Etc. Etc. Etc. y Medio Ambiente/Terce… · 0,4% de extracto de levadura 1% de tioglicolato sódico...
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- Yogures deshidratados - Leche en polvo
- Yerba mate - Café - Té
- Sopas instantáneas Frutas
- Pastas - Helados
- Bebidas - Chocolates
- Galletitas Cereales
- Aguas
- Etc. Etc. Etc.
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Efectos perjudiciales de las bacterias: patógenos bacterianos transmitidos porcontagio o por los alimentos y bebidas
Dr. Roberto Ricardo Grau
Universidad Nacional de Rosario (UNR)Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas
(FCByF)CONICET – Rosario
www.microbiologiarosario.org
6 de Noviembre de 2017
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LOS CUATRO
JINETES DEL
APOCALIPSIS:
1- LA MUERTE
2- LA GUERRA
3- EL HAMBRE
4- LA PESTEAlberto Durero 1498
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(4 x 1013) Km
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BIOFILMS
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24 h 48 h 72 h 96 h
ALGUNOS EJEMPLOS DE BIOFILMS DE BACILLUS
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¿CÓMO SE REGULA LA FORMACIÓN DEL BIOFILM Y LAS ESPORAS EN BACILLUS ?
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PhosphorelayATP
ADP
P
P
Señal
¿CÓMO SE REGULA LA FORMACIÓN DEL BIOFILM, LAS ESPORAS Y EL SLIDINGEN BACILLUS ?
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tasAbslA
epsSíntesis de flagelo
Síntesis de AG
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El género Clostridium
Características generales:
Bacilos Gram-positivos
Anaeróbicos
No reductores desasimilativos de sulfato
Formadores de endo-esporas
Hábitats naturales:
Tracto gastrointestinal del hombre y animales
Suelos y sedimentos de río
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Fenómenos asociados a Clostridium
Interés Industrial:
C. acetobutylicum → producción de solventes
Interés Clínico:
C. botulinum → botulismo
C. tetani → tétano
C. difficile → diarrea asociada a antibióticos. “SUPER-BUG”
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Fenómenos asociados a Clostridium
Interés Industrial:
C. acetobutylicum → producción de solventes
Interés Clínico:
C. botulinum → botulismo
C. tetani → tétano
C. difficile → diarrea asociada a antibióticos
C. perfringens → gangrena gaseosa, diarrea asociada a los antibióticos y/o alimentos
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La especie C. perfringens
Patógeno causante de enfermedades GI en humanos y animales
Su virulencia se debe a la producción de diferentes toxinas
4 toxinas letales principales
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Ciclo celular de C. perfringensen el tracto GI
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Regulación del inicio de la esporulación en Clostridium
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Estudio de la regulación de la esporulación en C. perfringens
Región 3’ de phoR de B. subtilis.
Secuencia del inserto contenido en p32
Cinco quinasas sensoras de esporulación de B. subtilis.
Caracterización molecular de
la posible quinasa sensora de
la esporulación de C.
perfringens
Estudio del rol fisiológico del Pi
sobre la esporulación en C.
perfringens y la producción de
CPE
Homología:
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Estudio de la regulación de la esporulación en C. perfringens
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Cinéticas de la aparición de esporas y de la variación del
pH
Cél. vegetivas Pre-esporas
Microscopía
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Efecto del Pi sobre la esporulación
Composición del DSSM:
1,5% de proteasa peptona
0,4% de extracto de levadura
1% de tioglicolato sódico
0,4% de almidón soluble
1% de Na2HPO4.7H2O→ 35mM
DSMM
¿Podría ser el Pi o el pH la señal
para la esporulación?
→ 2mM Pi
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Efecto del Pi sobre la esporulación
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Efecto del Pi sobre la producción de CPE
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¿Es el Pi o el pH la señal para la
esporulación?
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Efecto del Pi sobre la esporulación
Pi, 100% esporas
Tris, < 5% esporas
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¿A que nivel del desarrollo de la espora actúa el Pi ?
Pi
DSMM + Pi 35 mM
DSMM
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¿A qué nivel del desarrollo de la espora sería requerido el Pi ?
