ESTUDO FARMACOLÓGICO DE OXIMAS NOS SISTEMAS CARDIOVASCULAR …€¦ · universidade federal do...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E INOVAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

MARIA ALICE MIRANDA BEZERRA MEDEIROS

ESTUDO FARMACOLÓGICO DE OXIMAS NOS SISTEMAS

CARDIOVASCULAR E RESPIRATÓRIO

PETROLINA

2016

Maria Alice Miranda Bezerra Medeiros



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Recursos Naturais do Semiárido da

Universidade Federal do Vale do São Francisco, para

obtenção do Título de MESTRE EM RECURSOS

NATURAIS DO SEMIÁRIDO. Área de Concentração:

FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo

Ribeiro

PETROLINA

2016

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF.

Bibliotecário: Fabio Oliveira Lima - CRB-4/2092.

Medeiros, Maria Alice Miranda Bezerra.

M488e Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e respiratório/ Maria Alice Miranda Bezerra Medeiros.-- Petrolina, 2016. XIX; 136f ; il. ; 29cm.

Dissertação (Mestrado em Recurso Naturais do Semi-Árido) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina,

Petrolina-PE, 2016. Orientador: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro. 1. Oximas. 2. Relaxamento de músculo liso. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 615.3

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCOO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

Maria Alice Miranda Bezerra Medeiros



Dissertação apresentada como requisito parcial

para obtenção do título de Mestre em Recursos

Naturais do Semiárido, pela Universidade Federal

do Vale do São Francisco.

Aprovado em

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________

Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro

Orientador

___________________________________________

Prof. Dr. Fabrício Souza Silva

Examinador Interno

__________________________________________

Prof. Dr. Tiago Ferreira da Silva Araújo

Examinador Externo

DEDICATÓRIAS

Dedico este trabalho, primeiramente, a Deus, pelo dom da vida, por

me proporcionar tantas bençãos. A meus pais (Nilzinha e Naudo), pelo

apoio incondicional em todos os momentos, por acreditarem mais em mim

do que eu mesma. A meus irmãos, avós, tios, primos e namorado

(Alexandre) pelo incentivo. A todos os meus amigos, em especial Ayla,

Inaiara, Joana e Iza pelo apoio. Ao professor Luciano, por ter sido meu pai

científico durante esses dois anos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço, primeiramente, ao professor Luciano, que foi quem abriu as portas da

UNIVASF para mim, serei eternamente grata pela oportunidade, ensinamentos, apoio,

paciência e compreensão durante esses dois anos.

A UNIVASF, por toda estrutura disponibilizada para realização deste estudo.

A Capes, pelo apoio financeiro.

A todos do laboratório de farmacologia experimental (LAFEX), por terem me

acolhido tão bem e pela ajuda tanto experimental quanto teórica durante esse período.

Especialmente a Ayla (que me ensinou todos os protocolos), por todo tempo dedicado

a me ajudar, experimentos compartilhados e apoio incondicional durante a escrita desta

dissertação.

A professora Cleônia Roberta, professor Arlan, Maíra e Vitória, pela síntese e

disponibilidade das oximas.

Aos colaboradores da UFBA, professora Darízy, pelo imenso apoio,

ensinamentos, disponibilização do laboratório para realização dos testes com

mesentérica. A Jamile, William e Rafael, que me ensinaram e ajudaram na realização

destes. Jamais esquecerei o que fizeram por mim.

Ao professor Raimundo Palheta, pela enorme contribuição neste trabalho, pois foi

o principal responsável pela realização dos experimentos in vivo, além da paciência,

disponibilidade, ensinamentos e ajuda no tratamento dos dados e na redação do texto.

A Jaknea, pelo apoio na realização das cirurgias. Serei eternamente grata por tudo que

fizeram para enriquecer esta pesquisa.

A Gabriela, pela disponibilidade dos animais.

Aos membros da banca examinadora, Prof. Dr. Fabrício e Prof. Dr. Tiago, pelas

correções e sugestões que contribuíram para melhoria do trabalho.

Muitíssimo obrigada!!

Estudo farmacológico de oximas nos sistemas cardiovascular e

respiratório

2016

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... 10

LISTA DE TABELAS .................................................................................................... 13

LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... 14

RESUMO....................................................................................................................... 16

ABSTRACT ................................................................................................................... 17

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 19

2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................... 22

2.1 Sistema cardiovascular ........................................................................................... 22

2.2 Doenças cardiovasculares ...................................................................................... 24

2.3 Sistema respiratório ................................................................................................ 27

2.4 Doenças respiratórias ............................................................................................. 28

2.5 Contração e relaxamento de músculo liso............................................................... 30

2.6 Óxido nítrico ............................................................................................................ 32

2.7 Oximas ................................................................................................................... .34

3 OBJETIVOS .............................................................................................................. 38

3.1 Geral........................................................................................................................ 38

3.2 Específicos .............................................................................................................. 38

4 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 40

4.1 Material.................................................................................................................... 40

4.1.1 Material sintético .................................................................................................. 40

4.1.2 Animais ................................................................................................................. 41

4.1.3 Aspectos éticos .................................................................................................... 42

4.1.4 Substâncias e sais ............................................................................................... 43

4.1.5 Soluções nutritivas ............................................................................................... 44


respiratório

2016

4.1.6 Aparelhos ............................................................................................................. 44

4.2 Métodos ................................................................................................................... 45

4.2.1 Estudo da atividade vasorelaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-oxima

ativada e oxima substituída em aorta isoladada de rato ............................................... 45

4.2.1.1 Preparação de anéis de aorta isolada de rato ................................................... 45

4.2.2 Estudo da atividade vasorelaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-oxima

ativada e oxima substituída em mesentérica superior isoladada de rato ...................... 47

4.2.2.1 Preparação de anéis de mesentérica isolada de rato ....................................... 47

4.2.3 Estudo, in vivo, do efeito da aceto-oxima sobre a pressão arterial ...................... 48

4.2.4 Estudo da atividade relaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-oxima

ativada e oxima substituída em traquéia isolada de cobaia .......................................... 50

4.2.4.1 Preparação dos anéis de traquéia isolada de cobaia ........................................ 50

4.3 Análise dos Dados .................................................................................................. 52

5 RESULTADOS ........................................................................................................... 54

5.1 Estudo do efeito da atividade vasorrelaxante das oximas em aorta isolada de rato.

...................................................................................................................................... 54

5.1.1 Escolha do solvente para preparo da solução-estoque ........................................ 54

5.1.2 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e na

ausência de endotélio funcional .................................................................................... 55

5.1.3 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e

na ausência de endotélio funcional ............................................................................... 55

5.1.4 Efeito da oxima substituída sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e na


5.1.5 Efeito do Prenol acetilado sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e na


5.1.6 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de aorta isolada de rato na

presença e na ausência de endotélio funcional............................................................. 58


respiratório

2016

5.2 Estudo do efeito vasorelaxante das oximas em mesentérica superiror isolada de

rato ................................................................................................................................ 61

5.2.1 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato na


5.2.2 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato

na presença e na ausência de endotélio funcional ........................................................ 61

5.2.3 Efeito da oxima substituída sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato


5.2.4 Efeito do prenol acetilado sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato na


5.2.5 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de mesentérica isolada de rato


5.3 Estudo, in vivo, do efeito da aceto-oxima sobre a PA ............................................. 65

5.4 Estudo do efeito relaxante das oximas em traquéia isolada de cobaia ................... 71

5.4.1 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na presença e na

ausência de epitélio funcional ....................................................................................... 71

5.4.2 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na

presença e na ausência de epitélio funcional ................................................................ 71

5.4.3 Efeito da oxima substituída sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na

presença e na ausência de epitélio funcional ................................................................ 72

5.4.4 Efeito do prenol acetilado sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na presença

e na ausência de epitélio funcional ............................................................................... 72

5.4.5 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na

presença e na ausência de epitélio ............................................................................... 74

6 DISCUSSÃO .............................................................................................................. 78

7 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 84

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 86

APÊNDICES…………………………………………………………………………….……..96

ANEXOS………………………………………………………………………………………134


respiratório

2016

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Reação se síntese do prenol acetilado a partir do prenol e anidrido acético . 40

Figura 2: Reação se síntese da aceto-oxima a partir do prenol acetilado e pentilnitrito

...................................................................................................................................... 41

Figura 3: Reação se síntese da oxima substituída a partir da aceto-oxima e piridina .. 41

Figura 4: Reação completa da síntese da aceto-oxima e oxima substituída a partir do

prenol ............................................................................................................................ 41

Figura 5: Fotos do Rattus norvegicus e Cavia porcellus .............................................. 42

Figura 6: Fotos da aorta de rato e anel de aorta em haste metálica ............................ 46

Figura 7: Fotos do anel de mesentérica superior de rato, amplificador e anéis no banho

de órgãos ...................................................................................................................... 48

Figura 8: Foto do animal com as cânulas na artéria carótida e veia jugular ................. 49

Figura 9: Foto da cânula na artéria carótida esquerda conectada aos transdutores de

pressão MLT 1050 e MLT 0380 .................................................................................... 49

Figura 10: Fotos da traquéia de cobaia e anéis de traquéia em hastes metálicas ....... 51

Figura 11: Valores de Emax dos veículos DMSO+H2O e DMSO em enéis de aorta, pré-

contraídos com 10-6 M de FEN, na presença e ausência de endotélio..........................54

Figura 12: Valores de Emax do prenol acetilado (Pa), aceto-oxima (AO), aceto-oxima

ativada (AO+) e oxima substituída (OS) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6

M de FEN, na presença e na ausência de endotélio......................................................57

Figura 13: Efeito relaxante de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+) e oxima

substituída (OS) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença

e na ausência de endotélio.............................................................................................58

Figura 14: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima,

prenol acetilado e veículo em anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na

presença de endotélio....................................................................................................59


prenol acetilado e veículo em anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na

ausência de endotélio....................................................................................................59


respiratório

2016

Figura 16: Efeito relaxante da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima e

veículo sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença de

endotélio.........................................................................................................................60

Figura 17: Efeito relaxante da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima e

veículo sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na ausência de

endotélio.........................................................................................................................60

Figura 18: Efeito relaxante de aceto-oxima, aceto-oxima ativada, oxima substituída e

prenol acetilado sobre anéis de mesentérica superior, pré-contraídos com 10-6 M de

FEN, na presença e na ausência de endotélio..............................................................63

Figura 19: Efeito relaxante da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima,

prenol acetilado e veículo sobre anéis de mesentérica, pré-contraídos com 10-6 M de

FEN, na presença de endotélio......................................................................................64

Figura 20: Efeito relaxante da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima,

prenol acetilado e veículo sobre anéis de mesentérica, pré-contraídos com 10-6 M de

FEN, na ausência de endotélio.......................................................................................64

Figura 21: Efeito da aceto-oxima e do veículo, nas doses de 1 a 100 µg, sobre a

FC...................................................................................................................................66


PAS.................................................................................................................................66


PAD................................................................................................................................67


PAM................................................................................................................................67

Figura 25: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a FC, na presença de

atropina, L-NAME e sildenafil.........................................................................................68

Figura 26: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAS, na presença de


Figura 27: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAD, na presença de


Figura 28: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAM, na presença de


Figura 29: Duração do efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PA, na

presença de atropina, L-NAME e sildenafil....................................................................70


respiratório

2016

Figura 30: Valores de Emax de aceto-oxima, aceto-oxima ativada, oxima substituída e

prenol acetilado sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na

presença e na ausência de epitélio................................................................................73

Figura 31: Efeito relaxante de aceto-oxima, aceto-oxima ativada e prenol acetilado

sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença e na ausência

de epitélio ......................................................................................................................74


prenol acetilado e veículo em anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na

presença de epitélio........................................................................................................75


prenol acetilado e veículo em anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na

ausência de epitélio........................................................................................................75

Figura 34: Efeito relaxante da aceto-oxima ativada, aceto-oxima, prenol acetilado e

veículo sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença de

epitélio............................................................................................................................76

Figura 35: Efeito relaxante da aceto-oxima ativada, aceto-oxima, prenol acetilado e

veículo sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na ausência de

epitélio............................................................................................................................76


respiratório

2016

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Substâncias, sais e seus fornecedores .......................................... 43

Tabela 2. Composição da solução de Krebs .................................................. 44

Tabela 3. Comparação entre os valores de Emax das oximas em aorta e

mesentérica .............................................................................................................. 65

Tabela 4. Comparação entre os valores de pD2 das oximas em aorta e

mesentérica .............................................................................................................. 65


respiratório

2016

LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AA ácido araquidônico

ACh acetilcolina

AMPc 3’,5'-monofosfato cíclico de adenosina

AO aceto-oxima

AO+ aceto-oxima ativada por temperatura (37ºC)

ATP 5’-trifosfato de adenosina

Ca2+ íon cálcio

[Ca2+]i concentração de Ca2+ livre no citosol

CAM calmodulina

CaV canais para cálcio abertos por voltagem

CE50 concentração de uma substância capaz de produzir 50% de seu efeito

máximo possível

CO2 gás carbônico

DAG diacilglicerol

DPOC doença pulmonar obstrutiva crônica

DC débito cardíaco

DMSO dimetilsulfóxido

e.p.m. erro padrão da média

EDRF fator de relaxamento derivado do endotélio

Emax efeito máximo

FEN L(-) -fenilefrina

GMPc 3',5'-monofosfato cíclico de guanosina

GTP 5’-trifosfato de guanosina

Gq proteína Gq

HA hipertensão arterial

IP3 1,4,5-trisfosfato de inositol

K+ íon potássio

MLC cadeia leve da miosina

MLCK cinase da cadeia leve da miosina

MLCP fosfatase da cadeia leve da miosina


respiratório

2016

M concentração molar (mols/L)

mM milimolar (10-3 mol/L)

n número de experimentos realizados (tamanho amostral)

nM nanomolar (10-9 mol/L)

NO óxido nítrico

O2 oxigênio

OS oxima substituída

p probabilidade

PA pressão arterial

Pa prenol acetilado

PKA proteína cinase dependente de AMPc

PKG proteína cinase dependente de GMPc

PKC proteína cinase C

PGI2 prostacicilina

PLC fosfolipase C

RyR Receptor de rianodina

RPT resistência periférica total

RS retículo sarcoplasmático

VSM músculo liso vascular

VES volume de ejeção sistólico

vs versus

M micromolar (10-6 mol/L)

OBS: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta

relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas universalmente.


respiratório

2016

RESUMO

Palavras-chave: Oxima, pressão arterial, vasodilatação dependente de NO.

As doenças cardiovasculares e respiratórias afetam grande parte da

população mundial. Problemas na produção ou liberação de óxido nítrico (NO) estão

envolvidos em diversos processos destas enfermidades. O presente estudo teve

como objetivo avaliar o efeito relaxante, in vitro, de oximas inéditas em aorta,

mesentérica e traquéia, e o efeito do composto com maior atividade (in vitro) sobre a

pressão arterial, in vivo. Nos experimentos in vitro, os animais foram eutanasiados,

os órgãos foram retirados, após remoção de todos os tecidos conectivos, foram

divididos em anéis, que foram suspensos individualmente por hastes de aço

inoxidável, estas foram presas através de fios de algodão a transdutores de força, e

submersas em cubas contendo solução de Krebs, a 37 ºC, sob aeração de mistura

carbogênica em um sistema de banho para órgão isolado, acoplado a um

amplificador de força e conectado a um computador para monitoramento das

contrações. Já nos experimentos in vivo, os animais foram anestesiados, foram

colocadas cânulas na veia jugular e na artéria carótida, esta foi conectada aos

transdutores de pressão, acoplados a um sistema de aquisição de sinais biológicos.

Com isso a pressão arterial (mmHg) foi registrada, e a frequência cardíaca (FC)

(bpm) foi determinada a partir do registro contínuo da pressão arterial sistólica

(PAS). De acordo com os resultados obtidos, a broncodilatação ocasionada pelas

oximas não foi tão intensa quanto à vasodilatação. Deste modo, pode-se observar

que Aceto-Oxima (AO) foi eficaz e mais potente em aorta e mesentérica,

promovendo vasodilatação independente de endotélio, in vitro. AO também reduziu

FC e pressão arterial, in vivo. Seu efeito hipotensor não foi atenuado pela atropina

nem pelo L-NAME, não estando relacionado à ativação dos receptores muscarínicos

e de maneira independente da NOS, respectivamente. Entretanto, a duração da

hipotensão foi aumentada com o sildenafil e consequentemente, seu mecanismo de

ação provavelmente está relacionado à via do NO-GMPc, podendo ser um doador

de NO.


respiratório

2016

ABSTRACT

Keywords: Oxime, arterial pressure, NO-dependent vasodilation.

Cardiovascular and respiratory diseases affect much of the world's population.

Problems in the production or release of nitric oxide (NO) are involved in several

cases of these diseases. This study aimed to evaluate the relaxing effect of novel

oximes in aorta, mesenteric and trachea in vitro, and the effect of the compound with

better activity (in vitro) on arterial pressure in vivo. In the in vitro experiments, the

animals were euthanized, the organs were removed, after removal of all connective

tissues were divided into rings which were individually suspended by stainless steel

rods, these are attached through cotton threads to force transducers and submerged

in vats containing Krebs solution at 37 °C under carbogenic mixture aeration in an

isolated bath organ system coupled to a power amplifier and connected to a

computer for monitoring the contractions. For the in vivo experiments, the animals

were anesthetized, a cannulae was placed in the jugular vein and carotid artery and it

was connected to pressure transducers coupled to a biological signal acquisition

system. Hence, arterial pressure (mmHg) was recorded, and heart rate (HR) (bpm)

was determined from the continuous record of systolic arterial pressure (SAP).

