Estudos Citogenéticos nas Leucemias do Lactente · LMA- M3= Leucemia promielocítica aguda...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUC0 CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE GENTICA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA

Estudos Citogenticos nas Leucemias do Lactente

Terezinha de Jesus Marques Salles

Recife, 2010

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE GENTICA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA

Estudos Citogenticos nas Leucemias do Lactente

Terezinha de Jesus Marques Salles

Tese apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Gentica da Universidade

Federal de Pernambuco, como parte dos

requisitos necessrios para a obteno do

grau de Doutor em Gentica.

Orientadora: Profa Dra Neide Santos

Co-orientadora: Dra Maria Luiza Macedo Silva

Salles, Terezinha de Jesus Marques Estudos citogenticos nas leucemias do lactente/ Terezinha de Jesus Marques Salles. Recife: O Autor, 2010. 126 folhas : il., fig., tab.

Orientadora: Neide Santos. Co-orientadora: Maria Luiza Macedo Silva Tese (doutorado) Universidade Federal de Pernambuco.

Centro de Cincias Biolgicas. Gentica, 2010. Inclui bibliografia e anexos.

1. Citogentica 2. Leucemia em crianas 3. Hospitais

universitrios I. Ttulo. 572.8 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2011-035

v

AGRADECIMENTOS

Aos meus amados filhos, Vivian e Leonardo como estmulo para que eles sempre

tenham fora de vontade para atingir seus objetivos.

A meu querido marido, companheiro que sempre teve muita tolerncia e

compreenso em todas as decises da minha vida.

Aos meus queridos pais por toda educao e discernimento pelo lado correto da

vida.

Este trabalho no poderia ter sido realizado sem a colaborao de diversas

pessoas amigas a quem expresso os meus profundos agradecimentos:

Dra Neide Santos, minha orientadora, pela amizade e maneira gentil com que

aceitou tal incumbncia.

minha co-orientadora Dra. Maria Luiza Macedo Silva que desde o mestrado vem

ajudando na minha formao como citogeneticista, sem sua participao este

trabalho no teria tanto valor.

Ao intercmbio cientfico Brasil-Alemanha. Brasil - Laboratrio de Citogentica

Centro de Transplante de Medula ssea (CEMO), Instituto Nacional de Cancer

(INCA) coordenado pela Dra. Maria Luiza Macedo Silva / CAPES 3017089 e

Alemanha - Molekulare Zytogenetik Institt fr Humangenetik, Universitts

klinikum Jena coordenado pelo Dr. Thomas Liehr / DAAD XXXX9

Ao Dr Thomas Liehr orientador na Alemanha pelo projeto CAPES/ DAAD, pela

reviso dos trabalhos publicados e por todas as anlises realizadas em seu

laboratrio em Jena / Alemanha

vi

querida Eliane pela ajuda nos diagnsticos citogenticos, reviso dos FISH, pela

amizade e carinho durante todo esse tempo que temos trabalhado juntas.

Edinalva e Mariluze, mdicas hematologistas, que dividiram comigo os

diagnsticos, assim como, os sucessos e insucessos no tratamento das crianas

com leucemia.

Dra. Hasmik Mkrtchyan pela orientao na realizao das tcnicas de

citogentica molecular, e pelo incio de uma grande amizade.

Betnia pela ajuda nos exames e na confeco dos grficos da tese.

Elizngela pela amizade e pelos diagnsticos imunofenotpicos.

minha querida irm Olga pela ajuda na confeco da tese.

Dra Tereza Cartaxo, chefe dos laboratorios do CEONHPE, pela amizade e pela

sua dedicaco no desenvolvimento do laboratrio de citogentica desta Instituico.

A todas as mdicas do CEONHPE, Vera, Karina, Raquel, Silvania, Adriana,

Laurice, Leda e Marina que participaram conjuntamente no tratamento das crianas

com leucemia.

Teresa Marquim, Jemima e Amlia, pela ajuda na preparao das tcnicas

citogenticas.

vii

Dedico esta tese a todas as crianas portadoras de leucemia, na

esperana, de que no futuro breve, possamos ver uma mudana na

tragetria desta grave doena.

viii

SUMRIO

AGRADECIMENTOS .................................................................................................. V

LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... IX

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ XIII

LISTA DE QUADROS ...............................................................................................XV

LISTA DE TABELAS ...............................................................................................XVI

RESUMO.................................................................................................................XVII

ABSTRACT ............................................................................................................XVIII

1 INTRODUO .................................................................................................XVIII

2 REVISO DA LITERATURA ................................................................................ 3

2.1 AS LEUCEMIAS AGUDAS NOS LACTENTES ........................................................... 3 2.1.1 Mecanismos Hipotticos da Etiopatogenia das Leucemias Agudas dos Lactentes (LAL) ..................................................................................................... 4 2.1.2 Fisiologia da protena MLL ........................................................................ 8 2.1.3 Patogenia do gene MLL na leucemia do lactente .................................... 12 2.1.4 Mecanismo molecular na leucemia aguda do lactente MLL+ .................. 17

2.2 SNDROME MIELODISPLSICA (SMD) NA INFNCIA ............................................ 19 2.3 DIAGNSTICO DAS LEUCEMIAS NO LACTENTE .................................................... 24

2.3.1 Morfologia ................................................................................................ 25 2.3.2 Imunofenotipagem ................................................................................... 26 2.3.3 Citogentica Convencional ...................................................................... 27 2.3.4 Citogentica Molecular: FISH, M-FISH, MCB, mMCB ............................. 31

3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 38

3.1 OBJETIVOS GERAIS ......................................................................................... 38 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................................ 38

4. MATERIAL E MTODOS ................................................................................ 39

4.1 PACIENTES ..................................................................................................... 39 4.2 MTODOS ...................................................................................................... 39

4.2.1 Amostras ................................................................................................. 39 4.2.2 Citogentica Convencional ...................................................................... 39 4.2.3 Bandeamento G ...................................................................................... 40 4.2.4 Citogentica Molecular ............................................................................ 41

4.2.4.1 Hibridizao in situ Fluorescente (FISH) .......................................................................... 41 4.2.4.2 Multicolor FISH (M-FISH) e multitude multicolor banding (mMCB) ............................... 42 4.2.4.3 Bandeamento multicolorido (MCB)..................................................................................... 43

5. ASPECTOS TICOS ....................................................................................... 44

6. RESULTADOS ................................................................................................. 45

7. DISCUSSO .................................................................................................... 89

8. CONCLUSES .............................................................................................. 106

9. REFERNCIA BIBLIOGRFICA ................................................................... 108

10. ANEXOS ........................................................................................................ 119

ix

LISTA DE ABREVIATURAS

AcMo = anticorpo monoclonal

ALL1 gene (acute lymphoblastic leukemia 1 gene) = Gene da leukemia

linfoblstica aguda

AF6 = Gene do cromossomo 6 humano

AF9 = Gene do cromossomo 9 humano

AF1P = Gene do cromossomo 1 humano

AFX= Gene do cromossomo X humano

LMA-K= Leucemia megacarioblstica aguda

AnaE= Alfa-naftil acetato esterase

AnbE = Alfa-naftil butirato esterase

AREB-T= Anemia refratria em transformao

ASH2L gene (absent, small, or homeotic, Drosophila, homolog-like gene)= gene

ausente, pequeno ou hometico com homologia a Drosfila

BCR (Break Cluster Region) = Regio de pontos de quebra

CALLA = Antgeno comum da leukemia linfoblastica aguda (CD10)

CBP= Protena de ligao CREB

CCK ( Color changing karyotyping) = Caritipo de mudana de cor

CTD= (Cytolethal distending toxin) = Toxina de citoesqueleto distendinda

CEP = Sonda centromrica

COT1-DNAR= DNA bloqueador com um valor cot de 1

del = deleo cromossmica

der = cromossomo derivativo

dic = cromossomo dicntrico

domnio AT = domnio adenina transferase

dominio MT= domnio metil trasferase

x

EBV= Vrus Epstein Barr

FAB = Grupo cooperativo Franco-Americano-Britnico

FISH = Fluorescente in situ Hibrydization = Hibridizao in situ Fluorescente

FYRc e FYRN= Sequncias motivo pouco caracterizadas com regies ricas em fenilalanina/ tirosina, ao redor dos aminoacidos 50 e 100.

Gene EEN = Gene de fuso da leucemia extra onze dezenove

Gene ENL = Gene da leukemia onze dezenove

GBG = Badeamento G

HLA-DR = Antigeno de histocompatibilidade leucocitrio HLA-DR humano HRX gene = Gene humano Trithorax

HOX gene = Gene Homeoboxe

HTLV-1= Vrus humano tipo lymphotrop T Hb-F= Hemoglobina Fetal HDAC = histona deacetilase IgH = Imunoglobulina de cadeia pesada

Inv = inverso cromossmica

ISCN (International System Cytogenetic Nomenclature (Nomenclatura do sistema Internacional)

K-Ras (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)= oncogene homlogo de

sarcoma viral de rato Kirsten) LL= Leucemia do lactente

LAL = Leucemia aguda do lactente

LS = Sndrome Lentigene

LIF (leukemia inhibitory factor) = Fator inibitrio de leucemia

LLA= Leucemia linfoblstica aguda

LLA- Pr B = Leucemia Linfoblstica Pr-B

LMA = Leucemia mieloblstica aguda

xi

LMA-MO= Leucemia mielide aguda sem diferenciao

LMA- M1= Leucemia aguda sem maturao

LMA- M2= Leucemia mielide aguda com maturao

LMA- M3= Leucemia promieloctica aguda

LMA-M3v= Leucemia promielocitica variante

LMA- M4= Leucemia mielomonoctica aguda

LMA-M4 eo= Leucemia mielonocitica aguda eosinoflica.

