Estudo Farmacognóstico de Vernonia brasiliana (L.) Druce … · 2016-09-06 · À Dra. Eulália...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Estudo Farmacognóstico de Vernonia brasiliana (L.) Druce (Asteraceae) e determinação de sua Atividade Biológica

Lúcia Roberta de Souza Filizola

Dissertação Mestrado do Departamento de Ciências

Farmacêuticas /UFPE

Orientador : Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier

Recife- PE 2003

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Estudo Farmacognóstico de Vernonia brasiliana (L.) Druce (Asteraceae) e

determinação de sua Atividade Biológica

Lúcia Roberta de Souza Filizola

Dissertação de Mestrado, submetida ao Programa de Pós-Graduação do Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Área de concentração: Produtos Naturais

Orientador: Prof.Dr.. Haroudo Satiro Xavier

Recife – 2003

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Reitor

GERALDO JOSÉ MARQUES PEREIRA

Vice-reitor

YONY DE SÁ BARRETO

Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação

PAULO ROBERTO FREIRE CUNHA

Diretor do Centro de Ciências da Saúde

GILSON EDMAR GONÇALVES E SILVA

Vice- Diretor do Centro de Ciências da Saúde

JOSÉ THADEU PINHEIRO

Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

SILVANA CABRAL MAGGI

Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

ANTÔNIO RODOLFO DE FARIA

Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

DAVI PEREIRA DE SANTANA

Vice-Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

DALCI JOSÉ BRONDANI

LÚCIA ROBERTA DE SOUZA FILIZOLA

Estudo Farmacognóstico de Vernonia brasiliana (L.) Druce ( Asteraceae) e

determinação de sua Atividade Biológica

BANCA EXAMINADORA:

Membro Externo Titular

Prof. Dr. Nicácio Henrique da Silva

Departamento de Bioquímica da Universidade Federal de Pernambuco

Membros Internos Titulares

Profa. Dra. Eulália Camelo Pessoa de Azevedo Ximenes

Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco

Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier

Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco

Membro Externo Suplente

Profa. Dra. Rejane Magalhães de Mendonça Pimentel

Departamento de Botânica da Universidade Federal Rural de Pernambuco

Membro Interno Suplente

Profa. Dra. Maria Nelly Caetano Pisciottano

Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco

“ Sempre que duvidamos de nosso próprio caminho, ou perdemos a visão do

processo, temos de nos lembrar para onde estamos evoluindo, o que significa todo

o processo de viver. Alcançar o céu na Terra é a razão de estarmos aqui. E aqui

sabemos como se pode fazer isso...como será feito.”

(James Redfield)

AGRADECIMENTOS

À Deus, meus familiares e amigos, que me compreenderam nos momentos

de angústia e ausência, e me deram a certeza de que quando a perseverança é

nossa companheira diária, alcançar o nosso objetivo, torna-se inevitável.

Ao Prof. Haroudo Satiro Xavier, que me recebeu da melhor forma possível e

com quem tive o imenso prazer de compartilhar e aprender os ensinamentos de um

grande mestre e orientador.

Aos Amigos e Colegas do Laboratório Central de Saúde Pública (LACEN),

Dra. Ana Lima, Dra. Nancy Veloso , Benigna Silva, Elina Albino, Lígia Barbosa,

Cristina Durão, Cristiane Lima, Soraia de Souza, Silvana Farias, Cátia Menezes,

Cristina Menezes, Sandoval Vieira, Ismênia França, Carlos Alberto Lima, Letícia

Carneiro, Verônica Pereira, Maria dos Anjos Rodrigues, Cristina Monteiro, Zênia

Maciel, Denise Rodrigues, Manoel Albino, Tiago Gomes, Ângela Figueirôa,

Josemayre Luna, enfim, todos que compartilham comigo as tarefas diárias

profissionais, e que de forma direta ou indireta, sem exceção, me apoiaram.

À uma grande e eterna amiga, que me incentivou e participou de cada

momento desse trabalho. Agradeço imensamente a Deus pela bela oportunidade

que me deu de poder vivenciar e aprender o valor de uma grande amizade, Lúcia de

Fátima Francelino da Silva.

Aos colegas do mestrado: Ana Amélia Lira, Eduardo Gonçalves, Francisco

Jaime Júnior, Roseane Maria Costa, Risonildo Cordeiro, Rosiel Santos, Sabrina

Torres, Simone Bezerra, Thiago Aquino, Tereza Raquel, Valderes Almeida, Márcia

Francisca Linhares, pela amizade conquistada durante todo o tempo que estivemos

juntos.

À Drª Ana Albertina de Araújo pela ajuda e participação nesse trabalho.

Aos colegas do Laboratório de Farmacognosia, pela divertida e saudável

convivência, Diogo Florêncio, Lívia Barreto, Clébio Pereira, Karina Randau, Késia

Pontual, Frederico Duarte e Sarah Rodrigues.

À Dra. Evani Lemos, pela sua dedicação e amizade.

À Jovita Farias, pela amizade e dedicação.

Aos meus estimados amigos: Cristiano Soares da Rocha e Cristiane Rocha,

por toda nossa amizade, apoio e companheirismo na nossa jornada.

À Lindinalva Maria da Silva e minha avó, Maria José, por todo amor e carinho

dispensados.

À grande amiga e sogra, Sra. Lucíola Filizola, por todo apoio e incentivo.

Ao Prof. Francisco José de Abreu Matos, pela atenção e realização da

Espectrometria de Massas.

À Dra. Neide Shinohra, do Ins tituto de Nutrição da Universidade Federal de

Pernambuco, pela amizade e atenção.

À Dra. Mércia Caracciolo, do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, que

contribuiu para a realização dos testes farmacológicos.

À Dra. Eulália Ximenes, do Instituto de Antibióticos da Universidade Federal

de Pernambuco, pela sua amizade e cooperação técnica nos testes antimicrobianos.

À Dra. Ivone de Souza, pela amizade e auxílio na aquisição de animais para

os testes farmacológicos.

À Dra. Rejane Pimentel, Graça Chagas e Nilton, do Departamento de

Botânica da Universidade Federal Rural de Pernambuco, pela amizade,

profissionalismo e cooperação.

À Dra. Rita de Cássia Pereira, pela identificação do material botânico.

Ao Departamento de Química Fundamental (DQF) da Universidade Federal

de Pernambuco, pela realização dos ensaios espectrométricos.

Ao Prof. Dr. Parviz Afiatpour , Profª Maria do Carmo Fraga, Rejane Silva, Dr.

Almir Wanderley, Erick da Silva e Orion da Silva, do Departamento de Farmacologia

e Fisiologia da Universidade Federal de Pernambuco, pela amizade e realização dos

testes farmacológicos.

A todos os professores do Mestrado em Ciências Farmacêuticas, pelas

orientações e incentivo durante o curso.

À Secretária do Mestrado Iguacy Duque, por toda sua dedicação e amizade.

Ao Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPE, por disponibilizar as

instalações físicas para que fosse possível a realização deste trabalho.

Aos meus pais, Carlos e Maria José, meu avô, Luiz, que não se encontram

mais conosco, meu profundo agradecimento pela oportunidade que me deram de

poder conviver com pessoas e vivenciar momentos de grande sabedoria e

aprendizado, que jamais serão esquecidos.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS xii

LISTA DE TABELAS xiv

LISTA DE QUADROS xv

LISTA DE FIGURAS xvi

RESUMO xix

ABSTRACT xx

1. INTRODUÇÃO 21

2. OBJETIVOS

24

Capítulo I – Estudo Farmacognóstico

1. Farmacobotânica – Anatomia dos Órgãos Vegetativos

de Vernonia brasiliana (L.) Druce (Artigo aceito para

publicação na Revista Acta Farmacéutica Bonaerense)

25

Introdução 27

Materiais e Métodos 27

Resultados e Discussão 28

Referências Bibliográficas 31

2. Estudo Farmacoquímico

Introdução 35

2.1 Materiais e Métodos 38

2.1.2 Material Vegetal 38

2.1.3 Identificação do Material Botânico 38

2.2 Drogas e Reagentes 38

2.3 Equipamentos 40

2.4 Outros 40

2.5 Metodologia 41

2.5.1 Perfil Fitoquímico 41

2.5.2 Pesquisa de Polifenóis 43

2.5.3 Pesquisa de Saponinas

2.5.4 Pesquisa de Alcalóides

45

45

2.5.5 Pesquisa de Mono e Sesquiterpenos 45

2.5.6 Pesquisa de Triterpenos e Esteróides 46

2.5.7 Pesquisa de Iridóides 46

2.5.8 Pesquisa de Açucares Reduto res 47

2.6 Resultados e Discussão 47

2.6.1 Análises Cromatográficas do “Screening”

Fitoquímico das Folhas de V. brasiliana

47

2.6.2 Pesquisa de Polifenóis 48

2.6.3 Pesquisa de Saponinas 51

2.6.4 Pesquisa de Alcalóides 51

2.6.5 Pesquisa de Monoterpenos e Sesquiterpenos 51

2.6.6 Pesquisa de Terpenóides e Esteróides 52

2.6.7 Pesquisa de Iridóides 53

2.6.8 Pesquisa de Açúcares Redutores 54

2.7 Isolamento do Acetato de β - amirina (Molécula B) 56

2.7.1 Isolamento de dois Flavonóides (Molécula C1 e E2) 57

2.7.2 Caracterização das Moléculas C1, E2 e B 58

Capítulo II – Atividade Biológica de Vernonia brasiliana

(L.) Druce

1. Atividade Antimicrobiana 80

1.1 Revisão da Literatura 80


1.2.1 Microrganismos 81

1.2.2 Solventes e Padrões Primários 82

1.2.3 Meios de Cultura 82

1.2.4 Extratos Vegetais 82

1.3 Metodologia 83

1.3.1 Preparação dos Extratos Brutos 83

1.3.2 Preparação dos Inóculos Microbianos 84

1.3.3 Semeio 84

1.3.4 Leitura 85


2. Atividade Farmacológica 91

2.1 Revisão da Literatura 91


2.2.1 Animais 93

2.2.2 Extratos Vegetais 93

2.2.3 Drogas e Reagentes 93

2.2.4 Equipamentos e Materiais 94

2.3 Metodologia 94

2.3.1 Experimentos in vivo 94

2.3.1.1Observações Gerais e Toxicidade Aguda 94

2.3.1.2 Atividade Antinflamatória 95

2.3.1.3 Atividade Antiálgica 95


3. Conclusão Geral 97

Referências Bibliográficas 99

Anexos 105

LISTA DE ABREVIATURAS

AcOEt – Acetato de etila

AcOH- Ácido acético

AlCl3 – Cloreto de Alumínio

CCD – Cromatografia em Camada Delgada

CDCl3 – Clorofórmio Deuterado

ºC – Graus Celsius

cf. – Conferir

C – Centro

D – Direita

DAUFPE – Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco

E – Esquerda

EBM – Extrato Bruto Metanólico

EM – Espectro de Massas

H 3 BO3 – Ácido Bórico

HCOOH –Ácido Fórmico

IC – Isolado clínico

IPA – Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária

IV – Infravermelho

J – Constante de Acoplamento

MeOH – Metanol

mg - miligrama

mL – Mililitro

mm – Milímetro

NaOAc – Acetato de Sódio

NaOMe- Metóxido de Sódio

nBuOH – Butanol Normal

NEU – Difenilborinatodeamino2etila

nm - Nanômetros

P1 – Padrão

P2 - Padrão

pH – Potencial hidrogeniônico

ppm – partes por milhâo

Rf – Relação de Frente

RNM 1 H – Ressonância Nuclear Magnética Protônica

Tab. – Tabela

TMS - Tetrametilsilano

UFC – Unidade Formadora de Colônia

UFPE – Universidade Federal de Pernambuco

UI – Unidade Internacional

U.V – Ultravioleta

λmáx – Lâmbida Máximo (máximo comprimento de onda)

β - Beta

α - Alfa

µg – Micrograma

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos de Vernonia

brasiliana.

86

Tabela 2 – Atividade Antimicrobiana dos Flavonóides C 1, E2 ,

Nistatina e Anfotericina B.

87

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Componentes químicos encontrados em diversas espécies

de Vernonia.

