ESTUDOS DE LIBERAÇÃO, PERMEAÇÃO, ADESÃO E ... · de células de Franz, seguidos da avaliação...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ESTUDOS DE LIBERAÇÃO, PERMEAÇÃO, ADESÃO E ESTABILIDADE DE MEMBRANAS DE GELATINA CONTENDO ÁCIDO ÚSNICO NA FORMA LIPOSSOMAL PARA O TRATAMENTO DE QUEIMADURAS BRUNO DOS SANTOS LIMA SÃO CRISTÓVÃO - SE 2017
Transcript of ESTUDOS DE LIBERAÇÃO, PERMEAÇÃO, ADESÃO E ... · de células de Franz, seguidos da avaliação...
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA
MESTRADO EM CINCIAS FARMACUTICAS
ESTUDOS DE LIBERAO, PERMEAO, ADESO E
ESTABILIDADE DE MEMBRANAS DE GELATINA
CONTENDO CIDO SNICO NA FORMA LIPOSSOMAL
PARA O TRATAMENTO DE QUEIMADURAS
BRUNO DOS SANTOS LIMA
SO CRISTVO - SE
2017
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA
MESTRADO EM CINCIAS FARMACUTICAS
ESTUDOS DE LIBERAO, PERMEAO, ADESO E
ESTABILIDADE DE MEMBRANAS DE GELATINA
CONTENDO CIDO SNICO NA FORMA LIPOSSOMAL
PARA O TRATAMENTO DE QUEIMADURAS
BRUNO DOS SANTOS LIMA
Dissertao apresentada ao Ncleo de Ps-Graduao em Cincias da Farmacuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial obteno do grau de Mestre em Cincias Farmacuticas.
Orientador: Prof. PhD. Adriano Antunes de Souza Arajo
SO CRISTVO - SE
2017
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2017
FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
L732e
Lima, Bruno dos Santos
Estudos de liberao, permeao, adeso e estabilidade de
membranas de gelatina contendo cido snico na forma lipossomal
para o tratamento de queimaduras / Bruno dos santos Lima ;
orientador Adriano Antunes de Souza Arajo. So Cristvo, 2017.
88 f. : il.
Dissertao (mestrado em Cincias Farmacuticas)
Universidade Federal de Sergipe, 2017.
1. Farmcia. 2. Queimaduras. 3. Polmeros. 4. cido snico. I.
Arajo, Adriano Antunes de Souza. II. Ttulo.
CDU 615.12:616.5-001.17
BRUNO DOS SANTOS LIMA
ESTUDOS DE LIBERAO, PERMEAO, ADESO E
ESTABILIDADE DE MEMBRANAS DE GELATINA
CONTENDO CIDO SNICO NA FORMA LIPOSSOMAL
PARA O TRATAMENTO DE QUEIMADURAS
Dissertao apresentada ao Ncleo de Ps-Graduao em Cincias da Farmacuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial obteno do grau de Mestre em Cincias Farmacuticas.
Aprovado em: _____/_____/_____
_________________________________________
Orientador: Prof. PhD. Adriano Antunes de Souza Arajo
_________________________________________
1 Examinador: Prof. Dra. Francilene Amaral da Silva
_________________________________________
2 Examinador: Prof. PhD. Danilo Csar Galindo Bedor
PARECER
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DEDICATRIA
minha me... Tudo aquilo que sou, ou pretendo ser,
devo a um anjo: minha me. (Abraham Lincoln)
AGRADECIMENTOS
Mais um ciclo em minha vida acadmica chega ao fim! Mestrado em cincias
farmacuticas! Obrigado, Deus! Obrigado por todas as bnos e oportunidades!
Agradeo do fundo do corao a minha me, Silvaneide, que nunca mediu esforos
para que essa conquista tornasse realidade. Obrigado por toda dedicao, amor e
carinho! Essa conquista para a senhora! Te amo! Agradeo a minha namorada,
Hoany, por todo amor, apoio e companheirismo durante toda essa etapa. Te amo!
Meus sinceros agradecimentos ao meu orientador, Prof. Adriano Antunes,
pela confiana depositada em mim, pelos ensinamentos transmitidos e por ser um
exemplo de profissional. Agradeo a minha co-orientadora Paula Menezes, por toda
ajuda e disponibilidade em contribuir com meu trabalho em todas as etapas (Do
processo seletivo at a dissertao). s professoras Paula Nunes, Francilene e
Mairim por todas contribuies e avaliaes para com meu trabalho, as quais
levarei para minha vida acadmica!
Agradeo aos meus colegas do LeFT, por toda ajuda e parceria cientfica.
Obrigado Ana Maria, Anny, Bruna, Caio, Clara, Dayanne, Elosa, Gabi, Graa,
Guilherme, Jamily, Igor, Isabella, Isla, Lee, Lvia, Luciana, Marlia, Saran, Vallria,
Tati e Yasmim. Desejo todo sucesso para vocs. turma de mestrado 2016.1 do
PPGCF-UFS pelo apoio e diverso durante as aulas e seminrios da vida. todos
que fazem parte do PPGCF-UFS, principalmente Andr e Cristiani, por sempre me
ajudarem e tirarem minhas dvidas (que no foram poucas).
Por fim, agradeo a todos que direta ou indiretamente contriburam para a
minha formao. todos os colaboradores (universidades, laboratrios,
professores e alunos). CAPES, pelo financiamento, atravs da bolsa de
mestrado. Agora, que venha o doutorado! Vamos em frente, sempre em frente!
RESUMO
Estudos de liberao, permeao, adeso e estabilidade de membranas de gelatina contendo cido snico na forma lipossomal para o tratamento de queimaduras. Bruno dos Santos Lima, 2017.
As queimaduras so leses na pele que geralmente so causadas por acidentes trmicos e o tratamento dessa enfermidade considerado um grande desafio, devido a quantidade de complicaes que podem causar. Dessa forma, necessrio buscar alternativas que otimizem o tratamento das leses causadas por queimaduras, como por exemplo, o uso de membranas bioativas. O cido snico (AU) uma substncia que apresenta potencial para o tratamento de queimaduras. No entanto, esse composto apresenta algumas caractersticas fsico-qumicas desfavorveis, como a baixa solubilidade em gua. Uma das maneiras de estabilizar essa situao atravs da utilizao do AU encapsulado em lipossoma, combinado com uma membrana de gelatina. Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi preparar e caracterizar membranas de gelatina contendo AU incorporado em lipossomas para o tratamento de queimaduras. As membranas foram preparadas de acordo com mtodo de casting e os lipossomas pela tcnica de rotaevaporao do solvente. Aps a obteno, a capacidade de intumescimento das membranas foi avaliada. Um mtodo analtico foi desenvolvido e validado por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), o qual, foi utilizado para determinar o teor e a eficincia de encapsulao do AU nas membranas. Estudos de liberao in vitro, permeao e adeso do AU nas camadas da pele foram realizados atravs de clulas de Franz, seguidos da avaliao da estabilidade e fotoestabilidade da formulao. Macroscopicamente, as membranas de gelatina apresentaram colorao levemente amarelada, superfcie lisa e capacidade de intumescimento em tampo fosfato (pH 7,4) e soro fisiolgico. O mtodo desenvolvido por CLAE, mostrou-se eficaz para identificao e quantificao do AU e todos os parmetros utilizados para a validao apresentaram resultados adequados de acordo com a legislao vigente (RE 899 ANVISA, 2003). O teor de AU nas membranas foi de 172,07 0,27 gcm-2, obtendo eficincia de encapsulao de 93,75%. Os experimentos de liberao in vitro demonstraram que as membranas de gelatina contendo AU na forma lipossomal apresentaram um perfil de liberao controlado, liberando 98,15% (41,37 gcm-2) do AU em 24 horas de anlise. O AU apresenta capacidade de penetrar e permear nas camadas da pele, pois, foi quantificado na epiderme (3,54 0,79 gcm-2) e na derme (13,64 0,17 gcm-2), respectivamente, bem como, possui capacidade de adeso, uma vez que, permaneceram aderidos na pele aps a lavagem da formulao com soluo salina (epiderme: 2,32 0,95 gcm-2; derme: 8,87 0,56 gcm-2). As membranas apresentaram estabilidade variaes trmicas e a exposio luz, pois no demonstraram alteraes nas caractersticas macroscpicas e/ou diminuio significativa do teor do AU. De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir que as membranas de gelatina contendo AU na forma lipossomal uma formulao promissora para o tratamento de queimaduras, pois apresentam capacidade de controlar a liberao do AU e apresentam estabilidade adequada, alm do fato, que o AU apresenta capacidade de penetrar, permear e de aderir-se nas camadas da pele.
Palavras-chave: Queimaduras, biomateriais, gelatina, cido snico, lipossomas.
ABSTRACT
Studies of release, permeation, adhesion and stability of gelatin membranes containing usnic acid incorporated into liposomes for the burns treatment. Bruno dos Santos Lima, 2017.
Burns are injuries in the skin that are usually caused by thermal accidents and the treatment of this disease is considered a great challenge due the amount of complications that are caused. Therefore, is necessary to look for alternatives that optimize the treatment of injuries caused by burns such as the use of bioactive membranes. Usnic acid (UA) is a substance that has potential for the burns treatment. However, this compound presents some unfavorable physical-chemical characteristics, such as low solubility in water. One way to stabilize this situation is through the use of AU encapsulated in liposome and combined with a gelatin membrane. Therefore, the purpose of this work was to prepare and characterize gelatin membranes containing AU incorporated in liposomes to the burns treatment. The membranes were prepared according with the casting method and the liposomes by the solvent rotavaporation technique. After obtaining, the swelling capacity of the membranes was evaluated. The analytical method was developed and validated by high performance liquid chromatography (HPLC), which was used to determine the content and encapsulation efficiency of UA in the membranes. In vitro release studies, permeation and adhesion of UA to skin layers were performed by Franz cells, and after, the stability and photostability of formulation was evaluated. Macroscopically, gelatin membranes showed yellowish color, smooth surface and swelling capacity in phosphate buffer (pH 7.4) and saline solution. The method developed by HPLC was effective to the identification and quantification of UA and all parameters used for validation showed suitable results according with the current legislation (RDC 899 ANVISA, 2003). The UA content in the membranes was 172.07 0.27 gcm-2, obtaining encapsulation efficiency of 93.75%. The in vitro release experiments demonstrated that the gelatin membranes containing UA in liposomes showed a controlled release profile, releasing 98.15% (41.37 gcm-2) of the UA in 24 hours of analysis. The UA has the ability to penetrate and permeate in the skin layers because it was quantified in the epidermis (3.54 0.79 gcm-2) and dermis (13.64 0.17 gcm-2) respectively, as well as, it has adhesion capacity, because it remained adhered to the skin after washing the formulation with saline solution (epidermis: 2.32 0.95 gcm-2; dermis: 8.87 0.56 gcm-2). The membranes showed stability to thermal variations and light exposure, because they didnt show changes in the macroscopic characteristics and /or significant decrease in the UA content. According with the results obtained, we can conclude that gelatin membranes containing AU in liposomes are a promising formulation for the burns treatment, because they have the capacity to release control of UA and showed adequate stability, besides the fact that AU has the ability to penetrate, permeate and adhere in the skin layers.
