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EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO, NATIVA
DE SUELOS DEL PIEDEMONTE LLANERO ARTIFICIALMENTE CONTAMINADOS
CON DIÉSEL
LINA MARÍA QUIROZ ARANGO
UNIVERSIDAD SANTO TOMÁS
FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL
VILLAVICENCIO
2019
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO, NATIVA
DE SUELOS DEL PIEDEMONTE LLANERO ARTIFICIALMENTE CONTAMINADOS
CON DIÉSEL
LINA MARÍA QUIROZ ARANGO
Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de ingeniera ambiental
Directora
MARÍA ALEXANDRA MÉNDEZ LEAL
MSc. Microbióloga Industrial
UNIVERSIDAD SANTO TOMÁS
FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL
VILLAVICENCIO
2019
Autoridades Académicas
P. JOSÉ GABRIEL MESA ANGULO, O.P.
Rector General
P. EDUARDO GONZÁLEZ GIL, O.P.
Vicerrector Académico General
P. JOSÉ ARTURO RESTREPO RESTREPO, O.P.
Rector Sede Villavicencio
P. RODRIGO GARCÍA JARA, O.P.
Vicerrector Académico Sede Villavicencio
JULIETH ANDREA SIERRA TOBÓN
Secretaria de División Sede Villavicencio
YESICA NATALIA MOSQUERA BELTRÁN
Decana Facultad de Ingeniería Ambiental
Nota De Aceptación
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_____________________________
YESICA NATALIA MOSQUERA BELTRÁN
Decana de Facultad de Ingeniería Ambiental
_____________________________
MARÍA ALEXANDRA MÉNDEZ LEAL
Directora Trabajo de Grado
____________________________
JONATHAN STEVEN MURCÍA FANDIÑO
Jurado
____________________________
VERONICA DUQUE PARDO
Jurado
Villavicencio, junio de 2019
Dedicatoria
Dedico este proyecto de grado a Dios, mis padres e hija.
A Dios por darme la oportunidad de llevar a cabo este logro.
A mis padres gracias por su apoyo, esfuerzo y amor.
Agradecimientos
Gracias a la financiación del Fondo de investigación de la Universidad Santo Tomás de
Villavicencio (FODEIN), quien apoyó el macroproyecto “Comportamiento de las características
físicas, químicas y microbiológicas en suelos de vocación agrícola artificialmente contaminados
con Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero del Municipio de Cumaral (Meta)” del cuál fui
partícipe aportando insumos para el primer y segundo objetivo.
Gracias a la Universidad Santo Tomás de Villavicencio por la formación de alta calidad que me
brindo, por sus buenos maestros, en especial mi directora de trabajo María Alexandra Méndez Leal
por su apoyo y orientación en la realización de la investigación, gracias también al personal de
laboratorio por su paciencia y orientación.
Tabla de contenido
Pág.
Resumen ................................................................................................................................... 12
Introducción .............................................................................................................................. 14
1. Planteamiento del problema ............................................................................................... 16
1.1 Descripción del Problema ................................................................................................ 16
1.2 Formulación de la pregunta problema.......................................................................... 17
2. Objetivos ........................................................................................................................... 18
2.1 Objetivo general .............................................................................................................. 18
2.2 Objetivos específicos ....................................................................................................... 18
3. Justificación ....................................................................................................................... 19
4. Alcance del proyecto .......................................................................................................... 21
5. Antecedentes ...................................................................................................................... 23
6. Marco de referencia ........................................................................................................... 25
6.1. Marco Teórico ................................................................................................................ 25
6.1.1. Generalidades del piedemonte llanero. ...................................................................... 25
6.1.2. Suelo. ....................................................................................................................... 25
6.1.3. Fósforo. .................................................................................................................... 26
6.1.4. Microorganismos solubilizadores de fósforo. ............................................................ 28
6.1.5. Uso de fertilizantes. .................................................................................................. 29
6.2. Marco Conceptual ........................................................................................................... 30
6.2.1. Suelo. ....................................................................................................................... 30
6.2.2. Hidrocarburos. .......................................................................................................... 30
6.2.3. Diésel. ...................................................................................................................... 30
6.2.4. Fertilizante. .............................................................................................................. 30
6.2.5. Bacterias solubilizadoras de fósforo. ......................................................................... 31
6.2.6. Pseudomonas sp. ...................................................................................................... 31
6.2.7. Textura. .................................................................................................................... 31
6.2.8. Densidad aparente. ................................................................................................... 31
6.2.9. Densidad real............................................................................................................ 32
6.2.10. Porosidad................................................................................................................ 32
6.3. Marco Legal ................................................................................................................... 32
7. Metodología ....................................................................................................................... 36
7.1. Área de estudio ............................................................................................................... 36
7.2. Toma de muestra del suelo .............................................................................................. 36
7.3. Contaminación ex situ con Diésel ................................................................................... 37
7.4. Características físicas del suelo ....................................................................................... 38
7.5. Características químicas del suelo ................................................................................... 38
7.6. Características microbiológicas del suelo ........................................................................ 38
7.6.1. Capacidad solubilizadora de fosfatos. ....................................................................... 39
7.6.2. Caracterización fenotípica de las cepas aisladas. ....................................................... 39
7.6.3. Caracterización bioquímica. ..................................................................................... 40
7.6.4. Conservación de la cepa. .......................................................................................... 40
7.7. Diseño experimental y Análisis estadístico ...................................................................... 40
7.7.1. Diseño experimental. ................................................................................................ 40
7.7.2. Análisis estadístico. .................................................................................................. 41
8. Resultados y Análisis de Resultados ................................................................................... 42
8.1. Características físicas del suelo ....................................................................................... 42
8.1.1. Textura. .................................................................................................................... 42
8.1.2. Densidad aparente. ................................................................................................... 43
8.1.3. Densidad real............................................................................................................ 43
8.1.4. Porosidad. ................................................................................................................ 43
8.2. Características químicas del suelo ................................................................................... 44
8.3. Capacidad solubilizadora de fosfato ................................................................................ 48
8.4. Caracterización fenotípica de las cepas aisladas .............................................................. 50
8.5. Caracterización bioquímica ............................................................................................. 51
8.6 Conservación de la cepa ................................................................................................... 53
Conclusiones ............................................................................................................................. 54
Discusión de Resultados y Recomendaciones ............................................................................ 55
Referencias Bibliográficas......................................................................................................... 58
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1. Reglamentación Colombiana sobre hidrocarburos y contaminación del suelo………….32
Tabla 2. Concentraciones de diésel aplicadas a los diferentes tratamientos………………............40
Tabla 3. Resultados de textura por sedimentación……………………………………………….42
Tabla 4. Resultados de los parámetros químicos…………………………………………………44
Tabla 5. Análisis de varianza (ANOVA) para las características químicas……………………….46
Tabla 6. Capacidad solubilizadora de fosfatos de las cepas seleccionadas en medio de cultivo
Pikovskaya……………………………………………………………………………………….48
Tabla 7. Coeficiente de correlación de Pearson entre el volumen del diésel y el índice de
solubilización…………………………………………………………………………………….49
Tabla 8. Caracterización macroscópica y microscópica de las cepas seleccionadas en medio de
cultivo Agar King B………………………………………………………………………...........50
Tabla 9. Caracterización bioquímica de las cepas seleccionadas en medio de cultivo Agar King
B………………………………………………………………………………………………….52
Lista de figuras
Pág.
Figura 1. Mapa de ubicación del área de estudio………………………………………………….21
Figura 2. Toma de muestras del suelo…………………………………………………………….37
Figura 3. Reactores con muestra de suelo contaminada con diésel……………………………….37
Figura 4. Biplot para propiedades químicas de los diferentes tratamientos……………................47
Figura 5. Halo de solubilización de la C3P (lado izquierdo con 32 mm) y la C9P (lado derecho
con 10 mm)……………………………………………………………………….........................50
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 12
Resumen
El piedemonte llanero es uno de los paisajes más productivos económicamente y el más adecuado
para manejo agrícola, para lo cual se emplea gran cantidad de fertilizantes químicos, aportando
elementos al suelo, necesarios para la fertilidad, siendo el fósforo uno de los nutrientes esenciales
para el desarrollo de las plantas. No obstante, el tipo de suelo hará que la disponibilidad de fósforo
en forma de fosfatos, para las plantas sea mayor o menor, siendo menor para los suelos ácidos,
como los del piedemonte. Adicionalmente, al sobre uso de fertilizantes, se han de tener en cuenta
ciertos contaminantes, como el diésel, vertido al suelo por fugas en la maquinaria requerida para
el laboreo del suelo, el cual ocasiona cambios que afectarán la absorción de macronutrientes por
parte de las plantas.
Siendo los microorganismos presentes en suelos, los únicos capaces de devolver el equilibrio
al mismo, el presente proyecto aporta en segunda fase, al primer y segundo objetivo del macro-
proyecto “Comportamiento de las características físicas, químicas y microbiológicas en suelos de
vocación agrícola artificialmente contaminados con Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero
del municipio de Cumaral (Meta)”, debido a que determinó la capacidad de solubilizar fósforo
por parte de uno de los géneros bacterianos más conocidos con dicha propiedad, Pseudomonas sp.
nativa y la relación con las características químicas del suelo de donde se obtuvo, las cepas
previamente aisladas en la primer fase de estudio, se obtuvieron de los reactores contaminados con
0, 200, 500 y 800 ml de diésel.
