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EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020

Meacutetodo para determinaccedilatildeo de concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima em caldo dos agentes antifuacutengicos

para leveduras

Autores

MC Arendrup J Meletiadis J W Mouton K Lagrou Petr Hamal J Guinea e o Subcomitecirc de Teste de

Sensibilidade aos Antifuacutengicos (Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing -AFST) do Comitecirc Europeu

para Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ESCMID European Committee for Antimicrobial

Susceptibility Testing -EUCAST)

Traduccedilatildeo

Dra Analy Salles de Azevedo Melo ndash Professora Afiliada da Disciplina de Infectologia Departamento de

Medicina Universidade Federal de Satildeo Paulo (UNIFESP) ndash Satildeo PauloSP ndash Satildeo PauloSP e Membro do

Subcomitecirc de Antifuacutengicos no Comitecirc Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (BrCAST)

Dr Joatildeo Noacutebrega de Almeida Juacutenior - Meacutedico Assistente do Laboratoacuterio de Microbiologia Divisatildeo de

Laboratoacuterio Central Hospital das Cliacutenicas Faculdade de Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (HC-FMUSP) -

Satildeo PauloSP e Membro do Subcomitecirc de Antifuacutengicos no Comitecirc Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos

Antimicrobianos (BrCAST)

Dra Kelly Ishida - Professora Doutora do Departamento de Microbiologia Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash

Universidade de Satildeo Paulo (ICB-USP) ndash Satildeo PauloSP e Coordenadora do Subcomitecirc de Antifuacutengicos no Comitecirc

Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (BrCAST)

2

INTRODUCcedilAtildeO

Os testes de sensibilidade aos antifuacutengicos (TSA) satildeo indicados para fungos que causam infecccedilatildeo

especialmente quando a infecccedilatildeo eacute invasiva quando o tratamento eacute falho ou recidivante quando a resistecircncia

aos antifuacutengicos eacute possiacutevel ou quando a sensibilidade natildeo pode ser predita atraveacutes da identificaccedilatildeo da espeacutecie

O TSA eacute tambeacutem importante para a vigilacircncia de resistecircncia estudos epidemioloacutegicos e comparaccedilatildeo da

atividade in vitro dos antifuacutengicos novos e existentes

Meacutetodos de diluiccedilatildeo satildeo usados para estabelecer as concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas (CIMs) dos

antimicrobianos eles satildeo os meacutetodos de referecircncia para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos e satildeo

usados principalmente para estabelecer a atividade dos novos antifuacutengicos para confirmar a suscetibilidade

dos organismos que apresentam resultados conflitantes em outros testes de sensibilidade (como os testes

comerciais) e para determinar a suscetibilidade de organismos quando outros testes natildeo satildeo confiaacuteveis ou

natildeo foram validados Em meacutetodos de diluiccedilatildeo fungos satildeo avaliados pela sua habilidade em produzir

crescimento suficiente em poccedilos de placas de microdiluiccedilatildeo de meio de cultura liacutequido contendo diluiccedilotildees

seriadas dos agentes antifuacutengicos (microdiluiccedilatildeo em caldo)

A CIM do antifuacutengico eacute definida como a menor concentraccedilatildeo registrada em mgL do antifuacutengico que inibe o

crescimento do fungo em percentual preacute-definido (por exemplo 50 90 ou inibiccedilatildeo total) A CIM informa

sobre a sensibilidade ou a resistecircncia do organismo ao antifuacutengico a qual pode ajudar em decisotildees de

tratamento

A versatildeo atualizada (732) deste documento eacute direcionada para o teste de sensibilidade de leveduras de

importacircncia meacutedica (primariamente Candida e Cryptococcus) A primeira versatildeo deste documento foi

publicada em um documento provisoacuterio (71) em 2003 [1] e definitivo em 2008 [2] A segunda versatildeo do

documento continha informaccedilatildeo adicional a respeito dos solventes para caspofungina micafungina e

fluconazol tempo de estoque para placas contendo equinocandinas teste de sensibilidade para Cryptococcus

e os intervalos de CIM de anidulafungina para cepas de controle de qualidade [3] A terceira versatildeo foi

harmonizada em texto e formato com o documento definitivo para fungos filamentosos 932 e a definiccedilatildeo

revisada da categoria I foi introduzida e os intervalos de CIM para as cepas de controle de qualidade foram

removidos (e criado um documento separado resumindo todos os intervalos de CIM dos antifuacutengicos para as

cepas controle de qualidade - disponiacutevel no website httpwwwEUCASTorg) evitando a necessidade de

lanccedilamento de novos documentos com eventuais atualizaccedilotildees dos intervalos de CIM para as cepas controle

de qualidade A seccedilatildeo contendo a preparaccedilatildeo e calibraccedilatildeo do espectrofotocircmetro tambeacutem foi modificada no

presente documento

ESCOPO

Esta padronizaccedilatildeo EUCAST descreve um meacutetodo de teste de sensibilidade de leveduras para antifuacutengicos pela

determinaccedilatildeo da CIM As CIMs mostram a atividade in vitro de determinado antifuacutengico nas condiccedilotildees

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INTRODUCcedilAtildeO

Os testes de sensibilidade aos antifuacutengicos (TSA) satildeo indicados para fungos que causam infecccedilatildeo

especialmente quando a infecccedilatildeo eacute invasiva quando o tratamento eacute falho ou recidivante quando a resistecircncia

aos antifuacutengicos eacute possiacutevel ou quando a sensibilidade natildeo pode ser predita atraveacutes da identificaccedilatildeo da espeacutecie