LMA- M5= Leucemia monoblstica

LMA - M6= Eritroleucemia

LMMJ= Leucemia mielomonoctica juvenil

MAT = Mielopoese anormal transitria

MCB( Multicolor banding)= bandeamento multicolorido

mMCB(Multitude multicolor chromosome banding) = Todos cromossomos com bandeamento multicolorido

M-FISH( Multicolor FISH) = FISH multicolorido

MLL(myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia) = leucemia mista/linfide ou leucemia mista

MO = Medula ssea

MOF gene (mammalian ortholog of the Drosophila gene) - Gene de Drosfila ortologo mamfero)

MPO = Mieloperoxidase NF1= Neurofibromatose 1

OMS= Organizao Mundial Sade

P53 = Protena 53

P300 = Transcrio coactivator PAS (Periodic acid Shiff) cido Peridico de Schiff

PCP= Cromossomo Pintura Parcial

xii

PHD domain= Homedominio de Planta

Protena Rb= Protena do Retinoblastoma

Proteina WDR = protena com motivo triptofano cido asprtico repetido

PTPN11 ( protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 1) = Protena tirosina fosfatase, no receptora tipo 1

RBPB5 (RNA-binding protein splice variant b5) = Protena de quebra variante b5 ligante do RNA)

SBB= Sudan Black B

SC (Stem cells)= Clula Pluripotente

SD= Sndrome de Down

SEPT 2 = Protena septina 2

SEPT 5 = Protena septina 5

SEPT 6= Protena septina 6

SET domain = Domnio SET

SH = Sistema hematopotico

SHP-2(SH2 domain-containing tyrosine phosphatases) = Tirosina fosfatases contendo o domnio SH2

SMD= Sndrome Mielodisplsica

SmIg (Surface membrane imunoglobulin)= Antgeno de membrana de superfcie SMP= Sndrome Mieloproliferativa

SNC= Sistema Nervoso Central

SNL1= Sinal de localizao nuclear 1

SNL2= Sinal de localizao nuclear 2

SN= Sndrome de Nooam

SP= Sangue perifrico

t= translocao

WCP ( Whole chromosomic painting)= Cromossomo todo pintado

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representao esquemtica das regies do gene MLL e regies de quebras e translocaes.............................................................................7

Figura 2 -. Representao esquemtica das funes biolgicas da protena MLL

com os principais stios de transcrio....................................................10 Figura 3 - Adaptada. Modelo esquemtico do complexo MLL na regulao da

transcrio...............................................................................................11

Figura 4 - Metilao e transcrio do gene MLL.....................................................15

Figura 5 - Genes parceiros do gene MLL. ........................................................... 16

Figura 6 - Esquema das mltiplas funes das protenas normais e aberrantes MLL no programa desenvolvimento hematopotico......................................18

Figura 7- Distribuio da frequncia dos parceiros do MLL na infncia.............30

Figura 8 - Marcao da regio 11q23 com a sonda MLL LSI espectro .............. 33

Figura 9 - Metfase e ncleo interfsico com rerranjo do gene MLL.. ................. 34

Figura 10. Combinao de fluorocromos para identificao dos cromossomos no M-FISH.. .............................................................................................. 35

Figura 11- MCB (Bandeamento Multicolorido)..................................................... 36

Figura 12 - Portadores de Leucemia de novo (83 casos) .................................... 45

Figura 13 - Faixa etria dos lactentes com leucemia aguda e SMD .................... 46

Figura 14 - Anormalidades da regio 11q23 na LLA do lactente (N=13) ............. 54

Figura 15 - Bandeamento G no caso 6 (LLA),46,XX,t(4;11)(q21;q23) ................. 54

Figura 16 - Anormalidades citogenticas no relacionadas a regio 11q23 ....... 55

Figura 17- Frequncia das alteraes da regio 11q23 na LLA (n=17). ............. 56

Figura 18 - MCB no caso 31 (LLA) mostrando a trissomia 14 ............................. 58

Figura 19 - Dados citogenticos do caso 35 com LLA. ....................................... 59


Figura 21- Dados citogenticos do caso 45 com LLA ......................................... 61


../../../../../../../Users/Terezinha/Documents/Tese%20doutorado%20final/tese%20%20teca%2007.11.10correes%20pos%20pretese.doc#_Toc277895022

xiv

Figura 23 - Classificao FAB na LMA dos lactentes (N=23) .............................. 63

Figura 24 - Alteraes citogenticas na LMA dos lactentes (n=21). .................... 67

Figura 25 - Caritipo no caso 6(LMA-M4), 46,XY,t(1;11)(p32;q23) ..................... 68

Figura 26- Estudo do rearranjo do gene MLL na LMA do lactente (n=23) ........... 68

Figura 27- Dados citogenticos do caso 17 com LMA-M5. ................................. 70

Figura 28 - Dados citogenticos do caso 18 com LMA-M7. ................................ 71

Figura 29- Dados citogenticos do caso 20 com LMA-M5. ................................. 72

Figura 30- Dados citogenticos do caso 23 com LMA-M4eo. ............................. 73

Figura 31- Dados citogenticos do caso 1 com L bifenotpica............................. 76

Figura 32- Dados citogenticos do caso 2 com L bifenotpica............................. 77

Figura 33- Frequncia do rearranjo do gene MLL nas LAL ................................. 78

Figura 34- Achados citogenticos na SMD do lactente. ...................................... 79

Figura 35- Dados citogenticos do caso 2 com SMD. ......................................... 83

Figura 36- Dados citogenticos do caso 4 com SMD. ......................................... 84

Figura 37- Dados citogenticos do caso 6 com LMA/SMD ................................. 85

Figura 38- Dados citogenticos do caso 8 com LMA/SMD. ................................ 86

Figura 39- Dados citogenticos do caso 9 com LMA-M7 e Neurofibromatose. ... 87

Figura 40 - Dados citogenticos do caso 10 com SMD/LMA............................... 88

xv

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Critrios mnimos para o diagnstico da SMD na infncia .................... 19

Quadro 2. Classificao da Sndrome Mielodisplsica na infncia de acordo com a

OMS ..................................................................................................... 20

Quadro 3. Fluxograma para o diagnstico das leucemias no lactente ................... 24

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Adaptada. Frequncia dos principais parceiros do gene MLL, e do grupo

das diversas protenas geradas. ....................................................... 14

Tabela 2. Diferentes classes de sondas comumente usadas para anlise de FISH em laboratrios clnicos ..................................................................... 32

Tabela 3. Dados Clnicos e Citogenticos Clssico e Molecular dos lactentes com

LLA ...................................................................................................... 48

Tabela 4. Dados Clnicos e Citogenticos Clssico e Molecular dos lactentes com LMA ..................................................................................................... 64

Tabela 5. Dados Clnicos e Citogenticos Clssico e Molecular dos lactentes com leucemia de linhagem ambgua ........................................................... 77

Tabela 6. Dados Clnicos e Citogenticos Clssico e Molecular dos lactentes com SMD .................................................................................................... 83

xvii

RESUMO

A anlise citogentica convencional e molecular nas leucemias do lactente (LL) de fundamental importncia para estabelecer alteraes cromossmicas e que definem grupos e subgrupos de risco. Este estudo caracterizou alteraes cromossmicas em 83 lactentes, oriundos do Centro de Oncohematologia do Hospital Universitrio Oswaldo Cruz e Centro de Transplante de Medula ssea do Instituto Nacional do Cancer (CEMO/INCA) no perodo de julho/2000 a agosto/2010, sendo 73 casos de leucemias agudas (LA) e 10 de sndrome mielodisplsica (SMD). As Leucemias agudas foram classificadas como leucemia linfoblstica aguda (LLA) (47 casos), leucemia mielide aguda (LMA) (23 casos) e leucemias ambguas (3 casos). A idade dos pacientes com leucemia linfoblstica aguda variou de 5 dias a 22 meses, com proporo entre os sexos de 1:1. A idade dos casos de leucemia mielide aguda variou de 2 a 21 meses, sendo 15 masculinos e 7 femininos. Os subtipos morfolgicos foram leucemia mielide com diferenciao (M2), leucemia mielomonoctica (M4), leucemia mielomonoctica eosinoflica (M4eo), leucemia monoblstica (M5) e leucemia megacarioblstica (M7). O bandeamento G (GBG) revelou anormalidades da regio 11q23 em 38% dos casos de leucemia linfoblstica e em 50% dos casos de leucemia mieloblstica. O rearranjo do gene MLL por hibiridizao in situ foi observado em 65% e 39% das leucemias linfoblsticas e leucemia mielide, respectivamente. Nos casos com sndrome mielodisplsicas, a idade variou entre 20 dias a 20 meses, sendo seis do sexo masculino e quatro do feminino. Sete casos foram leucemia mieloblstica em portadores de S.Down, destes seis eram leucemias megacarioblsticas (LMA-K/LMA-M7) e uma leucemia mielide sem diferenciao (LMA-MO). Todas as leucemias megacarioblsticas tiveram caritipos complexos com translocaes envolvendo o cromossomo 1. Os mtodos de Hibridizao in situ (FISH), multicolor FISH (M-FISH) e bandeamento cromossmico multicolorido (MCB), foram essenciais nos casos duvidosos pelo GBG, nos caritipos complexos e nos casos de cromossomos marcadores.

Palavras Chaves: Gene MLL, citogentica molecular, leucemia do lactente.

xviii

ABSTRACT

Cytogenetic and molecular analysis in infant leukemia has extremely importance for establishing chromosomes alterations to defining groups and sub-groups of risk. This study has pointed chromosomes alterations in 83 infants originating from Cytogenetic Laboratory of Pediatric Oncohematology Center of University Hospital Oswaldo Cruz of Pernambuco and Cytogenetic Department of Nacional Center for Bone Marrow Transplant of National Cancer Institute from July/2000 until august/2010. Seventy three cases were acute leukemia (AL) and 10 of them, mielodysplasic syndrome (MDS). The acute leukemias were classified as acute lymphoblastic leukemia (47 cases), acute myeloid leukemia (23 cases) and ambiguous leukemias (3 cases). The acute lymphoblastic leukemia age has varied between 5 days to 22 months with gender proportion of 1:1. The acute myeloide leukemia ages have varied from 2 to 21 months, being 15 males and 7 females. The morphologic subtypes were acute myeloid leukemia without maturation (M2), myelomonocytic leukemia (M4), eosionophilic myelomonocytic leukemia (M4eo), acute monoblastic leukemia (M5) and acute megakaryoblastic leukemia (M7). G-banding has revealed abnormalities 11q23 in 38% of the acute lymphoblastic leukemia and 50% of the acute myeloid cases. The MLL gene rearrangement by in situ hibridization was observed in 65% and 39% of the acute lymphoblastic and acute myeloid leukemia, respectively. The myelodysplastic syndrome age has varied between 20 days to 20 months, being six males and 4 females. Seven cases were acute myeloid leukemia in Down syndrome carriers, being six acute megakaryoblastic leukemia (AMLK) and one undifferentiad acute myeloid (MO). All acute megakaryoblastic leukemia had complex kariotypes with translocation dealing with chromosome 1. The methods in situ hybridization (FISH), Multicolor FISH (M-FISH) and multicolor chromosomic banding (MCB) were essential in the doubtfully cases by G-banding, in complex kariotypes or mark chromosome cases.