En el presente estudio se identificó la capacidad solubilizadora de fosfatos por parte de nueve
cepas de Pseudomonas sp. en medio agar Pikovskaya adicionado con 0.1 g/L de Púrpura de
Bromocresol, identificándose que el 78% de las cepas posee alta capacidad solubilizadora de
fosfatos y que estas provenían del reactor con 500 ml de diésel, así mismo, se realizó tinción de
Gram, para el mantenimiento de pureza.
Palabras clave: Suelo, fósforo, Pseudomonas sp, diésel.
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Abstract
The Piedmont foothills is one of the most economically productive landscapes and the most
suitable for agricultural management, for which a large amount of chemical fertilizers are used,
contributing elements to the soil, necessary for fertility, with phosphorus being one of the essential
nutrients for the development of plants. However, the type of soil will make the availability of
phosphorus in the form of phosphates, for plants is higher or lower, being lower for acid soils, such
as those of the piedmont. Additionally, the overuse of fertilizers, must take into account certain
pollutants, such as diesel, spilled to the ground by leaks in the machinery required for soil tillage,
which causes changes that will affect the absorption of macronutrients by the plants.
Being the microorganisms present in soils, the only ones able to restore the equilibrium to it,
the present project contributes in the second phase, to the first and second objective of the macro-
project "Behavior of the physical, chemical and microbiological characteristics in soils of
agricultural vocation artificially Contaminated with Gasoline and Diesel in the foothills of the
municipality of Cumaral (Meta) ", because it determined the ability to solubilize phosphorus by
one of the most well-known bacterial genera with this property, Pseudomonas sp nativa and the
relationship with the characteristics Soil chemical from which it was obtained, the strains
previously isolated in the first phase of the study, were obtained from the reactors contaminated
with 0, 200, 500 and 800 ml of diesel.
In the present study, phosphate solubilizing capacity was identified by nine strains of
Pseudomonas sp in Pikovskaya agar medium added with 0.1 g / L of Bromocresol purpura,
identifying that 78% of the strains have phosphate solubilizing capacity and that they came from
the reactor with 500 ml of diesel, likewise, Gram stain was made, for the maintenance of purity.
Keywords: soil, phosphorus, pseudomonas sp, diesel.
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Introducción
El fósforo (P) es un nutriente esencial para el desarrollo de las plantas; desempeña un papel
fundamental en la síntesis de proteínas, clorofila, biosíntesis de lípidos, entre otros. Es el segundo
elemento limitante de las cosechas, después del nitrógeno, debido a su gran insolubilidad. (Navarro
& Navarro, 2003).
Los agricultores adicionan fertilizantes químicos a sus cultivos para suplir los requerimientos
de nitrógeno, fósforo y potasio de estos, aumentando así el costo de producción, contaminación al
medio ambiente y afectación a la salud, ya que las plantas consumen alrededor del 40% de cada
kilogramo de fertilizante aplicado y el 60% restante se pierde por diferentes vías que contaminan
el suelo y el agua (Nacional, 2014).
Algunas especies microbianas del suelo tienen la capacidad de convertir las formas insolubles
del fósforo en formas asimilables para las plantas, a través de procesos como la producción de
ácidos orgánicos, quelación e intercambio de reacciones (Begonia, Begonia, Miller, Gilliard, &
Young, 2004). Las bacterias que solubilizan activamente el fósforo representan un 10% de la
población microbiana del suelo, dentro de los géneros bacterianos encontrados esta Bacillus,
Flavobacterium, Burkholderia, Rizhobium y Pseudomonas (Coyne, 2000).
El suelo empleado para el macro-proyecto fue obtenido de la Institución Educativa Agrícola de
Guacavía, en Cumaral, este municipio del departamento del Meta, ubicado en la parte
noroccidental del departamento, en él se desarrolla principalmente turismo, ganadería, agricultura
y últimamente explotación de petróleo (Plan de Desarrollo Municipal, 2016), estas actividades
generan contaminación a los recursos naturales, y ejercen presión sobre el recurso, ocasionando
pérdida de fertilidad y por ende se pierde macronutrientes esenciales para el desarrollo y
crecimiento de las plantas como el fósforo (P) (Tejera, Heydrich, & Rojas, 2013).
Así, que en el presente documento se identificó la viabilidad y capacidad solubilizadora de
fosfatos de cepas nativas de Pseudomonas sp (Restrepo, y otros, 2015), microorganismos
metabólicamente muy versátiles, capaces de utilizar gran variedad de compuestos orgánicos e
inorgánicos, incluyendo tóxicos como hidrocarburos (Ruiz, 2007), además promueven el
crecimiento vegetal, inclusive en condiciones de contaminación por hidrocarburos, debido a la
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 15
acción degradadora y la reducción de los efectos tóxicos (Ruberto, Vázquez, & Mac Cormack,
2003).
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 16
1. Planteamiento del problema
1.1 Descripción del Problema
En la agricultura del piedemonte llanero es común el uso de maquinaria para sus diferentes
actividades agrícolas y por ende el uso de combustible como el diésel, las malas prácticas generan
accidentes de fuga o derrames de este contaminante en el suelo, además la actividad petrolera
también genera contaminación al suelo cuando se genera accidentes en las operaciones de
explotación, extracción y transporte del hidrocarburo, afectando la flora, fauna y salud de los seres
humanos (Velásquez, 2017).
La contaminación del suelo por parte del diésel causa efectos nocivos en la flora y fauna,
además de dañar los suelos agrícolas, afectando su fertilidad y crecimiento de los cultivos
(Cavazos, Pérez, & Gutiérrez, 2014). Los hidrocarburos son compuestos orgánicos susceptibles
para ser biodegradados, ya sea eliminados o trasformados en sustancias menos tóxicas (Velásquez,
2017), los microorganismos presentes en el suelo pueden degradar los hidrocarburos
transformándolos en compuestos menos tóxicos, siendo una buena opción de biorremediación
(Pérez, Silva, Peñuela, & Cardona, 2015).
La mayoría de los suelos en Colombia tienen deficiencia de fósforo y la disponibilidad es escasa
para las plantas, por lo que se requiere el uso de fertilizantes químicos en la agricultura para suplir
las necesidades nutricionales del suelo y así obtener altos niveles de productividad, aumentando
los costos de producción y la contaminación de los recursos naturales (Porras, 2016).
Los microorganismos presentes en el suelo juegan un papel importante en procesos que afectan
la transformación del fósforo en el suelo y su disponibilidad para las plantas, pueden solubilizar el
fósforo orgánico e inorgánico a través de la liberación de ácidos orgánicos y de enzimas
hidrolíticas que incrementan la disponibilidad de este macroelemento para las plantas (Porras,
2016).
El uso de microorganismos solubilizadores de fósforo es una gran alternativa para reducir la
contaminación y mejorar la productividad de los cultivos, además de producir sustancias
promotoras del crecimiento vegetal (Porras, 2016).
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 17
Entre los microorganismos más reportados por la gran capacidad de solubilizar fósforo se
encuentra el género Pseudomonas sp, consideradas también como importantes promotoras del
crecimiento vegetal. (Rodríguez & Fraga, 1999)
En Colombia el consumo promedio de fertilizantes es de 330 Kg de fertilizante por hectárea
según el estudio de la FAO en el año 2015 sobre la agricultura mundial. Los fertilizantes luego de
su aplicación se convierten en sustancias insolubles por parte de la planta, siendo necesaria la
aplicación de mayor cantidad, lo que conlleva a un aumento en las reservas en el suelo de estas
partes insolubles, afectando así la fertilidad y aumentando el costo de producción de los
agricultores, quienes gastan entre un 30 y 40% de su presupuesto en plaguicidas y fertilizantes de
síntesis química industrial para suplir los requerimientos de N, P y K de sus cultivos (Nacional,
2014), además que los precios de los fertilizantes en Colombia superan entre el 30 y 50% el precio
mundial (Marín A. , 2013), generando así en el 2018 un bajo uso de estos fertilizantes químicos
en el país por menor rentabilidad de los productos agrícolas (Dinero, 2018).
El uso intensivo de fertilizantes y la mecanización agrícola reducen las poblaciones microbianas
benéficas y el servicio ecosistémico que proveen. (Restrepo, y otros, 2015)
1.2 Formulación de la pregunta problema
Se generó la siguiente pregunta problema: ¿Cómo varía la capacidad solubilizadora de fósforo de
las Pseudomonas sp. del suelo disturbado y de vocación agrícola obtenido del Instituto Agrícola
Guacavía de Cumaral (Meta), contaminado artificialmente ex situ, en el laboratorio de Toxicología
y Biotecnología, con tres volúmenes diferentes de Diésel, durante un periodo de 5 meses teniendo
en cuenta las características físicas y químicas, especialmente fósforo?
Se estableció la siguiente hipótesis de investigación: Ante una eventual situación de derrame
de hidrocarburos y sus derivados, según las concentraciones del contaminante va a generarse un
efecto diferencial. Por lo que la afectación de los microorganismos presentes en el suelo dependería
de la concentración del derrame de hidrocarburo, por ende, a mayor concentración mayor es el
grado de afectación.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 18
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
Evaluar la viabilidad y capacidad de solubilizar fosfatos de Pseudomonas sp. en suelo contaminado
artificialmente ex situ, con diferentes volúmenes de Diésel y su relación con las características
físicas y químicas.
2.2 Objetivos específicos
• Determinar los parámetros físicos y químicos, de un suelo disturbado obtenido del Instituto
Agrícola Guacavía y contaminado artificialmente ex situ con tres volúmenes de Diésel.