SM101 (cepa tipo salvaje)
IH101 (mutante spo0A)
+Pi
+Pi
-Pi
-Pi
SM101 teñida con FM4-64
SM101 teñida con DAPI
+Pi
+Pi
-Pi
-Pi
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¿A qué nivel del desarrollo de la espora sería requerido el Pi ?
TRANSCRIPCIÓN DEL GEN spo0A
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Biomasa
Fosfato orgánico H2PO4-
Fe3+, Al3+, Ca2+
Fosfatos de
Fe, Al, Ca
Microorganismos
Mineralizacón
Orden
nanomolar
Orden
micromolar
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¿Rol fisiológico del Pi?
¿Existe algún hábitat natural con niveles de Pi suficientes que
permitan a C. perfringensesporular?
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El hábitat natural de C. perfringens
CPE
K
G
A
F
E
15-30 mM de Pi
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El Pi como señal medioambiental, pero no
nutricional
CPE
K
G
A
F
E
El TGI constituye un medio
ambiente rico en nutrientes
pero altamente hostil y
competitivo
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Rol del Pi como señal fisiológica
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Regulación catabólica por carbono de los factores de patogenicidad de Clostridiumperfringens relacionados con la gangrena
gaseosa
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Destrucción de tejido y de vasos sanguíneos por toxinas
liberadas.
Anoxia y proliferación
Avance de la gangrena con la consecuente necrosis de
los tejidos
Invasión y colonizaciónAdherencia
Capacidad de desplazarse y producir toxinas
mientras destruye tejidos
Gangrena gaseosa
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LA MOVILIDAD COMO FACTOR DE VIRULENCIA
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Movilidad en Clostridium perfringens.
C. perfringens ha sido originalmente clasificado como no móvil.
No posee flagelo.
No posee homólogos a genes de sistemas quimiotácticos.
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Sin embargo luego de secuenciarse los primeros genomas de C. perfringens patógenos se encontró que….
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Pili tipo IV y movilidad en Clostridium perfringens.
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LA MOVILIDAD COMO FACTOR DE VIRULENCIA
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Procesos bacterianos mediados por el Pili Tipo IV (T4P).
Adherencia a superficies bióticas y abióticas.
Conjugación bacteriana.
Incorporación de ADN exógeno.
Formación de comunidades complejas, biofilms.
Patogenia.
Desplazamientos bacterianos sobre diversas superficies.
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Ensayos de movilidad en placa con C. perfringens.
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TGY TY
Glu
Glu
Efecto de la concentración de glucosa.
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Movilidad no afectada
Movilidad reducida
Movilidad inhibida
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Diarrea en cerdos
Diarrea en perros
Diarrea en caballos
Diarrea esporádica
Diarrea asociada al uso de antibióticos
Intoxicación alimentaria
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Cinética del gliding de C. perfringens causante de gangrena gaseosa.
Sin glucosa
Con glucosa
125 mm h-1
600 a 700 mm h-1
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OTRO TIPO DE MOVILIDAD ASOCIADA A SUPERFICIES: EL SLIDING EN BACILLUS
Swarming Sliding
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Determinación de la expresión de genes de biosíntesis del T4P.
Cepa 13 / SM101
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Determinación de la expresión de genes de biosíntesis del T4P.
Cepa 13 / SM101
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Toxinas
Gangrena gaseosa, diarrea
asociado al uso de antibióticos y
consumo de alimentos
contaminados
C. perfringens
Clostridium perfringens
Pi
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Toxinas producidas por C. perfringens Tipo A, cepa 13.