According to the results, bronchodilation caused by oximes was not so intense as

vasodilatation. Thus, it can be noted that AO was effective and more potent in aorta

and mesenteric promoting vasodilation independent from endothelium in vitro. It also

reduced HR and arterial pressure in vivo. Its hypotensive effect was not attenuated

by atropine nor by L-NAME, not being related to activation of muscarinic receptors

and not dependent on the NOS, respectively. However, the duration of hypotension

was increased with sildenafil, consequently, its mechanism of action is related to the

NO-cGMP pathway, being a NO donor.


respiratório

2016

20

INTRODUÇÃO


respiratório

2016

19

1 INTRODUÇÃO

Os sistemas cardiovascular e respiratório são utilizados como modelos

experimentais de ensaios farmacológicos pré-clínicos para descoberta de novos

fármacos. Alterações na homeostasia destes estão relacionadas ao surgimento de

doenças com grande impacto socioeconômico, como hipertensão arterial (HA),

insuficiência cardíaca congestiva (ICC), aterosclerose, asma e doença pulmonar

obstrutiva crônica (DPOC) (HERNANDEZ et. al., 2014; MENEZES et. al., 2013;

MIRAVITLLES et. al., 2016; VOELTER-MAHLKNECHT, 2016).

Em relação às doenças cardiovasculares, estas são as principais causas de

morbidade e mortalidade no mundo. Além disso, muitas delas prejudicam a

capacidade de levar uma vida normal, resultando em enormes custos de saúde para

a sociedade e prejuízos individuais para o cidadão. Tais patologias são mais

prevalentes que a incidência conjugada de todas as formas de câncer, diabetes e

asma. Vale ressaltar que não há uma única causa para essas doenças, mas vários

fatores de risco, que alargam a possibilidade de sua ocorrência (SILVA, 2014). Nos

últimos anos sucedeu um aumento da incidência de aterosclerose e HA (DAS,

2009).

A HA possui influência multifatorial (genética, fisiologia e características

ambientais). Ultimamente acredita-se que problemas relacionados a produção ou

liberação de óxido nítrico (NO) são primordiais para o desenvolvimento e

manutenção dela (MENDES-JÚNIOR et. al., 2015). HA é considerada a causa

primária para o surgimento de várias patologias associadas ao sistema

cardiovascular. Ela também é responsável por aproximadamente 12,8% de todas as

mortes anuais (WICHA et. al., 2015).

Já sobre as doenças que acometem o sistema respiratório, grande parcela do

adoecimento e morte em adultos e adolescentes tem como causa tais patologias.

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), elas representam 8% do total de

mortes em países desenvolvidos e 5% dos países em desenvolvimento. A asma, por

exemplo, acomete aproximadamente 20% dos brasileiros (MENEZES et. al., 2013).

De acordo com a OMS, tal enfermidade afeta 7 milhões de pessoas (menores de 18

anos), nos Estados Unidos. Esta é caracterizada pela inflamação das vias aéreas


respiratório

2016

20

causando obstrução e limitação do fluxo aéreo (MEIRELES et. al., 2013). O NO está

envolvido em diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos do trato respiratório,

pois o subtipo neuronal da sintase do óxido nítrico (nNOS) está presente nos

capilares alveolares, assim ele é produzido e induz broncodilatação (SILVA, 2014).

O NO é um gás lipossolúvel, sintetizado a partir da L-arginina pela família de

sintases do óxido nítrico (NOS). Esse gás é sintetizado abundantemente no

endotélio vascular, sistema nervoso central e periférico (SILVA, 2014). Além de ser o

principal fator relaxante derivado do endotélio (EDRF), possui participação na

manutenção e regulação da pressão arterial (PA). Em músculo liso vascular, ele

promove vasorrelaxamento via NO-GC-PKG, além de poder ativar diretamente

proteínas e canais iônicos. Nitroglicerina e nitroprussiato de sódio são exemplos de

doadores de NO bastante aplicados em doenças cardiovasculares, como angina do

peito, hipertensão pulmonar e isquemia cardíaca. Entretanto, seu uso a longo prazo

pode levar ao desenvolvimento de tolerância, o que prejudica o tratamento da HA

(MENDES-JÚNIOR et. al., 2015).

Portanto, é de extrema importância a síntese de novos doadores de NO.

Algumas oximas já são consideradas novas doadoras de NO em sistemas biológicos

como vasos sanguíneos e regiões de inflamação, sendo comprovada a sua ação

como relaxante de músculo liso e antiinflamatória (ABDEL-AZIZ et al., 2013). O

termo oxima resulta da união entre as palavras oxigênio e imina, descoberta em

meados do século XIX. Elas são compostos orgânicos cuja formula geral é

RR’C=NOH, onde o R é um substituinte orgânico e o R’ pode ser um hidrogênio ou

um outro grupo orgânico (PERES, 2009). Estudos comprovaram que algumas

oximas possuem ação relaxante em artéria mesentérica superior isolada de ratos,

com ação relacionada à via do NO e canais para K+ (VERAS et. al., 2013).

Por conseguinte, o músculo liso é uma ferramenta bastante útil para a

investigação de atividades biológicas de substâncias sintéticas, uma triagem

farmacológica pode ser realizada para determinar se as substâncias sintéticas

apresentam algum efeito relaxante em músculos lisos previamente estimulados com

agentes contracturantes, onde vasoconstrição simula à HA e broncoconstrição à

asma. Dessa forma, esse músculo é indispensável na descoberta de novos

fármacos úteis para o tratamento destas enfermidades (SILVA, 2014).


respiratório

2016

21

REVISÃO DA

LITERATURA


respiratório

2016

22

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Sistema Cardiovascular

O sistema cardiovascular tem como função primordial, a distribuição do sangue

para os tecidos, fornecendo oxigênio (O2) e nutrientes essenciais para o

metabolismo das células, hormônios e outros sinais químicos, além de eliminar os

resíduos celulares. Todas as células do corpo humano necessitam de oxigênio para

viver. Nesse contexto, o conjunto formado pelo coração e vasos sanguíneos, é

responsável por distribuir o sangue rico em oxigênio por todo o corpo (COSTANZO,

2014). O gradiente de pressão (P) que existe entre o coração e os vasos

sanguíneos é a força motriz que permite o sangue fluir. Sendo o coração, o sistema

de propulsão, que por meio de contração, impulsiona o sangue pelo sistema

vascular, os quais podem ser veias ou artérias. Entre os vasos do sistema vascular,

as artérias são as mais calibrosas e transportam o sangue oxigenado para ser

distribuído por todos os tecidos do corpo. No decorrer do percurso, os vasos vão se

ramificando com diâmetro cada vez menor, até os capilares. Quanto menor o calibre

dos vasos, maior a resistência e consequentemente, menor a pressão sanguínea

(COSTANZO, 2014; SILVERTHORN, 2010).

O sangue que sai dos capilares contém baixa quantidade de oxigênio e alto

teor de gás carbônico. Ao passar pelos capilares, o sangue segue pelas veias e é

levado ao coração e em seguida aos pulmões, chegando aos capilares pulmonares,

onde o sangue volta a receber oxigênio e a ter o gás carbônico removido (SANTOS,

2013).

Os vasos sanguíneos podem ser divididos anatomicamente em três camadas,

adventícia, média e íntima. A mais externa, camada adventícia, é composta de

tecido conjuntivo denso, e componentes celulares como fibroblastos e macrófagos.

A camada média é a mais espessa e é composta principalmente de tecido muscular,

além de elastina e colágeno. A camada íntima, que fica em contato direto com o

fluxo sanguíneo, é constituída por uma única camada de células, o endotélio

(RODRIGUES, 2010).


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O endotélio apresenta funções importantes na regulação de diferentes eventos

fisiológicos, desde a regulação da permeabilidade vascular, coagulação, reações

inflamatórias, imunológicas e crescimento celular. Alterações de uma ou mais

dessas ações, podem causar disfunção endotelial vascular. As células endoteliais

sintetizam e liberam substâncias vasorelaxantes, em resposta a diferentes estímulos

mecânicos e químicos, que regulam o tônus vascular. Estas substâncias

vasorelaxantes incluem fatores relaxantes derivados do endotélio, como por

exemplo, a prostaglandina E2 (PGE2), e o NO. O endotélio também produz fatores

vasoconstritores, como endotelina e tromboxano, sendo estes fatores fundamentais

para o controle da pressão arterial média (PAM) e consequentemente, para a

homeostasia (WON et. al., 2014; RAMESHRAD et al., 2016).

A aorta, artéria de maior calibre do corpo humano, desempenha várias funções

sobre o sistema cardiovascular. Entre elas, a transmissão e distribuição do sangue

do coração para vasos de menor calibre que abastecem a periferia, além da função

de reservatório expansível, absorvendo o fluxo arterial da contração ventricular

esquerda na sístole, liberando em seguida o sangue durante a diástole (WHITLOCK;

HUNDLEY, 2015).

O controle do sistema cardiovascular se dá, em parte, pelo sistema nervoso

autônomo (SNA). A influência do SNA sobre o coração é dependente de

informações que partem, dentre outras, dos baroceptores, quimioceptores,

receptores atriais, receptores ventriculares, modificações do sistema respiratório,

sistema vasomotor, sistema renina-angiotensina-aldosterona e sistema

termorregulador. A partir do controle neural, as respostas das vias simpáticas e

parassimpáticas são estabelecidas, modulando assim a frequência cardíaca (FC)

(VANDERLEI et al., 2009).

A pressão arterial (PA) é a força que o fluxo sanguíneo exerce sobre as

paredes dos vasos sanguíneos. Para a manutenção da PA dentro do limite

normalmente aceito de 120/80 mmHg (pressão sistólica e diastólica,

respectivamente), são necessários ajustes na FC e no débito cardíaco (DC), além de

constantes reajustes do tônus vascular. O principal mecanismo autonômico

diretamente envolvido nesta resposta é o barorreflexo arterial. Dessa forma, o

aumento da variabilidade da PA relaciona-se com uma perturbação deste


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mecanismo reflexo de controle (OHNO; KANNO; TAKENAKA, 2016; WON et al.,

2014).

Uma maneira de se entender o controle da PA é através da equação “PA = DC

x RVP”, o qual: “PA” representa a pressão arterial média, “DC” é o volume de

sangue bombeado pelo coração em um dado intervalo de tempo, e “RVP” que é a

resistência dos vasos à passagem do sangue em seu interior. Sendo que o “DC”

depende da FC e do volume de sangue ejetado durante cada sístole (VES).

Portanto, a equação também pode ser: “PA = FC x VES x RVP”, onde o crescimento

de qualquer valor leva a um aumento na PA. Deste modo, um aumento anormal da

homeostase nos níveis da FC e/ou do VES e/ou da RVP de um indivíduo é capaz de

gerar um aumento patológico da PA, e culminar no desenvolvimento da hipertensão

arterial sistêmica (HAS) (LATERZA et. al., 2008; SILVA, 2014).

2.2 Doenças Cardiovasculares

As doenças cardiovasculares possuem grande impacto na saúde humana, uma

vez que são as principais responsáveis pelos óbitos em países desenvolvidos e em

desenvolvimento (SU et. al., 2014). Essas patologias podem acometer o coração,

culminando em insuficiência cardíaca congestiva, miocardiopatia ou doença

isquêmica do coração, mas também podem atuar nos vasos sanguíneos, levando ao

surgimento de doença arterial coronariana, aterosclerose e hipertensão (SILVA,

2014).

O crescimento contínuo da incidência de tais doenças ocorre devido à dieta e

estilo de vida inadequados, culminando no aparecimento de diabetes e obesidade.

Grande parte da população utiliza medicamento de forma contínua para algum

problema cardíaco (hipertensão, aterosclerose, diabetes, etc). Embora o uso deles

seja necessário, esse consumo diário pode levar a dependência do paciente ao

fármaco. Além disso, muitas vezes, o medicamento é utilizado para suprir o estilo de

vida inadequado, o que ocorre com vários pacientes apesar da gravidade da

patologia (DAS, 2009).

Outro fato importante é que os fatores de risco para essas doenças podem surgir

devido a distúrbios metabólicos, por conta da grande quantidade de obesos. Sendo


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2016

25

que nos últimos anos ocorreu um aumento da incidência de aterosclerose e

hipertensão (DAS, 2009).

A HA é o termo aplicado para adultos com pressão sanguínea sistólica superior a

140 mmHg e/ou pressão sanguínea diastólica superior a 90 mmHg (PATEL et. al.,

2015). Ela é crônica, silenciosa, de evolução cadenciada e procedência multifatorial.

Nos Estados Unidos seu índice permaneceu constante nos últimos dez anos (cerca

de 30%). Enquanto que no Brasil variou de 25,2 a 40,1%, e esse número foi

ampliado espantosamente entre os indivíduos acima de 60 anos. A média da

prevalência de HA nas capitais do Brasil em adultos acima de 18 anos, em 2012, foi

de 24,3%, de acordo com os últimos dados do IDB (Indicadores e Dados Básicos)

Brasil, cujos números foram referentes aos casos com diagnóstico médico prévio.

Pacientes entre 40 e 69 anos, que apresentam PA acima de 115x75 mmHg,

possuem risco de mortalidade por complicações cardiovasculares maior do que o

dobro a cada 20 mmHg de aumento na pressão sistólica ou 10 mmHg na diastólica.

Um desafio da saúde pública é o diagnóstico precoce da HA em um maior número

de pessoas (FERRAZZO et. al., 2014). Diante do exposto, a HA é considerada a

causa primária para o surgimento de várias patologias associadas ao sistema

cardiovascular. Além de ser estimada como a causadora de aproximadamente

12,8% de todas as mortes anuais. Por conseguinte, uma maneira de reduzir a

incidência de doenças cardiovasculares é controlar a HA, assim como promover a

melhoria da saúde. Vale ressaltar que o relaxamento e a contração da musculatura

vascular são fatores importantes na regulação da PA (WICHA et. al., 2015).

Em relação ao tratamento da HA, existem dois tipos, o não farmacológico e o

farmacológico. O primeiro é composto por uma alimentação saudável (frutas,

verduras, legumes, peixes, e outros alimentos com pouca gordura), restrição de

sódio, prática de atividade física, redução de peso, não ingestão de bebidas

alcoólicas e não utilização de cigarro. Já o tratamento farmacológico pode ser

realizado com medicamentos pertencentes a sete classes diferentes, classificadas

de acordo com seus locais ou mecanismos de ação. São elas: diuréticos, agentes

simpaticolíticos, bloqueadores de canais de Ca2+, inibidores da enzima conversora

da angiotensina (ECA), antagonistas do receptor de Angiotensina II (Ang II),

inibidores diretos da renina e vasodilatadores (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2012).


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Os diuréticos atuam aumentando a eliminação de sódio e água na urina,

consequentemente ocorre aumento do volume urinário. Essa classe é subdividida

em inibidores da anidrase carbônica (acetazolamida), osmóticos (manitol), de alça

(furosemida), tiazídicos (hidroclorotiazida), inibidores do canal para Na+ (amilorida),

antagonistas da aldosterona (espironolactona), inibidores de canais catiônicos

(nesiritide) e antagonistas do hormônio antidiurético (ADH) (conivapana)

(BRUNTON; LAZO; PARKER, 2012; LONGO; MARTELLI; ZIMMERMANN, 2011).

A segunda classe é composta pelos agentes simpaticolíticos, que dependendo

do tipo pode atuar no DC ou na RVP, eles são subdivididos em: agentes de ação

central (metildopa) (KINTIRAKI et. al., 2015), bloqueadores dos neurônios

adrenérgicos (reserpina) (SHAMON; PEREZ, 2009), antagonistas β-adrenérgicos

(propranolol, labetalol) (HOTTINGER et. al., 2014), antagonistas α-adrenérgicos

(doxazosina) (VAN DER ZEE; BOER, 2014) e antagonistas adrenérgicos mistos

(carvedilol) (HOTTINGER et. al., 2014).

Já os bloqueadores dos canais para cálcio (nifedipino e verapamil) promovem

vasodilatação, cronotropismo e inotropismo negativos. Enquanto que os inibidores

da ECA (captopril) e antagonistas do receptor da Ang II (losartana) possuem o

mesmo efeito, vasodilatação e redução da volemia (LONGO; MARTELLI;

ZIMMERMANN, 2011).

E finalmente, os vasodilatadores que causam uma redução da resistência

vascular, são subclassificados em arteriais (hidralazina) ou arteriais e venosos

(nitroprussiato de sódio). O nitroprussiato foi descoberto em 1849 e seu primeiro

relato de uso na clínica ocorreu em 1922, então foi estabelecida sua segurança e

eficácia hipotensiva, com administração intravenosa. O mesmo já foi utilizado como

hipotensor antes de cirurgias, para reduzir a perda de sangue durante o processo

cirúrgico, além de diminuir a pós-carga na ICC. Ele promove vasodilatação por ser

um doador de NO, este gás em músculo liso vascular, interage com a subunidade β1

da GC, que após ser ativada levará a formação de GMPc, que ativa PKG, e esta

quinase atua em alguns alvos promovendo a redução da concentração de cálcio

intracelular ([Ca2+]i) nas células musculares lisas da vasculatura, provocando

redução da RPT, ajudando na regulação dos níveis pressóricos. Estudos

demosntram que o NO, liberado por esse fármaco, também inibe a agregação


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plaquetária in vitro e in vivo. Entretanto, o nitroprussiato é um complexo que contém

cianeto, este pode ser liberado e induzir citotoxicidade. Mas até hoje é aplicado em

emergências hipertensivas, uma vez que possui ação rápida e provoca uma

vasodilatação generalizada, por isso só pode ser utilizado em ambiente hospitalar

(HOTTINGER et. al., 2014; KANDLER et. al., 2011; LIMA et. al., 2014).

