Estudos estruturais e biofísicos dos receptores nucleares...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO CARLOS

Estudos estruturais e biofísicos dos receptores

nucleares humanos dos hormônios

tireoidianos e seus complexos com ligantes

isoforma-específicos

Fábio Macêdo Nunes

Tese apresentada ao Instituto de Física de São Carlos, da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências na área de concentração: Física Aplicada.

Orientador: Prof. Dr. Igor Polikarpov

São Carlos – 2006

Nunes, Fábio Macêdo.

“Estudos estruturais e biofísicos dos receptores nucleares humanos dos hormônios tireoidianos e seus complexos com ligantes isoforma-específicos”

Fábio Macêdo Nunes – São Carlos, 2006.

Tese (Doutorado) – Área de Física Aplicada da Universidade de São Paulo, São Carlos 2006. 2006 - número de paginas: 126 Orientador: Prof. Dr. Igor Polikarpov 1.Receptores Nucleares. 2.Dicroismo circular. 3 Cristalografia. I. Título.

AGRADECIMENTOS

Ao cientista maior, Pois é dele que provém toda a inspiração e sabedoria para a busca incansável da verdadeira ciência. Longe dos olhos dos assopradores e perto daqueles que podem ver a ciência com olhos e coração de menino. Sem se esquecer que ciência não se restringe a trabalho, resultados, prêmios e reconhecimento, antes tudo deve ser encarada como uma arte e respeitada como tal.

Aos meus pais Fleury Ferreira Nunes e Doralice Macêdo Nunes. Por sempre

terem sido um exemplo de Fé, amparo, incentivo, boa vontade, dedicação e tolerância, sem os quais nada do que construí poderia ter sido realizado até hoje!

As minhas duas filhinhas, Rebeca Silva Nunes e Raquel Silva Nunes, que embora

ainda tão pequeninas sempre foram compreensivas, mesmo em virtude das dificuldades financeiras, aniversários e tantas outras datas importantes perdidas, enquanto viagens de pesquisa nos afastavam em muitos quilômetros.

Aos meus queridos e grandes mestres inspiradores da ciência: Ricardo Chequer

Chemas e Caetano Tourinho que sempre me incentivaram e foram exemplo de conduta e ética na ciência, sem contar com a infinita paciência com um jovem cheio de esperança e inexperiência.

Aos pesquisadores e professores Otavio Henrique Thiemann, Richard Charles

Garratt e Glaucius Oliva pela eterna boa vontade e continua atenção, mesmo quando se encontravam em meio a correria, as portas estavam sempre abertas.

Ao Professor Dr. Ralf Ribeiro que infelizmente não se encontra mais entre nós!

Tão pouco tempo... Suficiente para o entendimento do notável pesquisador professor e grande ser humano que era e sempre será em minha memória.

Ao Professor Dr. Igor Polikarpov pela orientação, amizade, conduta ética e

compreensão dos momentos difíceis, sem as quais este trabalho não poderia ter sido realizado. O meu sincero muito obrigado!

A banca examinadora pelas relevantes contribuições e críticas construtivas. Aos amigos: Hannes Fisher, Rodrigo Villares Portugal, Sandra Martha, José

Ribamar dos Santos Ferreira Júnior, Humberto Pereira, Andrei Leitão, Adriana Lucely Rojas, Glauber Silva Godoi, Daniel Ferreira da Silva e Mario de Oliveira Neto.

Aos colegas de luta e trabalho: Maria Auxiliadora Amorim, Santos, Marcos

Calgaro, Ricardo Aparício, André Luis Berteli Ambrosio, João Renato Muniz, Lucas Bleicher, Alessandro Nascimento, Ricardo Nicolucci, Napoleão Fonseca Valadares, Sandra Krauchenco e Ana Carolina Migliorini Figueira.

Ao aluno de Iniciação científica: Marcelo Liberato, Pela constante troca de conhecimentos e apoio ao projeto.

Ao corpo Docente e técnico do IFSC, por todo apoio prestado durante estes anos,

por quem sempre fui muito respeitado e bem tratado. Ao CNPq que sempre financiou minha carreira acadêmica. A FAPESP pela auxilio financeiro (processo 99/03387-4).

SUMÁRIO

1 O CAPÍTULO: INTRODUÇÃO AOS RECEPTORES NUCLEARES 1 1.1 RECEPTORES NUCLEARES 1 1.2 ESTRUTURA CANÔNICA DOS RECEPTORES NUCLEARES 3 1.3 MODELO DE LIGAÇÃO DO LIGANTE AO SÍTIO, “MODELO DA RATOEIRA” 8 1.4 A IMPORTÂNCIA DA MOBILIDADE DA HÉLICE 12 10 1.5 DIMERIZAÇÃO DOS LBDS 11 1.6 O BOLSO DE LIGAÇÃO (LBP-LIGAND BINDING POCKET) 11 1.7 AÇÃO DOS RECEPTORES NUCLEARES 12 1.8 POTENCIAL FARMACOLÓGICO DOS RN 15 1.9 OBJETIVOS 19 2 O CAPÍTULO: ESTUDOS DE SUB-CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO 20 2.1 METODOLOGIA 20 2.2 EXPRESSÃO DOS hTRα1LBD 20 2.3 PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE (hTRα1LBD) 21 2.4 PURIFICAÇÃO DO hTRα1LBD POR EXCLUSÃO DE TAMANHO (GEL FILTRAÇÃO) 22 2.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO (hTRα1LBD) 23 2.6 EXPRESSÃO 23 2.7 PURIFICAÇÃO 24 2.8 AFINIDADE 24 2.9 GEL FILTRAÇÃO 25 2.10 SUBCLONAGEM DO hTRα2LBD 26 2.11 TRANSFORMAÇÃO EM E. COLI (BL21 DE3) 26 2.12 EXPRESSÃO DO hTRα2LBD 27 2.13 PURIFICACAO DO hTRα2LBD 27 2.14 TROCA IÔNICA 28 2.15 RE-ENOVELAMENTO 29 2.16 RESULTADOS E DISCUSSÃO hTRα2LBD 29 2.17 SUBCLONAGEM DO hTRα2LBD. 29 2.18 EXPRESSÃO DO hTRα2LBD 31 2.19 EXTRAÇÃO PROTÉICA 32 2.20 TROCA IÔNICA 33 3 O CAPÍTULO: CRISTALIZAÇÃO 34 3.1 CRISTAIS 34 3.2 SOLUBILIDADE 35 3.3 FORÇA IÔNICA 37 3.4 PH E ÍONS 38 3.5 TEMPERATURA 38 3.6 CRESCIMENTO DE CRISTAIS A PARTIR DE UMA SOLUÇÃO 39 3.7 TÉCNICA DE CRISTALIZAÇÃO 40

3.8 METODOLOGIA 41 3.9 CRISTALIZAÇÃO DO (hTRα1LBD) 41 3.10 RESULTADOS E DISCUSSÃO (hTRα1LBD) 42 4 O CAPÍTULO - DIFRAÇÃO DE RAIOS-X E RESOLUÇÃO ESTRUTURAL 48 4.2 CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X 48 4.3 DIFRAÇÃO POR UM CRISTAL 49 4.4 A LEI DE BRAGG 50 4.5 O PROBLEMA DA FASE 51 4.6 SUBSTITUIÇÃO MOLECULAR 52 4.7 CRIO CRISTALOGRAFIA 52 4.8 METODOLOGIA 53 4.9 EXPERIMENTO DE COLETA DE DADOS DE DIFRAÇÃO 53 4.10 RESOLUCAO ESTRUTURAL E REFIAMENTO DAS ESTRUTURAS 54 4.11 RESULTADOS E DISCUSSÕES 57 4.12 VALIDAÇÃO DAS ESTRUTURAS 57 4.13 ANÁLISE DOS SÍTIOS DE LIGAÇÃO 59 5 O CAPÍTULO: DICROISMO CIRCULAR(CD) 65 5.1 DICROISMO CIRCULAR (CD) 65 5.2 DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DE UMA PROTEÍNA POR CD 66 5.3 ESTABILIDADE TÉRMICA 67 5.4 METODOLOGIA 68 5.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 70 6 o CAPÍTULO: CONCLUSÃO 87 6.1 CONCLUSÕES 87 6.2 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS 87 6.3 BIBLIOGRAFIA: 89

i

LISTA DE TABELAS

Tabela-1. Parâmetros e estatísticas de refinamento das estruturas....................................56 Tabela-2. Parâmetros dos índices de qualidade das estruturas (Procheck)..........................................................................................................................58 Tabela-3. Distâncias das interações de hidrogênio para os receptores hTRα1 e hTRβ1....................................................................................59 Tabela 4 – Temperaturas do processo de desenovelamento, frente ao acréscimo de temperatura com seus respectivos Tms........................................84 Tabela-5. Temperaturas médias (Tms) e entalpia (∆H) com suas respectivas incertezas.........................................................................................86

ii

LISTA DE FIGURAS

Figura-1. Ativação da transcrição dos receptores nucleares via ligação do

hormônio (ligante), em alguns casos o ligante sofre algumas alterações até se tornar o hormônio definitivo, sendo neste estágio conhecidos como pró-ligante.............................2

Figura-2. Representação esquemática da organização estrutural e funcional dos

receptores nucleares que foram conservadas evolutivamente. Região amino-terminal (A/B) em cinza, altamente variável entre os membros da família, onde se encontra o domínio de transativação independente de ligante AF-1, em azul(C) encontra-se o domínio de ligação ao DNA (DBD), extremamente conservado, em cinza (D) conectando o DBD ao LBD encontra-se a região dobradiça (hinge), que não é conservada, em verde (E) encontra-se o domínio de ligação ao ligante(LBD), conservado entre os membros da família dos RN, que possui na sua região C-terminal o domínio de transativação dependente do ligante AF-2. Em seguida, em cinza a região (F) que encontra-se, em alguns receptores. A região-F é muito variável e ainda não tem sua função bem conhecida.............................................................................................................................3

Figura-3. Esquema do domínio de ligação ao DNA dos receptores nucleares, com

seus dois característicos dedos de zinco e a extensão de sua região C-terminal (CTE). Nos dedos de zinco observa-se quatro cisteínas conservadas, que são coordenadas para cada dedo de zinco. A hélice 1 contém os resíduos da caixa P, que estão envolvidos na discriminação dos elementos responsivos. Os resíduos no segundo dedo de zinco que constituem a caixa D formam a interface de dimerização. A região C-terminal (CTE) contém as caixas T e a que são responsáveis pela ligação da proteína ao DNA em estado monomérico. Como mostrado acima, observa-se o cruzamento das hélices 1 e 2 num ângulo reto, formando a região de reconhecimento do meio-sítio do elemento responsivo............................................................................................................................6

Figura-4. Esquema explicativo da composição do domínio LBD conservado na

família dos receptores nucleares. Tal comparação é possível devido a similaridade entre o hRXRαLBD(apo) a esquerda e o hRARγ(holo)a direita....................................................7

Figura-5. Representação esquemática do domínio do domínio de ligação ao

ligante(LBD) em receptores nucleares. A esquerda se encontra a representação da estrutura do RXRα-apo e a direita a representação do RARγ-holo. Obs: Esta comparação foi possível porque a estrutura terciária do LBD do receptor RARγ e RXRα são bem similares. Observa-se que quando ocorre à ligação do ligante a estrutura do receptor muda, ficando mais compacta, o que fica claro com a modificação da posição da hélice-12 e do C-terminal...............................................................................................................9

iii

Figura-6 Ação dos RNs. O ligante migra via membrana plasmática e interage com o respectivo receptor o que pode não ser diretamente no núcleo, pois há a possibilidade de interação no citoplasma, como por exemplo, com kinases (a). Pode haver uma variação da média da localização dos diferentes receptores e que é afetada pela natureza dos ligantes. A interação dos ligantes controla uma diversidade de fatores. Na ausência do ligante, muitos receptores se encontram ligados a regiões reguladoras de genes alvo como co-repressores ou complexos de histonas desacetilase (HDAC) (b). A desacetilação das histonas é responsável pela condensação da cromatina o que explica o efeito do silenciamento do gene nos receptores apo. A ligação do ligante libera o complexo HDAC (c), o que resulta no recrutamento da histona acetil transferase (HAT) e do complexo de remodelação da cromatina (CRM) que promoverá um estado adequado para a acepção do complexo ativador na região onde se encontra ligado o receptor (d). Para finalizar, o mecanismo a polimerase II aloenzima (enzima pol II, TAF-TATA-binding protein-associated factor) e complexos mediadores são recrutados e aumentam a freqüência da iniciação da transcrição(e).................................................................................................14

Figura-7. SDS-PAGE da expressão do TRα1 a diferentes temperaturas. (M)

Marcador de peso molecular: BSA (67 kD), Ovalbumina (45 kD), Anidrase Carbônia (30kD), Inibidor de Tripsina de Soja (22,4 kD). Poços (1-6) indução da proteína recombinante com IPTG nas temperaturas 1-2 à 14oC, 3-4 à 20oC, 5-6 à 22oC................23

Figura-8. SDS-PAGE. (A) Purificação por afinidade do TRα1LBD na presença de

ligante (T3); (M) Marcador de peso molecular; (1 e 2) alíquotas da lavagem da resina Talon; (3 e 4) Diferentes aliquotas da eluição da proteína com 500 mM de imidazol. (B) Purificação por afinidade do TRα1LBD na ausência de ligante; (M) Marcador de peso molecular; (1-5) Diferentes frações de eluição da proteína recombinante na presença de tampão 2 com 500 mM de imidazol, poço 6 alíquota da resina........................................24

Figura-9. SDS-PAGE. (A) Purificação por gel filtração do TRα1LBD na presença

de ligante (T3); (M) Marcador de peso molecular; (1-7) diferentes frações de eluição. (B) Purificação por gel filtração do TRα1LBD na ausência de ligante. (M) Marcador de peso molecular; (1-5) diferentes frações de eluição...................................................................25

Figura-10. Géis de 1% agarose. (A) Amplificação por PCR do domínio de ligação

ao ligante de hTRα2. (pb) 1 Kb Plus DNA Ladder; Poços (1-5) amostras do produto da amplificação por PCR do hTRα2LBD, seta mostra amplicon de 1026 pb correspondente ao LBD de hTRα2. (B) Digestão com enzimas de restrição do hTRα2LBD subclonado em pGEMT. (pb) 1 Kb Plus DNA Ladder, inserto de 1026pb; A seta mostra um inserto de 786 pb correspondente ao LBD de hTRα1 utilizado como parâmetro de avaliação.........30

Figura-11. Gel de 1% agarose da subclonagem do hTRα2LBD. (pb) 1 Kb Plus

DNA Ladder; Poço 1 liberação do inserto do hTRα2LBD do pET 28a(+) após digestão com enzimas de restrição...................................................................................................30

Figura-12. SDS-PAGE. (A) Expressão de TRα2LBD. (M) Marcador de peso

molecular; Poços (1-4) extrato bruto do hTRα2LBD expresso a 37 0C, seta mostra a

iv

proteína recombinante de 39 kD. (B) Extrato bruto de diferentes colônias de hTRα2LBD na busca da que melhor expressa a proteína recombinante de 39 kD; No poço 9 hTRα1LBD purificada para comparação com hTRα2LBD................................................31

Figura-13. SDS-PAGE. Extração com uréia da hTRα2LBD. (M) Marcador de

peso molecular; no poço 2 amostra da lavagem do sedimento; No poço 3 amostra após ressuspender o sedimento em tampão B contendo uréia; no poço 4 alíquota após 8h de extração com tampão B contendo uréia.............................................................................32

Figura-14- SDS-PAGE. Purificação de hTRα2LBD através de cromatografia de

troca iônica. (M) marcador de peso molecular; Poços (1-4) diferentes frações contendo hTRα2LBD recombinante de 39 kD, seta preta..................................................................33

Figura -15. Distribuição de cargas e regiões hidrofóbicas sobre a superfície de

uma proteína.......................................................................................................................36 Figura-16. Diagrama de fase onde se mostra a solubilidade da proteína

(concentração de precipitante x concentração de proteína) onde ocorre a formação de cristais................................................................................................................................36

Figura-17. Figura esquemática do sistema utilizado na técnica de hanging drop

(gota pendurada)................................................................................................................40 Figura-18. Primeiros resultados obtidos após realização dos ensaios de

cristalização. A esquerda uma foto de esferulitas, a direita uma foto de uma mudança de fase.....................................................................................................................................43

Figura-19. Figura dos cristais coletados do hTRα1LBD complexado com T3 em

A(grupo espacial C2), T3 em B(grupo espacial P212121), TRIAC (grupo espacial P212121) em C e GC-1(Grupo EspacialP212121) em D.....................................................................44

Figura-20. Representação do estados dos cristais (morte dos cristais) a partir do

quarto dia após ensaio de cristalização..............................................................................46 Figura-21. Resultados obtidos nos ensaios de cristalização do hTRα1LBD apo.

Em A foto da proteína precipitada, em B foto de uma espécie de gel formado que ficava aderida à lamínula, a foto B está em preto e branco para melhorar o contraste do objeto mostrado.............................................................................................................................47

Figura-22. Fotografia de difração para um cristal real..........................................49 Figura-23. Ramachandran plot do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC: onde

94% dos resíduos estão agrupados em regiões mais favorecidas e 6% em regiões permitidas. (Os ângulos Phi e Psi estão em graus)............................................................57

v

Figura-24. Ramachandran plot do hTRβ1(LBD) complexado com o TRIAC: onde 92.7% dos resíduos estão agrupados em regiões mais favorecidas e 5.9% em regiões permitidas. (Os ângulos Phi e Psi estão em graus)............................................................58

Figura-25. Sítio de ligação do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC em detalhe

a densidade eletrônica do ligante em azul a 1.5 Sigma......................................................61

Figura-26. Vista esquemática das interações do ligante (TRIAC), no sitio de ligação do hTRα1(LBD), onde pode-se observar com clareza as interações do ligante.................................................................................................................................62

Figura-27. Sítio de Ligação do hTRβ1(LBD) complexado com TRIAC em detalhe

a densidade eletrônica do ligante em azul a 1.5 Sigma......................................................63 Figura-28. Vista esquemática das interações do ligante (TRIAC), no sitio de

Ligação do hTRβ1(LBD), onde pode-se observar com clareza as Interações do Ligante...............................................................................................................................64

Figura 29. Gráfico que apresenta os espectros de CD para hélice a em vermelho,

folha β em verde e seqüência aleatória ou randômica em preto para uma cadeia polipeptídica.......................................................................................................................67

Figura-30. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por

temperatura do hTRα1(LBD). Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm...................................................................................71


temperatura do hTRα1(LBD) complexado com T3. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm.................................72


temperatura do hTRα1(LBD) complexado com T4. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm................................ 73


temperatura do hTRα1(LBD) complexado com GC-1. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm.................................74


temperatura do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm.................................75

vi


temperatura do hTRα1(LBD)-apo. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm....................................................................................................................................76


temperatura do hTRα1(LBD) complexado com T3. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm....................................................................................................................................77


temperatura do hTRα1(LBD) complexado com T4. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm.................................78


temperatura do hTRα1(LBD) complexado com GC-1. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm.................................79


temperatura do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperaturaem (oC). Para uma concentração protéica total de 5µm..................................80

Figura-40. Espectro da estabilidade térmica realizadas para o hTRα1LBD com e

sem ligante. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e temperatura em (oC), na abscissa. Para uma concentração protéica total de 5µm.........................................................................................................81

Figura-41. Espectro da estabilidade térmica realizadas para o hTRβ1LBD com e

sem ligante. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e temperatura em (oC), na abscissa. Para uma concentração protéica total de 5µm.........................................................................................................82

Figura-42. Histogramas das entalpias de Van’t Hoff (A e C) e dos Tms (B e D).

em E as entalpias para as isoformas alfa e beta estão associadas e em F os Tms para as isoformas se encontram associados. (1, 2 3,4 e 5) equivalem à proteína no estado apo, e ligada a T3, T4, GC-1 e TRIAC sucessivamente...............................................................83

Figura-43.Histograma dos Tms Para TRα1 e TRβ1..............................................84

vii

LISTA DE ABREVIATURAS

RN – Receptor nuclear LBD - Domínio de ligação ao ligante DBD - Domínio de ligação ao DNA DNA – Ácido desoxirribonucléico LBP- Bolso de ligação do ligante TR - Receptor de hormônio tireoidiano MR- Substituição molecular AF-1 - Função de ativação-1 AF-2 - Função de ativação-2 DLS - Espalhamento de luz dinâmico DTT – Ditiotreitol ER - Receptor de estrogeno RE – Elemento responsivo ERE - Elemento responsivo a estrogeno HAT - Histona acetil transferase HDAC - Histona deacetilase HRE - Elemento responsivo a hormônio CRM - complexo de remodelação da cromatina TAF-TATA- Fator de ligação associado à proteína CoRNR box - Caixa co-repressora do receptor nuclear APL- Leucemia promielocítica aguda IPTG - isopropil-beta-D-thiogalactopiranoside LB - Luria broth PDB - Banco de dados para proteínas PPAR- Receptor de proliferação e ativação peroxossomal PR- Receptor de progesterona PXR- Pregnane X Receptor RAR - Receptor do ácido retinóico RXR - Receptor X retinóico SDS-PAGE - Gel de eletroforese em dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio SMRT- Receptor silenciador e mediador para retinóide e hormônio tireoidiano SRC-1 - Esteróide e coativador-1 TRE - Elemento responsive a TR TIF - Fator transcricional intermediário TRAP - Proteína associada a TR TSH - Hormônio de estimulação tireoidiano NCoR1- Receptor nuclear correpressor-1 NCoR2- Receptor nuclear correpressor-2 NSAIDs-Drogas não esteroidais e anti-inflamatória. NGFI- Fator indutor de crescimento do nervo.

viii

RESUMO

Os receptores nucleares (RNs) são um conjunto de proteínas e fatores de transcrição que formam uma superfamília que interagem com o DNA. Os receptores de hormônio tireoidiano são parte da família de receptores nucleares e possuem majoritariamente quatro isoformas: TRα1, TRα2, TRβ1 e TRβ2, geradas por splicing alternativo de RNA de dois genes: um para TRα e outro para TRβ. Neste trabalho realizou-se a sub-clonagem do hTRα2LBD, desenvolveu-se protocolos de expressão, purificação e re-enovelamento para o hTRα2LBD com produção de proteína solúvel e em grande quantidade. Desenvolveu-se também os protocolos de expressão purificação e cristalização com diversos ligantes para o hTRα1LBD. A estrutura do receptor hTRα1LBD complexada com TRIAC(3,5,3’-triiodothyroacetic acid) foi resolvida e um estudo comparativo do padrão de ligação com a isoforma hTRβ1LBD complexada com o mesmo ligante foi realizado para determinação da seletividade. Estudos comparativos do desenovelamento por temperatura foram realizados utilizando a técnica de dicroísmo circular (CD) para as isofromas hTRα1LBD e hTRβ1LBD complexadas com diversos ligantes.

ix

ABSTRACT

The nuclear receptors (NRs) comprise a large set of proteins and factors of

transcription which are grouped into the super family of the NRs that interacts with the DNA. The thyroid hormone receptors are members of NRs. The thyroid hormone receptor possesses four isoforms mainly: (TRα1, TRα2, TRβ1 and TRβ2), generated by splicing alternative of RNA from two genes. In this work hTRα2LBD was sub-cloned, protocols of expression, purification and re-folding for hTRα2LBD were developed, with production of soluble protein in great amount. Expression protocols for purification and crystallization with diverse ligands for hTRα1LBD were developed. The structure of the receptor hTRα1LBD complexed with TRIAC (3,5,3'-triiodothyroacetic acid) had been solved and a comparative study of the binding mode of the TRIAC for determination of the selectivity was carried out in the hTRα1LBD and hTRβ1LBD isoforms. Comparative studies between hTRα1LBD and hTRβ1LBD under unfolding testes by temperature were carried out thought circular dicroism(CD).