Keywords: Burns, biomaterials, gelatin, usnic acid, liposomes.
SUMRIO
1. Introduo ........................................................................................................ 16
2. Objetivos .......................................................................................................... 19
2.1. Objetivo geral ............................................................................................. 19
2.2. Objetivos especficos ................................................................................. 19
3. Reviso da Literatura ....................................................................................... 20
3.1. Pele ............................................................................................................ 20
3.2. Queimaduras .............................................................................................. 23
3.3. Cicatrizao ............................................................................................... 26
3.4. Produtos tecnolgicos usados para o tratamento de queimaduras ............ 28
3.5. Biomateriais ............................................................................................... 30
3.6. Gelatina ...................................................................................................... 34
3.7. cido snico ............................................................................................... 35
3.8. Lipossomas ................................................................................................ 38
4. Material e mtodos ........................................................................................... 43
4.1. Material ...................................................................................................... 43
4.2. Preparo das membranas ............................................................................ 43
4.3. Ensaios de intumescimento ....................................................................... 44
4.4. Desenvolvimento e validao do mtodo analtico para a identificao e
quantificao do AU por CLAE.......................................................................... 45
4.4.1. Linearidade .......................................................................................... 45
4.4.2. Limite de deteco e limite de quantificao........................................ 46
4.4.3. Preciso ............................................................................................... 46
4.4.4. Exatido ............................................................................................... 46
4.4.5. Robustez .............................................................................................. 47
4.5. Teor e eficincia de encapsulao do AU nas Memb/AU/Lip..................... 47
4.6. Uniformidade de contedo do AU nas Memb/AU/Lip ................................. 48
4.7. Estudos de liberao in vitro do AU ........................................................... 48
4.8. Absoro transdrmica do AU ................................................................... 49
4.8.1. Preparo da pele ................................................................................... 49
4.8.2. Permeao in vitro do AU nas camadas da pele ................................. 49
4.9. Ensaios de lavabilidade ............................................................................. 50
4.10. Estudo piloto de estabilidade ................................................................... 51
4.11. Estudo piloto de fotoestabilidade ............................................................. 51
4.12. Anlises estatsticas ................................................................................. 51
5. Resultados e discusso.................................................................................... 52
5.1. Obteno das Memb/AU/Lip ...................................................................... 52
5.2. Capacidade de intumescimento das Memb/AU/Lip .................................... 53
5.3. Desenvolvimento e validao do mtodo por CLAE .................................. 55
5.4. Eficincia de encapsulao do AU nas Memb/AU/Lip ............................... 60
5.5. Uniformidade de contedo do AU nas Memb/AU/Lip ................................. 61
5.6. Perfil de liberao in vitro do AU ................................................................ 62
5.7. Estudos de penetrao/permeao in vitro do AU ..................................... 65
5.8. Adeso do AU nas camadas da pele ......................................................... 66
5.9. Estudo piloto de estabilidade das membranas ........................................... 69
5.10. Estudo piloto de fotoestabilidade das membranas ................................... 73
6. Concluso ........................................................................................................ 76
7. Referncias ...................................................................................................... 77
NDICE DE FIGURAS
Figura 1 Representao esquemtica da pele. 21
Figura 2 Representao esquemtica dos tipos de queimaduras na
pele.
25
Figura 3 Estrutura qumica do AU (C18H16O7; massa molar: 344,31
g/mol).
36
Figura 4 A: Estrutura bsica dos lipossomas. B: Representao
esquemtica da incorporao de frmacos hidrofbicos e
hidroflicos nos lipossomas.
39
Figura 5 Classificao dos tipos de lipossomas. 41
Figura 6 Memb/AU/Lip obtida pelo mtodo de casting aps a secagem. 52
Figura 7 Perfil de intumescimento das Memb/AU/Lip em tampo fosfato
(pH 7,4) e soro fisiolgico. Os resultados foram expressos de
acordo com a mdia desvio padro (n= 3) das anlises.
54
Figura 8 A: Cromatograma do AU padro obtido por CLAE (280 nm). B:
Perfil cromatogrfico do AU extrado das membranas obtido
por CLAE (280 nm).
56
Figura 9 Curva de calibrao do AU padro na faixa de concentrao
de 5 100 g.mL-1.
57
Figura 10 Perfil de liberao in vitro do AU nas Memb/AU/Lip e
Memb/AU. Os resultados foram expressos de acordo com a
mdia desvio padro (n= 6) das anlises.
64
Figura 11 Perfil de penetrao e permeao do AU nas camadas da
pele. *** (p < 0,0001). Os resultados foram expressos de
acordo com a mdia desvio padro (n= 6) das anlises.
65
Figura 12 Porcentagem de AU retida nas Memb/AU/Lip e/ou na pele
aps s 4 horas de lavagem. Os resultados foram expressos
de acordo com a mdia desvio padro (n= 6) das anlises.
67
Figura 13 Perfil de adeso do AU nas camadas da pele. *** (p < 0,0001).
Os resultados foram expressos de acordo com a mdia
desvio padro (n= 6) das anlises.
68
Figura 14 Perfil do estudo de estabilidade das membranas sob
refrigerao (5 2 C) durante 120 dias. *** (p < 0,0001). Os
resultados foram expressos de acordo com a mdia desvio
padro (n= 3) das anlises.
70
Figura 15 Perfil do estudo de estabilidade das membranas sob
temperatura ambiente (25 2 C) durante 120 dias. *** (p <
0,0001). Os resultados foram expressos de acordo com a
mdia desvio padro (n= 3) das anlises.
70
Figura 16 Perfil do estudo de estabilidade das membranas
acondicionadas em estufa (45 2 C) durante 120 dias. *** (p
< 0,0001). Os resultados foram expressos de acordo com a
mdia desvio padro (n= 3) das anlises.
71
Figura 17 Perfil do estudo de fotoestabilidade das membranas durante a
exposio luz nos intervalos de tempo de 0 72 horas. ***
(p < 0,0001). Os resultados foram expressos de acordo com a
mdia desvio padro (n= 3) das anlises.
74
NDICE DE TABELAS
Tabela 1 Ensaios de preciso (repetibilidade e preciso intermediria)
da validao do AU.
58
Tabela 2 Teste de recuperao do AU em diferentes concentraes. 59
Tabela 3 Teor (gcm-2) e EE (%) do AU nas Memb/AU/Lip. 60
Tabela 4 Distribuio do AU nas Memb/AU/Lip. 62
Tabela 5 Teor mdio (n= 3) do AU nas fraes das Memb/AU/Lip e
Memb/AU nos intervalos de tempo dos estudos de
estabilidade.
72
Tabela 6 Teor mdio (n= 3) de AU nas fraes das Memb/AU/Lip e
Memb/AU nos intervalos de tempo dos estudos de
fotoestabilidade.
74
LISTA DE NOMENCLATURAS
g: Massa em microgramas;
ANVISA: Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria;
AU: cido snico;
CLAE: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia;
DP: Desvio padro;
DPR: Desvio padro relativo;
EE: Eficincia de encapsulao;
FDA: Food and Drug Administration;
g: Massa em gramas;
GRAS: Generally Regarded As Safe;
LD: limite de deteco;
LQ: limite de quantificao;
LUV: Vesculas unilamelar grande;
Memb/AU/Lip: Membranas de gelatina contendo AU incorporado em lipossomas;
Memb/AU: Membranas de gelatina contendo AU sem lipossomas;
mg: Massa em miligramas;
mL: Volume em mililitros;
MLV: Vesculas multilamelar;
nm: Nanmetro
PTFE: Politetrafluoretileno;
SUV: Vesculas unilamelar pequena;
TR: Tempo de reteno;
UV: Ultravioleta.
16
1. Introduo
As queimaduras so feridas traumticas que so causadas por agentes
trmicos, qumicos, eltricos ou radioativos. Atuam nos tecidos de revestimento do
corpo humano, ocasionando a destruio parcial ou total da pele e seus anexos,
podendo atingir camadas mais profundas, como o tecido celular subcutneo,
msculos e ossos (LIMA JNIOR et al., 2008). No Brasil, a estimativa que
ocorram aproximadamente 1 milho de acidentes com queimaduras por ano, sendo
que 100 mil pacientes procuram atendimento hospitalar e destes, cerca de 2,5 mil
morrem por razo direta ou indireta de suas leses (RICCI et al., 2015).
No geral, a incidncia de queimaduras est reduzindo nos ltimos anos,
devido ao aumento da preveno por parte da populao, tanto em casa e nos
locais de trabalho. Consequentemente, a taxa global de mortalidade de
queimaduras diminuiu em cerca de 30% devido aos avanos no manejo das
queimaduras agudas e novas tcnicas de controle sepse (principal causa de
mortalidade aps esse tipo de leso) (RAFLA; TREDGET, 2011).
Os aspectos sociais e econmicos devem ser levados em considerao para
o tratamento de pacientes acometidos por queimaduras, pois podem apresentar
efeitos negativos, levando a perda da qualidade de vida e diminuio da
produtividade dos pacientes (SEM; PALMIERI; GREENHALGH; 2015). O
tratamento para as leses drmicas causadas por queimaduras abrange processos
que objetivam combater as infeces, o alvio da dor, o tempo para o reparo
cicatricial completo e a qualidade da cicatriz, a qual, pode gerar resultados fsicos
e psicolgicos desagradveis (ONO et al., 2015).
Dentre os procedimentos teraputicos utilizados para o tratamento de
queimaduras, destacam-se o uso de formulaes farmacuticas derivadas da
sulfadiazina de prata (HERMANS, 2007; SERAFINI et al., 2014). Porm,
dependendo da situao, opta-se pelo uso de cirurgias e outras tcnicas, como o
laser teraputico. No entanto, esses processos so minuciosamente longos, de
alto custo e muitas vezes resultam em cicatrizes e danos na pele que devero ser
tratados atravs de novas terapias aps esses procedimentos. Diante disso, a
busca por novas alternativas para o desenvolvimento de formulaes com ao
17
anti-inflamatria, antimicrobiana e cicatrizante, tornou-se crescente entre
pesquisadores em todo o mundo (ONO et al., 2015).