• Identificar y determinar la viabilidad de Pseudomonas sp. solubilizadoras de fósforo, de un
suelo disturbado obtenido del Instituto Agrícola Guacavía y contaminado artificialmente ex situ
con tres volúmenes de Diésel.
• Determinar la correlación entre los cambios de las características físicas y químicas del
suelo contaminado con Diésel y la capacidad solubilizadora de fosfatos por parte de Pseudomonas
sp.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 19
3. Justificación
Uno de los grandes problemas que aquejan a la humanidad es la destrucción acelerada de los
recursos naturales, entre ellos el suelo debido a la expansión agrícola acelerada e insostenible,
modificando sus propiedades físicas, químicas y biológicas. Entre las actividades diarias de la
agricultura se utiliza maquinaria para la preparación de la tierra y la recolección de la cosecha que
causan derrames de diésel en el suelo, ya sean accidental o incidentalmente. De lo cual, según la
consulta realizada no se encontró información disponible sobre las cantidades derramadas de diésel
en estas actividades agrícolas, al tratarse de prácticas manejadas de forma particular y/o privada.
Adicionalmente, existe el potencial de degradación de los suelos por parte del uso de
fertilizantes químicos y de derrames registrados en el transporte de crudo y derivados del petróleo,
según la base de datos generada del convenio CORMACARENA-ECOPETROL se tiene
reportados 72 incidentes de hidrocarburos de fuentes móviles en el departamento del Meta, en
municipios de Cumaral, Puerto Gaitán, San Martín, Villavicencio, entre otros. Registrados desde
el año 2012 hasta el 2017, en donde se han derramado más de 128.737 galones de crudo causando
grandes afectaciones al medio ambiente, la principal causa de estos incidentes se da en un 52,77%
por fallas humanas, mecánicas (31.94%), de orden público (1.38%), mal estado de la vía (5.55%),
colisión (1.38%) o afectaciones por terceros (2.77%) y en un 5.55% no se reporta la causa
(CORMACARENA-ECOPETROL, 2018).
En los llanos orientales, se ha estado llevando a cabo un gran esfuerzo por parte de entidades
públicas y privadas, como la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Agrosavia),
con el objetivo de desarrollar investigaciones relacionadas a conocer los procesos, las condiciones
y la dinámica de los suelos del piedemonte llanero y calificar su estado, sin embargo es escasa la
información disponible sobre la contaminación por diésel en el suelo del piedemonte llanero, y
más aún las investigaciones del género Pseudomonas sp. como solubilizadoras de fósforo;
considerando que son limitados los reportes de las concentraciones de fósforo en la región, por
ende lo es también de las proporciones disponible de este, siendo de vital importancia su
conocimiento e investigación, ya que es uno de los macronutrientes del suelo, esencial para la
agricultura debido a su aporte nutricional y primordial para el desarrollo y crecimiento de las
plantas, teniendo como sus principales funciones fisiológicas, intervenir en procesos de
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 20
acumulación y liberación de energía en el proceso de metabolismo celular (Bobadilla & Rincón,
2008), forma parte de los ácidos nucleicos ADN y ARN, participa en la fotosíntesis y la síntesis
de almidón, el fósforo también forma parte de otros compuestos como el ácido fítico, el cual es
fundamental en el proceso de formación y desarrollo de las semillas y raíces, e igualmente una
deficiencia de este nutriente provoca entre diversas consecuencias, la reducción en la expansión
celular (enanismo) (Rodríguez & Flórez, 2004). Razón por la cual, es importante evaluar el
comportamiento de las Pseudomonas sp. pues representan una alternativa para el aumento en la
disponibilidad del fósforo asimilable para las plantas. Y lo es aún más el hecho de evaluar la
alteración en esta importante capacidad, bajo ambientes perturbados por la contaminación de
hidrocarburos y sus derivados.
Por tanto, en el presente estudio se identificó la viabilidad de solubilizar fosfatos del género
bacteriano Pseudomonas sp, a partir de un suelo del piedemonte llanero con vocación agrícola, en
el Instituto Agrícola de Guacavía en el municipio de Cumaral (Meta), disturbado y contaminado
artificialmente con diferentes volúmenes de diésel, para generar información básica del
comportamiento de los suelos del piedemonte llanero ante un eventual derrame de diésel en cuanto
a las características fisicoquímicas, y la capacidad del género Pseudomonas sp. para solubilizar
fósforo, ya que estas bacterias no han sido estudiadas en la región y como una alternativa para
biorremediación del suelo.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 21
4. Alcance del proyecto
El presente proyecto pertenece al macro-proyecto de investigación denominado “Comportamiento
de las características físicas, químicas y microbiológicas en suelos de vocación agrícola
artificialmente contaminados con Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero del Municipio de
Cumaral (Meta)”, ganador en modalidad de Proyectos independientes de grupos de investigación
en el marco de líneas activas y protocolizadas de investigación.
El proyecto tuvo como alcance, aportar información de las bacterias del género Pseudomonas
sp. como microorganismos solubilizadores de fósforo en un suelo no perturbado con
hidrocarburos, mediante la contaminación simulada y controlada ex situ con diésel a diferentes
volúmenes (0, 200, 500 y 800 ml) en un suelo disturbado con vocación agrícola del piedemonte
llanero extraído del Instituto Agrícola Guacavía del Municipio de Cumaral (Meta) ubicado en las
coordenadas 4°15’5.08’’ N y 73°10’59.72’’ O, siendo este el área de estudio (Figura 1).
Figura 1. Mapa de ubicación del área de estudio. Por: González & Mora, 2019.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 22
El estudio se ejecutó en un periodo de tiempo de 14 meses, el cual transcurrió desde el mes de
marzo del 2018 a abril del 2019, distribuidos así: dos meses para realizar el montaje de las pruebas
experimentales en las que se generó la contaminación simulada experimentalmente, a partir de esta
fecha y durante cada mes se realizó el muestreo para identificar la capacidad de solubilizar fósforo
de las Pseudomonas sp. y a la vez se realizaron pruebas que permiten identificar la actividad
bacteriana en los diferentes volúmenes de diésel. En los últimos 2 meses se realizaron los procesos
de análisis de los resultados obtenidos con respecto al potencial de las Pseudomonas sp. como
solubilizadoras de fósforo y las conclusiones de la investigación.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 23
5. Antecedentes
Se realiza la vigilancia tecnológica para identificar la tendencia en publicaciones de documentos
relacionados con el tema de solubilizadores de fósforo en suelos contaminados por hidrocarburos,
la cual está guiada por la siguiente clave de búsqueda: (TITLE-ABS- KEY (phosphorus) AND
TITLE-ABS- KEY (soil) AND TITLE-ABS- KEY (microorganisms) AND TITLE-ABS- KEY
(“oil spills”)). Determinando así, indicadores cienciométricos de la producción científica de dicho
campo. Lo anterior haciendo uso de la base de datos de Scopus. (Elsevier, 2019)
Bajo este parámetro de búsqueda fueron encontrados 21 documentos relacionados con el tema
en cuestión (Apéndice A).
De acuerdo con la base de datos, el número de artículos publicados por año es bajo, ya que
desde 1981 se comenzó a investigar el tema y solo han sido 21 documentos realizados hasta la
actualidad, además que durante varios años no se hizo investigación y en el año 2003 y 2015 se
reportaron 3 documentos, siendo este el reporte máximo por año y desde esa fecha hasta la
actualidad solo se ha registrado un documento en el año 2017.
La distribución de artículos publicados relacionados con el tema de estudio según el país
(Apéndice B), permite evidenciar que es Estados Unidos el que más investigación ha realizado en
cuanto al tema, según los resultados de la base de datos de Scopus; contando con 8 publicaciones.
El único país de América Latina que registra en el listado de publicaciones relacionadas con el
tema es México, por otra parte, Colombia no registra ninguna publicación relacionada a este campo
de investigación en torno al patrón de búsqueda en la mencionada base de datos. Pudiendo
relacionarse este comportamiento con la escasa o nula producción investigativa acerca de
solubilizadores de fósforo bajo condiciones de contaminación con diésel, en suelos del piedemonte
llanero.
Se han realizado pocos estudios de las Pseudomonas sp. como solubilizadoras de fósforo en
suelos contaminados por hidrocarburos, sin embargo, han logrado ser ampliamente aislados y
evaluados a partir de suelos de actividad agrícola, con el objetivo de evaluar el potencial promotor
de crecimiento vegetal, y la capacidad de solubilizar fósforo como alternativa sostenible al uso de
fertilizantes (biofertilizantes).
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 24
En china aislaron 5 cepas bacterianas de un suelo contaminado con petróleo a largo plazo en el
campo petrolífero de Daqing para biorremediar la contaminación de petróleo, donde se identificó
a Pseudomonas sp. y Pseudomonas aeruginosa mostrando una alta capacidad de degradación de
hidrocarburos del petróleo. Regulando la concentración de sal inicial, nitrógeno y fósforo. (Qu,
Tu, Jia, & Wang, 2013)
En Colombia se ha aislado de la rizosfera de cultivos como el chontaduro, Uchuva, café y arroz;
como microorganismos para solubilizar fosfato inorgánico. En donde diversos autores identifican
a las Pseudomonas sp, con la mayor actividad para la solubilización, además de otras bacterias
identificadas como Burkholderia sp (Patiño & Sanchez, 2012), Bacillus sp, (Cisneros, Sánchez, &
Menjivar, 2017) y Azotobacter (Florez, Leal, Ardila, & Cardenas, 2017). Adicionalmente, se ha
identificado la capacidad para promover la germinación de semillas, el tallo de las plantas y
longitud de la raíz (Caviedes, 2010).
