamente e, em seguida, eletroquimicamente. Na limpeza mecânica,

a superfície do eletrodo foi polida com spray de grão de diamante

(tamanho da partícula = 1 µm) da Kemet International Ltd, UK, e em

seguida, lavada rigorosamente com água purificada. Para a limpeza

eletroquímica, o eletrodo foi colocado numa solução de H2SO4 0,2 mol L-1

e, em seguida, foram efetuadas 10 varreduras sucessivas por VC numa

faixa de potencial entre – 1,0 V e + 1,3 V e v = 500 mV s-1.

O condicionamento eletroquímico da superfície do eletrodo foi

efetuado, após a limpeza mecânica/eletroquímica, através do registro de

vários voltamogramas no eletrólito suporte e na técnica a serem

utilizados, a fim de obter uma linha de base estável.


44

Lopes, I. C.

3.6 Testes de adsorção dos compostos

Para verificar efeitos de adsorção da MC-LR, SA ou 2-AAA na

superfície eletródica, foram realizados dois testes para cada um desses

compostos, conforme os procedimentos descritos a seguir:

1 - Após efetuar várias medidas na solução de cada composto para

todos os pH’s, sem limpeza da superfície do ECV, o eletrodo foi

lavado com um jato de água deionizada, em seguida, transferido

para uma nova solução eletrolítica e registrados os voltamogramas.

2 - Após a imersão do ECV na solução de cada composto para todos os

pH’s por 10 minutos, o eletrodo foi lavado com um jato de água

deionizada, em seguida, transferido para uma nova solução

eletrolítica e registrados os voltamogramas.

Para investigar a adsorção dos produtos de oxidação formados na

superfície do eletrodo, somente o procedimento 1 foi realizado.

3.7 Detecção dos centros eletroativos da microcistina-LR

Com o intuito de detectar os centros eletroativos da MC-LR sobre o

ECV, a oxidação eletroquímica dos cinco aminoácidos comuns

constituintes dessa toxina, Leu, Arg, Ala, Glu e Asp, foi inicialmente

investigada.

Uma vez que os aminoácidos incomuns Mdha e Adda, presentes na

MC-LR, não são oferecidos comercialmente, dois outros compostos foram

também testados eletroquimicamente. Tratam-se do 2-AAA e SA, Figura

3.2, os quais possuem similaridade estrutural aos grupos funcionais alvo.

O 2-AAA e o SA simulam estruturalmente o aminoácido raro Mdha e a

cadeia lateral Adda do anel peptídeo, respectivamente (GRETCHEN,

2007).


45

Lopes, I. C.

A

B

Figura 3.2. Estrutura química: (A) ácido 2-acetamidoacrílico e (B) ácido sórbico.

O procedimento de investigação voltamétrica de cada composto

estudado é descrito a seguir.

3.7.1 Teste dos aminoácidos Leu, Arg, Ala, Glu e Asp

O comportamento eletroquímico dos aminoácidos Leu, Arg, Ala, Glu

e Asp foi investigado em uma faixa de potencial entre 0,00 V à + 1,45 V.

Os testes foram efetuados em uma solução de cada aminoácido nas

concentrações de 30 e 60 µmol L-1 em soluções tampão pH 5,3 e 7,0,

utilizando DPV. Os voltamogramas foram registrados logo após a adição

da solução de cada aminoácido nos tampões e após 5, 24 e 29 horas de

incubação.

3.7.2 Teste dos compostos 2-AAA e SA

O comportamento eletroquímico dos compostos 2-AAA e SA foi

estudado em uma ampla faixa de potencial entre 0,00 V e + 1,5 V,

utilizando VC e VPD para o primeiro composto e VC, VPD e VOQ para o

segundo.

Os voltamogramas do 2-AAA e SA foram registrados logo após a

adição da solução de cada um desses aminoácidos nos tampões e após 24

OH

O

CH2

HN

O

H3CH3C OH

O


46

Lopes, I. C.

e 48 horas de incubação para o 2-AAA e após 5, 24, 48, 96 horas, 7 e 14

dias de incubação para o SA.

3.8 Construção da curva analítica

Para obtenção da curva analítica para a MC-LR, uma solução

estoque de 200 µmol L-1 foi preparada. A partir dessa solução, uma

alíquota foi adicionada a oito células eletroquímicas distintas contendo

eletrólito suporte pH 1,3, num volume total de 100 µL. Esse procedimento

foi empregado devido à rápida degradação da MC-LR nesse pH. A faixa de

concentração investigada foi de 2,5 a 35 µmol L-1.

As medidas foram realizadas por VPD e, entre cada adição, a

superfície do ECV foi sempre polida a fim de garantir uma superfície limpa

e evitar a adsorção dos produtos de oxidação da MC-LR.

3.8.1 Limites de detecção e quantificação

Através dos dados obtidos das medidas do branco e da curva

analítica Ip vs [MC-LR] estimaram-se as figuras de mérito, limites de

detecção (LD) e quantificação (LQ), a fim de verificar a possibilidade do

desenvolvimento de uma metodologia para a determinação da MC-LR em

águas naturais.

O LD é a menor concentração do analito a ser detectada e é

responsável por um sinal que é igual a três vezes o nível de ruído da linha

de base, não sendo necessariamente quantificado. Já o LQ consiste na

menor concentração do analito, que pode ser quantificada na amostra,

com precisão e exatidão aceitáveis, sob as condições em que foram

estabelecidos os ensaios, onde se considera que o limite do equipamento

ainda não tenha sido atingido. Assim, a sensibilidade do método será

avaliada pelo cálculo do LD e LQ, conforme as Equações (3.1) e (3.2),

respectivamente (MOCAK et al., 1997).


47

Lopes, I. C.

b

SLD b3

(3.1)

b

SLQ b10

(3.2)

onde Sb é o desvio-padrão das medidas do branco em eletrólito puro e ―b”

a inclinação da curva analítica, ou seja, o coeficiente angular em um nível

de significância de 95% de confiança.

Em uma curva analítica, o intervalo linear compreende uma faixa de

concentração que se estende desde a menor concentração, a qual se pode

realizar uma medida quantitativa (LQ), até a concentração na curva

analítica que se desvia da linearidade (Limite de Linearidade - LL),

(SKOOG, HOLLER e NIEMAN, 2002), conforme se observa na Figura 3.3.

Figura 3.3. Intervalo linear de um método analítico (Adaptado de SKOOG, 2002)


48

Lopes, I. C.

3.9 Condições experimentais para a investigação voltamétrica in situ da interação da microcistina-LR com dsDNA

A interação da MC-LR com o dsDNA foi inicialmente investigada por

VPD, conforme os parâmetros experimentais mostrados na Seção 3.3 e os

procedimentos apresentados a seguir.

3.9.1 Preparação do biossensor eletroquímico de dsDNA e

procedimento de incubação

Para o estudo voltamétrico inicial da interação da MC-LR com o

dsDNA, o eletrodo de carbono vítreo foi modificado pela imobilização de

dsDNA na sua superfície, levando à construção de um biossensor

eletroquímico de dsDNA.

A imobilização do filme multicamada de dsDNA na superfície do ECV,

previamente limpa e condicionada em eletrólito suporte (Seção 3.5), foi

obtida pela deposição de 5 µL de uma solução de dsDNA 50 μg mL-1

(previamente preparada em água, Seção 3.1) diluída em tampão acetato

pH 4,5. Após a secagem dessa primeira camada de dsDNA, o mesmo

procedimento foi repetido duas vezes, Figura 3.4A. Esse filme

multicamada de dsDNA preparado garante que o sinal eletroquímico

obtido seja devido apenas ao dsDNA modificado na superfície e não pela

adsorção não-específica do composto, uma vez que a superfície do

eletrodo encontra-se completamente coberta com o filme de dsDNA

(OLIVEIRA-BRETT e DICULESCU, 2004b).

Após a modificação, o eletrodo foi lavado com um jato de água

deionizada para remover as fitas de dsDNA não adsorvidas (OLIVEIRA-

BRETT e DICULESCU, 2004b). Em seguida, o biossensor foi incubado na

solução de MC-LR, Figura 3.4B. Após a incubação, o eletrodo foi lavado

com água deionizada para remover as moléculas não adsorvidas e


49

Lopes, I. C.

transferido para o tampão acetato pH 4,5. Este procedimento foi utilizado

para avaliar as interações de curto tempo da MC-LR com o dsDNA.

Figura 3.4. (A) Preparação do biossensor eletroquímico de dsDNA. (B)

Incubação do biossensor de dsDNA na solução de MC-LR.

Em paralelo, foram realizados experimentos de controle com os

biossensores de dsDNA seguindo as mesmas etapas acima descritas e nos

mesmos tempos de incubação utilizados para o analito, porém na

ausência da MC-LR.

As concentrações das soluções de MC-LR utilizadas nas incubações

com os biossensores de dsDNA estão descritas ao longo deste trabalho,

assim como os tempos de incubação estudados.


50

Lopes, I. C.

3.9.2 Preparação das soluções de dsDNA incubadas

Para uma avaliação direta da interação da MC-LR com o dsDNA,

soluções de dsDNA 50 μg mL-1

(previamente preparada em água, Seção

3.1) foram diluídas em tampão acetato pH 4,5 e incubadas (OLIVEIRA-

BRETT e DICULESCU, 2004a) com a MC-LR, Figura 3.5. A sua interação foi

analisada pela detecção no ECV, previamente limpo e condicionado (Seção

3.5), diretamente na solução. Esse procedimento permite investigar as

interações de longos tempos de incubação.

Figura 3.5. Preparação das soluções de dsDNA incubadas com MC-LR.

Soluções de controle de dsDNA foram preparadas em tampão pH

4,5, armazenadas nas mesmas condições descritas acima, porém na

ausência de MC-LR, e analisadas nos mesmos períodos de tempo que as

soluções incubadas com essa toxina.

As concentrações das soluções de MC-LR utilizadas nas incubações

com soluções de dsDNA estão descritas ao longo deste trabalho, assim

como os tempos de incubação estudados.


51

Lopes, I. C.

3.10 Condições experimentais para a investigação espectrofotométrica in situ da interação da microcistina-LR com

dsDNA

A interação da MC-LR com o dsDNA foi também investigada por

espectrofotometria UV-Vis, conforme os parâmetros experimentais

mostrados na Seção 3.2 e o procedimento descrito a seguir.

Uma solução de dsDNA 50 μg mL-1

(previamente preparada em

água, Seção 3.1) foi diluída em tampão acetato pH 4,5 e incubada com a

MC-LR (25 µmol L-1). A sua interação foi analisada pelo monitoramento

dos espectros de absorção de dsDNA na ausência e presença de MC-LR.

CAPÍTULO 4

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Resultados e Discussão

53

Lopes, I. C.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Comportamento eletroquímico da microcistina-LR

O estudo eletroquímico da MC-LR foi realizado sobre ECV, em vários

eletrólitos suporte com diferentes valores de pH, utilizando as técnicas de

VC, VPD e VOQ. Inicialmente, o comportamento voltamétrico da MC-LR foi

investigado por VC em uma solução recém-preparada de MC-LR 60 µmol

L-1 em tampão fosfato pH 7,0, saturada com gás N2.

Os voltamogramas foram registrados durante a varredura de

potencial iniciada em + 0,00 V e entre um potencial positivo limite de +

1,40 V e um potencial negativo limite de – 1,00 V. Independentemente da

direção da varredura inicial somente um pequeno pico anódico foi

observado, Figura 4.1, indicando que a MC-LR sofre somente oxidação na

superfície do ECV. Por esta razão todos os experimentos foram realizados

na faixa de potencial característica da região anódica.