Uma dessas alternativas, o uso de biomateriais, que surgem como uma
ferramenta promissora para o tratamento de leses causadas por queimaduras,
pois apresentam diversas vantagens, tais como: so biodegradveis, apresentam
baixo custo e podem ser utilizados em tecidos biolgicos para avaliar, aumentar ou
substituir tecidos ou exercer uma determinada funo no organismo (ANDRADE;
LIMA; ALBUQUERQUE, 2010; DAS; BAKER, 2016). Dentre os biomateriais,
membranas sintticas de gelatina, demonstram potencial para o tratamento de
queimaduras, pois apresentam propriedades mecnicas adequadas, capacidade
de promover e acelerar a granulao e epitelizao da pele, alm de permitir a
liberao gradual de frmacos em tecidos alvos (DANTAS et al., 2011; NUNES et
al., 2016).
Diante do exposto, existe um crescente interesse em estudos, que avaliam
a incorporao de compostos bioativos (frmacos sintticos ou produtos naturais)
em biomateriais, com nfase para os derivados de polmeros, como a gelatina.
Dentre os produtos naturais, destaca-se o cido snico (AU), um metablito
secundrio extrado do lquen Cladonia substellata Vainio, que apresenta diversas
atividades farmacolgicas descritas na literatura, como por exemplo: atividade anti-
inflamatria (VIJAYAKUMAR et al., 2000), antibacteriana (KARABACAK; TAYA;
KIVAN, 2014; MARTINELLI et al., 2014), antioxidante (RABELO et al., 2012) e
cicatrizante (NUNES et al., 2016).
De acordo com os exemplos citados, pode-se inferir que as atividades
descritas at o presente momento para o AU, tornam esse composto uma matria-
prima promissora para futuras investigaes. Entretanto, o AU possui limitaes
quanto a sua solubilidade e estabilidade, que podem reduzir os seus efeitos
farmacolgicos. No entanto, possvel contornar a baixa solubilidade em gua e
melhorar as caractersticas fsico-qumicas de frmacos, atravs da sua
encapsulao em nanopartculas (CONTRI et al., 2014).
Dentre os sistemas nanoestruturados, podemos destacar os lipossomas, os
quais, so vesculas constitudas de uma ou mais bicamadas fosfolipdicas
18
orientadas em torno de um compartimento aquoso. A sua estrutura semelhante a
membrana celular, em termos de hidrofilicidade e lipofilicidade, sendo assim, so
adequados como carreadores de frmacos e molculas insolveis em gua. Os
lipossomas so capazes de controlar a liberao, reduzir a toxicidade e melhorar a
biodisponibilidade de frmacos, alm de serem biodegradveis, biocompatveis e
no imunognicos. Desse forma, estes nanossistemas so versteis e
comprovadamente atxicos, sendo candidatos seguros para administrao de
produtos farmacuticos (HUANGA et al., 2014; NUNES et al., 2016; PANDEY;
RANI; AGARWAL, 2016).
Estudos anteriores realizados por nosso grupo de pesquisa, demonstraram
o efeito de membranas de colgeno contendo AU incorporados em lipossomas no
tratamento de queimaduras em ratos. As membranas foram caracterizadas e
avaliadas quanto aos efeitos sobre o processo de reparo cicatricial e concluiu-se
que as membranas promoveram a acelerao da cicatrizao da pele (NUNES et
al., 2011). Outros estudos, avaliaram as propriedades mecnicas e fsico-qumicas
de membranas de gelatina contendo AU em lipossomas, utilizando tcnicas de
anlise estrutural, trmica e morfolgica, alm da adio de nanopartculas de prata
para a realizao de ensaios microbiolgicos (MENEZES, 2013; TEIXEIRA, 2016).
Apesar do desenvolvimento das anlises citadas anteriormente, nenhum
estudo relacionado com a quantificao do AU nas membranas de gelatina foi
realizado, bem como, estudos de liberao, permeao e adeso nas camadas
pele e estabilidade das formulaes. Esses testes so de grande importncia, pois
os resultados obtidos dessas anlises, juntamente com os testes de caracterizao
fsico-qumica e ensaios clnicos comprovaro a eficcia da formulao para o
tratamento de queimaduras. De acordo com o que fora apresentado, este trabalho
teve como objetivo preparar e avaliar o teor, perfil de liberao, permeao, adeso
e estabilidade de membranas de gelatina contendo AU incorporados em
lipossomas para o tratamento de queimaduras.
19
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
- Avaliar o teor, liberao, permeao, adeso in vitro nas camadas da pele e a
estabilidade de membranas de gelatina contendo AU na forma lipossomal.
2.2. Objetivos especficos
- Preparar membranas de gelatina contendo AU incorporados em lipossomas;
- Avaliar a capacidade de intumescimento das membranas;
- Desenvolver e validar um mtodo analtico por Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (CLAE) para identificao e quantificao do AU;
- Determinar o teor, eficincia de encapsulao e uniformidade de distribuio do
AU nas membranas;
- Analisar o perfil de liberao in vitro do AU;
- Verificar a permeao cutnea in vitro e adeso do AU nas camadas da pele;
- Avaliar a estabilidade e a fotoestabilidade da formulao.
20
3. Reviso da Literatura
3.1. Pele
A pele desempenha um papel crucial na manuteno da vida atravs da
regulao do equilbrio hdrico e eletroltico. Atua como barreira mecnica
protegendo os componentes internos dos agentes nocivos do meio externo, sendo
responsvel pela regulao trmica do corpo e armazenamento de gordura, alm
de controlar o fluxo sanguneo e as funes sensoriais, tais como: frio, calor, odor,
tato, presso e dor (NAWAZ; BENTLEY, 2011). Quando esta barreira
interrompida devido leses como queimaduras, essas funes no so mais
adequadamente realizadas. Dessa forma, imprescindvel manter sua integridade
de maneira eficaz e em casos de traumas ou leses e restaura-la o mais rpido
possvel (WOLF et al., 2011).
De modo geral, a pele constituda por trs barreiras principais: a epiderme,
a derme e a hipoderme (Figura 1). A epiderme a camada que fica em contato com
o meio exterior, fina e avascular, representando a barreira fisiolgica de proteo.
A derme a camada abaixo da epiderme, caracterizada por ser altamente
vascularizada, alm de contribuir na elasticidade, coeso e termorregulao da
pele. A hipoderme a camada mais profunda da pele e assume funes de
proteo e reserva energtica. Alm disso, a pele apresenta subestruturas anexas
essenciais para a proteo e manuteno da homeostasia, tais como: a glndula
sebcea e sudorpara responsveis pela produo de sebo e sudorese,
respectivamente e os plos e unhas que apresentam funes de proteo
(COUTURAUD, 2009; RHEIN; PEOPLES; WOLF, 2009).
21
Figura 1: Representao esquemtica da pele.
Fonte: Disponvel em: . Acesso em: 22 de novembro de
2016.
Na epiderme ocorre a migrao celular das subcamadas mais internas para
as mais superficiais, em um processo conhecido como queratinizao. Esta
camada forma-se a partir de sua fronteira com a derme, local definido como juno
dermo-epidrmica. A epiderme, de maneira mais especfica, dividida em
diferentes subcamadas, sendo que a primeira denominada como estrato basal,
seguida do estrato espinhoso, estrato granuloso, estrato lcido e por fim, o estrato
crneo (LORENCINI et al., 2014).
O estrato basal, a subcamada mais profunda da epiderme, composta por
clulas-tronco que originaro os queratincitos e melancitos, os quais produzem
queratina e melanina, respectivamente. A queratina uma protena estrutural que
proporciona resistncia pele e melanina, que o pigmento responsvel pela cor
22
da pele e proteo contra a radiao ultravioleta. Alm disso, o estrato basal
tambm constitudo pelas clulas de Langerhans e de Merkel, que possuem papel
importante para a barreira imunolgica da pele e na percepo sensorial. A
atividade germinativa da camada basal muito alta, proporcionando a migrao
dos queratincitos para as camadas superiores. Nessas camadas, os
queratincitos, tornam-se achatados, acumulam queratina, desidratam-se, perdem
os ncleos e morrem, alcanando o estado mximo da diferenciao celular, no
qual so denominados de cornecitos (RHEIN; PEOPLES; WOLF, 2009;
LORENCINI et al., 2014).
Os cornecitos compem o estrato crneo da epiderme, uma subcamada de
clulas queratinizadas mortas que conferem rigidez superfcie da pele e dificultam
a sua permeabilidade, alm de serem a primeira camada exposta frmacos e
produtos cosmticos. O estrato crneo tambm se apresenta como uma barreira
eficiente contra raios ultravioleta, calor, frio, microrganismos, produtos qumicos e
foras mecnicas. A hidratao adequada do estrato crneo de grande
importncia para que ele descame apropriadamente. O fator de
umectao/hidratao natural da pele composto por lactato, aminocidos
formados a partir da quebra de filagrina, cido carboxlico da pirrolidona (PCA),
cido urocnico, sais inorgnicos, acares e uria. Ento, quando os cornecitos
atingem a poro mais externa do estrato crneo, sofrem descamao. Em uma
epiderme saudvel, h um equilbrio entre os processos de proliferao e
descamao o que resulta em um ciclo completo de renovao em um perodo de
28 dias (BARONI et al., 2012, LORENCINI et al., 2014; WICKETT; VISSCHER,
2015).
A derme uma camada espessa de tecido conjuntivo abaixo da epiderme,
vascularizada, enervada e nela esto presentes as glndulas sudorparas e os
folculos pilosos com suas glndulas sebceas. As clulas mais comuns da derme
so os fibroblastos que so responsveis pela sntese de protenas fibrosas como
o colgeno e elastina, que conferem propriedade viscoelstica a essa camada
(RHEIN; PEOPLES; WOLF, 2009). O colgeno a principal protena fibrosa
insolvel encontrada no tecido conjuntivo e na matriz extracelular drmica,
23
fornecendo pele fora e resistncia. A elastina compe as fibras elsticas da pele,
conferindo-lhe elasticidade (POON; KANG; CHIEN, 2015).
A matriz extracelular da derme caracterizada pela presena de
proteoglicanas e glicosaminoglicanas livres, como o cido hialurnico e por
mastcitos, que desempenham papel de proteo contra infeces. A presena de
vasos sanguneos na derme so de extrema importncia, pois garantem o
fornecimento de nutrientes e promovem a distribuio sistmica de frmacos
aplicados topicamente. As terminaes nervosas (nervos sensitivos) presentes na
derme so responsveis pela determinao das propriedades sensoriais da pele.
A derme est dividida em duas camadas: a camada papilar, que est em contato
com a epiderme e formada por tecido conjuntivo frouxo; e a camada reticular, a
qual, constituda por tecido conjuntivo denso no modelado, onde predominam a
presena das fibras colagenosas (RHEIN; PEOPLES; WOLF, 2009; LORENCINI et
al., 2014).