35

Quadro 1.1 – Estruturas de algumas substâncias descritas no gênero

Vernonia

37

Quadro 2– Fases móveis e reveladores utilizados para identificação de

metabólitos secundários em Vernonia brasiliana (L.) Druce

42

Quadro 3 – Metabólitos secundários encontrados no extrato bruto

metanólico das folhas de Vernonia brasiliana

47

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Vernonia brasiliana (L.) Druce - A. ramo vegetativo; B. ramo

florífero; C. inflorescência capítulo; D. estilopódio; E. brácteas involucrais

pilosas; F. receptáculo; G. cipsela.

33

Figura 2 – Vernonia brasiliana (L.) Druce - . A. pecíolo; B. raiz; C. caule;

D. nervura principal; E. epiderme adaxial com tricoma glandular capitado

(seta); F. epiderme abaxial com tricomas e estômatos anomocíticos; G.

mesofilo; H. margem foliar; I. tricoma não-glandular.

34

Figura 3 – Hábito Geral de Vernonia brasiliana (L.) Druce . 22

Figura 3.1 - Inflorescência de Vernonia brasiliana (L.) Druce 23

Figura 3.2 -Galha com presença de cecidias Vernonia brasiliana (L.)

Druce

23

Figura 4 - Cromatograma mostrando polifenóis encontrados em V.

brasiliana, no detalhe a molécula característica de derivado cinâmico

48

Figura 5 - Cromatograma no ultravioleta, mostrando os flavonóides

encontrados em V.brasiliana

49

Figura 5.1 - Cromatograma no visível, mostrando os flavonóides


49

Figura 6 - Cromatograma no ultravioleta de agliconas de flavonóides

encontradas nas folhas de V. brasiliana.

50

Figura 7- Cromatograma de Mono e Sesquiterpenos encontrados em V.

brasiliana

52

Figura 8- Cromatograma de Terpenóides, padrão de β - amirina e

padrão de β - sitosterol

53

Figura 9 – Cromatograma de Iridóides encontrados nas folhas de V.

brasiliana.

54

Figura 10 – Cromatograma de Açúcares (visível) e padrão glicose 55

Figura 11 - Flavonóide – origem das absorções no ultravioleta 58

Figura 12 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula

C1 em MeOH

61


C1 em MeOH/NaOMe.

61

Figura14 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula

C1 em MeOH/ AlCl3

62


C1 em MeOH /NaOAc

62


C1 em MeOH/ AlCl3 + HCl

63

Figura17 - Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula

C1 em MeOH/ NaOAc + H 3 BO3

63

Figura 18 - Espectro de H RMN, CDCl3, TMS, 300MHz da Molécula C1 64

Figura 19 - 5-hidroxi –7,4’ - dimetiléter flavona (Molécula C1) 65

Figura 20 – Espectro de Absorção na região do Ultraviole da Molécula E2

em MeOH.

68


E2 em MeOH / NaOMe

68


E2 em MeOH /NaOAc

69


E2 em MeOH /AlCl3

69


E2 em MeOH /AlCl3 + HCl

70

Figura 25- Espectro de Absorção na região do Ultravioleta da Molécula

E2 em MeOH/NaOAc + H 3 BO3

70

Figura 26 - Espectro de H RMN ,CDCl3 , TMS, 300MHz da Molécula E2 . 71

Figura 27 – Espectro Ampliado de H RMN ,CDCl3 , TMS, 300MHz da

Molécula E2 .

72

Figura 28 – 5,8,4’-trihidroxi-3,6,7-trimetiléter flavonol (Molécula E2) 73

Figura 29 – Espectrometria de Massas da Molécula B 75

Figura 30 - Principais fragmentos no Espectro de Massas da Molécula B

76

Figura 31 - Espectro de Absorção na região do Infravermelho da

Molécula B

77

Figura 32 - Espectro de HRMN, CDCl3 ,TMS, 300 MHz da Molécula B 78

Figura 33 – Estrutura do Acetato de β - Amirina. 79

Figura 34 - Atividade Antifúngica das Frações Flavanoídicas sobre

Candida albicans (DAUFPE 1007 e IC) e Candida krusei (A, B, C e D)

89

Figura 34.1 - Atividade Antifúngica das Frações Flavanoídicas sobre

Candida albicans (DAUFPE e IC) e Candida krusei ( E, F, G, H, I )

90

RESUMO

Vernonia brasiliana (L.) Druce – Asteraceae, é um arbusto comumente

encontrado em áreas ruderais do grande Recife e restos da Mata Atlântica do estado

de Pernambuco, sendo vulgarmente conhecida como “Tramanhem”, guardando

parentesco com inúmeros “Assa-Peixes” do gênero Vernonia. De longa data suas

folhas são empregadas na medicina popular, para inibir o reumatismo inflamatório,

cólicas hepáticas e em casos de hemorragia. O presente trabalho esboça um estudo

farmacognóstico com as folhas do vegetal, onde os aspectos Farmacobotânicos e

Farmacoquímicos são aprofundados, fornecendo subsídios à caracterização da

matéria prima e correlação com atividade antimicrobiana encontrada frente às

bactérias Gram positivas, Micrococcus flavus e Staphylococcus aureus, e leveduras,

Candida albicans e Candida krusei, frente às duas moléculas polifenólicas isoladas

(metoxiflavonas) e caracterizadas por análise espectroscópica (UV, RMN 1 H e EM).

Estas moléculas apresentaram atividade antifúngica, inibindo até 23 mm.

Igualmente, foi isolado e caracterizado o Acetato de β-amirina, triterpeno sem

correlação com as indicações etnofarmacológicas. Ensaios de toxicidade, antiedema

e analgesia também foram efetuados, sem apresentarem um significado maior. Um

“screening” cromatográfico com extrato foliar metanólico mostrou a presença de

polifenóis (glicosídeos de flavonóides, derivados cinâmicos e agliconas), terpenóides

(triterpenos, sesquiterpenos, monoterpenos, incluindo dois iridóides) e açúcares

redutores, ausência de cumarinas, fenilpropanoglicosídeos, taninos

(proantocianidinas condensadas e gálicos), saponósidos e alcalóides.

ABSTRACT

Vernonia brasiliana (L.) Druce – Asteraceae, is a shrub , scattered in the

Atlantic forests of the State of Pernambuco and around the city of Recife. It is known

locally as Tramanhem. Its leaves are utilized in folk medicine for the treatment of

rheumatoid arthritis, inflammation, hepatic colic and in the case of bleeding.The main

interest of present work out lined on pharmacognostic study, where the emphysize

was placed on pharmacobotany and pharmacochemistry aspect of its leaves. On

antibacterial study , its inhibitory properties on gram positive strain and yeasts were

observed. Two polyphenol molecules were isolated (methoxyflavonoids), and

characterized by spectroscopy ( UV, NMR, Mass ). These molecules revealed

antifungus activity. Also from the leaves were isolated and characterized ß-amirine

acetate, an triterpene without obvious correlation with popular use. The metanolic

extract of leaves of Vernonia brasiliana did not reveal any toxic effect up to 2 g/kg of

body weight, nor display analgesic or antinfammatory properties in rats.

Chromatography screening of metanolic extract of leaves, demonstrate the presence

of polyphenols (glycosides, flavonoids and aglicons), terpenoids (triterpenes,

sesquiterpenes, monoterpenes, including two iridoids) and sugar reducers, but

absence of cumarins, phenylpropanoglycosides, tannins (proantocianidins, galics),

saponins and alkaloids.

1 − I N T R O D U Ç Ã O

Em nosso país perde-se no tempo a contribuição de inúmeras espécies de

Vernonia ao receituário popular das plantas medicinais, reconhecidas,

genericamente, por seus ramos tênues e longos, como “assa-peixe,” o que traduziu

em algum momento, a aplicação mais generalizada desse vegetal (cf. FIGURAS 3,

3.1 e 3.2 ).

No Nordeste, cerca de 60 espécies foram descritas, medrando nas diversas

zonas do semi-árido, muito mais acentuadamente em clareiras e formações

secundárias da zona da mata (MATOS,1997). Particularmente no Recife e região

Metropolitana, destacando-se as espécies V. brasiliana (L.) Druce, V. condensata

Baker (exótica, nativa da Africa), V. cinerea Less e V. scorpioides Pers.

O enfoque de nosso trabalho recaiu sobre o primeiro taxon citado, por

algumas razões maiores: sua primeira citação botânica na região, remonta à época

dos primeiros naturalistas do Brasil, Guilherme Piso e Jorge Marcgrave, aportando

ao Recife nos últimos meses de 1637 e início de 1638 (PICKEL, 1949). O vegetal

(notadamente suas folhas) sempre foi tido pelas pessoas simples interioranas, como

excelente remédio contra cólicas hepáticas, hemorragias, corizas fortes, hematomas,

e ainda na cura de belides e outras moléstias da visão (CÉSAR, 1956). Reforçou,

ainda, nossa escolha, os estudos preliminares com esse vegetal, no Instituto de

Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, demonstrando a ocorrência

em suas folhas de um princípio antimicrobiano ativo contra Staphylococcus aureus

Rosenbach, em provas de disco de papel de filtro, estável mesmo quando aquecido

a 100 ºC, durante 30 minutos em pH ácido (D´ALBUQUERQUE et al.,1961).

Adicione-se a esses aspectos a ocorrência abundante da espécie em locais

próximos do Campus, traduzindo-se numa maior facilidade de obtenção de material

vegetal em perfeitas condições para estudo fitoquímico e de bioatividade, eixos

ainda escassamente estudados, o que nos pareceu compor um motivo singular e

relevante execução desse trabalho.

FIGURA 3 -Hábito Geral de Vernonia brasiliana (L.) Druce .

FIGURA 3.1 - Inflorescência de Vernonia brasiliana (L.) Druce

FIGURA 3.2 -Galha com presença de cecidias de Vernonia brasiliana (L.) Druce

2 − O B J E T I V O S

GERAL

Validação e caracterização botânica, e determinação de sua atividade

biológica (microbiológica e farmacológica) de metabólitos secundários de interesse

farmacológico presentes nas folhas de Vernonia brasiliana .

ESPECÍFICOS

Ø Caracterização Botânica;

Ø Perfil Cromatográfico da espécie Vernonia brasiliana (L.) Druce;

Ø Extração , isolamento e purificação de metabólitos secundários; e

Ø Determinação das atividades biológicas (microbiológicas e farmacológicas)

dos extratos brutos e substâncias isoladas.

C a p í t u l o I : E s t u d o F a r m a c o g n ó s t i c o 1 . F a r m a c o b o t â n i c a Artigo enviado e aceito para publicação – Revista Acta Farmacéutica

Bonaerense (cf. ANEXO A)

ANATOMIA DOS ÓRGÃOS VEGETATIVOS DE VERNONIA BRASILIANA (L.) DRUCE1

ANATOMY OF THE VEGETATIVE ORGANS OF VERNONIA BRASILIANA (L.) DRUCE1

LÚCIA ROBERTA DE SOUZA FILIZOLA (*)2, REJANE PIMENTEL3, KARINA

PERRELLI RANDAU2, HAROUDO SATIRO XAVIER.2

2Departamento de Ciências Farmacêuticas, Laboratório de Farmacognosia, Universidade

Federal de Pernambuco, Av. Arthur de Sá, S/N, 50740-521- Recife - PE-Brasil. E-mail:

[email protected]

3Departamento de Biologia, Laboratório de Fitomorfologia de Fanerógamas, Universidade

Federal Rural de Pernambuco, Av. Manoel de Medeiros, S/N- 52171-900, Dois Irmãos,

Recife-PE-Brasil. E-mail: [email protected]

Resumo

Descrições anatômicas de raiz, caule e folha de Vernonia brasiliana (L.) Druce mostraram

tricomas não-glandulares em forma da letra T encontrados em toda a planta, principalmente

na epiderme inferior das folhas. Alguns tricomas capitados foram observados na epiderme

inferior foliar. Na raiz, os feixes vasculares foram do tipo colateral circundados por uma faixa

descontínua de fibras agrupadas. A região medular apresentou células com dois tamanhos,

com as menores na posição central.

Palavras chaves: Vernonia brasiliana, Asteraceae, folha, caule, raiz.

Summary

Anatomical descriptions of root, stem and leaf of Vernonia brasiliana (L.) Druce (Asteraceae)

were made. Transversal and paradermal free-hand sections of fresh material were stained with

safranin and astra blue. All the analysis was done in digital images under a precalibrated light

microscope. Non-glandular two-arms T-shaped trichomes were found in the whole plant,

mainly in the lower epidermis of the leaves. Some capitate trichomes in the lower epidermis

of the leaves were observed. In root, the vascular bundles were collateral with a discontinuous

band of clustered fiber cells. The pith region showed two sizes of parenchyma cells with the

smaller cells in the central position.

