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PAULO ROBERTO BERTOLETTO

ESTUDO MORFOLGICO DO INTESTINO DELGADO DE RATOS NA

ISQUEMIA-REPERFUSO SOB OXIGENAO HIPERBRICA

Tese apresentada Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina, para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias.

SO PAULO 2005

PAULO ROBERTO BERTOLETTO

ESTUDO MORFOLGICO DO INTESTINO DELGADO DE RATOS NA

ISQUEMIA-REPERFUSO SOB OXIGENAO HIPERBRICA

Tese apresentada Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina, para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes

SO PAULO 2005

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA UNIFESP-EPM

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM

CIRURGIA E EXPERIMENTAO COORDENADOR: Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes

TESE DE MESTRADO

AUTOR: Paulo Roberto Bertoletto ORIENTADOR: Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes TTULO: Estudo morfolgico do intestino delgado de ratos na isquemia-reperfuso sob oxigenao hiperbrica. BANCA EXAMINADORA: 1- Presidente: Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes Coordenador do Programa de Ps-Graduao em Cirurgia e Experimentao da UNIFESP-EPM. MEMBROS EFETIVOS: 2 Prof. Dr. Danilo C. Teves Professor Adjunto da Disciplina de Histologia e Biologia Estrutural da UNIFESP-EPM. 3 Prof. Dr. Joo Ricardo Filgueiras Tognini Professor Titular do Departamento de Clnica Cirrgica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. 4 Profa. Dra. Maria Ligia Lyra Pereira Professora Assistente do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Cincias Mdicas de Santos UNILUZ. MEMBRO SUPLENTE 1- Prof. Dr. Hlio Plapler Professor Adjunto da Disciplina de Tcnica Operatria e Cirurgia Experimental da Universidade Federal de So Paulo-Escola Paulista de Medicina.

ii

o principio da Sabedoria o desejo autntico de instruo, e a preocupao pela instruo o amor Sabedoria II:6

iii

DEDICATRIA

minha esposa Maria Anglica e filhos Ana Carolina, Vanessa, Eduardo e Renata

que compartilham comigo os mritos e as tribulaes da jornada do mdico.

iv

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes, Coordenador do Programa de Ps-

Graduao em Cirurgia e Experimentao da Universidade Federal de So Paulo Escola

Paulista de Medicina, orientador deste trabalho; pesquisador e condutor deste programa, que

com o seu trabalho certamente melhorar o ensino e a pesquisa mdica no nosso pas.

v

AGRADECIMENTOS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO PAULO ESCOLA PAULISTA DE

MEDICINA UNIFESP-EPM, que me recebeu no Programa de Ps- Graduao em

Cirurgia e Experimentao tornando possvel este antigo objetivo.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL- UFMS, por ter

acreditado neste propsito.

Ao Prof. Dr. Luiz Francisco Poli de Figueiredo, Livre-Docente, Titular da

Disciplinade Tcnica Operatria e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, que me

acolheu.

Ao Prof. Dr. Celso Massaschi Inoueye, pela persitncia, entusiasmo e idealismo que o

caracterizam.

Ao Prof. Dr. Manuel de Jesus Simes, que com sua competncia e participao foi

fundamental na realizao deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Paulo de Oliveira Gomes, Professor Adjunto da Disciplina de Tcnica

Operatria e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, que transmite a sua imensa cultura.

Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero, Professora Afiliada ao Departamento

de Cirurgia da UNIFESP-EPM, pelos ensinamentos transmitidos.

Ao Prof. Dr. Murched Omar Taha, Professor do Departamento de Cirurgia da

UNIFESPEPM, pelos competentes ensinamentos transmitidos.

Profa. Dra. Celina Fochima, que colaborou na realizao deste trabalho.

Profa. Dra. Mirian A. Ghiraldini Franco, com o seu conhecimento e informaes

transmitidas.

Aos meus colegas mdicos de Dourados, Dr. Joo Vidigal, Dra. Stela Vidigal e Dr.

Jos Carlos Chaves que compartilharam comigo este caminho e que incentivaram

mutuamente nas etapas deste trabalho.

vi

Aos Acadmicos de Medicina do Curso de Medicina de Dourados da UFMS ,

epresentados por Adriana Regina Gonalves Ribeiro, Evandro Eduardo Canhao, Fbio de

Oliveira Riuto, Fernando Csar Frana Arajo, Karine Keiko Leito Higa, Lena Maria

Mukai Verri, Lvia Afonso Santos, Lvia Villela Teixeira e Thiago Pauluzi Justino que nos

acompanharam e participaram deste trabalho.

Elaine, Valdelice e Margarete e no nome delas eu quero agradecer a pacincia e

dedicao que todos os funcionrios tiveram para o desenvolvimento deste trabalho.

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Foto do confinamento dos animais................................................. 5

Figura 2 - Esquema de distribuio dos animais nos diversos grupos de

estudo..............................................................................................

6

Figura 3 - Foto do animal anestesiado e aps a tricotomia............................. 8

Figura 4 - Foto do ato operatrio com pina transpassando e isolando a veia

e artria mesentricas superiores, vistas por transparncia abaixo

do peritnio parietal........................................................................

9

Figura 5 - Foto mostrando a veia e artria mesentricas dissecadas e sendo

ocludas com pina hemosttica de microcirurgia tipo bulldog.....

9

Figura 6 - Foto das alas intestinais isquemiadas (macroscopia) aps a

abertura da cavidade e com a presena da pina hemosttica sem

oxigenao hiperbrica).................................................................

10

Figura 7 - Foto da cmara hiperbrica em acrlico para animais de pequeno

porte.B (base), T (Tampo) V (vlvula)...........................................

11

Figura 8 - Foto mostrando o manmetro e a presso usada durante o

experimento....................................................................................

11

Figura 9 - Foto do animal no interior da cmara durante o procedimento de

oxigenao hiperbrica. A (animal), C (cal sodada), V (vlvula)..

12

Figura 10 - Foto mostrando o segmento de leo terminal seccionado 40 mm

da juno leo-cecal com 50 mm de extenso, pronto para ser

imerso na soluo de fixao de formalina tamponada 10%.........

14

Figura 11 - Foto do procedimento de eutansia com aplicao de soluo

cloreto de potassio na veia cava inferior........................................

15

Figura 12 - Fotomicrografia caracterstica de uma lmina de intestino

delgado prepara pelo mtodo imunohistoqumica para expresso

da caspase 3, mostrado pela colorao acastanhada das clulas

em apoptose....................................................................................

16

viii

Figura 13 - Fotomicrografia caracterstica de uma lmina corada em HE com

a destruio das vilosidades intestinais classificada como grau 2

de leso celular...............................................................................

17

Figura 14 - Mostrando o equipamento usado para a leitura, microscpio Carl

Zeiss Axilab, sistema de captura Axiocom MRC e

processamento com o programa de computador Axiovision Rel

42.- (Zeiss)......................................................................................

20

Figura 15 - Mostrando detalhes do programa de computador usado Axiocam

MRC da Zeiss.................................................................................

20

Figura 16 - Fotomicrografia caracterstica de uma lmina corada pela HE,

mostrando as reas consideradas para a medio da parede

intestinal e demarcadas para identificao e contagem pelo

programa de computador (Axiovision Rel 4.2 da ZEISS)............

21

Figura 17 - Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo I, onde

pode-se notar a desestruturao das vilosidades, restos celulares

desprendidos no lmen intestinal e achatamento global da

mucosa .As criptas esto relativamente conservadas. A camada

sero-muscular est preservada. (HE 20X )..................................

24

Figura 18 - Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo I, onde

pode-se notar que as criptas esto relativamente conservadas.

Porm com focos de extravasamento hemorrgico na lmina

prpria e entre as criptas (setas) (HE 200X)...............................

24

Figura 19 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do

grupo II, mostrando a integridade das vilosidades e criptas,

embora em alguns setores possam perceber-se discretas

alteraes apicais na estruturao da vilosidade (HE 20X)........

26


grupo II, mostrando a integridade da vilosidade, com edema

discreto (seta fina), sem alteraes estruturais relevantes, porm

com discretos focos de extravasamento hemorrgico (seta

espessa). (HE 200X)....................................................................

26

ix


grupo III, onde se pode notar a desestruturao das vilosidades,

restos celulares desprendidos no lmen intestinal, achatamento

global da mucosa e focos esparsos de extravasamento

hemorrgico. As criptas esto desestruturadas com sinais de

edema e descolamento da lmina prpria. A camada sero-

muscular est preservada. (HE 20X)...........................................

28

Figura 22 - Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo III, onde

pode-se notar a ausncia de vilosidades, as criptas esto

destrudas, com focos de extravasamento hemorrgico na lmina

prpria e entre as criptas (setas) (HE 200X)...............................

28


grupo IV, mostrando a integridade das vilosidades e criptas,

embora em raros setores possam perceber-se discretas alteraes

apicais na estruturao da vilosidade (HE 20X).........................

30


grupo IV, mostrando a integridade da vilosidade, sem edema ou

alteraes estruturais relevantes. (HE 200X)..............................