A hipoderme ou tecido subcutneo a camada mais interna da pele, liga-se
a derme atravs de expanses das fibras colgenas e elsticas e constituda
principalmente por clulas de gordura denominadas adipcitos (clulas que
acumulam lipdios, como os triglicerdeos) e por mastcitos. A quantidade de
clulas, de fibras, vascularizao e inervao depende da regio corporal. A
hipoderme desempenha funes importantes para o corpo, como isolamento
trmico e proteo mecnica do organismo as presses e traumatismos externos,
reservatrio de gordura, alm de sustentar e conferir mobilidade as camadas
superiores da pele (COUTURAUD, 2009; RHEIN; PEOPLES; WOLF, 2009;
LORENCINI et al., 2014).
3.2. Queimaduras
Os aspectos socioeconmicos so relevantes no tratamento de pacientes
acometidos por queimaduras, pois os procedimentos teraputicos necessitam de
cobertura imediata para auxiliar na reparao, proteo contra infeces e
restaurao das funes normais da pele. O tratamento de queimaduras sempre
foi um desafio, tanto pela sua gravidade, como pela multiplicidade de complicaes
que normalmente ocorrem. Apesar da existncia de procedimentos mdicos
24
avanados, o tratamento ainda pode ser um grande problema, uma vez que,
durante esses procedimentos pode ocasionar a ativao de uma cascata pr-
inflamatria predispondo o paciente a estados de sepse e falncia mltiplas dos
rgos (ISERI et al., 2008; ANDRADE; LIMA; ALBUQUERQUE, 2010; SEN et al.,
2015).
A queimadura uma leso na pele provocada geralmente pelo calor, mas
tambm pode ser causada pelo frio, eletricidade, produtos qumicos e radiaes. A
pele pode ser destruda parcialmente ou totalmente, atingindo desde os plos, at
msculos e ossos. Em pases ocidentais, os acidentes causados por chama e
escaldadura, principalmente gua quente e leo, so as causas mais comuns. A
queimadura se constitui em uma leso dos tecidos vivos, a qual, varia desde uma
pequena bolha at formas graves e capazes de desencadear respostas sistmicas
proporcionais sua extenso e sua profundidade (ANDRADE; LIMA;
ALBUQUERQUE, 2010; GHANIM; RIZKALLAH; SAID, 2013).
As queimaduras podem gerar leses traumticas graves que levam
deformidades, invalidez e at a morte. Aproximadamente 195 mil mortes so
atribudas diretamente queimaduras em todo o mundo e a maior parte delas
(95%) ocorrem em pases subdesenvolvidos, onde os programas de preveno a
queimaduras ainda so primrios (WANG et al., 2015). Um estudo de reviso sobre
tratamentos de queimaduras em pases de mdia e baixa renda demonstrou que
cerca de 80% dos pases tm a capacidade de oferecer os cuidados iniciais bsicos
para toda a populao. Porm, a minoria destes so capazes de fornecer
tratamentos avanados (GUPTA et al., 2014).
De acordo com a gravidade e profundidade da leso, as queimaduras podem
ser classificadas em primeiro, segundo e terceiro grau (Figura 2). Quando apenas
a epiderme acometida, caracteriza a queimadura de primeiro grau ou superficial,
apresentando eritema, dor intensa e vermelhido. Porm, no h formao de
bolhas e alteraes hemodinmicas, ocorre regenerao completa da pele e no
deixam sequelas. As queimaduras de segundo grau so caracterizadas por serem
leses drmicas com espessura parcial e apresentam flictenas, visando conter a
perda de gua e sais minerais. So divididas em superficiais e profundas
(FERREIRA et al., 2003; NOWAK, 2012).
25
As superficiais so aquelas que envolvem a epiderme e a poro superficial
da derme, sendo que as glndulas sebceas e sudorparas so conservadas. Os
sintomas so semelhantes com os da queimadura de primeiro grau incluindo o
aparecimento de bolhas, aparncia mida da leso e no costumam deixar cicatriz
no local. As profundas so aquelas que afetam quase toda a poro drmica, sendo
semelhantes s de terceiro grau. H o risco de destruio das terminaes
nervosas da pele, porm so menos dolorosas que as superficiais. Nesses tipo de
queimadura comum o surgimento de cicatriz (FERREIRA et al., 2003; NOWAK,
2012).
Por fim, as queimaduras de terceiro grau, as quais, so caracterizadas por
serem as mais profundas, acometem toda a derme e atingem o tecido subcutneo,
causando a destruio total de nervos, folculos pilosos, glndulas sudorparas,
vasos sanguneos e ainda podem alcanar msculos e estruturas sseas. As
leses causadas por esse tipo de queimadura so esbranquiadas, secas,
indolores e levam a deformao da regio afetada, que no se curam sem
procedimentos cirrgicos, necessitando de enxertos (NOWAK, 2012).
Figura 2: Representao esquemtica dos tipos de queimaduras na pele.
Fonte: Disponvel em: Acesso em: 22 de novembro de 2016.
Os tratamentos das queimaduras implicam no somente em cirurgias de
enxertia de pele precoces, mas tambm em controlar e orientar a regenerao
26
cicatricial. Um dos recursos que est sendo utilizado para este fim a utilizao de
lasers de baixa potncia, que uma tcnica de fototerapia que envolve a aplicao
de luz monocromtica e corrente de baixa energia que apresenta capacidade para
induzir a cicatrizao de leses na pele (ANDRADE; LIMA; ALBUQUERQUE,
2010). Todos os procedimentos voltados para o tratamento de queimaduras tem
como objetivo evitar infeces por agentes externos, amenizar a dor e realizar o
reparo cicatricial da leso com eficcia e rapidez. Porm, a cicatriz continua a ser
o maior problema para os centros de queimadura, contribuindo para resultados
fsicos e psicolgicos negativos. Por isso, de grande interesse a busca por novas
formulaes que possam ser usadas como agentes cicatrizantes e antimicrobianos,
que atuem acelerando a dinmica cicatricial, alm de possibilitar um tratamento
eficaz, de maior conforto e breve retorno normalidade da vida do paciente
(BRUNO et al., 2013; GHIEH et al., 2015; GEE KEE et al., 2015).
3.3. Cicatrizao
A cicatrizao de leses cutneas um acontecimento fisiolgico complexo
concebido no s para restaurar a funo mecnica da pele e sua homeostase,
mas tambm para reduzir o risco de infeco e ainda mais complicaes, como
consequncias sistmicas (GAINZA et al., 2015). O reparo cicatricial
caracterizado por uma sequncia de eventos biolgicos que envolvem a
organizao de clulas, sinais qumicos e matriz extracelular em um processo
dinmico, harmnico e identificado pelo tipo de clula predominante (ZAMAN et al.,
2011).
Cicatrizao um processo de restaurao da integridade fsica interna e
externa das estruturas do corpo e compreende complexas interaes entre as
clulas e vrios outros fatores. um processo dinmico e complexo, composto de
trs fases: inflamao, proliferao e remodelao dos tecidos (SENGUPTA et al.,
2015). A fase inflamatria ou exsudativa, inicia-se logo aps a leso e encerra no
quarto ou quinto dia, incluindo as etapas de hemostasia, migrao de leuccitos e
incio da cascata de reparao tecidual, tendo como objetivo remover tecidos
desvitalizados. Em resposta a agentes inflamatrios, ocorre a diminuio do fluxo
sanguneo pela vasoconstrio para preveno de perda sangunea. As plaquetas
27
ativam processos bioqumicos, liberam mediadores da inflamao, fatores de
crescimento e glicoprotenas adesivas que constituem a matriz celular que auxiliam
no recrutamento das clulas inflamatrias no reparo da leso (ANDRADE; LIMA;
ALBUQUERQUE, 2010; ISAAC et al., 2010).
Aps esse procedimento, neutrfilos, moncitos, macrfagos e plaquetas
so atrados para o local da leso para realizar a fagocitose e degradao de
colgeno e elastina. Nesta fase, o macrfago a clula mais importante, pois
estabiliza a ferida e realiza a limpeza da rea lesionada por meio da fagocitose de
bactrias e tecido necrosado, direcionando o desenvolvimento do tecido de
granulao e preparando a rea para a prxima fase da reparao tecidual
(ROCHA JR et al., 2006; ANDRADE; LIMA; ALBUQUERQUE, 2010; ISAAC et al.,
2010).
A segunda fase do processo de cicatrizao a fase proliferativa, que
responsvel pela formao do tecido de granulao e dividida em trs subfases:
reepitelizao, fibroplasia e angiognese. Durante a reepitelizao ocorre a
migrao de queratincitos do leito da ferida e dos anexos epiteliais. A fibroplasia
a proliferao de fibroblastos, os quais produzem elastina, fibronectina,
glicosaminoglicanas e proteases, que so responsveis pelo desbridamento
(remoo de tecidos desvitalizados para preparar o leito da ferida para a cobertura
definitiva) e remodelamento fisiolgico. Os fibroblastos tambm so responsveis
pela produo de colgeno que conferem fora e integridade ao tecido. A ltima
etapa da fase proliferativa a angiognese que consiste na formao de novos
vasos sanguneos que daro suporte formao da nova matriz, sendo essencial
para a nutrio e a oxigenao do novo tecido que est sendo formado
(MANDELBAUM; DISANTIS; MANDELBAUM, 2003; ROCHA JR et al., 2006;
ANDRADE; LIMA; ALBUQUERQUE, 2010; ISAAC et al., 2010).
A ltima fase do processo a de maturao ou remodelao, onde ocorre a
substituio do colgeno tipo 3 pelo tipo 1, absoro de gua e diminuio do
nmero de vasos. a fase mais longa da cicatrizao, podendo durar meses ou
anos. Durante essa fase, o tecido de granulao retrocede, o colgeno depositado
se remodela e uma cicatriz com maior fora de tenso se forma, devido ao
cruzamento de diferentes padres das fibras de colgeno, sendo este o
28
responsvel pela fora e integridade do reparo. Esses elementos extracelulares,
principalmente o colgeno, comprimem de maneira mecnica as paredes recm-
formadas e delicadas dos capilares sanguneos, diminuindo o nmero de
fibroblastos ativos e a formao de novos vasos (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005;
ANDRADE; LIMA; ALBUQUERQUE, 2010; ISAAC et al., 2010; BOATENG et al.,
2015).
Devido complexidade patolgica e fisiolgica do processo de cicatrizao,
a perfeita regenerao dos tecidos difcil de ser alcanada. Portanto, necessrio
a avaliao de novos tratamentos, bem como, o uso de novas estratgias
relacionadas com a incorporao de frmacos sintticos ou produtos naturais em
sistemas versteis, que promovam a acelerao do processo de reparo cicatricial
de maneira eficaz e segura, alm do fato que esses sistemas devem ser eficazes
em todas as fases de cicatrizao, visto que, cada fase apresenta uma
caracterstica.