Key Words: Vernonia brasiliana , Asteraceae, leaf, stem, root.

Introdução

A família Asteraceae é encontrada na América do Sul, principalmente no Brasil,

Bolívia e Venezuela (Gleason, 1923a,b; Pruski, 1997), apresentando cerca de 1535 gêneros e

aproximadamente 23000 espécies (Bremer, 1994, 1996). Para o Brasil são referenciados cerca

de 180 gêneros (Barroso et al., 1991) e, aproximadamente, 900 espécies de Vernonia

(Cronquist, 1981), amplamente distribuídos em toda a região norte e nordeste. Seus

representantes ocorrem como ervas, arbustos e rastejantes (Leitão Filho, 1972).

Vernonia brasiliana (L.) Druce é vulgarmente conhecida como assa-peixe, assa- peixe

preto, assa-peixe roxo, pau de múquem, pau de muqueca e manjericão de cavalo (Barros,

2002). Esta espécie se destaca por sua ação antioxidante (Sims,1972) , tendo sido

extensivamente estudada, principalmente devido à presença de alguns flavonóides capazes de

exterminar o Trypanosoma cruzi (Carvalho, 1991).

Esta espécie é encontrada erroneamente identificada como V. scabra Pers em

diferentes herbários, provavelmente como conseqüência da identificação feita por Baker

(1873, citado por Barros, 2002). Uma vez que esta espécie é amplamente usada na medicina

popular por pessoas mais carentes, uma acurada identificação é de vital importância para que

a mesma não seja confundida com uma outra planta que, além de não solucionar um

determinado problema, ainda provoque o aparecimento de outros. O objetivo deste estudo foi

investigar a estrutura anatômica dos órgãos vegetativos de Vernonia brasiliana (L.) Druce,

visando resolver prováveis problemas na sua identificação taxonômica.

Material e Métodos

O material tipo foi depositado no Herbário IPA (Empresa Pernambucana de Pesquisa

Agropecuária), sob o número IPA 59515, identificado pela Dra. Rita de Cássia Araújo

Pereira. Indivíduos de V. brasiliana (L.) Druce foram coletados num fragmento de Floresta

Atlântica, localizado no município do Curado, Recife, estado de Pernambuco, Brasil.

Material fresco de raízes, caule e folhas, incluindo o pecíolo, foram fixados em FAA,

por 48 horas (Johansen, 1940; Sass, 1951) e corados com safranina e azul de astra (Krauter,

1985). As características anatômicas foram analisadas em cortes transversais, à mão livre.

Epidermes de ambas as superfícies foliares foram clarificadas com hipoclorito de sódio 30%,

neutralizados em água acética 1%, coradas com safranina e azul de astra, montadas em

glicerina 50% (Johansen, 1940; Sass, 1951; Krauter, 1985) e analisadas sob microscópio

precalibrado (Olympus B071). Todas as análises foram feitas em imagens digitais, usando o

programa de análise de imagens Image Tool 3.0 (UTSCHSA, 2002). Os tipos estomáticos

foram identificados segundo Van Cotthem (1970).

A descrição morfoanatômica apresentada baseou-se nos critérios e parâmetros

utilizados por Oliveira, Akisue & Akisue (1998).

Resultados e Discussão

Vernonia brasiliana (L.) Druce (Fig. 1) é um arbusto perene variando entre 0,5 e 2,5

m de altura. Caule muito ramificado com ramos cilíndricos, verdes a amarronzados e tricomas

abundantes. Folhas alternas, simples e pecioladas com estípulas persistentes. Pecíolo

achatado, inserção marginal, biconvexo e base arredondada. Lâmina lanceolada,

membranácea, delgada, margem lisa e nervação peninérvea. O limbo é de consistência

membranácea com algumas espécies apresentando ápice agudo, geralmente truncado, base

arredondada, bordo liso com 15 – 40 mm de comprimento e 10 – 20 mm de largura. Flores

reunidas em inflorescências do tipo capítulo, racemiformes e congestas. Coloração

violácea-pálida.

De modo geral, os caracteres morfológicos encontrados nesta espécie correspondem

àqueles apresentados para o gênero por Althof (1998) e Nunes (1982).

As raízes, em vista transversal, mostraram contorno perfeitamente circular (Fig. 2B)

revestidas por epiderme simples seguida por parênquima cortical e uma faixa descontínua de

fibras agrupadas. O sistema vascular é composto por quatro feixes colaterais e parênquima

medular.

O caule apresentou contorno sinuoso, em vista transversal (Fig. 2C), com revestimento

de epiderme simples contendo tricomas não glandulares. Os tricomas são do tipo

não-glandular, consistidos de um pedúnculo 7-seriado, encimado por uma única célula que,

em posição transversal, assemelha-se a dois braços, já descritos para Vernonia por Solereder

(1908, citado por Metcalfe & Chalk, 1989). O cilindro central apresentou feixes vasculares

maiores nas margens mais sinuosas e de 3 a 7 feixes vasculares menores entre eles. A medula

está constituída por dois tamanhos de células parênquimáticas com as menores na posição

central.

A vista transversal do pecíolo (Fig. 2 A) mostrou contorno côncavo-convexo com

feixes vasculares colaterais, 3 a 5 maiores e 3 a 4 menores. As células epidérmicas, em vista

frontal, mostraram paredes anticlinais levemente sinuosas, em ambas as superfícies foliares

(Fig. 2E,F). A epiderme foliar é simples, uniestratificada e revestida por uma cutícula

delgada, em ambas as superfícies (Fig. 2G). Foram identificados estômatos anomocíticos (Fig.

2F) na face inferior, situados ao mesmo nível das demais células epidérmicas. Pêlos

glandulares e não-glandulares estão presentes em ambas as superfícies foliares, apresentando

uma maior densidade na face inferior (Fig. 2H). Os pêlos não-glandulares (Fig. 2I)

consistiram de um pedúnculo 7-seriado, encimado por uma única célula que, em posição

transversal, apresenta a forma da letra T. Os pêlos glandulares capitados (Fig. 2E, seta)

apresentaram um pedúnculo unicelular encimado por uma célula globular.

A nervura principal (Fig. 2D), na porção mediana da lâmina foliar, apresentou três

feixes vasculares colaterais de tamanhos similares. O mesofilo dorsiventral (Fig. 2G) está

constituído de uma camada de parênquima paliçádico sob a epiderme superior e 4-5 camadas

de parênquima lacunoso.

Em geral, os representantes da família Asteraceae apresentam uma ampla variação na

estrutura anatômica em resposta às condições ambientais (Metcalfe & Chalk, 1989). Estes

autores afirmaram que a despeito desta ampla variação, os tricomas identificados nas

Asteraceae poderiam ser utilizados como caractere diagnóstico (Carlquist, 1958/1961 citado

por Metcalfe & Chalk, 1989).

Os tricomas observados em V. brasiliana apresentaram dois braços, com braços

desiguais em forma de T (Fig. 2I), foram similares aos tricomas encontrados em V.

senegalensis Less. (Metcalfe & Chalk, 1989). Trabalhos anteriores destes autores

apresentaram características semelhantes de diferentes gêneros de Asteraceae, contudo essa

informação foi restrita a poucas espécies nesta família sem qualquer referência à V. brasiliana

(L.) Druce.

A literatura disponível é abundante acerca da existência de tricomas glandulares em

indivíduos pertencentes ao gênero Vernonia. A ocorrência de pêlos glandulares capitados no

caule e folhas nesta espécie não foi registrada. O potencial sistemático desta característica

anatômica parece óbvio, mas a eficiência na sua aplicação necessitará de observações

comparativas entre as diferentes espécies do gênero Vernonia.

Provavelmente, as mais importantes características anatômicas que devem ser

consideradas bons descritores e atributos diagnóstico em V. brasiliana (L.) Druce são: 1) dois

tipos de tricomas; não-glandular, com dois braços com pedúnculo em forma de T e glandular,

com 1-pedúnculo e 1-cabeça, abundantes na epiderme foliar inferior, 2) faixa descontínua de

fibras agrupadas no cilindro vascular das raízes, 3) células com dois tamanhos no parênquima

medular do caule e, 4) contorno fortemente sinuoso no caule com grandes feixes vasculares

nas áreas mais sinuosas.

A grande quantidade de tricomas nas epidermes de V. brasiliana está, provavelmente,

associada com sua atividade medicinal, uma vez que estas estruturas são o maior reservatório

de substâncias produzidas pelas plantas. Estudos em plantas medicinais indicam a relevância

considerável da presença de pêlos como células de armazenamento. Alguns deles podem

armazenar terpenóides (Fahn, 1988), derivados de floroglucinol (Hurre et al., 1979 citados por

Fahn, 1988) além de outros altamente importantes no uso medicinal.

Nas células do parênquima radicular e caulinar não foi observado armazenamento de

amido ou outro tipo de material de reserva, provavelmente porque esta planta está bem

estabelecida e bem adaptada às condições ambientais onde ela foi coletada.

Vernonia é um gênero que contém muitas espécies e oferece muitas oportunidades

para estudos anatômicos comparativos além da pesquisa original de Metcalfe & Chalk (1989).

Em conseqüência de seu uso extensivo pela população e pela indústria como medicamento, é

necessário examinar estágios sucessivos do desenvolvimento dos órgãos vegetativos,

principalmente as folhas, em qua lquer estudo comparativo de V. brasiliana (L.) Druce.

Referências bibliográficas (1) Gleason, H. A. (1923) a. American Journal of Botany. 10:297-309.

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Press, Oxford, págs. 64-98.

(21) Fahn, A. (1988) Phyton 28:13-26.

Figura 1. Vernonia brasiliana (L.) Druce. A. ramo vegetativo; B. ramo florífero;

C.inflorescência capítulo; D. estilopódio; E. brácteas involucrais pilosas;

F.receptáculo; G. cipsela.

Figura 2. Vernonia brasiliana (L) Druce. A. pecíolo; B. raiz; C. caule; D. nervura principal;

E. epiderme adaxial com tricoma glandular capitado (seta); F. epiderme abaxial com tricomas

e estômatos anomocíticos; G. mesofilo; H. margem foliar; I. tricoma não-glandular.

2 Estudo Farmacoquímico

Introdução

O gênero Vernonia, aportando um grande número de espécies, certamente

abriga um vasto perfil fitoquímico com praticamente representantes de todos os

grupos de metabólitos secundários conhecidos, predominando os triterpenos,

esteróides, sesquiterpenos e flavonóides. Essas duas últimas classes de compostos

têm sido inclusive utilizadas como marcadores taxonômicos (CARVALHO,1999). Os

QUADROS 1 e 1.1 incluem e resumem alguns exemplos de moléculas e estruturas

químicas, respectivamente, já isoladas e caracterizadas nesse gênero (Base de

Dados NAPRALERT, 2003).

Quadro 1 - Componentes químicos encontrados em diversas espécies de Vernonia.

Espécie Compostos Químicos Partes da

Planta

Referência

V. acuminata acetato de Lupeol

(triterpeno)

PI Nestor, P.S./1984

V. altissima apigenina-7-metoxi

(flavona)

PA Wollenwerber, E.

et al./1989

V. angusticepis geandolide-3-oxo

(lactona sesquiterpênica)

acetato de lupeol

(triterpeno)

PA

PI

Budesinsky, M.et al

1994.

V. alvinii lupeol

(triterpeno)

R Bohlmann, F. et al.

1981

V. arkansana acetato de lupeol

(triterpeno)

β - sitosterol

(esteróide)

PA

R

Bohlmann, F. et al.

1991

V. arborea Zaluzanin D

(lactona sesquiterpênica)

R Bohlmann, F. et al.

1981

V. amygdalina quercetina

(flavonol)

FL Rwangabo, P.C.

et al /1986

V. brasiliana β-amirina ,germanicol e

lupeol (triterpenos)

F Almeida,T., M. et al.

1997

V. cinerea Acetato de α -amirina

(triterpeno)

β - sitosterol (esterol)

R Misra,T.N.et al.

1984

V. condensata lupeol (triterpeno) PA Bohlmann, F. et al.

1981

V. elaeagnifolia quempferol

(flavonol)

I Subramanian, N.S;

Nagarjan,S.,1981.