Figura 4.1. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos imediatamente após a

adição de uma solução de MC-LR 60 µmol L-1 em tampão fosfato pH 7,0, na ausência (—) e presença de MC-LR (—). ∆Es = 2 mV e v = 200 mV s-1.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

MC-LR

E / V (vs. Ag/AgCl)

1 A


54

Lopes, I. C.


Os voltamogramas cíclicos obtidos imediatamente após a adição da

solução de MC-LR 50 µmol L-1 em tampão acetato pH 3,4, mostraram o

pico de oxidação da MC-LR, pico 1a, em E1pa = + 1,21V, porém com a

corrente de pico ligeiramente maior que a do voltamograma obtido para o

pH 7,0 (Seção 4.1), Figura 4.2. Ao mudar o sentido da varredura nenhum

pico catódico foi observado, mostrando que a oxidação da MC-LR é um

processo irreversível, Figura 4.2. As varreduras sucessivas obtidas na

mesma solução, sem a limpeza da superfície do eletrodo, não mostraram

nenhum novo pico de oxidação, demonstrando que o processo de

oxidação da MC-LR não envolve a formação de nenhum produto de

oxidação eletroativo. Por outro lado, a diminuição da corrente do pico 1a

visualizada nas segunda e terceira varreduras ocorreu devido à adsorção

da MC-LR e/ou seus produtos de oxidação não-eletroativos na superfície

do eletrodo.

O mesmo comportamento eletroquímico da MC-LR foi observado nos

voltamogramas cíclicos registrados em vários valores de pH’s.

Figura 4.2. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos imediatamente após a adição de uma solução de MC-LR 50 µmol L-1 em tampão acetato pH 3,4: (—) 1ª,

(—) 2ª e () 3ª varreduras. ∆Es = 2 mV e v = 100 mV s-1.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

0.5 A

1a

E / V (vs. Ag/AgCl)


55

Lopes, I. C.

O efeito da velocidade de varredura sobre a corrente do pico 1a foi

estudado em uma solução recém-preparada de MC-LR 60 µmol L-1 em

tampão fosfato pH 7,0. Os voltamogramas foram registrados em

diferentes velocidades de varredura, entre 25 e 200 mV s-1. Para garantir

que a superfície do ECV permanecesse sempre limpa e evitasse possíveis

problemas de adsorção da MC-LR e/ou seus produtos de oxidação não-

eletroativos na sua superfície, o eletrodo foi sempre polido entre as

medidas.

Com o aumento da velocidade de varredura foi observado um

deslocamento do pico 1a para potenciais mais positivos, tanto como o

aumento da corrente capacitiva. O módulo da diferença entre o potencial

de pico e o potencial de meia altura de pico (|E1pa - E

1p/2a|) encontrado foi

igual a 43 mV. Uma vez que, para um sistema irreversível controlado por

difusão a equação é |E1pa - E1

p/2a| = 47,7 mV/(an’), onde a é o

coeficiente de transferência de carga anódica e n’ o número de elétrons

transferidos na etapa determinante da velocidade (BRETT e BRETT, 1996),

o valor de an’ = 1,11 foi determinado.

Ao aumentar a velocidade de varredura a corrente do pico 1a

aumentou linearmente com a raiz quadrada da velocidade, indicando uma

oxidação controlada por difusão das espécies em solução.

A corrente de pico em ampéres para um sistema irreversível

controlado por difusão é dada pela Equação (4.1):

2/12/12/15 ][)'(1099,2)( LRMCapa DLRMCAnnxAI

(4.1)

onde n’ é o número de elétrons transferidos durante a oxidação da

MC-LR (n’ = 1), determinado por VPD (Seção 4.1.2), A é a área do

eletrodo em cm2, DMC-LR é o coeficiente de difusão da MC-LR em cm2 s-1,

[MC-LR] é a concentração em mol cm-3 e v é em V s-1 (BRETT e BRETT,

1996). O valor da inclinação da relação linear Ipa vs. v1/2 encontrado foi


56

Lopes, I. C.

5,32 x 10-7 A/(V s-1), logo o valor do coeficiente de difusão da MC-LR em

tampão fosfato pH 7,0 foi determinado, DMC-LR = 7,62 x 10-6 cm2 s-1.

Para esse cálculo, a área eletroativa do ECV foi previamente

determinada pela equação de Randles e Sevick (BRETT e BRETT, 1996)

como sendo A = 1,02 x 10-2 cm2. Foi utilizada uma solução de K4[Fe(CN)6]

500 µmol L-1 em tampão fosfato pH 7,0, onde o coeficiente de difusão do

hexacianoferato de pótassio é 7,35 x 10-6 cm2 s-1 (HAYNES, 2011).


A influência do pH na oxidação eletroquímica da MC-LR foi estudada

em uma ampla faixa de pH, entre 1,3 e 11,9, utilizando VPD. Os

voltamogramas foram registrados em soluções recém-preparadas de MC-

LR 30 µmol L-1 em diferentes eletrólitos suporte.

Os voltamogramas foram obtidos imediatamente após a adição da

MC-LR em cada solução tampão. Para 1,3 pH 8,2, os resultados

obtidos na primeira varredura mostraram o aparecimento de somente um

pico anódico, pico 1a, em E1pa ≈ + 1,06 V, Figura 4.3A. Para pH 8,2, o

pico 1a não apareceu.

O potencial do pico 1a não variou com o pH, indicando que o

processo de oxidação da MC-LR é independente do pH, Figura 4.3B, e o

seu mecanismo envolve somente a transferência de elétrons e nenhum

próton (SMITH, 2006). O número de elétrons envolvidos na reação foi

determinado pelo valor da largura do pico a meia altura (W1/2) encontrado

para o pico 1a em todos os pH’s, obtendo-se um valor de W1/2 = 89,25

11,77 mV a 95% de confiança. O valor encontrado é próximo do valor

teórico, dado pela Equação (4.2), que corresponde a uma reação

eletroquímica envolvendo a transferência de um elétron (BRETT e BRETT,

1996). Consequentemente, o processo de oxidação da MC-LR ocorre com

a transferência de somente um elétron.


57

Lopes, I. C.

nFRTW /52,32/1

(4.2)

A variação da corrente do pico 1a com o pH mostrou um máximo de

corrente em pH 1,3, e com o aumento do pH houve um decréscimo

contínuo dessa intensidade de corrente, Figura 4.3B.

Figura 4.3. (A) Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida da 1ª varredura sobre ECV obtidos imediatamente após a adição de uma solução

de MC-LR 30 µmol L-1 no tampão em função do pH. (B) Relação dos Ep () e Ip () do pico 1a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.6

0.81.0

1.2

12

34

56

78

1a

A

pH

10 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)

0 2 4 6 8

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

B

pH

I p / n

A

E / V

(vs. A

g/A

gC

l)

0

20

40

60

80


58

Lopes, I. C.

Para todos os pH’s estudados, foram realizadas varreduras

voltamétricas sucessivas, sem efetuar a limpeza da superfície do eletrodo,

a fim de confirmar o comportamento do pico 1a observado na VC.

Nas segunda e terceira varreduras foi observado um decréscimo

progressivo da corrente do pico 1a e o seu potencial foi deslocado para

valores mais positivos, em todos os tampões. Esse efeito foi causado pela

diminuição da área eletroativa disponível na superfície do eletrodo, devido

à adsorção da MC-LR e/ou seus produtos de oxidação não-eletroativos. No

entanto, nenhum novo pico foi obtido nos segundo e terceiro

voltamogramas consecutivos, mostrando, assim como na VC, que o

mecanismo de oxidação da MC-LR não envolve a formação de qualquer

produto redox eletroativo. A Figura 4.4 mostra os voltamogramas obtidos

para MC-LR em tampão pH 5,3.

Figura 4.4. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução de MC-LR 30 µmol

L-1 em tampão pH 5,3. (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª varredura após transferência do eletrodo ao tampão. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

1a

2 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)


59

Lopes, I. C.

Logo em seguida, foi realizado o teste de adsorção para a MC-LR em

todos os pH’s, conforme os procedimentos descritos na Seção 3.6. Os

voltamogramas obtidos nessas condições não apresentaram nenhum pico

voltamétrico. Isso significa que a MC-LR não adsorve na superfície do

eletrodo. A Figura 4.4 mostra o voltamograma obtido para o teste de

adsorção da MC-LR em tampão pH 5,3 (procedimento 1 da Seção 3.6).


Experimentos de VOQ foram realizados em solução recém-preparada

de MC-LR 30 µmol L-1 em eletrólitos com diferentes valores de pH. Todos

os resultados obtidos nessas condições apresentaram resposta

eletroquímica semelhante à dos voltamogramas cíclicos e de pulso

diferencial.

No primeiro voltamograma registrado em tampão acetato pH 5,3

obtido imediatamente após a adição de MC-LR, o pico 1a, em E1pa = +

1,19 V, foi observado, Figura 4.5.

Uma das vantagens mais importantes da VOQ é que com essa

técnica o caráter reversível da reação de transferência de elétrons pode

ser observado durante a varredura. Como a corrente medida pode ser

amostrada em ambos os sentidos de aplicação dos pulsos, positivo e

negativo, os picos correspondentes à oxidação ou a redução das espécies

eletroativas na superfície do eletrodo podem ser obtidos no mesmo

experimento (GHICA e BRETT, 2005).

Diante disso, a irreversibilidade da reação referente ao pico 1a foi

confirmada pela obtenção das componentes de corrente direta e reversa

da corrente total, onde a componente direta mostrou o pico 1a no mesmo

potencial e com a mesma intensidade de corrente que a componente total

obtida. Na componente reversa nenhum pico catódico apareceu, o que

evidenciou o caráter irreversível da oxidação do pico 1a, Figura 4.5.


60

Lopes, I. C.

Figura 4.5. Voltamogramas de onda quadrada sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução de MC-LR 30 µmol L-1 em tampão acetato pH 5,3: 1ª varredura; It – corrente total, If – corrente direta, Ib – corrente reversa. f =

50 Hz, ∆Es = 2 mV, ∆Ep = 50 mV, veff = 100 mV s-1.

4.2 Comportamento eletroquímico de oxidação da microcistina-LR

degradada

As mesmas soluções de MC-LR em tampão inicialmente estudadas

foram deixadas em incubação por vários períodos de tempo. Com o passar

do tempo, essas soluções foram novamente analisadas e verificaram-se a

diminuição da intensidade de corrente do pico da MC-LR e o aparecimento

de um novo pico de oxidação em um valor de potencial menor. Esse

comportamento atribui-se à uma degradação da toxina em solução com a

formação homogênea de produto(s) de degradação (pdMC-LR)

eletroativo(s).

Desse modo, o processo de degradação química da MC-LR em todos

os tampões e o comportamento eletroquímico do(s) produto(s) gerado(s)

durante essa degradação foram investigados em detalhes por VC, VPD e

VOQ.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

E / V (vs. Ag/AgCl)

1a

1 AIb

It

If


61

Lopes, I. C.


Os experimentos iniciais sobre o comportamento de degradação da

MC-LR foram realizados em tampão acetato pH 3,4, utilizando VC. Os

voltamogramas foram registrados em uma solução de MC-LR 50 µmol L-1

após 96 horas de incubação, Figura 4.6.

Figura 4.6. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos após 96 h de incubação de MC-LR 50 µmol L-1 em tampão acetato pH 3,4. (—) 1ª e (—) 2ª varreduras

entre + 0,25 V e 1,35 V. ∆Es = 2 mV e v = 100 mV s-1.