El aislamiento e identificación de Pseudomonas sp, también se ha llevado a cabo en medios
contaminados con hidrocarburos tanto en el agua como en suelo. Donde se ha determinado que es
capaz de adaptarse a las condiciones que proporciona el medio alterado, tomando como fuente de
carbono y energía el contaminante, logrando degradarlo en cierta proporción.
De acuerdo con lo anterior, en Cuba aislaron el género Pseudomonas sp, con el objetivo de
estudiar la biodegradación de petróleo de 9 cepas aisladas de suelos contaminados por petróleo,
estableciendo como objeto de estudio a las cepas Gram negativas representadas por el género
Pseudomonas sp, siendo estas capaces de crecer sobre el crudo de petróleo como única fuente de
carbono y energía, identificando a Pseudomonas aeruginosa, quien presentó mayor crecimiento
logrando degradar hasta el 57% del petróleo. (Pérez, y otros, 2008)
Por otra parte, en Colombia, también se han realizado intentos con el objetivo de determinar la
capacidad degradadora, para uso potencial de biorremediación en ecosistemas. En la ciudad de
Cartagena se aislaron Pseudomonas aeruginosa, a partir de 4 hábitats de suelo y agua
contaminados por industria petroquímica, que permitió constatar su amplia adaptación (Cabrera,
Echeverri, & Manjarrez, 2010). Además, en otro estudio de la ciudad de Cartagena se determinó
de manera adicional microorganismos degradadores de petróleo crudo como fuente de energía
(Quintana, Cabrera, Tous, & Echeverry, 2012).
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 25
6. Marco de referencia
6.1. Marco Teórico
6.1.1. Generalidades del piedemonte llanero.
El piedemonte llanero está ubicado en la región de la Orinoquia colombiana, en la base de la
cordillera oriental con alturas de 200 a 700 msnm, el clima es tropical, húmedo y seco, con épocas
bien definidas de lluvia y sequía, con temperaturas uniformes a través del año, precipitación
promedio de 2800 mm y temperatura promedio de 26°C. Los registros de la dirección y velocidad
del viento son muy variables y la predominante es E-NE. La humedad relativa promedio es del
82% en invierno y 70-75% en verano. El piedemonte es uno de los paisajes más productivos
económicamente y el de mejor manejo agrícola y pecuario (Jamioy, 2011).
6.1.2. Suelo.
El suelo es un sistema complejo que alberga especies vegetales, animales y microorganismos. Los
microorganismos son de gran importancia porque se relacionan con procesos de edafogénesis,
ciclos biogeoquímicos de elementos como carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, hierro y otros
elementos, fertilidad de las plantas, protección frente a patógenos, y degradación de compuestos
xenobióticos, entre otros (Nogales, 2005). El suelo está formado por una corteza terrestre que
constituye elementos físicos, químicos y biológicos, que desempeñan funciones naturales como la
descomposición de productos vegetales o la biodegradación de componentes que contaminan el
suelo por medio de procesos metabólicos que llevan a cabo los microorganismos (Viñas Canals,
2005). La estructura del suelo está dividida en tres tipos de capas (horizonte A, B y C), el horizonte
A es el más superficial, en el cual abunda materia orgánica, el contacto de este con las bacterias
facilita la degradación de hidrocarburos (Ortega & Saiz, 1998). La contaminación del petróleo se
encuentra principalmente en el horizonte A, donde se encuentra el mayor contenido de materia
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 26
orgánica y microorganismos (Paul & Clark, 1998). Los suelos expuestos a la contaminación
prolongada de hidrocarburos, constituye un microhábitat adecuado para bacterias degradadoras,
donde el contaminante ejerce una presión sobre la población microbiana y se selecciona las que
sean capaces de sobrevivir y adaptarse a estas condiciones (Gómez, y otros, 2008).
En los ambientes contaminados existen especies con capacidades metabólicas específicas, que
hacen que la microflora se adapte al contaminante (Marchal, Pene, Solano, & Vandecasteele,
2003). Las Pseudomonas sp. son microorganismos capaces de utilizar el hidrocarburo como fuente
de carbono y energía, siendo una opción muy viable de biorremediación (Bracho, Díaz, & Soto,
2004).
Los suelos contaminados con hidrocarburos presentan mayor cantidad de microorganismos,
pero menor diversidad. Entre estos, se encuentran los capaces de biodegradar hidrocarburos,
representado 1% de la población total, es decir aproximadamente de 104 a 106 células por gramo
de suelo (Rojas, Torres, Fernández, Balderas, & Moroyoqui, 2010). Las bacterias Gram negativas
son el grupo con mayor capacidad para degradar los hidrocarburos (Narvaez, Gomez, & Martinez,
2008)
6.1.3. Fósforo.
Los nutrientes son necesarios para la actividad microbiana y metabólica de la Pseudomona sp, por
lo que se deben encontrar disponibles para su asimilación y síntesis (Viñas Canals, 2005), estos se
dividen en macronutrientes (C, N, P, K) y micronutrientes (Fe, Cu, Zn, S, Co, Mn, Mg y Ca).
El fósforo (P) es un elemento esencial e irremplazable para el metabolismo celular,
contribuyendo en el desarrollo de las plantas, a través del sistema radicular, frutos y demás, las
plantas lo necesitan para crecer y desarrollar su potencial genético y forma la base de un gran
número de compuestos de los cuales los más importantes son los fosfatos. El fósforo está en
pequeñas cantidades en las plantas, 0.2% aproximadamente y en los animales hasta el 1% de su
masa (Porras, 2016).
En el suelo existen diferentes fuentes de fósforo que pueden ser categorizadas como fósforo
inorgánico y orgánico.
El fósforo inorgánico se encuentra formando parte de minerales de calcio, hierro y aluminio
originados por mecanismos de precipitación y pueden liberar fósforo muy lentamente por medio
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 27
de la meteorización y son menos solubles que los compuestos de fósforo orgánico (Bobadilla &
Rincón, 2008). El fósforo disponible para las plantas se encuentra en el suelo en forma de
ortofosfatos, que son formas inorgánicas solubles, encontrándose iones monobásicos y dibásicos
(Benerjee, Palit, Sengupta, & Standing, 2010).
El fósforo orgánico está presente en la materia orgánica, que se origina por la degradación
microbiana de restos de animales y vegetales. En diversos suelos puede representar cerca de 50%
del fósforo total insoluble (Oliviera, y otros, 2008).
Los fosfatos desempeñan un papel esencial en los procesos de transferencia de energía y en el
metabolismo (Elizondo, 2005). Procesos que se afectan por la disponibilidad de este en el suelo,
pues el fósforo inorgánico (disponible para las plantas) representa del 50% - 70% del P total,
aunque puede variar entre el 10 y 90%, dependiendo del tipo de suelo (Patiño & Sanclemente,
2014). Es decir, una concentración disponible muy baja para los requerimientos de los cultivos.
Una insuficiencia de fósforo en el suelo puede influir en el retraso de la madurez y el desarrollo
de la planta, disminuyendo el rendimiento de la cosecha, lo que conlleva a la necesidad de uso de
fertilizantes que, al ser aplicados, aproximadamente el 90% pasa a formas solubles no disponibles
(Beltrán, 2014), solo una parte muy baja, entre 0,1 y 0,3 ppm, se encuentra realmente en solución,
plenamente disponible para plantas y microorganismos (Montecinos, 2003). Las plantas extraen
el P del suelo por solubilización de los minerales, con intervención de los microorganismos, en
función de sus necesidades. (Moreno, Nevarrete, & Virgos, 1998).
Los microorganismos presentes en el suelo son capaces de transformar el fósforo a través de
procesos como, mineralización, inmovilización, óxido reducción y solubilización, relacionados
con el metabolismo molecular (Patiño & Sanclemente, 2014). El mecanismo más usado por las
poblaciones microbianas para solubilizar el fosfato es a través de la producción de ácidos
orgánicos, los cuales actúan sobre las formas insolubles (fosfato tricálcico, fosfato dicálcico,
hidroxiapatita y roca fosfórica) (Lara, Esquivel, & Negrete, 2011).
Los ácidos orgánicos permiten que haya solubilización debido a que estos implican un descenso
en el pH a valores aproximados a 2, necesarios para que se pueda llevar a cabo la solubilización
Lara et al (2011).
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 28
6.1.4. Microorganismos solubilizadores de fósforo.
La mayoría de los microorganismos son encontrados a uno o dos centímetros de las raíces de las
plantas, zona denominada como rizosfera, debido a la gran cantidad de nutrientes que se encuentra
en esta zona. (Niklitscheck, 2008). Los microorganismos son importantes para la agricultura ya
que estos promueven la circulación de nutrientes para las plantas y a su vez, disminuyen la
fertilización química ayudando así a la conservación del medio ambiente y a una agricultura
sostenible.
Las bacterias que solubilizan activamente el fósforo representan un 10% de la población
microbiana del suelo. Dentro de los géneros de hongos se encuentran Aspergillus, Fusarium y
Sclerotium, un segundo grupo lo constituyen los Actinomycetes, entre las bacterias esta Bacillus,
Flavobacterium, Burkholderia, rizhobium y Pseudomonas (Coyne, 2000).