Um dos primeiros doadores de NO descritos foi a nitroglicerina, obtida por

Ascanio Sobrero em 1847. A mesma é uma molécula orgânica, éster de nitrato de

glicerol. Apesar da sua potente vasodilatação e hipotensão, provoca efeitos

colaterais como cefaléia e tolerância, o qual limita seu uso (LIMA et. al., 2014).

Entretanto, este fármaco promove vários benefícios ao sistema cardiovascular, tais

como redução da resistência coronariana, aumento da capacitância venosa, redução

da pré-carga, pode ser usada profilaticamente para impedir isquemia induzida pelo

exercício, e gera hipotensão (BODEN et. al., 2012).

Além farmacoterapia, mudança no estilo de vida acompanhada de dieta saudável

são medidas que podem ser aplicadas preventivamente, isso contribui para o

crescimento da expectativa de vida e redução da mortalidade, além de evitar ou

adiar a necessidade do tratamento farmacológico. Vale ressaltar que o tratamento

não medicamentoso deve ser adotado, e pode contribuir no retardo do aparecimento

da HAS, bem como na redução da PA e possíveis danos associados à doença.

Quando o tratamento não farmacológico não é suficiente para normalizar os índices

pressóricos, inicia-se o uso de medicamentos. Estes levam a redução da PA e,

consequentemente, previnem ou minimizam as complicações cardiovasculares. Para

uma melhor adesão do paciente, o tratamento deve ser simplificado e eficaz

(FERRAZZO et. al., 2014).

2.3 Sistema Respiratório

O sistema respiratório é dividido, anatomicamente, em superior (nariz, faringe

e laringe) e inferior (traquéia, brônquios, bronquíolos, ducto alveolar e alvéolos).

Esse sistema pode também ser separado em duas zonas, a zona condutora (nariz

para bronquíolos) que forma um caminho para a condução dos gases inalados e a


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zona respiratória (ducto alveolar para alvéolos), onde a troca de gases ocorre

(PATWA; SHAH, 2015).

A traquéia é um importante órgão do sistema respiratório. Apresenta formato

tubular, possui comprimento de aproximadamente 11 a 13 cm em indivíduos adultos

e é responsável por transportar gases e secreções brônquicas. A partir da traquéia,

a via aérea respiratória se divide em duas menores, e essa divisão ocorre

sucessivamente até a 23ª geração de ramificação. Essas ramificações formam um

sistema complexo de transporte de gases, conhecido como árvore traqueobrônquica

(PATWA; SHAH, 2015; HEDENSTIERNA; EDMARK, 2015).

Os pulmões se comportam como “balões infláveis”, que se distendem

ativamente por pressão positiva (dentro) e/ou pressão negativa criada no espaço

pleural. Normalmente, a pressão pleural negativa (Ppl) é suficiente para distender os

pulmões durante a fase inspiratória. Essa pressão pode ser chamada de pressão

transpulmonar (Ptp), que é expressa pela equação “Ptp=Paw–Ppl”, onde Ptp =

pressão transpulmonar, Paw = pressão alveolar e Ppl = pressão pleural (ANAESTH;

PATWA; SHAH, 2015). O movimento de gás inspirado e expirado é chamado de

ventilação. O pulmão realiza a ventilação como processo de entrada e saída de ar, e

esse processo é necessário para que as trocas gasosas e a captação de oxigênio

aconteçam (BANJAI et. al., 2009).

2.4 Doenças Respiratórias

As doenças do sistema respiratório podem acometer o pulmão, cavidade

pleural, brônquios, traquéia, vias aéreas superiores, nervos e músculos da

respiração. O músculo liso é um dos alvos para o desenvolvimento dessas

patologias. A hipertensão arterial pulmonar, enfisema pulmonar, doença pulmonar

obstrutiva crônica (DPOC) e asma são alguns exemplos dessas enfermidades.

Dentre estas, a asma e a DPOC (compreendendo bronquite crônica e enfisema) são

as doenças crônicas mais comuns em todo o mundo, e há indícios de que a

prevalência delas deve aumentar nos próximos anos (BRASIL, 2010; SILVA, 2014).

Essas doenças representam um proeminente motivo de adoecimento e morte

em adultos e adolescentes. Segundo a OMS, elas são responsáveis por


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aproximadamente 8% do total de óbitos em países desenvolvidos e 5% em países

em desenvolvimento (MENEZES et. al., 2013). Dentre as doenças crônicas não

transmissíveis, no Brasil, as patologias respiratórias crônicas representam 5% dos

óbitos, e 11,2% das causas de incapacidade (SANTOS et. al., 2015).

A asma faz parte desta estatística, uma vez que é caracterizada pela

inflamação das vias aéreas causando obstrução e limitação do fluxo aéreo

(MEIRELES et. al., 2013) merece destaque por sua prevalência média de 20% no

Brasil, esse índice é um dos maiores do mundo (MENEZES et. al., 2013). Portanto,

este é um problema de saúde pública no mundo que reduz a produtividade dos

pacientes e sua participação na sociedade. Milhões de indivíduos são portadores da

patologia, o que resulta anualmente em dois milhões de atendimentos emergenciais,

quinhentas mil internações hospitalares e cinco mil óbitos. Estudo realizado pelo

Ministério da Saúde em várias cidades do Brasil, aponta que 13,3% das crianças de

6 a 7 anos e de 13 a 14 anos são asmáticas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010;

MEIRELES et. al., 2013).

A depender da gravidade dos sintomas a asma pode ser classificada como

leve, moderada ou grave. De acordo com sua evolução, ela pode ser classificada

como intermitente ou persistente. Primeiramente se faz necessário um diagnóstico

correto, em seguida um tratamento adequado. A classificação da doença é essencial

para que o paciente possua uma terapia adequada (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2010). A asma não pode ser curada, mas os tratamentos modernos permitem o

controle eficiente dela. Os tratamentos são relacionados à prevenção e aos sintomas

das crises, para minimizar os sinais e evitar novas exacerbações agudas

(MEIRELES et. al., 2013).

O tratamento da asma pode ser realizado com fármacos que atuam no

relaxamento da musculatura das vias respiratórias (broncodilatadores) ou na

redução da inflamação (anti-inflamatórios). Novos medicamentos (modificadores dos

leucotrienos) e associação de medicamentos (corticóides inalatórios combinados

com agonistas β-adrenérgicos). Entretanto, alguns desses fármacos podem

acarretar efeitos indesejados, interações medicamentosas ou ser ineficiente para o

tratamento. Por conseguinte, é bastante importante que o paciente siga o tratamento


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medicamentoso corretamente para evitar o aparecimento de novas crises

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010; MEIRELES et. al., 2013).

Atualmente, conhece-se que a obstrução parcial das vias aéreas ocorre devido

à contração do músculo liso. Essa contração ocorre por um estímulo não especifico,

como atividade física, mudanças bruscas na temperatura ambiental, exposição à

alérgenos, que instigam a liberação de acetilcolina, histamina e prostanóides, além

de outros mediadores endógenos que ativam seus respectivos receptores

farmacológicos, dando origem a eventos de sinalização intracelular que culminam

com a contração da musculatura (SILVA, 2014).

2.5 Contração e relaxamento de músculo liso

A musculatura lisa corresponde a apenas 5% da massa muscular total do

organismo humano (AGUIAR, 2009). Entretanto, mesmo com essa pequena

porcentagem, estas células são responsáveis pelo controle e regulação do

funcionamento da maioria dos órgãos do corpo, apresentando-se como uma

ferramenta importantíssima para investigação de atividades farmacológicas de

substâncias. A contração da musculatura lisa é essencial para a manutenção da

pressão sanguínea, controle da respiração e do peristaltismo intestinal, além do que

vários problemas de saúde como HA, coronariopatia, asma, DPOC, cólicas uterinas

e intestinais estão relacionadas a uma regulação anormal da contratilidade dessa

musculatura (SANTOS et. al., 2013).

A ocorrência da contração da musculatura lisa se deve ao aumento da

concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i), através da liberação dos estoques

intracelulares ou pela entrada através dos canais para Ca2+ presentes na membrana

plasmática, esse aumento da [Ca2+]i faz com que este íon, no meio intracelular, se

ligue a calmodulina (CAM) e constitua o complexo 4Ca2+-CAM, este ativa a quinase

da cadeia leve da miosina (MLCK), que fosforila a MLC, e promove o deslizamento

das fibras de actina sobre as de miosina, que culmina na contração da musculatura

lisa (SILVA, 2014).

Os receptores α1 adrenérgicos são responsáveis pela regulação da PA por

estimulação da contração do músculo liso vascular, e pertencem a superfamília de


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receptores metabotrópicos ou acoplados a proteína G (GPCR). A proteína G

acoplada ao receptor citado é a Gq/11, que após ativada a subunidade α-GTP

estimula a fosfolipase C (PLC), que hidroliza o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2)

nos segundos mensageiros, 1,4,5-trisfosfato de inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG). O

IP3 se dissocia da membrana e se liga ao receptor do IP3 (IP3R), localizado no

reticulo sarcoplasmático (RS), com isso ocorre liberação de Ca2+ para o citoplasma

(WEGENER et al, 2013), o DAG ativa a proteína cinase C (PKC), que fosforila Cav

(REIS et. al., 2008), ocorrendo influxo de Ca2+. Esse aumento da [Ca2+]i culmina no

processo de vasoconstricção (WEGENER et al, 2013).

É importante ressaltar que a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares

colabora para o inicio do desenvolvimento da contração, mas sua manutenção

depende diretamente do influxo sustentado de Ca2+ através de canais na membrana

plasmática (SILVA, 2014).

Os canais iônicos sensíveis a voltagem transduzem os sinais através da

mudança no potencial de membrana (despolarização e hiperpolarização). Tais sinais

elétricos culminam em oscilações da [Ca2+]i, controlando várias funções fisiológicas,

como secreção de hormônios, sensações somáticas e a contração muscular. Os

canais para potássio, cálcio e sódio sensíveis a voltagem (Kv, Cav e Nav,

respectivamente), canais abertos por nucleotídeos cíclicos (CNG), canais receptores

de potencial transiente (TRP), canais de potencial transiente (TPC), canais ativados

por hiperpolarização e nucleotídeos cíclicos (HCN), canais para potássio

retificadores de entrada (Kir) e os canais para potássio de dois poros (K2P) são os

responsáveis por parte desse evento (SANTOS et. al., 2013).

A inibição do espasmo ou o relaxamento do músculo liso ocorre com o

impedimento de alguma etapa da via de sinalização da contração ou com o retorno

da [Ca2+]i aos níveis basais pelo processo de hiperpolarização da membrana. A

movimentação dos íons K+ na célula contribui para a regulação da entrada de Ca2+

pelos Cav, uma vez que o aumento da condutância ao K+ promove hiperpolarização

e a redução promove despolarização. No presente momento se conhece quatro

famílias de canais para K+, a dos canais para K+ sensíveis as correntes de Ca2+

(BKCa), Kv, Kir e dos canais para K+ sensíveis a ATP (KATP), entretanto as duas


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primeiras (BKCa e Kv) são as principais responsáveis pela hiperpolarização

(SANTOS et. al., 2013).

Já o mecanismo de transdução celular responsável pelo relaxamento está

relacionado à fosforilação via PKG ou PKA (proteína quinase dependente de GMPC

e de AMPC, respectivamente), que gera: acréscimo na atividade da Ca2+-ATPase do

RS e da membrana plasmática (SERCA e PMCA, respectivamente), e consequente

aumento do armazenamento e expulsão de Ca2+, simultaneamente; inativação do

IP3R, que leva a redução da saída de Ca2+ do RS; inibição da MLCK, que induz

redução da afinidade desta pelo complexo 4Ca2+-CAM, e impede a fosforilação da

MLC e posterior contração; ativação da fosfatase da MLC (MLCP), que retira o

fosfato da MLC, e impede que a contração permaneça; inibição dos Cav, que

induzem redução da [Ca2+]i; além da ativação dos Kv, que culminam em

hiperpolarização e posterior desativação dos Cav. A contratilidade do músculo liso, o

tônus das vias aéreas e a contratilidade rítmica do músculo cardíaco, são alguns dos

procedimentos do nosso organismo que necessitam dessa via (SANTOS et. al.,

2013).

Substâncias espasmolíticas estão envolvidas no tratamento de diversas

fisiopatologias, tais como HA, asma, cólicas uterinas ou intestinais. Portanto, um

fármaco que intervenha em qualquer mecanismo da contração da musculatura lisa,

que leve ao relaxamento, é extremamente útil. Além disso, os modelos

experimentais de músculos lisos são, relativamente, simples para investigação de

mecanismos de ação de drogas anti-espasmolíticas. Portanto, a descoberta de

substâncias capazes de prevenir ou curar tais patologias é de extrema importância,

pois elas atingem uma enorme parcela da população, seja em países pobres, em

desenvolvimento ou desenvolvidos (SANTOS et. al., 2013).

2.6 Óxido Nítrico

O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa, que está envolvida na regulação

de importantes processos fisiológicos, bem como o relaxamento vascular,

proliferação das células musculares lisas, secreção de insulina, tônus das vias

aéreas, peristaltismo, adesão dos leucócitos, agregação plaquetária, angiogênese e


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trombose. Considerado um gás lábil, o NO é capaz de difundir livremente nas

membranas celulares, característica que colabora com sua alta atividade biológica

(BIELLI et al., 2015; DIAS et. al., 2011).

O NO é sintetizado a partir do aminoácido L-arginina, por uma família de

enzimas, as NOS. Estas são homodímeros compostas de dois domínios, ligados por

meio de uma região de ligação à calmodulina. Três isoformas de NOS foram

identificadas em mamíferos, NOS neuronal (nNOS/1NOS), NOS endotelial

(eNOS/3NOS) e induzível (iNOS/2NOS). A nNOS, inicialmente encontrada no sistema

nervoso, mas também se apresenta constitutivamente em outros tecidos. eNOS é

produzida fisiologicamente em células endoteliais. Enquanto que a iNOS encontra-se

expressa em processos celulares anormais como na insuficiência cardíaca, e

diferentemente da eNOS, ela age independentemente de Ca2+ e é estimulada por

fatores inflamatórios, tais como citocinas e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)

(BIELLI et al., 2015; RAMESHRAD et al., 2016; SU, 2015; PEPINE, 2009).

A síntese do NO ocorre em duas etapas de uma reação. A primeira é a

N-hidroxilação de um grupo guanidino da L-arginina, formando N-hidroxi-L-arginina

(L-NOHA). Na segunda etapa da reação, a L-NOHA é metabolizada em L-citrulina e

NO. A síntese da L-NOHA a partir da L-arginina é considerada mais específica da

NOS. No entanto, a clivagem oxidativa da ligação C=NOH da L-NOHA em NO ou

outros óxidos de nitrogênio pode ser catalisada não apenas pela NOS, mas também

por outras hemoproteínas, tais como as ezimas microssomais do citocromo P450 ou

peroxidases (CHALUPSKY et. al., 2004).

Em condições fisiológicas, o NO é produzido a partir de eNOS. A acetilcolina,

bradicinina, trombina e substância P, são os principais fatores estimulantes para

produção desse gás. Em comum, esses fatores atuam aumentando a concentração

de cálcio intracelular nas células endoteliais, o que aumenta a ligação da

calmodulina, ativando eNOS. Dessa forma, a isoforma eNOS é essencial para a

regulação da produção de NO pelas células do endotélio (BIELLI et al., 2015; SU,

2015).

O NO desempenha um papel importante na preservação da homeostase

vascular. Níveis reduzidos de NO tem sido relacionado à patogênese de diferentes

doenças, como hipertensão e aterosclerose (RAMESHRAD et al., 2016). Pepine

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0024320515300758




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(2009), afirma que a redução da atividade biológica do NO, causada tanto pela

redução na síntese como pelo aumento da degradação por estresse oxidativo, tem

sido identificada como o mecanismo de maior relevância no processo multifatorial da

disfunção endotelial e na participação das principais disfunções cardiovasculares

(SU, 2015; PEPINE, 2009).

O mecanismo do NO como vasodilatador é investigado em todo o mundo.

Apesar da simplicidade estrutural, a bioquímica do NO é complexa, e contém radical

livre com amplas e variadas ações biológicas, sendo uma molécula-chave na

regulação do tônus vascular e consequentemente na pressão arterial tanto em

animais quanto em seres humanos (DANTAS et. al., 2014).

Diferentes estudos experimentais e clínicos demonstraram que alguns

fármacos como os inibidores da enzima conversora de angiotensina, bloqueadores

da angiotensina, estimuladores da eNOS, anti-oxidantes, β-bloqueadores,

bloqueadores do canal de cálcio, inibidores da fosfodiesterase 5, entre outras,

exercem efeitos protetores sobre o endotélio vascular. Atualmente, têm-se

aumentado o interesse em compostos químicos capazes de liberar NO para os

sistemas biológicos, uma vez que os doadores de NO mais utilizados na clínica

apresentam grandes limitações. Dessa forma, os novos doadores de NO, devem

apresentar características específicas, tais como ser de fácil preparação em uma

forma pura e estável, de preferência um sólido, liberar NO quantitativamente e seus

produtos de degradação não podem ser tóxicos (PAULO, 2011).