Na varredura efetuada no sentido positivo do primeiro

voltamograma, o pico 1a ocorreu em E1pa = + 1,21 V, porém um novo pico

anódico surgiu, pico 2a, em E2pa = + 0,94 V, indicando a oxidação do(s)

pdMC-LR formado(s) em solução, Figura 4.6. Ao mudar a direção da

varredura do primeiro voltamograma para o sentido inverso, dois picos de

redução, pico 4c, em E4pc = + 0,58 V, e pico 3c, E3

pc = + 0,47 V,

ocorreram, Figura 4.6. Esses dois picos indicam a redução dos produtos

de oxidação do(s) pdMC-LR formados na superfície do eletrodo durante a

varredura anódica. No segundo voltamograma obtido na mesma solução,

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

1a

2a

4a3

a

4c3

c

0.5 A

E / V (vs. Ag/AgCl)


62

Lopes, I. C.

sem a limpeza da superfície do ECV, os picos de oxidação 3a, em E3pa = +

0,52 V, e 4a, E4pa = + 0,62 V, ocorreram, Figura 4.6, evidenciando o

comportamento reversível dessas duas reações. Além disso, ainda na

segunda varredura as correntes dos picos 1a e 2a decresceram, devido à

adsorção desses produtos de oxidação na superfície do eletrodo.

A fim de verificar que o pico 2a levou a formação dos produtos de

oxidação correspondentes aos picos 3a e 4a, os voltamogramas foram

registrados sob as mesmas condições acima, com a superfície do eletrodo

limpa. Porém a direção da varredura anódica foi invertida imediatamente

após a varredura do pico 2a e antes do pico 1a. Como os picos 3a e 4a

ocorreram nessas condições, Figura 4.7, isso revela que eles são os

produtos de oxidação formados pela reação inerente ao pico 2a.

O mesmo comportamento eletroquímico da MC-LR degradada e de

seus produtos de oxidação foi observado em diferentes eletrólitos

suporte.

Figura 4.7. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos após 96 h de incubação de MC-LR 50 µmol L-1 em tampão acetato pH 3,4. (—) 1ª e (—) 2ª varreduras

entre + 0,25 V e 1,10 V. ∆Es = 2 mV e v = 100 mV s-1.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

E / V (vs. Ag/AgCl)

4c3

c

4a3

a

2a

0.5 A


63

Lopes, I. C.


O comportamento de oxidação da MC-LR degradada e de seus

produtos de oxidação foi estudado em uma ampla faixa de pH

compreendida entre 1,3 e 11,9, usando VPD. As análises foram realizadas

em soluções de MC-LR 30 µmol L-1 em diferentes eletrólitos suporte, após

5, 24 e 29 horas de incubação. Entre os experimentos, a superfície do ECV

foi sempre limpa.

Os voltamogramas obtidos para a MC-LR em tampão acetato pH 5,3

após 5 horas de incubação, mostraram a ocorrência do pico 2a, em E2pa =

+ 0,76 V, Figura 4.8C. Os resultados obtidos na mesma solução, porém

após longos períodos de incubação, ou seja, 24 e 29 horas, mostraram um

aumento progressivo da corrente do pico 2a com o aumento do tempo de

incubação. Simultaneamente, ocorreu um decréscimo da corrente do pico

1a e o deslocamento do seu potencial, Figura 4.8C. Esse mesmo

comportamento para ambos os picos foi observado em todos os eletrólitos

suporte com diferentes valores de pH, Figuras 4.8A, B e D.

Os experimentos acima mostram que durante a incubação da toxina

em tampão houve modificações estruturais na molécula com o aumento

do tempo de incubação. O decréscimo da corrente do pico 1a com o tempo

de incubação corresponde ao decréscimo da concentração da MC-LR,

atribuído à degradação da toxina. O deslocamento de potencial observado

para esse pico é provavelmente devido à uma isomerização da molécula

da toxina. Segundo o estudo de degradação da MC-LR induzida

ultrassonicamente realizado por Antoniou et al. (2008b), a oxidação e a

isomerização das ligações dieno da cadeia Adda da MC-LR ocorreram

simultaneamente. Em contrapartida, o aparecimento e o aumento da

corrente do pico 2a indicam a oxidação do(s) pdMC-LR formados em

solução e o aumento da sua concentração com o tempo, respectivamente.


64

Lopes, I. C.

Figura 4.8. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos em solução de MC-LR 30 µmol L-1 incubada em tampão: (A)

pH 3,4, (B) pH 4,4, (C) pH 5,3 e (D) pH 6,1. (—) 1ª varredura imediatamente após adição de MC-LR ao tampão e após (—) 5 h, (—) 24 h e (—) 29 h de incubação. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

Para todas as soluções tampão, a diminuição da corrente do pico 1a

com o aumento do tempo de incubação foi mais acentuada em pH’s 1,3 e

2,0 e com o aumento do pH essa diminuição foi mais lenta, Figura 4.9.

Isso mostra claramente que a degradação da MC-LR foi mais rápida em

pH’s muito ácidos. A influência do pH na degradação da MC-LR está em

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

2a

1aA

E / V (vs. Ag/AgCl)

3 nA

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

2a

1aB

3 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

2a

1a

E / V (vs. Ag/AgCl)

C

10 nA

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

D 2a

1a10 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)


65

Lopes, I. C.

concordância com aquela observada nos estudos de degradação por

indução dessa toxina apresentados por Shi et al. (2005), Song et al.

(2006) e Antoniou et al. (2008a), que encontraram uma maior taxa de

degradação para essa toxina sob condições ácidas.

Figura 4.9. Variação da corrente do pico 1a para 0, 5, 24 e 29 h de incubação

em tampão em função do pH.

Os voltamogramas sucessivos registrados na solução de MC-LR

incubada em tampão acetato pH 5,3 por 29 horas, mostraram na primeira

varredura o pico 1a, em E1pa = + 1,09 V, e o pico 2a, em E2

pa = + 0,76 V,

Figura 4.10B. Nas segunda e terceira varreduras, dois novos picos de

oxidação foram observados em E3pa = + 0,38 V e E4

pa = + 0,48 V,

correspondentes aos picos 3a e 4a, respectivamente, Figura 4.10B, os

quais adsorvem na superfície do eletrodo. Esses dois picos foram

apresentados anteriormente por VC. Como já mencionado, esses dois

picos são relativos à oxidação dos produtos de oxidação do(s) pdMC-LR

formados na superfície do eletrodo durante a primeira varredura de

potencial. Devido a esse processo adsortivo e, consequentemente,

1 2 3 4 5 6 7 8 90

10

20

30

40

50 0 h

5 h

24 h

29 h

pH

I p / n

A


66

Lopes, I. C.

diminuição da área eletroativa, as correntes dos picos 1a e 2a decresceram

gradativamente nas varreduras consecutivas. As Figuras 4.10A e C

apresentam os voltamogramas obtidos para a MC-LR em soluções tampão

pH 3,4 e 6,1, nas mesmas condições acima.

Figura 4.10. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida

sobre ECV obtidos após 29 h de incubação de MC-LR 30 µmol L-1 em tampão: (A)

pH 3,4, (B) pH 5,3 e (C) pH 6,1. (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª varredura após transferência do eletrodo ao tampão. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e

v = 5 mV s-1.

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

A

2 nA

1a

2a

4a3a

E / V (vs. Ag/AgCl)

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

B

4a

3a

2a

1a

10 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

C

1a

2a

4a

3a

10 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)


67

Lopes, I. C.

A adsorção dos produtos de oxidação do(s) pdMC-LR na superfície

do ECV foi confirmada logo após efetuar o teste de adsorção (Seção 3.6).

O resultado obtido apresentou somente os picos 3a e 4a, Figura 4.10B.

Isso confirma que esses produtos de oxidação adsorvem fortemente,

contudo nem a MC-LR nem o(s) pdMC-LR adsorvem na superfície

eletródica. Além disso, os voltamogramas obtidos sucessivamente nas

mesmas condições mostraram um decréscimo contínuo, porém lento, das

correntes dos picos 3a e 4a devido ao consumo dos produtos formados.

A Figura 4.11 apresenta os voltamogramas obtidos em uma faixa de

potencial menor, onde aparecem somente os picos 2a, 3a e 4a, após 29

horas de incubação da MC-LR em tampão. Ao delimitar a faixa logo após o

aparecimento do pico 2a e ao efetuar varreduras seguidas, verificou-se

que ambas as correntes dos picos 3a e 4a aumentaram, devido à formação

de mais produtos de oxidação do(s) pdMC-LR na superfície do ECV. As

varreduras foram realizadas sem a limpeza da superfície do eletrodo. Isso

foi verificado em todos os pH’s estudados.

Figura 4.11. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos após 29 h de incubação de MC-LR 30 µmol L-1 em tampão: (A)

pH 3,4 e (B) pH 6,1: (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

A 2a

4a3a

E / V (vs. Ag/AgCl)

1 nA

0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

B 2a

4a

3a

E / V (vs. Ag/AgCl)

10 nA


68

Lopes, I. C.

A dependência do pH com o(s) pdMC-LR e de seus produtos de

oxidação foi estudada em soluções de MC-LR incubadas em eletrólitos com

diferentes valores de pH após 29 horas de incubação.

Os resultados mostram que na primeira varredura efetuada, o pico

2a apareceu em todos os eletrólitos suporte, exceto em pH 1,3. Para 1,3

pH 9,2, o potencial do pico 2a foi deslocado para valores menos positivos

com o aumento do pH, Figura 4.12A, seguindo a relação E2pa (V) = 1,081

– 0,059 pH, Figura 4.12B. A inclinação da reta, 59 mV por unidade de pH,

mostra que o mecanismo de oxidação para essa reação envolve o mesmo

número de elétrons e prótons (SMITH, 2006). Levando em consideração

que a largura a meia altura do pico 2a encontrada em todos os pH’s foi

W1/2 = 73,67 2,66 mV a 95% de confiança, o processo de oxidação

envolvido ocorre com a transferência de um elétron e um próton.

Para as medidas realizadas nos pH’s 10,3 e 11,9, o potencial do pico

2a foi independente do pH, Figura 4.12B, indicando um mecanismo

envolvendo a transferência de apenas um elétron e nenhum próton e

atribuindo que o produto de oxidação da MC-LR degradada sofre

desprotonação química em eletrólitos mais alcalinos (PONTINHA,

OLIVEIRA e OLIVEIRA-BRETT, 2008). O valor do pKa ≈ 9,2 foi atribuído

para o(s) pdMC-LR.

A corrente do pico 2a aumentou com o aumento do tempo de

incubação em todos os meios estudados, confirmando que o processo de

degradação da MC-LR ocorreu de forma homogênea em solução. A

variação da corrente do pico 2a com o tempo de análise em diferentes

eletrólitos é representada na Figura 4.13. Foi observado que, para todos

os períodos de incubação, a corrente do pico 2a foi maior em eletrólitos

com 5,3 pH 6,1 e para eletrólitos muito ácidos e alcalinos foram

observadas pequenas intensidades de corrente. Isso mostra que nesse

intervalo de pH a reação de formação do(s) produto(s) de degradação da

MC-LR foi favorecida.


69

Lopes, I. C.

Figura 4.12. (A) Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida da 1ª varredura sobre ECV obtidos em solução de MC-LR 30 µmol L-1

em diferentes eletrólitos, após 29 h de incubação, em função do pH. (B) Relação do () Ep do pico 2a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.4

0.6

0.81.0

2

46

810

12

2a

A

10 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)

pH

0 2 4 6 8 10 12 14

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

B

pH

Ep /

V (

vs

Ag

/Ag

Cl)


70

Lopes, I. C.

Figura 4.13. Variação da corrente do pico 2a para 5 h, 24 h e 29 h de incubação em tampão em função do pH.