Las bacterias son los microorganismos predominantes que solubilizan fosfato mineral en los
suelos si se comparan con los hongos y los actinomicetos (Beltrán, 2014).
Las Pseudomonas sp, constituyen bacterias Gram negativas, es el grupo más heterogéneo, se
trata de microorganismos metabólicamente muy versátiles, capaces de utilizar gran variedad de
compuestos orgánicos e inorgánicos, incluyendo tóxicos como hidrocarburos alifáticos y
aromáticos (Ruiz, 2007). Entre las especies están P. fluorescens, P. putida, P. aeruginosa. P.
oryzihabitans, P. stutzeri, P. syringae entre otras. (Slabbinck, De Baets, Dawyndt, & Vos, 2010)
Estas bacterias pertenecen al grupo de promotoras de crecimiento vegetal (PGPR), dentro de
estos microorganismos están los géneros Pseudomonas, Azospirillum, Bacillus, Enterobacter,
Rhizobium, Burkholderia y Erwinia, entre otros (Porras, 2016).
Los microorganismos solubilizadores de fósforo constituyen hasta un 40% de la población de
bacterias del suelo y una porción significativa de ellos son aislados de la rizosfera, dentro de los
aislamientos se encuentran hongos como Aspergillus niger y bacterias como Bacillus sp y
Pseudomonas sp (Porras, 2016), Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium sp, Vibrio
proteolyticus, Enterobacter aerogenes y Streptomyces, entre otras (Fernández, Zalba, Gómez, &
Sagardoy, 2005).
Las bacterias que solubilizan el fosfato utilizan diferentes mecanismos para convertir las formas
insolubles en solubles para las plantas. La primera es la secreción de ácidos producidos en el
metabolismo de los azúcares, metabolizando el azúcar y liberando ácidos orgánicos como el ácido
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 29
butírico, acético, láctico, entre otros, que actúan como quelantes de los cationes de calcio (Ca),
aluminio (Al) y magnesio (Mg) que acompañan a la liberación de fosfatos. Otro método es
mediante las enzimas producidas por determinados tipos de bacterias, conocidas como fosfatasas,
las cuales mediante la hidrólisis son capaces de solubilizar el fósforo orgánico procedente de la
materia orgánica. Entre los géneros bacterianos más significativos de solubilizadores de fosfatos
se encuentran las Pseudomonas sp. (Benjumeda, 2017).
6.1.5. Uso de fertilizantes.
En Colombia se subutilizan los fertilizantes, esto se debe a que muchos agricultores no están
aplicando la dosis recomendada de fertilizantes, principalmente porque no se realiza un estudio
del suelo previo y no se conocen las características y requerimientos nutricionales del mismo
(Alfonso, 2017).
En el municipio de Cumaral se siembra arroz, maíz, cítricos, maracuyá, papaya, piña, palma de
aceite, cacao, café, plátano, yuca, entre otros, además de la ganadería (Secretaria de Desarrollo
Agroeconomico, 2018). Entre los fertilizantes químicos que contiene fósforo se utilizan en los
diferentes cultivos Triple 18, 25 4 24, 17 6 18 (estas son las concentraciones de N, P y K que tiene
cada fertilizante) con un precio aproximado de 68.000 pesos el bulto de 50 kilos, roca fosfórica
18.000 el bulto y DAP 85.000 el bulto.
Es importante tener en cuenta que el suelo está vivo y que existen enormes cantidades de
microorganismos que lo habitan (hongos, bacterias, actinomicetos), que aportan soluciones a las
necesidades de las plantas (Nacional, 2014), como el uso de las bacterias Pseudomonas sp. para
solubilizar fosfatos, contribuyendo así a la mejora de las propiedades del suelo, garantizando un
producto más sano y por ende menos costoso.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 30
6.2. Marco Conceptual
6.2.1. Suelo.
El suelo es una capa delgada que se ha formado a través de los siglos por medio de la desintegración
de las rocas superficiales por la acción del agua, aire y cambios de temperatura, está compuesto
por minerales, materia orgánica, aire, agua y organismos vegetales y animales (FAO, 1996).
6.2.2. Hidrocarburos.
Los hidrocarburos son sustancias naturales originadas a partir de algas acuáticas establecidas
durante millones de años, proceso iniciado con la fotosíntesis, la cual hace parte del ciclo del
carbono; y a través del tiempo geológico este aporte ha producido grandes cantidades de materia
fósil, estas sustancias están conformadas de compuestos con diferente solubilidad, volatilidad, y
como están formadas únicamente por átomos de carbono e hidrógeno son compuestos orgánicos
susceptibles a ser biodegradados, ya sea eliminados o transformados en sustancias menos tóxicas
tanto en suelos como en cuerpos de agua contaminadas (Yavari, Yeganeh, & Abolghasemi, 2015).
6.2.3. Diésel.
El diésel es un hidrocarburo en estado líquido compuesto por parafinas, se obtiene gracias al
proceso de destilación del petróleo crudo, tiene una densidad de 850 kg/m3, presenta un poder
calorífico de 8.800 kcal/kg, a diferencia de la gasolina, el diésel no se mezcla con etanol.
Aproximadamente el 86.1% de su composición es carbono, se compone en un 75% por
hidrocarburos saturados y el resto son aromáticos (Menna, 2018).
6.2.4. Fertilizante.
Fertilizante es cualquier material orgánico o inorgánico, natural o sintético, que se adiciona al suelo
con la finalidad de suplir determinados elementos esenciales para el crecimiento de las plantas,
pueden ser de dos tipos: orgánicos y minerales. Los orgánicos son de origen vegetal o animal y los
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 31
minerales son sustancias de origen mineral, producidas por la industria química o la explotación
de yacimientos naturales (fosfatos, potasa) (AEFA, 2017).
6.2.5. Bacterias solubilizadoras de fósforo.
Las bacterias solubilizadoras de fósforo son microorganismos promotores de crecimiento vegetal
(PGPR), habitan en la rizosfera de las plantas y la benefician potencializando su crecimiento y la
absorción de minerales y compuestos como fosfatos, además combaten la contaminación del suelo
sea de tipo orgánico o inorgánico (Benjumeda, 2017)
6.2.6. Pseudomonas sp.
Las Pseudomonas sp, son bacilos Gram negativos, aerobios estrictos, oxidasa positiva, tienen
cierta facilidad de adaptación que les permite adecuar el hábitat donde se encuentren para utilizar
diferentes fuentes como el carbono o el nitrógeno para su nutrición (Willey, Sherwood, &
Woolverton, 2013), además de tener alta capacidad para solubilizar fosfatos.
6.2.7. Textura.
La textura es la forma en la que se distribuyen por tamaños las partículas del suelo.
Específicamente a las proporciones relativas de las partículas o fracciones de arena, limo y arcilla,
en el suelo tamizado y con diámetro inferior a 2 mm, está relacionada con otras propiedades como
retención de agua, porosidad y retención de nutrientes, entre otras (González, 2014).
6.2.8. Densidad aparente.
La densidad aparente es la relación entre la masa y el volumen de las partículas de suelo y se
expresa en g/cm3 (González, 2014).
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 32
6.2.9. Densidad real.
La densidad real es la relación que existe entre la masa y el volumen de las partículas de suelo, el
volumen es el de las partículas de suelo menos el volumen que ocupa los poros y se expresa en
g/cm3 (González, 2014).
6.2.10. Porosidad.
La porosidad es la relación entre el volumen de los espacios vacíos y el volumen total de la masa
del suelo (González, 2014).
6.3. Marco Legal
Actualmente en Colombia no hay una normatividad que regule la contaminación del suelo por
hidrocarburos, y específicamente por diésel, por lo tanto, el marco legal se basa en acuerdos
internacionales, la constitución política, leyes, decretos y resoluciones que abordan temáticas sobre
la contaminación de los recursos naturales principalmente el suelo y sobre hidrocarburos (Tabla
1).
Tabla 1.
Reglamentación Colombiana sobre hidrocarburos y contaminación del suelo.
Tratados Internacionales
Declaración de Río de Janeiro sobre
Medio Ambiente y Desarrollo 1992.
Reconocimiento de la importancia de la
protección del suelo y sus usos potenciales en un
sentido de desarrollo sostenible.
Convenio de la Naciones Unidas
1994.
Fija como objetivo evitar y reducir la
degradación del suelo.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 33
Tabla 1. (Continuación).
Constitución Nacional
Artículo 8
Es obligación del Estado y de las personas
proteger las riquezas culturales y naturales de la
Nación.
Artículo 79
Derecho colectivo a un Ambiente Sano y a
participar en las decisiones que puedan afectarlo.
Artículo 80
El Estado planificará el manejo y
aprovechamiento de los recursos naturales, para
garantizar su desarrollo sostenible, su
conservación o sustitución. Además, deberá
prevenir y controlar los factores de deterioro
ambiental.
Artículo 95
Son deberes de la persona y del ciudadano
proteger los recursos naturales y velar por la
conservación del ambiente.
Leyes
Ley 2 de 1959 Reserva forestal y protección de suelos y agua.
Ley 23 de 1973 Principios fundamentales sobre prevención y
control de la contaminación del aire, agua y suelo.
Ley 9 de 1979
Por la cual se establecen normas que regulan
la protección de la salud pública y el Medio
Ambiente.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 34
Ley 99 de 1993
Crea el Ministerio del Medio Ambiente y la
estructura del Sistema Nacional Ambiental
(SINA).