30


grupo I, onde se pode notar as vilosidades marcadas mais

intensamente em marrom nas suas pores mdias e apicais,

sendo que a parte basal a colorao ocorra em menor

freqncia.(Imunohistoqumica 20X).........................................

32


Grupo I, onde se pode notar uma freqncia menor de clulas

marcadas em marrom acastanhado nas reas das criptas

intestinais. (Imunohistoqumica - 200X)........................................

32


Grupo II, onde se nota que as vilosidades esto bem conservadas

e a colorao marrom acastanhada se faz presente em maior

freqncia e intensidade nas bordas apicais. (Imunohistoqumica

20X).............................................................................................

34

x


grupo II, onde se pode notar nas criptas intestinais uma

marcao celular em marrom acastanhado de menor intensidade

e freqncia do nas correspondentes vilosidades do mesmo

grupo. (Imunohistoqumica 200X).................................................

34


grupo III, onde se pode notar intensa desestruturao das

vilosidades intestinais e colorao marrom acastanhada das

vilosidades remanescentes at junto s criptas intestinais.

(Imunohistoqumica- 20X).............................................................

36


Grupo III, onde se pode notar as criptas alteradas e freqncia e

intensidade da colorao marrom acastanhada semelhante a das

vilosidades. (Imunohistoqumica -200X).......................................

36


Grupo IV, onde se pode notar que as vilosidades esto

preservadas e a colorao marrom acastanhada em pequena

intensidade e freqncia ocorre em reas discretas no pice.

(Imunohistoqumica -20X).............................................................

38


grupi IV, onde se pode notar a quase total ausncia de clulas

marcadas em marrom acastanhado. (Imunohistoqumica

200X)..............................................................................................

38

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) da espessura

(micrometros) da parede intestinal medidas em cada animal de

cada grupo em vinte campos aleatrios em lminas coradas em

HE 20X........................................................................................

39

Tabela 2 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas

vilosidades intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte

campos aleatrios, em lminas marcadas pela

imunohistoqumica 20X..............................................................

41

Tabela 3 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas

criptas intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte



43

xii

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1 - Mdias e erro padro das mdias da espessura (micrometros) da

parede intestinal medidas em cada animal de cada grupo em

vinte campos aleatrios em lminas coradas em HE 20X...........

40

Grfico 2 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas

vilosidades intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte



42

Grfico 3 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas

criptas intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte



44

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

m = micrmetro

ATA= atmosfera absoluta

cm = centmetro(s)

cm = centmetro (s) cbico (s)

g = grama

H.E.= hematoxicilina eosina

I/R = isquemia e reperfuso

kg = kilograma

kgf = kilograma fra

m = metro

mg = miligrama

min = minuto

mL= mililitro

mm = milmetro

mmHg = milmetro(s) de mercrio

C = grau (s) Celsius

OHB = oxigenao hiperbrica

UNIFESPEPM = Universidade Federal de So Paulo, Escola Paulista de Medicina

xiv

RESUMO Objetivo: Estudar aspectos morfolgicos e imuno-histoqumicos do intestino delgado de ratos

sob isquemia e reperfuso (I/R) e submetidos oxigenao hiperbrica. Mtodos: Trinta e

dois ratos foram distribudos em quatro grupos (n=8) nos quais foi realizada a isquemia de

sessenta minutos e avaliados aps reperfuso de sessenta minutos. Nos animais do grupo I no

foi realizado nenhum procedimento de oxigenao hiperbrica (OHB), no grupo II a OHB foi

realizada no perodo de isquemia, no grupo II a OHB foi realizada no perodo de reperfuso e

no grupo IV foi realizada nos perodos de isquemia e reperfuso. Foi usada uma cmara

especial de acrlico para animais de pequeno porte com 2,0 atmosferas de presso e oxignio a

100% para os procedimentos de OHB. Segmentos de cinco centmetros de leo terminal foram

coletados aps sessenta minutos de reperfuso para estudo histolgico e imuno-histoqumico,

sendo avaliados os graus de leso da mucosa intestinal (ausente, leve, moderada e acentuada),

espessura da camada mucosa e do ndice de apoptose pela caspase 3. Resultados: O grupo I

apresentou leses acentuadas da mucosa, diminuio da espessura da camada mucosa e alto

ndice de apoptose (GI=0,70), caracterizando um modelo de leso de I/R. O grupo II

apresentou graus de leses de mucosa ausentes ou leves e menor ndice de

apoptose(GII=0,16). Os resultados dos grupos I e III so semelhantes com grau de leses

moderadas ou acentuadas e diminuio da espessura da camada mucosa e ndice de apoptose

prximo (GI= 0,70 e GII=0,84). No grupo IV os graus de leses foram semelhantes ao grupo

II, porm, com maior ndice de apoptose (GII=0,16 e GIV=0,42). Concluso: A oxigenao

hiperbrica realizada no perodo de isquemia preveniu as leses de I/R de modo mais eficaz

do que aplicada no perodo de isquemia e reperfuso. Quando aplicada somente no perodo de

reperfuso os resultados foram piores sugerindo que seu efeito protetor esteja vinculado a

preveno da formao dos radicais livres no perodo de isquemia.

xv

ABSTRACT

Objective: To study morphologic and immune-hystochemical aspects of the small intestine of

rats under ischemia and reperfusion (I/R) and submitted to the hyperbaric oxygenation

(HBO). Methods: Thirty two rats were distributed in four groups (n=8) us which the ischemia

of sixty minutes was accomplished and appraised after reperfusion of sixty minutes. In the

animals of the group I any procedure of HBO was not accomplished, in the group II HBO was

accomplished in the ischemia period, in the group II HBO was accomplished in the

reperfusion period and in the group IV it was accomplished in the ischemia periods and

reperfusion. A special acrylic chamber was used with 2.0 pressure atmospheres and oxygen to

100% for the procedures of HBO. Segments of five centimeters of terminal ileum were

collected after sixty minutes of reperfusion for histological study and immune-hystochemical,

being appraised the degrees of lesion of the intestinal mucosa (absent, mild, moderate and

severe), thickness of the mucosa and of the apoptosis index for the caspase 3. Results: The

group I presented accentuated lesions of the mucosa, decrease of the thickness of the mucosa

layer and high apoptosis index (GI=0.70), characterizing a model of lesion of I/R. The group

II presented degrees lesions of mucosa absent or mild and smaller apoptosis (GII=0.16). The

results of the groups I and III are similar with degree of moderate or accentuated lesions and

decrease of the thickness of the mucosa and index of similar apoptosis (GI = 0.70 and

GII=0.84). In the group IV the degrees of lesions were similar to the group II, however, with

larger apoptosis index (GII=0.16 and GIV=0.42). Conclusions: The hyperbaric oxygenation

accomplished in the ischemia period prevented the lesions of I/R in way more effective than

applied in the ischemia period and reperfusion. When only applied in the reperfusion period

the results were worse suggesting that the protecting effect is linked the prevention of the

formation of the free radicals in the ischemia period.

xvi

SUMRIO

1. INTRODUO.................................................................................................. 1

2. OBJETIVOS....................................................................................................... 4

3. MTODOS......................................................................................................... 5

4. RESULTADOS.................................................................................................. 23

5. DISCUSSO...................................................................................................... 45

6. CONCLUSES.................................................................................................. 54

7. REFERNCIAS................................................................................................. 55

8. NORMAS ADOTADAS.................................................................................... 60

APNDICE......................................................................................................... 61

xvii

1. INTRODUO A isquemia um fenmeno caracterizado pela restrio parcial ou total do aporte

sangneo arterial uma determinada rea do organismo. As conseqncias desta restrio

dependem das caractersticas metablicas do tecido atingido, da existncia de circulao

colateral e do tempo de restrio1.

Classicamente as repercusses da isquemia esto associadas a alteraes

morfolgicas e funcionais resultantes da necrose tecidual. Nas ltimas dcadas tm-se,

tambm, estudado os aspectos de morte celular programada. As alteraes provocadas pela

falta de aporte sangneo desencadeiam processos metablicos celulares que induzem a

clula a sua autodestruio sem a caracterstica reao inflamatria, conhecido como

fenmeno de apoptose1-4.

Portanto, a necrose e apoptose celular podem ser utilizados como indicadores das

alteraes de tecidos submetidos isquemia1-4.

O processo isqumico ganhou maior interesse com o avano na rea de

transplantes de tecidos e rgos. A retirada do tecido do doador at a implantao no

receptor passa obrigatoriamente por um perodo de isquemia5. Vrios procedimentos

foram elaborados para diminuir os danos atribuveis a ela. Fundamentalmente procuraram-

se meios de diminuir as necessidades metablicas dos tecidos transplantados pelo uso da

hipotermia ou o uso de solues de preservao com nutrientes e eletrlitos que suprissem

as necessidades do tecido as ser transplantado6.