Keys words: MLL Gene, molecular cytogenetic, infant leukemia.

Ma Marques-Salles , TJ Estudos Citogenticos na Leucemia do Lactente

1

1 INTRODUO

As leucemias no lactente (LL) so doenas graves da criana menor de dois

anos de idade. Tm ocorrncia em torno de 3% dos casos e caractersticas

especficas que diferem das leucemias em outras faixas etrias. Evidncias

sugerem origem intratero, devido ntima relao entre embriognese e

carcinognese. As LL podem ser leucemias agudas (LAL), leucemia linfide aguda

(LLA), leucemia mielide aguda (LMA), leucemias de linhagem ambgua (leucemias

bifenotpica e bilineal) ou sndrome mielodisplsica (SMD), mielopoese anormal

transitria (MAT), LMA em portadores de sndrome de Down (LMA/SD) e leucemia

mielomonoctica juvenil (LMMJ).

No lactente, a LLA ocorre em 60% dos casos tendo como prottipo o subtipo

pr-B. uma doena agressiva, com hiperleucocitose, visceromegalias e infiltrao

do sistema nervoso central (SNC). Em cerca de 80% dos casos existe o rearranjo

do gene MLL (leucemia mista mielide linfide), sendo as principais anormalidades

a t(4;11) e t(11;19). Estes rearranjos exercem um papel primordial na

leucemognese, pois a protena quimrica produzida atua como fator de

transcrio, estimulando continuamente a hematopoese.

A LMA ocorre em 40% dos lactentes e os subtipos mais freqentes so

leucemias mielomonoctica e monoblstica aguda (LMA-M4 e M5). As

translocaes mais freqentes so: t(9;11), t(6;11), t(10;11). Apesar da alta

frequncia do rearranjo envolvendo o gene MLL, diferentemente da LLA, na LMA o

prognstico no difere das outras faixas etrias. Nos recm-nascidos, h uma

maior ocorrncia da LMA em relao a LLA e a leucemia megacarioblstica aguda,

LMA-K(LMA-M7) que est associada t(1;22) o principal subtipo, cujo


2

prognstico desfavorvel. Entretanto, nos neonatos com SD h uma maior

frequncia do subtipo LMA-K, sem a t(1;22), e a doena cursa com bom

prognstico. Estes pacientes so classificados como SMD pela OMS que pertence

especificamente ao grupo LMA em portadores de SD. Cerca de 20-30% dos

neonatos com SD podem apresentar a mielopoese anormal transitrios (MAT) ou

achados de mielodisplasia antes do surgimento de LMA definitiva. Assim como os

portadores de MAT, os portadores de LMMJ so diagnsticados como SMD e

classificados no grupo de doenas mieloproliferativas/mielodisplsicas (SMD/SMP).

A LMMJ representa 3% das leucemias da infncia, ocorre em torno de 1,2 por

milho entre 0 a 14 anos. Atinge principalmente lactentes e crianas jovens,

menores de 5 anos. A doena indolente com prognstico ruim. Apesar de 80%

dos portadores de LMMJ apresentarem caritipo normal, a monossomia do

cromossomo 7 est frequentemente correlacionada doena.

No Brasil, os estudos citogenticos em lactentes so raros e no se conhece

as principais alteraes cromossmicas. Como a LAL uma doena com alto risco

de recidiva, relacionada ao rearranjo do gene MLL, presente em cerca de 70% dos

casos estudados, os protocolos atuais sugerem realizar estudos citogenticos para

indicao do tratamento incluindo quimioterapia e transplante de medula ssea.

Nas LMA, apesar da presena do rearranjo do gene MLL, decorrente

principalmente da t(9;11), existe boa resposta a poliquimioterapia, sem a

necessidade de transplante de medula ssea. Desta forma, os estudos pelas

tcnicas de citogentica convencional e molecular na LAL so de fundamental

importncia para estabelecer as alteraes cromossmicas, assim como, para

definir grupos e subgrupos de risco que se beneficiem com um tratamento

direcionado, o que de extrema relevncia epidemiolgica.


3

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 As Leucemias Agudas nos Lactentes

As leucemias agudas que acometem os lactentes (LAL) so neoplasias

malignas raras do sistema hematopotico e o primeiro caso clnico foi descrito em

1921 por Smith (apud Pierce, 1959). Em 1936, Goldhamer e Barnney descreveram

o acometimento cutneo na LMA e, em 1951, Bernhard e cols descreveram que os

fatores que causam leucemia poderiam ocorrer intrautero. Zussman et al. (1967)

descreveram um caso de leucemia congnita com anomalias cromossmicas

restrita ao clone leucmico e, revisaram as caractersticas clnicas de 50 outros

lactentes. Naquela poca, a correlao entre leucemias congnitas e sndromes

constitucionais (sndrome de Down, sndrome de Bloom e mais raramente,

sndrome de Patau e de Turner) levou especulao que as anomalias

cromossmicas adquiridas, que levam a transformao maligna, seriam

secundrias a leses decorrentes de instabilidade cromossmica ou leses em

stios frgeis dos cromossomos. Estas alteraes produziriam um clone anormal

oriundo, provavelmente, da leso na hematopoese embrionria (Quesnel e Malkin,

1997).

Em 1986, Pombo-de-Oliveira et al. publicaram um estudo mostrando as

alteraes moleculares na leucemia congnita de gmeos univitelinos. A reviso da

literatura, neste estudo mostrou que a maioria destas leucemias ocorria em

crianas menores de 1 ano. A partir desse perodo, os estudos sobre leucemias do

lactente ganharam grande impulso, principalmente, com a descoberta do gene MLL

no cromossomo 11, banda q23, como o marcador mais importante para este tipo

de leucemia (Ziermin van der Poel, 1991). Nos lactentes, com rearranjo do gene


4

MLL, as leucemias apresentam infidelidade celular podendo ser LLA pr-B, LMA

M4/M5 e L ambguas (Cimino et al.,1998). Nos lactentes, a LLA geralmente tem

comportamento clnico agressivo, cursa com leucometria elevada, visceromegalias

e infiltrao SNC, enquanto as infiltraes em pele, tecidos subcutneos, regio

retro-orbitria e gengiva ocorrem mais frequentemente na LMA (Pui et al.,1995,

Isoyama et al., 2002). A LMA-K ocorre em 10% das LMA da infncia, predomina

nos neonatos e em geral cursa com prognstico reservado, exceo dos

portadores de SD (Ribeiro et al, 1993).

2.1.1 Mecanismos Hipotticos da Etiopatogenia das Leucemias Agudas dos Lactentes (LAL)

As pesquisas realizadas in vitro e in vivo nas LAL so bastante promissoras

no que se refere etiopatogenia da doena, devido s caractersticas biolgicas

das clulas leucmicas e do curto perodo do surgimento das manifestaes

clnicas na doena. Apesar da dificuldade na identificao dos possveis fatores

predisponentes, a baixa idade, nestes casos, indica que mutaes recorrentes,

durante a gravidez ou durante a embriognese esto associadas ao processo

leucmico (Hartley e Sainsbury, 1981; Greaves, 1993). Os estudos moleculares em

gmeos univitelinos e siameses com leucemias agudas, atualmente, confirmam

que a mutao ocorre intratero. Um fato interessante, nestes casos, que apenas

um dos gmeos inicialmente afetado, posteriormente a doena passa para o

segundo gmeo por metstases, via anastomose intraplacentria ou atravs da

circulao materna (Pombo-de-Oliveira et al.,1986; Mahmound, et al.,1995

Greaves, 2003).


5

Apesar de no se saber quais fatores levam a leucemia, existem diversos

estudos elaborados que avaliam os fatores de risco no desenvolvimento da

doena. Uma hiptese muito cogitada que, durante a gestao as mulheres

sofram exposio a substncias inibidoras da topoisomerase II ou, a enzimas com

funes similares destes inibidores. Existem inibidores naturais da topoisomerase II

em frutas, vegetais, gro de soja (substncias flavonides tipo quercetina e a

genistena), chs preto e verde, cacau, vinhos (catechis) e quinolonas (Ross, 1995;

Alexander et al., 2001, Hengstler et al., 2002). A possibilidade de substncias

inibidoras de topoisomerase causarem leucemias advm da semelhana nos

achados citogenticos com a leucemia secundria ao tratamento quimioterpico

(Prieto et al., 1990). Dados da literatura mostram que drogas inibidoras de

topoisomerase produzem leso no cromossomo 11, no mesmo ponto de quebra

das LAL, na regio 11q23 (Hunger, 1998). Outros fatores sugeridos como indutores

de leucemias so: exposio materna a raios-X, agentes qumicos, como os

derivados de petrleo e alguns pesticidas (Lowengart, 1987; Rinski, 1987).

Durante a transformao leucmica, nvel molecular, ocorre ativao de

proto-oncogenes ou a formao do gene de fuso com propriedades de oncogene

(Hogge, 1994). Na maioria das vezes, um oncogene ativado por uma

translocao cromossmica, mas pode tambm resultar de uma mutao pontual,

amplificao e insero viral. Quando h translocao, um proto-oncogene se

fusiona a outro gene celular resultando num produto protico, que pode ser um

fator de transcrio e, assim codificar protenas envolvidas no crescimento e

diferenciao celular. Os genes, como o MLL, tm grande importncia na

leucemognese, pois atuam como Master genes, ou seja, genes regulatrios que


6

esto envolvidos na regulao da hematopoese e controlam a expresso de

diversos genes (Green, 1996).