V. erdvendbergii lupeol (triterpeno)

acetato de lupeol

( triterpeno)

PA

Dominguez, X.A. et al

1986

V. fasciculata genkwanina (flavona) F Narain, N.K./1997

V.flexuosa apigenina e astragalina

(flavonol)

F King,B.L.; Jones,S.B. /

1982

V. galamensis

ssp.

galamensis

quercitrina, quercetina

(flavonol)

PI Awaad,A.S.,Grace,

M.H,

2001

V. jalcana genkwaniana

(flavona)

PA Jakupovic,J. et al

1986

V. simplex apigenina-8-c-glicosídeo,

luteolina (flavona)

quercitrina (glicosídeo de

flavonol)

F King,B.L., Jones,S.B.

1982

Legenda : R = raiz, C= caule, F= folhas, PA = partes aéreas, PI = planta inteira , FL= flor , I = inflorescência

QUADRO 1.1 – Estruturas de algumas substâncias descritas no gênero Vernonia.

O

OOH

OH

OH

OH

CH2

CH3

CH3CH3

CH3 CH3

OH

CH3

CH3

H

H

H

O

O

O

O

OHOH

OH

OH

OH

CH3

OH

OH

Luteolina Lupeol Quercitrina

O

OOH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

O

OOH

O

OH

CH3

Apigenina Quercetina Genkwanina

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OHO

OH

HO OH

OH

CH3

CH3CH3

CH3CH3

OH

CH3

CH3CH3

Quempferol Vitexina Germanicol

2.1 Materiais e Métodos

2.1.2 Material Vegetal

O material vegetal utilizado para o estudo fitoquímico, foi obtido de indivíduos

adultos, constituídos de folhas, raiz e flor. Coletado no período compreendido entre

Dezembro de 2001 a Fevereiro de 2003, nos arredores da floresta atlântica,

localizada no Bairro do Curado, Recife.

Após a coleta, o material foi acondicionado em sacos plástico e conduzido ao

laboratório de Farmacognosia do Departamento de Farmácia. A secagem e

conservação foram realizadas à temperatura ambiente (30°C), em dependência

arejada, durante 5 dias, sendo então acondicionado em recipientes plásticos

apropriados e assim mantidos, enquanto não utilizado.

2.1.3 Identificação do Material Botânico

A identificação botânica do material vegetal foi efetuada na Empresa

Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA, em cujo herbário ficou depositada

exsicata sob o número 59515, a cargo da Dra. Rita de Cássia Araújo Pereira.

2.2 Drogas e Reagentes

Ø Acetato de Etila P.A (Merck);

Ø Acetona P.A (Merck);

Ø Ácido Clorídrico P.A (Merck);

Ø Ácido Fórmico P.A (Merck);

Ø Ácido Sulfúrico P.A (Merck);

Ø Água Destilada;

Ø Anidrido Acético P.A (Merck);

Ø Benzeno P.A (Merck);

Ø Carvão Ativado P.A (Merck);

Ø Cloreto de 2,3,5 – trifeniltetrazolio P.A (Merck);

Ø Clorofórmio P.A (Merck, Reagen);

Ø Difenil Boriloxietilamina P.A (Fluka);

Ø Etanol P.A (Merck);

Ø Hidróxido de Amônio P.A (Merck);

Ø Hidróxido de Sódio P.A (Merck);

Ø N-Hexano P.A (Reagen);

Ø Metanol P.A (Merck,Vetec e Reatif)

Ø Polietileno Glicol 400 P.A (Merck);

Ø Subnitrato de Bismuto (Merck);

Ø Vanilina P.A (Carlo Erba);

Ø ß- Sitosterol (Extrasynthese);

Ø ß- Amirina (Extrasynthese) e;

Ø Quercetina (Merck).

2.3 Equipamentos

Ø Balança Analítica;

Ø Balança semi-analítica;

Ø Câmara Ultra-Violeta (250-365 nm);

Ø Destilador;

Ø Estufa;

Ø Multiprocessador;

Ø Placa aquecedora;

Ø Câmara Fotográfica Digital;

Ø Bomba de vácuo;

Ø Aparelho de Soxhlet;

Ø Rotaevaporador Buchi Instruments;

Ø Espectrofotômetro de Ultravioleta, Perkin Elmer, Lambda 6;

Ø Espectrofotômetro de HRMN, Varian, modelo Unity Plus, 300MHz; e

Ø Espectrofotômetro de Massas R1010C, Delsi-Nermag.

2.4 Outros

Ø Borrifadores para Revelação em Cromatografia em Camada Delgada (CCD);

Ø Colunas Cromatográficas;

Ø Placas Cromatográficas (Merck);

Ø Cubas para CCD;

Ø Duolite S-861;

Ø Sephadex LH-20;

Ø Gel de Sílica 60 Merck;

Ø Celulose Machery - Nagel;

Ø Poliamida Polyclar AT – Serva; e

Ø Filmes Fotográficos -Kodak.

2.5 Metodologia

2.5.1 Perfil Fitoquímico

Obedecendo aos procedimentos do Laboratório de Farmacognosia, baseados

nos estudos de HARBORNE (1998), WAGNER (1996) , MARKHAM (1982) e

XAVIER (2001), alíquotas de 15 µL de uma infusão metanólica das folhas do vegetal

(10% p/v) foram submetidas à análise cromatográfica, usando-se placas prontas de

gel de sílica 60 Merck, art.105553, diversos sistemas de desenvolvimento e

reveladores adequados.

Dessa forma foram obtidos os cromatogramas pertinentes aos diversos

grupos de moléculas majoritárias, possivelmente presentes, tais como: polifenóis

(cumarinas, flavonóides, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, esteróides,

proantocianidinas condensadas, leucoantocianidinas, ácido gálico e taninos

hidrolisáveis), terpenos (monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, iridóides e

saponinas), alcalóides e açucares redutores, como descrito no QUADRO 2.

QUADRO 2 – Fases móveis e reveladores utilizados para identificação de

metabólitos secundários em Vernonia brasiliana (L.) Druce.

Metabólitos Sistema de Eluição Revelador Referência

Alcalóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

(100:11:11:27v/v)

Dragendorff Wagner,1984

Monoterpenóides,

Sesquiterpenóides e

Diterpenóides

Benzeno-AcOEt (97: 3v/v) Vanilina

Sulfúrica

Wagner,1996

Triterpenóides e

Esteróides

AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

(100:0,5:0,5:0,5 v/v)

Liebermann/

Burchard

Harborne,1998

Iridóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

(100:11:11:27 v/v) Vanilina

Sulfúrica Wagner,1984

Saponinas AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

(100:11:11:27 v/v) Vanilina

Sulfúrica Wagner,1996

Açucares n-BuOH-Me2CO-Tampão

fosfato pH= 5,0(40:50:10

v/v)

Trifeniltetrazólio Metz,1961

Cumarinas Éter-Tolueno-AcOH 10%

(50:50:50 v/v)

U.V Wagner,1996

Derivados Cinâmicos AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

(100:11:11:27 v/v)

NEU Wagner,1996

Flavonóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

(100:11:11:27 v/v)

NEU Wagner,1984;

Markham,1982.

Fenilpropanoglicosídeos AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

(100:11:11:27 v/v)

NEU Wagner,1996

Proantocianidinas

Condensadas e

Leucoantocianidinas

AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

(100:11:11:27 v/v)

Vanilina

Clorídrica

Robertson,1956

Taninos Hidrolisáveis

(ácido gálico)

AcOEt-tolueno-HCOOH

(10:3:1 v/v)

Alumen de

Ferro 1%

NEU

Stiasny,1912.;

Xavier, 2001

2.5.2 Pesquisa de Polifenóis

Incluem três grupos de moléculas, em função do procedimento:

I) Cumarinas, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos e

Flavonóides

II) Proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas

III) Taninos gálicos.

A pesquisa do grupo I é realizada obtendo-se dois cromatogramas, em um

deles emprega-se a fase móvel polar, acetato de etila - ácido fórmico - ácido acético

- água (100:11:11:27 v/v), destinado a moléculas polares (glicosídeos), o outro com

a mesma fase móvel em proporções menores, tornado o sistema menos polar

(100:1:1:1 v/v), destinado a moléculas livres (agliconas).

De acordo com esta metodologia a presença de cumarinas se caracteriza no

cromatograma por mancha com intensa fluorescência azul, quando observado sob

lâmpada ultravioleta (UV-365 nm). Após revelação com o reagente de NEU

(difenilborinatodeamino2etila), torna-se praticamente inalterada aquela coloração à

luz ultravioleta, os derivados cinâmicos e fenilpropanoglicosideos, apresentam

fluorescência azul-claro antes da revelação com o reagente de NEU, após a sua

aplicação e observação do cromatograma à 365nm, os derivados cinâmicos

adquirem forte fluorescência azul e os fenilpropanoglicosídeos fluorescência verde-

amarelada. Os flavonóides, por sua vez, em sua grande maioria, antes da revelação

com o reagente de NEU, mostram fluorescência à luz ultravioleta cor marrom escuro,

após a revelação adquire fluorescência que varia do laranja até o verde musgo,

conforme os substituintes no esqueleto molecular (BRASSEUR & ANGENOT,1986).

A pesquisa do grupo II efetua-se pela observação dos cromatogramas, com a

fase móvel mais polar e utilizando o revelador vanilina clorídrica a 1%, as manchas

das proantocianidinas condensadas (taninos catéquicos) apresentam-se em

vermelho vivo e com valores de Rf muito baixos, aquelas das leucoantocianidinas

coram-se igualmente em vermelho intenso, porém com Rf superior a 0,5 (dímeros)

ou entre 0,8 a 0,9 (monômeros).

A pesquisa do grupo III os taninos gálicos foram investigados obedecendo

uma modificação do protocolo proposto por Stiasny (1912), desenvolvida no

Laboratório de Farmacognosia (XAVIER, 2001). Inicialmente investiga-se por

cromatografia em camada delgada (CCD) a existência de ácido gálico. Para tanto,

uma alíquota do extrato bruto é co-cromatografado com padrão daquela molécula

empregando-se o sistema AcOET-Tolueno-Ácido Fórmico (10:3:1 v/v) e efetuando-

se a revelação com Alúmen de Ferro a 1%, o ácido gálico produz mancha de

coloração azul quase preto, apresentando aproximadamente um Rf em 0,60,

cromatograma idêntico é efetuado revelando-se com o reagente de NEU e

posteriormente observado à luz ultravioleta. O ácido gálico produz mancha com

fluorescência azul.

Para investigação de taninos gálicos, uma alíquota do extrato bruto em água

destilada (5 mL de solução a 10%) é submetida a tratamento hidrolítico com 15 mL

de formol e 5 mL de ácido clorídrico concentrado, refluxando-se sob agitação

durante 30 minutos. Quando frio, o hidrolisado é submetido à filtração simples em

papel, e o filtrado torna-se desprovido de formol e ácido por passagem em coluna

cromatográfica de Duolite S-861, lavando-se com água até obtenção de frações

isentas de aldeído e acidez. Os fenóis retidos na resina são finalmente

desadsorvidos com acetona e a fração acetônica submetida a CCD, como já descrito

para o ácido gálico. A existência de ácido gálico oriundo de taninos, apresenta-se no

cromatograma de forma quantitativa, e superior ao demonstrado pelo ácido gálico

presente em forma livre, quando essas duas moléculas coexistem no mesmo

material vegetal.


Esta pesquisa é realizada pela observação das características afrogênicas de

uma solução do extrato bruto em água, sendo a mesma submetida a violenta

agitação manual. A produção de espuma abundante e persistente, durante pelo

menos 1 hora, indica a presença de saponósidos. A confirmação pode ser efetuada

por CCD, empregando-se uma fase móvel polar e o revelador a vanilina sulfúrica ou

anisaldeído.


Para confirmação dessas moléculas, o cromatograma foi submetido à fase

móvel polar, acetato de etila: ácido fórmico : ácido acético : água (100:11:11:27 v/v)

e revelado com o reagente de Dragendorff. A presença de alcalóides caracteriza-se

pelo surgimento de manchas com coloração laranja forte.

2.5.5 Pesquisa de Mono e Sesquiterpenos

Moléculas terpênicas com baixo peso molecular, em geral, são de pouca

polaridade e reagem fortemente com vanilina sulfúrica, apresentando manchas com

coloração predominantemente entre o azul e o violeta. A alíquota foi

cromatografada usando-se como fase móvel tolueno:acetato de etila (97:3 v/v) e

revelada com os reagentes: solução etanólica de ácido sulfúrico a 5% e solução

etanólica de vanilina a 2%, aquecimento em estufa a 100°C, durante 3 minutos.