Na segunda varredura registrada nas mesmas condições descritas

previamente, apareceram os picos 3a e 4a, Figura 4.14A. O aumento do

pH do meio até pH 9,2 levou a um decréscimo no potencial desses picos,

Figura 4.14B. A dependência foi linear e a inclinação da reta, 59 mV por

unidade de pH, mostrou que o mecanismo de oxidação para cada reação,

correspondente a cada pico 3a e 4a, envolve o mesmo número de elétrons

e prótons. Os valores encontrados em todos os pH’s para W1/2 = 48,4

8,85 mV do pico 3a e W1/2 = 44 4,59 mV do pico 4a a 95% de confiança,

mostram que cada um desses processos de oxidação envolve a

transferência de dois elétrons e dois prótons.

Para as medidas realizadas nos pH’s 10,3 e 11,9, os potenciais dos

picos 3a e 4a foram independentes do pH, Figura 4.14B, indicando um

mecanismo de reação envolvendo a transferência de apenas dois elétrons

e nenhum próton. As correntes desses picos variaram com o pH, atingindo

um máximo de corrente em 5,3 pH 6,1, cada, Figura 4.14.

2 4 6 8 10 12

0

10

20

30

40

50

60

pH

I p / n

A

5 h

24 h

29 h


71

Lopes, I. C.


corrigida da 2ª varredura sobre ECV obtidos em solução de MC-LR 30 µmol L-1 em diferentes eletrólitos, após 29 h de incubação, em função do pH. (B) Relação do Ep dos picos () 3a e (▲) 4a e Ip dos picos () 3a e (∆) 4a com o pH. ∆Es = 2

mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.0

0.2

0.40.6

0.8

4

6

8

10

4a

3a

A

pH

E / V (v

s. Ag/AgCl)

5 nA

0 2 4 6 8 10 12 14

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

pH

I p /

nA

Ep /

V (

vs

Ag

/Ag

Cl)

0

10

20

30

40

50

60

B


72

Lopes, I. C.


Para melhor verificar o comportamento dos produtos obtidos

durante a degradação química da MC-LR em solução quanto a sua

reversibilidade, voltamogramas de onda quadrada em solução de MC-LR

30 µmol L-1 em diferentes tampões foram registrados, após 53 horas de

incubação.

A primeira varredura realizada na solução de MC-LR 30 µmol L-1 em

tampão acetato pH 5,3, mostrou o pico 2a, em E2pa = + 0,78 V, Figura

4.15A. A irreversibilidade dessa reação foi confirmada mediante a

obtenção das componentes de corrente direta e reversa da corrente total,

onde a componente direta apresentou o pico de oxidação no mesmo

potencial e com a mesma intensidade de corrente que a componente total

obtida. Porém, na componente reversa nenhum pico catódico ocorreu,

afirmando a irreversibilidade da reação de oxidação do(s) pdMC-LR.

Figura 4.15. Voltamogramas de onda quadrada sobre ECV obtidos em solução

de MC-LR 30 µmol L-1 incubada após 53 h em tampão pH 5,3: (A) 1ª e (B) 2ª varreduras; It – corrente total, If – corrente direta, Ib – corrente reversa. f = 50

Hz, ∆Es = 2 mV, ∆Ep = 50 mV, veff = 100 mV s-1.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

E / V (vs. Ag/AgCl)

0,5 AIb

If

It

2a

A

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

It

Ib

If

E / V (vs. Ag/AgCl)

1 A

2a

4a

3a

B


73

Lopes, I. C.

Na segunda varredura realizada nas mesmas condições acima, sem

a limpeza da superfície eletródica, os produtos de oxidação, picos 3a e 4a,

apareceram em E3pa = + 0,41 V e E4

pa = + 0,51 V, respectivamente. A

reversibilidade dessas reações foi confirmada pela obtenção das

componentes de corrente direta e reversa da corrente total de ambos os

picos, onde as intensidades de corrente de oxidação e redução para cada

pico foram iguais, Figura 4.15B. Ademais, os mesmos valores de potencial

obtidos para cada um dos picos, 3a e 4a, nas suas componentes de

corrente direta e inversa são um indicativo da adsorção desses produtos

de oxidação na superfície do eletrodo (OLIVEIRA et al., 2007).

O mesmo comportamento voltamétrico em termos de reversibilidade

para os processos redox dos picos 2a, 3a e 4a foi observado em todos os

pH’s estudados.

4.3 Análise cromatográfica da microcistina-LR

Para confirmar a degradação da MC-LR em meio aquoso observada

nos estudos voltamétricos, experimentos cromatográficos foram

realizados.

O cromatograma obtido para a solução recém-preparada de MC-LR

6,3 x 10-7 mol L-1 mostrou somente um pico referente a MC-LR obtido em

= 239 nm, com um tempo de retenção de 7,6 minutos, Figura 4.16.

Esse resultado está de acordo com a literatura (SHI et al., 2005).

Após 1 mês de incubação, a mesma solução de MC-LR foi

novamente testada e os resultados apresentaram três picos, Figura 4.16.

O pico da MC-LR apareceu no mesmo tempo de retenção, porém com

menor valor de absorbância, e os outros dois novos picos surgiram com

tempos de retenção de 5,7 e 10,3 minutos, com máximos de absorbâncias

em = 271 nm e = 209 nm, respectivamente. Isso mostra que a

degradação da MC-LR em meio aquoso e nas condições experimentais

estudadas, sem a utilização de qualquer processo de indução, ocorre com


74

Lopes, I. C.

a quebra da molécula em duas partes, levando a formação dos produtos

de degradação. Esses resultados estão em concordância com aqueles

observados nos estudos de degradação induzida da MC-LR por Bourne et

al. (1996), Song et al. (2006) e Antoniou et al. (2008a). Esses autores

observaram o aparecimento de produtos de degradação dessa toxina nos

cromatogramas obtidos.

5 10 15

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

10,2625,662

7,630

Ab

so

rbân

cia

t/ min

Figura 4.16. Cromatogramas da solução de MC-LR 6,3 x 10-7 µmol L-1 em

tampão acetato pH 3,4: (—) imediatamente após a adição da MC-LR no tampão e (—) após 1 mês de incubação no tampão.

Os experimentos cromatográficos aqui apresentados confirmam a

ocorrência da degradação da MC-LR observada pelas técnicas

voltamétricas.


75

Lopes, I. C.

4.4. Estudo voltamétrico dos aminoácidos Leu, Arg, Ala, Glu e Asp

Com o intuito de detectar os centros eletroativos da MC-LR sobre o

ECV, a oxidação eletroquímica dos aminoácidos Leu, Arg, Ala, Glu e Asp,

foi inicialmente investigada.

Os voltamogramas registrados para cada aminoácido nas

concentrações de 30 e 60 µmol L-1 em 0, 5, 24 e 29 horas de incubação,

utilizando VPD, não mostraram nenhuma resposta eletroativa para o

grupo de aminoácidos estudados.

4.5 Estudo voltamétrico do ácido 2-acetamidoacrílico

Para estudar a eletroatividade do 2-AAA e a sua possível correlação

com os sítios eletroativos da MC-LR, esse composto também foi

investigado eletroquimicamente.

A oxidação do composto 2-AAA foi estudada e os resultados estão

descritos a seguir.


Voltamogramas cíclicos foram obtidos em solução recém-preparada

de 2-AAA 750 µmol L-1 em tampão fosfato pH 7,0. O primeiro

voltamograma apresentou o pico de oxidação do 2-AAA, pico 1a, em E1pa =

+ 1,37 V, Figura 4.17. Ao mudar a direção da varredura nenhum pico

catódico foi observado, mostrando que esse processo de oxidação é um

processo irreversível, Figura 4.17. As varreduras sucessivas obtidas na

mesma solução, sem a limpeza da superfície do eletrodo, não mostraram

nenhum novo pico de oxidação, demonstrando que o processo de

oxidação do 2-AAA não envolve a formação de nenhum produto de

oxidação eletroativo. Em contrapartida, a diminuição da corrente do pico

1a visualizada nas segunda e terceira varreduras ocorreu devido à


76

Lopes, I. C.

adsorção do 2-AAA e/ou seus produtos de oxidação não-eletroativos na

superfície do eletrodo.

Figura 4.17. Voltamogramas cíclicos com linha de base corrigida sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução de 2-AAA 750 µmol L-1 em tampão fosfato pH 7,0: (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras. ∆Es = 2 mV e v =

50 mV s-1.


Voltamogramas de pulso diferencial também foram registrados para

o 2-AAA. Os experimentos foram realizados em solução recém-preparada

de 2-AAA 60 µmol L-1 em diferentes eletrólitos suporte, Figura 4.18.

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

1a

1 A

E / V (vs. Ag/AgCl)


77

Lopes, I. C.


corrigida da 1ª varredura, sobre ECV, obtidos imediatamente após a adição de uma solução de 2-AAA 60 µmol L-1 no tampão em função do pH. (B) Relação dos

() Ep e () Ip do pico 1a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.40.6

0.81.0

1.21.4

3

4

5

6

7

A1

a

pH

10 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)

3 4 5 6 7

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

pH

E /

V (

vs.

Ag

/Ag

Cl)

0

20

40

60

80

100

B

I p /

nA


78

Lopes, I. C.

Os resultados mostram um pico referente à oxidação do 2-AAA, pico

1a, em E1pa ≈ + 1,30 V, Figura 4.18A. Para pH 8,2, o pico 1a não

apareceu. O potencial do pico 1a não variou com o pH, indicando que o

processo de oxidação do 2-AAA é independente do pH, Figura 4.18B, e o

seu mecanismo envolve somente a transferência de elétrons e nenhum

próton (SMITH, 2006).

A largura a meia altura do pico 1a encontrado nos voltamogramas

registrados para todos os pH’s foi de W1/2 = 77 11,32 mV a 95% de

confiança, correspondendo a uma reação de oxidação envolvendo a

transferência de um elétron (BRETT e BRETT, 1996). Assim, o processo de

oxidação do 2-AAA ocorre com a transferência de somente um elétron.

A influência do pH na corrente do pico 1a, apresentada na Figura

4.18B, mostrou que a intensidade de corrente tende a diminuir com o

aumento do pH.

Voltamogramas sucessivos foram registrados nas mesmas condições

acima, em todos os pH’s. Nas segunda e terceira varreduras efetuadas,

em cada eletrólito suporte, a corrente do pico 1a diminuiu

consecutivamente, porém nenhum novo pico foi observado. A Figura 4.19

apresenta os voltamogramas obtidos para o 2-AAA em pH 4,5. Esse

comportamento foi causado, possivelmente, devido à adsorção do 2-AAA

e/ou seus produtos de oxidação na superfície do eletrodo. Todavia, o

mecanismo de oxidação do 2-AAA não envolve a formação de nenhum

produto de oxidação eletroativo. Esses resultados confirmam os obtidos

por VC.

Pelo teste de adsorção (Seção 3.6) realizado para todos os pH’s,

nenhum pico de oxidação foi observado nos voltamogramas obtidos,

indicando que o 2-AAA não adsorve na superfície eletródica. A Figura 4.19

mostra o voltamograma obtido para o teste de adsorção do 2-AAA em

tampão pH 4,5 (procedimento 1 da Seção 3.6).


79

Lopes, I. C.

Figura 4.19. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução de 2-AAA 60 µmol

L-1 em tampão pH 4,5. (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª varredura após transferência do eletrodo ao tampão. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV

s-1.

As mesmas soluções de 2-AAA em tampão utilizadas nos

experimentos anteriores foram armazenadas e em seguida, analisadas

após 24 e 48 horas de incubação. Os resultados mostram apenas uma

diminuição da corrente do pico 1a, sem o aparecimento de um novo pico

de oxidação, Figura 4.20. Isso indica que o composto 2-AAA sofreu

degradação em solução sem apresentar nenhum produto de degradação

eletroativo.