Contudo, apesar da adequao das solues de preservao, verificou-se que

grande parte das leses subseqentes apresentadas pelos tecidos transplantados estava

ligada ao perodo de reperfuso7. O reparo da circulao arterial leva ao tecido o

comburente necessrio para as reaes de oxidao. O oxignio oferecido aos tecidos

provoca uma produo quantitativamente elevada de espcies reativas de oxignio em

curto espao de tempo. A presena destes radicais livres de oxignio, que so altamente

energticos, causa a perioxidao das membranas celulares, ocasionando a necrose ou

desencadeando uma cascata de reaes bioqumicas que caracterizam o estresse oxidativo

e a apoptose 8-10.

2

Pra contornar essas situaes procurou-se acrescentar s solues de preservao,

ao doador e/ou ao receptor, substncias que tivessem ao antioxidante11. Vrias

substncias associadas diminuio da produo de espcies reativas de oxignio foram e

so testadas como o alfatocoferol, alopurinol, cido ascrbico, N-acetil-cistena,

fitoterpicos, entre outras. Tambm foram e so pesquisadas substncias que retiram as

espcies reativas de oxignio j produzidas conhecidas varredores (scavengers)4-6,11. Outra

proposta tambm em tela o procedimento de pr-condicionamento isqumico, onde

perodos curtos de isquemia so seguidos de perodos correspondentes de reperfuso

fazendo com os tecidos se adaptem a um perodo mais prolongado de isquemia

sustentada5,11.

Considerando estas propostas, surge a possibilidade do emprego da oxigenao

hiperbrica, partindo do princpio que a oferta de oxignio ao tecido isqumico poderia

interferir na subseqente fase da reperfuso. O surgimento das espcies reativas de

oxignio est ligado avidez que o tecido tem para realizar suas reaes de oxidao, e

conseqente produo de energia para o metabolismo celular, logo a seguir ao perodo em

que este elemento esteve escasso ou ausente. A oferta do oxignio nesta etapa poderia

evitar este mecanismo e assim poupar os tecidos do efeito deletrio da ao oxidantes

destes radicais livres12,13.

A oxigenao hiperbrica um procedimento que oferece oxignio puro (100%)

sobre presso, que varia entre 1 a 2,5ATA (atmosfera de presso). Baseada na Lei de

Henri (a diluio de um gs em um lquido diretamente proporcional a sua presso) e na

Lei de Boyle (em uma temperatura constante, o volume e a presso de um gs so

inversamente proporcionais) a oxigenao hiperbrica ir favorecer a difuso nos lquidos

e tecidos a serem transplantados14,15. Deste modo, seria mantida uma taxa metablica

bsica, que diminuiria os processos ligados isquemia14. A oferta de oxignio reproduziria

as condies habituais do tecido e impediria a formao anormal de espcies reativas de

oxignio16.

O Programa de Ps-Graduao em Cirurgia e Experimentao dentro da linha de

pesquisa de Integrao Orgnica de Transplantes desenvolve projetos voltados para o

estudo da aplicao da oxigenao hiperbrica no fenmeno de isquemia e reperfuso17-20,

em especial voltada para o transplante intestinal21,22.

3

Pesquisa anterior demonstrou que a oxigenao hiperbrica capaz de melhorar a

viabilidade das vilosidades intestinais de intestino delgado de ratos submetidos a trinta

minutos de isquemia e estudados aps trinta minutos de reperfuso. Os benefcios da

oxigenao hiperbrica, avaliados pela morfologia das vilosidades, so mais evidentes

quando ela aplicada no perodo de isquemia 21,22.

A literatura biomdica escassa respeito da oxigenao hiperbrica e o fenmeno

de isquemia e reperfuso de intestino. H um nico relato em que intestino delgado de

ratos foi submetido a cento e vinte minutos de isquemia (ocluso da artria mesentrica

superior) e noventa minutos de oxigenao hiperbrica nos perodos de isquemia e

imediatamente aps a reperfuso. O grau menor de leso da mucosa intestinal foi menor

quando a oxigenao hiperbrica foi aplicada no perodo de isquemia do que no perodo

de reperfuso 23, 24.

Existem evidncias experimentais em outros tipos de tecidos e rgos como

sistema nervoso25-27, clon28,29, fgado30, traumas31, choque32, leses actnicas18,33,34,

retalhos cutneos 35-37 em que a oxigenao hiperbrica trouxe efeitos benficos.

Deste modo, dando continuidade linha de pesquisa procurou-se investigar o papel

da oxigenao hiperbrica no modelo animal de isquemia e reperfuso intestinal de ratos,

submetendo-os um perodo de isquemia mais prolongado e aplicando a oxigenao

hiperbrica nos trs perodos do processo, ou seja somente na isquemia, somente na

reperfuso e em ambos, isquemia e reperfuso.

O objetivo foi verificar se h diferenas dos efeitos da oxigenao hiperbrica

dependente do perodo de aplicao e com isto contribuir para um melhor entendimento da

fisiopatologia do fenmeno de isquemia e reperfuso.

2. OBJETIVOS

Geral:

Estudar a integrao orgnica de transplantes intestinais de ratos com o uso de oxigenao

hiperbrica no fenmeno de isquemia e reperfuso.

Especfico:

Estudar a morfologia e a apoptose da mucosa intestinal de ratos submetidos isquemia e

reperfuso sob a ao da oxigenao hiperbrica.

3. MTODOS

Esta pesquisa foi submetida apreciao e aprovao da Comisso de tica em

Pesquisa do Hospital So Paulo - Universidade Federal de So Paulo - Escola Paulista de

Medicina (UNIFESP-EPM) com a referncia CEP n. 1581/03 e ratificada pelo Comit de

Biotica em Pesquisa da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul (UFMS) sob o n.

44/2003.

Amostra

Foram utilizados trinta e dois ratos machos (Rattus norvegicus albinus), da

linhagem Wistar, adultos, com peso mdio de 300g, procedentes do Biotrio da UFMS,

identificados por picotes no pavilho auricular direito ou esquerdo. No perodo que

precedeu o experimento os animais foram confinados individualmente em gaiolas plsticas

com tampo metlico na medida padro de 40x30x20cm, alimentados com dieta prpria

para a espcie (Purina) e gua vontade. As condies de aerao e luminosidade foram

naturais, em ambiente exclusivo para roedores e com baixo nvel de rudos externo. Os

cuidados de higienizao e alimentao foram dirios e realizados por tratador nico, sob

superviso de mdico veterinrio.

Figura 1 - Foto do confinamento dos animais.

6

Os procedimentos operatrios e de oxigenao hiperbrica foram realizados em

ambiente apropriado, em centro cirrgico adaptado para operaes em animais de pequeno

porte e em condies de assepsia e anti-sepsia.

Os animais foram distribudos em aleatoriamente em quatro grupos de estudo,

saber (Figura 2):

Grupo I (IR/ sem OHB): formado por 8 animais, submetidos isquemia e

reperfuso sem aplicao de oxigenao hiperbrica.

Grupo II (IR/OHB-I): formado por 8 animais, submetidos isquemia e reperfuso

de intestino delgado, com aplicao de oxigenao hiperbrica durante o perodo da

isquemia.

Grupo III (IR/OHB-R): formado por 8 animais, submetidos isquemia e

reperfuso de intestino delgado, com aplicao de oxigenao hiperbrica durante o

perodo de reperfuso.

Grupo IV (IR/OHB-IR): formado por 8 animais, submetidos isquemia e

reperfuso de intestino delgado, com aplicao de oxigenao hiperbrica nos perodos de

isquemia e de reperfuso.

AMOSTRA N= 32 ratos

Grupo I (n = 8)

I + R s/ OHB

Grupo II (n = 8)

I (OHB) + R

Grupo III (n = 8)

I + R (OHB)

Grupo IV (n = 8)

I (OHB)+ R (OHB)

Figura 2 Esquema de distribuio dos animais nos diversos grupos de estudo.

7

Procedimento anestsico

Os animais foram pesados em balana de preciso, sendo os valores obtidos (em

gramas), anotados no protocolo n 1; a seguir, foram anestesiados por via intramuscular

com soluo de cloridrato de quetamina (80mg.mL-1), acepromazina (1mg.mL-1) e

cloridrato de xilazina (10mg.mL-1), administrada por via intramuscular, na dose de

0,1mL.450g-1. A avaliao da eficcia da anestesia foi verificada pela perda do reflexo

crneo-palpebral e pela ausncia de reao preenso digital do coxim da pata traseira. As

doses ministradas foram suficientes para realizao de todo os procedimentos operatrios

e de oxigenao hiperbrica, sem necessidade de doses de complementao (Figura 3).

Procedimento operatrio

Os animais foram posicionados em decbito dorsal horizontal com as patas

dianteiras e traseiras fixadas com fita adesiva em prancha operatria; foi feita a epilao

da parede abdominal, e a anti-sepsia da pele com polivinilpirrolidona a 10% e iodo ativo a

1% (Povidine). Delimitao de campo operatrio pela colocao de pano fenestrado

esterilizado.

A inciso foi mediana, iniciada no processo xifide, com 50mm de extenso, no

sentido crnio caudal, interessando pele, tela subcutnea, aponeurose muscular e peritnio.

