XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/INPA . Manaus - 2009

ESTUDO QUÍMICO DO EXTRATOCAMPSIANDRA COMOSA BENTH. (FABACEAE)SUBSTÂNCIAS COM POTENCIAL ANTIOXIDANTE.

METANÓLICO DOS FRUTOS DEVISANDO

Joyce Freitas de MENEZES1; Francislani Nascimento dos SANTOS2; Jaqueline Inês Alves deAndrade"; Pierre Alexandre dos SANTOS4;Cecilia Veronica NUNEZs.'Bolsista PIBICjFAPEAM/INPA; 2Bolsista CNPq/INPA; 3Bolsista CNPq/INPA; 4Co-orientadorCPPN/INPAe bolsista DCR/CNPq/FAPEAM;sOrientadora CPPN/INPA.

1. IntroduçãoO Brasil é detentor da maior biodiversidade do planeta. Com cerca de 22% de todas as espéciesvegetais conhecidas, o Brasil possui um patrimônio genético potencialmente capaz de render-lhebenefícios econômicos (Lopes, 2006). Dentre essas espécies, pode-se destacar Campsiandracomosa Benth. (Fabaceae- Caesalpinoideae), cuja ocorrência é relatada no Brasil, Colômbia,Suriname e Venezuela. A espécie é popularmente conhecida como capoeirana ou acapuranadependendo da região, e estudos químicos dessa família relataram a presença de metabólitossecundários como esteróides, flavonóides, taninos e terpenos (Regasini et aI., 2008; Rezende et aI.,2004). Seus frutos servem como alimento para peixes e na medicina popular as folhas, cascas efrutos são utilizados como antifebril, antipirético, antiúlcera, como tônico e foram realizadosestudos contra malária e leishmaniose (Kvist et aI., 2006). Outro estudo revelou que das partesaéreas da espécie C. guayanensis foram isoladas saponinas (Braca et aI., 2006).Devido essas informações, será realizado o estudo fitoquímico dos frutos de Campsiandra comosaBenth visando o isolamento de substâncias com atividade antioxidante.

2. Material e métodosFrutos de C. comosa foram coletados no Lago do Catalão a 10 Km da cidade de Manaus-AM eidentificadas pela Dra Ieda Leão do Amara!. Foram secos em estufa de circulação forçada a 50°Cdurante dois dias, posteriormente moídos e extraídos com diclorometano, metanol e água. Sendocada extração realizada em triplicata e utilizando banho de ultrassom por 20 minutos. Após afiltração, os extratos foram concentrados utilizando rotaevaporador e/ou liofilizador. Para análiseprévia dos extratos foi utilizada cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), as placascromatográficas eluídas com sistemas apropriados e reveladas com UV (254nm e 365nm) iodo,sulfato cérico [Ce(S04ht para avaliação da atividade antioxidante, forão reveladas com solução de2,2-difenil-1-(2A,6-trinitrofenil)hidrazila (DPPH) 0,2% em MeOH que revela a capacidade desequestrar radicais livres. As regiões que adquirirem cor amarela após 30 minutos da aplicaçãoindicarão a presença de substâncias com atividade antioxidante na amostra (Cuendet, et aI., 1997).O fracionamento do extrato metanólico (7 g) foi realizado através de cromatografia em colunaaberta com sílica gel usando o gradiente de DCM/AcOEt 6:4 até AcOEt puro, AcOEt/MeOH 9,5:0,5até MeOH puro, como fase móvel, onde 63 frações foram obtidas, as quais foram analisadas emCCDe. As placas cromatográficas foram eluídas com sistemas apropriados e revelados com UV (254nm e 365 nm), iodo, sulfato cérico [Ce(S04hJ anisaldeído, cloreto férrico (FeCI3) e DPPH. A fração6-25 foi submetida a uma nova coluna cromatográfica aberta utilizando Florisil, como faseestacionária, devido às características observadas na amostra quando revelada em CCDC comdiferentes eluentes e reagentes. Dessa coluna foram coletadas 183 frações, onde várias fraçõesrevelaram a presença de menor número de substâncias. A fração 118 dessa coluna foi submetida amais um fracionamento, novamente utilizando coluna cromatográfica aberta e Florisil como faseestacionária, resultando em mais 35 frações, que após serem analisadas em CCDC algumas foramreunidas e a fração 20-25 foi fracionada utilizando os gradientes DCM/AcOEt 8:2 até DCM/AcOEt1:9; AcOEtjMeOH 9: 1 até MeOH puro e obtiveram-se 61 frações, as quais estão sendo analisadaspor CCDe. Os extratos diclorometânico, metanólico e aquoso foram testados para a atividadeantioxidante com DPPH· e Fe3+/Fenantrolina e os resultados foram comparados através daequivalência com o ácido ascórbico (Novaes, 2007). Os extratos ainda foram submetidos ao testeantibacteriano frente ao micro-organismo patogênico para peixes Aeromonas hydrophila. Os testesforam realizados segundo metodologia proposta por Hu et aI. (2004), modificada, em duplicata. Omicro-organismo teste (Aeromonas hydrophila) foi inoculado em placa de Petri contendo o meio decultura adequado e utilizando a técn ica de "spread -plate", onde foram feitas sete incisões circulares

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com diâmetro de 6,0 mm de modo a obter-se uma cavidade, foram avaliados os extratos. Comocontrole negativo foram utilizados água destilada e os solventes utilizados na preparação de cadaextrato e oxitetraciclina (20 uq/rnl.) como controle positivo.