A nNOS também está presente nos capilares alveolares. Portanto, o NO está

envolvido em diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos no sistema

respiratório (SILVA, 2014).

2.7 As Oximas

O termo oxima é a união entre as palavras oxigênio e imina, descoberta em

meados do século XIX. São compostos orgânicos cuja formula geral é RR’C=NOH,

onde o R é um substituinte orgânico e o R’ pode ser um hidrogênio ou um outro

grupo orgânico (PERES, 2009).


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As oximas (pralidoxima e abidoxima) foram originalmente utilizadas no

tratamento de intoxicação por organofosforados, devido a reativação da

acetilcolinesterase inibida (BUCKLEY et al., 2011; VAN HELDEN et al., 1996;

JOKANOVIC, 2012). Entretanto, estudos recentes já comprovam que algumas

oximas possuem ação relaxante em artéria mesentérica superior isolada de ratos,

com mecanismo relacionado à via do NO e canais para K+ (VERAS et. al., 2013).

Outras pesquisas com diferentes oximas demonstraram indução de

vasorrelaxamento por diferentes vias. Experimentos realizados em artérias sem

endotélio sugeriram o envolvimento da via NO-GMPc com o objetivo de avaliar os

efeitos vasculares induzidos por oximas (DANTAS et. al., 2014).

A estrutura química de tais oximas pode ser metabolizada por hemoproteínas,

enzimas do citocromo P450 e catalase, esta biotransformação culmina na liberação

de NO, que leva a vasodilatação independente da NOS (DANTAS et. al., 2014).

Portanto, várias delas já são consideradas novas doadoras de NO em

sistemas biológicos, como vasos sanguíneos e regiões de inflamação, sendo

comprovada sua ação como relaxante de músculo liso e anti-inflamatória (ABDEL-

AZIZ et. al., 2013).

Esta última atividade foi observada em algumas oximas estudadas por Abdel-

Aziz et. al., através do teste de edema de pata induzido por carragenina. Também foi

ressaltada a atividade gastroprotetora, onde uma análise histopatológica indicou que

o NO está envolvido na redução do aparecimento de úlcera gástrica. Além da ação

antiproliferativa, onde algumas oximas poderiam ser aliadas da terapia anticâncer,

com o intuito de exercer um efeito sinérgico, ou até retardar a resistência do fármaco

anticâncer (ABDEL-AZIZ et. al., 2013).

Além do câncer, outras patologias também causam grande impacto na

sociedade, como diabetes, hipercolesterolemia, aterosclerose e hipertensão,

entretanto estas podem ser solucionadas ou reguladas pela produção de NO a partir

de substratos exógenos por vias distintas da NOS. Amidoximas e cetoximas, são

exemplos de substâncias com a capacidade de liberar este gás. Recentemente,

vários derivados de oximas substituídas não-aromáticos foram avaliados como

doadores de NO. E então, formamidoxima, acetaldoxima, acetona oxima e

formaldoxima promoveram vasodilatação em anéis de aorta isolada de rato, na


respiratório

2016

36

ausência de endotélio funcional. Além da formamidoxima e formaldoxima, em

experimentações in vivo, na presença de um bloqueador da NOS (L-NAME), terem

permanecido com seu efeito hipotensor (JAROS et. al., 2007).


respiratório

2016

37

OBJETIVOS


respiratório

2016

38

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Contribuir para o estudo farmacológico de oximas em relação ao músculo liso e

aos sistemas cardiovascular e respiratório.

3.2 Específicos

Investigar o efeito de Aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+), oxima

substituída (OS) e prenol acetilado (Pa) sobre a aorta.

Investigar o efeito de AO, AO+, OS e Pa sobre a mesentérica.

Investigar o composto mais eficaz e potente sobre a pressão arterial em ratos

(in vivo).

Investigar o mecanismo de ação do composto mais eficaz e potente.

Investigar o efeito de AO, AO+, OS e Pa sobre a traquéia.


respiratório

2016

39

MATERIAL E

MÉTODOS


respiratório

2016

40

Piridina

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

4.1.1 Material sintético

Utilizou-se, como objeto principal de estudo neste trabalho, as etapas da

reação de síntese da oxima substituída (Figura 4). Essa síntese foi composta por

três etapas, primeiramente foi sintetizado o prenol acetilado (etanoato de 3-metil-but-

2-entila) a partir do prenol, anidrido acético e piridina (Figura 1), em seguida o prenol

acetilado reagiu com o pentilnitrito para formação da aceto-oxima (3-cloro-2-oxima-3-

metilbutilacetato) (Figura 2), e finalmente a aceto-oxima sofreu uma substituição com

a anilina, levando a formação da oxima subtituída (3-fenilamino-2-oxima-3-

metilbutilacetato) (Figura 3). O prenol acetilado, aceto-oxima e oxima substituída

foram gentilmente fornecidos pelos nossos colaboradores Profa. Dra. Cleônia

Roberta Melo Araújo e Prof. Dr. Arlan de Assis Gonsalves, do Laboratório de

Química Geral da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF).

As oximas permanecem em equilíbrio taltomérico entre a forma de oxima e de

nitroso. Diante disto, com o intuito de analisar se a temperatura influenciava este

equilíbrio, a aceto-oxima (AO) foi preparada a temperatura ambiente (22 ºC) e na

presença de temperatura (37 ºC), esta última foi denominada aceto-oxima ativada

(AO+).

Figura 1: Reação de síntese do prenol acetilado a partir do prenol e anidrido acético.

Prenol Anidrido acético Prenol acetilado


respiratório

2016

41

Pentilnitrito

Figura 2: Reação de síntese da aceto-oxima a partir do prenol acetilado e pentilnitrito.

Figura 3: Reação de síntese da oxima substituída a partir da aceto-oxima e piridina.

Figura 4: Reação completa da síntese da aceto-oxima e oxima substituída a partir do prenol.

4.1.2 Animais

Foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus) pesando entre 250 e 350 g e

cobaias (Cavia porcellus) de ambos os sexos pesando entre 300 e 500 g, todos

procedentes do Biotério Central da UNIVASF (Figura 5A e B). Antes dos

experimentos os animais foram mantidos sob rigoroso controle alimentar com uma

dieta balanceada a base de ração tipo “pellets” com livre acesso a água, com

ventilação e temperatura (221C) controladas e constantes, submetidos

Prenol acetilado

Aceto-oxima

Aceto-oxima

Anilina

Oxima substituída

Prenol Prenol acetilado

Aceto-oxima

Oxima substituída


respiratório

2016

42

diariamente a um ciclo claro-escuro de 12 h, sendo o período claro das 06 às 18 h.

Todos os experimentos foram realizados no período de 07 as 20 h.

Figura 5: Fotos de Rattus norvegicus (A) e Cavia porcellus (B).

4.1.3 Aspectos éticos

Todos os experimentos previstos foram executados de acordo com os

princípios éticos de experimentação animal da comissão de ética no uso de animais

(CEUA), pertencente ao comitê de ética e deontologia em estudos e pesquisa

(CEDEP/UNIVASF-Protocolo 0002/180615) e do Conselho Nacional de Controle de

Experimentação Animal (CONCEA). Para os experimentos, todos os animais foram

eutanasiados de modo rápido e indolor, sempre por profissional treinado em

bioterismo ou pelo próprio médico veterinário responsável pelo biotério, respeitando

a resolução do conselho federal de medicina veterinária (CFMV) nº 1000 do ano

2012 que estabelece normas para a prática didático-científica da eutanásia de

animais. Os ratos foram eutanasiados por deslocamento cervical e as cobaias por

concussão cerebral. Após eutanasiados, os animais foram colocados em recipientes

específicos para a empresa responsável recolher.

As drogas e substâncias utilizadas nos procedimentos experimentais bem

como algum material de consumo e outros materiais (seringas, agulhas, luvas de

látex descartáveis, restos de vísceras de animais, lâminas de bisturi, etc.) receberam

o mesmo tratamento do lixo hospitalar do município de Petrolina-PE, segundo a

Fonte: LAFEX

B

A


respiratório

2016

43

RDC 306 de 07 de dezembro de 2004 da ANVISA que dispõe sobre o regulamento

técnico para o gerenciamento de resíduos de serviços de saúde.

4.1.4 Substâncias e Sais

Tabela 1. Substância, sais e seus fornecedores.

Substância Fabricante

Ácido araquidônico (AA) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,

EUA)

Atropina Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,

EUA)

Bicarbonato de sódio (NaHCO3) Proquimios (RJ, Brasil)

Cloreto de cálcio bi-hidratado

(CaCl2.2H2O),

Isofar (Duque de Caxias, RJ,

Brasil)

Cloreto de sódio (NaCl) Proquimios (RJ, Brasil)

Cloreto de potássio (KCl) Vetec (RJ, Brasil)

Cloridrato de acetilcolina (ACh) Sigma-Aldrich St. Louis, MO,

EUA)

Cloridrato de L(-)-fenilefrina (FEN) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,

EUA)

Cloridrato carbamilcolina (CCh) Merck (Darmstadt, Alemanha)

Dimetilsulfóxido (DMSO) Cromato produtos químicos

LTDA.

Fosfato diácido de potássio

monohidratado (KH2PO4.H2O)

Isofar (Duque de Caxias, RJ,

Brasil)

L-NAME Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,

EUA)

Glicose anidra Proquimios (RJ, Brasil)

Salina (NaCl 0,9%) Farmax (Brasil)

Sildenafil Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,


respiratório

2016

44

EUA)

Sulfato de magnésio heptahidratado

(MgSO4.7H2O)

Proquimios (RJ, Brasil)

Twin 80 Merck (SP, Brasil)

Todas as substâncias foram solubilizadas em água pura ou, quando isso não

foi possível, em solventes adequados indicados pelos seus fabricantes, desde que

esses não sejam tóxicos em demasia para os órgãos isolados usados neste estudo.

4.1.5 Soluções Nutritivas

De acordo com os experimentos realizados, foram utilizados solução nutritiva

de Krebs, com seu pH ajustado para 7,4 com HCl (1N) e aerada com mistura

carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2). Sendo que os sais foram solubilizados em

água destilada.

Tabela 2. Composição da solução de Krebs

Substâncias Concentração (mM)

NaCl 118

KCl 4,6

MgSO4.7H2O 5,7

KH2PO4.H2O 1,1

CaCl2.2H2O 2,5

Glicose 11

NaHCO3 25

4.1.6 Aparelhos

Para o registro das contrações isométricas os segmentos dos órgãos isolados

foram suspensos em cubas (10 mL) de um sistema de banho para órgãos isolados

modelo EFF-321 (Insight Instruments, Brasil). As contrações isométricas foram

registradas através de transdutores de força modelo TRO015 (Panlab, S.L.,


respiratório

2016

45

Espanha) acoplados a um amplificador de força do tipo “bridge system” (Insight

Instruments, Brasil), conectado a um computador, sendo observados e armazenados

os registros de contração e relaxamento através do software DATAQ.

Para aferição do pH das soluções nutritivas foi utilizado um pHmetro digital de

bancada modelo pH250 (Policontrol, Brasil). Todas as substâncias foram pesadas

em balança analítica modelo FA2104N (Celtac, Brasil) ou semi-analítica modelo

MARK300 (Bel, Brasil) e os animais em balança comum modelo 9094C/4 (Toledo,

Brasil).

4.2 Métodos

4.2.1 Estudo da atividade vasorelaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-

oxima ativada e oxima substituída em aorta isoladada de rato

4.2.1.1 Preparações de anéis de aorta isolada de ratos

Os ratos foram eutanasiados por deslocamento cervical seguido por secção

dos vasos cervicais. O tórax do animal foi aberto e dissecado, a aorta torácica

(Figura 6A) foi retirada cuidadosamente e anéis aórticos de 3-5 mm (Figura 6B)

foram obtidos livres de tecido conectivo e adiposo. Foram utilizados anéis com e

sem endotélio funcional. Anéis sem endotélio funcional foram obtidos pela remoção

mecânica da camada endotelial, através do atrito provocado pela haste metálica em

contato com a parede interna do vaso. Para obtenção das respostas isométricas, os

anéis foram suspensos individualmente por hastes de aço inoxidável presas através

de fios de algodão a transdutores de força, em cubas de vidro (10 mL) contendo

solução de Krebs a 37 C e aerados com mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de

CO2). Os anéis aórticos foram deixados por um período de 60 min em repouso,

durante o qual foram mantidos sob uma tensão inicial de 1 g. Durante esse período,

a solução nutritiva foi renovada a cada 15 min para prevenir a interferência devido

ao acúmulo de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).

Após o período de estabilização, foi induzida uma contração com fenilefrina

(FEN) na concentração de 10-6 M. A integridade do endotélio vascular foi verificada


respiratório

2016

46

pela adição de acetilcolina (ACh) (10-6 M) à cuba durante a fase tônica da primeira

contração induzida por FEN (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). A retirada do

endotélio foi confirmada pela ausência ou relaxamento inferior a 10% induzido por

ACh; o mesmo foi considerado íntegro quando os anéis aórticos apresentarem

relaxamento induzido por ACh igual ou superior a 50% (em relação à força máxima

da contração inicial). Os anéis com relaxamento entre 10 e 50% foram excluídos.

Após a verificação da presença, ou não, do endotélio, as soluções de banho foram

trocadas, sendo as preparações lavadas a cada 15 min com solução de Krebs

durante um período total de 30 min. Decorrido este tempo, uma segunda contração

foi induzida pela adição de 10-6 M de FEN e durante a fase tônica e sustentada

dessa segunda contração, as substâncias foram adicionadas à cuba na

concentração máxima (10-4 M) ou de maneira cumulativa (10-7, 3.10-7, 10-6, 3.10-6,

10-5, 3.10-5 e 10-4 M), sendo avaliado seu efeito relaxante, eficácia e potência

determinadas em anéis de aorta de rato, na ausência e na presença de endotélio

funcional.

Todos os relaxamentos foram expressos como a percentagem reversa da

tensão máxima obtida pela adição da FEN à cuba, onde o relaxamento máximo foi

obtido quando a tensão registrada foi reduzida aos níveis basais iniciais.

Figura 6: Fotos da aorta de rato (A) e anel de aorta em haste metálica (B).

A

B

Fonte: LAFEX


respiratório

2016

47

4.2.2 Estudo da atividade vasorelaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-

oxima ativada e oxima substituída em mesentérica superior isoladada de rato

4.2.2.1 Preparações de anéis de mesentérica isolada de ratos

Todos os experimentos com mesentérica foram realizados no laboratório de

fisiologia e fermacologia endócrina e cardiovascular (LAFFEC), com a colaboração

da professora Dra Darízy Flávia Silva, na Univarsidade Federal da Bahia (UFBA) em

Salvador-BA.

Os ratos foram eutanasiados por câmara de CO2 seguido por secção dos

vasos cervicais. O abdomen do animal foi aberto e dissecado, a mesentérica

superior foi retirada cuidadosamente e anéis mesentéricos de 3-5 mm (Figura 7A)

foram obtidos livres de tecido conectivo e adiposo. Foram utilizados anéis com e

sem endotélio funcional. Anéis sem endotélio funcional foram obtidos pela remoção

mecânica da camada endotelial, através do atrito provocado pela haste metálica em

contato com a parede interna do vaso. Para obtenção das respostas isométricas, os

anéis foram suspensos individualmente por hastes de aço inoxidável presas através

de fios de algodão a transdutores de força, em cubas de vidro (10 mL) contendo

solução de Krebs a 37 C (Figura 7B) e aerados com mistura carbogênica (95% de

O2 e 5% de CO2). Os anéis mesentéricos foram deixados por um período de 60 min

em repouso, durante o qual foram mantidos sob uma tensão inicial de 1 g. Durante

esse período, a solução nutritiva foi renovada a cada 15 min para prevenir a

interferência devido ao acúmulo de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).

Após o período de estabilização, foi induzida uma contração com FEN na

concentração de 10-6 M. A integridade do endotélio vascular foi verificada pela

adição de ACh (10-6 M) à cuba durante a fase tônica da primeira contração induzida

por FEN (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). A retirada do endotélio foi confirmada

pela ausência ou relaxamento inferior a 10% induzido por ACh, o mesmo foi

considerado íntegro quando os anéis mesentéricos apresentaram relaxamento

induzido por ACh igual ou superior a 90% (em relação à força máxima da contração

inicial). Os anéis com relaxamento entre 10 e 90% foram excluídos. Após a

verificação da presença ou não, do endotélio, as soluções de banho foram trocadas,


respiratório

2016

48

sendo as preparações lavadas a cada 15 min com solução de Krebs durante um

período total de 30 min. Decorrido este tempo, uma segunda contração foi induzida

pela adição de 10-6 M de FEN e durante a fase tônica e sustentada dessa segunda

contração, as substâncias foram adicionadas à cuba de maneira cumulativa (10-7,

3.10-7, 10-6, 3.10-6, 10-5, 3.10-5 e 10-4 M), sendo avaliado seu efeito relaxante, eficácia

e potência determinadas em anéis de mesentérica de rato, na ausência e na

presença de endotélio funcional.


tensão máxima obtida pela adição da FEN à cuba, onde o relaxamento máximo foi

obtido quando a tensão registrada foi reduzida aos níveis basais iniciais.

Figura 7: Fotos do anel de mesentérica superior de rato (A), amplificador e anéis no banho de órgãos

(B).

4.2.3 Estudo, in vivo, do efeito da aceto-oxima sobre a pressão arterial

Os experimentos, in vivo, foram realizados em parceria com o laboratório de

farmacologia e biofísica veterinária da UNIVASF, com a colaboração do professor

Dr. Raimundo Campos Palheta Júnior.