Nas LAL as anormalidades cromossmicas mais frequentes envolvem o

gene MLL. Este gene est localizado no cromossomo 11q23, tambm conhecido

como gene leucemia linfide 1 (ALL1) ou gene Trithorax(HRX)(Fig.1) (Marschalek,

1997). Este gene codifica uma histona-lisina N-metiltransferase HRX, com

homologia epigentica protena reguladora transcricional Trithorax da Drosophila

melanogaster, um efetor transcricional dos genes HOX. A protena MLL

essencial, tanto no desenvolvimento do embrio, como na regulao dos genes

HOX. Dessa forma, o gene MLL conjuntamente com alguns genes HOX, atuam na

especificao e/ou expanso de clulas hematopoticas progenitoras (Stem Cells)

(Magli et al., 1997; Ernst et al., 2004). Aps a vida embrionria, a protena MLL

necessria para manuteno da transcrio dos genes HOX. Ento, a ligao entre

a protena MLL, a regulao de gene HOX e a hematopoese so de particular

importncia na fisiopatogenia das leucemias (Li et al., 2005).


7

Figura 1-Representao esquemtica das regies do gene MLL e regies de quebras e translocaes. Vrios domnios funcionais so mostrados: AT em gancho; sinais de localizao nuclear, SN1 e SN2; CxxC (MT), motivo rico em cistena homolga metiltransferase DNA eMDB1; PHD1-3 em dedo de zinco; regies CS1 e CS2, TAD, domnio de transativao; SET domnio SET. TRX regies estruturalmente conservadas com a Tritorax da Drosophila Melanogaster (TRX). Vrios ativadores transcrionais esto tambm representados. Fonte: Krivsov e Armstrong 2007.


8

2.1.2 Funes da Protena MLL

O entendimento do funcionamento da protena MLL de importncia

primordial para leucemognese. A MLL uma protena complexa com diversos

domnios funcionais, atua na regulao de genes de transcrio atravs dos seus

domnios AT e MT que se ligam diretamente ao DNA. A regio em gancho AT se

liga nas regies ricas em AT da pequena curvatura do DNA e o domnio MT, a uma

regio rica em cistena (CXXC) (Birke et al., 2002). A regio AT tem funo de

desmetilao e a MT de metilao nas sequncias CpG. A protena MLL atravs de

sua regio RD1 e RD2 tambm atuam como repressora da transcrio, atravs do

recrutamento de complexos HDAC ou protenas do grupo polycomb (Xia et

al.,2003). O domnio em dedo de zinco (PHD), semelhante a outras protenas PHD,

atua na remodelao da cromatina, alm da atividade na regulao transcrional

(Slany, 2005). Por conter motivos de auto associao na regio em dedos de zinco

e na regio do domnio SET (motivo tambm responsvel pela metilao de H3K4)

(fig 1), acredita-se que a protena MLL funciona como um dmero ou um

oligomrico (Rozovskaia et al., 2000). Ao lado destes domnios, esta protena, tem

dois sinais de localizao nuclear, na regio N terminal (SNL1 e SNL2), o qual

determina um padro pontilhado de localizao nuclear (Fig.1) (Daser e Rabbitts,

2004; Krivtsov e Amstrong, 2007).

A protena MLL aps ser completamente formada, ps transcricionalmente

clivada por uma protease, a taspase 1, em dois fragmentos: um fragmento N-

terminal de 320 kDa, com atividade de represso da transcrio, composto pelos

motivos em gancho AT e com suas regies SNL1 e SNL2 (localizao nuclear

salpicado 1 e 2), alm do domnio MT e o em dedo de zinco (MLLH) e num

fragmento C-terminal com 180kD, com forte atividade transcricional que contm o


9

domnio SET e o TAD (MLLC) (Hsieh et al., 2003). H uma interao entre os

domnios FYRN da MLL, localizado na regio terminal N-320, com FYRC e o

domnio SET, localizados na regio C180 (Fig. 2). Desta forma, estes dois

complexos peptdeos MLL (MLLH e MLLC) constroem a estrutura bsica,

necessria para o supercomplexo multiprotena MLL (MLL-MPSC). Os peptdeos

MLL conferem estabilidade e localizao subnuclear de pelo menos 27 protenas

adicionais. Este grande complexo nuclear inclui diversas protenas, com variadas

funes, como as WDR5, RBPB5 e ASH2L (Fig. 3) (Couture et al., 2006; Sterward

et al., 2006).

Estudos mais recentes mostram que a protena MLL tambm se liga ao DNA

atravs de protenas de ligao. Um exemplo a protena de ligao supressora de

tumor, conhecida como menin (codificada pelo gene MEN 1), ambas (MLL e menin)

atuam na regulao da expresso do gene HOX9 (Yokoyama et al., 2005). Alm do

HOX, existem outros genes alvos do gene MLL. Estudos atuais em clulas de

linhagem sugerem, na realidade, que o gene MLL exerce um papel global na

regulao da transcrio (Milne et al., 2005).


10

Figura 2- Representao esquemtica das funes biolgicas da protena MLL com os principais stios de transcrio.Trs stios AT em gancho que se ligam a pequena curvatura do DNA; SNL: 2 sinais salpicados de localizao nuclear; RD: domnios de represso; PHD + bromo envolvido na interao protena-protena; FYRN e o FYRC domnios associados a p300/p320 N-terminal, chamada MLLH e a protena C- terminal chamada de MLLc. Uma vez que a protena MLL clivada pela taspase em duas protenas antes de ir pro ncleo, formam um complexo multiprotena com o TFIID. TAD: domnio de transativao e liga o CBP que pode metilar as histonas H3 e H4 na rea HOX; SET: domnio SET metiltransferase, metilase H3, incluindo histonas na rea HOX para abertura da cromatina e transcrio. Fonte adaptada: Huret JL URL. http://AtlasGeneticsGenes/Oncology.org/mll.htlm

.

http://atlasgeneticsgenes/Oncology.org/mll.htlm


11

Figura 3- Modelo esquemtico do complexo MLL na regulao da transcrio. Uma

sequncia especfica do fator de transcrio se liga ao promotor e recruta o complexo MLL durante a fase de iniciao da transcrio. O domnio SET da MLL metila a lisina 4 da histona H3. Concomitantemente, a lisine 16 da histona H4 acetilada por MOF. Na fase de alongamento, o complexo MLL se acopla com a RNA pol II pela associao como CTD da RNA PoL II com o MLLH, MLLC, e a menin. Alm disso, o componente WDR5 specificamente reconhece e metila a lisina 4 da H3. Desta maneira, o modelo de modificao se espalha ao longo de uma regio de transcrio ativa. Fonte adaptada: Slany, 2005.


12

2.1.3 Patogenia do gene MLL na leucemia do lactente

As translocaes que envolvem o gene MLL levam a uma falha no

repareamento do DNA nas clulas hematopoticas em desenvolvimento

(Richardson e Jasin, 2000). A regio do ponto de quebra (BCR) entre os xons 8 e

13 o alvo para maioria do rearranjos, existindo ao longo desta regio stios de

clivagem para topoisomerase II. Esta uma regio na qual a protena se liga a

matriz nuclear e provavelmente contribui para o mecanismo pelo qual ocorrem as

traslocaes. Desta forma, a desregulao deste processo leva as translocaes

encontradas nas leucemias (Strissel et al., 1998).

Quando um determinado agente mutagnico penetra no organismo rompe a

estrutura do gene MLL entre as regies em dedos de zinco e de metilao,

ocasionando a perda da regio em dedo de zinco, stio de ligao ao DNA,

resultando num segmento truncado. Como os domnios de metilao (MT) e

gancho AT so mantidos, esta regio fica susceptvel a ligaes inespecficas com

alterao na metilao, levando a leucemognese. Por outro lado, a fuso com

genes parceiros resulta na codificao de protenas ricas em serina e prolina. Pelo

menos 52 protenas tm sido descritas, mas apenas algumas so classificadas

dentro de 5 grupos (Tabela 1) (Krivtson et al., 2007). No primeiro grupo esto as

protenas ligantes do DNA que se distribuem no citoplasma, na membrana nuclear,

no retculo endoplasmtico, no golgiossomo e nos ribossomos. Alguns exemplos de

protenas de fuso so AF4 da t(4,11), AF6 da t(6;11), AF9 da t(9;11), ENL da

t(11;19)(Meyer et al., 2009). O segundo grupo formado por protenas

citoplasmticas do tipo coiled coil, tais como: GAS 7, EEN, AF1P, AF6 e AFX (So

and Cleary, 2003; So et al., 2003). O terceiro grupo compreende um pequeno

grupo de protenas que inclui as septinas (SEPT2, SEPT5, SEPT6 9 e 11). As


13

septinas so protenas citoplasmticas que parecem estar envolvidas em diversos

processos como controle de ciclo celular, trfego de vesculas e

compartimentalizao da membrana plasmtica, embora o significado especfico,

ainda permanea desconhecido. No quarto grupo esto as histonas

acetiltransferases p300 e CBP (Rowley et al., 1997; Ida et al., 1997), e ao quinto

grupo pertence a MLL-PTD (duplicao parcial in tandem), que so resultantes da

duplicao interna in tandem de xons especficos (Schichman, 1994).

O achados comuns a todas as fuses do gene MLL, exceo da MLL-PTD,

so reteno do domnio AT em gancho e motivo em dedo de zinco CxxC (ambos

so essenciais para as fuses do gene MLL) assim como, a perda do domnio C-

terminal SET, o qual media a metilao da H3K4. Independente da fuso, o gene

MLL mantm a capacidade de regular positivamente a transcrio dos grupos de

genes HOX A e diversos outros genes. Na LAL, ainda no est esclarecido, qual

dos eventos o mais importante na induo leucmica, se a fuso de genes

produzindo novos transcritos como a formao de protenas quimricas que

contm o motivo em gancho AT ou, se a dimerizao do gene MLL (Cherif. 1992;

Tkachuk, 1992).


14

Tabela 1- Frequncia dos principais parceiros do gene MLL e do grupo das diversas protenas geradas.