1

1O CAPÍTULO: INTRODUÇÃO AOS RECEPTORES NUCLEARES

1.1 RECEPTORES NUCLEARES

Os receptores nucleares são um conjunto de proteínas e fatores de transcrição que

foram agrupadas em uma superfamília de receptores as quais interagem com o DNA. Esta

família está presente em todo o reino animal e se encontra envolvida em diversos aspectos

da vida, de maneira essencial para múltiplas funções fisiológicas como: homeostase,

reprodução, crescimento, diferenciação, morfogênese, apoptose e metabolismo1.

A família dos receptores nucleares é constituída por: Receptores de hormônios

esteróides, receptores do hormônio tireoidiano, vitamina D, retinóides, ácidos graxos,

prostaglandinas, além de um número crescente de receptores órfãos, assim denominados

uma vez que seus ligantes não foram ainda identificados. Muitos receptores nucleares tem

sido identificados via similaridade seqüencial com receptores conhecidos2,3.

Os receptores nucleares têm, suas funções ativadas pela ligação de uma molécula

sinalizadora lipofílica (figura-1). Através da ligação desta molécula sinalizadora é exercido

o controle dos processos e respostas transcricionais (1,2,3). Os receptores atuam em conjunto

com parceiros em complexos, que são denominados como: complexos co-ativadores,

quando em presença de seu ligante natural, participando da ativação da transcrição e co-

repressores quando participam da repressão da transcrição na ausência de ligante2. O

mecanismo de ação da transcrição de um modo geral se inicia quando um ligante se liga ao

sítio ativo do receptor que está ligado ao complexo repressor; após a ligação do ligante ao

sítio ativo do receptor uma alteração conformacional é desencadeada provocando a

2

liberação do receptor do complexo co-repressor, em seguida, o receptor se associa ao

complexo ativador seguindo-se da ligação ao DNA, desencadeando o inicio da transcrição4.

Figura-1. Ativação da transcrição dos receptores nucleares via ligação do hormônio (ligante).

Em alguns casos o ligante sofre algumas alterações até se tornar o hormônio definitivo, sendo neste estágio conhecidos como pró-ligante.

A família dos receptores nucleares em humanos possui 48 proteínas que regulam a

transcrição dos seus respectivos genes alvos5.

A superfamília dos receptores nucleares evoluiu a partir de um receptor ancestral

comum3. Tal fato confere a esta família uma organização estrutural bem característica, que

será descrita em seções posteriores.

A pesquisa de receptores nucleares hoje em dia apresenta grande influencia no

mercado mundial de fármacos, porque constituem alvos extremamente importantes para o

desenvolvimento destes, devido ao fato dos receptores estarem envolvidos em mecanismos

que possuem influência em diversas doenças que afetam a humanidade como alguns tipos

3

de câncer, obesidade, osteoporose, diabetes, doenças endócrinas, doenças metabólicas,

psoríase, acne, hipercolesteremia, arteriosclerose e desordem lipídica3.

1.2 ESTRUTURA CANÔNICA DOS RECEPTORES NUCLEARES

Os RNs (receptores nucleares) são constituídos de uma única cadeia, que se

organizam estruturalmente em módulos ou domínios com funções específicas. Estes

domínios são evolutivamente conservados, a saber: região amino-terminal, DBD (DNA

binding domain) e LBD (ligand binding domain) 5.

Figura-2. Representação esquemática da organização estrutural e funcional dos receptores

nucleares que foram conservadas evolutivamente. Região amino-terminal (A/B) em cinza, altamente variável entre os membros da família, onde se encontra o domínio de transativação independente de ligante AF-1, Em azul(C) encontra-se o domínio de ligação ao DNA (DBD), extremamente conservado, em cinza (D) conectando o DBD ao LBD encontra-se a região dobradiça (hinge), que não é conservada, em verde (E) encontra-se o domínio de ligação ao ligante(LBD), conservado entre os membros da família dos RN, que possui na sua região C-terminal o domínio de transativação dependente do ligante AF-2. Em seguida, em cinza a região(F) que encontra-se, em alguns receptores. A região-F é muito variável e ainda não tem sua função bem conhecida.

Região amino-terminal

Também conhecida como região A/B que contém o domínio de transativação AF-1

(activation function 1) de tamanho e seqüência variados entre os membros das famílias,

responsáveis pelo reconhecimento de co-ativadores e outros fatores de transcrição. Esta

4

região possui atividade celular-específica sugerindo que esta parte da proteína, contribui

para a especificidade de ação entre isoformas de um receptor. O domínio modulatório,

também é alvo de fosforilação realizada por diferentes caminhos de sinalização, tais

modificações via fosforilação podem afetar significativamente a atividade transcricional6

DBD

O DBD é o domínio de ligação ao DNA, sendo o módulo mais conservado entre a

superfamília dos receptores nucleares. Ele é composto por dois dedos de zinco e possui

normalmente de 60 a 70 aminoácidos. Na sua região C-terminal existem as conhecidas

caixas T e A .

O DBD é responsável pelo reconhecimento de seqüências especificas (elementos

responsivos) e ativação dos genes, possuindo um motivo de nove cisteínas conservadas ao

longo da família dos RNs que é responsável pela alta afinidade do DBD pelo DNA. Em

cada dedo de zinco existe um arranjo tetraédrico de cada zinco coordenando quatro

cisteínas. Cada íon zinco promove a formação de uma estrutura compacta e interdependente

com as cisteínas coordenadas. Alguns aminoácidos específicos estão situados na região

próxima aos dedos de zinco e estes são responsáveis pelo reconhecimento de seqüências

especificas de DNA ou motivos, na base do primeiro dedo de zinco, este agrupamento

específico de aminoácidos é conhecido como Caixa P ou “P Box” enquanto que na região

próxima ao segundo dedo de zinco temos a caixa D ou “D Box” que está envolvia no

processo de dimerização (figura-3).

O DBD possui um enovelamento característico de duas α-hélices sendo que a

primeira hélice começa na terceira cisteína conservada (hélice de reconhecimento) que se

5

liga à cavidade principal do DNA fazendo contatos com bases específicas. A segunda

hélice próxima ao C-terminal do segundo dedo de zinco forma um angulo reto com a

primeira hélice (hélice de reconhecimento figura-3)7.

Os RNs se ligam via DBD aos elementos responsivos (seqüência especifica de

DNA), derivados do motivo AGGTCA. A forma como estes receptores se ligam está

vinculada ao seu estado de oligomerização e desta maneira a região de ligação muda com o

estado de oligomerização. Normalmente a ligação ocorre de três maneiras:

Monômero, quando se liga a um sítio simples. Ex: alguns receptores órfãos

como NGFI-B.

Homodímero, quando se liga a sítio duplicado com palíndromo invertido.

Ex: receptores de esteróides.

Heterodimero, quando se liga a sítio duplicado com repetição direta. Ex:

heterodimeros com RXR.

Este fenômeno ocorre por que em cada receptor, existe na primeira hélice uma

região que é responsável pelo reconhecimento de resíduos expostos, que fazem a

discriminação entre os diferentes sítios de ligação, modulando desta forma, o padrão de

ligação do receptor nuclear ao respectivo gene para desencadear sua atividade biológica3 .

6

Figura-3. Esquema do domínio de ligação ao DNA. Com dois característicos dedos de zinco e a

extensão C-terminal (CTE). Nos dedos de zinco observam-se quatro cisteínas conservadas, que são coordenadas para cada dedo de zinco. A hélice 1 contém os resíduos da caixa P, que estão envolvidos na discriminação dos elementos responsivos. Os resíduos no segundo dedo de zinco que constituem a caixa D formam a interface de dimerização. O C-terminal(CTE) contém as caixas T e A que são responsáveis pela ligação da proteína ao DNA em estado monomérico. Observa-se o cruzamento das hélices 1 e 2 num ângulo reto, formando a região de reconhecimento do meio-sítio do elemento responsivo

A região hinge

A região hinge (dobradiça) ou domínio D é a porção conectora entre os domínios

DBD e LBD, permitindo assim a movimentação de um modulo sobre o outro. O domínio D

não é conservado entre a superfamília dos RNs, sendo em muitos casos ligado a sinalização

esta região também está envolvida em interações com co-repressores dos RNs pois,

alterações nela interferem a nível de cessar completamente interações entre receptores e co-

repressores.

7

LBD

O domínio de ligação ao ligante, LBD é um domínio com múltiplas funções; além

de atuar como domínio desencadeador do mecanismo de ação dos RNs, ser responsável

pela localização nuclear, homo-hetero dimerização, associação com co-repressores e co-

ativadores, proteínas de choque térmico, ele também possui a chamada região de

transativação AF-2 ou função de ativação ligante-dependente e é sabido que em muito RNs

possui uma fraca atividade de ativação do domínio via AF-2 ou AD.

Figura-4. Esquema explicativo da composição do domínio LBD conservado na família dos

receptores nucleares. Tal comparação é possível devido a similaridade entre o hRXRαLBD(apo) a esquerda e o hRARγ(holo) a direita.

O enovelamento do LBD ao longo da família dos RN é bem característico, sendo

partilhado pela maioria dos membros da família (figura-4). Este enovelamento é

basicamente constituído de 12 hélices-α numeradas de 1-12 e uma folha β (entre as hélices

5 e 6) organizadas em um sandwich“α-helical” (antiparalelo organizado estruturalmente

em três camadas como pode ser visto na figura-5)9,10. No centro de mais duas camadas três

hélices se organizam de tal maneira que um “core” é formado na região central do domínio,

8

os resíduos que constituem este “core” são, em sua maioria, de natureza hidrofóbica. Este

core hidrofóbico formado é o sítio ativo do LBD, sendo este alvo dos ligantes. O tamanho

da cavidade hidrofóbica formada varia entre os membros da família dos RNs e entre os

estados onde o receptor se encontra ligado ao ligante (holo) e na ausência do ligante (apo).

A estrutura dos receptores no estado holo são mais compactas o que evidencia claramente

uma alteração estrutural significativa. A modificação da estrutura num estado mais

compacto(holo) também confere uma maior estabilidade a proteína.

1.3 MODELO DE LIGAÇÃO DO LIGANTE AO SÍTIO, “MODELO DA

RATOEIRA”

As estruturas de diversos LBDs já resolvidas sugerem fortemente um mecanismo

similar ao de uma armadilha de rato para a entrada do ligante no receptor. Após a ligação

do ligante ao sítio de ligação, a região AF-2 torna-se competente para ativar a transcrição

causando um re-posicionamento da hélice 11, que agora se torna contínua com a hélice 10,

ao mesmo tempo em que a hélice 12 se movimenta provocando um “flip” do “loop-Ω”

entre as hélices 2 e 3 para abaixo da hélice 6 carreando o “loop” ao longo da região amino-

terminal da hélice H3. O estágio final da movimentação da hélice 12 é um posicionamento

estratégico no sentido de selar o LBP (ligand bind pocket), voltando esta hélice que antes

apontava para fora no estado apo, agora sobre a parte central da estrutura da proteína,

estado holo com a formação de ligações adicionais que promovem uma maior estabilização

do receptor, figura-5.

9

Figura-5. Representação esquemática do domínio de ligação ao ligante(LBD) em receptores nucleares. A esquerda se encontra a representação da estrutura do RXRα-apo e a direita a representação do RARγ-holo. Obs: esta comparação foi possível porque a estrutura terciária do LBD do receptor RARγ e RXRα são similares. Observa-se que quando ocorre à ligação do ligante a estrutura do receptor muda, ficando mais compacta, o que fica claro com a modificação da posição da hélice-12 e do C-terminal.

Outro aspecto importante a salientar é que o equilíbrio entre os estados apo e holo

de um dado receptor, pode ser alterado por conta de interações com a hélice 12 como ponte

salina que é o caso do receptor RARγ11 ou contatos hidrofóbicos, o que implica que a

presença do ligante não é crucial para a ocorrência de tal fenômeno, além de demonstrar

que a forma apo não é o estado conformacional de base.

10

A super expressão de co-ativadores ou mutações nos receptores pode gerar a

presença de receptores que não são ligante-dependentes, o que a nível de organismo pode

acarretar sérias desordens com conseqüências catastróficas para o indivíduo, como

complicações em terapias de câncer endócrino.

1.4 A IMPORTÂNCIA DA MOBILIDADE DA HÉLICE 12

Para os RNs que seguem a regra geral de ligação e composição estrutural do seu

LBD, a hélice 12 é um componente estrutural de vital importância no mecanismo da

ativação da transcrição, pois a conformação da hélice 12 é induzida pelo ligante. Após a

ligação do ligante ocorre uma alteração conformacional da proteína provendo um novo

padrão de ligações que proporcionam uma superfície adequada para a ligação dos co-

ativadores em seguida a região AF-2 é ativada iniciando a transcrição. Por meio de estudos

mutacionais, foi demonstrado a importância da região C-terminal conservada em muitos

LBDs dos RNs que contém a região AF-2, antes da resolução estrutural dos LBDs e foi

demonstrado que esta porção corresponde a hélice 12 anfipática . Como o movimento da

hélice 12 é ligante-induzido tal fato sugere que ela é crucial para controlar as propriedades

agonistas e antagonistas dos RNs devido às suas interações com o ligante e com os resíduos

que interagem com o ligante. 9,12,13

11

1.5 DIMERIZAÇÃO DOS LBDS

Os resultados mostram que o LBD possui uma habilidade natural para a

dimerização o que pode ser observado pois as estruturas dos ER, RXR, RAR, PR, e PPARγ

foram cristalizadas como dímeros 14.

Dados coletados para a dimerização dos LBDs dos: TR, RXR, RAR, e VDR foram

obtidos através de estudos de mutações pontuais e deleções. Tais estudos revelaram que

existe uma área comum de 40 aminoácidos situados nas hélices 10 e 11 que são

responsáveis pela homodimerização de RXR e TR e heterodimerização entre: RAR-RXR,

TR-RXR, e VDR-RXR. Entretanto mutações e deleções podem provocar a perda de folding

e interferir na análise dos resultados. Estudos posteriores sugerem que a região de

dimerização com parceiros diferentes variam por conta de que as regiões de interação entre

diferentes receptores não são sempre as mesmas, o que produz alterações na maneira com

que os LBDs interagem e dos resíduos envolvidos no processo15.

Existe uma possibilidade que quando o ligante se encontra no sítio de ligação, um

rearranjo conformacional seja provocado pela presença do ligante, produzindo um

rompimento das ligações que preservam o dímero do LBD. Este fenômeno produzido pelo

ligante pode provocara um bloqueio na ativação da transcrição14,16.

1.6 O BOLSO DE LIGAÇÃO (LBP-LIGAND BINDING POCKET)

O LBP é constituído por elementos de estrutura secundária das hélices 3,5,11,12

além dos “loops” 6,7,11,12 e os grampos de cabelos tipo β S1 e S213. Na maioria das

estruturas cristalográficas disponíveis e em estado holo. O ligante se encontra enterrado no

12

interior do LBP, sem uma clara entrada ou saída de acesso ao LBP, exceto no caso do

PPARγ onde se observa um espaço de acesso entre a hélice H3 e a volta-β que pode ter

tamanho suficiente para entrada de pequenos ligantes sem a necessidade de grandes

adaptações. Para os outros receptores alterações conformacionais que seguem o modelo da

ratoeira previamente descrito são necessárias para permitir o acesso do ligante ao LBP. Pois

a movimentação da hélice 12 abre um canal, que promove a remoção da “tampa”, que sela

o LBP.

O LBP é basicamente composto de resíduos hidrofóbicos com alguns resíduos

carregados na região interna perto da volta-β que serve como pontos de ancoragem para a

parte polar dos ligantes, tal fato está ligado também à seletividade dos ligantes. A maioria

dos RNs possui uma arginina conservada na hélice 5. Alguns resíduos polares são

claramente conservados nas subfamílias dos RNs de acordo com os requerimentos dos

ligantes das sub-formas de LBP característico de uma dada sub-família.

Outro aspecto interessante do LBP é a capacidade de adaptação ao ligante que o

bolso possui. Esta capacidade de reorganização para receber mais de um tipo de ligante é

possível principalmente por conta da flexibilidade das hélices 3,11,12 e do “loop” entre as

hélices 11 e 12, que permite uma reorganização dos resíduos para a acepção dos ligantes17.

Uma das grandes subfamílias da superfamília dos receptores nucleares são os

receptores de hormônio tireoidiano que particularmente serão abordados nesta tese por

conta dos estudos desenvolvidos no domínio de ligação ao ligante LBD das isoformas alfa

e beta.

1.7 AÇÃO DOS RECEPTORES NUCLEARES

13

Na ausência de ligantes os receptores nucleares se encontram em geral ligados a um

grupo de co-repressores transcricionais como o receptor nuclear co-repressor 1 (NCoR1),

ou o silenciador e mediador para retinóide e receptor de hormônio tireoidiano (SMRT),

também conhecido como (NCoR2). Tais proteínas recrutam complexos transcricionais que

contém desacetilases de histonas (HDACs). Estas desacetilases produzem uma condensação

da estrutura da cromatina exatamente sobre os promotores alvos, impedindo assim que os

receptores responsáveis pela ativação da transcrição possam encaixar nos elementos

responsivos (ER) do DNA produzindo desta maneira então, a repressão do mecanismo de

transcrição 18,5figura-6.

14

Figura-6. Ação dos RNs. O ligante migra via membrana plasmática e interage com o

respectivo receptor o que pode não ser diretamente no núcleo, pois há a possibilidade de interação no citoplasma, como por exemplo, com kinases (a). Pode haver uma variação da média da localização dos diferentes receptores e que é afetada pela natureza dos ligantes. A interação dos ligantes controla uma diversidade de fatores. Na ausência do ligante, muitos receptores se encontram ligados a regiões reguladoras de genes alvo como co-repressores ou complexos de histonas desacetilase (HDAC) (b). A desacetilação das histonas é responsável pela condensação da cromatina o que explica o efeito do silenciamento do gene nos receptores apo. A ligação do ligante libera o complexo HDAC (c), o que resulta no recrutamento da histona acetil transferase (HAT) e do complexo de remodelação da cromatina (CRM) que promoverá um estado adequado para a acepção do complexo ativador na região onde se encontra ligado o receptor (d). Para finalizar, o mecanismo a polimeraze II aloenzima (enzima pol II, TAF-TATA-binding protein-associated factor) e complexos mediadores são recrutados e aumentam a freqüência da iniciação da transcrição (e).46

15

Os co-repressores possuem uma região denominada caixa co-repressora do receptor

nuclear “corepressor nuclear-receptor box (CoRNR box)”, que interage com a região

hidrofóbica formada pelas hélices 3, 4 e 12 que são parte integrante do LBP (ligand binding

pocket). Quando um ligante se liga ao sítio este provoca uma alteração conformacional da

hélice 12, produzindo assim uma nova conformação que desestrutura a cavidade

hidrofóbica (CoRNR Box) promovendo a dissociação do complexo co-repressor. Essa nova

conformação da hélice 12 holo permite a interação desta com motivos co-ativadores com a

seqüência básica: LxxLL onde L é leucina e x qualquer aminoácido. O motivo LxxLL está

presente na maioria dos co-ativadores envolvidos em interações via LBD. Peptídeos ou

proteínas que contém o motivo LxxLL possuem a capacidade de serem reconhecidos pelo

sítio formado pelas hélices 3,4 e 12. Esta região é partilhada em interações com co-

repressores, este sítio também é reconhecido por co-repressores que possuem um motivo

similar mais não idêntico aos motivos dos co-ativadores. O agonista induz a mudança

conformacional do LBD que é a manifestação estrutural da função de transativação (AF-1)

do receptor nuclear. Observa-se que efeitos alostéricos ligante-induzidos sobre o LBD

podem controlar a atividade da região AF-1. O que se observa no caso de crosstalk entre as

regiões C e N-termianl5.

1.8 POTENCIAL FARMACOLÓGICO DOS RN

Por conta dos RNs estarem envolvidos em vários processos relacionados aos

organismos vivos como: crescimento, morfogênese, metabolismo, procriação, diferenciação

celular, proliferação, apoptose e manutenção da homeostase1,2,8, observando-se ainda que

cada mecanismo citado acima está ligado à ativação de um determinado ligante que

16

normalmente é lipofílico os RNs tornam-se facilmente alvos farmacológicos. Deve-se levar

em conta ainda que, cada um dos processos citados acima encontram-se estreitamente

entrelaçados uns com os outros, o que acarreta numa diversidade de papéis desempenhados

pelos RNs como um todo 8.

Segue abaixo alguns exemplos da atuação dos RNs de forma isolada para alguns

dos RNs que possuem seus ligantes conhecidos:

O PPAR-γ (receptor γ ativado pela proliferação do peroxisomo) é ativado por

muitos agonistas naturais como: prostaglandina-15-deoxi-∆12-14 J2 (15d-PGJ2), alguns

ácidos graxos poliinsaturados oxidados, fosfolipídeos, drogas anti-diabéticas,

“thiazolidinediones”(reduz nível de glicose no sangue), drogas anti esteroidais e anti-

inflamatória (NSAIDs). Diversos agonistas do PPAR-γ inibem muitas funções associadas

com ativação de células microgliais, o que sugere que estes compostos, sendo eles naturais

ou sintéticos podem estar envolvidos no controle de inflamações do cérebro. Acredita-se

que as células microgliais estão ligadas com processos inflamatórios e neurodegenerativos

e numa variedade de patologias do cérebro, em desordens crônico degenerativas como mal

de Alzheimer. PPAR-γ também se encontra ligado à cicloxigenases (COX), o que também

associa este receptor nuclear ao trato gastrintestinal e rins19.

RAR e RXR. Os Retinóides são moléculas de sinalização que atuam através da

interação com duas famílias de receptores de retinóides: A do receptor do ácido retinóico

(RAR α, β e γ) e a do a do receptor do ácido 9-cis-retinóico( RXR α, β e γ).

Os receptores de retinóides são de estrema importância, pois regulam importantes e

complexos eventos, que controlam etapas chaves durante o desenvolvimento, manutenção

do controle e homeostase induzindo ou inibindo a proliferação celular, diferenciação e

17

morte. Ou seja: Os receptores de retinóides demonstram uma grande capacidade de controle

da atividade de diferenciação e antiproliferação.

O tratamento de leucemia promielocítica aguda (APL) por retinóides transformou-se

no protótipo de terapia de diferenciação e trouxe grandes esperanças não só para a terapia

do câncer, mas também para a prevenção desta doença20.

ER (receptor de estrogênio). Terapias de reposição de estrogênio têm mostrado um

grande índice de sucesso contra os sintomas da menopausa como atrofia urogenital e picos

de temperatura. Além de serem também utilizados para prevenir e controlar efeitos da

osteoporose pós-menopausa.

Alguns dados também sugerem que estrógenos possuem efeitos benéficos no

sistema nervoso e cardiovascular o que indica que os estrógenos possuem potencial para

tratamento de arteriosclerose e mal de Alzheimer. Embora os efeitos positivos do uso de

estrógenos sejam conhecidos, existem evidências de que o uso contínuo leva a um aumento

reprodutivo de tecido canceroso. Tal problema tem levado a comunidade cientifica a

desenvolver grandes esforços no sentido de preservar os efeitos positivos do uso dos

estrógenos 21.

PR (receptor de progesterona) - Trata-se de um receptor esteróide que é chave na

regulação do crescimento da mama, lactação, ciclo menstrual, gravidez, suporte da gestação

e embriogenese. Em humanos a progesterona possui um papel fundamental na manutenção

do endométrio e desenvolvimento alveolar lobular durante o ciclo menstrual feminino e

gravidez22.