Os animais foram anestesiados com uretana (1.2 g/kg, i.p.), em seguida foi

realizada uma canulação dos vasos cervicais. Uma cânula de polietileno (PE 50),

preenchida com solução salina e heparina (500 U/mL), foi inserida na artéria carótida

esquerda, sendo reservada para o registro da PA. Na veia jugular direita foi

introduzido um cateter (PE 50) reservado a infusão de fármacos (Figura 8).

A B

Fonte: LAFFEC


respiratório

2016

49

Figura 8: Foto do animal com as cânulas na artéria carótida e veia jugular.

A avaliação das condições hemodinâmicas do rato foi realizada mediante

registro contínuo da PA, em mmHg, graças a conexão da cânula da artéria carótida

esquerda aos transdutores de pressão MLT 1050 e MLT 0380 (Figura 9), por sua

vez acoplados a um sistema de aquisição de sinais biológicos (PowerLab/8sp,

ADInstruments). Já a freqüência cardíaca (FC, em bpm) foi determinada a partir do

registro contínuo da pressão arterial sistólica (PAS).

Figura 9: Foto da cânula da artéria carótida esquerda conectada aos transdutores de pressão MLT

1050 e MLT 0380.

O procedimento foi realizado da seguinte maneira, a aceto-oxima foi

administrada, através da cânula da jugular, nas doses de 1, 5, 10, 20, 50, 100 e 250

µg, aplicadas num intervalo de cinco minutos, para a avaliação do efeito dependente

Fonte: LAFEX

Fonte: LAFEX


respiratório

2016

50

da dose. O mesmo procedimento foi realizado com o veículo, composto por DMSO

(12%), Twin 80 (3%), água destilada (12%) e salina (73%). Em seguida, a atropina

(0,5 mg/Kg) foi administrada, após o período de dez minutos, e então 20 µg de

aceto-oxima foi injetado. Depois o L-NAME (3 mg/Kg) foi aplicado, também foi

aguardado dez minutos para a adição da aceto-oxima (20 µg). E finalmente, foi

administrado sildenafil (0,5 mg/Kg), após dez minutos, 20 µg de aceto-oxima foi

adicionado ao catéter. E então os efeitos dos bloqueadores sobre a oxima foram

observados.

4.2.4 Estudo da atividade relaxante do prenol acetilado, aceto-oxima, aceto-oxima

ativada e oxima substituída em traquéia isolada de cobaia

4.2.4.1 Preparações dos anéis de traquéia isolada de cobaia

As cobaias foram sacrificadas por concussão cerebral seguida por secção dos

vasos cervicais. O tórax da cobaia foi aberto e dissecado, a traquéia (Figura 10A) foi

retirada e limpa de todo o tecido conectivo e adiposo. O órgão foi dividido em

segmentos, contendo 3-4 anéis de cartilagem cada (Figura 10B). Foram utilizados

anéis com e sem epitélio funcional. Anéis de traqueia sem epitélio foram obtidos

através da retirada do mesmo por atrito do lúmen do órgão com uma haste envolta

em algodão e embebida com solução de Krebs. Esses segmentos foram suspensos

individualmente por hastes de aço inoxidável e fios de algodão em cubas de vidro

(10 mL) contendo solução nutritiva de Krebs e conectados a transdutores de força,

estando sob uma tensão repouso de 1 g. Estes tecidos foram mantidos a uma

temperatura de 37C, aerados com carbogênio, e permaneceram em repouso

durante 60 min, sendo a solução trocada a cada 15 min. Após o período de

estabilização, uma primeira contração foi induzida pela adição de 10-6 M de carbacol

(CCh) à cuba.

A integridade do epitélio da traquéia foi verificada pela adição de ácido

araquidônico (AA) a cuba na concentração de 10-4 M (TSCHIRHART et al., 1987)

durante a fase tônica da primeira resposta induzida por CCh, onde anéis que

obtiveram relaxamentos superiores a 50% (em relação a força de contração inicial)


respiratório

2016

51

foram considerados com epitélio funcional. A retirada do epitélio foi confirmada pela

ausência de relaxamento em resposta à adição de AA a cuba ou quando este

relaxamento foi inferior a 10%, sendo este anel considerado sem epitélio funcional.

Os experimentos foram realizados com anéis de traqueia providos ou desprovidos

de epitélio funcional. Os anéis com relaxamento entre 10 e 50% foram excluídos.

Após a verificação da presença, ou não, do epitélio, as a soluções de banho foram

trocadas, sendo as preparações lavadas a cada 15 min com solução de Krebs

durante um período total de 30 min. Após a verificação da presença, ou não, do

epitélio, as soluções de banho foram trocadas, sendo as preparações lavadas a

cada 15 min com solução de Krebs durante um período total de 30 min. Decorrido

este tempo, uma segunda contração foi induzida pela adição de 10-6 M de CCh e

durante a fase tônica e sustentada dessa segunda contração, as substâncias foram

adicionadas à cuba na concentração máxima (10-4 M) e de maneira cumulativa (10-7,

3.10-7, 10-6, 3.10-6, 10-5, 3.10-5 e 10-4 M), sendo avaliado o seu efeito relaxante,

eficácia e potência determinadas em anéis de traqueia de cobaia na presença e na

ausência de epitélio funcional.


tensão máxima obtida pela adição da CCh à cuba, onde o relaxamento máximo foi

obtido quando a tensão registrada era reduzida aos níveis iniciais, isto é, foram

numericamente iguais a tensão inicial antes da adição da CCh à cuba.

Figura 10: Fotos da traquéia de cobaia (A) e anéis de traquéia em hastes metálicas (B).

A

B

Fonte: LAFEX


respiratório

2016

52

4.3 Análise dos Dados

Todos os dados obtidos foram expressos como média ± erro padrão da média.

O valor de “n” se refere ao número animais utilizados em cada experimento em um

dado protocolo, que pode chegar até um máximo de 7 animais, para que o resultado

obtido possa ser representativo e ao mesmo tempo não se use animais em demasia.

Para os experimentos in vitro, usando órgãos isolados, foi realizado ANOVA

seguido de Dunnet, onde as curvas mostrando a relação concentração-resposta de

uma substância foram ajustadas por uma regressão não-linear descrita pela

equação: Y = min + (max-min)/(1+10(LogEC50-X)*S)); onde “X” é o logaritmo na base 10

da concentração molar da substância testada, “Y” é a resposta relaxante da

substância testada em percentagem, “min” é o menor efeito assumido para “Y”,

“max” é o maior efeito assumido para “Y” e “S” é o valor da constante de Hill

(MOTULSKY; CHRISTOPOULOS, 2003). Através dessa equação foram calculados

os valores de pD2 (Logaritmo da concentração molar de uma substância em que ela

é capaz de causar 50% de seu efeito máximo), servindo como parâmetro de

potência relativa de uma substância, e o Emax (valor médio, em percentagem, do

efeito máximo obtido por uma substância em relação ao maior valor possível num

dado tecido) servindo como parâmetro de eficácia relativa de duas substâncias

(NEUBIG et al., 2003).

Diferenças entre as médias foram comparadas estatisticamente usando o teste

“t” de Student não-pareado, onde essas diferenças foram consideradas significantes

quando o valor calculado de “p” foi menor que 0,05. As análises estatísticas foram

realizadas usando o programa Graph-Pad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., San

Diego, CA, EUA).


respiratório

2016

53

RESULTADOS


respiratório

2016

54

5 RESULTADOS

5.1 Estudo da atividade vasorrelaxante das oximas em aorta isolada de rato

5.1.1 Escolha do solvente para preparo da solução-estoque

Nos experimentos in vitro, as substâncias foram dissolvidas com DMSO e

H2O, na proporção de 1:1, ou apenas em DMSO, então foi realizada a análise

estatística e ambos não foram significativamente diferentes (Figura 11). Entretanto,

AO, AO+ e Pa não foram dissolvidos em DMSO e H2O, portanto foi padronizado

apenas o DMSO para dissolução no preparo da solução-estoque.

O DMSO foi o solvente escolhido pelo fato dele ser aprótico (ANGELO et. al.,

2005), o que favorece que as moléculas permaneçam na forma de oxima, uma vez

que elas estão em equilíbrio taltomérico entre oxima e nitroso.

Já para os experimentos in vivo, foi utilizada uma mistura de DMSO (12%),

Twin 80 (3%), água destilada (12%) e salina (73%). Foram avaliados os efeitos

deste veículo sobre a FC (Figura 21), PAS (Figura 22), PAD (Figura 23) e PAM

(Figura 24), que não alterou significativamente estes parâmetros, e também não

modificou o efeito da AO em reduzir os níveis pressóricos em rato.

Figura 11: Valores de Emax dos veículos DMSO+H2O e DMSO em enéis de aorta, pré-contraídos com

10-6 M de FEN, na presença e ausência de endotélio. As colunas e barras verticais representam a

média e o e.p.m, respectivamente; (n=3).

DM

SO

+H

2O

(E

+)

DM

SO

(E+)

DM

SO

+H

2O

(E

-)

DM

SO

(E-)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Em

ax

(%)


respiratório

2016

55

5.1.2 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e na

ausência de endotélio funcional

A aceto-oxima (AO) (Figura 2), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de

aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M), atingindo um Emáx de

36,3±2,9% e 63,0±0,5% (Figura 12) na presença e na ausência de endotélio

funcional, respectivamente. Observou-se que AO foi mais eficaz na ausência de

endotélio funcional.

Adicionalmente, AO (de 10-7 a 10-4 M) relaxou de maneira dependente de

concentração os anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M),

atingindo um Emáx, na concentração de 10-4 M, de 50,0±10,8%, em anéis com

endotélio, e de 100,0±13,2% em anéis sem endotélio (Figura 13). AO foi

significativamente mais eficaz (p<0,05) na ausência de endotélio.

O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da AO foi de 4,1±0,1 na

presença e de 4,9±0,1 na ausência de endotélio, e foi mais eficaz (p<0,05) na

ausência de endotélio.

5.1.3 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de aorta isolada de rato na presença

e na ausência de endotélio funcional

A aceto-oxima ativada (AO+) (Figura 2), na concentração de 10-4 M, relaxou

anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M), atingindo um Emáx

de 40,0±12,5% e 42,7±10,9% (Figura 12) na presença e na ausência de endotélio

funcional, respectivamente. Não houve diferença significativa em relação à eficácia.

Adicionalmente, a AO+ (de 10-7 a 10-4 M) relaxou de maneira dependente de

concentração os anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M),

atingindo um Emáx de 49,8±5,8%, na concentração de 10-4 M, na presença e de

63,0±8,9% na ausência de endotélio funcional (Figura 13). Não houve diferença

significativa em relação à eficácia.

O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da oxima foi de 4,4±0,1 na

presença e de 4,1±0,1 na ausência de endotélio, não houve diferença significativa

entre esses valores.


respiratório

2016

56

5.1.4 Efeito da oxima substituída sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e

na ausência de endotélio funcional

A oxima substituída (OS) (Figura 3), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis

de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M), atingindo um Emáx de

40,3±9,3% e 40,3±10,5% (Figura 12) na presença e na ausência de endotélio

funcional, respectivamente. Não ocorreu diferença significativa em relação à

eficácia.

Adicionalmente, a oxima substituída (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira

dependente de concentração, anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com

FEN (10-6 M), atingindo um Emáx de 47,0±7,5%, na concentração de 10-4 M, na

presença de endotélio funcional e de 40,3±10,5% na ausência dele (Figura 13). Não

houve diferença significativa em relação à eficácia.

O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da oxima foi de 4,6±0,6 na


entre estes resultados.

5.1.5 Efeito do Prenol acetilado sobre anéis de aorta isolada de rato na presença e

na ausência de endotélio funcional

O prenol acetilado (Pa) (Figura 1) relaxou, na sua concentração de 10-4 M,

anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6 M), atingindo um efeito

máximo (Emáx) de 15,7±2,4% em anéis com endotélio e 0,7±0,3% em anéis sem

endotélio funcional (Figura 12). Observou-se que o Pa foi mais eficaz na presença

de endotélio (p<0,05).


respiratório

2016

57

Figura 12: Valores de Emax do prenol acetilado (Pa), aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+) e

oxima substituída (OS) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença e na

ausência de endotélio. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m,

respectivamente. *p<0,05 (teste “t”: E+ vs. E-; n=3 a 7).

AO (E + ) AO (E -)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Em

ax

(%)

*

AO + (E + ) AO + (E -)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Em

ax

(%)

Em

ax

(%

)

O S (E + ) O S (E -)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

P a (E + ) P a (E -)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Em

ax

(%)

*


respiratório

2016

58

Figura 13: Efeito relaxante de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+) e oxima substituída (OS)

sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença (■) e na ausência (□) de

endotélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05

(teste “t”: E+ vs. E-; n=5 ou 6).

lo g [A O ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

A O (E + )

A O (E - )

*

**

lo g [A O + ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

A O + (E - )

A O + (E + )

lo g [O S ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

O S (E + )

O S (E - )

5.1.6 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de aorta isolada de rato na

presença e na ausência de endotélio funcional

Nos experimentos em anéis de aorta na presença de endotélio funcional a OS,

AO+, AO, Pa e veículo não foram significativamente diferentes em relação a eficácia,

tanto quando aplicados na sua concentração máxima (10-4 M) quanto

cumulativamente (10-7 a 10-4 M) (Figuras 14 e 15). Já na ausência de endotélio, AO

foi significativamente eficaz nas aplicações de 10-4 M e cumulativamente (10-7 a 10-4

M) (Figuras 16 e 17).


respiratório

2016

59

Figura 14: Valores de Emax da oxima substituída, aceto-oxima ativada, aceto-oxima, prenol acetilado

e veículo em anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença de endotélio. As

colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente; (n=3).

OS

(E

+)

AO

+ (

E+)

AO

(E

+)

Pa (

E+)

Veíc

ulo

(E

+)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Em

ax

(%)


e veículo em anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na ausência de endotélio. As

colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05 (n=3).

Em

ax

(%

)

OS

(E

-)

AO

+ (

E-)

AO

(E

-)

Pa (

E-)

Veíc

ulo

(E

-)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

*


respiratório

2016

60

Figura 16: Efeito relaxante da oxima substituída (■), aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■) e

veículo (■) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na presença de endotélio. Os

símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente; (n=5).

lo g [X ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

O S (E + )

A O + (E + )

A O (E + )

V e íc u lo (E + )

Figura 17: Efeito relaxante da oxima substituída (■), aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■) e

veículo (■) sobre anéis de aorta, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na ausência de endotélio. Os

símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05 (n=5).

lo g [X ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

O S (E - )

A O + (E - )

A O (E - )

V e íc u lo (E - )* *

*

*


respiratório

2016

61

5.2 Estudo do efeito vasorelaxante das oximas em mesentérica superior

isolada de rato

5.2.1 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato na

presença e na ausência de endotélio funcional

A AO (Figura 2) (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de

concentração, anéis de mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN

(10-6 M), atingindo um Emáx de 100,2±4,4%, na concentração de 10-4 M, na presença

de endotélio funcional e 89,8±10,9% na ausência dele (Figura 18). Não houve

diferença significativa em relação à eficácia.



entre esses resultados.

5.2.2 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de mesentérica superior isolada de

rato na presença e na ausência de endotélio funcional

A AO+ (Figura 2) (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de





O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante da AO+ foi de 4,8±0,2 na


entre eles.

5.2.3 Efeito da oxima substituída sobre anéis de mesentérica superior isolada de


A OS (Figura 3) (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de



respiratório

2016

62







5.2.4 Efeito do prenol acetilado sobre anéis de mesentérica superior isolada de rato

na presença e na ausência de endotélio funcional

O Pa (Figura 1) (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de





O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante do Pa foi de 4,7±0,3 na


entre estes valores.


respiratório

2016

63

Figura 18: Efeito relaxante de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+), oxima substituída (OS)

e prenol acetilado (Pa) sobre anéis de mesentérica superior, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na

presença (■) e na ausência (□) de endotélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ±

e.p.m., respectivamente; (n=5).

lo g [A O ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

A O (E + )

A O (E - )

lo g [A O + ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

A O + (E + )

A O + (E - )

lo g [O S ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

O S (E + )

O S (E - )

lo g [P a ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

P a (E + )

P a (E - )

5.2.5 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de mesentérica isolada de


Em anéis de mesentérica a AO, aplicada de maneira cumulativa (10-7 a

10-4 M), foi significativamente eficaz quando comparada as demais oximas, tanto na

presença (Figura 19) quanto na ausência de endotélio funcional (Figura 20).


respiratório

2016

64

Figura 19: Efeito relaxante da oxima substituída (■), aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■), prenol

acetilado (■) e veículo (■) sobre anéis de mesentérica, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na

presença de endotélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m.,

respectivamente. *p<0,05 (n=5).

lo g [X ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

O S (E + )

A O + (E + )

A O (E + )

P a (E + )

V e íc u lo (E + )*

Figura 20: Efeito relaxante da oxima substituída (■), aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■), prenol

acetilado (■) e veículo (■) sobre anéis de mesentérica, pré-contraídos com 10-6 M de FEN, na

ausência de endotélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m.,


lo g [X ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

O S (E - )

A O + (E - )

A O (E - )

P a (E - )

V e íc u lo (E - )

*

*


respiratório

2016

65

Tabela 3. Comparação entre os valores do Emax das oximas em aorta e mesentérica.