Fonte adaptada: Krivtsov et al.,2007

Evidncias atuais sugerem que muitos parceiros de fuso do gene MLL

pertencem a uma rede envolvida na regulao da transcrio, atravs da

remodelao da cromatina e alongamento da transcrio (Slany, 2005). O gene

ELL, um parceiro do gene MLL um fator de alongamento que se associa a RNA

Pol II e a diversas protenas (Simone et al., 2001). Uma protena conhecida como

DOT1L, uma histona metiltransferase que metila o resduo de lisina 79 na histona

H3 (H3K79), medeia a fuso do rearranjo MLL/AF10 (Fig 4) (Okada et al., 2005).


15

Figura 4- Metilao e transcrio do gene MLL, como membro de um complexo

multiprotico, a protena MLL media a metilao de H3K4, nas regies promotoras dos genes ocupadas pela RNA Pol II. Fonte adaptada: Kritsov et al.,2007

Uma funo hipottica das fuses proticas mostrada na figura 4. A

protena MLL sem a regio SET, que tem atividade H3K4 metiltransferase, pode

recrutar a Dotilmetilferase H3K79. As fuses do gene MLL recrutam a protena

Dotil, nos stios que so normalmente ocupados pelos promotores do gene MLL

(como o gene HOXA), o que permite a metilao H3K79 dos Hoxes A, resultando

em expresses aberrantes (Okada et.al, 2005, Couture et al., 2006).

Atualmente, o gene MLL reconhecidamente o gene mais envolvido em

translocaes, mais de 54 genes de fuses foram identificados por clonagem

molecular, pela sequncia genmica do ponto de quebra ou pelo transcrito


16

quimrico (Fig.5) (Huret, 2005). A ocorrncia de duplicao parcial do gene MLL

observada em sangue perifrico e em medula ssea de adultos e lactentes normais

e em fgados fetais, demonstram que devem existir alteraes genticas adicionais

para completa transformao maligna na leucemia do lactente. Mutaes nos

genes codificadores das protenas Ras, p53 ou p16 so encontradas em alguns

casos, mas so inconsistentes. A protena karos que faz ligao com o DNA

necessria para o desenvolvimento linfide normal. Isoformas anormais desta

protena foram identificadas em sete lactentes com LLA com t(4;11) ou t(11;19).

Dessa forma, a ruptura do gene IKAROS hoje em dia considerada uma alterao

adicional na LLA do lactente (Sun, 1999; Felix e Lange, 2006).

Figura 5- Genes parceiros do MLL. Fonte: Atlas Genet Cytogenet Oncol

Haematol. Atualizado em 2009. Huret JL URL. http://AtlasGenetics Oncology.org/Genes/MLL.html


17

2.1.4 Mecanismo molecular na leucemia aguda do lactente MLL+

Provavelmente existem diferentes mecanismos envolvidos na leucemognese

do LAL, devido existncia de diferentes protenas MLL aberrantes e certamente

ocorre alguma conexo entre estes mecanismos (Fig. 6). Uma protena aberrante

resultante de translocaes ou duplicao parcial in tanden ocasiona um programa

gnico aberrante por diversos mecanismos: (1) por dimerizao (ou

oligomerizao), um mecanismo comum na leucemognese de diversas protenas

aberrantes (protenas de fuses parceiras citoplasmticas, MLL-PTD ou

amplificao gnica) (Martin et al., 2003); (2) as aberrantes MPSC-MLL,

recrutadoras de complexos remodeladores de cromatina levam a alteraes na

cromatina produzindo perfis gnicos aberrantes; (3) algumas protenas de fuses

so derivadas da fuso do gene MLL com parceiros citoplasmticos podem agir

como reguladores da transcrio via dimerizao (ex.MLL-EE); (4) alguns parceiros

de fuso podem ligar a molcula sinalizadora para o MPSC-MLL resultando em

extensa alterao do perfil gnico. Desta forma, uma protena MLL aberrante

presumidamente afeta o controle celular normal incluindo transduo de sinal e

ciclo celular e, possivelmente, tem uma ao direta na expresso gnica, a nvel de

cromatina de genes alvos, como nos genes HOX (Li et al., 2005).


18

Figura 6- Esquema das mltiplas funes das protenas normais e aberrantes MLL no programa desenvolvimento hematopotico. A protena normal necessria para manter o perfil gnico durante o programa de desenvolvimento hematopotico normal. A protena aberrante derivada de translocaes, duplicao parcial in tanden ou amplificao leva a expresso gnica e programa de desenvolvimento aberrante, que eventualmente resultar em leucemia. Diferentes mecanismos esto envolvidos na leucemognese por protenas MLL aberrantes e existem conexes entre estes mecanismos. Fonte adaptada: Li-Z-Y et al.,2005.


19

2.2 Sndrome Mielodisplsica (SMD) na Infncia

O termo sndrome mielodisplsica (SMD) refere-se a um grupo de

malignidades com displasia dos precursores hematopoticos que ocasionam

citopenia no sangue perifrico, a despeito da medula normal ou hipercelular. O

diagnstico das SMD se baseia em uma tabela de critrios mnimos (Quadro 1) e

segue a classificao da Organizao Mundial de Sade (OMS) (Quadro 2) que

normalmente usada em pediatria (Hasle et al.,2003).

Quadro 1. Critrios mnimos para o diagnstico da SMD na infncia

Pelo menos dois dos critrios abaixo:

Citopenia sem explicao

Morfologia com displasia de duas linhagens

Anormalidade citogentica clonal adquirida em clulas

hematopoticas

Blastos 5% na medula ssea

Fonte: Hasle et al.,2003


20

Quadro 2. Classificao da SMD (Sndrome Mielodisplsica) na infncia de acordo com a OMS (Organizao Mundial da Sade).

Fonte: Hasle et al.,2003.


21

Na infncia, algumas formas de SMD so iguais as do adulto, como a

anemia refratria (AR) e a anemia refratria com excesso de blastos (AREB-t), mas

algumas, ainda no foram diagnosticadas, como a anemia sideroblstica em anel e

a leucemia mielomonoctica crnica, entidade bem definida com caractersticas

prprias do adulto. Independente do grupo em que esteja definido o diagnstico,

cerca de 1/3 dos pacientes com SMD evoluem para LMA (Hasle et al., 1995; Lopes

e Lorand-Metze,1999).

Uma entidade muito discutida pela difcil classificao morfolgica na

infncia a leucemia mielomonocitica juvenil (LMMJ), que ora se apresenta com

achados de SMD e ora de sndrome mieloproliferativa (SMP). H dificuldades de

diagnstico devido heterogeneidade da doena. Como malignidade rara,

representa menos de 2% das leucemias da infncia e na maioria das vezes ocorre

na infncia precoce (em lactentes) e, principalmente, no sexo masculino. Os

pacientes apresentam episdios de infeces recorrentes, anemia, rash cutneo,

hepatoesplenomegalia e linfoadenomegalia generalizada. Os achados laboratoriais

mostram leucocitose (


22

pacientes com SN apresentam mutao na linhagem germinativa, no proto-

oncogene PTPN11. Este gene codifica a protena fosfatase 2 tirosina (SHP-2) que

exerce importante papel na via de transduo de sinal da hematopoese, liberando

sinais de ativao para receptores de fatores de crescimento ligadora para o gene

Ras. Mutaes dos genes PTPN11, KRAS2, NRAS e NF1 so encontradas em

conjunto nos pacientes com LMMJ. Estes dados apiam a hiptese de que a

hiperativao da via de sinalizao Ras exerce um papel central na LMMJ (Hess et

al., 1996; Kratz et al., 2005). A monossomia do cromossomo 7 a anomalia

citogentica mais encontrada, principalmente, em crianas com desordem mielide

e, desta forma, pode ser identificada em todos os subtipos de SMD, assim como na

LMA, sendo tambm um achado freqente na LMMJ (Kelleher et al., 1991; Yeilipek

et al., 1994).

As crianas portadoras de sindrome de Down (SD) apresentam

frequentemente, na primeira infncia, displasia hematopotica, antes de

apresentarem franca leucemia (Zipursky et al.,1994). Cerca de 10% das crianas

com SD nascem com a mielopoese anormal transitria (MAT) que na maioria dos

casos regride espontaneamente, ao redor dos 3 meses de vida e, raramente

evoluem com quadro fatal de fibrose medular e insuficincia renal (Zipursky et

al.,1994,2003; Zwaan et al., 2010). Estudos citolgicos, imunolgicos,

ultraestrutural e molecular das clulas blsticas dos portadores de MAT mostram

que as clulas precursoras dos megacaricitos apresentam achados comuns dos

progenitores eritride e megacarioctico. Mas, quando a leucemia desenvolve

predominantemente uma proliferao megacarioblstica aguda (Xavier et al.,

2009). Cerca de 30% dos portadores de MAT apresentam leucemia aguda nos


23

quatro primeiros anos de vida e provvel que alteraes adicionais ocorram para

transformao da MAT em LMAK (Taub, 2004).

Atualmente, existe considervel interesse em relatos da mutao somtica

adquirida no xon 2 do gene de transcrio eritride/megacaricito, o GATA-1. A

mutao deste gene em crianas com SD est diretamente relacionada com LMA-

K e MAT, indicando que a primeira doena derivada da segunda (Li et al., 2005;

Emerenciano et al.,2006). Malkin et al. (2000) mostraram que a protena p53

fundamental para diferenciao megacarioctica e que mutao do gene TP53

pode levar ao desenvolvimento de LMA-K em portadores de SD.

Tm sido observadas alteraes cromossmicas nos portadores de SD com

trissomia 21 ou mosaisismo, assim como, nos portadores de MAT (Zubizarreta et

al.,1995). Estas alteraes cromossmicas no diferem das encontradas nos

pacientes com SD e leucemias agudas, o que demonstra que h algo em comum

entre as duas entidades. A principal alteraco cromossmica descrita na SD (+21

constitucional) com SMD/LMA a trissomia 8, a qual parece participar do processo

mieloproliferativo (Zipursky et al., 1994; Creutzig et al., 1996). Outras alteraes

descritas nestes pacientes so duplicaes 1q ou, mais comumente, trissomia

parcial desta regio que pode ter um importante papel na patognese da doena

(Fong e Brodeur 1987; Blann et al., 2000).