Existem dois receptores de progesterona o receptor A (PRA) e o Receptor B (PRB).

Anormalidades reprodutivas e desempenho sexual estão ligadas ao PRA.

18

Agentes progestacionais têm sido usados como contraceptivos no tratamento da

menopausa por terapia de reposição hormonal, tratamento de câncer de mama e hiperplasia

endometrial.

Antiprogestinas também tem sido usadas como: contraceptivos, indução do trabalho

de parto, tratamento de meningiomas, endometriose e câncer do endométrio. Em câncer de

mama os níveis de progesterona são comumente utilizados como guia na terapia hormonal

e como marcador na prognose da doença 23.

TR (receptor de hormônio tireoidiano) - Existem predominantemente quatro

isoformas do TR (TRα1, TRα2, TRβ1 e TRβ2), que são gerados pelo splicing alternativo de

RNA de dois genes um para TRα e outro para TRβ. Em humanos o hipertiroidismo leva a

um aumento do metabolismo com redução dos níveis no plasma de colesterol. Tentativas de

aumento da taxa metabólica com o uso de tiroxina (T4), que após ser metabolizado é

convertido a 3,5,3’-triiodo-L-tironina (T3) levam a sérios problemas cardíacos. Sabe-se que

o tecido cardíaco é majoritariamente constituído pelo TRα1 e que o T3 não é seletivo para

nenhum dos TRs conhecidos. Parte da comunidade científica que trabalha diretamente com

TRs se encontra na busca de ligantes TRβ seletivos que se situam majoritariamente no

fígado e quando são ativados iniciam o metabolismo de gorduras e colesterol.

Ao longo dos anos várias estratégias para a redução dos níveis de colesterol vem

sendo desenvolvidas com a finalidade de prevenir doenças cardiovasculares.

Testes em roedores e primatas mostraram que derivados sintéticos dos hormônios

tireoidianos seletivos para o receptor TRβ tem mostrado uma eficiência maior na redução

dos níveis de colesterol LDL no plasma e triglicerídios que as terapias convencionais com

redução de peso corporal em 7% em uma semana com grande redução de gordura 17,24-26.

19

1.9 OBJETIVOS

Expressão heteróloga, purificação, estudos em solução e cristalográficos da porção

LBD dos receptor humano dos hormônio tireoidiano isoforma α1 (hTRα1LBD).

Cristalização do domínio LBD de hTRα1 com hormônios naturais e com um tiromimético.

Estudos comparativos entre os receptores α1 (hTRα1LBD) e β1 (hTRβ1LBD). Expressão

heteróloga e purificação da porção LBD do receptor humano de hormônio tireoidiano

isoforma α2 (hTRα2LBD).

20

2O CAPÍTULO: ESTUDOS DE SUB-CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO

2.1 METODOLOGIA

2.2 EXPRESSÃO DOS hTRα1LBD

O hTRα1LBD é constituído pelos amino ácidos 148-410 (contendo somente o LBD

foi inserido em pET28a(+) (Novagem)). O clone utilizado no estudo foi cedido pelo grupo

do Dr. John Baxter (Unidade de Pesquisa Metabólica, Centro de Diabetes, Universidade da

Califórnia, São Francisco, EUA).

Para determinação das melhores condições de expressão em Eschericia. Coli

(B834) diversos experimentos foram realizados no sentido de se obter a otimização da

expressão para o hTRα1LBD. Nestes experimentos via varredura sistemática determinou-se

as concentrações ideais de IPTG, meio de cultura, tempo de indução, temperatura e volume

de pré inoculo. Após o término da varredura das condições de expressão, observou-se que:

as melhores condições para expressão do hTRα1LBD seguem descritas abaixo no protocolo

de expressão desenvolvido.

Deixou-se crescer um pré-inoculo “overnight” em meio LB (1% Triptona, 0.5%

Extrato de levedura e 1% NaCl) a 37 0C com Kanamicina a 50µg/ml. Na manhã seguinte

transferiu-se 1,5 mL de pré-inoculo para 1 L de LB contendo Kanamicina e pôs-se para

crescer sob agitação à 20 0C até atingir a DO600nm de 1,75. Em seguida induziu-se com

IPTG a uma concentração final de 0,5 mM. O tempo de indução total foi de 6 h sob

agitação constante à 20 0C e 250 rpm.

21

Após o término da indução a cultura foi sedimentada por centrifugação a 6.000 rpm

(rotor GS 3-Sorvall) 20 min, à 4 0C. Durante todo o procedimento de sedimentação o meio

de cultura ainda não sedimentado foi mantido em banho de gelo. Após a sedimentação, o

sedimento proveniente de cada litro de cultura foi ressuspendido num volume de 20 mL de

solução TST (50 mM Tris-HCl pH- 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 20 mM β-

mercaptoetanol). Em seguida, adicionou-se à solução homogeneizada, lisozima (1,4

mg/grama de células). Deixou-se com lisozima por 20-30 min em gelo sob lenta agitação.

Após 30 min à 4 0C em agitação constante o extrato foi congelado em nitrogênio líquido e

armazenado à -80 0C.

2.3 PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE hTRα1LBD

Os receptores foram expressos com uma cauda N-terminal contendo 6 histidinas

codificadas pelo vetor pET28a (+) (Novagen).

Descongelou-se o extrato e sonicou-se por três ciclos de dez segundos com

intervalos de um minuto entre os ciclos. Em seguida centrifugou-se o lisado a 14.000 rpm

(rotor SS 34-Sorvall) à 4 0C. Sucedeu-se a retirada do clarificado, por aspiração, este foi

incubado com a resina de afinidade Talon Superflow (Clontech) 1 mL/6 g previamente

lavada e equilibrada com TST. Adicionou-se em conjunto Imidazol (10 mM) à mistura. A

mistura foi agitada lentamente por 1h em câmara fria a 40C. No próximo passo a resina +

solução de proteínas foi centrifugada a 500rpm a 40C, o sobrenadante foi aspirado a vácuo e

descartado. Lavou-se o “pellet” resultante (resina + proteína ligada) 2 vezes com tampão 1

(50 mM de Na3PO4 pH 8,0; 300 mM de NaCl; 10 % de glicerol e 10 mM de β-

mercaptoetanol) contendo 10 mM de imidazol por 5 minutos em agitação, em câmara fria a

22

4 0C e mais duas vezes com tampão 2 ( 50 mM de Na3PO4, pH 8,0; 400 mM de KCl; 10

mM de imidazol; 10 % de glicerol e 10 mM de β-mercaptoetanol) por 5 min. Eluiu-se a

proteína com 3 mL de tampão 2 adicionado de 500mM de imidazol por gravidade em

coluna de plástico Poly-Prep (Bio-Rad) a temperatura de 4 0C. As amostras obtidas foram

analisadas em SDS-PAGE 15 % e coradas com Comassie Blue. A proteína no estado apo

possuía um grau de pureza em torno de 90 % em quanto que a proteína no estado holo

possuía um grau de pureza de aproximadamente 95 % todas as alíquotas obtidas eram

checadas via SDS-PAGE 15 %.

Para a produção da proteína com ligante, no momento da incubação da resina com o

clarificado, adicionou-se o ligante de interesse em concentração 10x a equimolar e

manteve-se o recipiente sob proteção constante contra luz dada a sensibilidade frente à luz

dos ligantes (foto-sensíveis).

2.4 PURIFICAÇÃO DO hTRα1LBD POR EXCLUSÃO DE TAMANHO (GEL

FILTRAÇÃO)

Para purificação por filtração em gel, foi utilizada uma coluna Superdex 200 HL

26/60 (Amersham-Bioscience). Aplicou-se 3 ml do eluato da afinidade e procedeu-se a

eluição isocrática a 2 mL/min. A solução tampão utilizada foi: 20 mM Hepes-Na pH-8,0;

300 mM NaCl; 10 % de glicerol e 3 mM DTT. As amostras eluídas foram analisadas por

SDS-PAGE 15 % e coradas com Comassie Blue. A quantificação foi feita utilizando-se o

método colorimétrico de Bradford27. Como algumas alíquotas eram extremamente diluídas,

as proteínas foram concentradas através de centrifugação a 1500 x g, 4 0C, até atingirem as

concentrações adequadas para os experimentos de interesse. Fazendo-se uso do

23

concentrador Amicon Ultra 10 MWCO (Millipore). O grau de pureza das amostras obtidas

e checadas via SDS-PAGE eram superior a 98 % tanto para a proteína no estado apo como

no estado holo.

2.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO (hTRα1LBD)

2.6 EXPRESSÃO

Após o rastreamento dos outros fatores como concentração de IPTG, tempo de

indução e volume de inoculo, restou o ajuste da temperatura. Observou-se que a melhor

temperatura se encontrava a 20 oC que equivale ao 3o poço da figura-7, após o marcador.

Ainda assim observa-se que o “pellet” 4o poço contém uma grande quantidade de proteína

insolúvel, em todas as tentativas realizadas, não houve nenhuma condição em que a

proteína se encontrasse em alta porcentagem na fração solúvel. Mesmo assim como será

mostrado adiante, obtiveram-se grandes quantidades de proteína solúvel.

M 1 2 3 4 5 6

Figura-7. SDS-PAGE da expressão do TRα1 a diferentes temperaturas. (M) Marcador de peso molecular: BSA (66 kDa), Ovalbumina (45 kDa), Anidrase Carbônia (29kDa), Inibidor de Tripsina de Soja (22,1 kDa), Lacto albumina bovina(14,2kDa). Poços (1-6) indução da proteína recombinante com IPTG nas temperaturas 1-2 à 14oC, 3-4 à 20oC, 5-6 à 22oC.

66kDa 45kDa

29kDa

22,1kDa

14,2kDa

24

2.7 PURIFICAÇÃO

2.8 AFINIDADE

Seguem os resultados da purificação por afinidade do hTRα1LBD (figura-8) com

hormônio (A) e sem hormônio (B). Deve-se observar que em todas as purificações

realizadas, o padrão de pureza das proteínas nos estados, apo e holo se repetem,

independentemente, do tipo de ligante. Salienta-se ainda que todos os ligantes utilizados

eram agonistas e aumentavam a estabilidade da proteína consideravelmente. Faz-se

necessário destacar o resultado observado no gel (B) poço 6 corresponde a proteína

agregada na resina. No caso da proteína com ligante a quantidade retida na resina de

afinidade é muito menor (dado não mostrado).

(A) (B) M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6

Figura-8. SDS-PAGE. (A) Purificação por afinidade do TRα1LBD na presença de ligante (T3); (M) Marcador de peso molecular; (1 e 2) alíquotas da lavagem da resina Talon; (3 e 4) Diferentes aliquotas da eluição da proteína com 500 mM de imidazol. (B) Purificação por afinidade do TRα1LBD na ausência de ligante; (M) Marcador de peso molecular; (1-5) Diferentes frações de eluição da proteína recombinante na presença de tampão 2 com 500 mM de imidazol, poço 6 alíquota da resina.

66kDa 45kDa

29kDa

22,1kDa

14,2kDa

25

2.9 GEL FILTRAÇÃO

Após a purificação via afinidade. As amostras de proteínas se encontravam

relativamente puras para a maioria dos testes preliminares e em quantidades suficientes

para a realização dos estudos de interesse. Em contra partida quando se iniciaram os testes

de cristalização observou-se que o contaminante de 67 kD observado nos géis de afinidade

bem como a heterogeneidade dos estados oligoméricos atrapalhava significativamente a

cristalização das proteínas. Logo se constatou que a etapa de purificação em gel filtração

seria necessária e esta demonstrou-se uma etapa chave no sucesso da cristalização.

Pode-se observar abaixo os resultados da purificação por gel filtração do

hTRα1LBD com hormônio (A) e sem hormônio (B).

(A) (B) M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5

Figura-9. SDS-PAGE. (A) Purificação por gel filtração do hTRα1LBD na presença de ligante (T3); (M) Marcador de peso molecular; (1-7) diferentes frações de eluição. (B) Purificação por gel filtração do hTRα1LBD na ausência de ligante. (M) Marcador de peso molecular; (1-5) diferentes frações de eluição.

22,1kDa

66kDa

45kDa

29kDa

14,2kDa

26

2.10 SUBCLONAGEM DO hTRα2LBD

O clone da proteína completa do hTRα2LBD foi cedido ao grupo pelo Dr. John

Baxter (Unidade de Pesquisa Metabólica, Centro de Diabetes, Universidade da Califórnia,

São Francisco, EUA). O inserto do hTRα2LBD constituído pelos amino ácidos 148-490 foi

inserido em pGEMT-easy vector (Promega contendo somente o LBD) em seguida clivado e

inserido em pET 28a(+) (Novagem) nos sítios para Xho I e Nde I. Os clones obtidos foram

transformados em (DH5α) para proliferação. Uma fração do material após propagação foi

utilizada para mini preparação de plasmídeos, utilizando-se o Kit Qiaprep Spin (Qiagen).

Os plasmídeos purificados foram digeridos para verificação da liberação dos insertos, e

analisados via eletroforese em gel de agarose e coloração com Brometo de Etídeo para

visualização no transluminador. Em seguida os clones foram seqüenciados, (ABI Prism

377 DNA sequencer, Applyed Biosystems).

2.11 TRANSFORMAÇÃO EM E. coli (BL21 DE3)

Adicionou-se 0,5 µL dos clones à 100 µl de solução de CaCl2 (60 µM de CaCl2, 15

% de Glicerol e 10 µM de MOPS pH7,0) e 100 µL de células competentes. Em seguida a

mistura foi mantida no gelo por 30 min, sendo depois a mistura transferida para o banho 42

°C por 1 min e novamente retornou ao gelo por mais 2 min, seguindo-se por mais 2 min a

temperatura ambiente. Após o repouso a mistura foi adicionada a um tubo com 1 mL de LB

fresco e sem antibiótico, em seguida a mistura foi mantida a 370C em agitação por 1h. Ao

fim deste tempo, uma alíquota de 100µL foi retirada e devidamente espalhada em placa de

Petri contendo meio de cultura LB sólido e Kanamicina 50µg/mL. Após a secagem

27

completa em fluxo laminar as placas foram transferidas e permaneceram em média 16

horas a 37 0C para o crescimento das colônias. Após os testes de expressão uma colônia foi

selecionada e propagada em LB para preparação de estoques em glicerol e estocadas a -80

0C.

2.12 EXPRESSÃO DO hTRα2LBD

Seguindo a mesma linha da determinação das condições de expressão em E. coli

para o hTRα1LBD diversos experimentos foram realizados no sentido de se obter a

otimização da expressão para o hTRα2LBD. As melhores condições para expressão do

hTRα2LBD seguem descritas abaixo no protocolo de expressão desenvolvido.

Deixou-se crescer um pré inoculo “overnight” em meio LB (1 % triptona; 0,5%

extrato de levedura e 1 % NaCl) à 370C com Kanamicina a 50 µg/mL. Na manhã seguinte

transferiu-se o 1,5 mL de pré-inoculo para 1 L de meio LB contendo Kanamicina e pôs-se a

crescer sob agitação de 250 rpm à 37 0C até atingir a DO600nm de 1,75. Em seguida induziu-

se com IPTG a uma concentração final de 1,5 mM. O tempo de indução total foi de 6 h sob

agitação constante à 37 0C. Após o término da indução as bactérias foram sedimentadas por

centrifugação a 6.000 rpm (rotor GS 3-Sorvall) 20 min, à temperatura ambiente.

2.13 PURIFICACAO DO hTRα2LBD

Após a sedimentação, o sedimento proveniente de cada litro de cultura foi

ressuspendido num volume de 20 mL de solução TST (50mM Tris-HCl pH 8,0; 150 mM

NaCl; 0,05 % Tween20; 20 mM β-mercaptoetanol). Sonicou-se o material re-suspendido

28

por três ciclos de trinta segundos, com um intervalo de um minuto entre os ciclos a

temperatura ambiente. Em seguida, centrifugou-se a 14.000 rpm (rotor SS 34-Sorvall) à

temperatura ambiente. O clarificado foi aspirado e descartado. O sedimento foi novamente

re-suspendido (bruscamente) em vortex em tampão A (50 mM Tris-HCl; 2 mM β-

mercaptoetanol,pH-8,0), o material foi novamente centrifugado nas mesmas condições e o

produto da lavagem foi descartado. Em seguida, o sedimento foi re-suspendido via vortex

em tampão B (8 M Uréia; 50 mM Tris-HCl; 10 mM β-mercaptoetanol, pH 8,0), quando o

sedimento estava completamente homogêneo este foi submetido a mais 8 h de agitação

constante a temperatura ambiente. Após este período o material foi novamente centrifugado

sob as mesmas condições descritas acima. Após a centrifugação o sobrenadante foi

aspirado e o sedimento restante foi descartado.

2.14 TROCA IÔNICA

A coluna aniônica (Hiload 16/10 Q-SepharoseTM) foi equilibrada com o tampão B

(8 M Uréia, 50 mM Tris-HCl; 10 mM β-mercaptoetanol, pH 8,0). Toda a proteína oriunda

da extração da protéica previamente filtrada (50mL) foi injetada em um único passo na

coluna e eluída num fluxo contínuo de 1,0 mL/min por gradiente salino que atingiu 100 %

em 2 h, com tampão C (8 M Uréia; 50 mM Tris-HCl; 10 mM β-mercaptoetanol; 1 M NaCl;

pH 8,0) quando o gradiente atingiu 33 % a proteína foi eluída. As alíquotas com a proteína

foram coletadas para o processo de re-enovelamento.

29

2.15 RE-ENOVELAMENTO

Iniciou-se então o processo de re-enovelamento. A proteína foi submetida a

sucessivas etapas de diálise (em membrana de celulose) para retirada completa da uréia. O

Receptor hTRα2LBD foi transferido para um saco de diálise num volume de 10 mL sendo

em seguida dialisado contra um volume de 2 L que segue a seguinte regra: a cada duas

horas o tampão do Becker, (HEPES 10 mM pH-7,0; 100 mM de NaCl e 3 mM de DTT) foi

trocado, num primeiro momento a concentração de uréia era de 8 M na solução da proteína,

após 2 h de diálise passava a 4 M, e finalmente a 2 M o que perfazia um total de 4 h. Após

esta etapa, um sistema de bomba peristáltica com mangueiras plásticas foi montando num

Becker de 200 ml num fluxo contínuo onde 2 L de tampão foi gotejado “overnight” na

parte superior do Becker e uma segunda mangueira que foi posicionada no fundo do Becker

retirava a solução via bomba peristáltica até retirada completa da uréia. Após o término das

diálises, a solução tampão final onde se encontrava a proteína apresentou-se completamente

livre de uréia.

2.16 RESULTADOS E DISCUSSÃO hTRα2LBD

2.17 SUBCLONAGEM DO hTRα2LBD.

Abaixo pode-se observar o gel (A) da amplificação por PCR ( polymerization chain

reaction) do hTRα2LBD (figura-10). Após amplificação, obteve-se quantidade de inserto

suficiente para inserção no vetor de clonagem pGEMT-easy vector (Promega). Decidiu-se

adotar esta estratégia pois ela permitia a transferência do hTRα2LBD de maneira mais

30

eficaz no vetor de expressão pET28a(+). No gel (B) (figura-10) pode-se observar a

liberação dos insertos do hTRα2LBD clonado em pGEMT (poços 1 e 3) e do hTRα1LBD

proveniente do vetor pET28a(+) (poço 7). Como pode ser visto, o inserto do hTRα2LBD

apresenta o tamanho esperado de 1026 pb enquanto o do hTRα1LBD de 786 pb. Este

resultado confirmou a clonagem do hTRα2LBD no pGEMT .

No gel da figura-11 tem-se o resultado positivo da subclonagem do hTRα2LBD em

pET28a(+). A confirmação definitiva da clonagem do hTRα2LBD no pET28a(+) só foi

obtida após seqüenciamento dos clones e verificação de ausência de qualquer mutação.

(A) (B) pb 1 2 3 4 5 pb pb 1 2 3 4 5 6 7

Figura-10. Géis de 1% agarose. (A) Amplificação por PCR do domínio de ligação ao ligante de hTRα2. (pb) 1 Kb Plus DNA Ladder; Poços (1-5) amostras do produto da amplificação por PCR do hTRα2LBD, seta mostra amplicon de 1026 pb correspondente ao LBD de hTRα2. (B) Digestão com enzimas de restrição do hTRα2LBD subclonado em pGEMT. Marcador(pb) 1 Kb Plus DNA Ladder, inserto de 1026pb; A seta mostra um inserto de 786 pb correspondente ao LBD de hTRα1 utilizado como parâmetro de avaliação. 1 pb

1026pb

Figura-11. Gel de 1% agarose da subclonagem do hTRα2LBD. Marcador(pb) 1 Kb Plus DNA Ladder; Poço 1 liberação do inserto do hTRα2LBD do pET 28a(+) após digestão com enzimas de restrição.

1026pb 1026pb 786pb

31

2.18 EXPRESSÃO DO hTRα2LBD

A expressão em fração solúvel do hTRα2 mostrou-se extremamente problemática.

Mesmo tentando-se variar todas as condições possíveis como temperatura, concentração de

IPTG, inclusive estratégias como adição de detergentes, nenhum resultado positivo

significativo foi obtido. Em compensação a quantidade de proteína expressa era bastante

significativa, quando comparada com o hTRα1LBD, como pode ser observado no gel A que

mostra o extrato bruto de algumas condições testadas (figura-12), na figura (B) observa-se

também o extrato bruto resultante de teste de indução para seleção das colônias que

apresentaram expressão dentre as colônias bacterianas testadas. No poço 9 tem-se uma

amostra pura de hTRα1LBD (33 kD) para fins de comparação com hTRα2LBD expresso

(39 kD).

(A) (B) M 1 2 3 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura-12. SDS-PAGE. (A) Expressão de TRα2LBD. (M) Marcador de peso molecular; Poços (1-3) extrato bruto do hTRα2LBD expresso a 37 0C, seta mostra a proteína recombinante de 39 kD. (B) Extrato bruto de diferentes colônias de hTRα2LBD na busca das colônias que apresentam expressão da proteína recombinante de 39 kD (poços 1 e 2); No poço 9 hTRα1LBD purificada para comparação com hTRα2LBD.

33k39k 39k

66kDa 45kDa

29kDa

22,1kDa

14,2kDa

32

2.19 EXTRAÇÃO PROTÉICA

Devido ao fato da alta instabilidade do hTRα2LBD por conta de sua

hidrofobicidade, foi necessário o desenvolvimento de uma metodologia alternativa de

extração protéica. Embora o receptor possuísse calda de histidina, só através de uma

metodologia de extração desnaturante houve condições de extração da proteína

recombinante sem ter que retornar ao passo de sub-clonagem.

O SDS-PAGE da figura-13 mostra o resultado do processo de lavagem com tampão

A do “pellet” contendo hTRα2LBD, poço 2. Já no poço 3 uma alíquota com o material

ressuspendido em tampão B mostra a solubilização imediata dos corpos de inclusão

contendo hTRα2LBD, o que fica mais evidente após 8 h de extração com o mesmo tampão.

M 2 3 4

39k

Figura-13.SDS-PAGE. Extração com uréia da hTRα2LBD. (M) Marcador de peso molecular; No poço 2 amostra da lavagem do sedimento; No poço 3 amostra após ressuspender o sedimento em tampão B contendo uréia; No poço 4 alíquota após 8h de extração com tampão B contendo uréia.

66kDa

45kDa

29kDa

22,1kDa

14,2kDa

33

2.20 TROCA IÔNICA

O gel das alíquotas oriundas da coluna de troca iônica pode ser visto na figura-14.