Ley 430 de 1998
Por la cual se dictan normas prohibitivas en
materia ambiental referentes a los desechos
peligrosos y se dictan otras disposiciones.
Ley 685 de 2001 Código de minas.
Ley 1205 de 2008 Por medio de la cual se mejora la calidad de
vida a través de la calidad del diésel.
Decretos
Decreto 2811 de 1974 parte VII Del suelo agrícola y de los usos no agrícolas
de la tierra.
Decreto 321 de 1999
Por el cual se adopta el plan nacional de
contingencias contra derrame e hidrocarburos,
derivados y sustancias nocivas.
Decreto 1521 de 1998
Manejo, transporte y distribución de
combustibles líquidos derivados del petróleo para
estaciones de Servicio.
Decreto 1609 DE 2002
Por el cual se reglamenta el manejo y
transporte terrestre automotor de mercancías
peligrosas por carretera.
Decreto 2041 de 2014 Todo lo referente a las licencias y trámites
ambientales para el transporte de hidrocarburos.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 35
Tabla 1. (Continuación).
Nota: Normatividad colombiana sobre contaminación del suelo e hidrocarburo. Por: Quiroz,
2019.
Resoluciones
Resolución 004014 de 2005 Por la cual se restringe el transporte de
hidrocarburos por las vías del país.
Resolución 0170 de 2009 Se adoptan medidas para la conservación y
protección de los suelos en el territorio nacional.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 36
7. Metodología
7.1. Área de estudio
El presente estudio, recibe 17 cepas nativas previamente aisladas de reactores contaminados con
0, 200, 500 y 800 ml de diésel, del macro-proyecto “Comportamiento de las características físicas,
químicas y microbiológicas en suelos de vocación agrícola artificialmente contaminados con
Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero del municipio de Cumaral (Meta)”, la muestra de suelo
se obtuvo del predio de la Institución Educativa Agrícola de Guacavía del municipio de Cumaral-
Meta ubicado en las coordenadas 4°15’5.08’’ N y 73°10’59.72’’ O. Con un clima entre
superhúmedo medio (A2) y superhúmedo bajo (A1), con factores de humedad entre 101 y 300,
precipitaciones entre 2.800 y 5.270 mm, temperaturas entre 16.6 y 26.2 °C. La humedad relativa
media anual que se presenta en el área oscila entre 60 y 90%. Químicamente su suelo es de reacción
ácida, tiene bajo contenido de fósforo y bases (Ca, Mg, K); capacidad de intercambio catiónico y
saturación de bases igualmente bajas, niveles altos de aluminio intercambiable, valores medios y
bajos de carbono orgánico y fertilidad baja (IGAC; Gobernación del Meta, 2004)
7.2. Toma de muestra del suelo
El muestreo siguió lo establecido en la “Guía toma de muestras de suelo para análisis químico y
físicos” de CORPOICA, de acuerdo con la NTC 4113-2 del 2007 (Figura 2), trasladada al campus
Aguas Claras de la Universidad Santo Tomás, en donde se secó a temperatura ambiente y se tamizó
en malla de 2 mm de diámetro.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 37
Figura 2. Toma de muestras del suelo. Por: Quiroz, 2019.
7.3. Contaminación ex situ con Diésel
Después de tamizadas, se ubicaron 7 kg de suelo en cada reactor (polietileno), para ser
contaminadas con diésel, de acuerdo con (Hernández, Ferrera, & Rodríguez, 2003), se determinó
emplear los volúmenes de diésel (0, 200, 500 y 800 ml) (Figura 3), el volumen cero, hace referencia
a la muestra testigo sin contaminar, todas por triplicado, para un total de 12 reactores previamente
rotulados.
Figura 3. Reactores con muestra de suelo contaminada con diésel. Por: Quiroz, 2019.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 38
7.4. Características físicas del suelo
El procesamiento de las características físicas del suelo se llevó a cabo en el laboratorio de suelos
de la Universidad Santo Tomás, sede Villavicencio, empleando las siguientes metodologías:
textura por el método de sedimentación, densidad aparente por método de cilindro publicado en el
Manual de prácticas de campo y del laboratorio de suelos (SENA, 2013), densidad real por método
del picnómetro y porosidad.
7.5. Características químicas del suelo
Las características químicas fueron procesadas en el laboratorio de la corporación Colombiana de
Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA) en el centro de investigación Tibaitata, empleando
las siguientes metodologías: pH (VC_R _004 versión 03), conductividad eléctrica (NTC
5596:2008), materia orgánica (Walkey & black), fósforo disponible Bray II (VC_R _007 versión
02), azufre y boro disponible (Fosfato monobásico de calcio), acidez y aluminio intercambiable
(KCL), calcio, magnesio, potasio y sodio intercambiable (ID_R_072 versión 5), capacidad
intercambio catiónico (suma de cationes), micronutrientes en suelo por Olsen modificado hierro,
manganeso, cobre y zinc (NTC 5526:2007).
Los análisis de Hidrocarburos Totales del Petróleo (TPH) fueron analizados por el
laboratorio acreditado de Tecnoambiental SAS, utilizando la metodología: Ultrasonido NMX-
AA-145 SCFI-2008 IR SM 5520C.F.
7.6. Características microbiológicas del suelo
Los aislamientos de las cepas de interés fueron realizados en el laboratorio de Microbiología del
campus Aguas Claras de la Universidad Santo Tomás, por la egresada de Ingeniería Ambiental,
Ing. Andrea Katherine Riveros Herrera, quien participaba como auxiliar de investigación del
macro-proyecto. Entregó un total de 17 cepas con crecimiento sobre agar King B con emisión de
fluorescencia ante luz U.V., en su mayoría bacilos Gram negativos y Gram positivos, denominadas
C1P (Cepa 1 fosfatos), C2P, …, C17P.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 39
7.6.1. Capacidad solubilizadora de fosfatos.
Se determinó la capacidad de solubilización de fosfatos de las 17 cepas mediante siembra por
picadura en medio selectivo Agar Pikovskaya (PVK) que contiene fosfato tricálcico como única
fuente de P, adicionando 0,1 g/L de púrpura de bromocresol, el cual permite identificar la
formación de halos de solubilización que se evidencia por la acidificación del medio (viraje a
amarillo), se incubaron las cajas a 37°C durante 3 días, transcurridos los días de incubación, se
tomaron los datos del diámetro total de halo en mm y del diámetro de la colonia en mm durante
los días de crecimiento, mediante el software LAS EZ de LEICA EA4 HD, datos que se incluyeron
en la fórmula del índice de solubilización (I.S):
𝐼. 𝑆 =𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎 + 𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 ℎ𝑎𝑙𝑜
𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎
El diámetro del halo se calculó, restando el diámetro de la colonia al diámetro total del halo. De
acuerdo con (Sanclemente, Yacumal, & Patiño, 2017) las cepas que producen halos mayores a 10
mm son consideradas con alto potencial de capacidad solubilizadora, totalmente opuesto a halos
inferiores o iguales a 10 mm, consideradas de bajo potencial.
Teniendo en cuenta lo anterior se seleccionaron las cepas con diámetro de halo mayor a 10 mm,
para un total de 9 cepas seleccionadas.
7.6.2. Caracterización fenotípica de las cepas aisladas.
7.6.2.1. Caracterización macroscópica.
Se realiza una resiembra de las 9 cepas sobre Agar King B, para describir las características
macroscópicas de las cepas, tales como: color, forma y textura, se empleó el estereoscopio Leica
EZ4 (4X).
7.6.2.2. Caracterización microscópica.
Se realizó Tinción de Gram de las resiembras de las 9 cepas, para confirmar la morfología
microscópica por medio del microscopio Leica Dm750 (100X).
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 40
7.6.3. Caracterización bioquímica.
Se determinó la capacidad metabólica de las 9 cepas seleccionadas, mediante la realización de las
pruebas bioquímicas: Catalasa, Oxidasa, Agar Citrato Simmons, LIA (Agar de hierro lisina), TSI
(Agar tres azúcares hierro), MR-VP (Rojo de Metilo, Voges Proskauer), Agar Manitol Hipersalino
(Agar Chapman), Agar MacConkey, SIM (producción de H2S, formación de Indol y Movilidad)
y Tioglicolato.
7.6.4. Conservación de la cepa.
Se realizó en caldo BHI (Brain Heart Infusion), compuesto por 17,5 g/L de Infusión de cerebro y
corazón, 10 g/L de peptona, 2 g/L glucosa, 5 g/L de NaCl y 2.5 g/L de Fosfato disódico, se calentó
hasta completar su disolución, se adiciono 20% v/v de glicerol y se esterilizó en el autoclave
durante 20 minutos a 121°C.
7.7. Diseño experimental y Análisis estadístico
7.7.1. Diseño experimental.
Las características fisicoquímicas de la investigación se componen de 3 tratamientos, más uno de
control (testigo), todos por triplicado, para un tamaño de muestra total de 12 reactores (Tabla 2)
(Apéndice C).
Tabla 2.
Concentraciones de diésel aplicadas a los diferentes tratamientos.
Tratamiento Diésel adicionado
(ml)
Concentración de diésel
(mg kg-1 de suelo)
Testigo 0 0
1 200 2500
2 500 6100
3 800 9800
Nota: Concentraciones de diésel utilizadas. Por: González & Mora, 2019.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 41
7.7.2. Análisis estadístico.
Mediante el análisis de varianza (ANOVA) se evaluaron las características químicas para
establecer diferencias significativas entre los tratamientos experimentales, además se realizó un
Análisis de Componentes Principales (ACP) para relacionar las diferentes variables químicas con
los 4 tratamientos y por último se realizó el Coeficiente de correlación de Pearson para las
características químicas y el índice de solubilización, para establecer la relación entre las variables.