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

E / V (vs. Ag/AgCl)

1a

10 nA


80

Lopes, I. C.


sobre ECV obtidos em solução de 2-AAA 60 µmol L-1 incubada em tampão: (A) pH 3,5, (B) pH 4,5, (C) pH 5,3 e (D) pH 6,0. (—) 1ª varredura imediatamente

após adição de 2-AAA ao tampão e após (—) 24 h e (—) 48 h de incubação. ∆Es

= 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

A 1a

10 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

B1

a

10 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

C 1a

E / V (vs. Ag/AgCl)

10 nA

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

D1

a

5 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)


81

Lopes, I. C.

4.6 Estudo voltamétrico do ácido sórbico

Estudos eletroquímicos para o SA também foram realizados visando

investigar os centros eletroativos da MC-LR. Assim, o comportamento de

oxidação eletroquímica do SA e de seus produtos de degradação em

solução aquosa foi investigado conforme descrito a seguir.


O comportamento voltamétrico do SA foi inicialmente investigado

em uma solução recém-preparada de SA 750 µmol L-1 em tampão fosfato

pH 7,0.

O voltamograma obtido mostrou somente um pico anódico, pico 1a,

em E1pa ≈ + 1,38 V, Figura 4.21. A irreversibilidade dessa reação de

oxidação foi observada ao inverter o sentido da varredura de potencial

para valores menos positivos, visto que nenhum pico catódico foi

observado. Ao efetuar mais duas varreduras seguidas, sem a limpeza da

superfície do ECV, observou-se que nenhum novo pico de oxidação

apareceu demonstrando que o processo de oxidação do SA não envolve a

formação de nenhum produto eletroativo. Contudo, o decréscimo

consecutivo da corrente do pico 1a foi decorrente da adsorção do SA e/ou

seus produtos de oxidação não-eletroativos na superfície eletródica.


82

Lopes, I. C.

Figura 4.21. Voltamogramas cíclicos sobre ECV obtidos imediatamente após

adição de uma solução de SA 750 µmol L-1 em tampão fosfato pH 7,0: (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras. ∆Es = 2 mV e v = 50 mV s-1.


A oxidação eletroquímica do SA em função do pH foi estudada

utilizando soluções recém-preparadas de SA 150 µmol L-1 em diferentes

eletrólitos, entre pH’s 3,4 e 11,9, utilizando VPD.

Para pH’s 8,2, verificou-se o aparecimento do pico 1a, em E1pa ≈ +

1,36 V, Figura 4.22A. O potencial do pico é independente do pH, logo o

mecanismo de oxidação do SA envolve somente a transferência de

elétrons. O valor determinado igual a W1/2 = 86,5 8,37 mV a 95% de

confiança para o pico 1a, em todos os pH’s, evidencia que a reação de

oxidação do SA ocorre com a transferência de um único elétron e nenhum

próton está envolvido.

O gráfico da corrente do pico 1a em função do pH mostra que a

corrente decresce com o aumento do pH, apresentando maior intensidade

de corrente em pH 3,4, Figura 4.22B.

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

1a

2 A

E / V (vs. Ag/AgCl)


83

Lopes, I. C.

Figura 4.22. (A) Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida da 1ª varredura sobre ECV obtidos imediatamente após a adição de uma solução de SA 150 µmol L-1 no tampão em função do pH. (B) Relação dos

() Ep e () Ip do pico 1a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.40.6

0.81.0

1.21.4

3

4

56

7

A1

a

pH

50 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)

3 4 5 6 7

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

pH

0

100

200

300

400

500

B

I p /

nA

E /

V (

vs

. A

g/A

gC

l)


84

Lopes, I. C.

Voltamogramas sucessivos foram registrados em cada solução de

tampão, a fim de confirmar os resultados obtidos por VC. Os resultados

mostram somente um decréscimo contínuo da corrente do pico 1a,

nenhum novo pico voltamétrico foi observado durante as varreduras. A

Figura 4.23 apresenta os voltamogramas obtidos para o SA em tampão

pH 4,2.

Logo em seguida, foi realizado o teste de adsorção para todos os

pH’s (Seção 3.6). Os voltamogramas resultantes mostraram a presença

do pico 1a, porém com intensidade de corrente muito menor. Isso significa

que o SA adsorve na superfície do eletrodo. A Figura 4.23 mostra o

voltamograma obtido para o teste de adsorção do SA em solução tampão

pH 4,2 (procedimento 1 da Seção 3.6).

Figura 4.23. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos imediatamente após adição de uma solução de SA 150 µmol L-

1 em tampão pH 4,2. (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª varredura após transferência do eletrodo ao tampão. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV

s-1.

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

1a

E / V (vs. Ag/AgCl)

50 nA


85

Lopes, I. C.

4.6.3 Estudo voltamétrico do ácido sórbico degradado

Soluções de SA em eletrólitos suporte de diferentes valores de pH

foram deixadas em incubação por vários períodos de tempo. Ao serem

analisadas foram observados a diminuição da intensidade de corrente do

pico do SA e o surgimento de um novo pico de oxidação em valor de

potencial mais baixo, para todos os casos. Isso indica que a molécula de

SA sofreu degradação ao longo do tempo, com a formação homogênea de

produto(s) de degradação (pdSA) eletroativo(s) em solução aquosa. O

processo de degradação química do SA em tampão e o comportamento de

oxidação do(s) produto(s) de degradação gerado(s) foram investigados

utilizando VPD e VOQ, conforme apresentados a seguir.

4.6.3.1 Voltametria de pulso diferencial

Os experimentos iniciais sobre o comportamento de degradação do

SA foram realizados em tampão acetato pH 3,4. Os voltamogramas foram

obtidos após diferentes tempos de incubação em soluções de SA 30 µmol

L-1. Entre as medidas a superfície do ECV foi sempre polida.

Os voltamogramas registrados após 5 horas de incubação mostram

a ocorrência de um novo pico de oxidação, pico 2a, E2pa = + 0,83 V,

correspondente ao(s) pdSA em solução, Figura 4.24A. Os voltamogramas

obtidos na mesma solução após longos tempos de incubação, 24, 48, 96

horas, 7 e 14 dias, mostram um aumento progressivo da corrente do pico

2a com o aumento do tempo. Ao mesmo tempo, a diminuição e,

consequentemente, o desaparecimento do pico 1a foram observados,

Figura 4.24A. Esse comportamento voltamétrico de ambos os picos foi

verificado em todos os eletrólitos suporte estudados. A Figura 4.24B

apresenta os voltamogramas resultantes para o pH 5,3.

Esses resultados mostram que o ácido sórbico sofre modificações

estruturais com o tempo quando incubado em soluções tampão. O


86

Lopes, I. C.

decréscimo da corrente do pico 1a com o aumento do tempo de análise

corresponde ao decréscimo da concentração do SA, atribuído à sua

degradação. Por outro lado, o surgimento e o aumento do pico 2a indicam

a oxidação do(s) pdSA formados em solução eletrolítica e o aumento da

sua concentração com o tempo, respectivamente. Esses resultados estão

em concordância com os da literatura (HILDEGARD e SEBALITSCHKA,

1965, ARYA, 1980; ARYA e THAKUR, 1988; CAMPOS, ROJAS E

GERSCHENSON, 1996; YARRAMRAJU et al., 2007), onde os autores

relatam que o SA em solução aquosa sofre decomposição formando

produtos de degradação.

Figura 4.24. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida sobre ECV obtidos em solução de SA 30 µmol L-1 incubada em tampão: (A) pH

3,4 e (B) pH 5,3. (—) 1ª varredura imediatamente após adição de SA ao tampão e após (—) 5 h, (—) 48 h e (—) 14 dias de incubação. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e

v = 5 mV s-1.

Uma vez que, o pico 1a não foi observado nos voltamogramas

registrados após os períodos de incubação acima citados, exceto após 5

horas de incubação do SA em tampão pH 5,3, a taxa de degradação do SA

em meio aquoso foi avaliada somente pelo pico 2a.

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

2a

A 1a

E / V (vs. Ag/AgCl)

10 nA

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

B

1a

2a

E / V (vs. Ag/AgCl)

3 nA


87

Lopes, I. C.

Os voltamogramas sucessivos também foram registrados na solução

de SA em tampão acetato pH 3,4, após 14 dias de incubação, Figura 4.25.

Na primeira varredura, o pico 2a ocorreu em E2pa = + 0,82 V. Na segunda

varredura dois novos picos de oxidação, picos 3a, em E3pa = + 0,48 V, e

4a, em E4pa = + 0,57 V, foram observados. Esses dois picos correspondem

à oxidação dos produtos de oxidação do(s) pdSA formados na superfície

do eletrodo.

Os resultados obtidos para o teste de adsorção (Seção 3.6) desses

produtos na superfície do mesmo, apresentaram os picos 3a e 4a, Figura

4.25, mostrando que esses dois produtos adsorvem fortemente na

superfície do ECV.


sobre ECV obtidos após 14 dias de incubação de SA 30 µmol L-1 em tampão pH 3,4: (—) 1ª, (—) 2ª e (—) 3ª varreduras e (—) 1ª varredura após transferência do eletrodo ao tampão. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

O comportamento eletroquímico de oxidação do(s) pdSA e de seus

produtos de oxidação foi estudado na faixa de pH 3,4 pH 11,9, e os

0.4 0.6 0.8 1.0

4a

3a

2a

E / V (vs. Ag/AgCl)

5 nA


88

Lopes, I. C.

voltamogramas foram registrados em soluções de SA 30 µmol L-1

incubadas em diferentes eletrólitos, após 14 dias.

A ocorrência do pico 2a foi observada para pH 11,9. Para eletrólitos

com 3,4 pH 9,2, o potencial do pico 2a foi deslocado para valores

menos positivos com o aumento do pH, Figura 4.26A. A relação é linear e

segue a equação E2pa (V) = 1,03 – 0,059 pH, Figura 4.26B. A inclinação

da reta, 59 mV por unidade de pH, mostra que o mecanismo de oxidação

do pico 2a envolve o mesmo número de elétrons e prótons (SMITH, 2006).

O valor determinado igual a W1/2 = 72,88 10,45 mV a 95% de confiança

para o pico 2a em todos os pH’s evidencia que a reação de oxidação do

dSA ocorre com a transferência de um único elétron, consequentemente,

também um próton. Para pH 9,2, o potencial do pico 2a tende a ser

independente do pH, Figura 4.26B, indicando um sistema de reação

envolvendo a transferência de um único elétron e nenhum próton e

atribuindo que o produto de oxidação do SA degradado sofre

desprotonação química em eletrólitos mais alcalinos (PONTINHA,

OLIVEIRA e OLIVEIRA-BRETT, 2008). O valor do pKa ≈ 9,2 para o(s) pdSA

foi atribuído. Para pH 10,3 o pico 2a não foi observado.

Durante os experimentos, em cada eletrólito, vários voltamogramas

consecutivos foram obtidos. Na segunda varredura os picos 3a e 4a

ocorreram, correspondendo à oxidação dos produtos de oxidação do(s)

pdSA formados na superfície do eletrodo. Seu comportamento

voltamétrico foi estudado em função do pH do eletrólito suporte. Foi

observado que, ao aumentar o pH, um decréscimo do potencial de ambos

os picos 3a e 4a ocorreu. A dependência foi linear e a inclinação da reta,

59 mV por unidade de pH, mostrou que o mecanismo de oxidação dos

picos 3a e 4a envolve o mesmo número de elétrons e prótons. A largura a

meia altura de ambos os picos, em todos os pH’s, foi de W1/2 = 54,67

11,47 mV a 95% de confiança, logo esses processos de oxidação

envolvem a transferência de dois elétrons e dois prótons. Para pH 9,2,


89

Lopes, I. C.

os potenciais dos picos 3a e 4a tendem a ser independentes do pH,

indicando um mecanismo de reação envolvendo a transferência de

somente dois elétrons.