3.4. Produtos tecnolgicos usados para o tratamento de queimaduras
A sulfadiazina de prata na forma de cremes e/ou pomadas, bem como,
impregnada em gazes considerada o padro ouro para o tratamento de
queimaduras, pois o produto mais utilizado no tratamento no cirrgico dessa
enfermidade, principalmente em casos de 1 grau e 2 grau superficial. No entanto,
os produtos derivados dessa substncia apresentam algumas limitaes, como por
exemplo, so formulaes opacas e no biodegradveis, necessitando de trocas
dirias. Dessa forma, necessrio o desenvolvimento de novas formulaes e
produtos tecnolgicos para o tratamento das leses causadas por queimaduras
(HERMANS, 2007; SERAFINI et al., 2014).
A busca por formulaes que atuem acelerando a dinmica cicatricial e
possibilitando um tratamento eficaz que possam trazer maior conforto e breve
retorno a qualidade da vida do paciente, tem sido cada vez maior. Vrios materiais
como o alginato, quitosana, colgeno, celulose, gelatina e formulaes como os
hidrogis, hidrocolides e pelculas transparentes so recomendadas como
curativos passivos para feridas e queimaduras, devido sua influncia na resposta
29
celular local (WANG et al., 2012; JIN et al., 2013; MOGOSANU; GRUMEZESCU,
2014). Alguns estudos relatam que vrias formulaes, como as citadas acima,
apresentam capacidade de atuar na teraputica da cicatrizao de queimaduras,
exibindo diferentes aes, tais como: angiognese, inflamao, fibroplasia,
epitelizao e formao de colgeno (NUNES et al., 2011; KANOKPANONT et al.,
2012; WANG et al., 2012; DE ALMEIDA et al., 2013).
Devido aos diferentes tipos de queimaduras e suas profundidades, produtos
especficos que atendam s necessidades e fisiologia de cada caso devem ser
utilizados para tratar as consequncias funcionais e estticas das leses. As
crescentes pesquisas nesta rea que tem como o objetivo aperfeioar os produtos
usados como recurso teraputico e o desenvolvimento de novos tratamentos com
princpios naturais e sintticos, esto melhorando o prognstico dos pacientes
queimados (DE MELO COSTA et al., 2015). Algumas patentes de produtos
produzidos a partir de compostos naturais apresentam potencial para o tratamento
de queimaduras, pois so capazes de acelerar o reparo tecidual, diminuir a dor e a
inflamao, aumentar a sntese de fibroblastos e otimizar a regenerao da pele
(SERAFINI et al., 2014; DE MELO COSTA et al., 2015).
Nos ltimos anos, crescente em centros mdicos e grupos de pesquisa o
uso e desenvolvimento de novos produtos que atuem nos tecidos lesados por
queimaduras. Os curativos tm uma grande variedade de formulaes e
componentes, que podem apresentar atividade anti-sptica, biolgica e/ou possuir
prata na sua composio, como por exemplo, o ActicoatTM, que funciona como uma
membrana de polietileno de alta densidade e revestida de prata nanocristalina que
atua revestindo a regio da pele afetada por queimaduras, protegendo da
contaminao bacteriana e favorecendo a cicatrizao (WANG; KRAVCHUK;
KIMBLE, 2010; SERAFINI et al., 2014).
Alguns curativos podem apresentar ao de ocluso na leso, tais como: o
BiobraneTM, que uma membrana de silicone com nylon ligado peptdios do
colgeno drmico, substituto temporrio da pele curto prazo, por ser
semipermevel, flexvel e com boa aderncia; e o TegadermTM, uma membrana
sinttica que proporciona a formao de uma camada protetora no local lesado,
controlando a reduo de perdas proticas e a diminuio da contaminao e
30
proliferao bacteriana (WANG; KRAVCHUK; KIMBLE, 2010; SERAFINI et al.,
2014).
Alm dos produtos citados, podemos destacar o DuoDermeTM, membrana
impermevel que funciona como curativo hidroativo, ou ainda o CollatampFacieTM,
membrana de colgeno tipo I derivada de tendo de Aquiles de bovinos que pode
ser utilizada como um equivalente epidrmico temporrio (MENDES JUNIOR;
VITERBO; ROSA, 2007). Outros produtos tambm so comercializados para o
tratamento das leses causadas por queimaduras, tais como: Aquacel AgTM,
Mepilex AgTM, Actisorb AgTM. Alm desses, existem diversos produtos base de
biomateriais que so utilizados e comercializados para o tratamento de
queimaduras, demonstrando que o mercado de biomaterias est em constante
crescimento e favorvel para a populao, pois so produtos que apresentam
eficcia teraputica (CASSIDY et al., 2005; CARUSO et al., 2006; KHUNDKAR;
MALIC; BURGE, 2010; RIGO et al., 2012; SELCUK et al., 2012).
Alguns estudos desenvolveram membranas produzidas a partir de gelatina,
pectina, colgeno, goma xantana, entre outros componentes. Os resultados obtidos
mostram, que as membranas so geralmente biodegradveis e biocompatveis, e
funcionam como uma matriz filmognica para os princpios ativos que podem atuar
no processo de cicatrizao. Estas membranas tm sido foco de diversas
pesquisas cientficas e da indstria farmacutica, pois so completamente
absorvidos pela pele, formando uma matriz sobre a queimadura que funciona como
uma rede de apoio para a proliferao celular e neoformao da vascularizao.
Assim, eles agem eficientemente em vrias fases do processo de cicatrizao
(AYMAN et al., 2011; JIN et al., 2013; DE MELO COSTA et al., 2015).
3.5. Biomateriais
O tratamento de queimaduras considerado desafiador devido gravidade
dos sintomas que as leses podem causar. Diversos fatores locais e sistmicos
interferem e retardam a cicatrizao e, por isso, a reparao tecidual tem chamado
ateno de pesquisadores em busca de mtodos teraputicos que possam
solucionar ou minimizar as falhas nesse processo (ANDRADE; LIMA;
ALBUQUERQUE, 2010). Os avanos na tecnologia e na compreenso desse tipo
31
de leso impulsionaram o desenvolvimento de diversos curativos e alternativas de
tratamento. Os curativos atualmente disponveis podem ser classificados em
diferentes tipos, com base nos materiais utilizados para a sua fabricao, podendo
incluir: filmes, membranas, sprays, hidrocolides, hidrogis, entre outros
(GENUINO et al., 2014).
A bioengenharia tecidual um campo multidisciplinar que envolve a
aplicao de princpios e mtodos da engenharia e das cincias da sade para
assistir e acelerar a regenerao e o reparo de tecidos defeituosos ou danificados.
A busca por biomateriais disponveis para a medicina regenerativa cada vez maior
e novos materiais tm sido desenvolvidos, alegando vantagens sobre os j
existentes. A escolha do biomaterial vai depender da aplicao pretendida, porm
a maioria deles deve apresentar boa biocompatibilidade e uma microestrutura
porosa apropriada para facilitar a infiltrao celular, proliferao e diferenciao
(NELL et al., 2012).
Na comunidade cientfica de biomateriais e reas relacionadas a engenharia
de tecidos e medicina regenerativa, um biomaterial definido como uma substncia
produzida para adquirir uma forma, que por si s, ou fazendo parte de um sistema
complexo, atravs do controle da interao com os componentes do sistemas vivos,
utilizada para direcionar o curso de qualquer procedimento teraputico ou
diagnstico. Em outras palavras, um biomaterial utilizado para substituir ou
auxiliar a funo do tecido enquanto est em contato com ele, seja interna ou
externamente (CHEN; LIANGA; THOUAS, 2013).
O progresso da cincia dos materiais foi concomitante com o rpido
desenvolvimento de outros campos, como a biologia molecular e a nanotecnologia,
produzindo uma revoluo no uso dos biomateriais, os quais, foram submetidos a
aplicaes em diversas reas da pesquisa. Existe uma gama de biomateriais
disponveis, porm, a sua utilizao com eficcia e segurana ainda um desafio,
pois podem ocasionar reaes adversas no corpo humano. (EKDAHL et al., 2011;
DAS; BAKER, 2016).
Holzapfel e colaboradores (2013), classificaram os biomateriais em trs
tipos: Inertes, bioativos e bioabsorvveis. Os inertes so os biomateriais mais
32
rgidos, no absorvveis, capazes de provocar nenhuma ou mnima reao tecidual
aps sua aplicao. Os bioativos possibilitam a ligao do biomaterial ao tecido do
hospedeiro, melhorando a migrao do material atravs da estimulao do
crescimento de um novo tecido. Os bioabsorvveis so inicialmente incorporados
dentro do tecido e caracterizados como tempo-dependentes, ou seja, so
completamente absorvidos com o tempo (HOLZAPFEL et al., 2013).
Dentre os biomateriais, podemos destacar os polmeros, os quais, podem
ser sintticos ou naturais. Os sintticos so degradados por eroso em massa e
hidrlise de ligaes de ster e o tempo de degradao pode variar de semanas
anos. So exemplos: polietileno, poli(lcool vinlico), polimetilmetacrilato (PMMA),
polidimetilsiloxano, poli(etileno tereftalato), poli(cido gliclico), poli(cido ltico),
poli(xido de etileno), e poli(-caprolactona). Alguns desses polmeros so usados
como materiais de suturas e alguns fixadores ortopdicos de ligamentos e tendes
(MENDES JUNIOR; VITERBO; ROSA, 2007; JIN et al., 2013).
Os polmeros naturais ou biopolmeros so formados na natureza durante o
ciclo de crescimento de todos os organismos. A sntese desses polmeros envolve
enzimas catalisadoras, reaes de crescimento de cadeias ativando monmeros,
que caracterizam processos metablicos complexos dentro de clulas. Dentre
esses, destacam-se: alginato, amido, quitosana, cido hialurnico, colgeno,
gelatina, casena e heparina. Esses polmeros possibilitam o desenvolvimento de
inmeros produtos na engenharia de materiais e de tecidos e na rea mdica, pois
apresentam arquitetura celular que atua como suporte mecnico para construo
de novos tecidos in vitro ou in vivo, assim como, possibilita a incorporao de
substncias ativas em sua estrutura protica. Portanto, devem apresentar
caractersticas fsico-quimicas bem definidas e adequadas para cada fim
individualmente (MENDES JUNIOR; VITERBO; ROSA, 2007; JIN et al., 2013).