Estos datos fueron procesados mediante la herramienta Microsoft Office Excel y XLSTAT.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 42
8. Resultados y Análisis de Resultados
A continuación, se presentan los resultados obtenidos y análisis realizados para el logro de los
objetivos específicos propuestos.
8.1. Características físicas del suelo
8.1.1. Textura.
La técnica empleada para determinar la textura por sedimentación fue el método de Bouyoucos,
con el fin de determinar los porcentajes de los diferentes separados del suelo (arena, limo y arcilla)
(Tabla 3).
Tabla 3.
Resultados de textura por sedimentación.
Separado Unidad Resultado
Arcilla (< 0,002 mm) % 22,72
Limo (0,05 - 0,002 mm) % 2,73
Arena (2 – 0.05 mm) % 74,55
Textura Franco arcillo arenoso (FArA)
Nota: Porcentajes de la distribución de las partículas minerales en el suelo. Por: Quiroz, 2019.
Los valores dispuestos en la tabla 3 se ubicaron en el diagrama textural de la USDA,
herramienta para obtener las clases texturales en función de los porcentajes de arena, limo y arcilla,
lo cual indicó que la clase textural era franco arcillo arenoso (FArA), considerando que los
resultados se encontraban entre el rango de arena (≥45%), limo (<28%) y arcilla (20-35%)
(Matrero, 2014). Por otra parte, en los estudios realizados por Jamioy (2011), González (2014) y
Marín (2017) en el piedemonte llanero también reportaron la clase textural como franco arcillo
arenoso.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 43
8.1.2. Densidad aparente.
La densidad aparente se estableció por el método del cilindro, como resultado se obtuvo 1,11
g/cm3, las densidades aparentes típicas del suelo franco arcillo arenoso fluctúan entre 1.0 y 1.7
g/cm3, siendo la densidad aparente ideal <1.40 (USDA, 1999), encontrándose entre estos
parámetros la densidad aparente de la muestra testigo del suelo evaluado, por otra parte este valor
es menor a los rangos normales (1.3 – 1.4 g/cm3 ) reportados por CORPOICA (2007) para este tipo
de suelo, y para los valores normales (1,2 a 1,4 g/cm3) de las propiedades físicas de los suelos más
frecuentes en Colombia mencionado por Murillo (s.f.) para suelos de textura FArA. Marín (2017)
reportó una densidad aparente (0.81-1.57 g/cm3), Villegas (2012) de 1.07 a 1,37g/cm3, Jamioy
(2011) de 1,12 y 1,70 g/cm3, González (2014) de 1,61 y 1,68 g/cm3 en suelos del piedemonte
llanero clasificados como FArA.
8.1.3. Densidad real.
La densidad real se determinó con el método del picnómetro, como resultado se obtuvo un valor
de 2,28 g/cm3, encontrándose entre el rango (2.11 a 2.68 g/cm3) que reporto Jamioy (2011) y
González (2014) de (2,56 a 2,68 g/cm3) en suelos del piedemonte llanero clasificados como FArA,
es inferior al rango dado Villegas (2012) de 2,38 a 2,69 g/cm3.
8.1.4. Porosidad.
La porosidad se determinó teniendo en cuenta la relación de la densidad aparente y la densidad
real, dando como resultado una porosidad de 51,57%, teóricamente se acepta como buena una
porosidad total promedia de alrededor del 50%, Kaurichev (1984) califica la porosidad total del
suelo como satisfactoria en un rango de 50-55%, además, se encuentra dentro del rango de valores
normales (47 a 54%) proporcionado por Murillo (s.f) para suelos de textura FArA. Igualmente, en
suelos del piedemonte llanero clasificados como FArA Villegas (2012) reportó la porosidad en un
rango de 44,08 a 55,04%, Marín (2017) encontró una porosidad total menor y mayor al 50%,
Jamioy (2011) encontró rangos de 27.84% a 51.97% y González (2014) reportó la porosidad menor
del 50%.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 44
Según el estudio realizado por Jamioy (2011) la clasificación de la calidad física del suelo del
piedemonte de los llanos orientales de Colombia es alta en cuanto a densidad aparente (<1.4 - >1.2
g/cm3), media para arcilla (15-25%), baja en arena (>60 %) y limo (<20%).
8.2. Características químicas del suelo
Los resultados obtenidos de los parámetros químicos en los cuatro tratamientos indican que
algunos parámetros se vieron afectados negativamente por la presencia de diésel mientras que otros
no. El 61.11% de las variables disminuyeron sus valores con la contaminación del diésel en sus
diferentes concentraciones (Tabla 4), encontrándose el pH, CE, P, S, Ca, K, CIC, Na, Fe, Zn y Cu,
el restante, 38.88% incremento los valores con la presencia del contaminante, siendo el caso de la
MO, Al+H, Al, Mg, Mn, B y TPH.
Tabla 4.
Resultados de los parámetros químicos.
Determinación
Analítica Unidad Método Testigo T1 T2 T3
pH pH VC_R_004 Versión 03 5,37 5,3 5,2 5,28
CE dS/m NTC 5596:2008 0,65 0,36 0,26 0,25
MO % Walkey & Black 1,69 2,66 3,1 3,54
P mg/kg VC-R-007 Versión 02 34,35 13,93 7,19 12,93
S mg/kg Fosfato monobásico de
calcio
26,86 15,35 12,72 13,31
Al+H cmol(+)/kg KCl 0,05 0,16 0,21 0,21
Al cmol(+)/kg KCl 0 0,08 0,02 0
Ca cmol(+)/kg ID-R-072 Versión 5 4,28 3,48 3,38 3,05
Mg cmol(+)/kg ID-R-072 Versión 5 0,79 0,58 0,61 0,63
K cmol(+)/kg ID-R-072 Versión 5 0,46 0,35 0,33 0,35
Na cmol(+)/kg ID-R-072 Versión 5 0,15 <0,14 <0,14 <0,14
CIC cmol(+)/kg Suma de cationes 5,73 4,71 4,67 4,38
Fe mg/kg NTC 5526:2007 123,02 97,41 66,2 74,36
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 45
Tabla 4. (Continuación).
Mn mg/kg NTC 5526:2007 32,04 48,58 47,73 60,21
Zn mg/kg NTC 5526:2007 4,32 3,92 3 3,71
Cu mg/kg NTC 5526:2007 1,39 1,25 <1 <1
B mg/kg Fosfato monobásico de
calcio
0,33 0,25 0,38 0,45
TPH % Ultrasonido NMX-AA-
145 SCFI-2008 IR SM
5520C.F
0,004 3,7 5,26 6,6
Nota: Parámetros químicos evaluados, CE (Conductividad Eléctrica), MO (Materia Orgánica),
P (Fósforo disponible, Bray II), S (Azufre disponible), Al+H (Acidez intercambiable), Al
(Aluminio intercambiable), Ca (Calcio intercambiable), Mg (Magnesio Intercambiable), K
(Potasio intercambiable), Na (Sodio intercambiable), CIC (Capacidad de Intercambio Catiónico),
Fe (Hierro disponible, Olsen), Mn (Manganeso disponible, Olsen), Zn (Zinc disponible, Olsen),
Cu (Cobre disponible, Olsen), B (Boro disponible), TPH (Hidrocarburos Totales de petróleo). Por:
Quiroz, 2019.
En particular, el pH en todos los tratamientos estuvo en el rango de fuertemente ácido según
SSDS (2017), afectando la disponibilidad de fósforo debido a que frecuentemente hay una alta
fijación de este elemento volviéndolo insoluble, por la formación de fosfatos de aluminio y de
hierro (Jaramillo, 2002), la conductividad eléctrica, CE, entre 0 y 0.8 dS/m son aceptables para el
crecimiento de los cultivos en general (USDA, 1999), la capacidad de intercambio catiónico, CIC,
es baja (<10 cmol/kg) debido también al pH ácido (González, 2014).
El suelo no contaminado, usado como testigo presentó un pH ácido de 5,37 similar al pH de 5,3
reportado por Vanegas (2012) y se encuentra dentro del rango dado por Jamioy (2011) de 4,03 a
5,88 para suelos inceptisoles. El contenido de materia orgánica fue de 1,69%, el cual es inferior al
rango informado por Villegas (2012) de 2 a 3,1% en la muestra testigo y mayor en el tratamiento
3 y al de Rincón & Ligarreto (2010) entre 1,9 y 3%. Se obtuvo una capacidad de intercambio
catiónico de 5,73 cmol/kg y manganeso de 32,04 mg/kg valores similares al 5,02 cmol/kg y 33,7
mg/kg reportados por Vanegas (2012) respectivamente.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 46
Según Gonzáles (2014) los valores de fósforo para la muestra testigo oscila entre bajo y medio
(15-40 mg/kg), el fósforo disponible de los tratamientos son bajos (<15 mg/kg), demostrando así
que la contaminación del diésel afecta negativamente el fósforo disponible en el suelo, es decir, la
disponibilidad de todos los nutrientes a las plantas está regulada por el pH del suelo, este afecta la
solubilidad de algunos elementos y por lo tanto afecta el desarrollo de la planta, confirmando por
la baja disponibilidad de fósforo obtenida (Jaramillo, 2002).