Oxima

Emax

Aorta Mesentérica

Presença

de endotélio

(E+)

Ausência

de endotélio (E-

)

Presença

de endotélio

(E+)

Ausência

de endotélio

(E-)

AO 50,0±10,8%

100,0±13,

2%

100,2±4,4%

89,8±10,

9%

AO+ 49,8±5,8% 63,0±8,9% 80,8±6,2%

67,2±10,

3%

OS 47,0±7,5% 40,3±10,5

%

52,0±4,3%

68,8±5,7

%

Tabela 4. Comparação entre os valores do pD2 das oximas em aorta e mesentérica.

Oxima

pD2

Aorta Mesentérica

Presença

de endotélio

(E+)

Ausência

de endotélio (E-

)

Presença

de endotélio

(E+)

Ausência

de endotélio

(E-)

AO 4,1±0,1 4,9±0,1 4,9±0,1 5,1±0,2

AO+ 4,4±0,1 4,1±0,1 4,8±0,2 4,8±0,3

OS 4,6±0,6 4,7±0,4 4,3±0,2 4,4±0,1

5.3 Estudo, in vivo, do efeito da aceto-oxima sobre a PA

Nos experimentos in vitro, AO apresentou maior potência relaxante, portanto

foi investigado seu efeito sobre a PA, in vivo, em ratos. As injeções intravenosas de

AO nas doses de 1 a 250 µg produziram reduções na FC, pressão arterial sistólica

(PAS), diastólica (PAD) e média (PAM). As reduções na PA e FC foram de início

rápido e curta duração. A FC foi significativamente diminuída nas doses de 1, 10, 20,

50, 100 e 250 µg da AO (Figura 21). Enquanto que as PAS e PAD foram reduzidas


respiratório

2016

66

nas doses de 20, 50, 100 e 250 µg (Figuras 22 e 23), entretanto a PAM foi a partir da

dose de 10 µg (Figura 24).

Figura 21: Efeito da aceto-oxima (■) e do veículo (□), nas doses de 1 a 250 µg, sobre a FC. Os


F

C (

bp

m)

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

V e íc u lo

A O

D o s e (g )

*

* **

* *

Figura 22: Efeito da aceto-oxima (■) e do veículo (□), nas doses de 1 a 250 µg, sobre a PAS. Os


D o s e (g )

P

AS

(m

mH

g)

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

V e ic u lo

A O

* ** *


respiratório

2016

67

Figura 23: Efeito da aceto-oxima (■) e do veículo (□), nas doses de 1 a 250 µg, sobre a PAD. Os


D o s e (g )

P

AD

(m

mH

g)

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

V e ic u lo

A O

** * *

Figura 24: Efeito da aceto-oxima (■) e do veículo (□), nas doses de 1 a 250 µg, sobre a PAM. Os


D o s e (g )

P

AM

(m

mH

g)

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

V e ic u lo

A O

*

** * *

De acordo com as figuras 21, 22, 23 e 24, geralmente o efeito hipotensor foi

observado a partir da dose de 20 µg. Portanto, esta foi a dose padronizada para

testar os inibidores.

As reduções da FC (Figura 25), PAS (Figura 26), PAD (Figura 27) e PAM

(Figura 28) em resposta a administração intravenosa da AO (20 µg) não foram


respiratório

2016

68

atenuadas após a administração de 0,5 mg/Kg de atropina, antagonista de

receptores muscarínicos, indicando que a redução da FC e da PA não foi mediada

pela ativação muscarínica.

O mesmo aconteceu após a administração intravenosa de 3 mg/Kg de

L-NAME, bloqueador da NOS, comprovando que a redução da FC e da PA não tem

relação com a produção fisiológica de NO (Figuras 25, 26, 27 e 28).

Já após a administração intravenosa de 0,5 mg/Kg de sildenafil, inibidor da

fosfodiesterase 5 (PDE5), também não ocorreu atenuação da redução da FC (Figura

25), PAS (Figura 26), PAD (Figura 27) e PAM (Figura 28) causadas pela AO,

entretanto ocorreu um aumento na duração do efeito redutor da PA (Figura 29). Isto

significa que, provavelmente, o efeito hipotensor da AO está envolvido com a via

GC/GMPc/PKG.

Figura 25: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a FC, na presença de atropina, L-NAME e

sildenafil. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05

(n=5).

F

C (

bp

m)

VA

O

AO

At

AO

L

AO

S

Atr

op

ina

VA

t

L-n

am

eV

L

Sild

en

af i

lV

S

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

V: veículo

AO: aceto-oxima

AOAt: AO na presença de atropina

AOL: AO na presença de L-NAME

AOS: AO na presença de sildenafil

VAt: V na presença de atropina

VL: V na presença de L-NAME

VS: V na presença de sildenafil


respiratório

2016

69

Figura 26: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAS, na presença de atropina, L-NAME

e sildenafil. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente. *p<0,05

(n=5).

P

AS

(m

mH

g)

VA

O

AO

At

AO

L

AO

S

Atr

op

ina

VA

t

L-n

am

eV

L

Sild

en

af i

lV

S

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

* *

Figura 27: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAD, na presença de atropina, L-NAME


(n=5).

P

AD

(m

mH

g)

VA

O

AO

At

AO

L

AO

S

Atr

op

ina

VA

t

L-n

am

eV

L

Sild

en

af i

lV

S

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

*

V: veículo

AO: aceto-oxima







V: veículo

AO: aceto-oxima








respiratório

2016

70

Figura 28: Efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PAM, na presença de atropina, L-NAME


(n=5).

P

AM

(m

mH

g)

VA

O

AO

At

AO

L

AO

S

Atr

op

ina

VA

t

L-n

am

eV

L

Sild

en

af i

lV

S

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

* *

Figura 29: Duração do efeito da aceto-oxima, na dose de 20 µg, sobre a PA, na presença de

atropina, L-NAME e sildenafil. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m,


Du

ra

çã

o d

o e

feit

o d

a A

O (

s)

AO

AO

At

AO

L

AO

S

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

*

V: veículo

AO: aceto-oxima







AO: aceto-oxima





respiratório

2016

71

5.4 Estudo do efeito relaxante das oximas em traquéia isolada de cobaia

5.4.1 Efeito da aceto-oxima sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na presença e

na ausência de epitélio funcional

A AO (Figura 2), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de traquéia isolada

de cobaia pré-contraídos com carbacol (CCh) (10-6 M), atingindo um Emáx de

19,3±1,4% e 32,7±3,9% (Figura 30) na presença e na ausência de epitélio funcional,

respectivamente. AO foi significativamente eficaz na ausência de epitélio.

AO (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de concentração, anéis

de traquéia isolada de cobaia pré-contraídos com CCh (10-6 M), atingindo um Emáx de

50,8±9,2%, na concentração de 10-4 M, na presença de epitélio funcional e

35,4±4,5% na ausência dele (Figura 31). Não houve diferença significativa em

relação à eficácia.


presença e de 3,7±0,9 na ausência de epitélio, não houve diferença significativa


5.4.2 Efeito da aceto-oxima ativada sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na

presença e na ausência de epitélio funcional

A AO+ (Figura 2), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de traquéia isolada

de cobaia, pré-contraídos com carbacol (CCh) (10-6 M), atingindo um Emáx de


respectivamente. Não houve diferença significativa em relação à eficácia.

Adicionalmente, a AO+ (de 10-7 a 10-4 M) relaxou de maneira dependente de

concentração, anéis de traquéia isolada de cobaia pré-contraídos com CCh (10-6 M),

atingindo um Emáx de 73,0±5,2%, na concentração de 10-4 M, na presença de epitélio

funcional e 28,8±3,2% na ausência dele (Figura 31). AO+ foi significativamente

(p<0,05) eficaz na presença de epitélio.


respiratório

2016

72


presença e de 4,0±0,5 na ausência de epitélio, esta oxima foi significativamente

(p<0,05) eficaz na presença de epitélio.

5.4.3 Efeito da oxima substituída sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na


A OS (Figura 3), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de traquéia isolada

de cobaia, pré-contraídos com carbacol (CCh) (10-6 M), atingindo um Emáx de


respectivamente. Não ocorreu diferença significativa em relação à eficácia.

5.4.4 Efeito do prenol acetilado sobre anéis de traquéia isolada de cobaia na


O Pa (Figura 1), na concentração de 10-4 M, relaxou anéis de traquéia isolada

de cobaia pré-contraídos com carbacol (CCh) (10-6 M), atingindo um Emáx de


respectivamente. Não ocorreu diferença significativa em relação à eficácia.

Adicionalmente, o Pa (de 10-7 a 10-4 M) relaxou, de maneira dependente de

concentração, anéis de traquéia isolada de cobaia pré-contraídos com CCh (10-6 M),

atingindo um Emáx de 45,2±17,1%, na concentração de 10-4 M, na presença de

epitélio funcional e de 25,4±2,0% na ausência dele (Figura 31). Não houve diferença

significativa em relação à eficácia.

O valor de pD2 apresentado para o efeito relaxante do prenol acetilado foi de

0,9±0,0 na presença e de 3,8±0,7 na ausência de epitélio, não houve diferença

significativa entre esses valores.


respiratório

2016

73

Figura 30: Valores de Emax de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+), oxima substituída (OS)

e prenol acetilado (Pa) sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença e na

ausência de epitélio. As colunas e barras verticais representam a média e o e.p.m, respectivamente;

p<0,05; (n=3 a 5).

Em

ax

(%

)

AO (E + ) AO (E -)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

*

Em

ax

(%

)

AO + (E + ) AO + (E -)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Em

ax

(%

)

O S (E + ) O S (E -)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Em

ax

(%

)

P a (E + ) P a (E -)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0


respiratório

2016

74

Figura 31: Efeito relaxante de aceto-oxima (AO), aceto-oxima ativada (AO+) e prenol acetilado (Pa)

sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença (■) e na ausência (□) de

epitélio. Os símbolos e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05

(teste “t”: E+ vs. E-; n=5).

lo g [A O ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

A O (E + )

A O (E - )

lo g [A O + ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

A O + (E + )

A O + (E - )

*

*

lo g [P a ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

P a (E + )

P a (E - )

5.3.5 Comparação dos efeitos das oximas sobre anéis de traquéia isolada de cobaia

na presença e na ausência de epitélio

Em anéis de traquéia na presença de epitélio, concentração de 10-4 M, AO+ e

Pa foram significativamente (p<0,05) eficazes (Figura 32), enquanto que na ausência

dele, somente AO foi significativamente (p<0,05) eficaz (Figura 33). Já na aplicação

cumulativa (10-7 a 10-4 M), na presença de epitélio, apenas AO+ foi

significativamente (p<0,05) eficaz (Figura 34), e na ausência de epitélio, nenhuma

substância apresentou significância em relação à eficácia (Figura 35).


respiratório

2016

75


e veículo em anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença de epitélio. As


Em

ax

(%

)

AO

(E

+)

AO

+ (

E+)

OS

(E

+)

Pa (

E+)

Veíc

ulo

(E

+)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

* *


e veículo em anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na ausência de epitélio. As


Em

ax

(%

)

AO

(E

-)

AO

+ (

E-)

OS

(E

-)

Pa (

E-)

Veíc

ulo

(E

-)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

*


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76

Figura 34: Efeito relaxante da aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■), prenol acetilado (■) e veículo

(■) sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na presença de epitélio. Os símbolos

e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p<0,05 (n=5).

lo g [X ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

A O (E + )

A O + (E + )

P a (E + )

* V e íc u lo (E + )

Figura 35: Efeito relaxante da aceto-oxima ativada (■), aceto-oxima (■), prenol acetilado (■) e veículo

(■) sobre anéis de traquéia, pré-contraídos com 10-6 M de CCh, na ausência de epitélio. Os símbolos

e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente; (n=5).

lo g [X ] (M )

Re

lax

am

en

to (

%)

-7 .0 -6 .5 -6 .0 -5 .5 -5 .0 -4 .5 -4 .0

-4 0

-2 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

A O (E - )

A O + (E - )

P a (E - )

V e íc u lo (E - )


respiratório

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DISCUSSÃO


respiratório

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78

6 DISCUSSÃO

No presente estudo foi possível observar o efeito relaxante, in vitro, da AO

(3-cloro-2-oxima-3-metilbutilacetato) (Figura 2) sobre a musculatura lisa de

vasos de condutância (aorta) e de resistência (mesentérica superior), bem

como um efeito hipotensor, in vivo, em ratos anestesiados. As evidências

farmacológicas dão suporte à hipótese que tais efeitos no sistema

cardiovascular se devem a doação de NO pela oxima, sendo o mecanismo de

sinalização celular relacionado à via do NO-GMPc-PKG. Vale ressaltar que o

atual trabalho é pioneiro na demonstração do efeito relaxante desta oxima, não

havendo outros relatos sobre tal atividade na literatura especializada.

Apesar deste ineditismo de AO, pesquisas com outras oximas

demonstraram atividade anti-inflamatória, anti-ulcerogênica, antiproliferativa

(ABDEL-AZIZ et. al., 2013), antiviral (SIN et. al., 2009) e anti-hipertensiva

(DANTAS et. al., 2014; JAROS et. al., 2007). Esta última foi investigado nesse

estudo.

Embora três oximas (AO, AO+ e OS) terem sido testadas, apenas a AO

demonstrou efeito significativo, sendo eficaz e possuindo maior potência, bem

como foi em aorta e mesentérica superior isoladas de rato, como podemos

comprovar pelas figuras 15, 17 e 20. Tal efeito foi semelhante apenas nos

vasos citados, uma vez que em traquéia isolada de cobaia, AO só foi eficaz na

concentração de 10-4 M (Figura 33), o que não se repetiu na aplicação

cumulativa (10-7 a 10-4 M) (Figura 35). Nesta última concentração, apenas AO+

apresentou eficácia (Figura 34), diferente do que foi observado em aorta e

mesentérica.

Diante do exposto, AO só foi eficaz em aorta na ausência de endotélio

funcional (Figuras 12 e 13), diferente do resultado em mesentérica, onde ela foi

eficaz tanto na presença quanto na ausência de endotélio (Figura 18). O que

também foi distinto em traquéia, em que AO só foi eficaz na ausência de

epitélio, quando aplicada na concentração de 10-4 M (Figura 33), sendo que

esse efeito não foi reproduzido na aplicação cumulativa (10-7 a 10-4 M) (Figura

35). Já na presença de epitélio, AO não foi eficaz em nenhuma concentração


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2016

79

(Figuras 32 e 34). Neste caso, dentre as oximas, apenas AO+ foi eficaz em

ambas as concentrações (Figuras 32 e 34), mas na concentração de 10-4 M, Pa

apresentou relaxamento semelhante a AO+. Portanto, AO foi independente de

epitélio, mas não apresentou efeito quando aplicada cumulativamente, e AO+

foi dependente de epitélio para promover broncodilatação. Já nos vasos, AO

demonstrou que seu efeito relaxante não depende dos fatores derivados do

endotélio.

Acredita-se que AO seja um doador de NO, pois pesquisas realizadas

com várias oximas indicam que elas são doadoras de NO, e seu efeito

relaxante está envolvido com a via do NO-GMPc e canais para K+ (ABDEL-

AZIZ et. al., 2013; DANTAS et. al., 2014; NAKAO et. al., 2013). Portanto, a

independência de endotélio já era esperada, uma vez que AO provavelmente

causa liberação de NO e não precisa da eNOS para formação do mesmo.

Como já foi observado, AO demonstrou eficácia em mesentérica tanto na

presença quanto na ausência de endotélio, mas em aorta isto só ocorreu na

ausência de endotélio. Esta diferença entre os resultados dos órgãos se explica

pelo fato da artéria aorta ser um vaso de condutância e a mesentérica de

resistência, uma vez que este último tipo é responsável por mais de 80% da

resistência do fluxo sanguíneo corporal, sendo fundamental para alterações na

RPT, e consequentemente na PA (QUEK et. al., 2016).

É importante mencionar que o Pa foi testado com intuito de observar se

as oximas, sintetizadas a partir dele (Figura 4), causavam relaxamento no

órgão pela liberação de NO, uma vez que o Pa não libera esse gás.

Com o intuito de embasar melhor a proposta de doação de NO pela AO,

seus efeitos foram comparados com os de alguns doadores de NO presentes

na literatura. Pesquisas in vitro em aorta, realizadas com nitroprussiato de

sódio (doador clássico de NO utilizado na clínica) apontaram um Emax de

101,2±2,8%, semelhante ao da AO, 100,0±13,2% (Figura 13). No entanto, em

relação à potência farmacológica, o nitroprussiato apresentou pD2 de

8.25±0.12 e a AO de 4,9±0,1, sendo menos potente que o primeiro (LIMA et.

al., 2014).


respiratório

2016

80

Após comparar AO com outra oxima estudada por Dantas et. al. (oxima

S1), pode-se observar que AO relaxou, de maneira dependente de

concentração, os anéis de aorta isolada de rato pré-contraídos com FEN (10-6

M), e apresentou Emáx de 50,0±10,8%, na presença de endotélio (Figura 13),

sendo inferior ao da oxima S1, que foi 80±15%. Já na ausência de endotélio,

AO demonstrou Emáx de 100,0±13,2% (Figura 13), semelhante ao da oxima S1

que obteve 94±4%. AO foi significativamente mais eficaz (p<0,05) na ausência

de endotélio, já a oxima S1 não apresentou diferença significativa em relação à

eficácia dela na presença e na ausência de endotélio, mostrando

comportamento semelhante em ambos os casos (DANTAS et. al., 2014).