Aps a abertura da cavidade peritoneal, foram afastadas as vsceras abdominais;

identificadas e isoladas a artria e a veia mesentricas superiores, tendo com ponto de

referncia a coluna vertebral e a raiz do mesentrio (Figura 4). Dissecados os vasos, esses

foram ocludos com pina vascular de microcirurgia (tipo bulldog), durante sessenta

minutos, provocando-se a isquemia (Figura 5).

As vsceras foram recolocadas na cavidade abdominal e as bordas da parede

abdominal foram temporariamente aproximadas com quatro pontos simples de fio de

algodo 00, eqidistantes, em plano total, tracionados por pinas hemostticas com a

tenso necessria para coaptar as bordas e impedir o contato da cavidade peritoneal com o

ambiente externo e assim evitar exposio e ressecamento das vsceras (Figura 6).

8

Transcorridos os sessenta minutos os pontos de algodo foram afrouxados,

novamente as vsceras foram mobilizadas, identificada e removida a pina vascular

hemosttica, iniciando o perodo de reperfuso. Os pontos foram tracionados mantendo as

bordas da ferida abdominal aproximadas para o procedimento seguinte de oxigenao

hiperbrica.

Figura 3 Foto do animal anestesiado e aps a tricotomia.

9

Figura 4 - Foto do ato operatrio com pina transpassando e isolando a veia e artria mesentricas

superiores, vistas por transparncia abaixo do peritnio parietal.

Figura 5 Foto mostrando a veia e artria mesentricas dissecadas e sendo ocludas com pina

hemosttica de microcirurgia tipo bul dog. l

10

Figura 6 Foto das alas intestinais isquemiadas (macroscopia) aps a

abertura da cavidade e com a presena da pina hemosttica sem oxigenao hiperbrica).

A cmara de oxigenao hiperbrica.

Foi utilizada uma cmara idealizada e construda para uso em pequenos animais,

desenvolvida em pesquisa anterior22 no Programa de Ps-Graduao em Tcnica

Operatria e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM (Figuras 7 e 8).

A cmara foi construda em acrlico cristal transparente com resistncia de at 560

quilogramas por centmetro quadrado (kg/cm2) de tenso de ruptura e massa especfica a

20 graus igual a 1,19 (g/cm3). O cristal transparente permitiu a observao dos animais no

seu interior durante o experimento (Figura 9).

11

V

T

B

Figura 7 Foto da cmara hiperbrica em acrlico para animais de pequeno porte.B (base), T (Tampo) V (vlvula).

Figura 8 Foto mostrando o manmetro e a presso usada durante o experimento.

12

V

C

A

Figura 9 Foto do animal no interior da cmara durante o procedimento de oxigenao hiperbrica. A (animal), C (cal sodada), V (vlvula).

A construo em forma cilndrica com um fundo fixo e uma tampa do mesmo

material tem um dimetro de quarenta centmetros permitiu a presena de trs a quatro

animais em cada sesso de oxigenao hiperbrica.

No interior do cilindro, foi colocado um recipiente plstico multiperfurado com cal

sodada para reteno do gs carbnico exalado pelos animais (Figura 9).

Na tampa superior foi fixada uma conexo reta de de dimetro para sada de um

tubo de polietileno do mesmo calibre e conectado a um filtro regulador de presso com

capacidade de 0 a 10 quilogramas fora por centmetro quadrado (kgf/cm2). O filtro foi

conectado a um medidor de vazo pertencente a um tubo de oxignio, cilindro do tipo T,

com um volume de 10 metros cbicos (m3) e com regulador de presso em 315 kgf/cm2.

O aparato permitiu obter a presso estabelecida para o experimento de 2,0 ATA

(duas atmosferas de presso) e oxigenao constante de 100%.

13

Procedimento de oxigenao hiperbrica

Com a cmara devidamente preparada, logo aps o procedimento operatrio de

isquemia (Grupo II), reperfuso (Grupo III) ou isquemia e reperfuso (Grupo IV) os

animais foram colocados em seu interior, a tampa foi hermeticamente fechada e iniciada o

compresso com oxignio 100%.

Grupo I: os animais no foram submetidos oxigenao hiperbrica. Aps a

ocluso da artria e veia mesentricas superiores durante sessenta minutos, foram

afrouxados os pontos, aberta a parede abdominal, retirada a pina hemosttica (bulldog) e

iniciou-se a contagem de sessenta minutos do perodo de reperfuso.

Grupo II: imediatamente aps a aplicao da pina vascular, ocluindo os vasos

mesentricos superiores, os animais foram colocados na cmara hiperbrica, por um

perodo de sessenta minutos. Retirados da cmara, os pontos da parede abdominal foram

afastados, removida a pina vascular, aproximadas as bordas da ferida e iniciada a

contagem dos sessenta minutos do perodo de reperfuso.

Grupo III: aps a aplicao da pina vascular, ocluindo os vasos mesentricos

superiores, os animais foram mantidos fora da cmara hiperbrica por perodo de sessenta

minutos. Os pontos aplicados parede abdominal foram afastados, removida a pina

vascular, aproximadas as bordas da ferida e ento os animais foram colocados na cmara

hiperbrica e iniciada a contagem dos sessenta minutos do perodo de reperfuso.

Grupo IV: imediatamente aps a aplicao da pina vascular, ocluindo os vasos

mesentricos superiores, os animais foram colocados na cmara hiperbrica, por um

perodo de sessenta minutos. Retirados os animais da cmara hiperbrica, os pontos da

parede abdominal foram afastados, removida a pina vascular, aproximadas as bordas da

ferida, recolocados os animais na cmara e iniciada a contagem dos sessenta minutos do

perodo de reperfuso.

Procedimento de coleta de material

Nos animais de todos os grupos, aps os perodos de sessenta minutos de isquemia

e sessenta minutos de reperfuso, os pontos da parede abdominal foram removidos.

Identificou-se a juno do leo com o intestino grosso onde 40mm, medidos pela borda

14

contra-mesenterial, montante foram coletados fragmentos de intestino delgado com 5mm

de extenso (Figura 10).

Os fragmentos foram imersos em frasco hermtico contendo soluo de

formaldedo a 10%. O volume do fixador foi dez vezes superior ao do tecido fixado.

Figura 10 Foto mostrando o segmento de leo terminal seccionado 40 mm da juno leo-cecal com

50 mm de extenso, pronto para ser imerso na soluo de fixao de formalina tamponada 10%.

15

Procedimento de eutansia

Concluda a coleta dos fragmentos de intestino delgado, procedeu-se eutansia dos

animais ainda anestesiados, com aplicao endovenosa de 2mL de cloreto de potssio a

19,1% na veia cava inferior e verificado o bito pela parada cardiorespiratria (Figura 11).

Figura 11 - Foto do procedimento de eutansia com aplicao de

soluo cloreto de potssio na veia cava inferior.

16

Processamento histolgico

Aps vinte e quatro a quarenta e oito horas de fixao em formaldedo as peas

foram submetidas trocas sucessivas com lcool a 70oGL, progressivamente at 100oGL.

O processamento dos tecidos foi feito por duas imerses em lcool 70% por uma hora

cada, uma imerso em lcool 80% por uma hora, uma imerso em lcool 95% por uma

hora, trs imerses em lcool absoluto por uma hora cada, trs imerses em ter de

petrleo sendo a primeira por uma hora e as outras duas por duas horas cada, e trs

imerses em parafina, as primeiras duas por duas horas e a terceira por meia a uma hora

em vcuo.

Figura 12 Fotomicrografia caracterstica de uma lmina de intestino delgado prepara pelo mtodo

imunohistoqumica para expresso da caspase 3, mostrado pela colorao acastanhada das clulas em apoptose.

17

Figura 13 Fotomicrografia caracterstica de uma lmina corada em HE com a destruio das

vilosidades intestinais classificada como grau 2 de leso celular.

A seguir, os fragmentos foram submetidos tcnica de incluso em parafina e

realizados cortes de 7m de espessura em micrtomo rotativo. Os cortes histolgicos de

todos os animais foram corados pela hematoxilina-eosina (H.E.) e analisados em

microscpio de luz.

As imagens foram capturadas atravs de cmara de captura de imagem de alta

resoluo, software AXIOcam MRC da ZEISS e a leitura realizada em microscpio ptico

CARL ZEISS Axilab. O programa utilizado foi a Axiovision Rel 4.2 da ZEISS (Figuras

14 e 15).

Processamento de imunohistoqumica

Foi realizado processamento imuno-histoqumico para marcao da caspase e

mensurao da apoptose celular nas vilosidades intestinais, utilizando o complexo avidina-

biotina- peroxidase (ABC.).

Os tecidos foram cortados com 3 micra (m) de espessura e montados em lminas

de vidro previamente preparadas com o adesivo poli- D-lisina (Sigma Chemical

18

Corporation, P- 7886, Saint Louis MO. EUA). Os cortes foram desparafinizados em xilol

por 5 minutos (3 banhos), hidratados em lcool etlico absoluto (4 banhos) e lavados com

soluo salina tamponada (SST) em pH 7,4 por 5 minutos; posteriormente os cortes foram

tratados com perxido de hidrognio (HO) a 3% diludo em SST por 5 minutos para

bloqueio de peroxidase endgena. Utilizou-se o mtodo de recuperao de eptopos pelo

calor (SST de citrato com pH 6,4 por 15 minutos em forno de microondas) para a pesquisa

de caspase 3.