Dentre as formulaes derivadas de biomateriais, podemos ressaltar as
membranas bioativas, as quais, se apresentam como preparaes finas, flexveis,
transparentes (permitindo a visualizao do processo de regenerao cutnea),
permeveis ao vapor de gua, oxignio e impermeveis bactrias. So indicadas
para o tratamento de queimaduras, leses ps-operatria e feridas menores
incluindo abrases e laceraes. Os hidrogis e hidrocolides tambm so
33
amplamente utilizados, principalmente para o tratamento clnico de feridas crnicas
e leses causadas por queimaduras e geralmente, so constitudos de alginato e/ou
glicerina (JEANES; BITMEAD, 2015; DAS; BAKER, 2016).
Segundo Jayakumar e colaboradores (2011), um curativo ideal se comporta
como substituto da pele e utilizado para encobrir a leso e ajudar na cicatrizao,
fornecendo um formato estrutural para o tecido subjacente, induzindo a
neoformao vascular, permitindo trocas gasosas, impedindo a proliferao de
microrganismos, controlando o excesso de exsudato, enquanto mantm o ambiente
mido. Alm disso, precisa ser no aderente, facilmente removido e deve
apresentar propriedades antialrgicas, no txicas, bem como, promover a
cicatrizao da leso (JAYAKUMAR et al., 2011).
As prticas teraputicas que utilizam como base materiais de origem natural
tm ganhado destaque devido s diversas caractersticas favorveis ao processo
de reparao cicatricial, bem como biocompatibilidade, biodegradabilidade e
algumas estruturas semelhantes pele humana. A biocompatibilidade a
capacidade de ao de um biomaterial no momento da realizao de uma aplicao
especfica que consiste na preservao de elementos celulares do sangue, no
provocar respostas imunes e no induzir carcinogenicidade ou mutagenicidade.
Alm disso, devem apresentar propriedades biomecnicas capazes de
corresponder s solicitaes dinmicas e estticas que estaro sujeitas
(BOATENG et al., 2015).
Entretanto, devido necessidade de trocas frequentes e fabricao no
nacional de alguns destes produtos, o custo para a utilizao dos mesmos
elevado, tornando-os pouco acessveis populao de baixa renda e
economicamente inviveis para utilizao em larga escala nas Unidades de Terapia
de Queimados (DARGAVILLE et al., 2013; BANYARD et al., 2015). Assim, um dos
grandes desafios das pesquisas na rea de reparao tissular consiste no
desenvolvimento de produtos base de biomateriais que apresentem as
caractersticas adequadas ao tratamento e que sejam produzidos a partir de
matrias-primas de baixo custo e fcil obteno (DANTAS et al., 2011; GHIEH et
al., 2015; NUNES et al., 2016).
34
3.6. Gelatina
Um dos biomateriais amplamente utilizado na engenharia de tecidos a
gelatina, que uma protena obtida por hidrlise do colgeno. A desnaturao a
partir da tripla-hlice do colgeno resulta na formao de polieletrlitos carregados.
Em soluo, estes polieletrlitos podem interagir com molculas de carga oposta
para formar complexos poli-inicos que permitem a adeso de fatores de
crescimento (AHMAD et al., 2012; BOATENG et al., 2015).
Dois tipos de gelatina podem ser produzidos dependendo do tipo de
extrao. A gelatina tipo A, que obtida a partir da pele de porco, por meio de um
pr-tratamento cido, antes do processo de extrao e a tipo B, extrada por meio
de hidrlise bsica, de ossos de origem bovina (PEREZ et al., 2013). importante
ressaltar, que existe uma fonte alternativa para obteno de gelatina: a pele de
peixe. Esse tipo de gelatina apresenta ponto de fuso inferior em relao s
protenas obtidas de mamferos, o que pode representar vantagem farmacotcnica
no que tange aos aspectos sensoriais. Contudo, sua produo limitada, por ser
um procedimento de extrao caro em comparao aos outros e dessa forma
corresponde apenas a cerca de 1% do mercado de produo de gelatina (YOUNG,
2005; BORAN; REGENSTEIN, 2010; BOATENG et al., 2015).
A gelatina apresenta destaque por suas propriedades biocompatveis,
biodegradveis e no txicas. Sua utilizao nas indstrias cosmtica,
farmacutica e alimentcia, garantiu seu reconhecimento como um material
Generally Regarded As Safe (GRAS) pelo Food and Drug Administration (FDA).
Cerca de 350 mil toneladas de gelatina so produzidas por ano, que movimentam
um mercado de 2 bilhes de dlares (BORAN; REGENSTEIN, 2010; ELZOGHBY,
2013; PEREZ et al., 2013; BOATENG et al., 2015).
Alm disso, a gelatina um polmero natural que no apresenta
antigenicidade, reabsorvvel in vivo e devido presena de um grande nmero
de grupos funcionais na cadeia lateral, pode ser facilmente modificada para formar
materiais quimicamente reticulados, sendo que, apresenta propriedades versteis,
como excelente capacidade de formao de pelculas, permite a incorporao de
elementos ativos em sua estrutura, proporciona hemostasia e assim, facilita a
adeso e proliferao celular durante a cicatrizao. No entanto, as fracas
35
propriedades mecnicas tem sido descritas como algumas das desvantagens deste
biomaterial, mas essas limitaes so geralmente minimizadas com a reticulao
ou combinao de outros polmeros ou a adio de agentes plastificantes, como o
propilenoglicol (CURCIO et al., 2010; PEREZ et al., 2013; BOATENG et al., 2015).
Um estudo proposto por Perez e colaboradores (2013) relata a utilizao de
matrizes inteligentes para a engenharia de tecidos com a incorporao de
compostos bioativos em membranas de gelatina, de modo que esses compostos
possam ser liberados para atuar diretamente na pele lesionada (PEREZ et al.,
2013). Adicionalmente, outros autores sugerem que este produto favorece a
proliferao de fibroblastos, promove a cicatrizao e dessa forma pode ser
utilizada como matriz de uma formulao para o tratamento de queimaduras
(CAVALCANTE et al., 2011; NUNES et al., 2016).
3.7. cido snico
Os lquens so seres vivos resultantes da simbiose entre um fungo
(micobionte) e uma alga ou cianobactria (fotobionte). Podem ser encontrados
desde o nvel do mar at as montanhas mais altas e desta forma cada regio
apresenta organismos simbiticos diferentes com componentes especficos
prprios em resposta a sua condio ambiental. Mais de 17 mil espcies e mais de
800 produtos secundrios de lquens so conhecidos (MARTINELLI et al., 2014).
A produo de metablitos secundrios derivados de lquens, denominados
substncias ou cidos liqunicos, tm sido considerada valiosa devido s suas
atividades biolgicas e por isso, fonte de muitos estudos na medicina tradicional.
Dentre eles, o cido snico (AU) (Figura 3), desde o seu primeiro isolamento, em
1844, tornou-se o metablito liqunico mais estudado, pois este composto natural
apresenta grande potencial teraputico (ARAJO et al., 2015; NITHYANAND et al.,
2015).
36
Figura 3: Estrutura qumica do AU (C18H16O7; massa molar: 344,31 g/mol).
Fonte: Adaptado de ARAJO et al., 2015.
O AU exibe propriedades redox-ativas variveis, atuando como um agente
antioxidante e pr-oxidante, de acordo com as diferentes condies do sistema e
do ambiente celular (RABELO et al., 2012). Carvalho e colaboradores
demonstraram que o AU apresenta atividade antiprotozoria contra o Trypanosoma
cruzi, pois esse composto foi eficaz no combate das formas epimastigota e
tripomastigota desse agente etiolgico (DE CARVALHO et al., 2005). A atividade
antiviral do AU contra o poliomavrus e influenza A (H1N1) foi relatada por
Campanella et al. (2002) e Sokolov et al. (2012), respectivamente, confirmando que
essa molcula pode ser utilizada para o tratamento de infeces virais.
O AU apresenta atividade larvicida contra o Aedes aegypti, evitando a
transmisso da dengue, que uma doena viral causada pelo flavivrus, o qual,
transmitido pelo mosquito Aedes aegypti (BOMFIM et al., 2009). Diversos estudos
comprovaram a atividade antitumoral do AU em clulas humanas, tais como MCF-
7 (adenocarcinoma da mama), HeLa (adenocarcinoma do colo do tero) e HCT-
116 (carcinoma do clon) (SONG et al., 2012; BAKOROV et al., 2012;
BRISDELLI et al., 2013). O AU eficaz na proteo contra a radiao ultravioleta
(UV) e em baixas concentraes pode ser utilizado como ativo no preparo de filtros
solares (KOHLHARDT-FLOEHR et al., 2010).
37
A atividade do AU frente Candida orthopsilosis e Candida parapsilosis foi
investigado por Pires e colaboradores (2012). Os resultados apresentados neste
estudo foi o primeiro relato do AU mostrando atividade inibitria e fungicida (in vitro)
(PIRES; LUCARINI; MENDES-GIANNINI, 2012). Vijayakumar e colaboradores
(2000), demonstraram que o AU apresenta atividade anti-inflamatria dose-
dependente, empregando os modelos agudos e crnicos em roedores
(VIJAYAKUMAR et al., 2000).
No que diz respeito atividade antimicrobiana do AU, Karabacak e
colaboradores (2014), desenvolveram um sistema coloidal utilizando baixas
concentraes de AU e comprovaram sua ao contra diversos microrganismos,
tais como Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium e Klebsiella pneumonia
(KARABACAK; TAYA; KIVAN, 2014). Micropartculas polimricas carregadas de
AU revelaram eficcia contra Staphylococcus epidermidis e grande potencial para
a confeco de curativos para tratamento de feridas infectadas (MARTINELLI et al.,
2014).
O potencial do AU como agente cicatrizante de leses drmicas foi descrito
na literatura cientfica, sendo o mecanismo de ao correlacionado com a sua
capacidade para estimular a motilidade celular e como um promotor na
regenerao de tecidos, acelerando a migrao celular (JIN; DONG; HE, 2005).
Bruno e colaboradores (2013) atravs de ensaios in vitro e in vivo, apresentaram
resultados consistentes sobre a baixa citotoxicidade e a alta propriedade
cicatrizante do AU. Outros estudos avaliaram o efeito cicatrizante do AU
incorporado em membranas de colgeno em roedores e do AU incorporado em
membranas de gelatina em porcos e comprovaram que o AU apresenta eficcia
para o tratamento e cicatrizao de leses na pele causadas por queimaduras
(NUNES et al., 2011; NUNES et al., 2016).
Como demonstrado anteriormente, o AU apresenta propriedades
promissoras no tratamento de queimaduras, devido principalmente sua atividade
antimicrobiana, anti-inflamatria e cicatrizante. Contudo, essas atividades
teraputicas tornam-se limitadas, pois esse metablito liqunico possui
caractersticas fsico-qumicas desfavorveis, como baixa solubilidade em gua.