Contudo, em anéis de mesentérica na presença de endotélio, AO

apresentou Emáx de 100,2±4,4% (Figura 18), semelhante ao da oxima S1 que

foi 98±1%. O mesmo ocorreu na ausência de endotélio, uma vez que a AO

obteve Emáx de 89,8±10,9% (Figura 18) e a oxima S1 de 100±1%. Portanto, AO

e oxima S1 não possuíram diferença significativa em relação à eficácia na

presença ou ausência de endotélio funcional (DANTAS et. al., 2014).

Outro doador de NO encontrado na literatura foi o nitrato ciclohexano

(HEX), que administrado cumulativamente (10-10 a 10-3 M) em mesentérica,

possuiu Emax, na presença de endotélio,de 67,0±2,8% enquanto AO (10-7 a 10-4

M) foi de 100,2±4,4% (Figura 18), que foi superior mesmo em menor

concentração. Entretanto, na ausência de endotélio, HEX atingiu Emax de

100,4±4,1% e AO de 89,8±10,9% (Figura 18), demonstrando semelhança em

seus resultados. Quanto a potência farmacológica, na presença de endotélio

funcional, HEX apontou um pD2 de 5,84±0,22 e AO de 4,9±0,1, enquanto que

na ausência de endotélio, o pD2 de HEX foi 5,11±0,12 e o de AO 5,1±0,2.

Portanto, na presença de endotélio AO foi mais eficaz que HEX, e na ausência

deste, ela apresentou eficácia e potência similares ao HEX, mas vale relembrar

que HEX foi administrado em maior concentração (MENDES-JÚNIOR et. al.,

2015).

Como as oximas, provavelmente, são doadoras de NO, este também

está envolvido em diversos processos fisiopatológicos do trato respiratório

(SILVA, 2014), por isso que as mesmas foram testadas tanto em vasos (aorta e


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2016

81

mesentérica) como em traquéia. Comparamos o Emax delas nos três órgãos, e

foi possível visualizar que AO possuiu maior eficácia na promoção de

vasorrelaxamento do que na de broncodilatação.

Com isto, experimentos in vivo foram realizados para analisar o efeito de

AO sobre os níveis pressóricos, cujos resultados demonstraram que ela

também é significativamente eficaz na redução da FC (Figura 21), PAS (Figura

22), PAD (Figura 23) e PAM (Figura 24). Esse efeito redutor da PA foi breve, ou

seja, rapidamente os níveis pressóricos retornaram ao normal. Sendo mais um

indício de doação de NO, uma vez que este é um gás, então a hipotensão se

inicia e termina velozmente.

Então, foi possível visualizar que AO foi eficaz tanto in vitro quanto in

vivo, semelhante aos resultados da oxima S1, formamidoxima, formaldoxima e

nitroprussiato de sódio, uma vez que o efeito destas substâncias ocorreu via

NO-GC (DANTAS et. al., 2014; JAROS et. al., 2007; LIMA et. al., 2014).

Foi visto que a PA pode ser calculada a partir da fórmula “PA = DC x

RVP”, portanto qualquer que seja a alteração no DC ou na resistência vai

promover modificação dos níveis pressóricos (LATERZA et. al., 2008). Como

AO provoca vasorrelaxamento, resultado visualizado nos experimentos in vitro

com aorta e mesentérica (Figuras 13 e 18), isto culmina na redução da RVP e

consequente redução da PA, como observado in vivo (Figuras 22, 23 e 24).

Com o intuito de investigar o mecanismo de ação da AO, foi observado

seu efeito hipotensor na presença da atropina, antagonista dos receptores

muscarínicos, o qual não foi alterado, isto confirma que seu relaxamento não

foi mediado pela ativação dos receptores muscarínicos (YOO et. al., 2015). Isto

foi semelhante a dois doadores de H2S (Na2S e NaHS), que também

promovem vasorrelaxamento, e a presença da atropina não atenuou seu efeito

hipotensor (YOO et. al., 2015).

Como já foi mencionado, pesquisas realizadas com várias oximas indicam

que elas são doadoras de NO, e seu efeito relaxante está envolvido com a via

do NO-GMPc e canais para K+ (ABDEL-AZIZ et. al., 2013; DANTAS et. al.,

2014; NAKAO et. al., 2013). Portanto, a AO foi investigada na presença de L-

NAME, inibidor da NOS, e o efeito redutor da PA não foi atenuado. Dessa


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2016

82

forma observou-se que ela não depende da produção fisiológica de NO (YOO

et. al., 2015). O mesmo ocorreu com a formamidoxima (JAROS et. al., 2007) e

oxima S1, que também constataram ser independentes da NOS (DANTAS et.

al., 2014).

Então, para investigar se AO estava realmente envolvida com a

produção de GMPc, a mesma foi analisada após aplicação de sildenafil

(inibidor da fosfodiesterase 5), que impede a degradação do GMPc (JUPITER

et. al., 2015), com isso o período de duração do seu efeito sobre a PA foi

prolongado.

O sildenafil é bastante útil na disfunção erétil, segundo Jupter et. al,

Na2S é um doador de H2S e acredita-se que ele tenha atuação semelhante a

este fármaco. Na sua análise não ocorreu diferença significativa, em relação

aos níveis de pressão intracavernosa, do Na2S e do nitroprussiato de sódio

(doador de NO), uma vez que ambos atuam pela via do GMPc-PKG (JUPTER

et. al., 2015). Provavelmente, AO também é um doador de NO, e esse aumento

da duração do efeito hipotensor dela na presença do sildenafil, possivelmente

ocorreu pela produção de GMPc (induzida por AO) e pela inibição da

degradação dele (induzida por sildenafil), como o GMPc demorou para ser

metabolizado, devido a inibição da PDE5, o efeito hipotensor ocorreu por um

período maior.

De acordo com os resultados discutidos, é bastante provável que a AO

promova vasodilatação e redução da PA pela via do NO-GMPc, sendo um

doador de NO (ABDEL-AZIZ et. al., 2013; DANTAS et. al., 2014).


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83

CONCLUSÕES


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7 CONCLUSÕES

Diante dos resultados expostos no presente trabalho, foi possível concluir que

AO possui efeito tanto in vitro quanto in vivo, sendo a oxima mais eficaz e mais

potente. A mesma não depende da ativação dos receptores muscarínicos, nem da

produção fisiológica de NO, e aparentemente tem seu efeito dependente da doação

de NO, sendo uma oxima inédita na literatura.

Os resultados apresentados contribuíram para o estudo farmacológico das

oximas, sintetizadas a partir do prenol, na musculatura lisa. Entretanto outros

mecanismos precisam ser investigados para melhor elucidar sua sinalização celular.


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REFERÊNCIAS

REFERÊNCIAS


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COM


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95

CLUSÕES

APÊNDICES


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96

Apêndice A – Artigo

Cardiovascular effects of two new oximes

(3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate and

3-phenylamino-2-oxime-3-methylbutylacetate) in rats

Maria Alice Miranda Bezerra Medeirosa, Ayla Ribeiro Soaresb, Maíra Dias

Mangueira Bastosb, Jamile Morais de Albuquerquec, Jaknea dos Santos Leald,

Cleônia Roberta Melo Araújoe, Arlan de Assis Gonsalvesf, Darízy Flávia Silvag,

Raimundo Campos Palheta-Júniora, Luciano Augusto de Araújo Ribeiroa*

aPrograma de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido (PGRNSA),

Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), zip code 56304-

205, Petrolina, PE, Brazil.

bCurso de Graduação em Farmácia, Universidade Federal do Vale do São

Francisco (UNIVASF), zip code 56304-205, Petrolina, PE, Brazil.

cCurso de Fonoaudiologia, Universidade Federal da Bahia, Av. Reitor Miguel

Calmon, S/n, zip code 41.100-110, Salvador, BA, Brazil.

dPrograma de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias do Semiárido,

Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), zip code 56304-

205, Petrolina, PE, Brazil.

eColegiado de Ciências Farmacêuticas (CFARM), Universidade Federal do

Vale do São Francisco (UNIVASF), zip code 56304-205, Petrolina, PE, Brazil.

fPós-Graduação em Ciências dos Materiais, Universidade Federal do Vale do

São Francisco (UNIVASF), zip code 56304-205, Petrolina, PE, Brazil.

gUniversidade Federal da Bahia, Instituto de Ciências da Saúde, Departamento

de Biorregulação. Av. Reitor Miguel Calmon, S/n. Departamento de


respiratório

2016

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Biorregulação. zip code 41.100-110, Salvador, BA, Brazil.

*Corresponding author: Universidade Federal do Vale do São Francisco

(UNIVASF), Av. José de Sá Maniçoba, S/Nº, Campus Centro, P.O. Box 252,

CEP: 56.304-205, Petrolina-PE, tel.: +55-87-2101-6862, fax. +55-87-3862-

6974. E-mail address: [email protected] (Luciano A. A. Ribeiro).

Abstract

Some oximes are already considered new NO donors, being proven its

relaxing effect of smooth muscle and its action related to the NOsGC-cGMP pathway.

The main objective of this study was to evaluate the relaxant effect in vitro of two new

oximes (3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate and 3-phenylamino-2-oxime-3-

methylbutylacetate) in aorta and mesenteric vessels and the effect of the 3-chloro-2-

oxime-3-methylbutylacetate on arterial pressure, in vivo.

The two oximes promoted vasodilation in an endothelium independent

manner. The 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate oxime also reduced heart rate

and arterial pressure. Its hypotensive effect was not attenuated by atropine or L-

NAME treatments. However, the hypotension effect was increased with sildenafil

addition. Thus, the AO may be a new NO donor, their activity is related to the way of

the NO-sGC-cGMP signally.

Keywords: oximes; NO-donor; vasorelaxant effect; hypotensive effect; NO-

dependent effects.

1. Introduction

Hypertension has been identified as a major trigger for other cardiovascular

diseases and lately it is believed that the vascular endothelial dysfunction is crucial in

the development and maintenance of hypertension (Tanaka and Minamino, 2015;

Gkaliagkousi et al., 2015; Bohlen, 2015).


respiratório

2016

98

The endogenous production of nitric oxide (NO), acts directly on soluble

guanylyl cyclase (sGC), leading to an increase in guanosine 3,5-cyclic

monophosphate (cGMP) concentration and subsequent activation of

cGMPdependent protein kinase (PKG), which triggers the phosphorylation of various

proteins that promote a pivotal role in many physiological processes, such as

vasorelaxation (Walter, 1989). Therefore, impairment on the NO production or

reduction its half-life can lead to various pathophysiological events, such as arterial

hypertension (Gkaliagkousi et al., 2015; Boger, 2003; Hornyak et al., 2011).

NO-based therapies has potential for the treatment of various cardiovascular

diseases, as has been described for portal hypertension (Fiorucci et al., 2004), in

myocardial protection from surgical ischemic-reperfusion injury (Vinten-Johansen,

Sato, Zhao, 1995), pulmonary hypertension (Fan and Du, 2004), erectile dysfunction

(Ferro, 2006), angina and coronary syndromes (Rajpurohit et al., 2015).

Indeed, NO donors, such as sodium nitroprusside, nitroglycerine, hydralazine

and isosorbide dinitrate are routinely used for the control and treatment of some of

cardiovascular diseases, including hypertension (Loskove and Frishman, 1995;

Popovic et al., 2005; Yiginer et al., 2015).

The increased interest on the physiological role of NO in the homeostatic

control of the cardiovascular system has been accompanied by even greater interest

in development of new NO donors, principally when occur a decrease in the

production of NO or NO synthase (NOS) activity leads to endothelial dysfunction,

which can be detected in heart failure and hypertension (Wong et al. 2010; Schulz et

al., 2008).

In these cases, they are being researches with NO donor molecules for

restoring NO deficiency, such as nitroglycerin and oximes, which do not need

endothelium participation to release NO (Dantas et al., 2014; Veras et al., 2013;

Chalupsky et al., 2004). The oximes, such as pralidoxime and obidoxime, have been

originally designed as therapeutic agents used in the clinical treatment of

organophosphorus compounds poisoning by being able to reactivate the inhibited

acetylcholinesterase (Buckley et al., 2011; van Helden et al., 1996; Jokanovic, 2012).

As recently has been describle a potential of oximes on the vasorelaxation of rodents


respiratório

2016

99

trhought NO/sGC/PKG pathways (Dantas et al., 2014; Veras et al., 2013; Chalupsky

et al., 2004), they were tested.

In this work, the effects of two new oximes (3-chloro-2-oxime-3-

methylbutylacetate and 3-phenylamino-2-oxime-3-methylbutylacetate) were

investigated on the cardiovascular system, through in vitro and in vivo approaches,

along with the possible NO-sGC-cGMP pathway that underlies the effects of

compound with more activity (eficacy and potency).

2 Material and methods

2.1 Chemicals and drugs

The following oximes were used: ethanoate 3-methyl-but-2-entile (referred

here as Pa), 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate (referred here as AO), 3-chloro-

2-oxime-3-methylbutylacetate activated by heating (40°C for 30 min; referred here as

AO+) and 3-phenylamino-2-oxime-3-methylbutylacetate (referred here as OS). The

oximes were synthesized in the General Chemistry Laboratory of the Federal

University of São Francisco Valley (UNIVASF). The phenylephrine (PE),

acetylcholine (ACh), atropine, Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), TWEEN®

80 and urethane were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) and

sildenafil citrate that was gift from Pfizer Inc. (Sandwich, Kent, UK). All salts for the

Krebs’ solution were purchased from Vetec (São Paulo, SP, Brazil).

2.2 Preparation of oximes solutions

In the in vitro experiments, all oximes were dissolved into DMSO. The DMSO

concentration never exceeded 5% (v/v) into the organ chamber. However, in the in

vivo experiments, AO was dissolved in a solution composed by 12% of DMSO, 3% of

TWEEN® 80, 12% of distillated water, and 73% of saline.

2.3 Animals and ethic aspects

Male Wistar rats (weighing 250-350 g) were obtained from the Central

Bioterium of UNIVASF. They were housed in a controlled temperature room (22 ±

1°C) under a 12/12 h light/dark cycle and free access to food and water until the day


respiratório

2016

100

of the experiment. All experiments were performed in accordance with local ethics

committee (CEDEP-UNIVASF), under approval code CEDEP/UNIVASF-

0002/180615, and following the National Council for Animal Experiments Control

(CONCEA) guidelines.

2.4 In vitro studies: preparation of the rat aortic and mesenteric rings

The rats under anesthetic effect were sacrificed through exsanguination. The

thoracic aorta and superior mesenteric arteries were carefully excised and placed in

Krebs’ salt solution, with the following composition: 118 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 5.7

mM MgSO4.7H2O, 1.1 mM NaH2PO4.H2O, 2.5 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 11 mM

glucose. The pH was adjusted to 7.4 by HCl addition. The aorta/mesenteric

immersed in Krebs’ solution was continuously bubbled with a 95% O2 and 5% CO2

gas mixture (carbogen). The aorta/mesenteric was cutted into rings (3-5 mm long),

which were immersed in water-jacketed organ-baths containing 10 mL of Krebs’

solution at 37 °C and bubbled with carbogen mixture. The aortic/mesenteric rings

were mounted between two L-shaped stainlesssteel hooks, with one end fixed in

place and the other end attached to a force transducer (TRO015, Panlab®,

Barcelona, Spain), which was coupled to an bridge system amplifier (Model 321,

Insight Instruments, São Paulo, SP, Brazil) and connected to an computer running

WinDaq software (DATAQ Instruments, Akron, OH, USA). The aortic/mesenteric

rings were allowed to stabilize for 60 min at a preload tension of 1 gF (baseline).

During the resting period, the Krebs’ solution was changed every 15 min to avoid

accumulation of metabolites. For some experimental protocols, the endothelium was

removed by gently rubbing the luminal surface of the ring with a cotton-stick swab.

2.5 In vivo studies: blood pressure and heart rate protocols on anesthetized rats

After a 60 min stabilization period, the aortic/mesenteric rings were contracted

by 0.3 µM PE and the isometric tension was recorded. When a stable contraction

was reached (plateau was reached in approximately 15-20 min) 1 µM ACh was

added to the organ bath to confirm the presence/absence of endothelium (Furchgott

and Zawadzki, 1980). After a second PE-induced contraction, a single concentration

(10-4 M) or cumulative concentrationresponse curves to the oximes (10-7 to 10-4 M)


respiratório

2016

101

were performed. In addition, the relaxing effect of the vehicles used to dissolve the

oximes was determined.

The animals were then isolated in Bollman's cages and fasted for 16 h with

free access to a water. Next, the rats were anesthezied with 1.2 g/kg urethane (i.p.)

and fitted with polyethylene cannula inserted into the carotid artery and jugular vein.

Their arterial cannulae were connected to blood pressure transducer coupled to a

digital acquisition system (PowerLab/8SP, AD Instruments, Bella Vista, NSW,

Australia) for the continuous recording of systolic arterial pressure (SAP), diastolic

arterial pressure (DAP) and mean arterial pressure (MAP), and the jugular catheter

was utilized for pharmacologic treatments. Mean arterial pressure (MAP) was used to

characterize vasoactive effects of examined acetone oxime. Blood pressure effects

of examined AO oxime were studied in diferent conditions: (1) rats free of any drug

(control); (2) rats with an acute blockade of muscarinic receptors by i.v. injection of

0.5 mg/kg atropine (10 min prior to the experiment); (3) rats with an acute blockade

of NO synthase elicited by i.v. injection of 3 mg/kg L-NAME (10 min prior to the

experiment); and (4) rats with an acute blockade of phosphodiesterase by i.v.

injection of 0.5 mg/kg sildenafil citrate (10 min prior to the experiment). Each

experiment started with the recording of basal blood pressure values for at least 30

min. Thereafter, the AO oxime of interest were given intravenously at 5 min intervals

to construct their cumulative dose-response curves (1, 5, 10, 20, 50, 100 e 250 µg by

i.v. administration) of blood pressures and heart rate measurements. On the

protocols in the presence of blockers/inhibitors, the AO oxime was administered

intravenously at a single dose of 20 µg.