Em seguida, os tecidos foram incubados com anticorpo primrio anti- caspase 3 em

mdia por 16 horas, incluindo o perodo noturno. No dia seguinte, aps lavagem em SST,

os cortes foram incubados com anticorpo secundrio biotinilado na diluio de 1: 300

(Vector Corporation, Burlingame, Califrnia, EUA). A seguir realizou-se incubao por

45 minutos com complexo ABC na proporo de 1 gota do reagente A (avidina) e uma do

reagente B(biotina ligada peroxidase) na diluio de 5 ml de soluo do TRIS.

Para visualizao da reao, os cortes foram tratados com soluo de DAB (3-3) -

tetrahidrocloreto de diaminobenzidina na concentrao de 1 mg/ml de soluo tampo de

TRIS e soluo de perxido de hidrognio (HO) por 5 minutos. Os cortes foram contra-

corados com hematoxilina de Harris por 20 segundos ou verde de metila por 5 minutos

com posterior desidratao em banhos de lcool etlico absoluto (5 banhos) e xilol (3

banhos).

Todos os passos da reao imunohistoqumica foram realizados temperatura

ambiente, com exceo da incubao no forno de microondas. Entre cada passo da reao

as laminas foram lavadas varias vezes com SST (pH = 7,4).

A expresso imunhistoqumica da caspase foi identificada e quantificada por

programa de computador (o programa AXIOVISION Rel 4.2 da ZEISS) partir de tecido

com cor marron acastanhado (Figura 12)

Critrios de avaliao histolgica pela colorao em HE

As lminas coradas em HE foram avaliadas qualitativamente pela descrio do

histologista, sem conhecimento dos grupos a que pertenciam as lminas.

A descrio qualitativa procurou avaliar a viabilidade da mucosa intestinal pelo

grau de leso celular segundo os seguintes critrios:

19

a) grau 0: ausncia de restos celulares no lmen intestinal, vilosidades integras,

pice de vilosidades sem sinais de necrose;

b) grau I: ausncia de restos celulares no lmen intestinal, vilosidades ligeiramente

alteradas na sua disposio com descolamento em relao a sua lmina prpria e/ou sinais

de necrose celular em clulas apicais;

c) grau II: presena de restos celulares no lmen intestinal, vilosidades

desestruturadas e necrose de clulas epiteliais alm de sua parte mdia ou prxima s

criptas intestinais (Figura 13).

Obedeceu-se tambm um critrio quantitativo de medio da espessura da parede

intestinal, desde a sua camada mais externa (serosa) at o alto da vilosidade mais

proeminente dentro do lmen intestinal ou das criptas (Figura 16). Foram escolhidos vinte

campos aleatoriamente para a leitura e medidas de espessura. As medidas, expressas em

micrometros, foram processadas por programa de computador Axiovision Rel 42.-Zeiss e

apresentadas pelas suas mdias e desvio-padro.

20

Figura 14 Mostrando o equipamento usado para a leitura, microscpio Carl Zeiss Axilab, sistema de

captura Axiocom MRC e processamento com o programa de computador Axiovision Rel 42.-(Zeiss).

Figura 15 - Mostrando detalhes do programa de computador usado Axiocam MRC da Zeiss.

21

Figura 16 - Fotomicrografia caracterstica de uma lmina corada pela HE, mostrando as reas consideradas

para a medio da parede intestinal e demarcadas para identificao e contagem pelo programa de computador (Axiovision Rel 4.2 da ZEISS).

Critrios de avaliao imunohistoqumica

O programa de computador Axiovision Rel 42.-Zeiss permitiu a marcao das

clulas coradas em marron acastanhado (expresso imunohistoqumica da caspase 3), sua

contagem em vinte campos aleatrios, clculo de sua porcentagem em relao s clulas

no coradas em marron-castanho (clulas sem expresso imunohistoqumica da caspase 3)

e apresentao dessas medidas em mdia e desvio-padro. O ndice da apoptose foi

calculado considerando a porcentagem de clulas apoptticas marcadas em cada 1000

clulas contadas.

22

Anlise estatstica

De acordo com a natureza das variveis foi utilizado o teste de anlise por

varincia (ANOVA) e o teste de Tukey Kramer para comparaes mltiplas de variveis.

Estabeleceu-se um p< 0,05 (5%) para rejeio da hiptese de nulidade e os valores

significantes foram assinalados com um asterisco.

4. RESULTADOS Descrio qualitativa microscpica (colorao em HE)

As lminas de cada um dos oito animais de cada grupo, coradas pela hematoxilina-

eosina, foram lidas e submetidas descrio qualitativa submetidas aos critrios de graus

de leso.

Animais do Grupo I Isquemia e reperfuso sem oxigenao hiperbrica.

A avaliao realizada pela leitura em pequeno aumento (20x) e grande aumento

(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ampla prevalncia de leses

celulares grau II. Foi freqente o encontro da presena de restos celulares no lmen

intestinal, vilosidades desestruturadas e necrose de clulas epiteliais alm de sua parte

mdia ou prxima s criptas intestinais, sendo raras as que apresentaram aspecto

aparentemente normal (Figura 17). As criptas intestinais embora conservadas em sua

maioria, em alguns focos j apresentavam sinais de desestruturao e necrose celular

esparsa (Figura 18) A camada seromuscular est preservada sem edema ou focos de

hemorragia.

24

Figura 17 Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo I, onde pode-se notar a desestruturao das vilosidades, restos celulares desprendidos no lmen intestinal e achatamento global da mucosa .As criptas esto relativamente conservadas. A camada sero-muscular est preservada. (HE 20X )

Figura 18 Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo I, onde pode-se notar que as criptas esto relativamente conservadas. Porm com focos de extravasamento hemorrgico na lmina prpria e entre as criptas (setas) (HE 200X).

25

Animais do grupo II Oxigenao hiperbrica somente no perodo de isquemia.

.


(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ocorrncia de leses

celulares grau I. entremeadas com prevalncia de ausncia de leses (grau 0). Foi patente a

ausncia de restos celulares no lmen intestinal, algumas vilosidades estavam ligeiramente

alteradas na sua disposio com descolamento em relao a sua lmina prpria e/ou com

sinais de necrose celular em clulas apicais, porm a grande maioria das vilosidades no

apresentou sinais de leso celulares (Figuras 19 e 20).

26

Figura 19 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo II, mostrando a

integridade das vilosidades e criptas, embora em alguns setores possam perceber-se discretas alteraes apicais na estruturao da vilosidade (HE 20X).

Figura 20 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo II, mostrando a integridade da vilosidade, com edema discreto (seta fina), sem alteraes estruturais relevantes, porm com discretos focos de extravasamento hemorrgico (seta espessa). (HE 200X).

27

Animais do grupo III Oxigenao hiperbrica somente no perodo de reperfuso.





mdia ou prxima s criptas intestinais, no tendo sido encontradas vilosidades normais

(Figura 21). As criptas intestinais em sua maioria esto alteradas, com focos j freqentes

de desestruturao, necrose celular e extravamento hemorrgico (Figura 22) A camada

seromuscular est preservada sem edema ou focos de hemorragia.

28

Figura 21 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo III, onde se pode notar

a desestruturao das vilosidades, restos celulares desprendidos no lmen intestinal, achatamento global da mucosa e focos esparsos de extravasamento hemorrgico. As criptas esto desestruturadas com sinais de edema e descolamento da lmina prpria. A camada sero-muscular est preservada. (HE 20X).

Figura 22 Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo III, onde pode-se notar a ausncia

de vilosidades, as criptas esto destrudas, com focos de extravasamento hemorrgico na lmina prpria e entre as criptas (setas) (HE 200X).

29

Animais do Grupo IV Oxigenao hiperbrica nos perodos de isquemia e de

reperfuso


(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ocorrncia de poucas leses

celulares grau I, com ampla prevalncia de ausncia de leses (grau 0). Foi patente a

ausncia de restos celulares no lmen intestinal, poucas vilosidades ligeiramente alteradas

na sua disposio com descolamento em relao a sua lmina prpria e/ou sinais de

necrose celular em clulas apicais e a grande maioria das vilosidades no apresentava

sinais de leso celulares (Figuras 23 e 24).

30

Figura 23 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo IV, mostrando a integridade das vilosidades e criptas, embora em raros setores possam perceber-se discretas alteraes apicais na estruturao da vilosidade (HE 20X).

Figura 24 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo IV, mostrando a integridade da vilosidade, sem edema ou alteraes estruturais relevantes. (HE 200X).