24

2.3 Diagnstico das leucemias no lactente

Para um diagnstico preciso das leucemias no lactente necessrio um

algoritmo de exames sequenciados, como mostra o fluxograma no Quadro 3.

Quadro 3. Fluxograma para o diagnstico das leucemias no lactente.

Confeccionada pelo autor, de acordo em Bain, 2001 e Hasle et al.,2003.

LLA: Leucemia linfide aguda de linhagem T ou B

MO: Leucemia mielide aguda sem diferenciao

M1: Leucemia aguda sem maturao

M2: Leucemia mielide aguda com maturao

M3: Leucemia promieloctica aguda e a variante M3v

M4: Leucemia mielomonoctica aguda e a variante M4eo

M5: Leucemia monoblstica

M6: Eritroleucemia

M7: Leucemia megacarioctica aguda

SMD/LMMJ-Sndrome mielodisplsica/Leucemia mielomonoctica Juvenil MAT Mielopoese Anormal Transitria


25

2.3.1 Morfologia

At meados da dcada de 70, os diversos tipos de leucemias eram

classificados pelos seus aspectos morfolgicos, no havia um consenso para

distinguir corretamente as leucemias linfoblsticas e mieloblsticas. Entretanto, em

1976, aps a uniformizao das leucemias agudas pelo grupo Franco-Americano-

Britnico (FAB) e com a introduo das reaes citoqumicas, muitos diagnsticos

foram definidos (Bennett et al, 1976). Mas, o diagnstico da leucemia linfoblstica

continuava sendo feito por excluso, pois os estudos das reaes citoqumicas,

no eram suficientes para diferenciar as leucemias de linhagem mielide.

Atualmente, a classificao FAB continua com importncia no diagnstico,

mas tem valor limitado no prognstico. Na classificao FAB, a LLA apresenta dois

principais subtipos, L1 e L2, que so baseados no tamanho celular, basofilia

citoplasmtica, tamanho do ncleo, padro de cromatina nuclear e presena de

nuclolos. Enquanto na LMA so descritos oito subtipos, de MO-M7, com algumas

variantes, baseadas no tamanho celular, presena ou ausncia de granulaes

citoplasmticas, forma e tamanho do ncleo, padro de cromatina e presena de

nuclolos (Bennett et al.,1976,1991). Nos lactentes, os subtipos mais freqentes

so M4, M5 e M7, h poucos casos descritos de M1 e M2 e raros os casos com

M4eo e M3 (Biondi, 1994; Pui, 1995; Silva et al., 2008).


26

2.3.2 Imunofenotipagem

Com o progresso das tcnicas imunolgicas, surgiu a imunofenotipagem, cujo

princpio utiliza um anticorpo monoclonal dirigido para o antgeno presente na

clula leucmica. Este mtodo revela com preciso a natureza das clulas

blsticas e a fase celular na qual ocorreu a parada do processo de maturao

celular que originou o clone leucmico. Uma das mais importantes contribuies

desta metodologia foi a deteco precoce da mieloperoxidase em clulas com

morfologia indiferenciada, cujas reaes citoqumicas eram negativas. Assim,

muitos casos de leucemias agudas, antes consideradas indiferenciadas, puderam

ser classificados como leucemia mielide com diferenciao mnima (LMA-M0) ou

como leucemias de clulas pluripotentes. A imunofenotipagem tambm permitiu o

diagnstico da leucemia megacarioblstica e dos casos de leucemias com

expresso de marcadores de mais de uma linhagem, conhecida como leucemias

ambguas que so as leucemias bilneas e bifenotpicas (Foon e Todd, 1986;

Bennett et al., 1991).

A citometria de fluxo na LLA permite classificar de linhagem B em pr-B,

CALLA e pr-B (presena da imunoglobulina de superfcie intracitoplasmtica) e a

LLA de linhagem T em pr T, Pr-T e T madura (Jennings e Foon, 1997). Nos

lactentes menores que 12 meses, o subtipo pr- B o mais encontrado, aps esta

faixa etria comeam a surgir os casos de LLA- CALLA. So raros os lactentes

com LLA pr-B, assim como, de linhagem T (Emerenciano et al., 2007). A

incorporao da imunofenotipagem, citogentica e biologia molecular

classificao morfolgica, originou a classificao MIC-M para leucemias agudas,

que agrupa as leucemias com a finalidade de reconhecer entidades especficas


27

que diferem em suas etiologias, mecanismos de leucemognese, achados clnicos

e hematolgicos, prognstico, assim como, a otimizao do tratamento (Bain,

2001).

2.3.3 Citogentica Convencional

Nos anos 70 a introduo de tcnicas de identificao cromossmica foi de

grande importncia para a etiologia clonal das leucemias agudas. Os estudos feitos

nas dcadas de 60 e 70 demonstraram que clulas tumorais apresentavam

marcadores cromossmicos recorrentes com importncia diagnstica e prognstica

(Chaganti et al., 1979). Secker-Walker et al. (1997) foram os primeiros a

demonstrar que o nmero de cromossomos estava relacionado com a evoluo

clnica e o prognstico nas crianas portadoras de LLA.

O estudo citogentico classifica a LLA de acordo com o nmero modal de

cromossomos em cinco grupos. Grupo hiperdiplide, dividido em: hiperdiplide I

(47 a 50 cromossomos) e hiperdiplide II (mais de 50 cromossomos); Grupo

hipodiplide (menor de 46 cromossomos); Grupo com caritipo normal (46

cromossomos sem alteraes estruturais evidentes) e grupo pseudodiplide (46

cromossomos, com alteraes estruturais e/ou numricas) (Raimondi, 1993; Heim

e Mitelman, 1995).

O grupo hiperdiplide I representa de 10 a 15% da LLA da infncia. Neste

grupo o ganho de alguns cromossomos, como +8, +10, +21 e +X so observados,

sendo a trissomia do cromossomo 21, a mais frequente, seguida dos cromossomos

X, 8 e 10. As alteraes estruturais mais frequentemente encontradas, em 6% dos

casos, foram anomalias do 1q, 6q, 12p e 19p (Raimond et al.,1992).


28

O grupo hiperdiplide II se divide em hiperdiploidia com 51 a 68

cromossomos, casos com near-triploidia (69 a 81 cromossomos) e casos com near

tetraploidia (82 a 94 cromossomos). O primeiro subgrupo observado em 25% a

30% das LLA da infncia, e tem como caracterstica um bom prognstico, ou seja,

melhor resposta ao tratamento. A hiperdiploidia encontrada em crianas entre 2 e

10 anos com leucometria no muito elevada, fentipo CALLA (CD10) e tem como

caractersticas comuns cpias extras dos cromossomos 4, 6, 10, 14, 17, 18, 20, 21

e X, duplicao do 1q e isocromossomo 17q, em alguns casos. O ganho isolado do

cromossomo 21 uma anormalidade comum na LLA, ocorrendo em 20% dos

casos com alterao citogentica e mais de 90% dos casos com hiperdiploidia com

mais de 50 cromossomos (Raimondi et al.,1992; Paulsson et al., 2005).

O grupo pseudodiplide ocorre em 40% dos casos, enquanto o grupo com

caritipo normal (sem alterao cromossmica detectvel pela citogentica

convencional) compreende de 10 a 15%. O grupo hipodiplide observado em 7 a

8% das LLA da infncia. Na maioria destes casos, h perda do cromossomo inteiro,

translocaes no balanceadas e formao de cromossomos dicntricos

(Raimondi, 1993).

O estudo citogentico, alm de ajudar no entendimento da fisiopatologia, tem

sido muito importante para estabelecer fatores de risco no tratamento das

leucemias. Enquanto os caritipos com hiperdiplidia II esto associados a um

prognstico favorvel e devem ser tratados apenas com quimioterapia para baixo

risco, os pacientes com caritipos hipodiplide ou com translocaes

cromossmicas como t(1;19), devem ser tratados com quimioterapia para alto risco

e os portadores de t(4;11) e t(9;22), alm de quimioterapia, devem realizar


29

transplante de medula ssea em primeira remisso (Ribeiro e Pui, 1993; Heerema

et al., 1999, Isoyama et al., 2002).

Na LMA, as alteraes cromossmicas especficas podem ser de dois tipos,

rearranjos cromossmicos balanceados, como translocaes e inverses. Estas

alteraes causam fuso de genes que esto envolvidos na regulao e na

diferenciao celular. Os rearranjos cromossmicos no balanceados envolvem

perda ou deleo de genes contribuindo para a transformao maligna por perda

da funo de genes supressores de tumor (Pedersen-Bjergaard e Rowley, 1994).

O estudo citogentico na LAL bastante peculiar, os fatores prognsticos

encontrados em outras leucemias agudas, como t(9;22) e a hiperdiploidia sem

alteraes estruturais, so raros (Lampert et al.,1992). As anormalidades

citogenticas basicamente envolvem a regio 11q23, onde encontrado o gene

MLL. Este gene atua em translocaes com diversos parceiros, atualmente j

foram descritas mais de 54 translocaes (Johansson et al.,1998; Heerema et

al.,1999). As translocaes envolvendo a regio 11q23 ocorrem em 80% das LLA e

em 50% das LMA, sendo as mais frequentes: a t(4;11) na LLA e a t(9;11) na LMA,

enquanto a translocao t(11;19) ocorre em ambos tipos de leucemias.

Praticamente todos os casos de leucemia ambgua apresentam algum tipo de

rearranjo do gene MLL (Fig.7). Alguns casos com caritipo hiperdiplide esto

associados translocao t(1;22), especfica da LMA-M7 do neonato (Carroll et al.,

1991; Lion et al., 1992).

O valor de mau prognstico do rearranjo do gene MLL para maioria dos

subtipos de leucemia do lactente estabelecido. Entretanto, outras anormalidades

da regio 11q23 tais como, deleo e inverso, nas quais o MLL no est

rearranjado, apresentam melhor evoluo clnica, exceo so os casos de LMA-


30

t(9;11), na qual existe o rearranjo do MLL, mas no apresentam impacto negativo

no prognstico (Raimondi et al., 1995; Behm et al., 1996, Secker-Walker, 1998).

Uma translocao especfica e bem estabelecida em lactente com LLA que no

envolve o gene MLL e associada a bom prognstico a t(5;15)(Heerema et

al.,1994; Silva et al.,2001).