O TSA eacute tambeacutem importante para a vigilacircncia de resistecircncia estudos epidemioloacutegicos e comparaccedilatildeo da

atividade in vitro dos antifuacutengicos novos e existentes

Meacutetodos de diluiccedilatildeo satildeo usados para estabelecer as concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas (CIMs) dos

antimicrobianos eles satildeo os meacutetodos de referecircncia para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos e satildeo

usados principalmente para estabelecer a atividade dos novos antifuacutengicos para confirmar a suscetibilidade

dos organismos que apresentam resultados conflitantes em outros testes de sensibilidade (como os testes

comerciais) e para determinar a suscetibilidade de organismos quando outros testes natildeo satildeo confiaacuteveis ou

natildeo foram validados Em meacutetodos de diluiccedilatildeo fungos satildeo avaliados pela sua habilidade em produzir

crescimento suficiente em poccedilos de placas de microdiluiccedilatildeo de meio de cultura liacutequido contendo diluiccedilotildees

seriadas dos agentes antifuacutengicos (microdiluiccedilatildeo em caldo)

A CIM do antifuacutengico eacute definida como a menor concentraccedilatildeo registrada em mgL do antifuacutengico que inibe o

crescimento do fungo em percentual preacute-definido (por exemplo 50 90 ou inibiccedilatildeo total) A CIM informa

sobre a sensibilidade ou a resistecircncia do organismo ao antifuacutengico a qual pode ajudar em decisotildees de

tratamento

A versatildeo atualizada (732) deste documento eacute direcionada para o teste de sensibilidade de leveduras de

importacircncia meacutedica (primariamente Candida e Cryptococcus) A primeira versatildeo deste documento foi

publicada em um documento provisoacuterio (71) em 2003 [1] e definitivo em 2008 [2] A segunda versatildeo do

documento continha informaccedilatildeo adicional a respeito dos solventes para caspofungina micafungina e

fluconazol tempo de estoque para placas contendo equinocandinas teste de sensibilidade para Cryptococcus

e os intervalos de CIM de anidulafungina para cepas de controle de qualidade [3] A terceira versatildeo foi

harmonizada em texto e formato com o documento definitivo para fungos filamentosos 932 e a definiccedilatildeo

revisada da categoria I foi introduzida e os intervalos de CIM para as cepas de controle de qualidade foram

removidos (e criado um documento separado resumindo todos os intervalos de CIM dos antifuacutengicos para as

cepas controle de qualidade - disponiacutevel no website httpwwwEUCASTorg) evitando a necessidade de

lanccedilamento de novos documentos com eventuais atualizaccedilotildees dos intervalos de CIM para as cepas controle

de qualidade A seccedilatildeo contendo a preparaccedilatildeo e calibraccedilatildeo do espectrofotocircmetro tambeacutem foi modificada no

presente documento

ESCOPO

Esta padronizaccedilatildeo EUCAST descreve um meacutetodo de teste de sensibilidade de leveduras para antifuacutengicos pela

determinaccedilatildeo da CIM As CIMs mostram a atividade in vitro de determinado antifuacutengico nas condiccedilotildees

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descritas para o teste e podem ser usados para o manejo das infecccedilotildees em conjunto com outros fatores como

farmacocineacutetica farmacodinacircmica e mecanismos de resistecircncia Os valores de CIM permitem que os fungos

sejam categorizados como ldquosensiacuteveisrdquo ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo aumentadardquo ou ldquoresistentesrdquo para determinados

antifuacutengicos se os pontos de cortes cliacutenicos apropriados estiverem sido estabelecidos Adicionalmente a

distribuiccedilatildeo das CIMs pode ser usada para determinar populaccedilotildees selvagens ou natildeo-selvagens quando pontos

de corte epidemioloacutegicos espeacutecie-especiacuteficos satildeo aplicados

Este documento tem o intuito de fornecer um meacutetodo adequado faacutecil raacutepido e econocircmico para o teste de

sensibilidade aos antifuacutengicos de leveduras e facilitar o grau de reprodutibilidade inter-laboratorial Como os

fatores teacutecnicos laboratoriais satildeo de grande relevacircncia esta padronizaccedilatildeo eacute focada nas condiccedilotildees do teste

incluindo preparaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo do inoacuteculo tempo de incubaccedilatildeo temperatura e formulaccedilatildeo do meio

TERMOS E DEFINICcedilOtildeES

1 Antifuacutengico substacircncia de origem natural sinteacutetica ou semi-sinteacutetica que inibe o crescimento ou eacute letal para

o fungo Desinfetantes antisseacutepticos ou conservantes natildeo fazem parte desta definiccedilatildeo

2 Propriedades dos antifuacutengicos

a Potecircncia Fraccedilatildeo antimicrobiana ativa de uma substacircncia testada A potecircncia eacute expressa em miligramas por

grama (mgg) ou como conteuacutedo ativo em Unidades Internacionais (UI) por grama ou como uma fraccedilatildeo de

volume ou fraccedilatildeo de massa em percentual ou como uma quantidade da concentraccedilatildeo de uma substacircncia

(fraccedilatildeo de massa) em mol por litro dos ingredientes na substacircncia teste

b Concentraccedilatildeo Quantidade de um agente antimicrobiano em um volume definido do liacutequido A concentraccedilatildeo

eacute expressa em unidades do SI como miligramas por litro (mgL)

3 Soluccedilatildeo de estoque Soluccedilatildeo inicial usada para as diluiccedilotildees adicionais

4 Concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima Miacutenima concentraccedilatildeo do antifuacutengico que inibe o crescimento da levedura

em determinado periacuteodo de tempo A CIM eacute expressa em mgL

5 Pontos de corte (breakpoints) Valores especiacuteficos de CIM nos quais os fungos podem ser classificados nas

categorias cliacutenicas ldquosensiacutevelrdquo ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo aumentadardquo ou ldquoresistenterdquo Os valores dos pontos de

corte podem ser alterados com o surgimento de novas informaccedilotildees (ex mudanccedilas na dose de antifuacutengicos

comumente usados) ou quando surgir dadosconhecimentos adicionais

a) S - Sensiacutevel regime de dose padratildeo um microrganismo eacute categorizado como ldquosensiacutevel regime de dose

padratildeordquo quando existe alta probabilidade de sucesso terapecircutico usando o regime de dosagem padratildeo do

agente antimicrobiano

b) I ndash sensiacutevel exposiccedilatildeo aumentada um microrganismo eacute categorizado como ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo

aumentadardquo quando existe alta probabilidade de sucesso terapecircutico somente quando satildeo utilizadas doses

mais altas do agente antimicrobiano que o normal ou quando o agente tem elevada concentraccedilatildeo no siacutetio da

infecccedilatildeo

4

c) R - Resistente um microrganismo eacute categorizado como ldquoresistenterdquo quando existe uma alta probabilidade de

falha terapecircutica mesmo quando a exposiccedilatildeo ao antimicrobiano eacute aumentada