2.6 Statistical analysis

The data are presented as mean ± S.E.M or pD2 ± S.E.M, were pD2 is the

negative log of the concentration that produces a response which is 50% of the

maximum response (-log[EC50]), being a measure of agonist potency. The pD2

values were determined by non-linear regression from the dose-response curves.

Differences between means were statisticaly evalued by Student’s t-test or ANOVA

followed by Dunnett post-hoc test, when it was appropriate, and differences with

calculated p value of less than 0.05 (p<0.05) were considered statisticaly significant.


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2016

102

All statistical analyses were performed in GraphPad Prism© 6.0 (GraphPad Software

Inc., San Diego, USA).

3 Results

In aortic rings pre-contracted by PE, the AO, AO+ and OS oximes had a

concetration-dependent (from 10-7 to 10-4 M) relaxant effect both in the presence and

absence of endothelium (Fig. 1). Among the oximes tested, AO was the more

effective and potent in to relax the aortic rings, with an Emax=100.0±13.2% and

pD2=4.1±0.1 in the presence of endothelium than in the absence of endothelium

(Emax=50.0±10.8% and pD2=4.9±0.1) (Fig. 1A). Despite that, AO+ and OS also

relaxed the aortic rings in the concentration-dependent manner, with a full relaxation

effect attained at 10-4 M (Fig. 1B and C), although the AO+ Emax was of 40.0±12,5%

and 42.7±10.9% in aortic rings with and without endothelium, respectively. For the

AO+ pD2 values was 4.4±0.1 and 4.1±0.1 in aortic rings with and without

endothelium, respectively. The OS oxime had an Emax and pD2 (Fig. 1C) in the

presence (47.0±7.5% and 4.6±0.6, respectively), and in the absence of endothelium

(40.3±10.5% and 4.7±0.4, respectively). There were no significant differences either

between these values of Emax or pD2 for AO+ and OS.

Since the compound 3-methyl-but-2-entile (Pa) was the precursor to the

synthesis of 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate (AO) (see Supplementary

Material for molecular formulas and synthesis diagram) was investigated its relaxing

effect on the aortic and mesenteric rings, in precense and absence of endothelium.

The administration of 10-4 M of Pa showed an inexpressive relaxing effect (less than

10%) in both the presence and the absence of the endothelium (data not shown).

Similarly, the DMSO 5% (v/v) had a small (less than 15%) relaxant effect on aortic

and mesenteric rings regardless of the presence of endothelium (data not shown).

In the mesenteric rings, AO, AO+ and OS oximes presented a relaxant effect

in both, with and without endothelium rings, in the concentrationdependent manner

(into a range of 10-7 to 10-4 M; see Fig. 1D, E and F). The Emax values of AO, AO+

and OS on mesenteric rings with endothelium were (100.2±4.4%, 80.8±6.2% and

52.0±4.3%, respectively) and without endothelium (89.8±10.9%, 67.2±10.3% and


respiratório

2016

103

68.8±5.7%, respectively. The pD2 values of AO, AO+ and OS on mesenteric rings

with endothelium were (4.9±0.1, 4.8±0.2 and 4.3±0.2 respectively), and without

endothelium (5.1±0.2, 4.8±0.3 and 4.4±0.1, respectively). Comparing the values Emax

and pD2, the AO oxime is more effective (p<0.05) than AO+ and OS, however all

oximes has the same potency in to relax the rings of mesenteric, regardless of the

presence or absence of endothelium.

The compound Pa was also tested in mesenteric rings and unlike what

occurred on aortic rings it presented a relaxant effect (in a concentrationdependent

manner). There are no significant differences between that values Emax of compound

Pa on mesenteric rings with endothelium (68.5±5.3%) and without endothelium

(54.8±11.2%), as well as pD2 values (4.7±0.3, and 3.9±0.5, respectively).

In vivo assessment, the AO diminish the SAP, DAP (Fig. 2), as well as heart

rate (HR) and MAP, it was observed after the i.v. treatment with AO ranging from 1

up to 250 μg (Fig. 3). The reduction of the blood pressure (Fig. 4A) and HR had a

fast onset and was short-lived (89.8±11.5 s). The HR was significantly decreased

after the treatment with 1, 10, 20, 50, 100, and 250 µg of AO (Fig. 3A) while SAP and

DAP were significantly decreased after the treatment with 20, 50, 100 and 250 µg

(Fig. 2A and B). Moreover, from 10 up to 250 µg doses was observed an outstanding

reduction of MAP from19 to 38 mmHg (Fig. 3B).

The reductions of SAP (Fig. 5A), DAP (Fig. 5B), MAP (Fig. 5C) and HR values

(Fig. 5D) in response to administration of AO (20 µg, i.v.) were not significantly

changed after treatment with atropine (0.5 mg/Kg) or L-NAME (3 mg/kg). However,

the treatment with sildenafil (0.5 mg/Kg, i.v) significantly enhance (over 2-fold) the

effect of AO on SAP (-20.5±3.5 to -42.7±4.3 mmHg), DAP (-18.2±5.2 to -41.0±4.6

mmHg) and MAP (-19.7±4.6 to -42.6±3.8 mmHg), except for HR, as can be seen in

Fig. 5. Further, the duration of effect of AO on MAP level was significantly increased

(from 89.8±11.5 s to 208.5±20.3 s), in the presence of sildenafil (Fig. 6).

4 Discussion

The findings from this study shows relaxing effect of AO (3-chloro-2-oxime-3-

methylbutylacetate) on the conductance (aorta) and resistace arteries (mesenteric) in


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2016

104

vitro, as well as AO diminish arterial pressure and heart rate on anesthetized rats.

The pharmacological evidences supports the hypothesis that more effects on the

cardiovascular system are due to the NO-donation by oxime and the cellular

signaling mechanism related to the NOsGC-GMPc pathway. It is noteworthy that the

current research is a pioneer in the demonstration of the relaxing effect of this oxime,

with no other reports of such activity available in the literature.

The term oxime results from the union of the words oxygen and imine,

discovered in the mid-nineteenth century. They are organic compounds whose

general formula is RR'C=NOH, where R is an organic substituent and R' may be

hydrogen or other organic group (Pratt et al., 2004).

Many oximes have shown biologic effects such as anti-inflamatory activity,

anti-ulcer, antiproliferative (Abdel-Aziz et al., 2013), antiviral (Sin et al., 2009),

vasorelaxant effect (Veras et al., 2013) and anti-hypertensive (Dantas et al., 2014;

Jaros et al., 2007). It is well accepted that oximes have some of their biological

effects explained by their potential to donate NO by the catalysis of its C=NOH group

(Abdel-Aziz et al., 2013). In biological systems, the synthesis of NO is linked to

reaction of L-arginine with O2 catalyzed by one of the NOS isoforms. The reaction

occurs in two stages, the first one consisting in the Nhydroxylation of guanidine group

of L-arginine, leading to formation of N- hydroxy-L-arginine (L-NOHA), and the

second one is the catabolism of C=NOH group of L-NOHA into L-citrulline and NO.

Besides of NOS, other enzymes, such as microsomal cytochromes P450 and

peroxidases, may also catalyze the release of NO from groups C=NOH (Chalupsky

and Cai, 2014; Chalupsky et al., 2004).

It was demonstrated the vassorexant effect of two oximes (AO and OS) and

AO activated by heating (AO+) in the aorta and mesenteric vessels (Fig. 1). AO

presented itself as the most effective and potent as well as it was the only oxime that

has demonstrated a differentiated action in rings with and without endothelium, at lest

in rat aorta. In aortic ring in the absence of endothelium AO was about 2-fold more

effective than in presence of endothelium and approximately 10-fold more potent (Fig

1A).

There are reports that oximes had its relaxing effect increased after the

removal of the vascular endothelium and, by the other hand, some oximes had its


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105

effects independently on the vascular endothelium (Stepanovic-Petrovic et al, 2004,

2010; Veras et al., 2013). This discrepancy seems to be justified by tissue and/or

species differences (Vetrovský et al., 2002).

In a similar study, a new oxime derivated from lapachol was more effective

and potent in relaxing rat aorta rings without endothelium than those with

endothelium (Dantas et al., 2014). Another example was found to cyclohexane

nitrate, an oxime that also proved to be more effective and potent in relaxing rings

devoid of vascular endothelial (Mendes-Júnior et al., 2015). Furthermore, not only

oximes exhibit this pattern, but also other NO donors such as sodium nitroprusside

(SNP) has its effects markedly augmented and prolonged by endothelium removal

(Iwatani et al., 2007).

Despite the different effect presented by AO in the aorta, with respect to

vascular endothelium, AO demonstrated similar efficacy and potency in rat

mesenteric rings in the presence and absence of endothelium (Fig. 1D), showing a

marked difference between the action in these two different types of arteries. As

might be expected, some differences are found when comparing to relaxation

response of substances in the aorta and mesenteric, especially regarding the

presence and absence of endothelium (Greenberg et al., 1991; Adegunloye and

Sofola, 1997; Oliva et al., 1984), what could explain the fact that AO effect be

different on aorta and mesenteric vessels.

Since AO had a more effective vasorelaxant effect on rat aortic and

mesenteric rings, in vivo experiments were performed to investigate its effect on

blood pressure and heart rate. The results showed that AO, in a dosedependent

manner (1 to 250 µg) significantly reduced the SAP, DAP (Fig. 2), HR and MAP (Fig.

3).

Studies conducted with many oximes indicate they potential as NO-donors,

where vasorelaxing effects, by means of activation of NO-cGMP-PKG pathway, could

explain changes in blood pressure (Abdel-Aziz et al., 2013; Dantas et al., 2014).

Besides, the fast onset and short-lived effect of AO on MAP and HR it is typical for a

NO-donor (Maliszewska-Scislo et al., 2008).


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106

Therefore, to access the role of NO-sGC-cGMP pathway in the hypotensive

effect of AO, were performed experiments using atropine (a muscarinic antagonist),

L-NAME (the NOS inhibitor), and sildenafil (selective PDE5 inhibitor).

In this work, it was observed that neither atropine (Fig. 4B) or L-NAME

significantly alter the AO effect on SAP, DAP, HR or MAP parameters, indicating that

neither the activation of endothelial M3 receptor or the endogenous production of NO

by eNOS enzyme are involved in the hypotensive effect of AO. Similar results can be

found for other oximes, such as formamidoxime (Jaros et al., 2007) and S1 oxime

(Dantas et al., 2014), thus the hypothesis the vasorelaxation activity by oximes, such

as AO oxime, due to the directly NO-donation here are reinforced.

The involvement of NO pathways in the present effects is supported by

sildenafil treatment significantly increases the AO effects on SAP (Fig. 4C), DAP and

MAP (Fig. 5) as well as the length of effect (Fig. 6), indicating that increased cGMP

levels could be involved in the hypotensive effect and corroborating the presented

hypothesis of NO donation with consequent activation of the sGC-cGMP pathway. In

many studies sildenafil, as well as other PDE inhibitors, is used as a tool to confirm

involvement of NO-sGC-cGMP signaling pathway on effect of many vasoactive and

hypotensive drugs (Goulopoulou et al., 2015; Wang et al., 2013; Caremel et al.,

2010).

The vascular relaxation induced by NO-sGC-cGMP pathway is associated with

differents intracelullar events, such as a decrease in cytosolic Ca2+ concentration, the

activation of different potassium channels, decreased inositol 1,4,5-trisphophate (IP3)

production and closure of voltage-dependent L-type Ca2+ channels (L-type Cav)

(Chadha et al., 2008). In this sense, further studies should be focused on molecular

mechanism of cardiovascular effects due to AO.

In conclusion, the present study demonstrates pharmacological evidence that

the 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate oxime (AO) has its vasorelaxant and

hipotensor effect possibly explained by its ability to donate NO and subsequently

activate the sGC-cGMP signaling pathway.


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2016

107

Acknowledgments

The authors would like to thanks to CAPES by granting scholarship and to

UNIVASF by the technical and financial support to this work. We would like to also

thank to Pedro G. S. Sá by improvements in the manuscript.

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Fig. 1. Concentration-response curves showing the vasorelaxant effect of AO, AO+

and OS oximes on aortic (A, B, C) and mereseteric (C, D, F) rings with (filled

symbols) and without (hollow symbols) endothelium (n=6). The vasorelaxant effect of

oximes was expressed as reverse percentage of maximal tension attained in PE-

induced contractions. The symbols and vertical bars showed in the figure represent

the means and SEM, respectively. *p<0.05 (with vs. without endothelium: Student’s t

test).

Fig. 2. Concentration-response curves showing the effect of AO () and vehicle ()

on the systolic blood pressure (SAP, A) and diastolic blood pressure (DAP, B) on

anesthetized rats (n=5). The effect of AO was expressed as pressure variation (in

mmHg). The symbols and vertical bars showed in the figure represent the means and

SEM, respectively. *p<0.05 (AO vs. vehicle: Student’s t test).

Fig. 3. Concentration-response curves showing the effect of AO () and vehicle ()

on heart rate (HR, A) and mean arterial pressure (MAP, B) on anesthetized rats

(n=5). The effects of AO were expressed as beats per minute (bpm) on HR or as

expressed as pressure variation (in mmHg) on MAP. The symbols and vertical bars

showed in the figure represent the means and SEM, respectively. *p<0.05 (AO vs.

vehicle: Student’s t test).

Fig. 4. Original records oh the hypotensor effect of sequential administration of AO

(A), the effect of AO (20 µg) in the absence or presence of atropine (B) and the effect

of AO (20 µg) in the absence or presence of sildenafil (C) on anesthetized rats.

Fig. 5. Effect of AO (20 µg) on the systolic blood pressure (SAP, A) and diastolic

blood pressure (DAP, B), mean arterial pressure (MAP, C) and heart rate (HR, D) in

absence and presence of atropine, L-NAME and sildenafil on anesthetized rats (n=5).

The effects of AO were expressed as pressure variation (in mmHg) or beats per

minute (bpm). The columns and vertical bars showed in the figure represent the

means and SEM, respectively. *p<0.05 (AO vs. AO+Atropine/L-NAME/Sildenafil:

One-Way ANOVA followed by Dunnett’s post-test).


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Fig. 6. Duration of AO (20 µg) effect on the mean arterial pressure (MAP) on

anesthetized rats in absence and presence of atropine, L-NAME and sildenafil (n=5).

The duration effects of AO was expressed as time (in seconds). The columns and

vertical bars showed in the figure represent the means and SEM, respectively.

*p<0.05 (AO vs. AO+Atropine/L-NAME/Sildenafil: One-Way ANOVA followed by

Dunnett’s post-test).

Professor F.P. Nijkamp

Editor in Chief of European Journal of Pharmacology

Feb 29th, 2016

Dear Professor F.P. Nijkamp,

Please find enclosed our manuscript entitled "Cardiovascular effects of two new

oximes (3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate and 3-phenylamino-2-oxime-3-

methylbutylacetate) in rats" by Medeiros et al., which we would like to submit for

publication as a ‘Research Paper’ in European Journal of Pharmacology. In this work

the relaxant effects of 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate and 3-phenylamino-2-

oxime-3-methylbutylacetate were investigated on rat isolated aortic and mesenteric

rings and the effect of 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate was also investigated

in the blood pressure and heart rate protocols on anesthetized rats. In this work was

demonstrated that the two new oximes promoted vasodilation effect, in an

endothelium independent manner, of both aortic and mesenteric rings. Besides that,

the 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate oxime also reduced heart rate and arterial

pressure on anesthetized rats and its hypotensive effect was not attenuated by

atropine or L-NAME treatments.

However, the hypotensive and bradycardic effects were significantly increased

after sildenafil treatment. Based on these facts, we rise the hypothesis that the at

least 3-chloro-2-oxime-3-methylbutylacetate oxime may be a new NO donor and their

activity is related to the NO-sGC-cGMP signally pathway.


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We confirm that this manuscript has not been published elsewhere and is not

under consideration by another journal. All authors have approved the manuscript

and agree with submission to European Journal of Pharmacology.

The authors have no conflicts of interest to declare.

Please address all correspondence to:

Luciano A. A. Ribeiro, Ph.D.

Cover Letter

Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF)

Colegiado de Ciências Farmacêuticas (CFARM)

Av. José de Sá Maniçoba, Campus Centro, Caixa Postal 252,

56.304-205, Petrolina-PE, Brazil.

Phone: +55-87-2101-6862/Fax.: +55-87-3862-6974

e-mail: [email protected]

We shall look forward to hearing from you at your earliest convenience.

Yours sincerely,

Ribeiro, Luciano (PhD)


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Apêndice B – Participação de eventos


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Apêndice C – Participação da comissão organizadora de evento


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2016

127

Apêndice D – Participação de evento como palestrante


respiratório

2016

128

Apêndice E – Participação de evento como avaliador de trabalho científico


respiratório

2016

129

Apêndice F – Resumos apresentados em eventos


respiratório

2016

130


respiratório

2016

131


respiratório

2016

132


respiratório

2016

133

ANEXOS


respiratório

2016

134

ANEXO A

ESTUDO FARMACOLÓGICO DE OXIMAS NOS SISTEMAS CARDIOVASCULAR …€¦ · universidade federal do...

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