Figura 7-- Distribuio da frequncia dos genes parceiros do MLL na infncia. Os principais genes de fuso so: AF4, nas LLA; AF9 na LMA e o ENL em ambas. A fuso do MLL encontrada em praticamente todos os casos de leucemia bifenotpica. Fonte: Krivtsov e Armstrong, 2007.


31

2.3.4 Citogentica Molecular: FISH, M-FISH, MCB, mMCB

Um grande nmero de alteraes cromossmicas humanas tem sido

definidas por tcnicas citogenticas convencionais. Contudo, muitos pacientes

apresentam pequenas delees ou alteraes interstciais que no podem ser

detectadas atravs do bandeamento G. Em adio, cromossomos marcadores ou

alguns rearranjos cromossmicos podem ser difceis, ou mesmo, impossveis de

ser definidos por tcnica convencional. A tcnica de hibridizao in situ

fluorescente (FISH) e suas variantes (caritipo espectral-SKY, FISH-multicolor,

bandeamento multicolorido - MCB) tm ajudado nestes casos e atualmente tem

grande importncia metodolgica na deteco e confirmao de anormalidades

cromossmicas humanas (Schrock et al., 1996; Speicher et al., 1996; Liehr et

al.,2009).

Na tcnica de FISH as sondas so preparadas apartir de nucleotdeos,

fragmentos ou seqncia de DNA especficos, que so ligadas a uma cadeia de

DNA complementar (DNA alvo) no cromossomo a ser estudado. Para localizao

do DNA alvo, aplicado um anticorpo marcado com corante fluorescente. A anlise

feita em microscopia de fluorescncia. Desta forma, a FISH permite a localizao

precisa de genes ou seqncias de DNA diretamente nos cromossomos. Existem

diversos tipos de sondas cromossmicas (tabela 2); a CEP (marca o centrmero do

cromossomo), WCP (sonda de cromossomo inteiro), sonda especfica do telmero

e as que so especficas de determinadas regies ou genes especficos, entre

outras (Liehr e Pellestor, 2009)

A tcnica de FISH pode ser realizada em metfases ou ncleos interfsicos

de material como sangue perifrico, medula ssea, alm de peas tumorais. Essa


32

tcnica tem produzido um considervel impacto na anlise citogentica por permitir

uma anlise rpida de um grande nmero de clulas, ao mesmo tempo em que

favorece o diagnstico de diversas neoplasias. Alm disso, a utilizao de sondas

do cromossomo inteiro e regies especficas tm permitido caracterizar diferentes

rearranjos cromossmicos.

Tabela 2. Diferentes classes de sondas comumente usadas para anlise de

FISH em laboratrios clnicos

Fonte: Liehr e Pellestor, 2009.

Tipo

Intensidade da

Fluorescncia

Aplicao

Sondas para

regies especficas

Sonda Centromrica

Forte Identifica alteraes numricas; monossomias; trissomias.

Sonda Telomrica Moderada a fraca Identifica rearranjos envolvendo o telmero

Sondas para cromossomos inteiros ou de partes dos cromossomos

Sonda WCP e PCP Forte a moderada

Identifica pequenos marcadores ou alteraes quando o bandeamento G for inconclusivo.

Sondas

locus especfica

para translocao e sondas gnicas

Moderada Detecta translocaes em metfases ou ncleos interfsicos

Microdeleo Moderada Detecta microdelees em metfases

Amplificao Gnica Forte Detecta aumento no nmero de copias gnicas em metfases e/ou em ncleos interfsicos


33

No estudo das leucemias, a tcnica de FISH pode ser realizada em clulas

em metfase ou em ncleos interfsicos de sangue perifrico e/ou medula

ssea, contribuindo para preciso no diagnstico cromossmico das diversas

leucemias. Como o rearranjo do gene MLL freqente na LAL, a aplicao

desta tcnica fundamental para o diagnstico e prognstico da doena, (Huret,

2005). A figura 8 mostra as regies onde a sonda hibridizada no cromossomo

11, com sua regio 3 marcada em vermelho e 5 em verde. Qualquer ruptura

desta regio com consequente translocao produzir a separao dos sinais de

fluorocromos verdes e vermelhos como exemplicado na figura 9.

Figura 8. Marcao da regio 11q23 com a sonda MLL LSI espectro veremlho e verde. Fonte: http://www.abbottmolecular.com/ LSIMLLDualColorBreak ApartRearrangementProbe_5318.aspx

http://www.abbottmolecular.com/%20LSIMLLDualColorBreak%20%20Aparthttp://www.abbottmolecular.com/%20LSIMLLDualColorBreak%20%20Apart


34

Figura 9. Metfase e ncleo interfsico com rerranjo do gene MLL. H trs sinais, um que corresponde a fuso dos fluorocromos verde

e vermelho, dando cor amareladado encontrada no gene normal e outros dois, verde e vermelho, separados que corresponde a translocao do referido gene. Fonte: http://www.abbottmolecular/ LSIMLLDualColorBreakAparRearrangmentProbe_5318.aspx

As tcnicas SKY e M-FISH so variantes da tcnica de FISH e permitem

visualizar simultneamente todos os cromossomos humanos, em diferentes cores.

Estas tcnicas tm a finalidade de elucidar a ocorrncia de rearranjos

cromossmicos tais como translocaes, inseres e alteraes estruturais

complexas, facilitando consideravelmente a anlise do caritipo. Em ambas as

tcnicas, as sondas so originadas da marcao e amplificao de cada um dos 24

cromossomos, por DOP-PCR, degenerate oligonucleotide-primed PCR. Esta

tcnica permite a amplificao aleatria do DNA e utiliza sequncias degeneradas

de nucleotdeos. Ambas, SKY e M-FISH usam um esquema combinatrio ligado a

fluorocromos distinguveis espectralmente, mas os mtodos diferem aps a


35

hibridizao in situ, na deteco e discriminao de diferentes combinaes de

fluorescncia (Schrock et al.,1996; Speicher et al.,1996).

Na tcnica de SKY a imagem adquirida na combinao de microscopia

epifluorescente, imagem CCD (charge-coupled device) e um espectofotmetro de

Fourier. Este aparelho mede a emisso inteira de uma nica exposio, em todos

os pontos da imagem. Na tcnica de M-FISH imagens separadas so capturadas

de cada um dos cinco fluorocromos usando filtros de microscpios, estas imagens

so ento, combinadas em um software. Ambas as tcnicas usam pseudocores

para os cromossomos baseados em seus fluorocromos especficos (Speicher et

al.,1996; Trask, 2002). A figura 10 ilustra os fluorocromos usados para obter cores

especficas para os 24 cromossomos.

Figura 10- Fluorocromos usados na identificao dos cromossomos no M-FISH. Uma coluna de 5 cores corresponde aos 5 fluorocromos indicados. A combinao destas cores compe os 24 cromossomos humanos. Fonte: Liehr et al.,2009.


36

Como as tcnicas de M-FISH e a de SKY, outras tcnicas tem sido descritas

com a mesma finalidade, entre outras: o FISH 24 cores, FISH COBRA (FISH de

ligao de taxa de combinao binria), CCK (cariotipagem de mudana de cor).

Apesar de todos esses mtodos permitirem reduzir o tempo de anlise e facilitar a

deteco de rearranjos cromossmicos (translocaes, inseres) e identificao

de cromossomos marcadores, ainda tm sido descritas limitaes quanto a exata

localizao do ponto de quebra das translocaes, assim como identificao de

delees, duplicaes e inverses (Trask, 2002, Liehr et al., 2009).

A tcnica de bandeamento multicolorido (MCB) (Fig.11) foi inicialmente

desenvolvida e testada no cromossomo 5 por Chudoba et al.(1999), posteriormente

est tcnica foi desenvolvida por Liehr et al. (2002) para os 24 cromossomos

humanos.

Figura 11. MCB (Bandeamento Multicolorido). As bandas e sub-bandas so

marcadas com os fluorocromos especficos de cada regio. Facilita a determinao do ponto de quebra em casos de translocaes, delees e inverses dos cromossomos. Fonte: Liehr et al, 2009.


37

A tcnica de MCB foi introduzida com o intuito de determinar a exata

localizao do ponto de quebra nos cromossomos. Esta tcnica pode ser alinhada

com o bandeamento G, mas independente do comprimento do cromossomo

analisado apresentando uma maior resoluo, quando comparado ao

bandeamento G. O MCB permite a diferenciao de reas de regies

cromossmicas em bandas e sub-bandas. Est tcnica permitiu a realizao de

uma biblioteca com 138 regies cromossmicas, atravs da tcnica de

microdisseco ao nvel de 450-550 bandas especficas do genoma humano e,

analisa atravs de um sistema com pseudocores diferentes, nas regies

cromossmicas especficas. Esta metodologia tem sido extremamente til no

esclarecimento dos rearranjos mascarados em caritipos complexos (Liehr et al.,

2009).


38

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivos Gerais

Este trabalho teve como objetivo realizar um estudo do tipo srie de casos

(retrospectivo e prospectivo), para identificar e caracterizar as alteraes

cromossmicas em crianas entre 0- 22 meses com leucemia, nos laboratrio de

Citogentica do Centro de Oncohematologia Peditrica (CEONHPE)/Recife e do

laboratrio do Centro de Tansplante de Medula ssea do Instituto Nacional do

Cancer (CEMO-INCA)/RJ, no perodo de julho 2000 a agosto 2010.

3.2 Objetivos Especficos

1. Definir os achados citogenticos divididos por faixa etria (< de 6 meses, de 6

meses at 12 meses; >12 meses at 22 meses);

2. Relacionar a classificao morfolgica (subtipo FAB) com os achados

citogenticos;

3. Descrever as alteraes cromossmicas constitucionais associadas leucemia

do lactente;

4. Verificar a frequncia do rearranjo do gene MLL nos portadores de LA do

lactente at a idade de 22 meses;

5. Caracterizar molecularmente o rearranjo do gene MLL e quando indicado outros

rearranjos, em ncleos interfsicos atravs do FISH nos pacientes sem

metfases;

6. Caracterizar molecularmente caritipos complexos e alteraes cromossmicas

crpticas atravs do FISH, M-FISH e MCB.