Exposiccedilatildeo eacute uma funccedilatildeo de como o modo de administraccedilatildeo dose intervalo entre as doses tempo de

infusatildeo bem como a distribuiccedilatildeo e a excreccedilatildeo do antimicrobiano influenciaraacute o microrganismo no siacutetio de

infecccedilatildeo

6 Selvagem (Wild Type WT) Uma levedura eacute denominada selvagem (WT) para uma espeacutecie pela ausecircncia de

resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel e mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de resistecircncia para o

agente em questatildeo

7 Natildeo Selvagem (Non-Wild Type NWT) Uma levedura eacute denominada natildeo selvagem (NWT) para uma espeacutecie

pela presenccedila de resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel ou mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de

resistecircncia para o agente em questatildeo

Notas

a) Um isolado de levedura eacute classificado como S I ou R ao se aplicar os pontos de corte cliacutenicos (clinical

breakpoints) em um teste fenotiacutepico definido

b) Um isolado de levedura eacute classificado como selvagem (WT) ou natildeo selvagem (NWT) ao se aplicar os pontos de

corte epidemioloacutegicos (ECOFFs) em um teste fenotiacutepico definido

c) Microrganismos natildeo selvagens (NWT) podem ter um ou mais mecanismos de resistecircncia mas dependendo

dos valores dos pontos de cortes cliacutenicos (clinical breakpoints) microrganismos selvagens (WT) e natildeo selvagens

(NWT) podem ou natildeo responder clinicamente ao tratamento com o agente especiacutefico

d) O microrganismo selvagem eacute apresentado como WT lez mgL e o natildeo selvagem como NWT gt z mgL (onde z eacute

o ponto de corte epidemioloacutegico ou ECOFF) O ECOFF eacute o maior valor de CIM para isolados sem mecanismos

de resistecircncia fenotipicamente detectaacuteveis

e) O valor de ECOFF natildeo seraacute alterado a natildeo ser que novos dados acumulativos de CIM indiquem a necessidade

de ajuste

8 Cepas de referecircncia para controle de qualidade Cepas catalogadas e caracterizadas com estaacuteveis e definidos

fenoacutetipos eou genoacutetipos de sensibilidade aos antifuacutengicos Satildeo obtidas de coleccedilotildees de culturas e usadas para

fins de controle de qualidade

9 Meacutetodo do teste de sensibilidade

a) Diluiccedilatildeo em caldo Teacutecnica em que diluiccedilotildees seriadas (usualmente 12) do antifuacutengico satildeo realizadas em

meio liacutequido que eacute inoculado com um nuacutemero padronizado de organismos e incubado por um tempo

determinado O objetivo deste meacutetodo eacute a determinaccedilatildeo de CIM

b) Microdiluiccedilatildeo Execuccedilatildeo da diluiccedilatildeo em caldo em placas de microdiluiccedilatildeo com uma capacidade de

aproximadamente 300 microL por poccedilo

10 Caldo Meio liacutequido usado para o crescimento in vitro do fungo

11 Inoacuteculo Nuacutemero de leveduras (unidades formadoras de colocircnias) suspendida em um certo volume O inoacuteculo

eacute expressado como unidades formadoras de colocircnia por mililitro (UFCmL)

5

PROCEDIMENTO DO TESTE

Geral

O teste eacute realizado em uma placa de microdiluiccedilatildeo de fundo chato Tampas de vedaccedilatildeo de evaporaccedilatildeo natildeo

devem ser utilizadas pois afetam a concentraccedilatildeo de oxigecircnio

Dados preliminares sugerem que placas de microdiluiccedilatildeo tratadas versus natildeo tratadas para tecido produzem

valores de CIMs diferentes (dados natildeo publicados) Aleacutem disso diferentes plaacutesticos parecem ter impacto na

ligaccedilatildeo da droga o que pode afetar os valores de CIM Estudos futuros satildeo necessaacuterios para avaliar estes

fatores Para a maioria das distribuiccedilotildees de CIM obtidas pelo comitecirc do EUCAST para determinaccedilatildeo de valores

de ECOFF e pontos de corte foram utilizadas placas de microdiluiccedilatildeo tratadas para tecidos e satildeo portanto

melhores para produzir valores de CIM similares O meacutetodo eacute baseado na preparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalho

de agentes antifuacutengicos em volumes de 100 L por poccedilo aos quais inoacuteculos de 100 L satildeo adicionados

Meio

RPMI 1640 (com L-glutamina e indicador de pH sem bicarbonato) suplementado com glicose para uma

concentraccedilatildeo final de 2 (RPMI 2 G) eacute recomendado [4] A utilizaccedilatildeo de 2 ao inveacutes do padratildeo de 02 de

concentraccedilatildeo de glicose tem mostrado resultados com melhor crescimento e facilidade na determinaccedilatildeo do

ponto final [5] Aacutecido 3-(N-morfolino) propanosulfocircnico (MOPS) em concentraccedilatildeo final de 0165 molL pH 70

eacute o tampatildeo recomendado para ser usado para o meio RPMI 1640 A composiccedilatildeo do RPMI 1640 estaacute

apresentada na Tabela 1 O meio recomendado RPMI com 2 de glicose (RPMI 2 G) eacute preparado com o

dobro da concentraccedilatildeo (para permitir diluiccedilatildeo de 50 [11] uma vez que o inoacuteculo eacute adicionado ver

ldquoPreparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalhordquo em diante) como segue