Após a cromatografia por troca iônica observou-se que a proteína possuía um estado de

pureza razoável sendo possível a sua utilização em ensaios de cristalização uma vez re-

enovelada. Por conta deste resultado decidiu-se fazer o re-enovelamento via extração da

uréia. A proteína recombinante pós-diálise se mostrou solúvel, um resultado bastante

animador frente às diversas dificuldades encontradas até o momento no estudo do

hTRα2LBD. Este dado juntamente com a experiência com o hTRα1LBD mostra que uma

gel filtração seria um passo adequado a ser feito com a hTRα2LBD solúvel, antes de se

iniciar os estudos de cristalização.

M 1 2 3 4

39k

Figura-14-SDS-PAGE. Purificação de hTRα2LBD através de cromatografia de troca iônica. (M) marcador de peso molecular; Poços (1-4) diferentes frações contendo hTRα2LBD recombinante de 39 kD, seta preta.

66kDa

45kDa

29kDa

22,1kDa

34

3O CAPÍTULO: CRISTALIZAÇÃO

3.1 CRISTAIS

Para a obtenção de cristais, deve-se respeitar uma série de pré-requisitos.

Principalmente partindo-se do pré-suposto de que um cristal apresenta uma ordem bem

definida e periódica em sua estrutura interna.

Logo deve-se inferir de maneira bem apropriada a seguinte questão: Porque um

sistema de uma solução de proteínas cristaliza, já que é constituído de elementos

assimétricos que espontaneamente diminui seus muitos graus de liberdade e arranja-se com

alta precisão numa rede fixa? Tal fenômeno aparentemente contradiz fortemente a teoria da

entropia. A cristalização de macromoléculas de uma solução é um fenômeno de equilíbrio

reversível e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos dependem das propriedades físicas e

químicas das soluções envolvidas. Sob certas condições de supersaturação o sistema é

encaminhado ao estado de equilíbrio no qual o soluto está entre uma fase sólida e uma

solúvel. Deve-se observar que neste caso a entropia do sistema vai diminuir, o que será

compensado pela formação de interações químicas novas e mais estáveis. Observa-se então

que a energia livre do sistema diminui favorecendo o processo de ordenamento das

moléculas. Pode-se dizer desta maneira que a proteína cristaliza porque sua energia livre

diminui, pois o número de interações atrativas aumenta e o de interações repulsivas diminui

viabilizando a cristalização em concordância com a entropia.

35

3.2 SOLUBILIDADE

A solubilidade de qualquer tipo de molécula (soluto), está intimamente vinculada a

sua natureza. A sua identidade implica numa maior ou menor capacidade de interagir com

as moléculas do solvente, o que nos remete às características de polaridade do soluto em

questão. De um modo geral quanto maior a semelhança na polaridade de um soluto com um

solvente, maior será a sua solubilidade, pois haverá uma maior interação, seja ela do tipo

dipolo-dipolo, dipolo induzido ou outra natureza de interação. No caso da água como

solvente, por exemplo: moléculas de água fazem interação do tipo dipolo-dipolo, com a

superfície do soluto, formando uma camada de revestimento (camada de solvatação), em

volta do soluto interagindo com este e também com outras moléculas de água. Desta forma

o soluto é solvatado. A alta constante dielétrica da água, também contribui para a

solubilidade e permite a separação de íons carregados. Por sorte as proteínas apresentam

uma estrutura bem definida que contém grupos polares e apolares. Suas propriedades de

solubilidade podem ser caracterizadas e reproduzidas. Pode-se considerar a proteína como

um grande íon polivalente e discutir sua solubilidade em termos da teoria de Debye-Huckel,

que foi desenvolvida para descrever as propriedades de íons pequenos, que considera a

proteína como se possuísse uma carga centralizada e não distribuída, conforme mostra a

(figura 15).

36

Figura -15. Distribuição de cargas e regiões hidrofóbicas sobre a superfície de uma proteína.

Na maior parte da discussão, as moléculas de proteínas são consideradas como

estando em uma solução. Isto ignora um aspecto muito importante; a solubilidade é

dependente de um equilíbrio termodinâmico entre os estados sólido e líquido,

conseqüentemente, a solubilidade dependerá da natureza do estado sólido.

O que se deseja é encontrar em que situação, partindo-se de uma solução de

proteína, consegue-se obter um cristal. (Figura-16)

Figura-16. Diagrama de fase onde se mostra a solubilidade da proteína (concentração de precipitante X concentração de proteína) onde ocorre a formação de cristais.

37

3.3 FORÇA IÔNICA

A teoria de Debye-Hükel reconhece que, o modelo iônico simples era insatisfatório

na descrição das propriedades de eletrólitos exceto em soluções muito diluídas. Como a

concentração de íons é aumentada, uma “atmosfera” de íons de cargas opostas tende a

formar-se em torno de cada íon. A atmosfera iônica muda, a interação dos íons com as

moléculas da água, portanto modifica a solubilidade.

A concentrações iônicas baixas, o efeito da atmosfera iônica provoca um aumento

na solubilidade bem como aumenta as possibilidades para interações favoráveis com as

moléculas de água. Isto mostra que íons de carga maior podem efetivamente modificar a

solubilidade. Um aumento da solubilidade a baixas forças iônicas é característico da

maioria dos íons sendo comumente encontrado nas proteínas, que são mais solúveis na

presença de uma pequena quantidade de eletrólitos do que em água pura. O fenômeno é

conhecido como “saltig-in”, com o aumento da força iônica, os íons adicionados, começam

a competir um com o outro e com o soluto pela água que rodeia. A remoção resultante das

moléculas de água do soluto começa a diminuir a solubilidade. A diminuição na

solubilidade a altas forças iônicas é denominada de “salting-out” que é proporcional à força

iônica. O fenômeno de “salting-out” é observado para todas as espécies solúveis em água,

sendo estas íons, moléculas orgânicas, gases ou proteínas.

É claro que a teoria de Debye-Huckel não explica completamente a solubilidade das

proteínas. As proteínas são muito maiores que a maioria dos íons, e tem padrões de carga

da superfície que não estão relacionados com sua carga líquida. Diferentes íons podem

afetar a solubilidade de uma proteína de maneira diferente.

38

3.4 pH E ÍONS

Tem-se considerado, a proteína como uma espécie carregada, com uma valência

fixa líquida, isto é claramente incorreto.

Pode-se modificar carga líquida adicionando-se ou removendo-se prótons, isto é

mudando o pH da solução ou ligando especificamente, íons a grupos polares da proteína.

Geralmente a proteína é mais solúvel quanto mais carga líquida contém. O ponto de menor

solubilidade ocorre quando a carga líquida é zero. Isto porque os íons podem se empacotar

numa forma sólida e interagir eletrostaticamente sem acúmulo de carga líquida de alta

energia. O ponto de carga nula é o ponto isoelétrico (pI).

Um controle adequado do pH durante a cristalização é condição necessária para

obtenção de cristais. Para o controle do pH, faz-se uso de soluções tampão, as quais devem

manter o pH num patamar ótimo para cristalização o que ocorre normalmente nas

imediações do pI.

3.5 TEMPERATURA

Muitos dos fatores que governam a solubilidade, tem uma acentuada dependência

da temperatura.

A constante dielétrica diminui com o aumento da temperatura e os termos da

entropia na energia livre da solução tendem a dominar os termos da entalpia. Portanto não é

surpreendente que, o coeficiente de temperatura da solubilidade, varie de proteína para

proteína, com condições tais como força iônica e pH. A altas forças iônicas, a maioria das

proteínas são menos solúveis a 250C do que a 40C. Como exemplo pode se observar o caso

39

de uma proteína numa solução de sulfato de amônia, onde a solubilidade por conta do

aquecimento da solução às vezes diminui 10X. Ocasionalmente as proteínas, mostram uma

solubilidade mínima à 250C, freqüentemente, o coeficiente de temperatura é positivo numa

baixa força iônica a solubilidade aumenta com a elevação da temperatura. Na água pura o

coeficiente de temperatura é positivo para a maioria das proteínas. Generalizações para o

coeficiente de temperatura, para as proteínas são difíceis, uma elevação ou redução na

temperatura pode levar uma proteína à saturação, o que depende da proteína e das

condições experimentais.

3.6 CRESCIMENTO DE CRISTAIS A PARTIR DE UMA SOLUÇÃO

Para se propiciar o crescimento de cristais de qualquer composto, as moléculas devem

ser levadas à supersaturação, (estado termodinamicamente instável), (figura-16) que pode

resultar numa fase cristalina ou amorfa, quando retorna ao equilíbrio. A supersaturação

pode ser atingida pela evaporação lenta, ou pela variação de parâmetros tais como: força

iônica, pH, tipo de íon e concentração de solvente orgânico estas propriedades podem ser

usadas para reduzir a solubilidade da proteína, de tal modo que a solução pode tornar-se

saturada ou supersaturada. A supersaturação é um estado metaestável, sua conversão ao

estado mais estável é cineticamente controlada. Uma solução supersaturada, eventualmente

dá origem a núcleos cristalinos, alguns dos quais crescerão e se tornarão cristais maiores, o

processo pode ser separado em 3 estágios.

Nucleação

Crescimento

Cessação do crescimento

40

3.7 TÉCNICA DE CRISTALIZAÇÃO

Atualmente existem vários métodos para a obtenção de cristais de proteínas. O mais

utilizado dentre eles é o hanging drop (gota pendurada)28que é uma técnica de difusão de

vapor (foi a técnica utilizada neste trabalho para obtenção dos cristais). Normalmente parte-

se de uma gota que possui um volume em torno de 2-10 µl de proteína que é misturada de

um modo geral em igual volume ao da solução de cristalização (tampão, sal e precipitante).

A mistura (proteína + solução do poço) (figura-17) é colocada sobre uma lamínula

siliconizada, em seguida a lamínula é invertida e colocada sobre um poço contendo um

reservatório 500-1000µl de solução de cristalização. Este poço possuí graxa de vácuo na

extremidade, que em contato com a lamínula sela a saída do poço evitando que a

concentração no interior deste sistema possa variar(figura-17).

Figura-17. Figura esquemática do sistema utilizado na técnica de “hanging drop”(gota

pendurada).

A diferença de concentração entre o precipitante na gota e o reservatório após um

certo tempo tende a um equilíbrio que é estabelecido através da difusão de vapor do meio

menos concentrado (gota) para o mais concentrado (poço). Este equilíbrio é atingido

41

quando os gradientes de concentração se equalizam tanto na gota como no poço, o que leva

alguns dias29,30.

3.8 METODOLOGIA

3.9 CRISTALIZAÇÃO DO hTRα1LBD

A técnica utilizada para a cristalização foi a de gota pendurada descrita

anteriormente28. Antes da realização dos ensaios de cristalização propriamente dito, existe

uma rotina de preparação que incluí; preparação das caixinhas com graxa de vácuo,

homogeneização das soluções de agente precipitante, equalização da temperatura tanto das

soluções de agente precipitante (fatorial) como da proteína com à temperatura de estudo.

Após o término dos ensaios de cristalização todas as caixinhas preparadas eram embaladas

em papel alumínio visando à proteção contra a luz, dado ao fato de que a maioria dos

ligantes eram foto sensíveis. Após 12 h todas as caixinhas preparadas eram analisadas em

microscópio.

Utilizou-se inicialmente e sistematicamente os kits Cristal Screen I e II, Grid Screens

NaCl, MPD, PEG, NH4SO4 (Hampton Research), contra as solução de proteína, padrão

(proteína a 10mg/mL +10mM HEPES pH-7; 600mM de NaCl). Como ponto de partida dos

estudos de cristalização, utilizou-se o receptor na forma holo complexado com T3.

A condição mais promissora se encontrava no kit Cristal Screen I, solução no7, que

já havia sido previamente observada na literatura31. A partir deste momento a condição no7

que continha: 1.4 M acetato de sódio tri-hidratado (NaH3OAc) e 0.1 M cacodilato de sódio

(NaCac) pH 6.5, foi aberta e melhorada sistematicamente, até o surgimento dos primeiros

42

cristais coletáveis. Para a obtenção dos primeiros cristais, variou-se neste processo não só a

concentração das soluções do precipitante, bem como as concentrações de proteína (com

alto grau de pureza, pós-gel filtração), temperatura: ambiente, 4oC e 18oC (que são hoje

disponíveis no IFSC). As melhores condições foram: 0,1M Cacodilato de Sódio, pH 7.0,

7.2, 7.5, 7.8 e 8.0 e 8,5, as concentrações de Acetato de Sódio foram: 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.3 e

1.4M.

Após atingido sucesso na cristalização do hTRα1LBD com T3. Utilizaram-se as

mesmas condições de cristalização previamente selecionadas com o T3 para os ensaios de

cristalização com o mesmo procedimento para os ligantes: TRIAC(3,5,3’-triiodothyroacetic

acid), T4 e GC-1[3, 5- dimetil-4-(4’-hidroxi-3’-isopropilbenzil)-acetato de fenoxi]. Os

resultados foram positivos salvo as suas respectivas peculiaridades discutias na seção de

resultados.

3.10 RESULTADOS E DISCUSSÃO (hTRα1LBD)

Após o uso de todos os Kits mencionados na metodologia. Observou-se que em

algumas condições com o receptor no estado holo, existia o aparecimento de sinais claros

de um indício do início do processo de cristalização. Resultados tais como esferulitas,

mudanças de fase (figura-18) além de que em muitas condições observou-se o surgimento

de micro-cristais. As condições onde houve o surgimento de micro-cristais não foram

estudadas, pois como em muitos casos existe o aparecimento de micro-cristais de sal e por

inspeção visual é impossível distingui-los (dado ao reduzido tamanho por difração de raios-

X, não há possibilidade de testá-los) optou-se por explorar condições mais promissoras.

43

Figura-18. Primeiros resultados obtidos após realização dos ensaios de cristalização. Em A foto

de esferulitas e em B foto de uma mudança de fase.

Normalmente, quando num primeiro momento não se possui nenhuma informação

prévia da literatura de alguma proteína correlata cristalizada e quando num primeiro teste

de cristalização não se obtém um cristal difratável (fenômeno raro em cristalização de

proteínas) opta-se, pelo desenvolvimento de condições onde as mudanças de fases são

visíveis como na figura-18, (onde num experimento de cristalização de proteínas

seguramente tal fenômeno só ocorre com proteínas, pois os sais não reproduzem o mesmo

fenômeno) o que não foi o caso do presente estudo para o hTRα1LBD. Pois já se conhecia

uma condição extraída da literatura31 onde cristais haviam sido obtidos, para receptores

holo com alto grau de identidade.

Vale a pena destacar que: diversas tentativas foram realizadas com a proteína

oriunda da coluna de gel filtração sem prévia troca do tampão. Só foi possível obter sucesso

na cristalização do hTRα1LBD holo quando o tampão em que a proteína se encontrava (gel

filtração) foi sucessivamente mudado e principalmente quando foi adicionado 600mM de

NaCl, demonstrando que neste receptor o fenômeno de “salting-out” possui marcada

importância na sua cristalização.

A B

44

De um modo geral cada caixinha de cristalização onde o resultado era positivo,

possuía uma quantidade altíssima de cristais. Algumas gotas possuíam mais de 30 cristais

viáveis.

Figura-19. Figura dos cristais coletados do hTRα1LBD complexado com T3 em A(grupo espacial C2), T3 em B(grupo espacial P212121 ), TRIAC em C (grupo espacial P212121) e GC-1 em D (grupo espacial P212121).

O tamanho dos cristais variava imensamente, normalmente possuíam 0.5 x 0.4 x

0.3 mm a 18oC e a 4oC eles possuíam sua maior dimensão variando em torno de 0.6-0.8mm

(figura-19). Os cristais obtidos do receptor no estado holo possuíam um tamanho maior e

melhor conformação quando crescidos a 4oC, salienta-se ainda que a quantidade de cristais

a 4oC era reduzida. No caso da primeira cristalização com T3 à 4oC obtiveram-se poucos

cristais por gota na maioria dos poços. O que fica obvio quando se pensa em consumo de

proteína versus crescimento do cristal. Para todos os cristais obtidos a 4oC, o grupo espacial

D C

B A

45

sempre era o mesmo P212121, o que evidencia a importância da temperatura na condução da

cristalização. A 18oC Encontrava-se mais de um grupo cristalino, o grupo C2, que foi

verificado tanto para os ligante T3 como GC-1.

O tempo de crescimento dos cristais do hTRα1LBD holo era em torno de 12-24

horas sendo que quando a temperatura de cristalização era de 18oC, em torno de 5minutos

podia-se observar nitidamente a formação dos primeiros núcleos cristalinos crescendo no

microscópio. Tal fato permitiu um amplo estudo dos melhores volumes de precipitante

versus volume de solução de proteína a serem utilizados em cada ensaio. Determinou-se

que quando a cristalização era realizada com T3, a melhor relação entre volume de

proteína(10mg/mL) e agente precipitante era de 1/1µL respectivamente; no caso do TRIAC

1/0,5 µL; quando o ligante era GC-1 a melhor proporção foi de: 1/0,25 µL; quando tentou-

se cristalizar com T4 1/1 µL. Como o T4 sofre foto decomposição, um grande problema era

observado pois uma parte do T4 se convertia a T3, como o T3 possuí maior afinidade pelo

sítio de ligação que o T4 o resultado obtido era sempre T3 ligado. Existia também um

aspecto negativo: embora os cristais crescessem rapidamente em todas as temperaturas

estudadas, os mesmos também morriam muito rapidamente. Cerca de 4 dias após a

maturação do cristal, este começava a se deteriorar e no quinto ou sexto dia, pós

cristalização, este estava completamente inválido para difração, muitas vezes se tornavam

uma película no fundo da lamínula. Por conta deste problema assim que se completava 24h

pós-ensaio de cristalização, ou se congelava e estocavam-se os cristais em nitrogênio

liquido ou estes estariam imprestáveis aos estudos cristalográficos (figura-20).

46

Em relação à seletividade dos ligantes. O T3 não possui seletividade entre as

isoformas α e β dos receptores de hormônio tireoidiano. O TRIAC possui maior afinidade

pelos receptores tireoidianos que o T3. O TRIAC também possui um menor tempo de

residência nos receptores nucleares que o T3 e uma menor meia vida plasmática. Sabe-se

que o TRIAC possui uma certa beta seletividade (se liga duas vezes mais fortemente ao

TRβ1 do que ao TRα1). O GC-1 é um ligante sabidamente desenvolvido para ser β

seletivo31,32.

No caso dos ensaios de cristalização do hTRα1LBD apo. Diversas tentativas foram

realizadas com todos os kits disponíveis e na totalidade dos experimentos realizadas a

maioria dos resultados observados era proteína precipitada (figura-21 A). O melhor

resultado obtido com o receptor apo foi apresentado na condição 9 : 0,2M de acetato de

amônio, 0,1M de citrato de sódio e 30% de peg 4000 do Cristal Screen I, o material

observado na foto era semelhante a um gel que estava aderido na lamínula, as tentativas de

melhoramento da condição não levaram a quaisquer resultados, (figura-21 B). Os

Figura-20. Representação do estados dos cristais (morte dos cristais) a partir do quarto dia após ensaio de cristalização.

47

resultados obtidos levam a uma clara observação, que a proteína no estado apo se encontra

instável. O que demonstra que antes da cristalização demandam esforços no sentido de

estabilização da proteína em solução, o que fica evidenciado em diversas etapas do

processo de purificação com obtenção de menor rendimento por conta de precipitação da

proteína em solução, além de altas quantidades de proteína que sempre ficam retidas na

membrana do concentrador no processo de concentração da proteína, o que não é verificado

para o receptor no estado holo.

Figura-21. Resultados obtidos nos ensaios de cristalização do hTRα1LBD apo. Em A foto da proteína precipitada, em B foto de uma espécie de gel formado que ficava aderida à lamínula, a foto B está em preto e branco para melhorar o contraste do objeto mostrado.

A B

48

4O CAPÍTULO - DIFRAÇÃO DE RAIOS-X E RESOLUÇÃO ESTRUTURAL

4.2 CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X

No corrente capítulo serão descritos alguns princípios básicos de cristalografia de

raios-X bem como a metodologia utilizada no experimento de difração, da coleta à

resolução e validação das estruturas estudadas. Abordagens detalhadas sobre cristalografia

de raios-X podem ser encontradas em diversos livros sobre o assunto na literatura

científica.

Como objetivo final do experimento de difração de raios-X em proteínas, espera-se

gerar um mapa de densidade eletrônica a partir das intensidades coletadas da difração de

raios-x por monocristal. No entanto no experimento de difração as fases das ondas

espalhadas são perdidas o que se conhece como o problema das fases. O mapa de densidade

é construído a partir do fator de estrutura que é uma grandeza física e pode ser definido

como:

F ( hkl ) = f j

j=1

N

e i hx ky lzj j j2 π ( )+ +∑(4.0)

onde: fj = fator de espalhamento do j-ésimo átomo

xj , yj , zj = vetor posição relativo do j-ésimo átomo

N = número de átomos na cela

h k l = índices de Miller associados aos planos

Em função da vibração térmica:

fi2

= exp(-2Bisen2θ/λ2).(fio)2

(4.1)

49

onde fio é o fator de espalhamento atômico47.

4.3 DIFRAÇÃO POR UM CRISTAL

Quando se submete um cristal de proteínas a um feixe de raios X, um grupo de

átomos (em uma certa orientação favorável) espalha os feixes e estes interagem

construtivamente produzindo o fenômeno da difração que gera um conjunto de

pontos(spots) que são registrados no detector, produzindo uma imagem de difração, como a

que pode ser observada na figura-22. Em seguida após uma rotação do cristal, um novo

grupo de átomos entrará em orientação e uma nova imagem será coletada.

O método mais utilizado para a coleta de dados de difração de raios-X em proteínas

é o método de rotação. A cada oscilação um grupo de planos entra em condição de difração

gerando uma imagem que será coletada via detector.

Figura-22. Fotografia de difração para um cristal real

50

4.4 A LEI DE BRAGG

A relação formulada por W.L. Bragg é conhecida como a lei de Bragg é a seguinte:

nλ = 2d (hkl) senθ (4.2)

Que nos permite prever onde ocorrerá difração num espaço monitorado, onde:

d é a distância entre os planos cristalinos; λ é o comprimento de onda dos raios-X; n é um

número inteiro chamado de ordem de reflexão; h, k, l são os índices de Miller da família de

planos.

Esta relação foi formulada por Lawrence Bragg considerando a difração como

sendo a conseqüência de reflexões de feixes de raios-X por planos (teóricos) de átomos

pertencentes à mesma família, ou seja, planos paralelos e equivalentes entre si. Os raios-X

penetram no cristal e um certo número de planos refletirão o feixe incidente, as ondas

interferirão construtivamente quando a equação (4.1) for satisfeita. Esta equação é satisfeita

quando o feixe incidente e os planos estiverem a um determinado ângulo θ, que é

conhecido como ângulo de Bragg.

Os raios espalhados por todos os átomos em todos os planos de uma mesma família

estão em fase quando a diferença de caminho for um múltiplo inteiro do comprimento de

onda λ da radiação incidente (interferência construtiva), formando um feixe difratado numa

determinada direção.

Em outras direções do espaço, os feixes espalhados estão fora de fase e anulam-se

uns aos outros (interferência destrutiva)33.

51

4.5 O PROBLEMA DA FASE

O objetivo final na determinação de estruturas é obter a distribuição da densidade

eletrônica na cela unitária, ou seja, as posições atômicas, partindo das intensidades

medidas. O que significa calcular a seguinte equação:

ρ π( ) ( ) ( )xyzV

F hkl ec h k l

i hx ky lz= ∑ ∑ ∑ − + +1 2(4.3)

Onde :

xyz - são as coordenadas fracionárias; Vc - volume da cela unitária (volume no espaço de

difração).