Figura 4.26. (A) Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida da 1ª varredura sobre ECV obtidos em solução de SA 30 µmol L-1 em diferentes eletrólitos, após 14 dias de incubação, em função do pH. (B) Relação

do () Ep do pico 2a com o pH. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.20.4

0.60.8

1.01.2

2

4

6

810

2aA

5 nA

pH

E / V vs. Ag/AgCl

2 4 6 8 10 12

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

B

E /

V (

vs

. A

g/A

gC

l)

pH


90

Lopes, I. C.

Voltamogramas de pulso diferencial foram também registrados em

todos os eletrólitos suporte após diferentes tempos de incubação, ou seja,

24, 48, 96 horas, 7 e 14 dias. A variação da corrente do pico 2a com o

tempo, Figura 4.27, mostrou que a reação de formação do(s) produto(s)

de degradação do SA foi favorecida em eletrólitos ácidos e diminuiu com o

aumento do pH, tornando-se insignificante a partir de pH 6,0.

Esses resultados estão de acordo com a literatura (ARYA, 1980),

que revelou que a degradação do SA em meio aquoso segue uma reação

cinética de primeira-ordem ou pseudo-primeira-odem e a taxa de reação é

muito dependente da concentração de prótons. A taxa de reação de

degradação decresce com o aumento do pH e torna-se insignificante em

pH 5,0. Uma vez que o pKa do ácido carboxílico é 4,75, sugere-se que

apenas as moléculas de SA não dissociadas são susceptíveis à degradação

oxidativa em meio aquoso; moléculas ionizadas são degradadas de forma

insignificante.

Figura 4.27. Variação da corrente do pico 2a para 24 h, 7 e 14 dias de incubação em tampão em função do pH.

4 6 8 10

0

5

10

15

20

25

pH

I p / n

A

24 h

7 dias

14 dias


91

Lopes, I. C.

4.6.3.2 Voltametria de onda quadrada

Visando caracterizar os produtos obtidos durante o processo de

degradação do ácido sórbico e compreender a reversibilidade de seu

sistema, voltamogramas de onda quadrada foram registrados em

diferentes eletrólitos suporte.

As varreduras voltamétricas realizadas em uma solução de SA 30

µmol L-1 em tampão acetato pH 3,4, após 20 dias de incubação, mostram

o pico de oxidação 2a, E2pa = + 0,87 V, Figura 4.28A, na primeira

varredura efetuada. A irreversibilidade dessa reação foi confirmada pela

obtenção das componentes de corrente direta e reversa da corrente total,

onde a componente direta mostrou o pico 2a no mesmo potencial e com a

mesma intensidade de corrente que a componente total obtida. A

componente reversa não apresentou nenhum pico catódico, Figura 4.28A.

Figura 4.28. Voltamogramas de onda quadrada sobre ECV obtidos em solução de SA 30 µmol L-1 incubada após 20 dias em tampão pH 3,4: (A) 1ª e (B) 2ª varreduras; It – corrente total, If – corrente direta, Ib – corrente reversa. f = 50

Hz, ∆Es = 2 mV, ∆Ep = 50 mV, veff = 100 mV s-1.

A segunda varredura realizada apresentou os produtos de oxidação,

pico 3a, E3pa = + 0,51 V, e pico 4a, E4

pa = + 0,62 V, Figura 4.28B. A

0.4 0.6 0.8 1.0

Ib

If

It

A 2a

0.5 A

E / V (vs. Ag/AgCl)

0.4 0.6 0.8 1.0

Ib

If

It

B

4a

3a

2a

E / V (vs. Ag/AgCl)

1 A


92

Lopes, I. C.

separação e demonstração da componente total de suas componentes

direta e reversa confirmou a reversibilidade dessas duas reações, visto

que as correntes e os potenciais de pico de oxidação e redução são iguais

para ambas as reações, Figura 4.28B.

4.6.3.3 Mecanismos de oxidação do ácido sórbico e dos seus

produtos de degradação

Baseado nos resultados anteriormente descritos na VC, VPD e VOQ

para o SA e sua degradação em solução aquosa, mecanismos de reação

para a oxidação desse composto e dos seus produtos de degradação

foram propostos.

Como já mencionado, a oxidação eletroquímica do SA, pico 1a,

Figura 4.22, é um processo irreversível que ocorre em uma única etapa

envolvendo a transferência de apenas um elétron. Esse processo não

envolve a formação de nenhum produto de oxidação eletroativo.

A oxidação do SA tende a ocorrer nas duplas ligações entre C2 - C3

ou C4 – C5. Como a dupla ligação entre C2 – C3 se encontra próximo ao

grupo carboxila, esse exerce um efeito protetor que dificulta o processo de

oxidação e a dupla ligação entre C4 – C5 se torna mais susceptível.

Portanto, o mecanismo de oxidação proposto para o SA, pico 1a, Figura

4.29, envolveu a quebra da dupla ligação entre C4 - C5 com a adição do

grupo hidroxila na posição C5, pico 1a, seguida pela desprotonação

química do produto de oxidação (LOPES et al., 2011).

Figura 4.29. Mecanismo de oxidação proposto para o ácido sórbico.

H3C OH

O

15 3

4 2

-1e-

H2O

H3C OH

OOH

H3C OH

O

pico 1a


93

Lopes, I. C.

Os resultados obtidos para o SA em solução tampão em vários

tempos de incubação revelaram que essa molécula se degrada ao longo

do tempo e a reação de formação do(s) produtos(s) de degradação

eletroativo(s), pico 2a, Figuras 4.24 e 4.27, foi favorecida em eletrólitos

ácidos. Isso corrobora com o estudo apresentado por Arya (1980) sobre a

estabilidade do SA em solução aquosa. Segundo a autora, após a

incubação do SA em eletrólitos ácidos, a banda de absorção atribuída à

dupla ligação conjugada do grupo carbonila na molécula do SA diminuiu

com o aumento do tempo de incubação, indicando a degradação do SA. A

taxa de degradação diminuiu com o aumento do pH e foi acompanhada

pelo aumento simultâneo de carbonilas totais e o teor de malonaldeído.

Como principais produtos de degradação dessa molécula em solução

aquosa foram referidos o malonaldeído, crotonaldeído e acroleína

(HILDEGARD e SABALITSCHKA, 1965; ARYA, 1980).

Diante disso, considera-se que o SA ao se degradar em solução

tampão gera os produtos de degradação anteriormente mencionados.

Uma vez que, a acroleína é uma molécula planar com os sitemas das

ligações duplas carbono-carbono e carbono-oxigênio sobrepostos, que

aumentam a estabilidade do sistema conjugado, a sua oxidação exigiria

uma quantidade de energia muito maior do que a do potencial aplicado ao

ECV. Por essa razão, o pico 2a foi considerado decorrente exclusivamente

da oxidação eletroquímica do malonaldeído, que se encontra

completamente enolizado em solução aquosa (MACDONALD e DUNFORD,

1989), e crotonaldeído.

Um mecanismo foi proposto para a oxidação do malonaldeído e

crotonaldeído, pico 2a, Figura 4.30. Esta reação envolveu a remoção de

um elétron e um próton formando um íon radical, o qual reagiu com a

água levando à formação de 2-hidroximalonaldeído (MARDER e

SCHUERCH, 1959; MACDONALD e DUNFORD, 1989) e 2-

hidroxicrotonaldeído, Figura 4.30. Esses produtos dihidroxilados sofreram


94

Lopes, I. C.

oxidação reversível, picos 3a – 3c e 4a – 4c, envolvendo a transferência de

dois elétrons e dois prótons, Figura 4.30 (LOPES et al., 2011).

Figura 4.30. Mecanismo de oxidação proposto para os produtos de degradação

do ácido sórbico: crotonaldeído (R é C = CH2), malonaldeído (R é C = O).

4.7 Mecanismo de oxidação da MC-LR e dos seus produtos de

degradação

Baseado nos resultados voltamétricos da MC-LR e sua degradação

em solução aquosa, do 2-AAA e nos estudos voltamétricos e mecanísticos

apresentados para o SA e os seus produtos de degradação em solução,

mecanismos de reação para a oxidação da MC-LR e os seus produtos de

degradação foram propostos.

Os experimentos realizados em soluções contendo os cinco

aminoácidos comuns constituintes da MC-LR (Leu, Arg, Ala, Glu e Asp)

não apresentaram resposta eletroquímica. Porém, os voltamogramas

registrados em soluções de 2-AAA e SA (compostos de estruturas

químicas similares aos aminoácidos Mdha e Adda, respectivamente)

mostraram que ambos os compostos são oxidados eletroquimicamente em

ECV. Desse modo, pôde-se concluir que os centros eletroativos da MC-LR

correspondem a esses dois grupos.

Os potenciais de oxidação do 2-AAA e do SA, E1pa ≈ 1,30 V e E1

pa ≈

1,36 V, respectivamente (Figuras 4.18 e 4.22), foram ligeiramente

R

OH

R

O

R

OH

ROH

OH

OO

O

O

O

-1e-; -1H++ H2O

-2 e-

-2 H++2 e-

+2 H+-2 H+

-2 e-+2 e-

+2 H+

pico 2a

pico 4a -4

cpico

3 a-3 c


95

Lopes, I. C.

diferentes do potencial da MC-LR, E1pa ≈ 1,06 V (Figura 4.3), observados

em DPV. Contudo, o comportamento eletroquímico dos três compostos foi

similar. Conforme já relatado, a oxidação eletroquímica tanto da MC-LR,

quanto do 2-AAA e SA, pico 1a, é um processo irreversível ocorrido em

uma única etapa, que envolve a transferência de um elétron e sem a

formação de qualquer produto de oxidação eletroativo.

Baseado nesses resultados, mecanismos de oxidação da MC-LR em

solução aquosa foram propostos, Figura 4.31.

O

Glu

NH

Arg

OCH3

7

4

5

6

-1e-

pico 1a

O

Glu

NH

Arg

OCH3

H2O

OH

GluN

Ala

CH2

OH

GluN

Ala

CH2

OH

GluN

Ala

CH3

OH

H2O

OH

O

Glu

NH

Arg

OCH3

B)

A)

-1e-

pico 1a

Figura 4.31. Mecanismos de oxidação propostos para a MC-LR: Oxidação nos aminoácidos Mdha (A) e Adda (B).

A oxidação do aminoácido Mdha, pico 1a, ocorreu com a remoção de

um elétron do grupo metileno, seguido pelo ataque nucleofílico direto da


96

Lopes, I. C.

água e a formação de um produto de oxidação hidroxilado, Figura 4.31A.

Por outro lado, a oxidação do aminoácido Adda, pico 1a, baseada no

mecanismo descrito para o SA (Figura 4.29), envolveu a quebra da dupla

ligação entre C6 – C7 com a adição do grupo hidroxila na posição C7,

seguida pela desprotonação química do produto de oxidação, Figura

4.31B. Vale ressaltar a possibilidade de a transferência de elétron de

ambos os centros eletroativos ter ocorrido simultaneamente, levando a

formação de dois picos sobrepostos, ou seja, as duas reações de oxidação

ocorreram ao mesmo tempo gerando um único pico (pico 1a).