2.5.6 Pesquisa de Triterpenos e Esteróides

Estas moléculas em solução clorofórmica, na presença de anidrido acético e

ácido sulfúrico concentrado (reagente de Liebermann-Burchard), produzem

colorações que variam do azul esverdeado (esteróides) ao castanho avermelhado

(triterpenos) (HASHIMOTO, 1970). Uma adaptação do método à CCD, permite aferir

a presença dessas moléculas (HARBORNE,1998; SHARMA,1991). Placas

cromatográficas foram submetidas a fase móvel tolueno-acetato de etila (90:12),

reveladas com o reagente de Liebermann-Burchard, seguido de aquecimento a

100°C e estufa, durante 5 minutos, com observação no visível e luz ultravioleta (365

nm).

2.5.7 Pesquisa de Iridóides

Alguns iridóides (glicosídeos de monoterpenos modificados, do tipo

asperulina, aucubina e monotropeína) reagem com vanilina sulfúrica, produzindo

uma coloração violácea (HARBORNE,1998). Placas cromatográficas contendo o

extrato metanólico foram submetidas à fase móvel polar acetato de etila: ácido

fórmico : ácido acético : água (100:11:11:27 v/v) e revelados com vanilina sulfúrica,

seguida de aquecimento a 100°C, durante 5 minutos.

2.5.8 Pesquisa de Açúcares Redutores

Cromatogramas com o extrato metanólico foram submetidos a fase móvel

butanol-tampão fosfato, pH = 5,0 - acetona (4:1:5 v/v) e revelados com solução

metanólica a 4% de cloreto de trifeniltetrazólio, seguida de aquecimento a 100°C,

durante 5 minutos (RUSSEL,1983). Desenvolvimento de manchas com coloração

vermelho-sangue confirmam a existência de açucares redutores.

2.6 Resultados e Discussão

2.6.1 Análises Cromatográficas do “Screening” Fitoquímico das Folhas de

V. brasiliana.

O QUADRO 3 expressa os resultados obtidos após ensaios preliminares

efetuados no extrato bruto metanólico das folhas.

QUADRO 3 – Metabólitos secundários encontrados no extrato bruto metanólico das folhas de Vernonia brasiliana.

MOLÉCULAS RESULTADOS

Cumarinas Negativo

Proantocianidinas condensadas e

Leucoantocianidinas

Negativo

Derivados Cinâmicos Positivo

Fenilpropanoglicosídeos Negativo

Flavonóides Positivo

Taninos Hidrolisáveis Negativo

Alcalóides Negativo

Iridóides Positivo

Saponinas Negativo

Triterpenóides e Esteróides Positivo

Monoterpenóides e Sesquiterpenóides Positivo

Açucares Positivo

2.6.2 Pesquisa de Polifenóis

A ausência de cumarinas foi constatada pela inexistência, no cromatograma,

de moléculas com forte fluorescência à luz ultravioleta (365 nm). Nessas condições,

uma molécula com valor de Rf elevado em fase móvel polar, com tênue

fluorescência azul claro, exacerbada após reação com o reagente de NEU foi

evidenciada, indicando um derivado cinâmico. As moléculas do tipo

fenilpropanoglicosídeos, de fluorescência verde amarelada foram excluídas neste

tipo de ensaio.

Essa molécula encontra-se sobreposta a uma outra de fluorescência laranja,

um flavonóide (cf. FIGURA 4).

FIGURA 4 - Cromatograma mostrando polifenóis encontrados em V. brasiliana, no detalhe a molécula característica de derivado cinâmico.

Cinco manchas com Rf decrescentes (0,80 - 0,50), pertencentes a flavonóides

foram observadas. Aquelas com Rf próximo a 0,50 são de glicosídeos de

flavonóides, dentre estas, percebe-se duas manchas com Rf 0,60 e 0,62 de

fluorescência vermelha, devido a glicosídeos de Eriodictiol (flavanona). Estas

mesmas moléculas forneceram um cromatograma no visível, onde após reagirem

com o reagente de NEU por um período de 2 horas, mostram coloração vermelha

intensa. Observa-se ainda nestas condições uma mancha com RF 0,70 e de

coloração vermelha, também pertencente a esse tipo de moléculas (cf. FIGURAS 5

e 5.1).

FIGURA 5.1 Cromatograma no visível, mostrando os flavonóides


FIGURA 5 Cromatograma no ultravioleta,

mostrando os flavonóides encontrados em V.brasiliana

Com uma fase móvel de polaridade mediana, pôde-se avaliar as agliconas de

flavonóides que se localizaram no “front” do cromatograma anterior. Nestas

condições observamos a existência de pelo menos seis dessas moléculas (cf.

FIGURA 6).

FIGURA 6 - Cromatograma no ultravioleta de agliconas de flavonóides encontradas

nas folhas de V. brasiliana.

As moléculas com Rf maiores, em torno de 0,50 e 0,60 , são do tipo

Apigenina ou Quempferol (fluorescência esverdeada). A molécula com Rf 0,30 e

0,10, de fluorescência laranja , são Quercetínicas ou Luteolínicas. Uma molécula com

Rf aproximado de 0,20, um derivado de Eriodictiol (fluorescência vermelha), foi

evidenciado, bem como uma com Rf 0,30, sobreposta, de fluorescência esverdeada

(Apigenínica ou Quempferólica) (BRASSEUR & ANGENOT,1986). Não foi

constatados a existência de proantocianidinas, taninos gálicos, nem ácido gálico.


Ensaio por via úmida (afrogenicidade), revelou a inexistência dessas

moléculas. Ausência de espuma persistente e abundante, dispensando-se o

emprego de cromatografia.


Os ensaios realizados , por CCD (reagente de Dragendorff) ou por via úmida

(reação com reagentes de precipitação de alcalóides), em vidro de relógio e revelada

com reagentes de Dragendorff, Mayer, Bertrand e Bouchardat, indicaram a

inexistência destas moléculas.

2.6.5 Pesquisa de Monoterpenos e Sesquiterpenos

A existência de terpenóides de baixo peso molecular, mono e sesquiterpenos

foram evidenciadas no cromatograma obtido após desenvolvimento com fase móvel

de baixa polaridade , tolueno : acetato de etila (97:3 v/v) e revelada com vanilina

sulfúrica, seguida de aquecimento em estufa a 100°C, durante 5 minutos. Quando

pelo menos seis moléculas foram observadas, aquelas em número de três de Rf

superior (Rf entre 0,70-0,90), devido a monoterpenos e, as outras três de Rf 0,20,

0,25 e 0,35, devido provavelmente a sesquiterpenos, cf. FIGURA 7.

FIGURA 7- Cromatograma de Mono e Sesquiterpenos encontrados em V. brasiliana

2.6.6 Pesquisa de Terpenóides e Esteróides

Um cromatograma desenvolvido com fase móvel de baixa polaridade, tolueno

: acetato de etila (90:12 v/v) foi revelado com o reagente de Liebermann-Burchard,

após prévio aquecimento em estufa a 100°C, durante 5 minutos, seguido de

exposição à luz ultravioleta, apresentou 04 manchas, duas com Rf elevado (Rf 0,70

e 0,80) e duas com Rf em torno de 0,40 e 0,50. Destas , uma correspondendo ao β-

sitosterol e a outra ao Acetato de β - amirina , com Rf ligeiramente superior ao da β -

amirina (cf. co-cromatografia com este padrão) (cf. FIGURA 8).

FIGURA 8- Cromatograma de Terpenóides (A) –EBM; (P1) -padrão de β - amirina; (P2) - padrão β - sitosterol

2.6.7 Pesquisa de Iridóides

A presença dessas duas moléculas foi constatada no cromatograma quando

revelado com vanilina sulfúrica e posterior aquecimento em estufa a 85°C, durante 5

minutos, observando-se o desenvolvimento de duas manchas com coloração

marrom e marrom-violácea, de Rf 0,60 e 0,65, respectivamente (cf. FIGURA 9).

FIGURA 9 – Cromatograma de Iridóides encontrados nas folhas de V. brasiliana.

2.6.8 Pesquisa de Açúcares Redutores

A existência de açucares redutores, glicose e provavelmente dois

dissacarídeos,

foi observada no cromatograma revelado com Cloreto de Trifeniltetrazólio, seguido

de aquecimento em estufa a 85°C, durante 5 minutos. Observando-se manchas de

coloração vermelha com Rf de 0,30 - 0,40 e 0,50, esta última correspondendo a

glicose (cf. co-cromatografia com este padrão na FIGURA 10).

FIGURA 10 – Cromatograma de Açucares (visível) : (E) – EBM; (D) -.padrão glicose

O perfil fitoquímico obtido a partir do extrato bruto das folhas, confirmou a

predominância de compostos polifenólicos e terpenóides. Dentre os polifenóis, foi

constatado a presença de derivado cinâmico, e um número majoritário de

flavonóides, reforçando o descrito na literatura (Base de dados do NAPRALERT,

2003), como a presença de glicosídeos do eriodictiol e agliconas de outros

flavonóides. Moléculas fenólicas, tais como: cumarinas, fenilpropanoglicosídeos

proantocianidinas, taninos gálicos e ácido gálico, não foram constatadas nos ensaios

realizados.

Quanto aos terpenóides, foram encontrados aqueles de baixa polaridade,

mono e sesquiterpenos, como também as moléculas de alto peso molecular,

triterpenos e esteróides, em concordância com a co-cromatografia apresentada na

FIGURA 8 (padrões de β - amirina e β- sitosterol).

A presença de alguns iridóides, foi constatada no cromatograma com o

aparecimento de duas manchas características. A inexistência de saponinas foi pré-

determinada pela ausência de espumas, através do ensaio preliminar de

afrogenicidade. Os alcalóides não estavam presentes nas folhas da planta em

estudo.

Açúcares redutores, glicose e provavelmente dois dissacarídeos, foram

identificados em cromatograma, correspondendo a co-cromatografia do padrão de

glicose utilizado (cf. FIGURA 10).

2.7 Isolamento do Acetato de β - Amirina (Molécula B)

Cerca de 15 g do extrato bruto metanólico foi tratado com n-hexano (50 mL,

três vezes), adicionados de carvão ativado (3g) e colocados em repouso por 15

minutos. A solução hexânica foi submetida à filtração simples em papel e o líquido

resultante concentrado a 1/10 do volume inicial. Em seguida foi realizada uma

cromatografia em coluna de gel de sílica - 60 (70-230 mesh), 30x5 cm, empacotada

com n-hexano, seguindo-se um gradiente de polaridade crescente (Benzeno e

AcOEt), obtendo-se 70 frações de 15 mL cada. As frações eluídas (47-53), com

Benzeno : AcOEt (17:3 v/v), mostraram, quando analisadas por CCD, sistema

Tolueno : AcOEt (90:15 v/v) e, reveladas com o reagente de Liebermann – Burchard,

uma única substância de Rf 0,50, reunidas e submetidas a evaporador rotatório para

eliminação do solvente, forneceram 340 mg de sólido esbranquiçado. As demais

frações continham outras moléculas.

2.7.1 Isolamento de dois Flavonóides (Moléculas C1 e E2)

Para a obtenção dessas moléculas, foi realizada uma pré–purificação do

extrato bruto metanólico (6g), empregando-se coluna cromatográfica de Sephadex

LH–20, 70x8 cm, empacotada e eluída com Metanol, da qual foram obtidas 16

frações de 300 mL cada. As frações 8-11, quando analisadas por CCD, mostraram

conter a maioria dos flavonóides. Estas foram reunidas e forneceram após

eliminação do solvente à vácuo (30°C), cerca de 2,5g de material ligeiramente

amarelado. Para o isolamento dos flavonóides, após vários ensaios cromatográficos,

optou-se por cromatografar o material em coluna cromatográfica de Poliamida

Polyclar AT-Serva, art.33162, empacotada e eluída em Benzeno, assim foram

obtidas 83 frações de 15 mL cada uma.

As frações 7-13 (C1) e 59-79 (E2), mostraram em CCD, tratar-se de

flavonóides e estavam praticamente puras. Uma re-cromatografia foi realizada com

cada um desses grupos de frações em nova coluna de Poliamida, usando-se para

C1, como eluente n-hexano: clorofórmio (13:7 v/v) e para a cromatografia de E2

clorofórmio: AcOEt (17:3 v/v). Dessa forma duas moléculas puras, C1 (140 mg) e E2

(120 mg), foram isoladas.