3. Resultados e discussãoVisando o isolamento de substâncias antioxidantes, o extrato metanólico continua sendofracionado. Quatro colunas cromatográficas abertas foram realizadas buscando a purificação dassubstâncias presentes no extrato. Contudo, as frações 2, (3-4) e 5 da coluna 24CCFM1 serãopurificadas utilizando-se cromatografia em fase líquida de alta eficiência (CLAE). Os extratosdiclorometânico, metanólico e aquoso, apresentaram resultados diferentes em relação à atividadeantioxidante nos métodos DPPH' e Fe3+/Fenantrolina. A atividade antioxidante avaliada pelos testesquantitativos com DPPH' (tabela 1) e Fe3+/Fenantrolina (tabela 2) foram comparados com aequivalência do ácido ascórbico, onde os resultados dos extratos que se aproximarem de 1,0 temalta atividade antioxidante. O ácido ascórbico foi escolhido como padrão por ser um antioxidanteativo nos organismos. Sendo o ácido ascórbico um antioxidante padrão, o ensaio quantitativo comDPPH'(tabela 1) e com Fe3+/Fenantrolina (tabela 2) revelou que os extratos metanólico e aquosodos frutos de Campsiandra comosa Benth. apresentaram atividade antioxidante bastante elevada,enquanto o extrato diclorometânico foi inativo nos dois testes. Os testes preliminares em CCDCutilizando como revelador DPPH' mostraram o mesmo comportamento e a revelação das placas deCCDC usando cloreto férrico indicou a possível presença de substâncias fenólicas. O extratometanólico dos frutos apresentou atividade antioxidante mais elevada que o ácido ascórbico noensaio com Fe3+/Fenantrolina, e no ensaio com DPPH' também apresentou uma atividadesignificativa. Nos testes para verificar a atividade antibacteriana, o extrato diclorometânico nãoapresentou atividade, enquanto o extrato metanólico apresentou um halo de 9 mm, e o extratoaquoso um halo 7 mm, demonstrando ambos uma atividade antibacteriana mediana. Os testes parase determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Mínima Bactericida (CMB)estão em andamento.

Tabela 1. Variação da absorbância em 517 nm eequivalência da absorbância do extrato com ácido, b' I d d - d ' d ascórbico com o com o oxidante DPPH.ascor ICO resu ta o a reacao os extratos e do aci o

Extrato 11 ABSl5171 AA [Equi] Equiv.

Frutos DCM 0,057 0,295 17,388

Frutos MeOH 0,750 2,969 1,685

Frutos Água 1,002 3,941 1,269

y = 0,259x - 0,019R2 = 0,999

1,00,90,80,7

CI) 0,6~ 0,5

!:J. 0,4- 0,3

0,20,10,0

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00

Concentração de AA em Iig.mL-1

Figura 1: curva do ácido ascórbico com DPPH

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Tabela 2. Variação da absorbância em 508,8 nm e equivalência da absorbância dos extratos comácido ascórbico, resultado da reação dos extratos e do ácido ascórbico com o oxidanteFe3+/Fenantrolina.

Extrato t::,. ABS1508,81 AA IEquil Equiv.

Frutos DCM 1,119 1,703 2,948

Frutos 7,781 11,784 0,426MeOH

Frutos 2,557 3,879 1,295Água

2.5 y = O,191x + 0,015R2 = 0,9992,0

.!!o5<.>s:::'~Oo'"t5

0,0

0,00 5,00 10,00 15,00

Concentração de Fe2+ em ILg.mL·1

Figura 2: Curva de Ferro com a Hidroxilamina.

y = O,1262x + 0,0874ff = 0,9993

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0 +------,----,.---,-----,0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

Concentração de AA em pg.mL·1

Figura 3: Curva de ácido ascórbico com Fe3+/Fenantrolina.

4. ConclusãoO extrato metanólico dos frutos de Campsiandra comosa Benth apresentou atividade antioxidantemais elevada, que o ácido ascórbico puro, no ensaio com Fe3+/Fenantrolina, e no ensaio com DPPH'o extrato também apresentou uma atividade significativa. Os testes, que avaliam a atividadeantimicrobiana do extrato, revelaram uma atividade mediana. Contudo, ainda não se conseguiu oisolamento de substâncias com potencial antioxidante, assim o fracionamento cromatográfico dasfrações ativas deve continuar, visando o isolamento desses metabólitos.

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Braca, A.; Abdel-Razik, A.F.; Mendez, J.; De Tomasi., N. 2006. Triterpenoid saponins fromCampsiandra guayanensis. Joumal of Natural Products, 69(2): 240-246.

CUENDET, M.; HOSTETTMANN, K.; POTTERAT,D.W. 1997. Iridoid glucosides with free radicalscavenging properties from Fagrae blumei. Helvetica Chimica Acta, 80: 1145-1152.

Kvist, L.P.; Christensen, S.B.; Rasmussen, H.B.; Mejia, K.; Gonzalez, A. 2006. Identification andevaluation of Peruvian plants used to treat malaria and leishmaniasis. Journal ofEthnopharmacology, 106: 390-402.

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Rezende, C. M.; Correa, V. F. S.; Costa, A. V. M.; Casto, B. C. S.; Alves, R. J. V. 2004.Constituintes Químicos Voláteis das flores e folhas do pau-brasil (Caesalpinia echinata, Lam.).Química Nova, 27(3): 414-416.

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