Gen Nombre Letra griega
Actividad durante la gangrena gaseosa
plc PLC
(Fosfolipasa C)
Alfa Fosfolipasa C y Esfingomielasa. Promueve la agregación plaquetaria, generando anoxia por obturación de vasos sanguíneos.
pfoA PFO (Perfringolisina)
Theta Citotóxica para macrófagos. Importante en los estadíos iniciales de la infección. Involucradas en el escape de C. perfringens al fagosoma del macrófago.
colA Colagenasa Kappa Degradación de colágeno (Avance en el tejido de la gangrena gaseosa).
nagH Hialuronidasa Mu Endo-beta-N-acetilglucosaminidasa sería capaz de actuar sobre tejido conectivo (Avance en el tejido de la gangrena gaseosa).
nanI Neuraminidasa (Sialidasa)
Remueve ácido siálico de un gran número de glicoproteína, glicolípidos y oligosacáridos; estaría involucrada en la patogenia y nutrición de Clostridium (Avance en el tejido de la gangrena gaseosa).
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Gangrena gaseosa producida por Clostridium perfringens.
Infección aguda causada por C. perfringens (por ejemplo Cepa 13).
Las toxinas PLC y PFO son esenciales.
Destrucción de tejido, alteraciones en la agregación plaquetaria y en la marginación de leucocitos.
Terapia con antibióticos poco eficaz, la gangrena gaseosa puede avanzar hasta 1 cm por hora.
Escape de macrófagos Crean anoxia por reducción del flujo sanguíneo al sitio de
infección
Provisión de nutrientes
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A B
PL
C a
ctivity O
D 6
20
nm
Time relative to T0 (minutes)
PF
O a
ctivity O
D 5
50
nm
Time relative to T0 (minutes)
D
PL
C a
ctivity O
D 6
20
nm
PF
O a
ctivity O
D 5
50
nm
C
Time relative to T0 (minutes) Time relative to T0 (minutes)
DISMINUCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE TOXINAS DEBIDO A REPRESIÓN CATABÓLICA
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A B pfoA-gusAplc-gusA
plc
exp
ressio
n (
-glu
cu
ron
idase
activity, M
ille
r u
nits)
pfo
Ae
xp
ressio
n (
-glu
cu
ron
idase
activity, M
ille
r u
nits)
Time relative to T0 (minutes) Time relative to T0 (minutes)
C
16S rRNAplc pfoAmRNA
plc
-mR
NA
an
dp
foA
-mR
NA
no
rma
lize
d le
ve
ls
+Glucose + +
REPRESIÓN CATABÓLICA DE LA EXPRESIÓN DE GENES CODIFICANTES PARA TOXINAS
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Strain
+Glucose
Sucrose
Genotype13 KO13
++ +
ccpA-ccpA+
A BP
LC
activity
(OD
62
0 n
m)
plc
expre
ssio
n (-g
lucuro
nid
ase a
ctivity,
Mill
er
unid
s)
+
13 KO13
++ +
ccpA-ccpA+
C D
PLC
activity
(OD
6
20
nm
)
plc
expre
ssio
n (-g
lucuro
nid
ase a
ctivity,
Mill
er
unid
s)
KO13
+
ccpA-
Norm
aliz
ed
plc
-mR
NA
levels
E
LA PRODUCCIÓN DE TOXINAS Y LA EXPRESIÓN DE SUS GENES CODIFICANTES ESTÁN BAJO EL CONTROL DEL REGULADOR TRANSCRIPCIONAL POR CATABOLITO CcpA
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Jaque mate pastor a la Gangrena Gaseosa
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PROBIOTIC SPORESGERMINATION/PANSPERMIA
COLD SHOCK
LYMPHOCYTE PROLIFERATION
AND CELL-MEDIATED INMUNITY
Increased susceptibility
to bacterial and viral
infection
SEXUALITY/ FERTILITY
Sexual behavior
problems
Impotence
Loss of libido
Cardiac deficit
SKELETAL MUSCLE CELL
PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION
SPORE
DIFFERENTIATION
BRAIN DEVELOPMENT
OSTEOBLAST/ OSTEOCLAST
PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION
ALCOHOLAbuse, intoxication,
treatment
Learningdisabilities
DepressionPsycosis
Reducedbrain mass
Bone desease
FAS
REGULATION OF
DEVELOPMENT
PATHOGENESIS
SOCIO/PSYCHOMICROBIOLOGYECOLOGICAL ANTIBIOTIC
PRODUCTION
FRUITING BODY
FORMATION