Os experimentos realizados em solução tampão após diferentes

tempos de incubação mostraram que a MC-LR se degrada ao longo do

tempo, com a formação de produto(s) de degradação, pico 2a, Figuras 4.8

e 4.12, que envolvem a transferência de um elétron e um próton. Além

disso, a oxidação do(s) pdMC-LR envolve a formação de dois produtos de

oxidação, picos 3a e 4a, que sofrem reações redox reversíveis com a

transferência de dois elétrons e dois prótons, Figuras 4.10 e 4.14.

Similarmente à MC-LR, o SA é conhecido por se degradar em

solução aquosa (ARYA, 1980; ARYA e THAKUR, 1988; HILDEGARD e

SABALITSCHKA, 1965; YARRAMRAJU et al., 2007). Nos experimentos

previamente descritos (Seção 4.6), o SA sofre degradação química em

tampão com o tempo de incubação. Após a degradação química, o pico de

oxidação do SA, pico 1a, diminuiu, enquanto um novo pico ocorreu em

valor de potencial mais baixo, pico 2a, mostrando a formação homogênea

de dois produtos de degradação. A oxidação dos produtos de degradação

do SA levou à formação de duas espécies eletroativas, picos 3a e 4a, que

como no caso da MC-LR sofrem reações redox reversíveis.

Dada a semelhança observada no comportamento eletroquímico dos

dois compostos em estudo, o esquema de degradação da MC-LR e o

mecanismo de oxidação de seus produtos de degradação em solução


97

Lopes, I. C.

foram propostos em conformidade com o mecanismo descrito para a

oxidação dos produtos de degradação do SA apresentado na Figura 4.30.

Diante disso, a Figura 4.32 mostra o esquema proposto para a

degradação da MC-LR em solução aquosa e o mecanismo de oxidação de

seus produtos de degradação.

Após a incubação em soluções tampão, a cadeia lateral Adda da MC-

LR foi separada da estrutura do anel peptídeo. Esse processo pode ter

ocorrido em dois diferentes lugares da cadeia, no C4 ou C6, dando origem

a dois produtos de degradação eletroativos (1 e 2) contendo um grupo

hidroxila, Figura 4.32A, e a dois outros produtos de degradação (1' e 2'),

consistentes com a MC-LR remanescente da estrutura do anel peptídeo,

Figura 4.32A.

Isso é condizente com alguns trabalhos da literatura que revelaram

que a degradação da MC-LR geralmente é iniciada no grupo Adda,

principalmente nas duplas ligações conjugadas (SONG et al., 2006;

ANTONIOU et al., 2008a; ANTONIOU et al., 2008b). Segundo, SONG et

al., 2006, o local mais susceptível à oxidação é nas duplas ligações

conjugadas do grupo Adda, principalmente, por causa da sua posição na

molécula da MC-LR. Um mecanismo proposto para a degradação

fotocatalítica dessa toxina mostrou que a oxidação foi iniciada nas duplas

ligações conjugadas do aminoácido Adda, formando MC-LR-enol via

substituição por hidroxila no C7 e levando a remoção completa da cadeia

Adda (ANTONIOU et al., 2008b).

A formação do pico 2a foi atribuído à oxidação dos produtos de

degradação (1 e 2). Essa reação envolveu a remoção de um elétron e um

próton formando um íon radical, o qual reagiu com a água levando à

formação de produtos dihidroxilados, Figura 4.32B. Esses produtos

dihidroxilados sofreram oxidação reversível, picos 3a – 3c e 4a – 4c,

envolvendo a transferência de dois elétrons e dois prótons, Figura 4.32B.


98

Lopes, I. C.

OCH3

Glu

NH

O

Arg

76

5

4

OCH3

OH

OCH3

OH

Glu

NH

O

Arg

Glu

NH

O

Arg

(1) (2)

(1') (2')

+ +

degradação degradação

A)

R

OH-1e-;-1H+

pico 2a

R

O

R

OH

H2O

R

OH

OH

OCH3 O

O

OCH3 O

O

+2e-

+2H+-2e-

-2H+

+2e-

+2H+

-2e-

-2H+pico 3 a

- 3c

pico 4a - 4

c

Onde R é:OCH3

para o pico 3a e

OCH3

para o pico 4a

B)

Figura 4.32. (A) Esquema proposto para a degradação química da MC-LR e (B) Mecanismo de oxidação proposto para os seus produtos de degradação em

solução.


99

Lopes, I. C.

4.8 Estudo eletroanalítico da microcistina-LR

A detecção direta da MC-LR sobre um ECV, utilizando técnicas

voltamétricas, pode ser uma maneira simples para determinar a presença

desta toxina em águas naturais.

4.8.1 Curva analítica

Com o propósito de avaliar a possível aplicação do eletrodo de

carbono vítreo como sensor voltamétrico para a detecção de MC-LR (pico

1a), uma curva analítica foi obtida numa faixa linear de concentração de 5

a 25 µmol L-1 em tampão pH 1,3 (procedimento descrito na Seção 3.8).

Este eletrólito suporte foi escolhido devido a obtenção de maior

sensibilidade para o pico da MC-LR.

A Figura 4.33A mostra os voltamogramas resultantes da adição das

diferentes concentrações de MC-LR sobre ECV, onde é possível observar o

aumento proporcional da corrente de pico com o aumento da

concentração da toxina.

A dependência linear da Ip com a concentração da toxina em

solução, Figura 4.33B, mostrou que a curva de trabalho para a MC-LR

sobre a superfície eletródica estudada pode ser expressa pela equação

matemática:

1/])[09,0(62,1)44,1(36,8/ molLLRMCnAI (3)

com um coeficiente de correlação R = 0,9957 para N = 5 e SD = 1,37 x

10-9.


100

Lopes, I. C.

0 5 10 15 20 25 30

0

10

20

30

40B

I p

/ n

A

[MC-LR] / M

Figura 4.33. (A) Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida para oxidação da MC-LR, sobre ECV, em tampão pH 1,3, numa faixa linear de

concentração de 5 à 25 µmol L-1. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1. (B) Relação da Ip com a concentração da MC-LR nas mesmas condições.

0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3

0

5

10

15

20

25

30

35 5

10

15

20

25

[MC-LR] = mol L-1

A

1a

I p / n

A

E / V (vs. Ag/AgCl)


101

Lopes, I. C.

4.8.2 Figuras de mérito

Sabe-se que as figuras de mérito constituem os parâmetros

requeridos para validação do método analítico proposto. Com esse intuito,

avaliou-se o sistema quanto a sua sensibilidade, limites de detecção (LD)

e quantificação (LQ).

Entende-se como sensibilidade de um método a capacidade que este

tem, em determinado nível de confiança, de distinguir duas concentrações

próximas (MOCAK et al., 1997). Do ponto de vista prático a sensibilidade

de calibração (IUPAC) constitui a inclinação da curva analítica (b ), cujo

valor encontrado foi da ordem de 1,62 (± 0,09) 1molL

nA

, a qual foi

utilizada para estimar os LD e LQ do método.

O LD foi calculado com base na Equação 3.1 (Seção 3.8.1). Foram

registradas 20 medidas do brancos a fim de estimar o desvio padrão da

média aritmética (Sb= 0,000752 nA), os quais são de extrema

importância para avaliar a resposta da metodologia. Sendo assim, o LD

obtido foi de 0,0014 µmol L-1 (1,39 µg L-1). O LQ foi calculado mediante a

Equação 3.2 (Seção 3.8.1) e o valor encontrado foi de 0,0046 µmol L-1

(4,57 µg L-1). Esses limites estimados estão acima do valor limite

estabelecido pela OMS para MC-LR total em água potável, que é de 1 µg

L-1 (WHO, 1998). Além disso, eles não podem ser considerados aceitáveis,

visto que seus valores estimados estão muito abaixo do esperado para as

concentrações usadas na construção da curva analítica, Figura 4.33B.

Esses resultados podem ser atribuídos ao polimento realizado na

superfície do eletrodo entre cada medida, o qual pode levar a pequenas

alterações na sua superfície, induzindo a um erro experimental. Sendo

assim, tal procedimento provocou um deslocamento significativo de

potencial de pico, Figura 4.33A, implicando na sensibilidade de calibração.

Como já comentado na Seção 3.8, tal polimento foi necessário devido a

adsorção dos produtos de oxidação da MC-LR na superfície do eletrodo.


102

Lopes, I. C.

4.9 Interação da microcistina-LR com DNA

A interação da MC-LR com dsDNA foi estudada a fim de investigar a

ação dessa toxina na indução de mudanças conformacionais no DNA,

clivagem das ligações de hidrogênio e/ou dano oxidativo nas bases do

DNA. O efeito de interação foi investigado por VPD e espectrofotometria

UV-Vis.

4.9.1 Avaliação voltamétrica in situ da interação da microcistina-

LR com dsDNA utlizando biossensores de dsDNA

O estudo inicial da interação da MC-LR com o dsDNA foi feito

mediante a imersão do biossensor eletroquímico de dsDNA, previamente

preparado (Seção 3.9.1), numa solução recém-preparada de MC-LR e

incubado durante 10 e 20 minutos. As concentrações da MC-LR testadas

foram 30 e 100 µmol L-1. Após a incubação, o biossensor foi lavado com

água deionizada, assegurando desse modo a remoção de moléculas não

ligadas ao DNA e, em seguida, transferido para o tampão acetato pH 4,5.

Os biossensores de dsDNA de controle também foram preparados e

analisados, conforme o procedimento descrito na Seção 3.9.1. Teve-se

como objetivo assegurar que as mudanças observadas nos

voltamogramas dos biossensores na presença de MC-LR foram de fato

decorrentes da interação da MC-LR/dsDNA com o passar do tempo.

O efeito de interação da MC-LR/dsDNA foi observado comparando as

alterações na intensidade de corrente dos picos de oxidação

característicos do DNA - as bases purínicas desoxiguanosina (dGuo), Epa ≈

+ 1,05 V, e desoxiadenosina (dAdo), E1pa ≈ + 1,30 V (OLIVEIRA-BRETT e

DICULESCU, 2004b) - com os biossensores de dsDNA de controle. A

ocorrência dos picos dos produtos de oxidação da guanina e/ou adenina -

os biomarcadores 8-oxoguanina (8-oxoGua) e 2,8-dihidroxiadenina (2,8-

DHA) observados em E1pa ≈ + 0,45 V em tampão acetato pH 4,5 - é um


103

Lopes, I. C.

indicativo de dano oxidativo causado ao DNA (OLIVEIRA-BRETT, PIEDADE

E SERRANO, 2000; DICULESCU, PIEDADE E OLIVEIRA-BRETT, 2007).

Em tampão acetato pH 4,5, o voltamograma registrado para o

biossensor de dsDNA de controle mostrou a presença dos picos de

oxidação: dGuo e dAdo, em E1pa = + 0,99 V e E2

pa = + 1,25 V,

respectivamente, Figura 4.34A.

Em outro experimento, Após 10 minutos de incubação de um novo

biossensor de dsDNA na solução de MC-LR 30 µmol L-1, observou-se uma

diminuição da intensidade das correntes dos picos da dGuo e dAdo, em

comparação com os picos do dsDNA de controle. Transcorridos 20 minutos

de incubação de um novo biossensor, os voltamogramas mostraram uma

diminuição significativa das correntes dos picos de oxidação do dsDNA,

Figura 4.34A. Isso mostra que a MC-LR interage com o dsDNA e indica

que a diminuição dos picos dGuo e dAdo é consequência da redução do

contato das bases do dsDNA com a superfície do eletrodo, que dificultou a

transferência de elétrons, como resultado de mudanças conformacionais

na dupla hélice do dsDNA. Essas modificações conformacionais podem ser

explicadas pelo enrolamento da dupla hélice sobre si mesma, ou seja, a

sua estrutura tornou-se condensada após interagir com a MC-LR.