1 Adicione os componentes conforme a Tabela 2 a 900 mL de aacutegua destilada

2 Agitar ateacute que os componentes estejam completamente dissolvidos

3 Com agitaccedilatildeo ajuste o pH para 70 a 25C com 1 M de hidroacutexido de soacutedio

4 Adicione aacutegua para um volume final de 1000 mL

5 Esterilizar por filtraccedilatildeo utilizando filtro com poros de 022 m

6 Armazenar a temperatura de 4C ou menor por ateacute 6 meses

7 Para controle de qualidade use uma aliacutequota do meio esterilizado para verificar a esterilidade para

re-testar o pH (69 ndash 71 eacute aceitaacutevel) e para controle de crescimento com uma cepa referecircncia

Meio para teste de anfotericina B

Atualmente eacute recomendado que o RPMI 2 G seja usado tambeacutem para anfotericina B O caldo natildeo-sinteacutetico

Antibiotic Medium 3 (AM3) suplementado com concentraccedilatildeo final de glicose a 2 tem sido utilizado para a

detecccedilatildeo de resistecircncia a anfotericina B [6-9] Entretanto existe variaccedilotildees de lote para lote deste meio e

6

tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um

inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3

AGENTES ANTIFUacuteNGICOS

Geral

Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes

puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis

Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste

de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data

de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos

a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo

fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento

de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente

antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute

Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque

Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do

antifuacutengico que seraacute utilizado

A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue

Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)

Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)

O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso

por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo

da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo

menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees

sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a

aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o

antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis

7

de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador

por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das

soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento

deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)

para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada

durante o processo

A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos

volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados

a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram

previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6

meses a esta temperatura [11]

Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa

do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade

(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado

para determinar a potecircncia

Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho

A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A

variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados

para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo

na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado

O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo

de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em

aacutegua destilada

As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa

que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute

mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um

resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito

a seguir

1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser

difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais

2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela

4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos

3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo

final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo

necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente

4

c) R - Resistente um microrganismo eacute categorizado como ldquoresistenterdquo quando existe uma alta probabilidade de

falha terapecircutica mesmo quando a exposiccedilatildeo ao antimicrobiano eacute aumentada

Exposiccedilatildeo eacute uma funccedilatildeo de como o modo de administraccedilatildeo dose intervalo entre as doses tempo de

infusatildeo bem como a distribuiccedilatildeo e a excreccedilatildeo do antimicrobiano influenciaraacute o microrganismo no siacutetio de

infecccedilatildeo

6 Selvagem (Wild Type WT) Uma levedura eacute denominada selvagem (WT) para uma espeacutecie pela ausecircncia de

resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel e mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de resistecircncia para o

agente em questatildeo

7 Natildeo Selvagem (Non-Wild Type NWT) Uma levedura eacute denominada natildeo selvagem (NWT) para uma espeacutecie

pela presenccedila de resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel ou mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de

resistecircncia para o agente em questatildeo

Notas

a) Um isolado de levedura eacute classificado como S I ou R ao se aplicar os pontos de corte cliacutenicos (clinical

breakpoints) em um teste fenotiacutepico definido

b) Um isolado de levedura eacute classificado como selvagem (WT) ou natildeo selvagem (NWT) ao se aplicar os pontos de

corte epidemioloacutegicos (ECOFFs) em um teste fenotiacutepico definido

c) Microrganismos natildeo selvagens (NWT) podem ter um ou mais mecanismos de resistecircncia mas dependendo

dos valores dos pontos de cortes cliacutenicos (clinical breakpoints) microrganismos selvagens (WT) e natildeo selvagens

(NWT) podem ou natildeo responder clinicamente ao tratamento com o agente especiacutefico

d) O microrganismo selvagem eacute apresentado como WT lez mgL e o natildeo selvagem como NWT gt z mgL (onde z eacute

o ponto de corte epidemioloacutegico ou ECOFF) O ECOFF eacute o maior valor de CIM para isolados sem mecanismos

de resistecircncia fenotipicamente detectaacuteveis

e) O valor de ECOFF natildeo seraacute alterado a natildeo ser que novos dados acumulativos de CIM indiquem a necessidade

de ajuste

8 Cepas de referecircncia para controle de qualidade Cepas catalogadas e caracterizadas com estaacuteveis e definidos

fenoacutetipos eou genoacutetipos de sensibilidade aos antifuacutengicos Satildeo obtidas de coleccedilotildees de culturas e usadas para

fins de controle de qualidade

9 Meacutetodo do teste de sensibilidade

a) Diluiccedilatildeo em caldo Teacutecnica em que diluiccedilotildees seriadas (usualmente 12) do antifuacutengico satildeo realizadas em

meio liacutequido que eacute inoculado com um nuacutemero padronizado de organismos e incubado por um tempo

determinado O objetivo deste meacutetodo eacute a determinaccedilatildeo de CIM

b) Microdiluiccedilatildeo Execuccedilatildeo da diluiccedilatildeo em caldo em placas de microdiluiccedilatildeo com uma capacidade de

aproximadamente 300 microL por poccedilo

10 Caldo Meio liacutequido usado para o crescimento in vitro do fungo

11 Inoacuteculo Nuacutemero de leveduras (unidades formadoras de colocircnias) suspendida em um certo volume O inoacuteculo

eacute expressado como unidades formadoras de colocircnia por mililitro (UFCmL)