39

4. Material e Mtodos

4.1 Pacientes

Foram estudadas as caractersticas clnicas e citogenticas de 83 crianas

portadoras de leucemia de novo, com idade inferior a 22 meses, que deram

entrada nos laboratrios de citogentica do CEONHPE e do CEMO/INCA-RJ no

perodo de julho 2000 a agosto 2010.

4.2 Mtodos

4.2.1 AAmostras

As amostras de medula ssea (MO) dos pacientes foram colhidas nos

referidos centros de diagnstico e tratamento. Para o diagnstico da doena foi

realizada uma puno diagnstica da medula ssea e 5 lminas para

citomorfologia e reaes de citoqumica. Nesta ocasio foram retirados entre 5 a 10

mL de sangue da medula ssea, em seringas estreis e heparinizadas, que foram

enviadas para os laboratrios de citogentica e de marcadores celulares, dos

respectivos centros. Os estudos citogenticos moleculares pelas tcnicas M-FISH e

MCB, entre outras tcnicas, foram realizados no laboratrio de gentica do Instituto

de Antropologia e Genetica Humana da Universidade de Jena/Alemanha.

4.2.2 Citogentica Convencional

As preparaes cromossmicas foram realizadas a partir de cultura de

medula ssea (MO) e/ou sangue perifrico (SP) utilizando tcnicas de obteno e

identificao cromossmica, de acordo com Testa et al. (1985). As clulas da MO


40

e/ou SP de cada paciente foram cultivadas em meio de cultura composto de RPMI

1640 (SIGMA) e soro bovino fetal (20%) em tubos Falcon. As clulas foram

incubadas durante 24 horas em estufa a 37 C. Aps 22hs foi adicionada colchicina

(SIGMA) na concentrao de 0,05g/mL. No fim da incubao as culturas foram

retiradas e as lminas testes foram confeccionadas. Para anlise cromossmica

convencional as lminas foram coradas com Giemsa a 2% (Merck) diludo em

tampo fosfato (pH 6,8) por 6 minutos, para verificao do ndice mittico e

qualidade das metfases.

4.2.3 Bandeamento G

O bandeamento G foi realizado segundo Seabright (1971), com

modificaes. Os cromossomos foram identificados e classificados de acordo com

o ISCN (2009). A anlise cromossmica foi realizada em microscpia ptica e a

documentao realizada com o sistema de captura de imagens Cytovision da

Applied Imaging. Para cada paciente foram analisadas 20 clulas. Um caso foi

considerado anormal quando mais de trs metfases apresentaram a mesma

alterao cromossmica. A presena de clulas normais, concomitantes com as

clulas anormais, foi usada como parmetro para afastar a possibilidade de uma

alterao cromossmica constitucional. A excluso de alteraes constitucionais foi

realizada nos pacientes com 100% de alteraes cromossmicas no recorrentes

e, naqueles com anomalia dos cromossomos X e Y, atravs da anlise cariotpica

do sangue perifrico, estimulado por fitohemaglutinina.


41

4.2.4 Citogentica Molecular

4.2.4.1 Hibridizao in situ Fluorescente (FISH)

A sonda LSI MLL Dual Color break apart (Abbott Molecular/Vysis) foi usada

na anlise do rearranjo do gene MLL nos lactentes estudados. Os casos com

rearranjos cromossmicos complexos e/ou suspeitos de outras anormalidades,

para confirmao da citogentica clssica, foram estudados tambm com sondas

comerciais para outros genes alvos especficos tais como: LSI BCR/ABL (Abbott

Molecular/Vysis), para a translocao t(9;22); LSI TEL/AML1(Abbott

Molecular/Vysis), para a translocao t(12;21), WCP7(Abbott Molecular/Vysis), de

acordo com a metodologia do fabricante. Foram utilizadas tambm em alguns

casos sondas centromricas e subcentromricas, assim como as tcnicas de M-

FISH, MCB e mMCB (sondas de fabricao prpria cedidas pelo laboratrio de

citogentica molecular do Instituto de Gentica Humana e Antropologia da

Universidade de Jena, Alemanha).

1. Pr-tratamento das lminas as lminas foram preparadas com o

material a ser estudado um dia anterior ao procedimento, em seguida foram

colocadas em uma soluo crescente de etanol 75%, 95% e 100% por 3 minutos

cada. Posteriormente, as lminas foram colocadas em uma soluo 10 mM HCL e

500uL de pepsina (20mg/mL) a 37 C por 5min. Em seguida em PBS1X por 5

minutos, e ento numa fixao com a soluo de formaldedo com cloreto de

magnsio por 10min. Aps este perodo foram lavadas em PBS por 5 minutos e em

seguida novamente desidratadas na srie crescente de etanol, 70%, 90% e 100%

(3 minutos para cada concentrao).


42

2. Desnaturao do DNA Cromossmico e das Sondas a desnaturao foi

realizada simultaneamente numa placa aquecedora a 73 C por 3 minutos e em

seguida as lminas foram colocadas para hibridizao em camara mida a 37C

por 24h para o FISH e MCB e 72h para o M-FISH

3. Lavagem ps-hibridizao - Foi realizada com 1XSSC a 62-65 C por 5

minutos. Em seguida as lminas foram lavadas numa soluo de 0,4x SSC:

IGEPAL a TA (temperatura ambiente) por 5 minutos sob agitao. Em seguida,

foram colocadas no PBS1X por 5 minutos e ento lavadas com gua deonizada.

Aps este perodo as lminas foram desidratas em soluo crescente de etanol,

70%, 90% e 100% (3 minutos cada). Aps a secagem das lminas foi aplicado o

corante DAPI (Vysis).

4. Anlise As anlises citogenticas foram realizadas em microscpio de

fluorescncia Olympus BX 51 e a documentao atravs do sistema da captura de

imagens Cytovision (Applied imaging).

4.2.4.2 FISH multicolorido (M-FISH) e bandeamento multicolorido de todos os cromossomos (mMCB)

Para a realizao do M-FISH e mMCB foram aplicadas 24 sondas de

cromossomos inteiros humanos contendo cinco fluorocromos Rodamina, Vermelho-

Texas, FITC (fluorescein isothiocyanate), DEAC (diethylaminocoumarin), Cyanine

5, fornecendo um padro diverso de pseudocores para cada cromossomo. As

imagens foram capturadas processadas e analisadas utilizando um microscpio de


43

fluorescncia equipado com Sistema de captura digital para FISH e programas

para anlise de imagem, ISIS (MetaSystem) Heidelberg/Alemanha.

4.2.4.3 Bandeamento cromossmico multicolorido (MCB)

Para o MCB foram aplicadas sondas marcadas com cinco fluorocromos

diferentes para regies (bandas) especficas de cada cromossomo, seguindo a

tcnica introduzida por Liehr et al.(2009). Tanto para a tcnica M-FISH como para a

tcnica MCB os procedimentos foram os mesmos usados para a tcnica de FISH

com a diferena que as sondas estavam com marcao indireta e sofreram

procedimentos especficos como descrito a seguir.

As sondas foram diludas em tampo de hibridizao (dextran sulfato) com o

COT1 (Roche, cat no. 158074), sendo 10 mg para o MCB e 25 mg para o M-FISH,

a seguir desnaturadas no termociclador por 5 min a 75 C, posteriormente a 4 C

por 2 minutos e logo a seguir a 37 C por 30 minutos. A desnaturao do material

biolgico foi feita com formamida 70% em uma placa aquecedora 73-74 C por 3

minutos, em seguida colocadas em soluo de etanol 70% a -20 C,

posteriormente a 95% e 100%, 3 minutos cada. Aps as lminas estarem secas

foram aplicadas as sondas e vedadas com uma lamnula com uma cola especfica

para hibridizao, e colocadas em uma cmara mida por 24 horas para as sondas

WCP e MCB e 72 h para o M-FISH e mMCB.

Aps esta etapa, as lminas sofreram lavagens rpidas semelhante ao

FISH, sendo feita outra etapa com uma soluo (Marvel 0,2g e 2 mL do 0,4SSC-

Tween) prpria para lavagens de lminas que foram hibridizadas com sondas

biotinizadas e/ou digoxigenadas. De acordo com a sonda a ser utilizada, foram


44

aplicados anticorpos especficos. Em caso de sondas marcadas com biotina o

anticorpo usado foi a Streptavidina marcada com FITC (1:250) ou Cy5 (1,5:50) e,

para digoxigenina, a antidigoxigenina, marcada com Rodamina ou Fluorescena (1-

8:10). Aps aplicao dos anticorpos, as lminas foram levadas para cmara mida

a 37 C por 40 minutos. A seguir foram lavadas por duas vezes no 4x SSCTw e

uma vez na gua deionizada e ento desidratadas em soluo crescente de etanol

70-95-100%. Em seguida as lminas foram coradas com o DAPI e mantidas a 25

C podendo ser analisadas em at 30 dias. As anlises foram feitas no microscpio

Zeiss, programa Isis MetaSystem, seguindo o ISCN (2009).

5. ASPECTOS TICOS

O projeto foi submetido ao Comit de tica do Hospital Universitrio

Oswaldo Cruz (HUOC/UPE) e do Instituto Nacional do Cncer (INCA/RJ) (Anexo

1). Os pais ou responsveis pelos pacientes foram orientados sobre a proposta de

estudo e foram informados de todos os critrios para a incluso no projeto e

assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).


45

6. RESULTADOS

No perodo de julho de 2000 a agosto de 2010 foram estudados 83 lactentes

(0 - 22 meses), portadores de leucemias de novo. Os diagnsticos foram assim

especificados: 73 pacientes com LAL, sendo 47 LLA, 23 LMA e trs leucemias com

linhagem ambgua. Dez casos foram classificados como SMD, sete como doena

em portadores de SD, seis eram portadores de LMA e um caso de MAT, uma

paciente neurofibromatose foi includa neste grupo. Um paciente foi classificado no

grupo SMP/SMD e um com AREB-t no grupo de SMD (figura 12). Dos 83 lactentes,

24% eram

Ma Marques-Salles , TJ

Estudos Citogenéticos nas Leucemias do Lactente · LMA- M3= Leucemia promielocítica aguda...

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