31

Descrio qualitativa microscpica ( imunohistoqumica caspase 3)

Animais do Grupo I Isquemia e reperfuso sem oxigenao hiperbrica.

presentavam tambm, embora

em bem menor freqncia clulas em apoptose (Figura 26).



celulares grau II. Foi freqente o encontro da presena de clulas marcadas em marrom

acastanhado, ou seja a expresso da marcao da caspase 3, na vilosidade intestinal sendo

em maior intensidade da sua parte mdia para o pice (Figura 25). As criptas intestinais

embora conservadas em sua maioria, em alguns focos j a

32

Figura 25 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo I, onde se pode notar as vilosidades marcadas mais intensamente em marrom nas suas pores mdias e apicais, sendo que a parte basal a colorao ocorra em menor freqncia.(Imunohistoqumica 20X)

Figura 26 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do Grupo I, onde se pode notar uma freqncia menor de clulas marcadas em marrom acastanhado nas reas das criptas intestinais. (Imunohistoqumica - 200X).

33

Animais do grupo II Oxigenao hiperbrica somente no perodo de isquemia.


(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ocorrncia de leses

celulares grau I. entremeadas com prevalncia de ausncia de leses (grau 0). A grande

maioria das vilosidades no apresentou sinais de leso celulares e a colorao marrom

acastanhada da marcao imunohistoqumica da caspase 3 se fez notar com maior

freqncia e intensidade nas bordas apicais das vilosidades (Figura 27). As criptas

intestinais estavam conservadas e a colorao marrom foi bem menos intensa e freqente

que nas vilosidades (Figura 28).

34

Figura 27 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do Grupo II, onde se nota que as vilosidades esto bem conservadas e a colorao marrom acastanhada se faz presente em maior freqncia e intensidade nas bordas apicais. (Imunohistoqumica 20X).

Figura 28 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo II, onde se pode notar nas criptas intestinais uma marcao celular em marrom acastanhado de menor intensidade e freqncia do nas correspondentes vilosidades do mesmo grupo. (Imunohistoqumica 200X).

35

Animais do grupo III Oxigenao hiperbrica somente no perodo de reperfuso.





mdia ou prxima s criptas intestinais, no tendo sido encontradas vilosidades normais

(Figura 29). As criptas intestinais em sua maioria esto alteradas, com focos j freqentes

de desestruturao, necrose celular e extravamento hemorrgico (Figura 30) A camada

seromuscular est preservada sem edema ou focos de hemorragia.

36

Figura 29 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo III, onde se pode notar

intensa desestruturao das vilosidades intestinais e colorao marrom acastanhada das vilosidades remanescentes at junto s criptas intestinais. (Imunohistoqumica- 20X).

Figura 30 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do Grupo III, onde se pode notar as criptas alteradas e freqncia e intensidade da colorao marrom acastanhada semelhante a das vilosidades. (Imunohistoqumica -200X).

37

Animais do Grupo IV Oxigenao hiperbrica nos perodos de isquemia e de

reperfuso


(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ocorrncia de poucas leses

celulares grau I, com ampla prevalncia de ausncia de leses (grau 0). A colorao

marrom acastanhada ocorreu em pequena intensidade e menor freqncia nas regies

apicais das vilosidades poupando as partes mdias e basais (Figura 31). As criptas no

apresentam sinais de colorao acastanhada (Figura 32).

38

Figura 31 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do Grupo IV, onde se pode notar que as vilosidades esto preservadas e a colorao marrom acastanhada em pequena intensidade e freqncia ocorre em reas discretas no pice. (Imunohistoqumica -20X).

Figura 32 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupi IV, onde se pode notar

a quase total ausncia de clulas marcadas em marrom acastanhado. (Imunohistoqumica 200X).

39

Medidas de espessura da parede intestinal

As diversas medidas da espessura das paredes intestinais medidas nas lminas

individuais de cada animal em cada grupo, contadas pelo programa de computador em

vinte campos aleatrios so apresentadas como uma tabela das mdias e erro padro da

mdia (Tabela 1 e Grfico1).

Tabela 1 Mdia e erro padro da mdia (EPM) da espessura (micrometros) da parede intestinal medidas em cada animal de cada grupo em vinte campos aleatrios em lminas coradas em HE 20X.

Animais

Grupos

GI

GII

GIII

GIV

Mdia

172,79

327,50

142,50

266,49

EPM

5,95

30,23

6,05

20,01

Teste ANOVA (p < 0,001)

GI = GIII

GII = GIV

GII = GIV > GI = GIII

40

0

50

100

150

200

250

300

350

GRUPO IGRUPO IIGRUPO IIIGRUPO IV

Grfico 1 - Mdias e erro padro das mdias da espessura (micrometros) da parede intestinal medidas em cada animal de cada grupo em vinte campos aleatrios em lminas coradas em HE 20X.

Medidas dos ndices de apoptose

41

As medidas dos ndices de apoptose, calculados para as clulas marcadas em

marrom acastanhado nas vilosidades e criptas e contados pelo programa de computador,

so apresentados com mdias e erro padro das mdias nas tabelas 2 e 3 e nos grficos 2 e

3.

Tabela 2 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas vilosidades intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte campos aleatrios, em lminas marcadas pela imunohistoqumica 20X.

Animal

Grupos

GI

GII

GIII

GIV

Mdia

0,70

0,16

0,84

0,42

EPM

0,08

0,01

0,03

0,05


Teste de Tuke - Kramer para comparaes mltiplas ( F calculado =20,980)

GII < GIV < GI = GIII

42

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Grupo IGrupo IIGrupo IIIGrupo IV

Grfico 2 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas vilosidades intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte campos aleatrios, em lminas marcadas pela imunohistoqumica 20X.

43

Tabela 3 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas criptas intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte campos aleatrios, em lminas marcadas pela imunohistoqumica 20X.

Animal

Grupos

GI

GII

GIII

GIV

Mdia

0,44

0,43

0,41

0,46

EPM

0,11

0,05

0,07

0,06


Teste de Tuke - Kramer para comparaes mltiplas ( F calculado = 0,066)

GI = GII = GIII = GIV

44

0,38

0,39

0,4

0,41

0,42

0,43

0,44

0,45

0,46

Grupo IGrupo IIGrupo IIIGrupo IV

Grfico 3 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas criptas intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte campos aleatrios, em lminas marcadas pela imunohistoqumica 20X.

5. DISCUSSO O fenmeno de 0isquemia e reperfuso pode ocorrer em processos patolgicos

envolvendo vsceras abdominais, em especial o intestino delgado. Tem interesse particular

o fenmeno quando associado aos procedimentos de transplante intestinal. A retirada do

rgo do doador, sua preservao at o implante no receptor e a subseqente reperfuso

objeto de estudo na literatura pertinente, pois so diversos os pontos ainda no

adequadamente esclarecidos1-4.

A linha de pesquisa em Integrao Orgnica de Tecidos e rgos, do Programa de

Ps-Graduao em Cirurgia e Experimentao, dedica sua ateno para os problemas

envolvidos no transplante intestinal e entre as propostas para melhorar os resultados desses

transplantes investiga o papel da oxigenao hiperbrica17-22.

Para consecuo do modelo animal de doena foi escolhido o rato, uma vez que

outros trabalhos na literatura o utilizam, o que pde facilitar a confrontao dos

resultados23,38-40. Por outro lado o rato um dos animais mais frequentemente usados em

modelos experimentais, tendo em vista sua fcil obteno e manipulao, com custos

baixos41. A facilidade de manuteno em ambiente controlado facilitou a elaborao de

uma amostra homognea de ratos machos, com idade e peso similares.

Os procedimentos seguiram as diretrizes do Comit Brasileiro de Experimentao

Animal (COBEA) e devidamente avaliado pelos Comits de tica das instituies

envolvidas na pesquisa.

Os procedimentos anestsicos usados foram os que so padronizados pelo

Programa de Ps-graduao em seus experimentos envolvendo ratos. O uso da associao

de quetamina, acepromazina e xilazina foi suficiente para manter os animais em plano

anestsico durante todos os procedimentos operatrios e de oxigenao hiperbrica. A

administrao intramuscular por sua vez evitou eventuais intercorrncias dos anestsicos

com a aplicao intraperitoneal (leso de alas ou interao com os procedimentos

operatrios). A aplicao de anestsicos inalatrios seria incompatvel com a necessidade

de manter os animais sob a oxigenao hiperbrica23,40-43.

Existem vrios modelos na literatura biomdica de provocao do fenmeno de

isquemia e de reperfuso44. A isquemia pode ser total45-50 ou parcial51-65 e pode-se ocluir o

componente arterial isoladamente47-67 ou em associao com o componente

46

venoso23,43,55,57. A interrupo do fluxo arterial ou artrio-venoso pode ser mantida durante

todo o experimento40,61.66 ou podem-se estabelecer perodos variveis de isquemia e

perodos variveis de estudo aps a reperfuso50-65.

A associao de ocluso da artria e da veia concomitantemente um modelo que

est mais prximo da realidade de um transplante. O intestino removido do doador ter

ambos os componentes vasculares ligados e retirados. Trabalhos experimentais mostraram

que a dupla ocluso leva o comprometimento significativo da mucosa intestinal, j aos

trinta minutos de isquemia21,22,43,50,63. Ampliou-se o perodo para sessenta minutos para

surpreender leses mais significativas e para corresponder a um tempo maior que ocorre

nos procedimentos de transplante ou nas leses oclusivas arteriais do mesentrio47.