2.7.2 Caracterização das Moléculas C1, E2 e B

2.7.2.1 Caracterização da Molécula C1

Normalmente as absorções de flavonóides no ultravioleta são importantes

ferramentas para sua caracterização molecular. Estas absorções, para efeito de

estudos espectroscópicos, estão definidas como produzidas por cromóforos do

primeiro anel A (Banda II, 240-285 nm) e dos anéis C e B (Banda I, 300-550 nm) (cf.

FIGURA 11).

O

O FIGURA 11 - Flavonóide – origem das absorções no ultravioleta

A molécula codificada como C1, apresentou λmáx. (MeOH) no ultravioleta :

250 nm (ombro), 270 nm (Banda II) e 350 nm (Banda I) (cf. FIGURA 12). Estas

absorções estão coincidentes com aquelas esperadas para uma flavona, 250-280

nm (Banda II) e 300-350 nm (Banda I) (MARKHAM,1982).

A coloração da fluorescência desta substância (verde musgo), quando um seu

cromatograma é revelado com o reagente de NEU e exposto à luz ultravioleta (365

nm), indica um flavonóide com um substituinte em 4’, portanto um esqueleto do tipo

A

B

Banda II

Banda I C

apigenínico (BRASSEUR & ANGENOT, 1986), reforçando os dados do ultravioleta.

Isto fica definido pela presença, no espectro de ressonância magnética nuclear

protônica, de um singlete com um único próton a 6,58 ppm e característico de

flavonas (MABRY,1970). Outras absorções no ultravioleta após o emprego de

reagentes de deslocamento, permitiram importantes definições:

a) Tratamento com NaOMe, determinou um efeito batocrômico na Banda I de 55 nm

(350 - - 405 nm) com diminuição da intensidade, indicando que a molécula não

contém uma hidroxila livre em 4’, desde que se trata de uma flavona. A inexistência

de decomposição com o tempo (contínua diminuição da intensidade), sugere a

inexistência de 3,4’ – OH, grupos o-dihidroxi no anel A ou 3 hidroxilas adjacentes no

anel B(cf. FIGURA 13) (MARKHAM,1982).

b) O tratamento com AlCl3, produziu um efeito batocrômico na Banda I, com relação

ao espectro em metanol de 45 nm, indicando a existência de hidroxila em C-5. Uma

oxigenação em C-6 não é possível, nem tão pouco uma prenilação nesse átomo

com hidroxila em C–5, porque não acarretaria deslocamento ou ocorreria um

deslocamento muito menor (17-20 nm). Da mesma forma, a existência de um OH em

C-3 fica afastada, pois o efeito batocrômico seria superior a 50 nm (50-60 nm) (cf.

FIGURA 14). A adição de ácido clorídrico ao AlCl3 não provocou alteração no

espectro, cf. FIGURA 16 , indicando a inexistência de formação do complexo (o-

dihidroxi) com o alumínio, que seria posteriormente desfeito pelo ácido, confirmando

portanto, uma hidroxila em C- 5 (MARKHAM,1982).

c) Usando-se NaOAc como agente de deslocamento, não foi observado efeito

batocrômico da Banda II, indicando a ausência de OH livre em C- 7 (cf. FIGURA 15)

(MARKHAM,1982).

d) A combinação dos reagentes NaOAc e H3BO3, não produziu nenhum efeito

batocrômico da Banda I, o que era esperado se existissem grupos orto dihidroxi no

anel B, cf. FIGURA 17 .

Os dados espectroscópicos obtidos a partir do Espectro de Ressonância

Magnética Nuclear Protônica (HRMN, CDCl3 , TMS, 300MHz, ppm) foram definitivos

à elucidação estrutural de C1. O espectro apresenta absorções apenas em um

campo magnético baixo, a partir de 3,00 ppm. Em 3,88 ppm e 4,00 ppm foram

observados 2 singletes com 3 prótons cada, característicos de metoxila, um par de

dubletes com J de 3 Hz são característicos de prótons em C-6 (6,37 ppm) e C-8

(6,49 ppm) (MABRY,1970). Um singlete centrado a 6,58 pm, referido anteriormente,

e típico de próton em C-3, portanto de flavonas. Finalmente um par de dubletes com

J de 8 Hz (sistema AA’BB’), caracteriza a substituição no anel B, e se devem aos

prótons em 3’, 5’ (7,00 ppm) e 2’ ,6’ (7,50 ppm) (cf. FIGURA 18). Todos esses dados

estão plenamente de acordo com as estrutura 5-hidroxi-7,4’-dimetoxiflavona (cf.

FIGURA 19), esta substância não tão difundida, ocorre em Baccharis rhomboidalis

Remy, uma Asteraceae (SILVA,1971).

FIGURA 19 - 5-hidroxi –7,4’ - dimetiléter flavona (Molécula C1)

2.7.2.2 Caracterização da Molécula E2

A molécula codificada como E2 apresentou um espectro de absorção na

região do ultravioleta com λmáx.(MeOH) nm : 270, 282 e 344, cf. FIGURA 20. Estas

absorções estão na faixa esperada para flavonas (250-280 nm, Banda II) e (310-350

nm, BandaI). A coloração verde musgo da fluorescência desta molécula à luz

ultravioleta (365 nm), quando um seu cromatograma é revelado com

Difenilborinatodiamino2etila (NEU), mostra que se trata de flavona ou flavonol com

um único substituinte em C-4’ (BRASSEUR & ANGENOT,1986), seria portanto um

esqueleto do tipo apigenínico (flavona) ou quempferólico (flavonol). Após adição de

reagentes de deslocamento, outras absorções no ultravioleta foram obtidas:

a) O tratamento com NaOMe determinou um efeito batocrômico de 60 nm na banda I

(344 - - 404)(cf. FIGURA 21), indicando uma hidroxila em C-4’ livre, pois não houve

diminuição da intensidade ou redução contínua da intensidade (decomposição),

afastando a possibilidade de existência de 3,4’ OH, grupos o-dihidroxi no anel A ou 3

hidroxilas adjacentes no anel B (tipo Miricetina). Afastando-se também a

possibilidade de uma hidroxila em C-3 com hidroxila substituída em C-4’

(MABRY,1970).

b) O tratamento com reagente NaOAc provocou um leve efeito batocrômico (270 --

273) de apenas 3 nm (cf. FIGURA 22). Isto indica a inexistência de uma hidroxila

livre em C-7, ao mesmo tempo em que aponta para a existência de substituintes

oxigenados em C-6 ou C-8. A combinação dos reagentes Acetato de Sódio e Ácido

Bórico, não produziu nenhum efeito batocrômico (cf. FIGURA 25), indicando a

inexistência de grupos de o-dihidroxi no anel B (MABRY,1970).

c) O tratamento com AlCl3 determinou um efeito batocrômico de 42nm (344 - - 386)

(cf. FIGURA 23), mostrando e reforçando a existência de uma hidroxila em C-5. Um

efeito ainda maior seria esperado se houvesse a possibilidade de se ter uma

hidroxila em C-3, com ou sem 5-OH. A adição do àcido clorídrico ao AlCl3 não

provocou alterações no espectro,o que era esperado se existissem hidroxilas

vizinhas no anel B (cf. FIGURA 24).

O Espectro de Ressonância magnética Nuclear Protônica (HRMN, CDCl3,

TMS, 300MHz, ppm) foi elucidativo (cf. FIGURAS 26 e 26.1):

a) O espectro não mostrou absorções abaixo de 3,00 ppm, há um grupo de

singletes a 4,37ppm, cuja integração indica tratar-se de três metoxilas. A inexistência

de um singlete correspondendo a 1 próton entre 6,5 ppm e 6,8 ppm, elimina a

possibilidade de ser uma flavona (MABRY,1970).

b) A inexistência de absorções entre 6,00 ppm e 7,00 ppm, exclui a presença de

prótons no anel A. O padrão de substituição no anel B deve permitir uma franca

interação entre seus prótons para manter a simetria dos mesmos, portanto do tipo

AA’ e BB’, com uma hidroxila em C-4’, levando a dois dubletes centrados em 7,51

ppm (H-5’), 7,53 ppm (H-3’), 7,70 ppm (H-6’) e 7,72 ppm (H-2’) (MABRY,1970;

HARBORNE,1975).

A estrutura dessa molécula, considerando os dados do ultravioleta, é

consistente com o flavonol 5,8,4’ – trihidroxi- 3,6,7 trimetiléter (cf. FIGURA 27), esta

molécula, ainda não foi referenciada na família Asteraceae, .segundo nossa busca

em literatura pertinente.

FIGURA 27 – 5,8,4’-trihidroxi-3,6,7-trimetiléter flavonol (Molécula E2)

2.7.2.3 Caracterização da Molécula B

O Espectrômetro de Massas (EM) desse composto (cf. FIGURA 29),

apresenta um íon molecular (M+) a 468 m/z, com um pico base a 218 m/z. Este

último fragmento é diagnóstico, pois resulta de uma reação Diels-Alder inversa, a

partir do pico pai, como descrito na literatura (DJERASSI et al,1962; BUDZIKIEWICZ

et al,1963). Os outros fragmentos mais importantes e que reforçam a estrutura da

molécula são aqueles m/z 203 e 189 m/z (cf. FIGURA 30), todos em consonância

para o esperado de um composto triterpênico da série do oleanano, como descrito

pelos autores citados.

O Espectro de Infravermelho da Molécula B, caracteriza-se pela presença de

absorções entre 2853 e 2923 cm-1. correspondendo a estiramento simétrico e

assimétrico dos grupos CH, CH2 e CH3. Absorção a 1733 cm –1, corresponde a

absorção da carbonila de um éster (cf. FIGURA 31). A absorção em 1459 cm-1 é

uma deformação angular simétrica no plano de CH2. Absorção a 1376cm-1, se deve

a vibrações de deformação angular fora do plano, simétrica e assimétrica, do

metileno.

A confirmação final pode ser feita com base no Espectro de Ressonância

Magnética (HRMN, CDCl3, 300MHz, ppm). Este se enquadra perfeitamente no

esperado para moléculas triterpênicas. A região entre 0,70 ppm e 2,00 ppm contém

invariavelmente sinais intensos produzidos pelos grupos metilenos e metila.

Observam-se singletes correpondentes a metilas em 0,78 ppm; 0,80 ppm; 0,83 ppm;

0,85 ppm; 0,87ppm; 1,25 ppm; 1;58 ppm; 1,68 ppm e 2,04 ppm. Em 4,49 pm é um

multiplete, o próton do C-3. Em 5,15 ppm, há um dublete correspondendo aos

prótons de dupla ligação. O espectro HRMN da molécula B é apresentado na

FIGURA 32. A possível estrutura, considerando os dados acima relatados é, para o

Acetato de β - Amirina (cf. FIGURA 33). Essa substância, embora comum nos

vegetais superiores, não tinha sido ainda referenciada em V. brasiliana.

OCH3

O

OCH3

O

H

H

m/z 468

m/z 189 m/z 218m/z 203

+ -CH3 (C - CH3 + 2H)

-

+.

+

. +

0

250 u.m.a

FIGURA 30 - Principais fragmentos no Espectro da Molécula B

100 % 44 % 62 %

FIGURA 31 - Espectro de Absorção na região do Infravermelho da Molécula B

FIGURA 32 - Espectro de HRMN, CDCl3 , TMS, 300 MHz da Molécula B

FIGURA 33 – Estrutura do Acetato de β - Amirina.

Capítulo II : Atividade Biológica de Vernonia brasiliana (L.) Druce

1. Atividade Antimicrobiana

1.1 Revisão da Literatura

Membros da família Asteraceae, notadamente do gênero Vernonia, Eremanthus

e Eupatorium, devido a sua rica composição em lactonas sesquiterpênicas,

triterpenos e flavonóides, são importantes fontes bioativas contra fungos e bactérias.

Registros não tão recentes deram conta de que folhas de Vernonia brasiliana,

centro de nossos estudos, continha uma molécula ativa contra Staphylococcus

aureus, e igualmente contra bacilos Gram positivos, Gram negativos e leveduras de

interesse médico (D`ALBUQUERQUE et al, 1961).

No livro “Plantas do Nordeste, Especialmente do Ceará”, consta que o

cozimento das folhas, banhos ou loções, é recomendado para o reumatismo

inflamatório (BRAGA,1976).

Testemunho com outras espécies de Vernonia, relata a atividade inibitória contra

Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, e fraca atividade frente o

Aspergillus flavus (CHEN et al,1987).

Dezenove espécies dos gêneros incluindo Vernonia, Eremanthus e Eupatorum

foram testadas contra Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis, e seis espécies foram ativas contra os fungos: Candida albicans,

Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Cladosporium sphaerospermum.