Comportamentos similares foram observados nos picos de oxidação

do dsDNA por Oliveira et al. (2009) e Corduneanu et al. (2010), quando

investigaram a interação eletroquímica do dsDNA com a talidomida e

quelatos de paládio com poliaminas biogênicas espermina e espermidina,

respectivamente.


104

Lopes, I. C.

Figura 4.34. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida obtidos para o biossensor de dsDNA 50 µg mL-1 de controle (—) e incubado

durante 10 (—) e 20 minutos (—) numa solução de MC-LR em tampão acetato pH 4,5: (A) 30 e (B) 100 µmol L-1. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

Nenhum outro pico anódico referente à oxidação da 8-oxoGua ou

2,8-DHA foi detectado nos voltamogramas resultantes, Figura 4.34A. Isso

é um indicativo de que não houve dano oxidativo ao dsDNA pela MC-LR

nas condições experimentais estudadas.

Comportamento similar foi observado para a solução de MC-LR na

concentração de 100 µmol L-1, Figura 4.34B.

4.9.2 Avaliação voltamétrica in situ da interação da microcistina-

LR com dsDNA utilizando soluções de dsDNA incubadas

O estudo da interação direta da MC-LR com dsDNA foi realizado

através de soluções de dsDNA incubadas com esta toxina (Seção 3.9.2), a

fim de observar a possível ocorrência de danos oxidativos ao dsDNA pela

MC-LR durante longos tempos de incubação.

Soluções de dsDNA 50 µg mL-1 foram incubadas com a MC-LR 30

µmol L-1 em tampão pH 4,5, durante 0, 1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas. As

soluções de dsDNA de controle foram também preparadas e analisadas,

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

dAdo

dGuo

A

E / V (vs. Ag/AgCl)

10 nA

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

dAdo

dGuo

B

10 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)


105

Lopes, I. C.

conforme o procedimento descrito na Seção 3.9.2. A superfície do ECV foi

sempre polida entre cada medida para evitar o decréscimo das correntes

devido a adsorção do dsDNA após varreduras sucessivas.

Os efeitos da interação MC-LR/dsDNA foram obtidos por comparação

dos sinais analíticos de oxidação da dGuo e dAdo na ausência e presença

da MC-LR na solução.

O primeiro voltamograma registrado para a interação entre MC-

LR/dsDNA revelou um aumento da intensidade da corrente de pico em +

0,99 V logo após a adição da toxina na solução de dsDNA, quando

comparado com o dsDNA de controle, Figura 4.35A. Isso ocorreu devido à

duas contribuições: a oxidação dos resíduos de dGuo das cadeias do

dsDNA e a oxidação das moléculas de MC-LR, desde que respondem em

potenciais similares. Comportamento análogo foi verificado por Oliveira et

al. (2007), ao avaliar in situ a interação voltamétrica da ocratoxina A com

dsDNA. Em contrapartida, a corrente de pico da dAdo diminuiu, Figura

4.35A, provavelmente devido à uma interação da MC-LR com o dsDNA.

Figura 4.35. Voltamogramas de pulso diferencial com linha de base corrigida de uma mistura de dsDNA 50 µg mL-1 e MC-LR 30 µmol L-1 em tampão acetato pH 4,5, obtidos em um ECV: (A) (—) dsDNA de controle, (—) 0 h; (—) 2 h e (—) 6 h

de incubação; (B) (—) dsDNA de controle, (—) 24 h e (—) 48 h de incubação. ∆Es = 2 mV, ∆Et = 70 ms e v = 5 mV s-1.

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

A

dA

do

dG

uo

5 nA

E / V (vs. Ag/AgCl)

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

B

dM

C-L

R

dA

do

dG

uo

E / V (vs. Ag/AgCl)

5 nA


106

Lopes, I. C.

Quando a solução de MC-LR/dsDNA foi investigada após 2 e 6 horas

de incubação, a intensidade das correntes dos picos da dGuo e dAdo

diminuiu sucessivamente com o aumento do tempo de incubação, Figura

4.35A. O mesmo comportamento foi observado no estudo da interação da

MC-LR/dsDNA utilizando biossensores de dsDNA (Seção 4.9.1). Sendo

assim, a dupla hélice do dsDNA sofreu condensação, tornando-se uma

estrutura compacta após interagir com a toxina. Esses experimentos

mostram que a toxina interage e se liga às cadeias do dsDNA.

Após 24 horas de incubação, Figura 4.35B, além da diminuição das

correntes dos picos do dsDNA, houve o aparecimento de um novo pico em

E3pa = + 0,80 V. Como mostrado na Seção 4.2.2, a MC-LR sofre

degradação em solução ácida e, por conseguinte, o pico em + 0,80 V é

devido à oxidação dos pdMC-LR em solução. A corrente desse pico

aumentou consideravelmente após 48 horas de incubação, indicando um

aumento da concentração dos pdMC-LR, Figura 4.35B. Em adição, durante

todos os experimentos executados foi observado o aumento da largura a

meia altura do pico de oxidação em + 0,99 V com o aumento do tempo de

incubação, Figuras 4.35A e B. Porém, após 24 horas de incubação foi

observado o seu desdobramento e a ocorrência de um novo pico em E2pa =

+ 1,12 V referente à oxidação da MC-LR, Figura 4.35B. Isso indica que as

cadeias helicoidais do dsDNA podem ter sofrido um desenrolamento

durante a interação com essa toxina deixando-a mais exposta na

superfície do eletrodo.

Uma vez que, nenhum pico anódico correspondente aos picos de

oxidação da 8 oxoGua ou 2,8-DHA foi observado em todos os

voltamogramas registrados, conclui-se que, para as condições

experimentais estudadas, não houve dano oxidativo ao dsDNA pela toxina

em estudo. Embora, a literatura relate que a MC-LR causou danos

oxidativos ao DNA quando foram investigados a sua capacidade em

induzir danos ao DNA em célula de hepatoma humano (HepG2) (ZEGURA,


107

Lopes, I. C.

SEDMAK e FILIPIC, 2003) e os efeitos da MC-LR sobre o DNA em vários

órgãos de camundongos (GAUDIN et al., 2008), ambos utilizando o teste

do cometa in vivo.

4.9.3 Avaliação espectrofotométrica in situ da interação da microcistina-LR com dsDNA

Medidas espectrofotométricas da interação da MC-LR com dsDNA

foram realizadas a fim de averiguar os resultados observados nos estudos

voltamétricos.

Para verificar se a MC-LR influencia na conformação do dsDNA, as

diferenças entre os espectros de absorção de dsDNA foram monitorados

na ausência e presença de MC-LR.

Os espectros de absorção registrados para o dsDNA de controle 50

µg mL-1 e MC-LR 25 µmol L-1 são mostrados na Figura 4.36. A banda de

absorção típica do dsDNA foi observada em = 260 nm, devido

exclusivamente às transições * das bases purina e pirimidina

(RODGER e SANDERS, 2010) e a absorção referente à MC-LR foi obtida

em = 239 nm, atribuída à transição * do aminoácido Adda,

constituinte dessa toxina (SHI et al., 2005).

O espectro registrado, logo após preparar a mistura MC-LR/dsDNA

em tampão pH 4,5, exibiu somente uma banda em = 238 nm, porém

com a intensidade de absorção diminuída, Figura 4.36. A intensidade da

banda ocorrida em = 260 nm diminuiu drasticamente. Isso é um indício

de que houve uma mudança conformacional na estrutura do dsDNA

durante a incubação com a toxina, levando à condensação da estrutura de

dupla hélice do DNA. Comportamento similar foi observado por Oliveira et

al. (2009) ao estudar a interação espectrofotométrica in situ do fármaco

talidomida com dsDNA.

Os resultados espectrofotométricos concordaram com os dados

observados em VPD.


108

Lopes, I. C.

250 300 350 400

0.00

0.04

0.08

0.12

0.16

Ab

so

rbâ

nc

ia

240 280 320

0.000

0.005

0.010

0.015

dsDNA

/ nm

Figura 4.36. Espectros de absorção de: (—) dsDNA de controle 50 µg mL-1; (—) MC-LR 25 µmol L-1 e (—) solução de dsDNA 50 µg mL-1 obtida imediatamente após a adição da MC-LR 25 µmol L-1, em tampão pH 4,5. Inserção: espectro de

absorção da mistura dsDNA/MC-LR entre 210 e 350 nm.

CAPÍTULO 5

CONCLUSÕES

Conclusões

110

Lopes, I. C.

5 CONCLUSÕES

Os estudos realizados por VC, VPD e VOQ evidenciaram que a MC-LR

sofre oxidação eletroquímica sobre um ECV em um processo irreversível e

independente do pH. Essa reação envolveu a transferência de apenas um

elétron, sem a formação de qualquer produto de oxidação eletroativo.

Com o passar do tempo foi observado que a MC-LR sofre

degradação química em solução tampão, levando à formação homogênea

de dois produtos de degradação eletroativos. Esses produtos sofrem

oxidação eletroquímica em um processo irreversível e dependente do pH.

Além disso, a oxidação desses produtos levam à formação de duas

espécies eletroativas que sofrem reações redox reversíveis em um

processo dependente do pH.

O estudo cromatográfico da MC-LR confirmou a degradação dessa

toxina em solução aquosa observada pelas técnicas voltamétricas.

Os experimentos obtidos por DPV em soluções contendo Leu, Arg,

Ala, Glu e Asp não mostraram nenhuma resposta eletroativa, enquanto

que os compostos 2-AAA e SA foram oxidados na superfície do ECV.

Diante disso, os mecanismos de oxidação da MC-LR e dos seus produtos

de degradação formados em solução aquosa foram propostos.

A partir do estudo eletroanalítico realizado por DPV, uma curva

analítica foi obtida na faixa linear de concentração de 5 a 25 µmol L-1 com

um LD = 0,0014 µmol L-1 (1,39 µg L-1) e LQ = 0,0046 µmol L-1 (4,57 µg L-

1). Porém, os limites encontrados ainda não são considerados apropriados

para a determinação desta toxina em águas naturais, uma vez que o valor

limite estabelecido pela OMS para MC-LR total em água potável é de 1 µg

L-1. Além disso, eles não podem ser considerados aceitáveis, visto que

seus valores estimados estão muito abaixo do esperado para as

concentrações usadas na construção da curva analítica.

Conclusões

111

Lopes, I. C.

Os resultados obtidos durante a investigação in situ da interação da

MC-LR com dsDNA, por DPV e espectrofotometria UV-Vis, levaram a uma

possível descrição dessa interação.

A MC-LR leva a modificações na estrutura da dupla hélice do dsDNA

ao longo do tempo de incubação. Essa toxina interage e se liga às cadeias

de estrutura rígida do dsDNA e também induz a sua condensação,

confirmada pela diminuição da intensidade de corrente dos picos da dGuo

e dAdo observada em VPD e pelo desaparecimento quase total da banda

de absorção do dsDNA em espectrofotometria. Nenhum dano oxidativo ao

dsDNA por essa toxina foi observado nos períodos de incubação

estudados.

5.1 Perspectivas futuras

Utilização da técnica de VOQ no desenvolvimento de um método

analítico para a determinação da MC-LR em águas naturais, na

intenção de minimizar os problemas associados ao envenenamento

da superfície do eletrodo com os produtos de oxidação da toxina;

Desenvolvimento de um analisador automático flow-batch e

utilização de eletrodos quimicamente modificados na determinação

da MC-LR em águas naturais, visando uma maior sensibilidade

analítica;

Investigação da interação da MC-LR com dsDNA por MFA, a fim de

verificar as características morfológicas da superfície dos

biossensores eletroquímicos de DNA durante a interação com a

toxina.

CAPÍTULO 6

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências Bibliográficas

113

Lopes, I. C.

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