Através do procedimento experimental utilizado, é possível medir as intensidades

dos feixes difratados que são proporcionais ao quadrado dos fatores de estrutura. Como os

fatores de estrutura são quantidades complexas ao fazer o produto dele com o seu complexo

conjugado toda a informação sobre a fase do fator de estrutura é perdida, de modo que será

necessário algum método que permita recobrar as fases, e desse modo calcular a equação

acima, ou seja, encontrar a estrutura que deu origem ao conjunto de feixes difratados, em

posição e intensidade. Não existe uma solução geral para o problema, mas existem métodos

que podem ser aplicados com sucesso para a resolução deste problema, como os métodos

de substituição molecular (que foi usado no presente estudo na determinação estrutural),

substituição isomórfica múltipla, dispersão anômala múltipla e métodos diretos33.

52

4.6 SUBSTITUIÇÃO MOLECULAR

Substituição molecular (MR) é uma técnica para resolver o problema das fases. MR

pode ser usado para resolver uma estrutura quando se tem um bom modelo para uma fração

razoável da estrutura no cristal. Como a base de dados de estruturas resolvidas torna-se

cada vez maior, esse método será muito útil para uma grande quantidade de novas

estruturas. Certamente o método também é muito útil em estudo de ligações ou estudos de

complexos formados em proteínas previamente determinadas.

O nível de semelhança de duas proteínas depende da semelhança na seqüência de

seus aminoácidos e do enovelamento da proteína. O que significa que normalmente se pode

predizer a qualidade do modelo produzido por substituição molecular. Como uma regra

geral, o nível de semelhança na seqüência de aminoácidos de duas proteínas refletirá o

nível de semelhança no enovelamento das proteínas. Dessa maneira, a substituição

molecular provavelmente será falha se o modelo de referência possuir baixa homologia

com a seqüência da proteína em estudo ou se o modelo de referencia for incompleto.

4.7 CRIO CRISTALOGRAFIA

Com o advento da crio cristalografia tornou-se mais fácil o manejo de cristais.

Nessa técnica, os cristais são pescados da gota e imersos em solução com igual composição

na qual é adicionada uma substância chamada crio-protetora. Existem vários crioprotetores,

como: etileno glicol, glicerol, PEGs, etc. O cristal fica imerso nessa solução crioprotetora

por alguns segundos, sendo então colocado diretamente num feixe de nitrogênio líquido.

Assim o cristal sofre um congelamento ultra-rápido e inicia-se então a coleta dos dados de

53

difração. O congelamento dos cristais traz a grande vantagem de evitar a deterioração pelos

radicais livres que são formados pela interação dos raios X com a amostra. Isto possibilita

uma coleta completa de dados a partir de um único cristal e a manutenção da intensidade da

radiação difratada e permite melhorar todas as estatísticas durante a redução dos dados34.

4.8 METODOLOGIA

4.9 EXPERIMENTO DE COLETA DE DADOS DE DIFRAÇÃO

Os cristais foram retirados das soluções originais, em seguida mergulhados em outra

gota contendo uma solução onde a quantidade de matéria dos solutos foi mantida e o

volume de água foi alterado, 20% do volume de água da solução original foi subtraído e

substituído por etileno glicol. Após a transferência do cristal da gota mãe para a solução

crioprotetora, o cristal foi deixado por 1-3 minutos em repouso para que as moléculas de

etileno glicol pudessem penetrar no cristal via canais de solvente. Deve-se salientar também

que cristais de grandes dimensões devem ser submetidos há um tempo maior de exposição

à solução crioprotetora antes de serem congelados. O cristal é então congelado ultra

rapidamente na cabeça goniométrica, no corrente caso a temperatura durante toda a coleta

foi de 100K. Uma vez alinhado o cristal e determinada a estratégia de coleta, inicia-se então

a coleta de dados propriamente dita.

Os cristais obtidos do hTRα1LBD complexado com T3, T4,TRIAC e GC-1 foram

sucessivamente coletados pelo método de rotação, que consiste em girar o cristal ao redor

do eixo perpendicular ao feixe de raios X, o que corresponde a um deslocamento em graus

54

no ângulo φ. Esse deslocamento foi de 1° para os conjuntos coletados. Cada foto coletada é

uma seção de um grau do padrão de difração do cristal.

A indexação e integração das imagens foram realizadas pelo programa MOSFLM35. O

escalonamento e promediação dos dados coletados foram realizados no SCALA36 do CCP4

(Collaborative Computational Project Number 4, 1994). Após obtido o output final que

contém os índices de Miller (hkl), os módulos dos fatores de estrutura, |F(hkl)|, e suas

respectivas incertezas (σ(F)) para cada reflexão, calculadas a partir das intensidades

reduzidas, inicia o procedimento do faseamento.

O conteúdo de solvente na unidade assimétrica foi determinada utilizando-se o

programa Matthews_coeff 37.

O sistema utilizado para coleta de dados se encontra no Laboratório de

Cristalografia de Proteínas do Centro de Biotecnologia Molecular Estrutural -IFSC/USP.

Constituído de um gerador do tipo ânodo rotatório RIGAKU ultraX 18 com sistema de

aquisição MAR345dtb (placa de imagem), a um comprimento de onda de 1,5418 Å (Cu-

Kα).

4.10 RESOLUCAO ESTRUTURAL E REFIAMENTO DAS ESTRUTURAS

A estrutura do hTRα1LBD complexada com TRIAC foi resolvida em colaboração

com o Dr. Ricardo Aparício. A estrutura do hTRβ1LBD complexada com TRIAC foi

resolvida pela Dra. Sandra Martha Gomes Dias no seu doutorado em colaboração com o

Dr.André Luis Berteli Ambrosio e cedida gentilmente para a elaboração deste trabalho.

Dentre os cristais obtidos do hTRα1LBD complexado com os ligantes T3, T4, GC-1 e

TRIAC, só o complexo com TRIAC foi resolvido nesta tese os demais conjuntos de dados

estão sendo explorados pelo grupo.

55

Os parâmetros e estatísticas de refinamento das estruturas se encontram na tabela 1.

Para o faseamento utilizou-se a técnica de substituição molecular (MR, Molecular

Replacement). Como descrito acima, o MR utiliza informações de similaridade seqüencial

entre proteínas da mesma família, dado que em geral elas possuem um enovelamento

característico. O modelo da proteína é modificado de acordo com os mapas de densidade

gerados e a seqüência de aminoácidos da estrutura a se determinar.

A busca por soluções foi realizada no programa AMORE38 e o modelo empregado

para resolução das estruturas com TRIAC foi o TRβ1LBD complexado com T3, numa

resolução de 3.7Å (PBD ID 1BSX) embora existam outros PDBs de receptores de

hormônio tireoidiano já resolvidos como: 1NAV-A, 1Y0X-X, 1NQ1-A, 1NUO-A, 1R6G-

A, 1NQ0-A, 1NQ2-A, 1N46-B e 1Q4X-A . Após a obtenção inicial do conjunto de fases,

se faz necessário um refinamento de parâmetros utilizados para descrever o modelo. O

empacotamento das moléculas foi inspecionado manualmente e o modelo foi submetido a

refinamentos pelo algoritmo de máxima verossimilhança (Maximum Likelihood) com

fatores de temperatura isotrópicos utilizando-se o programa REFMAC (Collaborative

Computational Project Number 4). Vários ciclos de refinamento com alterações manuais do

modelo, foram feitos via inspeção visual dos mapas de densidade eletrônica 2Fobs - Fcalc,

αcalc, e Fourier diferença (Fobs - Fcalc, αcalc), usando o programa gráfico ‘O’39, alternados com

cálculos realizados após uma série intermediária de alterações para o refinamento das

posições atômicas.

Por conta da ocorrência de tendências (bias) nos modelos, quando estes estão sendo

refinados, é necessário o acompanhamento constante da qualidade do modelo.

A validação das estruturas, que permitem a verificação dos parâmetros e análise

dos modelos construído, no corrente estudo foi realizada no programa: PROCHECK40.

56

Tabela-1. Parâmetros e estatísticas de refinamento das estruturas.

hTRα1(LBD)+TRIAC hTRβ1(LBD) +TRIAC

Grupo espacial P212121 P3121

Parâmetros da cela unitária

a(Å) 60.01 68.795

b(Å) 80.82 68.795

c(Å) 102.39 131.032

α(0) 90 90

β(0) 90 90

γ(0) 90 120.00

Faixa de resolução (Å)

48.22-2.10 59.55-2.57

N0 imagens 291 160

N0 reflexões observadas 316,651 103,131

N0 reflexões únicas 28,288 11,371

Multiplicidade 10.6(6.0) 8.6(5.2)

Completeza(%) 99.8(98.1) 99.6(97.2)

Rsym a(%) 6.4(51.6) 6.6(47.6)

⟨I/σ(I)⟩c 23.02(2.52) 20.42(2.25)

Refinamento

Rfactor 19.4 19.4

Rfree 21.5 24.4

Moléculas de água 123 40

R.m.s desvios

Comprimento de ligação(Å) 0.037 0.021

Ângulos de ligação (0) 2.61 1.98

Média do B-factor(Å2) 46.2 49.6

57

4.11 RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.12 VALIDAÇÃO DAS ESTRUTURAS

Para cada estrutura foi realizada a validação do conjunto de dados com o programa

procheck. Segue abaixo o resultado.

FIGURA-23. Ramachandran plot do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC: onde 94% dos resíduos estão agrupados em regiões mais favorecidas e 6% em regiões permitidas. (Os ângulos Phi e Psi estão em graus).

58

FIGURA-24. Ramachandran plot do hTRβα1(LBD) complexado com o TRIAC: Onde 92.7% dos resíduos estão agrupados em regiões mais favorecidas e 5.9% em regiões permitidas. (Os ângulos Phi e Psi estão em graus).

Tabela-2. Parâmetros dos índices de qualidade das estruturas (Procheck). Parâmetros hTRα1(LBD) +TRIAC hTRβ1(LBD) +TRIAC Comprimento de ligações(%) dentro dos limites

99.3 98.7

Ângulos de ligações(%)dentro dos limites

98.7 96.8

Grupos Planares(%) 100 100 Fator de qualidade geral(%) 98.795 94.850

Observando-se a estéreo química e com base na análise dos dados da tabela-2 versus

Ramachandran plot para cada estrutura, observa-se que: o refinamento das estruturas foi

satisfatório e as estruturas apresentam uma boa qualidade.

59

4.13 ANÁLISE DOS SÍTIOS DE LIGAÇÃO

Observando-se os sítios dos receptores hTRα1LBD e hTRβ1LBD se constata uma

grande similaridade estrutural. A única diferença de resíduos observada é que a ASN 331

TRβ1 assume a mesma posição relativa da SER 277 do TRα1.

O Bolso de ligação pode ser dividido em duas partes uma hidrofílica que esta ligado

a interação dos átomos de oxigênio (1, 3 e 4) e uma hidrofóbica que está associada às

interações com os átomos dos anéis do ligante como fica claro observando-se as figuras 26

e 27.

O padrão de interação entre os ligantes nos dois receptores é semelhante. O que

dificulta a analise de seletividade. Analisando-se as ligações (tabela-3),

Tabela-3. Distancias das interações de hidrogênio para os receptores hTRα1 e hTRβ1 Receptor Átomos do ligante Átomos dos resúduos Dist(Å) hTRα1(LBD) +TRIAC O1 NE2/1- HIS-381 2.82 O3 NH1/1 -ARG-266 3.16 O3 N/1 -SER-277 2.83 O4 NH2/1 -W-52 2.43 O4 NH2/1-ARG-266 3.18 hTRβ1(LBD) +TRIAC O1 NE2/1-HIS-435 2.77 O3 NH1/1- ARG-320 3.06 O3 N/1- ASN-331 2.63 O4 NH2/1 -ARG-320 3.65

observa-se que o comprimento das interações também são semelhantes, salvo a ligação do

O4 nos receptores que possui uma diferença razoável em relação ao comprimento de

ligação, além da presença da água 52 no sítio do hTRα1(LBD). Tal fato poderia sugerir que

o TRIAC estaria mais fortemente ligado ao receptor hTRα1(LBD) do que ao hTRβ1(LBD)

60

(figuras 25 e 27), o que de certa maneira parece ser um contra-senso por conta de que é

conhecido da literatura que o TRIAC apresenta uma certa beta seletividade32. Desta forma o

que se pode observar é que entalpicamente o padrão geral de ligações com o TRIAC

aparentemente favorece o hTRα1(LBD). Porém a componente entalpica é apenas uma parte

da energia associada ao processo total de ligação do ligante ao sítio, já que em termos de

energia total de um processo termodinâmico, a energia do sistema é a energia livre de

Gibbs e que esta energia é a composição da contribuição entalpica somada a entrópica.

Neste caso em estudo a componente entrópica para a ligação do hTRβ1(LBD) com TRIAC

certamente domina o processo pois sabe-se que o TRIAC é beta seletivo, ou seja é

precisamente no termo entrópico que reside o favorecimento ou maior afinidade

(seletividade) da ligação do TRIAC com hTRβ1(LBD) desfavorecendo este processo para

hTRα1(LBD).

Outro fato interessante é que embora exceto a interação com a ARG-320 todas as

outras interações de hidrogênio com as cadeias laterais são mais curtas, indicando que estas

interações são mais fortes para o hTRβ1(LBD).

Desta forma decidiu-se utilizar a técnica de CD para estudar a estabilidade dos

ligantes, já que esta técnica sendo aplicada ao estudo do desenovelamento da proteína

poderia fornecer informações valiosas frente à estabilização da proteína pelos ligantes.

61

Figura-25. Sítio de ligação do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC em detalhe a densidade eletrônica do ligante em azul a 1.5 sigma.

62

Figura-26. Vista esquemática das interações do ligante (TRIAC), no sitio de ligação do hTRα1(LBD). Onde pode-se observar com clareza as interações do ligante.

2.82

63

Figura-27. Sítio de ligação do hTRβ1(LBD) complexado com TRIAC em detalhe a densidade eletrônica do ligante em azul a 1.5 sigma.

64

Figura-28. Vista esquemática das interações do ligante (TRIAC), no sitio de ligação do hTRβ1(LBD), onde pode-se observar com clareza as interações do ligante.

65

5O CAPÍTULO: DICROISMO CIRCULAR(CD)

5.1 DICROISMO CIRCULAR (CD)

O dicroísmo circular mede a diferença de absorção entre a luz polarizada à direita,

contra a luz polarizada à esquerda que surgem por conta da assimetria estrutural.

Num dado comprimento de onda(λ):

∆A = (AL - AR) (5.0)

Onde ∆A é a diferença entre a absorbância entre a luz circularmente polarizada a

esquerda e a direita.

A ausência de uma estrutura regular tem como resultado intensidade zero do

fenômeno de dicroísmo. Ao passo que estruturas ordenadas possuem sinal positivo e

negativo.

O CD é particularmente útil em:

Determinar se uma proteína se encontra enovelada

Caracterizar sua estrutura secundária e terciária.

Comparação das estruturas obtidas de uma proteína produzida por diferentes

fontes (sistemas de expressão).

Comparar estruturas de diferentes mutantes de uma mesma proteína.

66

Estudo conformacional da proteína sobre stress: estabilidade térmica, pH,

denaturantes, estabilidade frente à mudança de tampões e adição de

estabilizantes.

Estudos de reversibilidade térmica frente à proteína desenovelada.

Determinar se interações proteína-proteína ou proteína ligante alteram a

conformação da proteína.

5.2 DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DE UMA PROTEÍNA

POR CD

A estrutura secundaria pode ser estimada por CD no UV distante região espectral

de: 190-250nm. Nesta faixa de comprimento de onda os cromóforos respondem quando

situados num “fold” regular. α-hélice, folhas-β e enovelamento randômico possuem um

espectro de forma peculiar com suas características e magnitudes (figura-29). As frações

aproximadas de cada estrutura secundária de uma proteína podem ser estimadas pela

analise do espectro de CD. Estas aproximações podem ser realizadas graças à banco de

dados de diversas proteínas que são depositadas e possuem seu sinal catalogado neste

banco, que serve de parâmetro para os cálculos propostos.

Como todas as técnicas espectroscópicas CD é baseado numa média da população

das moléculas em estudo. Deste modo quando o CD puder determinar que uma certa

estrutura secundaria apresenta-se em 35% na proteína o CD não permite identificar a que

67

resíduos esta associada está dada conformação (α-hélice, folhas-β e enovelamento

randômico) (figura-29).

Figura-29. Gráfico que apresenta os espectros de CD para hélice α em vermelho, folha β em verde e seqüência aleatória ou randômica em preto, para uma cadeia polipeptídica.

5.3 ESTABILIDADE TÉRMICA

A estabilidade de uma proteína frente o aumento de temperatura pode ser estudada

via CD, porque alterações na estrutura secundária da proteína causam alterações na resposta

do sinal e estas alterações podem ser acompanhadas no espectro em geral com perda de

sinal frente ao aumento de temperatura. Em alguns casos um dado espectro na região do

UV próximo (250-350nm) ou distante pode ser acompanhado para diversas temperaturas.

Alternativamente um único comprimento de onda pode ser selecionado para

acompanhamento via variação de temperatura com o monitoramento de alguma

68

característica intrínseca (estrutural) da proteína em estudo. Em geral o CD é utilizado para

determinar em que grau o pH, tampões, sais, açucares e certos aditivos interferem na

estabilidade térmica da proteína. Muitas proteínas nas imediações do ponto de ebulição

precipitam e perdem seu enovelamento de forma irreversível. Um estudo do re-

enovelamento pode ser realizado pelo resfriamento gradativo, seguido de reaquecimento,

para que se possa observar se este processo é reprodutível e reversível.

Pelo acompanhamento no espectro na região do UV distante pode-se determinar

quando a proteína perde totalmente a estrutura secundaria o que é conhecido como

“melting” (desenovelamento) ou quando a conformação é alterada em só uma região da

proteína, o que pode implicar em alguns casos na mudança da estrutura secundária. Para

certas proteínas quando nativa e enovelada num arranjo de folhas-β após o “melting”, esta

proteína pode adquirir um enovelamento de hélice-α. Em muitas proteínas há a transição de

folhas-β para hélice-α.

Outro aspecto a salientar é que para a realização dos estudos de CD, os

requerimentos ao nível de quantidade de proteína não são muito altos. Soluções que

contenham entre 50 µg/mL a 1mg/mL são suficientes para a realização dos estudos. Deve-

se também utilizar um tampão que não possua alta absorção na região do espectro estudado,

além de altas concentrações de sal, histidinas, ou imidazol41,42.

5.4 METODOLOGIA

As medidas de CD foram conduzidas em colaboração com o aluno de doutorado

Rodrigo Villares Portugal.

69

As amostras do receptor de hormônio tireoidiano humano, domínio LBD nas

isoformas α1 e β1, complexados com os ligantes: T3,T4,TRIAC e GC-1, para as análises

em CD, foram preparadas e alíquotas no tampão: 20mM de HEPES, pH-8; 50mM de NaCl

e 5% de glicerol. Todas as alíquotas medidas se encontravam numa concentração de 5µM

de proteína contra uma concentração de 20µM dos ligantes. Ou seja, após a reação de

ligação, os ligantes se encontravam numa proporção de 3x em excesso a concentração

equimolar do receptor para as alíquotas em estudo. A reação de ligação entre ligante e

receptor foi realizada em câmara fria 40C sob agitação constante durante uma hora.

Em cada medida, 200µL da proteína complexada era introduzida numa cubeta de

quartzo e submetida a medição. A temperatura inicial da medida foi de 200C, após

equalização da temperatura da amostra no aparelho, iniciou-se o processo de aquecimento e

a cada minuto um espectro era coletado, no comprimento de (222nm), ou seja: optou-se por

acompanhar apenas uma região delimitada ao invés de plotar um espectro contínuo, a

variação da temperatura foi de um grau por minuto, este procedimento foi repetido até

800C. Ou seja, a variação da varredura da temperatura do experimento foi de 60oC.

As medidas foram realizadas no equipamento (Espectropolarímetro Jasco J-720

(Jasco - Japão)) equipado com controlador de temperatura.

Os dados coletados foram tratados e os parâmetros de energias foram calculados

utilizando o programa comercial SigmaPlot 2.0 (Jandel Scientific)43,44, com base na

entalpia de desenovelamento de van’t Hoff45.

As proteínas nas duas isoformas, α1 e β1 foram purificadas de acordo com o

protocolo de purificação descrito no capítulo 2. O hTRβ1LBD foi purificado e cedido pela

aluna de doutorado Ana Carolina Migliorini Figueira.

70

5.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Como pode ser observado analisando-se o gráfico de desnaturação dos ligantes e da

proteína no estado apo. Escolheu-se um comprimento de onda fixo (222nm) e procederam-

se os experimentos.

Para cara isoforma foi realizado o experimento de desenovelamento frente à

variação térmica em duplicata. Uma série de gráficos foram construídos exemplificando

este fenômeno, seguido de sua predição teórica (figuras 30-39). O processo de

desenovelamento pode ser acompanhado mais facilmente observando-se os dados da

tabela-4.

De um modo geral observa-se que as isoformas alfa e beta assumem um

comportamento peculiar a cada ligante no curso do seu desenovelamento (figuras 30-39).

Um comportamento particularmente semelhante no padrão de desenovelamento pode ser

observado nas duas isoformas sem ligantes (figuras 30 e 35).

Com base nestes gráficos de desenovelamento, calcularam-se os Tms (Temperatura

do meio da transição) e a entalpia aparente de van’t Hoff que se encontram dispostos na

tabela-5.

71

hTRα(LBD)-Apo

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60 70

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Medida-1Medida-2Predição teórica para a medida 1Predição teórica para a medida 2

Figura-30. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do

hTRα1(LBD). Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µM.

72

hTRα1(LBD)+T3

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60 70

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2



hTRα1(LBD) complexado com T3. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µM.

73

hTRα1(LBD)+T4

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60 70

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2




74

hTRα1(LBD)+GC-1

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60 70

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2



hTRα1(LBD) complexado com GC-1. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µM.

75

hTRα1(LBD)+TRIAC

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60 70

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2



hTRα1(LBD) complexado com TRIAC. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µM.

76

hTRß1(LBD)-Apo

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2



hTRα1(LBD)-apo. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µM.

77

hTRß1(LBD)+T3

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2




78

hTRß1(LBD)+T4

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2


Figura-37. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com T4. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µM.

79

hTRß1(LBD)+GC-1

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2


Figura-38. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com GC-1. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µM.

80

hTRß1(LBD)+TRIAC

Temperatura(oC)

20 30 40 50 60 70

Des

enov

elam

ento

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2


Figura-39. Espectro de CD a 222nm da curva de desenovelamento por temperatura do hTRα1(LBD) complexado com TRIAC. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e na abscissa a temperatura em (oC). Para uma concentração protéica total de 5µM.

81

Observando-se a curva de desnaturação da proteína no caso do hTRα1LBD-apo e

comparando-se com os valores descritos na tabela 4 pode-se observar que de 200C até

aproximadamente 430C a estrutura secundária se mantém. A partir de 440C. Até

aproximadamente 600C existe uma perda acentuada da estrutura secundária sem a formação

de estados intermediários, o que pode ser observado na curva de desnaturação para todos os

ligantes. (figura-40). Como pode se observar na figura-40 a presença de ligantes no

hTRα1LBD promove uma estabilização frente a variação de temperatura que é peculiar a

cada ligante e tal fato provoca um claro deslocamento nas curvas. Analisando-se os valores

da tabela e cruzando-se estas informações com os deslocamentos observados nas curvas do

hTRα1LBD pode-se inferir que existe uma certa ordem de estabilização crescente frente aos

ligantes, que seria:

T4 GC-1 T3 TRIAC

TRα1LBD 5mM

Temperatura (oC)

40 45 50 55 60 65 70

α

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

TR alpha LBD + T3 TR alpha LBD apo TR alpha LBD + TRIAC TR alpha LBD + GC1 TR alpha LBD + T4

Figura-40. Espectro da estabilidade térmica realizadas para o hTRα1LBD com e sem ligante. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e temperatura em (oC), na abscissa. Para uma concentração protéica total de 5µM.