Dentre as espécies avaliadas, aquelas dos gêneros Vernonia e Eremanthus

mostraram as melhores atividades (DAVINO et al,1989).

Atividades antifúngicas foram também notadas quando extratos de folhas e

caules de espécies de Vernonia eram testadas contra Aspergillus flavius, A.

parasiticus, A . ochracus, A. fumigatus, Penicillium citrinum e Fusarium sp,

produtores de micotoxinas (FREIRE,1995).

Diante desses relatos, ensaios com extratos e diversas partes de V. brasiliana

foram testados frente a microrganismos Gram positivos, Gram negativos e

leveduras. Alguns destes microrganismos estão depositados na Coleção de Culturas

Microbianas do Departamento de Antibióticos e outros foram isolados da clínica

médica.


1.2.1 Microrganismos

Para a determinação da atividade antimicrobiana foram utilizados

microrganismos Gram positivos, Gram negativos, Bacilo Gram negativos e leveduras

pertencentes ao gênero Candida..

Cocos Gram positivos: Micrococcus flavus –DAUFPE (323);

Staphylococcus aureus - IC (133 e 138);

Bacilo Gram negativo: Proteus mirabilis - IC (03) .

Fungos Leveduriformes: Candida albicans -DAUFPE (1007);

Candida krusei -DAUFPE (1002);

Candida albicans IC (01 a 09).

1.2.2 Solventes e Padrões Primários

Ø Metanol , Clorofórmio, Acetato de Etila, Benzeno e Hexano

Ø Padrões de Antibióticos Fúngicos testados: Nistatina (Potência 4800 UI/mg) e

Anfotericina B (Potência 850 µg).

1.2.3 Meios de Cultura

Ø Ágar Mueller Hinton (Oxoid);

Ø Caldo Mueller Hinton (Oxoid);

Ø Ágar Saboraud (Oxoid) e;

Ø Caldo Saboraud (Oxoid).

1.2.4 Extratos Vegetais

Ø Extrato bruto metanólico das sépalas -EMS (5% p/v);

Ø Extrato bruto metanólico do caule - EMB (5% p/v);

Ø Extrato bruto metanólico da raiz – EMR (5% p/v);

Ø Extrato bruto com acetato de etila da flor seca – EATF (5% p/v);

Ø Extrato bruto metanólico das folhas – EMF (5% p/v);

Ø Extrato bruto benzênico das folhas – EBF (5% p/v);

Ø Fração terpênica (FT) das folhas : molécula B (18mg/mL) em

benzeno:acetato de etila (1: 1v/v) e;

Ø Frações flavonóidicas (FF) das folhas: Molécula C1 (15mg/mL) e Molécula E2

(11mg/mL) em hexano : clorofórmio (13:7v/v) e clorofórmio : acetato de etila

(17:3 v/v), respectivamente.

1.3 Metodologia

A atividade Antimicrobiana das moléculas foi avaliada pelo Método de Difusão

em Meio Sólido (Bauer & Kirby ,1966), calcado na inibição do crescimento de um

microrganismo semeado na superfície do meio de cultura em torno de um disco de

papel de filtro impregnado com a droga. O método indica se o microrganismo tem

alguma sensibilidade ou é resistente a uma determinada substância numa

concentração conhecida (MOURA et al., 1992).

Na padronização dos inóculos microbianos, bem como para a manutenção e

avaliação das atividades, foram empregados os meios líquidos e sólidos de Müller-

Hinton e Saboraund, para bactérias e leveduras, respectivamente.

1.3.1 Preparação dos Extratos Brutos

As partes do vegetal (caule, sépalas, raiz, flor seca e folhas), foram

submetidas a infusão com metanol, acetato de etila e benzeno, sob agitação durante

30 minutos. As alíquotas foram reservadas para os testes (c.f item 1.2.4). A molécula

terpênica B e flavonoídicas (C1 e E2), foram obtidas por meio de ensaios

cromatográficos (itens 2.7 e 2.8). Para verificar a ação dos solventes sobre os

microrganismos, foram realizados controles (brancos) com Metanol, Benzeno e

Acetato de Etila.

Os padrões antibióticos utilizados, Nistatina e Anfotericina B, foram

solubilizados segundo literatura pertinente (FARM. BRÁS. IV), as concentrações

finais corresponderam a 1mg/mL.

1.3.2 Preparação dos Inóculos Microbianos

As culturas foram inoculadas em Caldo Müeller-Hinton e Sabouraund,

incubadas a 37ºC por 24 horas. Os inóculos foram padronizados com água

esterilizada, cuja turbidez correspondeu ao tubo 0,5 da escala de MacFarland, o que

equivale a 108 unidades formadoras de colônias (UFC/mL).

1.3.3 Semeio

Suspensões padronizadas dos microrganismos foram semeadas por

esgotamento em placas de Müeller-Hinton e Sabouraund com swabs estéreis. Sobre

os discos de papel, de 6 mm de diâmetro e peso de 30 mg ± 4 cm2 , foram pipetados

20 µL dos extratos ou das soluções de B, C1 e E2. Os discos foram secos, para

total eliminação dos solventes e depositados sobre os meios previamente

semeados, em seguida foram incubadas a 37ºC/24 horas (ACAR et al., 1996;

COURVALIN et al.,1985).

1.3.4 Leitura

Após incubação durante 24 horas, as leituras dos diâmetros dos halos de

inibição em torno dos discos contendo as amostras foram efetuadas com o auxílio de

régua milimetrada. Sendo considerado como padrão de sensibilidade os halos de

inibição iguais ou superiores a 10 mm.


Os extratos brutos de algumas partes do vegetal, foram selecionados para uma

avaliação da atividade antimicrobiana frente a bactérias Gram positivas, Gram

negativas e fungos leveduriformes, os resultados obtidos são apresentados na Tab.

1.

As moléculas flavonoídicas, obtidas das folhas, e os padrões antifúngicos de

referência, foram submetidos a ensaios de atividade antimicrobiana. Inicialmente

houve uma avaliação do perfil de inibição das moléculas, a partir dos resultados

obtidos, os padrões referenciados foram submetidos ao mesmo modelo de ensaio, a

fim de compararmos os resultados. Os resultados obtidos são apresentados na Tab.

2 e ilustrados nas FIGURAS 34 e 34.1 .

TABELA 1 – Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos de Vernonia brasiliana

Halos de Inibição (mm) Cepas EMS 5% EMC 5% EMR 5% EMF 5% EBF 5% EATF 5%

Staphylococcus

aureus 133

08 08 (-) 10 08 08

Staphylococcus

aureus 138

10 10 (-) 12 08 08

Micrococcus

flavus 323

20 13 10 18 10 (-)

Proteus mirabilis

03

(-) (-) (-) 09 08 07

Candida albicans

1007

08 (-) (-) (-) (-) (-)

Técnica de Difusão em Agar (-) = ausência de inibição; EMS (extrato bruto metanólico das sépalas); EMC (extrato bruto metanólico do caiule); EMR (extrato bruto metanólico da raiz); EMF (extrato bruto metanólico das folhas); EBF (extrato bruto benzênico das folhas) e EATF (extrato bruto com acetato de etila da flor seca). Observação : solventes utilizados não apresentaram inibição.

Analisando a Tab. 1 observa-se que em relação a atividade antimicrobiana

dos extratos brutos de folhas, raízes, sépalas e flores sobre as cepas testadas, o

extrato bruto metanólico das folhas apresenta melhor atividade inibitória.

TABELA 2 – Atividade Antimicrobiana dos Flavonóides C1, E2 , Nistatina e

Anfotericina

Halos de Inibição (mm) Cepas FF C1

(30 µg/ mL)

FF E2

(22 µg/ mL)

Nistatina

(25 µg/ mL)

Anfotericina B

(17 µg/ mL)

Staphylococcus

aureus 133

09 (-) NT NT

Staphylococcus

aureus 138

(-) 09 NT NT

Micrococcus

flavus 323

(-) 10 NT NT

Proteus

mirabilis 03

(-) (-) NT NT

Candida krusei

1002

18 22 NT NT

Candida

albicans 1007

17 23 21 16

Candida

albicans -IC 01

08 10 17 16

Candida

albicans -IC 02

10 12 20 15

Candida

albicans –IC 03

08 13 20 17

Candida

albicans -IC 04

09 14 20 16

Candida

albicans IC 05

09 18 35 35

Candida

albicans -IC 06

09 10 21 16

Candida

albicans -IC 07

09 11 17 17

Candida

albicans -IC 08

09 13 22 16

Candida

albicans -IC 09

11 13 21 17

Técnica de Difusão em Agar (-) = ausência de inibição FF = fração flavonoídica; IC = isolado clínico; NT = Não testado

A tabela 2 mostra que as moléculas dos flavonóides apresentaram para

alguns microrganismos atividades relevantes, notadamente aquelas desenvolvidas

por E2. A referida molécula apresentou um halo de inibição de 23mm sobre a

Candida albicans (DAUFPE 1007) superior aos padrões antifúngicos testados. A

molécula terpênica não foi referida por não apresentar em análise anterior atividade

antimicrobiana e antifúngica diante das cepas testadas.

FIGURA 34 - Atividade antifúngica das frações flavonoídicas sobre Candida albicans (DAUFPE 1007 e IC) e Candida krusei Legendas : A = CA – IC 02; B = CA- IC 04; C = CA –IC 03; D = CA – IC 07;

FIGURA 34.1 - Atividade antifúngica das frações flavanoídicas sobre Candida albicans (DAUFPE e IC) e Candida krusei (DAUFPE) Legendas : E = CA-IC 05; F = CK 1002; G = CA 1007; H = CA-IC 09; I = CA-IC 08.

2. Atividade Farmacológica

2.1 Revisão da Literatura

A farmacoetnologia de espécies de Vernonia, está associada em muitos países,

sobretudo, a problemas gastrointestinais, estomacais, cicatrizantes,

antiinflamatórios, antipiréticos, dentre outros (Base de Dados NAPRALERT, 2003).

Nesse domínio, poucos relatos estão dirigidos a V. brasiliana. De fato, as

informações mais detalhadas de seu emprego na medicina popular, estão

registradas no livro do professor Getúlio César, da Universidade Federal Rural de

Pernambuco, escrito há mais de cinco décadas e do qual transcrevemos, ipsis

litteris, o que nos pareceu mais relevante: “o suco das suas folhas bem pisadas,

coado, é um esplêndido remédio para cólicas hepáticas. O doente que dessa

medicação se utiliza sente a dor, depois de alguns minutos, ir fugindo e desaparecer

por encanto, deixando a pessoa livre, por muitos meses, de tão dolorosa angústia.”

“As raízes e folhas cozidas ou em chás tem, no interior, grande aplicação

em casos de hemorragia. Daí o seu batismo., por caboclos agradecidos, de

Tramanhem. Para defluxos e corizas fortes, as flores e folhas, em chá, opera

milagre, até para derrame pulmonar”.

“Pessoas que se machucam e ficam cheias de dores encontram, no sumo do

Tramanhem, bebido, e no cozimento de' suas folhas e ramos, alívio certo quando

banha com essa tisana a parte molestada ”.

“As folhas novas, as das sumidades do vegetal, são aproveitadas pelos nossos

matutos para curar belides e outras moléstias da vista. Operam da seguinte maneira:

as folhas novas colhidas, depois de bem lavadas, para as livrar da poeira, em água

bem limpa, são amarradas pelos pecíolos para formar um pequeno molho; em um

frasco de boca larga e um tanto espaçoso se dependura, pela rolha, o molhinho das

folhas de modo que não toque no vidro. Isso feito, se expõe o frasco sob os raios

diretos do sol para destilar, como dizem. Com o calor e a irradiação solar opera-se,

nas folhas ainda vivas, a transpiração e a clorovaporização, sendo a água nelas

contidas expulsa dos tecidos para se depositar no fundo do frasco. Depois as

folhinhas murchas são retiradas e a água que delas saiu guardada para servir de

colírio “.

“Em caso de Pterígio, que é o espessamento da conjuntiva em forma triangular,

cujo vértice procura cobrir a córnea, uma gota do suco das folhas depois de bem

coado em pano bem fino, pingado em cada olho é o remédio pelos roceiros

procurados com resultados surpreendentes. Afirmam eles que a membrana que

tenta cobrir o globo ocular, com essa intervenção, será destruída, desaparecendo

totalmente em poucos dias se o doente insistir em usá-lo metodicamente”. E

arremata, aquele autor, finalizando: “No domínio da veterinária o Tramanhem tem

entrada: as folhas bem machucadas em um pouco de água, depois de coada, a

golda é aplicada em forma de clister nos casos de cólicas e câmara de sangue dos

eqüinos com resultado positivo e imediato” (CESAR, 1956).