O modelo proposto mostrou que nos animais do grupo I, em que aps a isquemia e

a reperfuso no foram submetidos oxigenao hiperbrica, ocorreram leses

importantes da mucosa intestinal. As figuras 17 e 180 mostram o grau de destruio

celular caracterizado como grau I, onde houve destruio celular com desestruturao das

vilosidades intestinais, presena de restos celulares no interior do lmen intestinal. Focos

de necrose puderam ser identificados em alguns campos. As criptas, embora com

celularidade conservada, apresentaram descolamento da lmina prpria e focos

hemorrgicos. A marcao pela caspase 3 mostrou que as clulas das criptas embora

conservadas morfologicamente apresentaram-se em boa parte marcadas pelo corante

marrom acastanhado (Figuras 25 e 26). Ocorreu uma significativa diminuio da espessura

da camada mucosa (Tabela 1). Os achados demonstraram um padro de destruio celular

mensurvel e mais intenso que o encontrado em outro experimento da linha de pesquisa

em que a isquemia de trinta minutos e reperfuso de trinta minutos mostraram leses

qualitativamente similares, porm em menor intensidade21,22. O modelo atendeu ao

proposto: produo de leso de mucosa mensurvel e de intensidade moderada grave,

semelhante a outros modelos43,49,55,65. No se identificou alteraes morfolgicas

importantes nas camadas serosa e muscular.

Uma vez que o modelo produziu as leses padronizadas foi possvel avaliar o papel

da aplicao da oxigenao hiperbrica na evoluo destas leses.

As leses necrticas e apoptticas que se manifestaram na avaliao do grupo I

podem ser atribudas ao mecanismo conhecido e bastante estudado da isquemia e

reperfuso.

47

O oxignio o comburente da reao de combusto essencial para a produo de

energia no organismo humano, armazenado em ltima instncia nos complexos de

adenosina trifosfato (ATP). Estas reaes de combusto partir de substratos oxidveis ou

combustveis, em especial a glicose, so levadas cabo em sua maior parte nas

mitocndrias e dependem de uma interelao de substratos, enzimas, vitaminas e

eletrlitos, evidentemente reaes ocorrendo no meio interno aquoso1-4.

Uma enzima, a xantina desidrogenase, uma das responsveis pelo mecanismo de

fornecimento de um eltron altamente energtico para a nicotinamida adenina difostato

(ADP) que sendo receptora deste eltron se transforma no ATP, armazenando a energia

resultante da combusto de modo estvel e transportvel dentro da prpria clula ou para

outros tecidos e rgos. A supresso do oxignio determina a converso da XD em xantina

oxigenase (XO)10. Esta enzima utiliza o oxignio como receptor de eltrons, numa ligao

instvel e altamente energtica formando os conhecidos radicais livres de oxignio (RLO)

ou espcies reativas de oxignio (EROs) como o superxidos (OH-) e perxido de

hidrognio (H2O2)10,51,67. Os radicais livres de oxignio determinam a destruio das

camadas lipoproticas das membranas celulares do ncleo, mitocndrias e do citossol

levando a morte celular imediata por necrose ou desencadeando processos bioqumicos

que, aps um determinado tempo, levar morte celular por apoptose1-4.

As pesquisas tm buscado formas de evitar ou atenuar os efeitos destas espcies

reativas de oxignio ou radicais livres5-7. Tm-se utilizado substncias inibidoras da

formao dos radicais livres conhecidas como antioxidantes, substncias varredoras destas

substncias (scavengers), processos de pr-condicionamento fsico ou qumico, onde

supresses parciais e progressivas de oxigenao antecedem uma supresso sustentada

mais prolongada2-7. Cada proposio tem mostrado vantagens e desvantagens na

dependncia dos modelos utilizados de isquemia/reperfuso, nas doses das substncias

utilizadas, nos perodos em que so empregadas, nos parmetros que so usados para

avaliao dos resultados, entre outras variveis intervenientes1-7.

Entre as mltiplas propostas em estudo, a oxigenao hiperbrica tem um suporte

terico que a torna objeto de pesquisa nas situaes de isquemia/reperfuso. Considerando

que o fator desencadeante de todo o processo a privao do oxignio, o oferecimento

deste elemento aos tecidos, no momento em que a perfuso sangunea estiver ausente ou

48

prejudicada, poder suprimir ou diminuir o desencadeamento da cascata de eventos

bioqumicos que levaro formao dos radicais livres.

Na OHB, a respirao de oxignio a 100% sob condies hiperbricas pode

aumentar em muitas vezes a presso parcial do oxignio no plasma e lquidos corporais14-

16,67,68. Se a respirao de oxignio a 100% ocorrer em meio de presso igual a 2 ATA

(atmosferas de presso), a presso parcial do oxignio aumentada de 150mmHg para

2.280mmHg com um contedo de oxignio dissolvido no plasma de 0,32mL/100cm3 de

sangue para 6,8mL/100cm3 de sangue69. Este oxignio dissolvido pode, por difuso,

alcanar o tecido privado de circulao7-9,14-16.

Baseado neste suporte terico e tambm no suporte emprico da utilizao da

oxigenao hiperbrica em outros trabalhos experimentais, fundamenta-se a linha de

pesquisa e em particular este projeto de pesquisa.

Por outro lado as leses advindas deste processo de isquemia/reperfuso e o

eventual efeito da oxigenao hiperbrica podem ser avaliados morfologicamente pela

extenso da necrose resultante, bem como pela avaliao do processo apopttico.

A avaliao da necrose se fez pela descrio qualitativa dos achados histolgicos

identificveis na colorao pela hematoxilina e eosina. Estabeleceu-se um escore de

acordo com o grau das leses, classificando-as em leses leves ou ausentes (grau 0)

moderadas (grau I) e graves (Grau II). A literatura apresenta classificaes mais

detalhadas e diferentes critrios de graduao para avaliar a leso das clulas epiteliais de

revestimento das vilosidades intestinais43,49,50,55,65,66. Como aqui se associou a medio do

processo apopttico, que tido como indicador mais fidedigno do fenmeno estudado,

optou-se por uma avaliao morfolgica qualitativa mais singela e complementada com

estudo quantitativo de medio das camadas da parede intestinal.

Os resultados mostraram que nos animais em que a oxigenao hiperbrica foi

aplicada somente no perodo de isquemia (Grupo II) apresentaram um escore de leso

celular grau 0 (Figuras 19 e 20), uma espessura de camada mucosa mais espessa,

traduzindo uma maior preservao das vilosidades (Tabela 1). Estes resultados foram

significantes quando comparados com os dos animais do Grupo I tido como controle.

Portanto de se presumir que o oxignio 100% fornecido sob duas atmosferas de

presso foi capaz de manter os processos bioqumicos celulares prximos normalidade

49

evitando que as clulas do revestimento epitelial das vilosidades entrassem em processo

necrtico.

A aplicao da oxigenao hiperbrica no perodo de reperfuso (Grupo III) por

sua vez no foi capaz de proteger a mucosa com a mesma intensidade mostrando um

escore de leso celular grau II (Figuras 21 e 22), uma espessura de camada mucosa

prxima ao do grupo I (Tabela 1) onde no foi aplicada a oxigenao hiperbrica.

Portanto, no perodo de reperfuso licito imaginar que os processos envolvidos no

mecanismo de necrose celular j teriam ocorrido no perodo anterior de isquemia e que a

oferta de oxignio no perodo subseqente foi incapaz de impedir a cadeia de eventos

biolgicos.

Os animais do grupo IV que receberam a oxigenao hiperbrica tanto no perodo

de isquemia quanto de reperfuso apresentaram resultados similares aos animais do grupo

II. As leses celulares foram leves ou ausentes, porm com espessura de camada mucosa

inferior mostrando um grau maior de comprometimento. Os resultados mostram que h

certa similaridade deste grupo IV com os do grupo II, embora haja uma diferena na

medida da espessura da mucosa em nmeros absolutos, mas considerando o desvio-padro

os dados se sobrepem. Uma limitao do experimento , pois o tamanho da amostra. de

se esperar que uma amostra maior possa expressar esta diferena com maior clareza.

Em sntese, a avaliao histolgica dos grupos, mostrou que a oxigenao

hiperbrica aplicada no perodo de isquemia tem um papel preponderante na preservao

do revestimento celular e na integridade das vilosidades intestinais. No entanto a sua

aplicao exclusiva no perodo de reperfuso no surtiu um efeito protetor comparvel aos

dos grupos II e IV. Aventou-se, pois a hiptese que o oxignio hiperbrico oferecido

quando oferecido na ausncia da circulao pode se difundir nos lquidos corporais e, de

algum modo, impedir ou minimizar as leses celulares necrticas. A aplicao do oxignio

hiperbrico nos dois perodos, isquemia e reperfuso, no entanto mostraram resultados

inferiores aos do grupo II e muito superiores aos grupos I e III. Pode-se inferir que o efeito

protetor do oxignio na fase de isquemia foi de algum modo prejudicado pela presena do

mesmo no perodo de reperfuso, mostrando certa independncia dos fenmenos

biolgicos nas duas etapas. Poderia o oxignio ofertado na fase de reperfuso estar

favorecendo a formao de radicais livres e assim favorecendo a leso celular.