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PROCEDIMENTO DO TESTE

Geral

O teste eacute realizado em uma placa de microdiluiccedilatildeo de fundo chato Tampas de vedaccedilatildeo de evaporaccedilatildeo natildeo

devem ser utilizadas pois afetam a concentraccedilatildeo de oxigecircnio

Dados preliminares sugerem que placas de microdiluiccedilatildeo tratadas versus natildeo tratadas para tecido produzem

valores de CIMs diferentes (dados natildeo publicados) Aleacutem disso diferentes plaacutesticos parecem ter impacto na

ligaccedilatildeo da droga o que pode afetar os valores de CIM Estudos futuros satildeo necessaacuterios para avaliar estes

fatores Para a maioria das distribuiccedilotildees de CIM obtidas pelo comitecirc do EUCAST para determinaccedilatildeo de valores

de ECOFF e pontos de corte foram utilizadas placas de microdiluiccedilatildeo tratadas para tecidos e satildeo portanto

melhores para produzir valores de CIM similares O meacutetodo eacute baseado na preparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalho

de agentes antifuacutengicos em volumes de 100 L por poccedilo aos quais inoacuteculos de 100 L satildeo adicionados

Meio

RPMI 1640 (com L-glutamina e indicador de pH sem bicarbonato) suplementado com glicose para uma

concentraccedilatildeo final de 2 (RPMI 2 G) eacute recomendado [4] A utilizaccedilatildeo de 2 ao inveacutes do padratildeo de 02 de

concentraccedilatildeo de glicose tem mostrado resultados com melhor crescimento e facilidade na determinaccedilatildeo do

ponto final [5] Aacutecido 3-(N-morfolino) propanosulfocircnico (MOPS) em concentraccedilatildeo final de 0165 molL pH 70

eacute o tampatildeo recomendado para ser usado para o meio RPMI 1640 A composiccedilatildeo do RPMI 1640 estaacute

apresentada na Tabela 1 O meio recomendado RPMI com 2 de glicose (RPMI 2 G) eacute preparado com o

dobro da concentraccedilatildeo (para permitir diluiccedilatildeo de 50 [11] uma vez que o inoacuteculo eacute adicionado ver

ldquoPreparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalhordquo em diante) como segue

1 Adicione os componentes conforme a Tabela 2 a 900 mL de aacutegua destilada

2 Agitar ateacute que os componentes estejam completamente dissolvidos

3 Com agitaccedilatildeo ajuste o pH para 70 a 25C com 1 M de hidroacutexido de soacutedio

4 Adicione aacutegua para um volume final de 1000 mL

5 Esterilizar por filtraccedilatildeo utilizando filtro com poros de 022 m

6 Armazenar a temperatura de 4C ou menor por ateacute 6 meses

7 Para controle de qualidade use uma aliacutequota do meio esterilizado para verificar a esterilidade para

re-testar o pH (69 ndash 71 eacute aceitaacutevel) e para controle de crescimento com uma cepa referecircncia

Meio para teste de anfotericina B

Atualmente eacute recomendado que o RPMI 2 G seja usado tambeacutem para anfotericina B O caldo natildeo-sinteacutetico

Antibiotic Medium 3 (AM3) suplementado com concentraccedilatildeo final de glicose a 2 tem sido utilizado para a

detecccedilatildeo de resistecircncia a anfotericina B [6-9] Entretanto existe variaccedilotildees de lote para lote deste meio e

6

tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um

inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3

AGENTES ANTIFUacuteNGICOS

Geral

Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes

puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis

Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste

de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data

de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos

a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo

fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento

de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente

antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute

Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque

Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do

antifuacutengico que seraacute utilizado

A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue

Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)

Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)

O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso

por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo

da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo

menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees

sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a

aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o

antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis

7

de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador

por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das

soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento

deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)

para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada

durante o processo

A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos

volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados

a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram

previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6

meses a esta temperatura [11]

Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa

do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade

(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado

para determinar a potecircncia

Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho

A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A

variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados

para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo

na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado

O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo

de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em

aacutegua destilada

As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa

que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute

mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um

resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito

a seguir

1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser

difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais

2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela

4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos

3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo

final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo

necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente

5

PROCEDIMENTO DO TESTE

Geral

O teste eacute realizado em uma placa de microdiluiccedilatildeo de fundo chato Tampas de vedaccedilatildeo de evaporaccedilatildeo natildeo

devem ser utilizadas pois afetam a concentraccedilatildeo de oxigecircnio

Dados preliminares sugerem que placas de microdiluiccedilatildeo tratadas versus natildeo tratadas para tecido produzem

valores de CIMs diferentes (dados natildeo publicados) Aleacutem disso diferentes plaacutesticos parecem ter impacto na

ligaccedilatildeo da droga o que pode afetar os valores de CIM Estudos futuros satildeo necessaacuterios para avaliar estes

fatores Para a maioria das distribuiccedilotildees de CIM obtidas pelo comitecirc do EUCAST para determinaccedilatildeo de valores

de ECOFF e pontos de corte foram utilizadas placas de microdiluiccedilatildeo tratadas para tecidos e satildeo portanto

melhores para produzir valores de CIM similares O meacutetodo eacute baseado na preparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalho

de agentes antifuacutengicos em volumes de 100 L por poccedilo aos quais inoacuteculos de 100 L satildeo adicionados

Meio

RPMI 1640 (com L-glutamina e indicador de pH sem bicarbonato) suplementado com glicose para uma

concentraccedilatildeo final de 2 (RPMI 2 G) eacute recomendado [4] A utilizaccedilatildeo de 2 ao inveacutes do padratildeo de 02 de

concentraccedilatildeo de glicose tem mostrado resultados com melhor crescimento e facilidade na determinaccedilatildeo do

ponto final [5] Aacutecido 3-(N-morfolino) propanosulfocircnico (MOPS) em concentraccedilatildeo final de 0165 molL pH 70

eacute o tampatildeo recomendado para ser usado para o meio RPMI 1640 A composiccedilatildeo do RPMI 1640 estaacute

apresentada na Tabela 1 O meio recomendado RPMI com 2 de glicose (RPMI 2 G) eacute preparado com o

dobro da concentraccedilatildeo (para permitir diluiccedilatildeo de 50 [11] uma vez que o inoacuteculo eacute adicionado ver

ldquoPreparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalhordquo em diante) como segue