No que se refere à toxicidade do gênero, há registro de umas poucas espécies

que contêm um glicosídeo cardiotônico, sendo abortiva em caso de um uso

prolongado das mesmas (MARTINS,2000)


2.2.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar, Rattus norvegicus var. albinus , de ambos os

sexos, com aproximadamente 2 meses (200 – 300g) e, camundongos Mus

musculus, ambos os sexos, com aproximadamente 2 meses (20 – 30g), todos

oriundos dos biotérios do Instituto de Antibióticos, Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da UFPE e Centro de Pesquisa Ageu Magalhães –UFPE. Os animais

receberam água e dieta ad libitum e foram mantidos em condições controladas de

iluminação (ciclo 12 horas claro/escuro) e temperatura 25 ± 2ºC.

2.2.2 Extratos Vegetais

Foram utilizados resíduos de extratos brutos metanólicos das folhas de

Vernonia brasiliana (20%), suspensos em água.

2.2.3. Drogas e Reagentes

Ø Cloreto de Sódio a 0,9% (salina);

Ø Carragenina;

Ø Indometacina;

Ø Tween 80 e;

Ø Mepiridina.

2.2.4 Equipamentos e Materiais

Ø Plestimômetro;

Ø Banho – Maria;

Ø Cronômetro;

Ø Becker;

Ø Balança semi-analítica;

Ø Balança Analítica;

Ø Bastão de Vidro e;

Ø Seringas Descartáveis.

2.3 Metodologia

2.3.1 Experimentos in vivo

2.3.1.1 Observações Gerais e Toxicidade Aguda

As observações dos efeitos gerais do extrato do vegetal nas doses de 0,25 a

2,0g/kg por via intraperitoneal foram realizadas em camundongos de ambos os

sexos. Os animais foram distribuídos em grupos de 6, onde um dos grupos recebeu

salina 0,9% (controle).

Após a administração das amostras, os animais confinados e dispostos em

uma superfície plana, foram observados durante 240 minutos. Posteriormente foram

realizadas observações a intervalos regulares, durante 7 dias. Os efeitos de

alterações na postura, motilidade, depressão, frequência respiratória, sedação, entre

outros, foram anotados segundo os critérios propostos por MALONE (Malone,1977).

2.3.1.2 Atividade antiinflamatória

Inflamação aguda induzida por carragenina : Foi utilizado o teste de edema da

pata de ratos, induzido por carragenina (Winter,1962). O efeito antiinflamatório foi

comparado com o da Indometacina (10mg/ kg) e aquele do extrato vegetal nas

doses de 500 mg e 1000mg/ kg de peso por via oral.

2.3.1.3 Atividade Antiálgica

A ação analgésica do resíduo do extrato metanólico, dissolvido em água, foi

determinado pelo método da Placa Quente (Eddy e Leimbach,1953). Este consiste

em colocar o animal sobre uma placa de alumínio aquecida em banho-maria à

temperatura constante de 55ºC. A resposta ao estímulo térmico, medida em

segundos, corresponde ao lamber das patas ou andar em círculos. A reatividade dos

camundongos medida aos 20 minutos e imediatamente antes da administração das

drogas serve como controle. Após injeção intraperitoneal da amostra nas doses de

500mg e 1000mg/ kg, a reação ao calor foi novamente medida por 01 hora, 02 horas

e 03 horas. Miperidina (30mg/ kg) e salina a 0,9% foram utilizadas como droga

referência e controle, respectivamente.


2.4.1 Observações Gerais e Toxicidade Aguda .

Os testes de atividade geral em camundongos tratados com extrato de V.

brasiliana (0,25 /kg a 2,0g /kg) não revelaram qualquer alteração que os

diferenciassem dos animais controle durante os 07 dias de observação, sugerindo,

ausência de toxicidade aguda nas doses empregadas.

2.4.2 Atividade Antinflamatória

O extrato do vegetal não mostrou atividade antiinflamatória quando

administrado por via oral nas doses de 500mg /kg e 1000mg /kg.

2.4.3 Atividade Antiálgica

Quando administrado por via intraperitoneal nas doses de 500mg/kg e

1000mg/kg, o extrato do vegetal não apresentou atividade antiálgica.

3 Conclusão Geral

Os estudos realizados com a espécie Vernonia brasiliana propiciou o

conhecimento de aspectos farmacobotânicos, farmacoquímicos e relacionaram as

atividades biológicas (antimicrobiana e farmacológica), ainda pouco abordadas.

O estudo farmacobotânico forneceu importantes atributos diagnósticos para a

espécie em tela, ressaltando-se: a) dois tipos de tricomas, um não glandular com 2

braços ornados de pendúnculo em forma de T e outro, glandular, 1-pendúnculo, 1-

cabeça, ambos abundantes na epiderme foliar inferior; b) existência de faixa

descontínua de fibras agrupadas no cilindro vascular das raízes; c) parênquima

medular do caule com células de dois tamanhos.

Na análise farmacoquímica das folhas, predominaram a existência de

metabólitos terpênicos e polifenólicos (flavonóides), salientando a identificação de

três moléculas, um triterpeno, um flavonol e uma flavona. A primeira molécula bem

difundida nos vegetais superiores trata-se de um triterpeno do grupo oleanano. A

flavona de distribuição bem mais restrita, anteriormente constatada em outro táxon

de Asteraceae e um flavonol, para o qual esta parece ser a primeira descrição nessa

família.

O estudo da atividade biológica mostrou que o extrato bruto metanólico das

folhas é desprovido de toxicidade aguda, da mesma forma que não foram

evidenciadas propriedades antinflamatória e antiálgica nas doses analisadas. Em

relação à atividade antimicrobiana, tanto o extrato referido como as frações

flavonoídicas, apresentaram resultados relevantes com halos de inibição entre 18 e

23 mm de diâmetro, frente às cepas de Candida albicans (DAUFPE e Isolados

Clínicos) e Candida krusei, leveduras responsáveis por diversas infecções

sistêmicas em pacientes graves e ou imunodeprimidos; ressaltando que a molécula

E2 (flavonol) apresentou um halo de inibição de 23 mm sobre a Candida albicans,

superior ao padrão do antibiótico testado, Anfotericina B, considerado como uma das

melhores drogas antifúngicas.

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XAVIER, H. S., Comunicação Pessoal, Recife, 2001.

ANEXOS

ANEXO A – CARTA DO DR. NESTOR O . CAFFINI RELATIVA A ACEITAÇÃO E PUBLICAÇÃO DO ARTIGO NA REVISTA ACTA FARMACÊUTICA BONAERENSE.

A Scientific Journal of the College of Pharmacists of the Province of Buenos Aires, Argentina

Publicación científica del Colegio de Farmacéuticos de la Provincia de Buenos Aires, Argentina Calle 5 Nª 966, La Plata 1900, Argentina. Tel. (54 221) 429 0900

http://www.colfarma.com.ar/afb/index.html

La Plata, 13 de junio de 2003 Lúcia Roberta de Souza Filizola Departamento de Ciências Farmacêuticas, Laboratório de Farmacognosia, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Arthur de Sá, S/N, 50740-521- Recife - PE- Brasil

E-mail: [email protected] Ref.: AFB 71503

Estimada Dra. Filizola:

Tengo el agrado de dirigirme a usted con el objeto de poner en su conocimiento que la nueva versión de su trabajo “Anatomia dos Órgãos Vegetativos de Vernonia brasiliana (L.) Druce”, de Lúcia R. de S. FILIZOLA, Rejane PIMENTEL, Karina P. RANDAU & Haroudo S. XAVIER, es aceptable para ser publicado en Acta Farm. Bonaerense. Oportunamente le remitiremos por correo electrónico un archivo PDF con la prueba de imprenta para que proceda a su revisión.

Quedo a la espera de la nueva versión del manuscrito, de acuerdo a las

sugerencias del árbitro. Al tiempo de agradecer su colaboración, hago propicia la oportunidad para saludarla con las expresiones de mi mayor consideración.

Dr. Néstor O. Caffini, Editor E-mail: [email protected]

Anexo B - Normas da Revista Acta Farmacêutica Bonaerense

Disponível em < http:// www.colfarma.org.ar/afb> Acesso em : 30/08/2003.

Acta Farmacéutica Bonaerense considerará a publicação de contribuições vinculadas direta ou indiretamente às Ciências Farmacêuticas, na forma de trabalhos originais, comunicações curtas, atualizações, revisões, notas ao Editor, etc. Os trabalhos deverão ser enviados ao Editor, Acta Farmacéutica Bonaerense, Calle 5 Nº 966, 1900 La Plata, Argentina, em duas vias e escritos em espaço duplo. Juntamente com as duas cópias do manuscrito, os autores deverão enviar uma versão em disquete de 3 ½ " contendo os arquivos correspondentes em Word ou Word Perfect for Windows. Serão aceitos manuscritos em espanhol, português e inglês.

A apresentação deverá seguir as seguintes regras gerais:

a) Na margem superior direita deverá constar a numeração da página e o nome do autor a quem a correspondência deverá ser enviada.

b) O Título deverá fornecer, da forma a mais concisa possível, informações claras sobre conteúdo do trabalho. Se o trabalho estiver escrito em espanhol ou português, deverá incluir uma tradução do título em inglês. Se o trabalho estiver escrito em inglês, o título deverá ser acompanhado de uma tradução em espanhol.

c) Abaixo do título deverá constar o primeiro nome completo e sobrenome de cada um dos autores, com identificação (*) do autor para o qual a correspondência deverá ser enviada. Nas próximas linhas serão declarados os endereços postais dos autores.

d) A seguir será incluido um Resumo de aproximadamente 100 palavras. Se os trabalhos estiverem escritos em espanhol ou portugues, deverá ser incluido uma tradução do resumo em inglês (Summary). Se o trabalho está escrito em inglês o Summary deverá ser acompanhado de um resumo em espanhol.

e) Após o resumo deverão ser listadas ao menos três Palavras chaves em ordem alfabética, em espanhol ou português e em inglês (Key Words).

f) Na medida do possível, o trabalho deverá ser dividido em capítulos, sugerindo-se os seguintes títulos: Introdução, Material e Métodos, Resultados, Discussão e/ou Conclusões. Em continuação poderão ser incluídos os Agradecimentos.

g) As referências bibliográficas serão numeradas conforme a ordem em que são citadas no texto. A bibliografia deverá ser listada ao final do trabalho e ordenada numericamente abaixo do título Referências bibliográficas. As citação de periódicos1, monografias2, e livros3 deverão seguir exatamente os seguintes exemplos:

(1) Pazos, A., K.H. Wiederhold & J.M. Palacios (1986) Eur. J. Pharmacol. 125: 123-9

(2) Boelcke, O. (1992) "Plantas vasculares de la Argentina, nativas y exóticas", Ed. Hemisferio Sur, Buenos Aires, págs. 209-10

(3) Askhenazi, A. & G.E. Peralta (1994) "Muscarinic acetylcholine receptors", en "Hanbdbook of receptors and channels" (S.J. Peroutka, ed.), CRC Press, Boca Raton, Fda., Vol. 1, págs. 1-27

h) As tabelas e figuras serão numeradas, utilizando números árabicos, na ordem em que aparecem citadas no texto. O tamanho das letras e símbolos incluidos nas figuras devem ser estabelecidos em dimensão adequada, considerando que esses são habitualmente reduzidos ao tamanho de meia coluna (6.5 cm). Os títulos e texto de figuras e tabelas devem ser incluidos após as referências bibliográficas.

Os trabalhos recebidos serão remetidos aos consultores corespondentes, que avaliarão criticamente os manuscritos, cuja opinião será comunicada imediatamente ao autores. Se os consultores sugerirem correções, os autores deverão enviar a nova versão em duplicata, acompanhada de outro disquete contendo os arquivos correspondentes. Os trabalhos serão corrigidos em caso de conter erros sintáticos ou ortográficos. Acta Farmacéutica Bonaerense enviará, sem encargo aos autores, cinqüenta separatas de cada trabalho publicado.

Estudo Farmacognóstico de Vernonia brasiliana (L.) Druce … · 2016-09-06 · À Dra. Eulália...

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