38
Outro problema sua alta hepatotoxicidade, que impede a sua administrao por
via oral, limitando sua aplicao teraputica (FRANCOLINI et al., 2013). Sendo
assim, produtos insolveis e/ou txicos devem ser veiculados atravs de um
sistema de liberao capaz de otimizar a dose teraputica, minimizar a ocorrncia
de efeitos txicos e viabilizar a administrao do composto em uma formulao que
melhore sua solubilidade, como exemplo: os sistemas lipossomais (VENTURINI et
al., 2015; PEREZ et al., 2016).
3.8. Lipossomas
Nanotecnologia uma definio para as tcnicas, materiais e dispositivos
que atuam em escala nanomtrica, ou seja, estruturas que mantm forma e
tamanho situados entre 1 a 999 nanmetros (nm). Representa uma das tecnologias
mais promissoras do sculo XXI e tem sido considerada como a nova revoluo
industrial em diversas reas da pesquisa (PAPAKOSTAS et al., 2011). A tecnologia
em nanoescala tm atrado muita ateno pela expectativa do impacto que
materiais nanoestruturados podem causar na veiculao de novos produtos,
proporcionando uma forma de dosagem de frmacos mais adequada, bem como,
melhorando sua penetrao nas clulas e liberao direta nos tecidos alvos
(FERREIRA; RANGEL, 2009).
Nos ltimos anos, com os avanos das pesquisas cientficas, a
nanotecnologia tem sido bastante empregada no tratamento e preveno de
doenas. Os sistemas nanoestruturados, sejam eles nanopartculas lipdicas,
polimricas ou lipossomas, apresentam benefcios para a incorporao de
frmacos, tais como: protegem as substncias contra agentes externos, aumentam
a estabilidade e a biodisponibilidade de formulaes e apresentam a capacidade
de promover a liberao controlada de frmacos (VENTURINI et al., 2015; PEREZ
et al., 2016).
Os lipossomas so estruturas vesiculares formadas por uma ou mais
bicamadas concntricas de lipdios intermediadas por compartimentos aquosos.
Estes sistemas possuem natureza anfiflica, elevada biocompatibilidade e
biodegradabilidade (Figura 4). Alm disso, podem ter seu tamanho, composio
lipdica/aquosa e propriedades de superfcie facilmente modificadas. Estas
39
caractersticas tornam os lipossomas sistemas altamente versteis, atuando como
nanocarreadores, capazes de transportar frmacos pouco solveis em gua, de
forma a aumentar a biodisponibilidade e propiciar sua administrao (DIMER et al.,
2013).
Figura 4: A: Estrutura bsica dos lipossomas. B: Representao esquemtica da
incorporao de frmacos hidrofbicos e hidroflicos nos lipossomas.
Fonte: Disponvel em: Acesso: 23 de novembro de 2016.
A natureza anfiflica dos lipossomas permitem que eles sejam capazes de
encapsular substncias hidroflicas e/ou lipoflicas simultaneamente, sendo que, as
hidroflicas ficam depositadas no compartimento aquoso e as lipoflicas se inserem
na bicamada lipdica. Os lipossomas so capazes de proteger o frmaco da
degradao e reduzir sua toxicidade. Podem ser produzidos e formulados para
realizar a distribuio especfica do composto no tecido alvo e realizam a liberao
controlada do ativo encapsulado (BOZZUTO; MOLINARI, 2015; PANDEY; RANI;
AGARWAL, 2016).
Os lipossomas so basicamente constitudos por fosfolipdios que podem ser
de origem natural ou sinttica e representam os principais componentes das
40
membranas celulares. A porcentagem molar de fosfolipdios varia de 55 a 100%
dos componentes lipossmicos totais. Os lipdios mais utilizados no preparo de
lipossomas so os que apresentam forma cilndrica, como a fosfatidilcolina,
fosfatidilserina, fosfatidilglicerol e esfingomielina. Esses lipdios tendem a formar
uma bicamada estvel em meio aquoso. Porm, dentre estes, a fosfatidilcolina a
mais empregada em formulaes de lipossomas, pois apresentam grande
estabilidade em casos de variaes de pH ou da concentrao de sal no meio (JING
et al., 2015; PANDEY; RANI; AGARWAL, 2016). O colesterol o componente
principal adicionado nas formulaes de lipossomas para estabilizar a bicamada
lipdica. Alm disso, podem ser utilizados para aumentar a fluidez, elasticidade e
permeabilidade dos lipossomas (MAGARKAR et al., 2014).
A classificao dos lipossomas pode ser determinada com base no tamanho
e no nmero de camadas de fosfolipdios. So classificados em: vesculas
multilamelar (MLV), vesculas unilamelar pequena (SUV) e vesculas unilamelar
grande (LUV) (Figura 5). As MLV, so lipossomas compostos por uma srie de
bicamadas fosfolipdicas concntricas separadas por fase aquosa. So grandes em
tamanho, podendo medir at 5 m. As SUV so constitudas por um compartimento
aquoso fechado por uma nica bicamada lipdica. O tamanho destes lipossomas
variam de 20-100 nm. As LUV tambm so compostas de uma nica bicamada
lipdica que circunda o compartimento aquoso, porm, o tamanho destes
lipossomas so maiores que as SUV, variando de 100-250 nm (AKBARZADEH et
al., 2013; PATTNI et al., 2015; PANDEY; RANI; AGARWAL, 2016).
41
Figura 5: Classificao dos tipos de lipossomas.
Fonte: Adaptado de PANDEY; RANI; AGARWAL, 2016.
Existem vrios mtodos para o preparo de lipossomas, tais como: remoo
de solvente, remoo de detergente, remoo de emulso e injeo de etanol. O
mtodo de preparo influencia as propriedades dos lipossomas, incluindo a sua
forma, tamanho, estabilidade e eficincia de carregamento do frmaco. O mtodo
de remoo de solvente o mtodo mais comum e o primeiro descrito para
produo de lipossomas. Resumidamente, os lipdios so dissolvidos em mistura
de clorofrmio e/ou metanol na concentrao de 10-20 mg.mL-1, dependendo da
solubilidade. O solvente removido pela tcnica de rotaevaporao sob presso
reduzida para produzir uma fina pelcula de lipdios, denominada de filme
fosfolipdico. Este submetido a secagem durante o tempo necessrio, seguida por
hidratao com soluo aquosa (LAOUINI et al., 2012; AKBARZADEH et al., 2013;
BOZZUTO; MOLINARI, 2015).
Alguns estudos j utilizaram o AU encapsulado em lipossomas. Lira e
colaboradores (2009) observaram que o uso do complexo AU/lipossomas pode ser
uma estratgia alternativa para superar a baixa solubilidade do AU em gua e
manter a sua atividade antimicrobiana (LIRA et al., 2009). Nunes e colaboradores
(2011), demonstrou que o AU encapsulado em lipossomas e incorporado em
membranas de colgeno, apresenta atividade cicatrizante, sendo eficaz para o
tratamento de queimaduras (NUNES et al., 2011). Ferraz-Carvalho e colaboradores
42
(2016), avaliaram o efeito o AU/lipossomas contra o Mycobacterium tuberculosis
(agente etiolgico da tuberculose) e demonstraram que o AU incorporado em
lipossomas pode ser utilizado como uma forma de dosagem para melhorar a
atividade antimicobacteriana da rifampicina, que um frmaco de primeira escolha
para o tratamento de infeces causadas pelo M. tuberculosis (FERRAZ-
CARVALHO et al., 2016). De acordo com esses estudos, a incorporao do AU em
sistemas lipossomais melhoram suas propriedades fsico-quimicas e eficcia
farmacolgica.
43
4. Material e mtodos
4.1. Material
Para o preparo das membranas de gelatina foi empregado gelatina em p
(fornecedor NP produtos alimentcios LTDA), propilenoglicol (Proquimios) e cido
actico (Neon). Para o preparo dos lipossomas, utilizou-se o lipdio fosfatidilcolina
(Lipoid GMBH), (+)- cido snico (C18H16O7, pureza 98%, Sigma-Aldrich) e
clorofrmio (Dinmica). Dimetilsulfxido (Sytnh) e tampo fosfato pH 7,4
(Neon) foram utilizados como meios de dissoluo para as membranas. Metanol
(HPLC gradient grade, Sigma-Aldrich) e gua ultrapura (milli-q system, millipore)
foram utilizados como fase mvel para os procedimentos analticos.
4.2. Preparo das membranas
As membranas de gelatina contendo AU incorporado em lipossomas
(Memb/AU/Lip) foram preparadas de acordo com o mtodo descrito por NUNES e
colaboradores (2016). Inicialmente, preparou-se a soluo de gelatina, contendo
1 g de gelatina em p, 60 mL de cido actico (0,5 mol/L) e 0,2 g de propilenoglicol
(agente plastificante). Essa soluo foi submetida agitao magntica durante 24
horas.
Os lipossomas foram preparados dissolvendo 250 mg de fosfatidilcolina e 10
mg de AU em 20 mL de clorofrmio. Essa soluo foi sonicada em banho de
ultrassom por 10 minutos e aps esse procedimento, o solvente orgnico foi
evaporado pela tcnica de rotaevaporao sob temperatura de 40 C. Aps a
evaporao do solvente, formou-se um filme fosfolipdico no fundo do balo, o qual,
foi ressuspenso com 40 mL de gua ultrapura e em seguida foi submetido a banho
de ultrassom por 30 minutos, formando uma disperso de lipossomas em meio
aquoso. Aps 24 horas de agitao da soluo de gelatina, verteu-se a soluo dos
lipossomas, mantendo-se sob agitao magntica por mais 24 horas.
As Memb/AU/Lip foram obtidas utilizando o mtodo de casting (NUNES et
al., 2016). Nesse mtodo as disperses aquosas de polmeros so vertidas em
suportes adequados, tais como: superfcies de polietileno ou placas de petri. Dessa
forma, aps s 24 horas de agitao, verteu-se a soluo das membranas em
44
placas de petri de 14 cm de dimetro, as quais, foram depositadas em capela para
a secagem temperatura ambiente.
Membranas de gelatina contendo AU sem lipossomas (Memb/AU) foram
preparadas utilizando a mesma metodologia, com exceo do uso da
fosfatidilcolina para a formao do filme fosfolipdico. Nessa formulao, o AU foi
dissolvido no clorofrmio e adicionado diretamente na soluo de gelatina. Essas
membranas sem lipossomas, ou seja, contendo o AU livre, foram utilizadas como
formulao controle de alguns experimentos, para fins de comparao de
resultados.
4.3. Ensaios de intumescimento
A capacidade de intumescimento das membranas foi avaliada pela tcnica
de imerso (HASANI-SADRABADI et al., 2011). As Memb/AU/Lip foram
fracionadas em rea de 25 cm2 e divididas em dois grupos (A e B). O grupo A foram
imersas em 100 mL de tampo fosfato (pH 7,4) e o B em 100 mL de soro fisiolgico.