1 Adicione os componentes conforme a Tabela 2 a 900 mL de aacutegua destilada

2 Agitar ateacute que os componentes estejam completamente dissolvidos

3 Com agitaccedilatildeo ajuste o pH para 70 a 25C com 1 M de hidroacutexido de soacutedio

4 Adicione aacutegua para um volume final de 1000 mL

5 Esterilizar por filtraccedilatildeo utilizando filtro com poros de 022 m

6 Armazenar a temperatura de 4C ou menor por ateacute 6 meses

7 Para controle de qualidade use uma aliacutequota do meio esterilizado para verificar a esterilidade para

re-testar o pH (69 ndash 71 eacute aceitaacutevel) e para controle de crescimento com uma cepa referecircncia

Meio para teste de anfotericina B

Atualmente eacute recomendado que o RPMI 2 G seja usado tambeacutem para anfotericina B O caldo natildeo-sinteacutetico

Antibiotic Medium 3 (AM3) suplementado com concentraccedilatildeo final de glicose a 2 tem sido utilizado para a

detecccedilatildeo de resistecircncia a anfotericina B [6-9] Entretanto existe variaccedilotildees de lote para lote deste meio e

6

tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um

inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3

AGENTES ANTIFUacuteNGICOS

Geral

Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes

puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis

Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste

de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data

de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos

a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo

fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento

de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente

antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute

Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque

Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do

antifuacutengico que seraacute utilizado

A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue

Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)

Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)

O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso

por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo

da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo

menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees

sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a

aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o

antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis

7

de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador

por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das

soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento

deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)

para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada

durante o processo

A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos

volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados

a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram

previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6

meses a esta temperatura [11]

Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa

do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade

(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado

para determinar a potecircncia

Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho

A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A

variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados

para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo

na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado

O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo

de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em

aacutegua destilada

As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa

que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute

mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um

resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito

a seguir

1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser

difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais

2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela

4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos

3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo

final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo

necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente

6

tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um

inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3

AGENTES ANTIFUacuteNGICOS

Geral

Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes

puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis

Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste

de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data

de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos

a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo

fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento

de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente

antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute

Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque

Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do

antifuacutengico que seraacute utilizado

A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue

Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)

Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)

O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso

por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo

da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo

menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees

sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a

aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o

antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis

7

de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador

por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das

soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento

deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)

para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada

durante o processo

A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos

volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados

a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram

previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6

meses a esta temperatura [11]

Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa

do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade

(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado

para determinar a potecircncia

Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho

A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A

variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados

para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo

na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado

O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo

de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em

aacutegua destilada

As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa

que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute

mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um

resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito

a seguir

1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser

difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais

2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela

4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos

3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo

final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo

necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente

7

de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador

por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das

soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento

deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)

para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada

durante o processo

A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos

volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados

a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram

previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6

meses a esta temperatura [11]

Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa

do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade

(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado

para determinar a potecircncia

Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho

A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A

variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados

para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo

na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado

O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo

de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em

aacutegua destilada

As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa

que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute

mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um

resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito

a seguir

1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser

difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais

2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela

4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos

3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo

final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo

necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente

8

4 Dispense 99 mL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo em 10 tubos

5 Retire 100 microL de cada tubo com 200 x a concentraccedilatildeo final da droga antifuacutengica em solvente e

transfira para 10 tubos com 99 mL do meio de cultura (diluiccedilatildeo 1100) A concentraccedilatildeo do solvente nos tubos

com o meio de cultura eacute 1 e a concentraccedilatildeo dos agentes antifuacutengicos eacute 2 x a concentraccedilatildeo final

Esquemas de diluiccedilatildeo alternativos podem ser usados se eles mostrarem uma performance tatildeo boa quanto ao

meacutetodo de referecircncia [13]

Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo

Usar plaacutesticos esteacutereis (evitando os plaacutesticos de alta ligaccedilatildeo) descartaacuteveis placas de microdiluiccedilatildeo com 96

poccedilos com poccedilos de fundo chato sem tampas de baixa evaporaccedilatildeo com capacidade de aproximadamente

300 microL por poccedilo

Nos poccedilos de 1 a 10 de cada coluna da placa de microdiluiccedilatildeo dispense 100 microL de cada tubo contendo a

concentraccedilatildeo correspondente (2 x a concentraccedilatildeo final) do agente antifuacutengico Por exemplo para itraconazol

dispense na coluna 1 o meio contendo 16 mgL na coluna 2 meio contendo 8 mgL e assim por diante ateacute a

coluna 10 para o meio contendo 003 mgL

Para cada poccedilo das colunas 11 e 12 dispense 100 microL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo

Sendo assim cada coluna de 1 a 10 conteraacute 100 microL de 2x a concentraccedilatildeo final do antifuacutengico em meio RPMI

2 G com o dobro da concentraccedilatildeo e com 1 do solvente As colunas 11 e 12 conteratildeo o dobro da

concentraccedilatildeo do meio RPMI 2 G

Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo

As placas podem ser seladas com filme plaacutestico ou folha de alumiacutenio e estocadas a -70ordmC ou abaixo por ateacute 6

meses ou a -20ordmC por no maacuteximo 1 mecircs sem perda da potecircncia do antifuacutengico [11] As equinocandinas satildeo

menos estaacuteveis portanto devem ser preparadas e estocadas a -70ordmC (e natildeo a -20ordmC) (dados natildeo publicados M

Cuenca-Estrella)

Uma vez que as placas forem descongeladas natildeo devem ser recongeladas As placas devem ser usadas

imediatamente quando forem retiradas do freezer particularmente CIMs de anidulafungina podem aumentar

se as placas forem deixadas a temperatura ambiente depois de descongeladas muito antes da inoculaccedilatildeo

PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO

A padronizaccedilatildeo do inoacuteculo eacute essencial para a acuraacutecia e reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos

antifuacutengicos

O inoacuteculo deve ser preparado ressuspendendo 5 colocircnias representativas obtidas de cultura de 18-24 h em

meio aacutegar nutritivo em aacutegua destilada A concentraccedilatildeo final deve ficar entre 05 x 105 e 25 x 105 CFUmL

9

Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia

1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar

Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste

2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h

em pelo menos 3mL de aacutegua destilada

3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000

rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia

em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute

um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1

para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um

turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland

Cryptococcus spp

Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas

placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST

Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em

comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento

(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte

de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo

(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio

YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram

a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os

diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute

recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para

espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de

crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o

valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido

mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC

INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO

As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a

fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis

Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de

leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este

procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25

x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio

10

esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de

microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de

esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle

de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado

Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes

conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador

giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar

Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser

verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril

homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma

contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o

procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o

teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido

localmente dependendo da necessidade)

INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO

Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia

le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida

guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se

absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma

absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C

RESULTADOS DA LEITURA

As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda

recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por

exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos

Anfotericina B

A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado

com controle de crescimento livre de antifuacutengico

Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas

A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave

inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico

INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e

espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e

11

no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de

antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente

levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a

terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e

importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de

valores de pontos de corte e de ECOFF

CONTROLE DE QUALIDADE

Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos

em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles

Cepas controle

CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das

concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas

controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de

acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas

C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo

da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para

este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture

Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)

ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar

Estoque das cepas controles

Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem

ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose

inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas

Uso de rotina das cepas controles

Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado

ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar

Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)

1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo

esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora

do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada

2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo

teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final

3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para

garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido

9

Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia

1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar

Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste

2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h

em pelo menos 3mL de aacutegua destilada

3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000

rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia

em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute

um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1

para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um

turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland

Cryptococcus spp

Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas

placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST

Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em

comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento

(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte

de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo

(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio

YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram

a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os

diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute

recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para

espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de

crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o

valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido

mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC

INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO

As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a

fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis

Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de

leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este

procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25

x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio

10

esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de

microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de

esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle

de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado

Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes

conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador

giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar

Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser

verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril

homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma

contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o

procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o

teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido

localmente dependendo da necessidade)

INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO

Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia

le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida

guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se

absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma

absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C

RESULTADOS DA LEITURA

As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda

recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por

exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos

Anfotericina B

A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado

com controle de crescimento livre de antifuacutengico

Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas

A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave

inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico

INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e

espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e

11

no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de

antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente

levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a

terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e

importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de

valores de pontos de corte e de ECOFF

CONTROLE DE QUALIDADE

Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos

em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles

Cepas controle

CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das

concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas

controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de

acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas

C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo

da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para

este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture

Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)

ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar

Estoque das cepas controles

Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem

ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose

inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas

Uso de rotina das cepas controles

Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado

ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar

Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)

1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo

esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora

do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada

2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo

teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final

3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para

garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido

10

esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de

microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de

esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle

de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado

Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes

conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador

giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar

Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser

verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril

homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma

contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o

procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o

teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido

localmente dependendo da necessidade)

INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO

Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia

le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida

guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se

absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma

absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C

RESULTADOS DA LEITURA

As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda

recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por

exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos

Anfotericina B

A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado

com controle de crescimento livre de antifuacutengico

Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas

A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave

inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico

INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e

espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e

11

no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de

antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente

levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a

terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e

importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de

valores de pontos de corte e de ECOFF

CONTROLE DE QUALIDADE

Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos

em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles

Cepas controle

CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das

concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas

controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de

acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas

C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo

da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para

este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture

Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)

ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar

Estoque das cepas controles

Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem

ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose

inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas

Uso de rotina das cepas controles

Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado

ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar

Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)

1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo

esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora

do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada

2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo

teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final

3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para

garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido

11

no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de

antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente

levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a

terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e

importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de

valores de pontos de corte e de ECOFF

CONTROLE DE QUALIDADE

Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos

em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles

Cepas controle

CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das

concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas

controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de

acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas

C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo

da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para

este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture

Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)

ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar

Estoque das cepas controles

Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem

ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose

inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas

Uso de rotina das cepas controles

Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado

ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar

Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)

1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo

esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora

do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada

2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo

teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final

3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para

garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido

12

4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas

controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro

dos intervalos esperados

13

REFEREcircNCIAS

14

15

Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640

Constituinte

gL

L-arginina (base livre) 0200

Biotina 00002

L-asparagina (anidra) 0050

D-pantotecircnico 000025

L-aspaacutertico aacutecido 0020

Colina cloreto de 0003

L-cistina bull 2HCI 00652

Foacutelico aacutecido 0001

L-glutacircmico aacutecido 0020

Mioinositol 0035

L-glutamina 0300

Niacinamida 0001

Glicina 0010

PABA 0001

L-histidina (base livre) 0015

Piridoxina HCl 0001

L-hidroxiprolina 0020

Riboflavina 00002

L-isoleucina 0050

Tiamina HCl 0001

L-leucina 0050

Vitamina B12 0000005

L-lisina bull HCI 0040

Nitrato de caacutelcioH2O 0100

L-metionina 0015

Cloreto de potaacutessio 0400

L-fenilalanina 0015

Sulfato de magneacutesio

(anidro)

004884

L-prolina 0020

Cloreto de soacutedio 6000

L-serina 0030

Fosfato de soacutedio dibaacutesico

(anidro)

0800

L-treonina 0020

D-glicose 2000

L-triptofano 0005

Glutationa reduzida 0001

L-tirosina bull 2Na 002883

Vermelho fenol Na 00053

L-valina 0020

16

Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G

Componentes Concentrado 2x

Aacutegua destilada 900 mLa

RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g

MOPS 6906 g

Glicose 36 g

aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para

70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume

final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso

17

Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de

concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos

Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)

Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64

Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64

Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

DMSO dimetil sulfoacutexido

aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente

soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo

portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor

(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH

_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)

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15

Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640

Constituinte

gL

L-arginina (base livre) 0200

Biotina 00002

L-asparagina (anidra) 0050

D-pantotecircnico 000025

L-aspaacutertico aacutecido 0020

Colina cloreto de 0003

L-cistina bull 2HCI 00652

Foacutelico aacutecido 0001

L-glutacircmico aacutecido 0020

Mioinositol 0035

L-glutamina 0300

Niacinamida 0001

Glicina 0010

PABA 0001

L-histidina (base livre) 0015

Piridoxina HCl 0001

L-hidroxiprolina 0020

Riboflavina 00002

L-isoleucina 0050

Tiamina HCl 0001

L-leucina 0050

Vitamina B12 0000005

L-lisina bull HCI 0040

Nitrato de caacutelcioH2O 0100

L-metionina 0015

Cloreto de potaacutessio 0400

L-fenilalanina 0015

Sulfato de magneacutesio

(anidro)

004884

L-prolina 0020

Cloreto de soacutedio 6000

L-serina 0030

Fosfato de soacutedio dibaacutesico

(anidro)

0800

L-treonina 0020

D-glicose 2000

L-triptofano 0005

Glutationa reduzida 0001

L-tirosina bull 2Na 002883

Vermelho fenol Na 00053

L-valina 0020

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Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G

Componentes Concentrado 2x

Aacutegua destilada 900 mLa

RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g

MOPS 6906 g

Glicose 36 g

aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para

70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume

final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso

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Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de

concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos

Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)

Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64

Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64

Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

DMSO dimetil sulfoacutexido

aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente

soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo

portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor

(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH

_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)

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Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640

Constituinte

gL

L-arginina (base livre) 0200

Biotina 00002

L-asparagina (anidra) 0050

D-pantotecircnico 000025

L-aspaacutertico aacutecido 0020

Colina cloreto de 0003

L-cistina bull 2HCI 00652

Foacutelico aacutecido 0001

L-glutacircmico aacutecido 0020

Mioinositol 0035

L-glutamina 0300

Niacinamida 0001

Glicina 0010

PABA 0001

L-histidina (base livre) 0015

Piridoxina HCl 0001

L-hidroxiprolina 0020

Riboflavina 00002

L-isoleucina 0050

Tiamina HCl 0001

L-leucina 0050

Vitamina B12 0000005

L-lisina bull HCI 0040

Nitrato de caacutelcioH2O 0100

L-metionina 0015

Cloreto de potaacutessio 0400

L-fenilalanina 0015

Sulfato de magneacutesio

(anidro)

004884

L-prolina 0020

Cloreto de soacutedio 6000

L-serina 0030

Fosfato de soacutedio dibaacutesico

(anidro)

0800

L-treonina 0020

D-glicose 2000

L-triptofano 0005

Glutationa reduzida 0001

L-tirosina bull 2Na 002883

Vermelho fenol Na 00053

L-valina 0020

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Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G

Componentes Concentrado 2x

Aacutegua destilada 900 mLa

RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g

MOPS 6906 g

Glicose 36 g

aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para

70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume

final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso

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Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de

concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos

Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)

Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64

Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64

Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

DMSO dimetil sulfoacutexido

aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente

soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo

portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor

(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH

_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)

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Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G

Componentes Concentrado 2x

Aacutegua destilada 900 mLa

RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g

MOPS 6906 g

Glicose 36 g

aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para

70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume

final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso

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Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de

concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos

Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)

Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64

Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64

Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

DMSO dimetil sulfoacutexido

aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente

soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo

portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor

(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH

_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)

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Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de

concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos

Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)

Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64

Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64

Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4

DMSO dimetil sulfoacutexido

aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente

soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo

portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor

(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH

_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)

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Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash

64 mgL

Etapa Concentraccedilatildeo

(mgL)

Fonte Volume do

antifuacutengico

(L)

Volume do

solventea

(L)

Concentraccedilatildeo

intermediaacuteria

(mgL)

Concentraccedilatildeo (mgL)

apoacutes diluiccedilatildeo 11000

com meio RPMI 2 G

(2x concentrado)b

1 12800 c Estoque 200 0 12800 128

2 12800 Estoque 100 100 6400 64

3 12800 Estoque 50 150 3200 32

4 12800 Estoque 50 350 1600 16

5 1600 Etapa 4 100 100 800 8

6 1600 Etapa 4 50 150 400 4

7 1600 Etapa 4 50 350 200 2

8 200 Etapa 7 100 100 100 1

9 200 Etapa 7 50 150 50 05

10 200 Etapa 7 25 175 25 025

a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos

b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na

tabela

c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees

estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente

19

Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland

Etapa Procedimento

1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de

018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente

2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia

a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013

3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute

usado para ajustar o inoacuteculo

4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente

5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso

6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses

• EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
• Autores
• Traduccedilatildeo
• INTRODUCcedilAtildeO
• ESCOPO
• TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
• Notas
• PROCEDIMENTO DO TESTE
• Geral
• Meio
• Meio para teste de anfotericina B
• AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
• Geral
• Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
• Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
• Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
• Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
• PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
• Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
• Cryptococcus spp
• INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
• INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
• RESULTADOS DA LEITURA
• Anfotericina B
• Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
• INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Cepas controle
• Estoque das cepas controles
• Uso de rotina das cepas controles
• REFEREcircNCIAS
• Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
• Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
• Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland

19

Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland

Etapa Procedimento

1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de

018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente

2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia

a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013

3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute

usado para ajustar o inoacuteculo

4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente

5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso

6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses

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• Geral
• Meio
• Meio para teste de anfotericina B
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• Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
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• Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
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• INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
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• Uso de rotina das cepas controles
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