82

Toda a metodologia empregada no hTRα1LBD foi repetida para o hTRβ1LBD.

Observando-se a curva de desnaturação da proteína no estado apo (figura-41.) e

acompanhando os dados da tabela-4, observa-se que o desenovelamento começa numa

temperatura de aproximadamente 440C e termina em 620C. Este perfil de desenovelamento

do hTRβ1LBD-apo difere para a proteína com T4. Quando o ligante é T3 já observa-se

também uma alteração maior do perfil. Para os últimos dois últimos ligantes GC-1 e

TRIAC registrou-se uma acentuada alteração no perfil de desenovelamento, sugerindo uma

maior resistência à perda de estrutura. No exemplo do hTRα1LBD havia uma ordem na

estabilização da proteína complexada frente a temperatura pela presença dos ligantes. No

presente caso existe uma alteração deste perfil pela estabilização dos ligantes que segue a

diante:

T4 T3 GC-1 TRIAC

TRβ1LBD 5mM

Temperatura (oC)

20 40 60 80

α

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

TR beta LBD + T3 TR beta LBD apo TR beta LBD + TRIAC TR beta LBD + GC1 TR beta LBD + T4

Figura-41. Espectro da estabilidade térmica realizada para o hTRα1LBD com e sem ligante. Tem-se na ordenada o grau de desenovelamento percentual ou perda de estrutura secundária(α) e temperatura em (oC), na abscissa. Para uma concentração protéica total de 5µM.

83

0 1 2 3 4 5 6

Ent

alpi

a ap

aren

te

de v

an't

Hof

f

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

∆ΗAlfa

0 1 2 3 4 5 6

Tm (o

C)

46

48

50

52

54

56

58

60

62

Tm-Alfa

0 1 2 3 4 5 6

Ent

alpi

a ap

aren

te d

e va

n't H

off

40

60

80

100

120

140

160

∆H-Beta

0 1 2 3 4 5 6

Tm(o

C)

48

50

52

54

56

58

60

62

64

Tm-BetaCol 1

0 1 2 3 4 5 6

Enta

lpia

apa

rent

e de

van

't H

offd

e

0

50

100

150

200

250

DH-Alfa1 DH-Beta1

0 1 2 3 4 5 6

Tm(o

C)

0

10

20

30

40

50

60

70

Tm-Alfa Tm-Beta

Figura-42. Histogramas das entalpias de van’t Hoff (A e C) e dos Tms (B e D). Em E as entalpias para as isoformas alfa e beta estão associadas e em F os Tms para as isoformas se encontram associados. (1, 2, 3, 4 e 5) Equivalem à proteína no estado apo e ligada a T3, T4, GC-1 e TRIAC sucessivamente.

A B

F E

D C

84

Observando-se atentamente a figura-42, pode-se perceber que os gráficos para A e

B possuem uma similaridade que não é casual, ou seja: existe uma correlação entre a

variação da entalpia aparente e a variação dos Tms, pois eles variam de forma semelhante.

Quando se analisam os gráficos C e D para a isoforma beta, pode-se observar que o

comportamento dos gráficos seguem a mesma tendência descritas anteriormente para os

gráficos A e B . O que demonstra que para os receptores de hormônio tireoidiano isoformas

alfa e beta a entalpia de desenovelamento acompanha o padrão da variação das

temperaturas médias de transição e que estas variações são semelhantes entre si. Tal fato

fica claro quando plota-se as entalpias e os Tms para as duas isoformas

separadamente(gráficos E e F da figura-42). Estes resultados sugerem que estas

correlações estão associadas a padrões de estabilidade e seletividade. Analisando-se o

conjunto de gráficos de A à F depreende-se que os processos são semelhantes e que a

energia de interação entre eles varia de acordo com os ligantes associados. Tal fenômeno

pode ser entendido a luz da seletividade dos ligantes.

Tabela 4 – Tabela das temperaturas do processo de desenovelamento, frente ao acréscimo de temperatura com seus respectivos Tms.

Receptor Ligante Início do desenovelamento em(oC)

Término do desenovelamento em(oC)

TM

hTRα1LBD - 44 60 52 T3 53 66 59,0 T4 44 62 55 GC-1 53 68 58,8 TRIAC 53 66 60,2 hTRβ1LBD - 44 62 52 T3 48 64 59.5 T4 46 63 56 GC-1 48 67 61,7 TRIAC 48 68 63

85

Observando-se todos os dados levantados até o momento fica estabelecida a importância

dos ligantes na estabilização dos receptores hTRα1(LBD) e hTRβ1(LBD). Quando se cruzam

os dados apresentados até o momento, versus o gráfico dos Tms agrupados para as duas

isoformas (fig-43), observa-se uma diferença visível no papel de estabilização da proteína

pelos ligantes frente a temperatura média de transição. Acompanhando a curva dos Tms

para o TRα1 observa-se que de um modo geral todos os ligantes estabilizam a proteína, só

que para os ligantes GC-1 e TRIAC não se observa grandes alterações da estabilização. Pois

eles se encontram mais ou menos num mesmo patamar de Tm para o T3, que não apresenta

seletividade para as isoformas. Mais quando observa-se estes ligantes para o TRβ1 fica claro

que o GC-1 e principalmente o TRIAC assumem um patamar distinto dos outros ligantes e

semelhantes entre si. Agregando-se a esta análise a já conhecida beta seletividade dos

ligantes GC-131 e TRIAC32 (para isoforma beta) da literatura pode-se dizer que estes dados

sugerem o papel do TRIAC como um ligante beta seletivo, já que uma maior seletividade

está associada a uma maior afinidade ou capacidade de interação pelo sitio de ligação e

teoricamente quanto mais fortemente ligado ao sítio de ligação maior será a estabilização da

proteína o que poderia ser acompanhada indiretamente por uma maior resistência ao

processo de desenovelamento que foi acompanhado pelos dados levantados via CD.

86

Tms para TRα1 e TRβ1

Alpha Tm Beta Tm

Tem

pera

tura

(o C)

52

54

56

58

60

62

64

Apo T3 T4 GC-1 TRIAC

Figura-43. Histograma dos Tms para hTRα1(LBD) e hTRβ1(LBD).

Tabela-5. das temperaturas médias (Tms) e entalpia (∆H) com suas respectivas incertezas.

hTRαLBD Apo T3 T4 Gc-1 Triac

Tm(AP)(oC)-erro 52± 0,1 59± 0,1 55± 0,5 58.8± 0,1 60,2± 0,1

∆H(AP) (kcal)-erro 140±10 213± 21 145±8 182±18 195±18

hTRβLBD

Tm(AP) (oC)-erro 52 ± 0,5 59.5± 0,9 56± 1,5 61.7±1,3 63± 0,7

∆H (AP) (kcal)-erro 73± 9 98±12 55±8 74±12 102± 16 (oC)-Temperatura em graus Celsius, (kcal)- Quilo caloria e (AP)-Aparente.

87

6o CAPÍTULO: CONCLUSÃO

6.1 CONCLUSÕES

Neste trabalho realizou-se a sub-clonagem do hTRα2LBD, desenvolveram-se os

protocolos de expressão purificação e re-enovelamento para o hTRα2LBD com produção de

proteína solúvel e em grande quantidade.

Desenvolveram-se também os protocolos de expressão purificação e cristalização

com diversos ligantes para o hTRα1LBD. As estruturas dos receptores foram resolvidas e

um estudo do padrão de ligação para determinação da seletividade do TRIAC foi realizado.

Estudos de CD foram realizados nas isoformas do hTRα1LBD e hTRβ1LBD com diversos

ligantes e em conjunto com os dados da estruturas conclui-se que foi possível explicar a

beta seletividade do TRIAC através observação do comportamento deste ligante frente ao

padrão de desenovelamento. Os dados estruturais e de CD para o hTRα1LBD e hTRβ1LBD

indicam que contribuiçâo entrópica é extremamente importante na explicação da beta

seletividade do TRIAC.

6.2 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS

Os estudos relativos ao hTRα2 LBD mesmo sendo ainda inconclusivos apresentam

uma boa possibilidade de sucesso, dado ao fato de que determinou-se as condições

necessárias para a produção solúvel da proteína em grandes quantidades. Sendo que como

próximos passos, estudos de CD e DLS (dynamic light scattering) devem ser desenvolvidos

como etapas prévias para determinação da estabilidade frente a tampões, adição de aditivos

88

e previsão dos estados oligoméricos antes do inicio dos estudos de cristalização

propriamente ditos.

O estudos sobre a seletividade do TRIAC para os receptores hTRα1LBD e

hTRβ1LBD possibilitou um maior entendimento do padrão das interações dos TRs.

A disponibilidade de estruturas dos receptores de hormônio tireoidiano possibilita

a realização de busca em banco de dados de compostos (virtual screening) com o objetivo

de encontrar novos ligantes para estes receptores. Também é possível utilizar ferramentas

de docking para gerar e estudar modelos de interação com o receptor. Técnicas de QSAR

(quantitative structure activity relationship) podem se beneficiar do alinhamento molecular

gerado por programas de docking utilizando as estruturas cristalográficas. Essas

informações podem auxiliar a melhor compreensão do modo de interação do receptor com

os ligantes e até mesmo na descoberta de novos ligantes.

Os resultados obtidos sobre os receptores hTRα1LBD e hTRβ1LBD contribuem

num âmbito geral para ampliação do conhecimento e entendimento sobre os receptores de

hormônio tireoidiano, tal conhecimento pode contribuir para o estudo e desenvolvimento

de tiromiméticos que possuem grande potencial no desenvolvimento de fármacos. Os

resultados produzidos nesta tese sobre o hTRα1LBD e hTRβ1LBD serão publicados na

forma de um artigo em revista especializada, que já está sendo escrito e será posteriormente

submetido.

De maneira complementar aos estudos de CD, pode-se desenvolver também

estudos de micro calorimetria, onde a energia de ligação pode ser medida diretamente.

Alguns trabalhos produzidos no decurso do doutorado se encontram nos anexos 1

e 2.

89

6.3 BIBLIOGRAFIA:

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46-Gronemeyer, H., J. A. Gustafsson, et al. (2004). "Principles for modulation of the

nuclear receptor superfamily." Nat Rev Drug Discov 3(11): 950-64.(referencia-figura) 47- Rossmann M.G and Arrold E.Y. International table of crystalography F, Ed-

Miller:56

93

ANEXO 1

crystallization papers

Acta Cryst. (2004). D60, 1867±1870 DOI: 10.1107/S0907444904017858 1867

Acta Crystallographica Section D

BiologicalCrystallography

ISSN 0907-4449

Crystallization and preliminary X-ray diffractionstudies of isoform a1 of the human thyroid hormonereceptor ligand-binding domain

F. M. Nunes,a R. Aparicio,a³

M. A. M. Santos,a R. V. Portugal,a

S. M. G. Dias,a F. A. R. Neves,b

L. A. Simeoni,b J. D. Baxter,c

P. Webbc and I. Polikarpova*

aInstituto de FõÂsica de SaÄo Carlos, Universidade

de SaÄo Paulo, Av. Trabalhador SaÄoCarlense 400,

SaÄo Carlos, SP, 13560-970, Brazil,bUniversidade de BrasõÂlia, Faculdade de

CieÃncias da SauÂde, LaboratoÂ rio de Farmacologia

Molecular, BrasõÂlia, DF, Brazil, and cUniversity

of California, Metabolic Research Unit, San

Francisco, USA

³ Current address: Universidade Estadual de

Campinas, Instituto de QuõÂmica, CP6154,

Campinas, SP, 13084-862, Brazil

Correspondence e-mail:

[email protected]

# 2004 International Union of Crystallography

Printed in Denmark ± all rights reserved

Thyroid hormone receptors (TR) play critical roles in virtually all

tissues. The TR ligand-binding domain (LBD) participates in

important activities, such as transcriptional activation and repression,

through conformational changes induced by hormone binding. Two

crystal forms of isoform 1 of the human thyroid hormone receptor

LBD (hTR1) in complex with the thyroid hormones T3 and Triac

were obtained. The hTR1±T3 complex was crystallized in a

previously unobserved crystal form (space group P212121, a = 59.98,

b = 80.80, c = 102.21 AÊ ), with diffraction patterns extending to 1.90 AÊ

resolution on a rotating-anode X-ray source, and in space group C2

(a = 117.54, b = 80.66, c = 62.55 AÊ , = 121.04), with data extending to

2.32 AÊ resolution. The hTR1±Triac complex was also crystallized in

the new space group P212121, with unit-cell parameters a = 60.01,

b = 80.82, c = 102.39 AÊ ; its resolution limit extended to 2.20 AÊ on a

home source. Phasing was carried out by the molecular-replacement

method and structural re®nement is currently in progress. The re®ned

structures may provide insight into the design of new thyromimetics.

Received 5 May 2004

Accepted 20 July 2004

1. Introduction

Thyroid hormone receptors (TRs), members of

a superfamily of eukaryotic transcription

factors, are ligand-activated transcription

factors that bind to thyroid hormone-response

elements (TREs) in the regulatory region of

target genes and mediate the biological effects

of thyroid hormones. The receptors exhibit a

modular structure with functionally separable

domains. The most highly conserved domains

are the DNA-binding domain (DBD) and the

ligand-binding domain (LBD) (Evans, 1988;

Laudet et al., 1992). The LBD participates in

several types of activity, including hormone

binding, homo- and/or heterodimerization,

molecular interactions with heat-shock

proteins and transcriptional activation and

repression (Tsai & O'Malley, 1994; Ribeiro et

al., 1995). Hormone binding induces confor-

mational changes which control these proper-

ties and in¯uence gene expression (Tsai &

O'Malley, 1994; Ribeiro et al., 1995). Therefore,

the three-dimensional structure of a liganded

LBD is critical for understanding the structural

mechanisms of hormone action.

Thyroid hormones, namely 3,5,30-triiodo-l-

thyronine (T3), 3,5,30,50-tetraiodo-l-thyronine

(T4) and 3,5,30-triiodothyroacetic acid (Triac),

play critical roles in the differentiation, growth,

metabolism and physiological function of

virtually all tissues. Two major subtypes of

thyroid hormone receptors (TR1 and TR2,

and TR1 and TR2) are encoded by two

different genes (Ribeiro et al., 1995). TR1,

TR1 and TR2 are ligand-binding isoforms of

TR, whereas TR2 does not bind thyroid

hormones. Differences in af®nity towards

thyroid hormones are observed amongst the

different ligand-binding isoforms. TRs mediate

distinct physiological effects owing to differ-

ences in tissue abundance and receptor-speci®c

activity (Forrest & VennstroÈ m, 2000). Studies

in patients with the syndrome of resistance to

thyroid hormones, in which abnormal TR is

present, and with TR1ÿ/ÿ mice suggest that

TR is the major TR regulating heart rate

(Johansson et al., 1998; Forrest & VennstroÈ m,

2000; Yen, 2001; Gloss et al., 2001). TR is

critical in controlling hepatic cholesterol

metabolism and thyroid-stimulating hormone

(TSH) suppression, which may be because of

the high expression of TR in liver (70±80% of

total TR) and pituitary (Schwartz et al., 1992;

WikstroÈ m et al., 1998; Gloss et al., 2001). In

particular, TR1 is widely distributed in the

tissues and regulates metabolic rate. Identi-

fying thyromimetics that interact selectively

with the isoforms TR1 and TR1 may be

crucial in treating important diseases such as

obesity and lipid disorders.

The available TR structural data include rat

TR1 LBD in complex with T3 (Wagner et al.,

1995) and Triac (Wagner et al., 2001) and

human TR1 LBD (hTR1) in complex with a

synthetic thyromimetic (Ye et al., 2003).

However, despite this previous work, the

structural basis for the selectivity of the TR


isoforms in thyroid ligand binding is not yet

well established. To further investigate the

molecular mechanism of hTR1 speci®city,

X-ray crystallographic studies were recently

initiated. In this work, we report the puri®-

cation, crystallization, data collection and

molecular-replacement solutions obtained

for hTR1 in complex with T3 and Triac.

Data to higher resolution than previously

published (Ye et al., 2003; Dow et al., 2003)

have been obtained, which is likely to be a

consequence of a different molecular

packing. These new studies may be impor-

tant for better understanding of the struc-

tural basis of TR isoform selectivity and for

the design of more potent isoform-speci®c

thyromimetics.

2. Materials and methods

2.1. Expression and purification

The human TR1 LBD construct

including amino-acid residues Glu148±

Val410 (NCBI protein accession No.

A40917) fused in frame to the C-terminus of

a polyhistidine (His) tag was expressed in

Escherichia coli strain B834 harbouring a

pET28a(+) plasmid (Novagen), as illu-

strated in Fig. 1. A Luria Broth [LB;

1.6%(w/v) tryptose, 1%(w/v) yeast extract,

0.5%(w/v) NaCl] starter culture was inocu-

lated with a single colony of an LB-agar

culture and grown overnight at 310 K. The

initial culture was inoculated at 1% in a

major LB culture and grown at 293 K in

kanamycin medium until the A600 nm reached

1.7. After this, isopropyl thio--d-galacto-

side (IPTG) was added to a concentration of

0.5 mM and culture growth was continued

for 6 h at 293 K.

The cells were harvested by centrifugation

and the pellet resuspended in 50 mM Tris±

HCl buffer pH 7.5 containing 150 mM NaCl,

0.05% Tween-20, 1 mM phenylmethyl-

sulfonyl¯uoride (PMSF) and 20 mM

2-mercaptoethanol. The culture was incu-

bated on ice with 0.5 mg mlÿ1 lysozyme and

disrupted by sonication. The lysate was

centrifuged for 20 min at 14 000 rev minÿ1

in a Sorvall SS34 rotor at 277 K and the

obtained supernatant was incubated for

30 min with a 20-fold molar excess of T3

(Sigma) or Triac (Sigma).

To purify the holo hTR1, the super-

natant was mixed with Talon Super¯ow

Metal Af®nity Resin (Clontech) and shaken

at 277 K for 1 h. The resin was washed twice

with 50 mM sodium phosphate buffer pH 8.0

containing 300 mM NaCl, 10% glycerol,

10 mM 2-mercaptoethanol, 25 mM imida-

zole, 1 mM PMSF and 0.05% Tween-20 and

twice with the same solution without Tween-

20. The protein was eluted in a single step

with 50 mM sodium phosphate buffer pH 8.0

containing 300 mM NaCl, 10% glycerol,

10 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM PMSF,

0.05% Tween-20 and 500 mM imidazole.

After the af®nity column, the fractions

were pooled and corrected for the conduc-

tivity of the initial phenyl solution. The

protein was applied onto a Phenyl 5PW 8/75

(TosoHaas) column pre-equilibrated with

20 mM Na HEPES buffer pH 8.0 containing

0.5 mM EDTA, 700 mM (NH4)2SO4, 3 mM

dithiotreitol (DTT). The column was washed

with the previous solution and eluted with a

90 min 0±100% gradient of 20 mM Na

HEPES buffer pH 8.0 containing 0.5 mM

EDTA, 20% glycerol, 10% acetonitrile,

3 mM DTT at 0.75 ml minÿ1. After this step,

the protein was loaded onto a HL Superdex

200 or 75 26/60 gel-®ltration column

(Amersham Bioscience) equilibrated with

20 mM Na HEPES buffer pH 8.0 containing

1 mM EDTA, 3 mM DTT, 0.01% Tween-20

and 200 mM NaCl. The protein recovered

was concentrated by ultra®ltration (Amicon

Ultra 10 kDa MWCO, Millipore), resus-

pended in a solution of 600 mM NaCl and

3 mM DTT and further concentrated to

10 mg mlÿ1.

The protein content and purity of all

chromatographic fractions were checked by

Coomassie Blue-stained SDS±PAGE. The

average yield of the protein was about 6 mg

per litre of culture, with purity higher than

99%. Protein concentrations were deter-

mined using the Bradford dye assay (Bio-

Rad) using bovine serum albumin as stan-

dard.

2.2. Crystallization

Initial crystallization conditions were

screened at temperatures of 277 and 291 K

by the sparse-matrix method (Jancarik &

Kim, 1991) using the macromolecular crys-

tallization reagent kits Crystal Screens I and

II (Hampton Research). In each trial, a

hanging drop of 1 ml of protein solution

containing either T3 or Triac (see x2.1) was

mixed with 1 ml precipitant solution and

equilibrated against a reservoir containing

500 ml precipitant solution. At both

temperatures, evidence for crystals was

found in Hampton Crystal Screen I solution

No. 07, formulated with 1.4 M sodium

acetate trihydrate (NaH3OAc) and 0.1 M

sodium cacodylate (NaCac) pH 6.5. For both

the T3 and Triac complexes, further optimi-

zation at 291 K led to crystallization condi-

1868 Nunes et al. hTR1 ligand-binding domain Acta Cryst. (2004). D60, 1867±1870

Figure 1Schematic diagrams of human TR1 (hTR1) and the construct used in the crystallographic experiments (hTR1construct), showing the N-terminal, DBD (DNA-binding), hinge (connecting region) and LBD (ligand-binding)domains. Numbers indicate the amino-acid positions in the receptors. The amino acids of the plasmid pET28a(+)that is coexpressed with hTR1 construct are shown.

Table 1Crystal parameters and data-collection statistics.

Values in parentheses refer to the last resolution shell

T3 complex Triac complex

Space group P212121 C2 P212121

Unit-cell parametersa (AÊ ) 59.98 117.54 60.01b (AÊ ) 80.80 80.66 80.82c (AÊ ) 102.21 62.55 102.39 () 121.04

Solvent content (%) 68.3 69.1 68.4ASU content (molecules) 1 1 1Resolution range (AÊ ) 31.47±1.90 (2.00±1.90) 19.92±2.32 (2.45±2.32) 48.22±2.20 (2.32±2.20)No. images 260 77 291No. observed re¯ections 323718 32461 267634No. unique re¯ections 39272 18188 26000Multiplicity 8.2 (7.8) 1.8 (1.7) 10.3 (11.0)Completeness (%) 98.7 (98.9) 83.7 (87.3) 100 (100)Rsym (%) 5.9 (38.3) 7.9 (37.5) 5.9 (37.5)hI/(I)i 7.8 (2.0) 7.7 (2.0) 11.2 (2.1)


tions similar to those reported for human

TR LBD complexes (Wagner et al., 2001).

A reservoir solution containing 1.0 M

NaCac and 0.1 M NaH3OAc pH 7.2 was

mixed with protein solution in equal

amounts and equilibrated against reservoir

solution at 291 K. Well formed crystals grew

within 12±24 h.

Two different crystal forms of hTR1 in

complex with T3 have been obtained

(Table 1). Crystals were grown under the

same crystallization conditions and exhib-

ited similar morphology (Fig. 2). In the case

of the hTR1±Triac complex, only crystals

belonging to the previously unobserved

space group P212121 were obtained, with

unit-cell parameters similar to those of the

corresponding crystal form of the hTR1±

T3 complex; however, they had a somewhat

different morphology (Table 1 and Fig. 3).

2.3. Data collection

X-ray diffraction experiments were

performed with a MAR Research

MAR345dtb image-plate detector mounted

on a Rigaku UltraX 18 rotating-anode X-ray

generator providing Cu K radiation

(1.5418 AÊ ), operated at 50 kV and 100 mA

and equipped with Osmic confocal Max-

Flux optics.