50

A apoptose, por sua vez um processo bioqumico complexo que pode ser

desencadeado por estmulos externos ou internos e que tem uma evoluo reversvel ou

irreversvel na dependncia de mltiplos fatores. Ela est envolvida em quase todos os

processos de atividade celular e nos mais diversos tecidos e rgos. Seu comportamento

bioqumico est na dependncia da capacidade que tem a clula, e por conseqncia o

tecido ou mesmo o rgo, de reverter o estmulo desencadeante.

A presena de radicais livres um dos fatores que podem desencadear a cascata de

eventos qumicos que vo desembocar na apoptose celular identificada pelas seguintes

caractersticas morfolgicas: retrao celular, condensao da cromatina sob a membrana

nuclear, formao de bolhas citoplasmticas e corpsculos apoptticos e fagocitose das

clulas ou corpsculos apoptticos.

A apoptose o ponto final de uma cascata, dependente de energia, de eventos

moleculares, desencadeadas por certos estmulos e consiste em quatro componentes

distinguveis mas superpostos: vias sinalizadoras (que desencadeiam a apoptose), controle

e integrao (molculas reguladoras que inibem, estimulam ou antecipam a apoptose e,

assim, determinam o prognstico), fase de execuo comum (onde esto envolvidas as

proteases do grupo das caspases) e remoo das clulas mortas. A remoo das clulas

mortas se faz por fagocitose de modo eficiente, sem deixar vestgios e praticamente no h

inflamao.

A fase de execuo a parte final do processo. Uma cascata de proteoltica, que

est ligada a todas as formas de apoptose, mediada pela famlia das caspases que abrange

mais de dez membros. Elas existem como zimognios e ao sofreram o processo de

clivagem posto em movimento um processo de ativao rpida e seqencial.

Considerando o exposto optou-se por avaliar a apoptose pela expresso da caspase

3 que est relacionada com a fase de execuo do processo e, portanto irreversvel, porm

ainda sem expresso morfolgica identificvel. tambm um bom indicador do dano que

um estmulo lesivo capaz de provocar no tecido.

Nos animais do grupo I o ndice apopttico, ou seja, a relao entre o nmero de

clulas marcadas nas vilosidades por reao imuno-histoqumica pela caspase3 e o nmero

de clulas viveis, no marcadas significantemente maior que em outros dois grupos de

estudo. As vilosidades intestinais, parcialmente ntegras, exibem uma porcentagem

considervel de clulas marcadas inclusive atingindo clulas das criptas intestinais

51

(Figuras 21 e 22). O modelo proposto de isquemia e reperfuso foi, portanto capaz de

produzir alteraes bioqumicas importantes e mensurveis na mucosa intestinal de ratos.

Os animais do grupo II, que receberam a oxigenao hiperbrica no perodo

somente de isquemia exibiram um ndice apopttico significantemente menor que o grupo

I, mostrando que a oferta de oxignio sob presso neste perodo deve realmente ter

influenciado os processos bioqumicos celulares evitando a formao de radicais livres.

Deve ter contribudo para o funcionamento normal do aparato bioqumico celular em que

pese a falta de irrigao arterial e venosa, pela difuso do oxignio nos lquidos corporais.

A fundamentao de ao do oxignio hiperbrico parece ter contribudo para que uma

oferta do mesmo mantivesse as funes bioqumicas celulares de produo de energia sem

desvios na cadeia enzimtica, que o ponto de partida da cadeia de eventos que

desembocam no processo de apoptose.

Os achados da histologia vistos anteriormente so concordantes com os achados da

marcao da apoptose pela caspase 3.

A mesma coincidncia com a histologia ocorreu com os achados de ndice

apopttico nos animais do grupo III. A oferta de oxignio somente no perodo de

reperfuso foi o que apresentou ndices apoptticos significantemente maiores que todos

os grupos. O oxignio hiperbrico no perodo de reperfuso no protegeu as clulas de

uma agresso externa advinda da formao de radicais livres que certamente ocorreu no

perodo de isquemia. Portanto, no perodo de reperfuso licito imaginar que os processos

bioqumicos de produo de radicais livres j teriam ocorrido no perodo anterior de

isquemia e que a oferta de oxignio no perodo subseqente foi incapaz de impedir a

cadeia de eventos bioqumicos.

Por outro lado os animais do grupo IV, que receberam o oxignio hiperbrico nos

dois perodos apresentaram ndice apoptticos menores que o grupo controle (Grupo I),

porm superiores aos do grupo II. De certa forma a oferta de oxignio no perodo de

reperfuso seja de forma isolada ou aps a oferta na isquemia leva a uma piora nos

resultados de preservao celular. Uma hiptese para explicar o fato seria que apesar de

favorecer os processos bioqumicos normais na fase de isquemia a oxigenao hiperbrica

no protegeria de modo total, permitindo na fase subseqente a formao de radicais livres

que teriam sua ao facilitada pela presena abundante do mesmo na reperfuso. Tambm

se observou que houve uma tendncia dos valores encontrados no grupo IV se

52

assemelharem aos do grupo II, e com um aumento da amostra os dados possam mostrar a

real validade da diferena encontrada.

Isto implica que novos estudos com maior nmero de animais ou com marcadores

de apoptose mais especficos para outras fases de sua cascata bioqumica devam ser

estudados.

Os resultados mostraram que as criptas intestinais esto razoavelmente protegidas

da apoptose em todos os grupos (Tabela 2), embora apresentem comprometimento de

edema e infiltrado hemorrgico nos animais sem proteo de oxigenao hiperbrica

(Grupo I). Tambm a marcao da caspase 3 foi mais intensa nos animais deste grupo.

conhecido o fato da migrao das clulas de revestimento das vilosidades ocorrer da base

para o pice, partir da camada celular das criptas. A integridade das criptas mostrou que

ocorreu uma resistncia maior aos fatores agressivos. A sua preservao deve ser um fator

importante na futura reepitelizao da mucosa.

Outro ponto a ser pesquisado a integridade das camadas serosa e muscular

Sabidamente os msculos, lisos ou esquelticos, so tecidos mais resistentes isquemia.

No entanto, a motilidade intestinal de um futuro intestino transplantado depende da

integridade muscular e principalmente dos plexos nervosos submucosos e mioentricos.

Seria outro ponto de interesse a ser pesquisado luz da oxigenao hiperbrica.

53

Consideraes finais

O modelo de promoo de isquemia por perodo de sessenta minutos e seu estudo

tambm aps sessenta minutos de reperfuso permitiu formular um modelo que provoca

alteraes morfolgicas mais intensas na mucosa de ratos. As alteraes bioqumicas pela

marcao da caspase 3 envolvendo o fenmeno da apoptose tambm se mostrou intensa e

mensurvel. Este modelo mais favorvel para estudos que envolvam o transplante

intestinal porque trabalha com perodos de observao mais prximos do que pode ocorrer

na prtica de procedimentos em animais de experimentao ou seres humanos.

A pesquisa permitiu inferir que a oxigenao hiperbrica atende, nos seus

princpios tericos, como um procedimento que pode proteger tecidos, em particular a

mucosa intestinal, num modelo de isquemia/reperfuso. A fundamentao terica da oferta

de oxignio difusvel pelos lquidos corporais parece ter encontrado respaldo nos

resultados uma vez que a sua presena de algum modo protegeu a mucosa intestinal na

vigncia da interrupo arterial e venosa do fluxo sanguneo.

Dentro das limitaes inerentes aos critrios de avaliao histolgicos propostos e

no tipo de marcador utilizado para a apoptose, foi possvel estabelecer uma relao causal

do papel protetor da oxigenao hiperbrica nas leses de isquemia e reperfuso.

A fundamentao terica da ao da oxigenao hiperbrica ficou mais explicita na

avaliao do grupo em que ela foi aplicada no perodo de isquemia mostrando que,

possivelmente impedindo a formao de radicais livres, interferiu favoravelmente na

cadeia de eventos bioqumicos com conseqente preservao morfolgica da mucosa

intestinal.

Fica claro que outros trabalhos devem ser levados cabo com procedimentos de

avaliao mais especficos na mucosa, muscular e plexos mioentricos, para uma

avaliao mais consistente do papel da oxigenao hiperbrica no fenmeno de isquemia e

reperfuso intestinal.

6. CONCLUSES 1- A oxigenao hiperbrica mais eficaz para proteger as leses da mucosa intestinal

de ratos na isquemia e reperfuso quando aplicada no perodo de reperfuso.

2- A oxigenao hiperbrica quando aplicada no perodo de isquemia somente no

protege as leses da mucosa no fenmeno de isquemia e reperfuso.

3- A proteo da oxigenao hiperbrica aplicada no perodo de isquemia e no perodo de

reperfuso qualitativamente inferior aplicao somente no perodo de reperfuso.

7. REFERNCIAS

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ESTUDO MORFOLÓGICO DO INTESTINO DELGADO DE … · caracterizam. Ao Prof. Dr. Manuel ... pode-se...

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