As anlises foram determinadas com os meios de imerso temperatura de 37
2 C. Para determinar o grau de intumescimento, as amostras foram inicialmente
pesadas e imersas em recipientes contendo os meios, em diferentes intervalos de
tempo: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas. Aps cada tempo, as
amostras foram removidas do meio, colocadas em papel filtro para retirar o excesso
de lquido e pesadas novamente. As anlises foram realizadas em triplicata (n= 3)
e a quantidade de lquido adsorvido pelas Memb/AU/Lip foi determinada pela
equao 1.
. (1): = ( )
100
onde, Pu (peso mido) o peso da amostra aps o tempo de imerso no meio e
Ps (peso seco) o peso inicial da amostra.
45
4.4. Desenvolvimento e validao do mtodo analtico para a identificao e
quantificao do AU por CLAE
Para as anlises cromatogrficas, foi preparada uma soluo estoque de AU
(padro; pureza 98%) dissolvido em metanol na concentrao de 200 g.mL-1. A
soluo obtida foi submetida banho de ultrassom por 30 minutos e em seguida,
filtrada em filtros de membrana (PTFE) de 0,45 m. As anlises por CLAE foram
realizadas em um cromatgrafo lquido Shimadzu, equipado com um
degaseificador DGU-20A3, duas bombas LC-20AD, um injetor automtico SIL-20A
HT, um forno CTO-20A, um detector de arranjo de diodos SPDM20Avp, acoplados
a um sistema controlador CBM-20A. As anlises foram determinadas em uma
coluna analtica C18 de fase reversa Phenomenex Luna de 150 x 4,6 mm de
dimetro (5 m tamanho de partcula). O fluxo da fase mvel foi de 1 mLmin-1 e o
volume de injeo da amostra foi de 20 L. Os solventes utilizados na fase mvel
foram: (B) metanol e (A) cido actico (1%) em gua milli-q (v/v). O mtodo
consistiu de um sistema isocrtico de eluio na proporo de 90/10 (B/A) da fase
mvel em um tempo de anlise de 10 minutos (NUNES et al., 2015). O comprimento
de onda para deteco do AU foi de 280 nm e a temperatura do forno foi de 25 C.
Para a identificao do AU nas Memb/AU/Lip, estas foram dissolvidas em 10 mL
de metanol e mantidas sob agitao magntica por 12 horas. A soluo obtida foi
filtrada em filtros de membrana (PTFE) de 0,45 m e analisada por CLAE. O AU
presente nas membranas foi identificado com base no tempo de reteno (TR) e
no espectro de absoro ultravioleta (UV) do AU padro.
O mtodo analtico foi validado de acordo com a Resoluo RE n 899, de
29 de maio de 2003, regulamentada pela ANVISA, que determina a Guia para
validao de mtodos analticos e bioanalticos. Os parmetros utilizados para a
validao foram: linearidade, limite de deteco (LD), limite de quantificao (LQ),
preciso, exatido e robustez (ANVISA, 2003).
4.4.1. Linearidade (Intervalo de calibrao)
A lineariedade do mtodo foi estabelecida atravs da avaliao do
coeficiente de correlao (r) de uma curva de calibrao do AU. A curva foi obtida
46
em cinco concentraes diferentes: 5, 10, 25, 50 e 100 gmL-1. As anlises foram
realizadas em triplicata (n= 3).
4.4.2. Limite de deteco e limite de quantificao
O Limite de deteco (LD) pode ser determinado com base na relao de
que o sinal da substncia analisada 3 vezes maior que o rudo da linha de base
e o limite de quantificao (LQ) com base na relao de 10 vezes maior que rudo
da linha de base (ANVISA, 2003). O LD e LQ foram calculados de acordo com as
equaes 2 e 3, respectivamente.
. (2): = 3
. (3): = 10
onde, DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y e IC a inclinao da
curva de calibrao.
4.4.3. Preciso
A preciso do mtodo foi avaliada de acordo com a repetibilidade (preciso
intra-dia) e preciso intermediria (preciso inter-dia). A repetibilidade foi
determinada a partir do preparo de 9 amostras do AU na concentrao de
100 gmL-1, realizadas no mesmo dia, com o mesmo analista e instrumentao. A
preciso intermediria foi avaliada com o preparo de 6 amostras do AU na
concentrao de 100 gmL-1 em dois dias diferentes, com analistas e
instrumentao diferentes. Os resultados foram expressos de acordo com o desvio
padro relativo (DPR) das anlises.
4.4.4. Exatido
Para avaliar a exatido do mtodo, realizou-se um teste de recuperao
utilizando o mtodo de adio de padro, o qual, consiste em adicionar quantidades
conhecidas de AU nas solues metanlicas das Memb/AU/Lip. A recuperao foi
determinada adicionando trs amostras de AU em trs diferentes concentraes: 5
(baixa), 50 (mdia) e 100 (alta) gmL-1. Todas as amostras foram analisadas em
47
triplicata (n= 3). As porcentagens de recuperao foram calculadas de acordo com
equao 4 e os resultados tambm foram expressos de acordo com o DPR das
anlises.
. (4): (%) = (. . )
. 100
Onde, a Concentrao experimental a quantidade de AU nas Memb/AU/Lip com
as solues padres adicionadas, a Concentrao terica a quantidade de AU
nas Memb/AU/Lip sem os padres e a Quant. AU adicionada a quantidade de AU
nas trs diferentes concentraes.
4.4.5. Robustez
A robustez foi determinada atravs de pequenas variaes dos parmetros
utilizados no desenvolvimento do mtodo analtico. Os parmetros escolhidos
foram o fluxo da fase mvel e a temperatura do forno o qual a coluna foi aplicada.
O fluxo da fase mvel foi modificado para 0,8; 0,9 e 1,1 mLmin-1 e a temperatura
foi alterada para 20, 30 e 35 C.
4.5. Teor e eficincia de encapsulao do AU nas Memb/AU/Lip
O teor e a eficincia de encapsulao (EE) do AU foram determinados
atravs da dissoluo de segmentos de Memb/AU/Lip com rea de 7 cm2 em 10
mL de metanol, mantidos sob agitao magntica constante (250 rpm) por 12
horas, para permitir que todo AU encapsulado na membrana esteja em soluo.
Em seguida, a soluo obtida foi filtrada em filtros de membrana (PTFE) de 0,45
m e analisadas por CLAE. Os segmentos foram obtidos a partir de trs
Memb/AU/Lip diferentes (A, B e C) e as anlises foram realizadas em triplicata (n=
3). A EE foi calculada de acordo com equao 5, descrita abaixo:
. (5): = 1
2 100
onde, C1 o teor de AU presente nas membranas e C2 a quantidade inicial de
AU utilizado para preparar as Memb/AU/Lip.
48
4.6. Uniformidade de contedo do AU nas Memb/AU/Lip
Para determinar se o AU est distribudo de maneira uniforme ao longo das
Memb/AU/Lip, foram obtidas 11 fraes com rea de 7 cm2, sendo que cada frao
foi dissolvida em 10 mL de metanol e mantida sob agitao durante 12 horas. As
solues obtidas foram filtradas em filtros de membrana (PTFE) de 0,45 m e o
teor de AU em cada frao foi determinado por CLAE. Esse experimento foi
realizado utilizando 3 Memb/AU/Lip diferentes. Dessa forma, foram analisadas 33
fraes por CLAE.
4.7. Estudos de liberao in vitro do AU
Os ensaios de liberao in vitro foram realizados em clulas de Franz
automatizadas (MicroettePlus Multi-Group, Hanson Research Corporation,
Chatsworth, CA, USA), sob temperatura de 37 0,5 C. A rea de difuso das
clulas de Franz foi de 1,76 cm2 e o compartimento do meio receptor de 7 mL.
Membranas de acetato de celulose (12 kDa, Sigma-Aldrich) foram fixadas na
extremidade das clulas com a funo de barreira para a liberao e foram
pr-hidratadas com soluo salina para se fixarem entre o compartimento doador e
receptor das clulas de Franz, sobre as quais, foram aplicadas as Memb/AU/Lip. O
ensaio utilizou como meio receptor, soluo aquosa de DMSO 2% (v/v), sob
agitao magntica constante (250 rpm) e o sistema foi mantido em condio sink
durante todo experimento (SERAFINI et al., 2014). Alquotas de 2 mL do meio
receptor foram coletadas em diferentes intervalos de tempo: 0; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6;
8; 10; 12; 18 e 24 horas. Na medida em que as alquotas eram retiradas, a mesma
quantidade de meio receptor era reposta no compartimento. As amostras coletadas
foram filtradas em filtros de membrana (PTFE) de 0,45 m e analisadas por CLAE,
para quantificar a quantidade de AU liberado em cada intervalo de tempo. As
coletas e anlises foram realizadas em sextuplicatas (n= 6). Os experimentos de
liberao in vitro tambm foram realizados com a formulao controle (Memb/AU),
com o objetivo de comparar os resultados das duas membranas e comprovar a
possvel liberao controlada que obtida com formulaes contendo lipossomas
(PANDEY; RANI; AGARWAL, 2016).
49
4.8. Absoro transdrmica do AU
4.8.1. Preparo da pele
Para os estudos de penetrao/permeao do AU nas camadas da pele
foram utilizadas peles de orelha de porco como membrana. As amostras de pele
foram doadas por um abatedouro de animais da regio (So Cristvo, Sergipe,
Brasil). O excesso de gordura dos tecidos, hipoderme e plos foram removidos e a
superfcie da pele foi devidamente limpa com gua corrente e armazenada em
papel alumnio -20C at sua utilizao. Antes de cada experimento, a pele foi
cortada em pedaos redondos com rea de 3 cm de dimetro e apresentaram
espessura entre 1,8 e 2,2 mm, medidas por um medidor de espessura de marcao
(No. 7301, Mitutoyo, Japan).
4.8.2. Permeao in vitro do AU nas camadas da pele
Os experimentos de permeao foram realizados em clulas de Franz
automatizadas (MicroettePlus Multi-Group, Hanson Research Corporation,
Chatsworth, CA, USA), sob temperatura de 37 0,5 C, durante 24 horas. O meio
receptor utilizado para a garantia da condio sink foi 7 mL de uma soluo aquosa
de DMSO 2% (v/v), mantido sob agitao magntica constante (250 rpm) durante
todo o experimento (SERAFINI et al., 2014). As peles foram aplicadas
manualmente na rea de difuso da clula de Franz (1,76 cm2) com soluo salina
e sobre elas foram aplicadas as Memb/AU/Lip. Alquotas de 2 mL do meio receptor
foram coletadas em diferentes intervalos de tempo: 0; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12;
18 e 24 horas. Na medida em que as alquotas eram retiradas, a mesma quantidade
de meio receptor era reposta no compartimento. As amostras col