To prevent radiation damage, cryocrys-

tallographic techniques (Garman &

Schneider, 1997) were employed. Crystals

were brie¯y soaked in a cryoprotectant

solution containing 1.0 M NaCac, 0.1 M

NaH3OAc pH 7.2 and 20%(v/v) ethylene

glycol and rapidly cooled in a gaseous

nitrogen stream (Oxford Cryosystems).

Data were collected by the oscillation

method from single crystals maintained at

100 K during data collection. In all cases, the

oscillation range was 1, with exposure times

of 6 min (T3 complex, space group P212121),

15 min (T3 complex, space group C2)

and 20 min (Triac complex) per image

(Fig. 4).

A single data set was collected for each

crystal form of hTR1±T3. X-ray data for

the orthorhombic crystal were collected with

a crystal-to-detector distance of 150 mm,

giving an outer edge resolution of 1.86 AÊ .

For the monoclinic form, the crystal-to-

detector distance was set to 200 mm, with a

maximum resolution of 2.21 AÊ at the

detector edge. The hTR1±Triac data set

was collected using a crystal-to-detector

Acta Cryst. (2004). D60, 1867±1870 Nunes et al. hTR1 ligand-binding domain 1869

Figure 2Single crystals of hTR1 in complex with T3. Typicaldimensions are 0.5 0.4 0.3 mm.

Figure 3hTR1±Triac crystals measuring approximately0.5 mm in the longest dimension.

Figure 4A 1 oscillation frame from a cryocooled hTR1±T3 crystal. Diffraction spots with hkl indices (ÿ21, ÿ28, 1),(ÿ21, ÿ29, 1) and (ÿ22, ÿ31, 0) were marked at resolutions of 2.03, 2.00 and 1.88 AÊ , respectively. The resolutionat the edge of the image is 1.87 AÊ .

Figure 5Stereoview of the hTR1±T3 complex ligand-binding region. Initial 2Fobs ÿ Fcalc (blue) and Fobs ÿ Fcalc (red)electron-density maps were contoured at the 1.0 and 3.0 levels, respectively, around the model (C trace,coloured yellow). The ®gure unequivocally indicates the presence of the ligand. The drawing was prepared usingPyMOL (DeLano Scienti®c, San Carlos, CA, USA; http://www.pymol.org).


distance of 170 mm, with an outer edge

resolution of 2.00 AÊ .

3. Results and discussion

Data reduction was performed using

MOSFLM and SCALA (Collaborative

Computational Project, Number 4, 1994;

Winn et al., 1997). Crystal parameters and

data-collection statistics are summarized in

Table 1. The solvent content was calculated

using the total molecular weight of the

hTR1 amino-acid sequence in addition to

21 amino acids from the initiation codon,

yielding a polypeptide of 284 amino acids

(MW = 32 205 Da; Table 1). The correct

number of molecules present in the asym-

metric unit (ASU) was determined during

the molecular-replacement procedure.

Primary sequence search and sequence

alignments were performed using ENTREZ

and BLAST (Altschul et al., 1997). A

sequence identity of 83%, with 92% simi-

larity, resulted from the alignment of hTR1

(Nakai et al., 1988) and human TR(Weinberger et al., 1986; Sakurai et al., 1990).

Thus, chain A of the corresponding dimeric

X-ray structure (PDB code 1bsx; Darimont

et al., 1998) was used as a search model

(waters, the T3 molecule and a peptide

fragment of GRIP1, a coactivator, were

excluded from the search model). It is worth

noting that the recently reported thyroid

receptor structures (PDB codes 1nav and

1nax; Ye et al., 2003) could equally well be

used in this case.

Molecular-replacement calculations were

carried out using a resolution range of 10.0±

4.0 AÊ and default parameters in the program

AMoRe (Navaza, 1994; Collaborative


Winn et al., 1997). In all cases, clear solutions

were obtained for one molecule in the ASU.

A search for a second molecule was not

successful. After ®tting, correlation coef®-

cients of 60.2, 62.9 and 62.4% resulted for

hTR1±T3 in the orthorhombic crystal

form, hTR1±T3 in the monoclinic form and

hTR1±Triac, respectively. The corre-

sponding R factors were 41.7, 39.5 and

41.9%, respectively.

The I atoms present in the T3 and Triac

molecules provided signi®cant anomalous

signal, except in the case of the monoclinic

form of hTR1±T3 complex, the data set of

which contains a smaller number of images.

Thus, to certify whether the ligands were

bound to the active sites in the three struc-

tures, the following procedure was

employed. For each complex, an initial

model was built by application of the

suitable molecular-replacement solution

(PDBSET; Collaborative Computational

Project, Number 4, 1994; Winn et al., 1997),

from which structure factors were derived

using the program SFALL (Collaborative


Winn et al., 1997). Electron-density maps

(2Fobs ÿ Fcalc and Fobs ÿ Fcalc) were calcu-

lated and extended around the initial model.

The known ligand-binding region was

assessed by visual inspection using the

program O (Kleywegt et al., 2001),

contouring the 2Fobs ÿ Fcalc and Fobs ÿ Fcalc

maps at the 1.0 and 3.0 levels, respec-

tively. This approach was successful in

clearly identifying the presence of the ligand

in all three initial structures, as expected.

Fig. 5 illustrates this result for the hTR1±

T3 complex in the orthorhombic crystal

form. Structural re®nement is in progress.

This work was supported by FundacËaÄo de

Amparo aÁ Pesquisa do Estado de SaÄo Paulo

(FAPESP) via grants 02/13577-0 and 99/

03387-4, Conselho Nacional de Desenvolvi-

mento CientõÂ®co e TecnoloÂ gico (CNPq) and

National Institutes of Health Grant

DK41842 (to JDB). JDB has proprietary

interests in and serves as a consultant and

Deputy Director to Karo Bio AB, which has

commercial interests in this area of research.

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Winn, M., Dodson, E. J. & Ralph, A. (1997).Methods Enzymol. 277, 620±633.

Ye, L., Li, Y., Mellstrom, K., Mellin, C., Bladh,L. G., Koehler, K., Garg, N., Garcia Collazo,A. M., Litten, C., Husman, B., Persson, K.,Ljunggren, J., Grover, G., Sleph, P. G., George,R. & Malm, J. (2003). J. Med. Chem. 46, 1580±1588.

Yen, P. M. (2001). Physiol. Rev. 81, 1097±1142.

1870 Nunes et al. hTR1 ligand-binding domain Acta Cryst. (2004). D60, 1867±1870

ANEXO 2

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10111213141516171819202122232425

26272829303132333435363738394041424344454647484950

515253

5455

ARTICLE IN PRESSYJMBI-58292; No. of pages: 13; 4C: 4, 6, 7, 9

doi:10.1016/j.jmb.2006.05.008 J. Mol. Biol. (2006) xx, xxx–xxx

OF

Structural Rearrangements in the Thyroid HormoneReceptor Hinge Domain and Their Putative Role inthe Receptor Function

Alessandro S. Nascimento1†, Sandra Martha Gomes Dias1†Fábio M. Nunes1, Ricardo Aparício1, Andre L. B. Ambrosio1

Lucas Bleicher1, Ana CarolinaM. Figueira1, Maria AuxiliadoraM. Santos1

Mário de Oliveira Neto1, Hannes Fischer1,2, Marie Togashi3

Aldo F. Craievich2, Richard C. Garratt1, John D. Baxter3

PaulWebb3 and Igor Polikarpov1⁎
O 1Instituto de Física de SãoCarlos, Universidade de SãoPaulo, Avenida Trabalhador SãoCarlense, 400 CEP 13560-970São Carlos, SP, Brazil
2Instituto de Física,Universidade de São Paulo,São Paulo, SP, Brazil

3Diabetes Center, MetabolicResearch Unit, and theDepartment of Medicine,University of California SanFrancisco, San Francisco,CA 94143, USA

U

† A.S.N. and S.M.G.D. contributedPresent addresses: S.M.G. Dias, C

University, Ithaca, NY, ZIP 14853, U6154, Campinas, SP 13084-862, BrazAbbreviations used: TR, thyroid h

DNA-binding C domain; RXR, retinProtein Data Bank.E-mail address of the correspondi

0022-2836/$ - see front matter © 2006 P

ORRE

CTED

PRThe thyroid hormone receptor (TR) D-domain links the ligand-bindingdomain (LBD, EF-domain) to the DNA-binding domain (DBD, C-domain),but its structure, and even its existence as a functional unit, arecontroversial. The D domain is poorly conserved throughout the nuclearreceptor family and was originally proposed to comprise an unfolded hingethat facilitates rotation between the LBD and the DBD. Previous TR LBDstructures, however, have indicated that the true unstructured region isthree to six amino acid residues long and that the D-domain N terminusfolds into a short amphipathic α-helix (H0) contiguous with the DBD andthat the C terminus of the D-domain comprises H1 andH2 of the LBD. Here,we solve structures of TR-LBDs in different crystal forms and show that theN terminus of the TRαD-domain can adopt two structures; it can either foldinto an amphipathic helix that resembles TRβ H0 or form an unstructuredloop. H0 formation requires contacts with the AF-2 coactivator-bindinggroove of the neighboring TR LBD, which binds H0 sequences that resemblecoactivator LXXLL motifs. Structural analysis of a liganded TR LBD withsmall angle X-ray scattering (SAXS) suggests that AF-2/H0 interactionsmediate dimerization of this protein in solution. We propose that the TR D-domain has the potential to form functionally important extensions of theDBD and LBD or unfold to permit TRs to adapt to different DNA responseelements. We also show that mutations of the D domain LXXLL-like motifindeed selectively inhibit TR interactions with an inverted palindromicresponse element (F2) in vitro and TR activity at this response element incell-based transfection experiments.

© 2006 Published by Elsevier Ltd.
C Keywords: thyroid hormone receptor; nuclear receptors; DNA responseelements; hinge domain N*Corresponding author
equally to this work.3-137, Molecular Medicine Department, College of Veterinary Medicine, CornellSA; R. Aparicio, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, Cx. P.il.ormone receptor; NTD, N-terminal domain; LBD, ligand-binding EF domain; DCD,oid X receptor; TRE, T3 response element; SAXS, small-angle X-ray scattering; PDB,

ng author: [email protected]

ublished by Elsevier Ltd.

mailto:[email protected]

C

56

57585960616263646566676869707172737475767778798081828384858687888990919293949596979899100101102103104105106107108109110111112113114115116117

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2 Structural Rearrangements of TR Hinge Region

ARTICLE IN PRESS

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Introduction

Thyroid hormone receptors (TRs) are members ofthe nuclear hormone receptor (NR) family of ligand-modulated transcription factors that regulate geneexpression in response to thyroid hormone (pre-dominantly triiodothyronine, T3).1–3 Like other NRs,TRs are single polypeptides comprised of threediscrete domains: an N-terminal AB domain (NTD)a central DNA binding C domain (DBD) and a C-terminal ligand binding EF domain (LBD), and TR-dependent gene activation involves concertedactions of all three domains. TR DBDs guide thereceptors to specific T3 response elements (TREs)within target promoters. The TRs then utilizemultiple protein–protein interaction surfaces inassembly of active transcription complexes: a dis-tinct LBD surface mediates homodimer formation orheterodimer formation with retinoid X receptors(RXRs), another surface in the DBD engages inheterodimer-specific contacts with RXR DBD andactivation functions in theNTD (AF-1) and LBD (AF-2) recruit coactivator complexes that, in turn,enhance gene expression by remodeling local chro-matin and switching on the transcription machinery.X-ray structures of the TR DBD and LBD have

provided insights into the mechanism of TR action.A structure of an RXR-TR DBD heterodimer on acognate TRE arranged in a direct repeat (DR)orientation4 highlights DNA binding and RXR-TRDBD heterodimer interfaces and reveals that theTRβ DBD contains an α-helical C-terminal exten-sion (CTE) that makes auxiliary contacts withDNA and is not present in RXRs. Multiple X-raystructures of LBDs of TRα and TRβ isoforms5–10reveal a fold that is typical of NR LBDs,11–13 withthe ligand buried in the core of the domain, andfacilitated targeted mutagenesis approaches thatshowed: (1) the major TR LBD dimer/heterodimersurface is comprised of a conserved hydrophobicinterface at the junction of H10 and H11, similar toother surfaces observed in crystals of NR LBDdimers and heterodimers,14 (2) that AF-2 is asurface-exposed hydrophobic cleft comprised ofresidues from H3 and H5 and completed by T3-dependent packing of C-terminal H12 against theLBD; an event that simultaneously occludes anoverlapping corepressor binding surface.15 Thisformulation has been confirmed in X-ray crystalstructures of TRand other NR LBDs in complexwith short target peptide motifs derived fromcoactivators, including the p160s SRC1 and GRIP1,which are comprised of short α-helical motifs thatconform to the consensus Leu-X-X-Leu-Leu.In spite of these advances, little is known about

structural relationships between domains, rearran-gements required to permit TRs to adapt to differentTREs and mechanisms of communication betweendomains. It is important to understand theseinfluences. TRs can bind TREs that are repeats ofthe consensus sequence AGGTCA arranged as directrepeats, inverted palindromes or palindromes2,3 andTRE arrangement influence the direction and extent

TED P

ROOF

of the response to T3. Further, T3 binding to the LBDdifferentially regulates TR DNA binding activity; T3enhances TR monomer DNA binding, inhibits TRhomodimer DNA binding and does not affect RXR-TR interactions with DNA. Finally, our low-resolu-tion solution structures of RXR DBD-LBDs indicatethat relationships between the DBD and LBD differaccording to whether the RXR LBDs form dimers ortetramers.16 Collectively, these findings indicate thatthe TR and NR DBDs must communicate with theirLBDs, and vice versa, and that improved understand-ing of these influences is important for understand-ing TR and NR action.The NR hinge, or D domain, that bridges the

LBD and DBD represents one obvious potentialsource of communication between these twodomains. This region is poorly conserved betweenNR family members and was originally proposedto act as a flexible linker to facilitate rotationbetween the DBD and LBD and permit NRs toadapt to different response elements. Nevertheless,it is now clear that the NR hinge harbors multiplefunctional elements: nuclear location signals (nls),sequences required for efficient DNA binding,17 anactivation function (τ2, TRβ residues 207 to 217)18and repression functions19 and that it plays rolesin T3 binding and corepressor release20 andcorepressor binding.18,21–23Our X-ray structures of TRα and TRβ LBDs have

even led us to question the notion that a truestructural hinge may even exist. The structuresrevealed that residues that were originally assignedto the C terminus of the TR hinge actually fold as partof first α-helix of the LBD (H1). Moreover, while therat TRα hinge domain does appear disordered incrystal structures, the human TRβ hinge contains anN-terminal α-helix (H0; E202–I208) that overlaps theTRβ DBD CTE.4–6 Thus, the TRβ ‘‘hinge’’ actuallycorresponds to distinct parts of a greater DBD andLBD, raising the question of the source of theflexibility required for recognition of diverse TREs.Here, we examined the basis for TR isoform-

specific differences in hinge structure by solvingmultiple structures of TR LBDs. We confirm thatTRβ hinge can fold an amphipathic H0 and find thatthe N-terminal part of the TRα hinge can also form asimilar structure, but find that formation of thisstructure is dependent on interactions with thehydrophobic coactivator-binding groove of theneighboring TR LBD in the crystal lattice. We alsodetect similar relationships in a published mineral-ocorticoid receptor (MR) LBD structure.24 Our low-resolution solution X-ray structures of TRα LBDsindicate that similar interactions mediate formationof unusual liganded LBD dimers in solution. Wepropose that H0 only adopts α-helical structure incontact with appropriate partners and that a similarcontact with undefined proteins may regulatefunctionally important transitions between a disor-dered hinge and an ordered DBD CTE that areimportant for TR action in vivo and plasticity inrecognition of different DNA response elements. Weprovide experimental evidence that mutations

181182183184

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t1:19

t1:20

3Structural Rearrangements of TR Hinge Region

ARTICLE IN PRESS

introduced into LXXLL-like motif of the hingeregion indeed significantly influence both TR-TREinteractions in vitro and TR transcriptional activity incells.

C

219220221222223224225226227228229

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Results

The hinge domain of both TRs can fold into ashort amphipathic helix 0

Here, we solved crystal structures of the humanTRβ LBD (amino acid residues 202–461) in thehexagonal crystal form and the human TRα LBD(amino acid residues 148–410) in complex with T3in two different space groups (orthorhombic andmonoclinic). All of these structures contain a singleTR within the asymmetric unit (Table 1) andoverall structure of both TR LBDs closely resemblesthose of previous TR structures.5–8 Thus, organi-zation of the main portion of the LBD will not befurther described.We did detect major differences in organization of

the hinge (D) domain in each of our structures. TheN-terminal portion of the human TRβD region foldsinto a short H0 α-helix comparable to that observedin previous structures. By contrast, the humanTRαDregion folds into a short H0 α-helix in the structurerevealed by the orthorhombic crystal form, but wascompletely unstructured in the structure revealed inthe monoclinic crystal form, as previously observedin the monoclinic rat TRα LBD crystal structure.The overall organization of TRα H0 in the

orthorhombic crystal form was comparable to thatobserved in previous TRβ structures, and our ownTRβ structure. TRα H0 is approximately ten aminoacids and two turns long (Figure 1(a)). According toamphipathic character of the helix H0, the charged

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252253254255256257258259260261262263264265266267268269270271272273274275

Table 1. Details of X-ray diffraction data processing andstructure refinement

TRα1+T3,orthorhombic

TRα1+T3,monoclinic

TRβ+T3Hexagonal

Space group P212121 C2 P3121Resolution (Å) a 63.25–1.87 32.22–2.33 33.35–2.30

(1.92–1.87) (2.40–2.33) (2.36–2.30)

Unit cell parametersa (Å) 59.98 117.569 68.95b (Å) 80.79 80.626 68.95c (Å) 102.21 62.614 131.11

Rmergeb 4.3 (49.2) 8.6 (38.3) 7.7 (56.5)

Completeness(%)

99.9 86.0 99.0

Multiplicity 6.3 (6.0) 1.8 (1.7) 16.1 (5.5)Bond

length (Å)0.041 0.027 0.024

Bondangles (°)

3.85 2.62 2.63

Rfactor (%) 14.8 18.7 20.4Rfree (%) 18.6 23.7 24.7

a Values between parentheses correspond to resolution range inhighest resolution bin.

b Rmerge=Σhkl∣Ihkl–(Ihkl)∣/ΣhklIhkl.

TED P

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and hydrophobic residues are clustered on theopposite sides of the helix, pointing, respectively, tothe top and to the bottom in the view given by Figure1(a). The same is true for the TRβ H0 structure(Figure 1(b)). By contrast, the TRα D domain isunstructured and strongly disordered in the mono-clinic crystal form. In fact, due to the conformationaldisorder of the D domain CTE, only a fraction of thisregion could be unambiguously traced in theelectron density maps (Figure 1(c)).We conclude that the N terminus of the TR D

domain can adopt two different forms; a short αhelix (H0) or a completely unstructured form, andthat these arrangements differ according to theprecise crystal form.

TR H0 interacts with the AF-2 surface of thesymmetry-related LBD molecule

To investigate the influence of crystal form on TRαhinge domain structure, we examined packinginteractions between individual LBD subunits inthe orthorhombic and monoclinic crystal forms.Strikingly, TRβ and TRα1 H0 both interact with thesymmetry-related LBDmolecule by docking into theAF-2 groove formed by the C-terminal helix (H) 12and H3 and H5. By contrast, the crystallographicstructure of TRα1 in the monoclinic space group didnot exhibit similar interactions; the unfolded D-domain was loosely placed in the solvent channel ofthe crystal without forming any apparent interac-tions with the neighboring LBDs.Structural superposition of the TRβ1 and TRα1

crystallographic structures with the X-ray model ofTRβ1 complex with co-activator (GRIP1) peptide26reveals great similarity in the position, orientationand a mode of binding of the hinge region of themolecule to the co-activator binding groove to thatof GRIP1 peptide (Figure 2(a)). TRα1 and hTRβ1 H0fits snugly into the AF-2 surface and the interactionnetwork of the hTR D domain is superimposable inatomic detail onto the set of interactions observed incrystal structures of hTRβ5 and VDR35 complexeswith coactivator peptides (Figure 2(b) and (c)). Moreprecisely, TRβ1 H0 docks in the AF-2 region; andresidues L204 and I208 play an equivalent role toL690 and L694 residues of the coactivator NRbinding motif 690LXXLL694, and establish Van derWaals interactions to the hydrophobic coactivator-binding site composed of helices 3, 4 and 12 (Table2). On the rim of the binding site, charge clampinteractions between E457 and K288 side-chainswith, respectively, H0 E203 and S207 main chainatoms fix the H0 peptide in place and these chargedinteractions are further strengthened by a hydrogenbond between hinge E203 side-chain and a mainchain amino group of L454 in the AF-2 hydrophobicgroove (Figure 2(b)).Similar interactions are observed in the human

TRα structure. TRα residues M147, M150 and I151 inhuman TRα structure play a structural role of threeconserved leucine residues in coactivator NR-bind-ing motif 690LXXLL694 and establish Van der Waals

NCOR

RECT

EDPR

OOF

276277278279280281282283284285

286287288289290291292293294295

Figure 1. TR D domain CTE can adopt two structural forms: a structured α-helix (H0) and an unstructured peptide.(a) The hTRα structure in the orthorhombic space group with the D-domain CTE peptide folded as an α-helix. (Side-chains of the amino acid residues Met147 and Arg158 are in double conformation; only a preferred conformation isshown.) (b) The hTRβ structure with the D-domain CTE in the form of an α-helix. (c) Crystal structure of hTRα with theunfolded and unstructured hinge peptide (in the monoclinic space group).


ARTICLE IN PRESS

Uinteractions with hydrophobic residues on the floorof the AF-2 cleft. Charge clamp interactions of theTRα LBD side-chain residues E403 and K234 with,respectively, H0 M147 and M150 main chain atomsfix H0 in the correct orientation.It is important to mention that in all cases the

interactions are formed between, simultaneously,the positively (Lys) and negatively (Glu) chargedside-chains of the charge clamp and the mainchain groups of the interacting (H0 or coactivator)

peptide (Figure 2(b)–(d) and Table 3). The peptide,thereby, is fixed in place and in register relative tothe coactivator-binding groove independently ofits exact amino acid sequence. The charge clampdefines only a direction in which interacting α-helix is being docked, but is not selective towardamino acid composition (Figure 2(d)). The require-ment on the amphipathicity of the helix comesfrom the hydrophobic nature of the amino acidside-chains covering the floor of the AF-2 cleft.

C

296297298299300

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303304305306307308309310311312313314315316317318319320321322323324325326327328329330331332333334335336337338339340341342343344345346347348349350351352353354355356

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388389390391392393394395396397398399400401402403404405406407408409410411412413414415


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Together, these results indicate that formation ofTR D-domain H0 is dependent upon contacts withthe AF-2 surface of the neighboring LBD and thatthis interaction is analogous to interactions of the TRLBDs and coactivator peptides.36

TR LBDs form hinge-mediated dimers insolution

To find out whether hinge-mediated interactionsoccur in solution, we obtained low-resolutionstructures of liganded TRα LBD dimers in solutionby conducting small angle X-ray scattering (SAXS)experiments. Whereas liganded TRα LBDs generallyform monomers in solution at low protein concen-trations, it is possible to obtain dimers at the higherprotein concentrations used in these experiments.Both experimentally derived radii of gyration (Rg)and the maximum inter-particle distances (Dmax)indicated that the TRα LBD protein indeed formsdimers in solution.Low-resolution structural envelopes of the TR

LBD were obtained from SAXS data analysis usingab initio methods (Material and Methods) andrevealed a biplane butterfly-like molecular struc-ture (Figure 3(a)–(c)). Two separate domains,forming the ‘‘wings’’ of the butterfly, are openedat the angle of approximately 120° (Figure 3(a)). Tounderstand how the solution structure of the TRαLBD dimer is related to high resolution X-raystructures of the TRα LBD, we analyzed fitting ofthe high-resolution structure of the observedcrystallographic hTRα1 LBD hinge-mediateddimer and, also, closely packed symmetric dimersof other NR LBDs into the TRα SAXS molecularenvelope of the protein in solution. The fitsuggested that the form of the TRα dimerobserved in solution corresponded to an elongatedhinge-mediated dimer, and not to the classicalsymmetric LBD homodimer mediated by symmet-ric interactions between H10-H11 regions. TwoLBD domains correspond to the butterfly wingsand are connected to each other by the hingepeptide (Figure 3(a)).We also calculated theoretical scattering curves for

the hinge-mediated dimer and symmetric dimer andfound that there was close agreement between thetheoretical scattering curve for the TRα hinge-mediated dimer and experimental small-angle scat-tering intensity data as indicated by proximity tounity of the statistical goodness-of-fit parameterχ=1.1. This was not the case for theoreticalscattering curves calculated for the closely packedsymmetric dimers of other NR LBDs observed, forexample, in hER LBD33 and hRXR LBD37 crystalstructures and, also, in RXR LBD solution studies.38These strongly disagree with the SAXS experimentaldata (χ=2.12 and χ=2.67 for ER LBD and RXR LBDdimers, respectively, Table 2). Together, these find-ings suggest that formation of liganded TRα LBDdimers in solution involves contacts between theTRα hinge domain and the coactivator-binding siteof a neighboring TR LBD.

D PRO

OF

TRβ H0 LXXLL-like motif is required for DNAbinding and TR activity

To analyze the significance of the TR H0 LXXLL-like motif in TR action, we mutated the Ser206,Ile207 pair that contacts the hydrophobic floor of theAF-2 surface to either Ala (A) or Lys (K) and studiedeffects of these mutations upon TR DNA bindingand transcriptional activity (Figure 5(a)).The H0 mutations specifically inhibited TR

homodimer formation on an inverted palindromicTRE in vitro. Figure 5(b) indicates that theTRβH0AA mutation modestly inhibited homodi-mer formation on an F2 inverted palindromicresponse element and that the TRβH0KK mutantexhibited a stronger inhibitory effect. This effect wasspecific to the F2 element; residual TR monomerbinding to the F2 element (lower band) was notaffected, nor was RXR-TR heterodimer formationupon the same element. Likewise, TR and RXR-TRinteractions with DR-4 and palindromic TREs wereunaffected.The H0 mutation also selectively inhibited TR

transcriptional activity at F2. Figure 5(c) shows thatthe TRβH0KK mutation inhibited T3 response at anF2-dependent reporter gene by over 50%. The samemutation did not affect T3 response at DR-4 orpalindromic TRE-dependent reporters. Thus, ourdata indicate that TRβ H0 LXXLL-like motif isselectively required for TR action at one type of TRE(F2 response element).
TEDiscussion
Here, we examined the conformation of the TR Ddomain or ‘‘hinge’’ in X-ray structures of TRα andTRβ LBDs in different crystal forms and discoveredan explanation for discrepancies between the TRαand TRβ D domain structures detected in previousstudies. Fletterick, Baxter and co-workers noted thatthe TRβ hinge folds into a short α-helix (H0) that iscontiguous with the TRβ DBD α-helical CTE.5,6These results led to the suggestion that there may beno true TR structural hinge, with sequences previ-ously assigned to the hinge on the basis of sequencehomology actually corresponding to extensions ofthe DBD and LBD. We show here that the Nterminus of the TRα hinge can also fold into ashort amphipathic H0, but in addition we find thatformation of this structure is dependent on contactswith the AF-2 surface of the symmetry-related LBDmolecule. Low-resolution SAXS structures of T3-liganded TRα LBD in solution are consistent withformation of unusual dimers, mediated by hinge/AF-2 contacts. Thus, we suggest that the TR hingedomain can adopt two forms: it can either fold into ashort H0 or unfold into a long unstructured regionand this transition is dependent on molecularpacking contacts.There are strong analogies between the interaction

mode of TR AF-2 with H0 and with coactivatorLXXLL motifs. While TRβ and TRα H0 contain

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416417418419

420421422423

Figure 2. (a) hTRβ1 crystallographic dimer. Helix 12 is shown in magenta, hinge in green. Superposed is the structureof hTRβ1 (cyan) co-crystallized with a coactivator peptide (in red) (PDB entry 1BSX). (b) Details of the TRβD domain CTEH0–coactivator binding groove interactions. (c) Interactions between GRIP1 peptide with AF-2 of TR LBD. (d) Molecularsurface representation of the TR LBD painted according to the surface charges. Charged residues at the rim of the bindinggroove serve to orient TR D domain CTE H0 (shown as sticks).


ARTICLE IN PRESS

hydrophobic sequences that do not exactly resemblean LXXLLmotif (TRβH0 204LQKSI208 and TRα1 H0147MEEMI151), both sequences dock into the AF-2surface in a position and orientation that is very

similar to that observed with LXXLL motifs. Thus,both H0 peptides are oriented by contacts with‘‘charge clamp’’ amino acids with charged side-chains positioned at the rim of the co-activator

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Figure 2 (continued)


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C424425426427428429430431432433434435436437438439440441442443444445446447448449450451452453454455

456457458459460461462463464465466467468469470471472473474475476477478479480481482483484485486487488489490491492493494495496497498499500501502503504

Table 2t2:1 . Structural parameters from SAXS datat2:2

t2:3 Parameter/sample

hTRα LBD(SAXS) Crystallographic dimers

t2:4 Exp. a DAMb hTRα1 c hRXRα d hERe

t2:5 Dmax (nm) 11.5 11.83 11.16 9.54 8.29t2:6 Rg (nm) 3.45 3.57 3.12 2.52 2.34t2:7 Discrepancy χ - 1.06 1.10 2.12 2.67t2:8 Resolution (nm) 4.03 4.03 - - -

a Exp., calculated from the experimental data.t2:9b DAM, parameters of the ab initio low-resolution SAXS model,

averaged over ten independent DAMs.t2:10c Mod, parameters obtained from the present hTRα1

crystallographic model.t2:11d ID PDB 1LBD biological unit.t2:12e ID PDB 1A52.t2:13

t3:1t3:2

t3:3

t3:4t3:5t3:6t3:7t3:8t3:9

t3:10t3:11

t3:12


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CORR

Egroove, and fold with the H0 hydrophobic surface incontact with the hydrophobic floor of the cleft.Further, several previous studies have indicated thatcoactivator LXXLL motifs are unstructured insolution and only fold into an amphipathic α-helicalstructure upon contact with AF-2, much as we havefound for H0 formation. The fact that an NR AF-2surface can bind to peptides that deviate from theprecise LXXLL consensus sequence is not surprising:previous studies have shown that alternate hydro-phobic peptides can bind to different NR AF-2surfaces.36 We suggest that contacts with TR AF-2could induce α-helical formation in a wide range ofsuboptimal amphipathic peptides containingΦXXΦΦ, ΦXXXΦ or ΦXXΦX, (where Φ is ahydrophobic residue and X is any residue), providedthat the local concentration is high enough toovercome reduced affinity.Hinge domain interactions with the hydrophobic

grooves are not uncommon. We do detect AF-2/H0interactions between TR LBDs in solution, and closeinspection of the Protein Data Bank (PDB) revealssimilar AF-2/H0 contacts in other TR structures.6Further, analysis of a recent human MR structurereveals that the D-domain adopts an H0 structurethat interacts with AF-2 in the symmetry-relatedMRLBD via the ISRAL peptide motif.24 Thus, similarinteractions may be possible for a variety of NRs.What role could TR H0 play in TR action? While

our experimental data indicate that contacts be-tween the hinge domain and TR AF-2 are requiredfor induction of H0, and that liganded TR LBDs rely

UNTable 3. The distances between residues of hinge domain an

hTRβ LBD Distance (Å) Hinge hTRβ LBD Distance

V458–CG2 3.88 L204–CD2 E457–OE2 2.39E457–OE1 3.53 E203–N E457–OE1 2.56L305–CD1 3.56 I208–CD1 L454–CD1 3.07K288–NZ 2.99 S207–O P453–CB 3.86V284–CG1 4.04 I208–CG1 V284–CG2 3.95— — — V284–CG1 3.74

The distances between hTRβ1 and the coactivator GRIP are also showa Distances based on the structure 1BSX deposited on PDB.26b Met147 is a cloning artefact. This amino acid residue makes part o

and substitutes for Lys147 in the correct hTRα sequence.

TED P

ROOF

upon this interaction for dimer formation insolution, we do not have direct evidence that theseTR AF-2/H0 contacts are important. We insteadfavor the idea that observed molecular interactionsare a manifestation of the propensity of theamphipathic part of the hinge domain to bind tothe hydrophobic grooves of the partner proteins orto form disordered structure in solution in theabsence of such interactions. Perhaps TR H0 isinduced by docking against other proteins that haverecognition motifs that bind amphipathic α-helices,as shown for the interactions of the corepressor N-CoR with the p160 coactivator ACTR.39We also propose that the capacity of the TR D

domain to undergo structural rearrangement to formH0 is important for TR DNA-binding activity andadaptation to different TRE sequences. Our previousTRβ structures had suggested that the true unstruc-tured hinge is very short (three to six amino acidresidues), and that the hinge domain sequences thatwere identified on the basis of structural homologyactually correspond to extensions of the DBD andLBD.6 The structures reported here suggest that theH0 region can exist in two states and that it canunfold to form a disordered loop in the absence ofprotein–protein contacts. This finding, coupled withprevious results from in trans assembly assays and invitro pulldown assays, which indicate that H1 candissociate from the body of the LBD,40,41 leads us tosuggest that the D domain has the potential torearrange and adopt different structural forms: itcould either fold into segments of an extended DBDand LBD or unfold to form true unstructured hingethat would facilitate rotational flexibility betweenLBD and DBD.Two lines of experimental evidence lend support

to the notion that TR hinge structure is important forselective TRE recognition. Our model, based onabove described crystallographic structures, predictsthat flexibility required to bind to diverse TREsequences would be acquired at the expense of TRDBD CTE structure and, therefore, at the expense ofauxiliary contacts with DNA. Accordingly, TRhomodimers bind more readily to inverted palin-dromic TREs than to direct repeats, where consider-ation of the likely relative orientation of the LBD andDBD indicates that rotational flexibility is requiredfor DNA binding. Second, we report here thatmutation of Ser206 and Ile207 in the hydrophobic

d AF-2 for hTRα1 and hTRβ1

(Å) GRIP1 a hTRα LBD Distance (Å) Hinge

I689–N V404–CG1 3.45 M147–CEb

L690–N E403–OE1 2.83 M147 - NL690–CD2 L251–CD2 3.52 I151–CD1I689–CD1 I248–CG2 4.06 M147–CEb

L693–CD1 K234–NZ 2.72 S153–OGL694–CD2 V230–CG2 4.06 M150–CE

n. The rows show residues in the same position.

f the linker peptide between true hTRα fragment and a 6xHis tag

UNCO

RREC

TED P

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Figure 3. Superposition of theaveraged SAXS DAMs (bluespheres) and the hinge-mediatedcrystallographic dimer of hTRα1LBD shown as a cartoon in yellowand cyan. Three orthogonal stereoviews are given.


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surface of H0 selectively inhibits TRβ homodimerbinding to an inverted palindromic TRE in vitro andT3 response at the same element in vivo, but does notaffect other TR interactionswithDNA.While theH0-KK mutation could conceivably inhibit TRβ DNAbinding by disrupting hitherto unsuspected contactsbetween H0 and DNA, consideration of the TRβDBD X-ray structure4 suggests that H0 will lie closeto DNA without large-scale rearrangement of theCTE (not shown).We therefore favor the idea that theTRβH0mutation inhibits F2 interactions via indirecteffects on the structure of the contiguous DBD CTE.Together, the predictions in the model outlined

above raise the possibility that unspecified protein–protein contacts could play a role in H0 formationand, indirectly, upon TR DNA binding activity.There is a wealth of biochemical and molecularbiological evidence that the D domain is involved inco-repressor binding.18,21–23 It is interesting tospeculate that contacts with corepressors or similarproteins could directly regulate TR DNA bindingactivity and rotational flexibility via induction of Ddomain structure.

C565566567568569570571572

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574575576577578579580

E

Materials and Methods

Protein expression

The humanTRβLBD region (residues 202–461) and TRαLBD (residues 148–410) were expressed in Escherichia coliBL21(DE3) strain from the pET28 vector as described.25 ALuria Broth (LB) starter culture was inoculated with asingle colony of a LB-agar culture and grown overnight at37 °C. The initial culturewas inoculated at 1% in amajor 2XLB culture and grown at 22 °C in kanamycinmedium untilthe A600nm reached 1.5, 0.5 mM isopropylthio-β–D-galactoside (IPTG) was then added and the culture wasincubated for 4–6 h at 22 °C. The induced cultures wereharvested by centrifugation and the pellets were resus-pended in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.05%

UNCO

RR
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Tween 20, 20 mM β-mercaptoethanol. Phenylmethylsulfo-nylfluoride (PMSF) and lysozyme were added to 1 mMand 250 μg/ml, respectively, and the culturewas placed onice for 30 min. The lysate was sonicated and clarified bycentrifugation for 30 min at 14,000 rpm in a Sorvall SS34rotor at 4 °C and T3 (Sigma) was added to molar excess of20X and incubated for 1 h at 4 °C. The supernatant wasincubated with 1 ml of Talon Superflow Metal AffinityResin (Clontech) per liter of culture for 1 h at 4 °C. The resinwas washed with 50 mM sodium phosphate (pH 8.0),300mMNaCl, 10% (v/v) glycerol, 0.05%Tween 20, 10mMβ-mercaptoethanol. Bound T? protein was eluted with50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10%glycerol, 0.05% Tween 20, 10 mM β-mercaptoethanol,500 mM Imidazole in a single step. The eluted protein wasloaded into the gel filtration columnHL Superdex 75 26/60(Amershan Bioscience) equilibrated with 20 mM Hepes,1 mM EDTA, 3 mM DTT, 300 mM Nacl. An isocratic runwas carried out at flow rate of 2 ml/min. Proteins wereconcentrated by centrifugation at 1500g at 4 °C usingAmicon Ultra concentrators 10MWCO (Millipore).

Crystallization

For hTRβ LBD, crystallization screens were preformednear the already published conditions.26 The suitablecrystals were grown within one day with 100 mM sodiumcacodylate (pH 6.8), 1.4 M sodium acetate at 18 °C. The X-ray diffraction quality crystals of hTRα grew in 1.0 Msodium cacodylate and 0.1 M sodium acetate threehydrate(pH 7.2).25 The fine variations of the crystallizationconditions led to crystals in two different (orthorhombicP212121 and monoclinic C2) space groups.

Diffraction data collection

All diffraction datasets were collected at Mar345dtbimage plate detector mounted at a Rigaku Ultra X18rotating anode generator. An Osmic confocal MaxFluxoptics and CuKα radiation were employed. Prior to datacollection crystals were soaked in cryoprotectant solutionsand rapidly cooled in a gaseous nitrogen stream at 100 Kto prevent the radiation damage.

Figure 4. Experimental solu-tion scattering curve of hTRα1 andtheoretical scattering intensities.Desmeared experimental curve isshown as dots with error bars,theoretical scattering intensityfrom the average dummy model isgiven in continuous line; predictedscattering intensity from the hinge-mediated asymmetric TRα1 LBDdimer structure is shown as abroken line, from hRXRα LBD(PDB id 1LBD) as a gray line andfrom hERα LBD33 (pdb id 1A52) isgiven in broken gray line. An insetdisplays the correspondent Guinierplot.

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Figure 5. TRβ H0 is required for recognition of the F2TRE and T3 response. (a) Location of TRβH0withmutatedresidues (AA and KK) marked. (b) Exposure of a gel shiftassay reveals (upper panel) binding of TRβ wild-type andmutant homodimers and monomers to an F2 element and(lower panel) binding of wild-type TRβ and mutants asheterodimers with RXR to the same element. (c) Results oftransfection assay showing that the TRβ H0KK mutantselectively inhibits T3 response at the F2 element. Valuesrepresent an average of three independent experiments.


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UNCStructure solution

All structures were solved by molecular replacement,using AMORE and/or MOLREP, both as implemented inCCP4 suite.27 hTRβ (PDB entry 1BSX) was used as asearch model for TRα1+T3 structure determination andrefinement. All the following structures have been solvedby molecular replacement with TRα1+T3 structure as asearch model and refined using REFMAC5. Details of dataprocessing and refinement are given in Table 1.

Small angle X-ray scattering; SAXS measurements

The X-ray scattering data were collected at the smallangle X-ray scattering beamline at the National Synchro-tron Light Laboratory (Campinas, Brazil) using one-

F

dimensional position-sensitive detector. TRα1 constructscomprising hinge and LBD domains (residues 148 to 410)at several concentrations between 3 and 9 mg/ml and inthe presence of T3 were measured using X-ray wavelengthλ=1.48 Å and a sample-detector distance of 1044 mm. Themomentum transfer range (q=4 π sin θ / λ, where 2θ is thescattering range) covered from 0.1 to 1.5 nm−1. Thescattering curves of the protein solutions and the solventswere collected for a period of 100 s per frame andaccumulated for ten frames for each scattering curve.Comparators between low and high concentrationshowed that concentration effect was negligible andtherefore the more intense X-ray scattering data collectedfrom the samples at 9 mg/ml and corrected by thesmearing effect were utilized for structural studies. Thedesmeared scattering curve, simulated curves of theDAMs and high-resolution models are given in Figure 4.Guinier plot exhibited a linear behavior within the intervalof 0.09 nm−2<q<0.2 nm−2 (Figure 1, inset) and provided aradius of gyration estimate of 3.33 nm. The structuralparameters derived from these curves are given in Table 2.

TED P

ROData analysis and molecular shape determination

The data were normalized by the incident beamintensity, sample absorption and corrected for the non-homogeneity of detector response. The scattering curvesof the solvent were subtracted. The radii of gyration (Rg)and maximum intraparticle distances (Dmáx) were calcu-lated by the indirect Fourier transformation as imple-mented in the program GNOM.28 Corrections for thesmearing effect were introduced and the distancedistribution function p(r) was calculated as well. Anumber of dummy atom models (DAM) of the proteinwere generated using the program GASBOR.29 Theprogram simulates the internal structure of the protein,making it unnecessary to subtract the Porod's constantintensity.30 The models were derived from the experi-mental scattering curve without any assumptions of aninternal symmetry of the particle. Several runs of ab initioshape determination with different starting conditions ledto consistent results as judged by the structural similarityof the output models that yielded nearly identicalscattering patterns and fitting statistics in a stable andself-consistent process. For automated analysis andsuperposition of the molecular reconstructions, a pro-gram package DAMAVER,31 which aligns two modelsrepresented by ensembles of points and provides adissimilarity measure between them, was used. InDAMAVER, all pairs are compared in a set of models, areference model is selected giving the smallest averagedissimilarity measure and possible outliers are discarded.All the models except the outliers are superimposed ontothe reference model using SUPCOMB,31 and the entireassembly is remapped onto a densely packed grid ofbeads where each grid point is characterized by itsoccupancy factor. The grid points with higher occupan-cies are selected to yield the volume equal to the averageexcluded volume of all the individual models. Thisaveraging technique permits one to analyze the stabilityof the reconstruction and yields the model preserving themost probable features of the particle, significantlyimproving the reliability of the results. The final shaperestoration was performed with ten independent ab initiosimulations. hTRα1 dimer has been filled withNDAM=1110 dummy atoms with a packing radiusra=0.19 nm. The final low-resolution model, obtainedwith DAMAVER, was an average of ten DAMs.

C

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UNCO

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Fitting of high-resolution models

Theoretical solution scattering curves and Rg and Dmaxof the scattering objects were computed based oncrystallographic structures of both asymmetric hinge-mediated TR LBD dimers and also symmetric hRXRLBD32 and hER LBD33 dimers using the programCRYSOL.34 The program uses multipole expansion forfast calculation of the spherically averaged scatteringpattern and takes into account the hydration shell. Thesuperposition of the crystallographic models with aver-aged low-resolution model was done with SUBCOMP.31

Gel shifts

Binding of TR to the F2 inverted palindromic element(FINISH ref Ralff dimer paper) DNA was assayed bymixing 20 fmol of 35S-labeled TRs produced in areticulocyte lysate system, TNT T7 (Promega), with10 ng oligonucleotide and 1 μg of poly(dI-dC) (AmershamPharmacia Biotech) in a 20 μl reaction volume.14 Thebinding buffer contained 25mMHepes, 50mMKCl, 1 mMDTT, 10 μMZnSO4, 0.1% NP-40, 5% glycerol. After 30 minat room temperature, the mixture was loaded onto a 5%(w/v) non-denaturing polyacrylamide gel that was pre-run for 30 min at 200 V. To visualize complexes, the gelwas run at 4 °C for 120 min at 240 V, in a running buffercontaining 6.7 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, and 3.3 mMsodium acetate. The gel was then fixed, treated withAmplify (Amersham Pharmacia Biotech), dried andexposed for autoradiography.TRs used in assay were first quantified with an [125I]T3

binding assay. Amounts used for gel shift assay were alsoconfirmed through SDS-PAGE run of [35S]TRs, where gelswere fixed, dried and exposed for autoradiography. Bandsvisualized in X-ray films were quantified with a Kodakimager.

Transfections

HeLa cells were maintained in DME H-21 4.5 g/l glucose, containing 10% (v/v) fetal bovine serum, 2 mMglutamine, 50 units/ml penicillin, and 50 mg/mlstreptomycin. For transfection, cells were collected andresuspended in Dulbecco's phosphate-buffered saline(0.5 ml/5.0×106 cells) containing 0.1% dextrose, andtypically 4 μg reporter, 1 μg of TR expression vector orempty vector control, and 2 μg of pCMV-β-galactosidase.Cells were electroporated at 240 V and 960 microfarads,transferred to fresh media, and plated into 12-well plates.After incubation for 24 h at 37 °C with T3 or vehicle, cellswere collected and pellets were lysed by addition of150 μl of 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) containing 0.2%Triton X-100. The reporters contained 2 TREs (F2)upstream of the herpes simplex virus TK promoterTATA box linked to luciferase coding sequence (LUC).LUC and β-galactosidase activities were measured usingthe Luciferase Assay System (Promega) and Galacto-Light Plus beta-Galactosidase Reporter Gene AssaySystem (Applied Biosystems), according to the manufac-turer's instructions.

Protein Data Bank accession codes

Atomic coordinates have been deposited with the RCSBProtein Data Bank and are available under accession codesxxxx.

TED P

ROOF

Acknowledgements

We thank L. Bleicher, S. Krauchenco and N.H.Martins for assistance inmanuscript preparation andfor helpful discussion. I.P. also thanks to Fundaçãode Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP) for supporting this work by grant 99/03387-4 andConselhoNacional deDesenvolvimentoCientífico e Tecnológico (CNPq). A.C.M.F., A.L.B.A.,A.S.N. and M.O.N. also thank FAPESP for financialsupport via their PhD studentship awards. J.D.B. wassupported by NIH grants DK41482 and 51281.

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C

784785786787788789790791792793794795796797798799800801802803804805806807808809810811812813814815816817818819820821822823824825826827828829830831832833834835836837838839840841842843844

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Edited by P. Wright

(Received 17 January 2006; received in revised form 12 April 2006; accepted 3 May 2006)

Estudos estruturais e biofísicos dos receptores nucleares...

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