En un estudio realizado por (Jamioy, Menjivar, & Rubiano, 2015) realizaron una clasificación
de la calidad química del suelo inceptisol del piedemonte de los llanos orientales de Colombia, la
calidad química del suelo es alta en cuanto a pH (>5), Ca (>1.5 cmol/kg), Mg (>0.5 cmol/kg), Al+H
(<1.5 cmol/kg) y calidad alta para Fe en la muestra testigo (100-182 mg/kg) y media para los
diferentes tratamientos (50-100 mg/kg).
Para comprender, la relación e influencia existente entre la disponibilidad de P y la
contaminación artificial con diésel, se elaboró el coeficiente de correlación de Pearson (Apéndice
D), encontrando relaciones positivas con altos valores significativos entre P y CE (0.970), S y P
(0.987), K y P (0.995), Na y P (0.968), indicando que al incrementar una de estas variables, la otra
también aumenta, existe una relación negativa con alto valor significativo entre P y Al+H (-0.968)
indicando que al disminuir una variable la otra también disminuye. Por otra parte, se realizó el
Análisis de varianza (ANOVA) (Tabla 5), donde se puede observar que la significación (Valor
crítico para F) es mayor al nivel de significancia del 0,05, se puede analizar que las diferencias
entre las medias no son estadísticamente significativas y por lo tanto no hay relación entre las
diferentes variables.
Tabla 5.
Análisis de varianza (ANOVA) para las características químicas.
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre grupos 35424,60314 17 2083,800185 38,2519314 4,91844E-24 1,815540397
Dentro de los
grupos 2941,687017 54 54,4756855
Total 38366,29016 71
Nota: Análisis de varianza (ANOVA). Por: Quiroz, 2019.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 47
Posteriormente, se elaboró el Análisis de Componentes Principales (ACP), seleccionando los
componentes F1 y F2 que explicaron el 94.23% de la variabilidad de los datos, el componente F1
con el 80,84% y el componente F2 con el 13,39%. En el Biplot (Figura 4) se observa las variables
activas (variables químicas) con relación a las observaciones activas (los 4 tratamientos).
Figura 4. Biplot para propiedades químicas de los diferentes tratamientos. Por: Quiroz, 2019.
En la figura 4 se puede observar que los tratamientos están ubicados en diferentes cuadrantes
(a excepción de T2 y T3), representando diferencias entre sí. La distribución de los vectores
permite distinguir cada tratamiento, igualmente indica que todas las propiedades son importantes,
mientras que los ángulos entre ellos representan la posible relación de las variables, dado que
ángulos agudos (menor de 90º) significan correlación positiva, ángulos rectos (90º) tienen
correlación nula y ángulos obtusos (mayor de 90º) la correlación es negativa. La ubicación positiva
de la variable Al incide en el T1, las variables negativas próximas a -1, como TPH, MO, Al+H y
Mn inciden en el tratamiento T2 y el B en el tratamiento T3, el testigo se relaciona de manera
directa con CE, CICE, S, P, K, Na, Mg, Cu, Fe, Zn, pH y Ca indicando una correlación positiva
entre ellas (González & Mora, 2019).
pH
CE
MOP
S
Al+H
Al
Ca
Mg
K
Na
CICE
Fe
Mn
Zn
Cu
B
TPH
Testigo
T1
T2
T3-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1
F2 (
13,3
9 %
)
F1 (80,84 %)
Biplot (ejes F1 y F2: 94,23 %)
Variables activas Observaciones activas
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 48
8.3. Capacidad solubilizadora de fosfato
A partir de las lecturas realizadas al día tres de incubación se obtuvo el índice de solubilización
presentado en la Tabla 6, se muestran los datos tomados.
Tabla 6.
Capacidad solubilizadora de fosfatos de las cepas seleccionadas en medio de cultivo
Pikovskaya.
Cepa Volumen
diésel (ml)
Diámetro de la
colonia (mm)
Diámetro total
del halo (mm)
Índice de
solubilización (I.S)
C1P* 500 8 23 2.875
C2P 500 6 10 1.666
C3P 500 6.5 32 4.923
C4P 500 7 30 4.285
C5P 200 5 25 5
C6P 800 3 27 9
C7P 500 3 21 7
C8P 500 2 22 11
C9P 500 7 10 1.428
Nota: Índice de solubilización de las cepas, *C1P= Cepa 1 Fosfatos. Por: Quiroz, 2019.
El total de cepas nativas recibidas, fue de 17, pero solamente nueve presentaron la capacidad
solubilizadora de fosfato con halos mayores a 10mm, las cepas C1P, C2P, C3P, C4P, C5P, C6P,
C7P y C8P, son bacilos Gram negativos identificados como Pseudomonas sp, a excepción de la
C9P, este es un bacilo Gram positivo, identificado como Bacillus sp, que también presento alto
potencial de solubilización, este último resultado coincide con los encontrados por Lara et al
(2011), quienes aislaron bacterias con capacidad solubilizadora de fosfatos en suelos de Montería
(Colombia), cultivados con guayaba agria Psidium araca, encontrando que la mayoría (93%)
correspondían a bacilos Gram negativos.
El género Bacillus es el más representativo del grupo de solubilizadores de fosfato, se encuentra
presente en el suelo, agua, vegetales y aire, son bacilos aerobios y anaerobios facultativos, Gram
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 49
positivos pertenecientes a la familia Bacillaceae y catalasa positiva (Layton, Maldonado, Monroy,
Corrales, & Sánchez, 2011), evidente en la Tabla 9. Entre las especies potencialmente
solubilizadoras se encuentran: Bacillus licheniformes, B. pumilus, B. subtilis y B. brevis. (Arévalo
& Moreno, 2014).
Teniendo en cuenta la tabla 6, C8P tuvo el I.S más alto con un valor de 11, seguido de C6P con
un valor de 9, C2P y C9P tuvieron el I.S más bajo con valores de 1.666 y 1.428 respectivamente,
además se puede observar que la capacidad solubilizadora de fosfatos no se puede medir solamente
con el diámetro de halo, ya que la cepa C3P tuvo el diámetro de halo más alto (32 mm) y no está
dentro de los índices más altos de solubilización.
De acuerdo con los estudios realizados por (Niklitscheck, 2008), (Becerra, Quintero, Martínez,
& Matiz, 2011), (Constanza, Arévalo, & Moreno, 2014) y (Lara, Esquivel, & Negrete, 2011)
obtuvieron índices de solubilización entre 2.4 y 4.2 destacándolos como altos y con buena
capacidad de solubilización de fosfatos, a partir de estos estudios se puede afirmar que la mayoría
de las cepas seleccionadas (77.77 %) tienen buena capacidad solubilizadora de fosfatos a
excepción de C2P y C9P.
Teniendo en consideración el volumen del diésel, el 78% de las cepas seleccionadas por su alta
capacidad de solubilizar fosfato pertenecen a la contaminación de 500 ml, 11% a 200 ml y 11% a
800 ml, demostrando así que las cepas seleccionadas tienen mayor capacidad de solubilizar fosfato
en una contaminación de 6100 mg de diésel por kg de suelo (500 ml), además se realizó la
correlación de Pearson (Tabla 7), dando una correlación positiva (0.31) con tendencia a 0 entre el
volumen del diésel y el índice de solubilización, interpretando que la correlación entre estas dos
variables es débil y que por tanto, una variable no afecta significativamente a la otra, es decir, la
capacidad de solubilizar fosfato por parte de las Pseudomonas sp. no dependen de la concentración
del diésel.
Tabla 7.
Coeficiente de correlación de Pearson entre el volumen del diésel y el índice de solubilización.
Diésel I.S
Diésel 1
I.S 0,31 1
Nota: Coeficiente de correlación de Pearson. Por: Quiroz, 2019.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 50
En la figura 5 se puede observar el halo de solubilización de C3P y C9P, mostrando así el halo
con mayor y menor diámetro de las cepas seleccionadas.
Figura 5. Halo de solubilización de la C3P (lado izquierdo con 32 mm) y C9P (lado derecho
con 10 mm). Por: Quiroz, 2019.
En el apéndice E se encuentra el registro fotográfico de C1P, … C9P, sobre medio de cultivo
King B sin exposición a luz ultravioleta, a través de la luz ultravioleta, tinción de Gram y el halo
de solubilización.
8.4. Caracterización fenotípica de las cepas aisladas
A las 9 cepas seleccionadas se les realizó una caracterización macroscópica (descripción de la
colonia) y microscópica (tinción de Gram) como se observa en la Tabla 8.
Tabla 8.
Caracterización macroscópica y microscópica de las cepas seleccionadas en medio de cultivo
Agar King B.
Cepa Código cepa Características
macroscópicas
Características
microscópicas
C1P -10-1A 500 D T3 Colonia cremosa, forma
circular, color verde
fluorescente.
Bacilos Gram -
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 51
Tabla 8. (Continuación).
C2P 10-1B 500 D T1 Colonia cremosa, forma
circular, color verde
fluorescente.
Bacilos Gram -
C3P 10-1B 500 D T2 Colonia cremosa, forma
circular, color verde
fluorescente.
Bacilos Gram -
C4P 10-1A 500 DM2 Colonia cremosa, forma
circular, color verde
fluorescente.
Bacilos Gram -
C5P 10-2C 200 DM2
T1 T4
Colonia cremosa, forma
circular, color verde
fluorescente.
Bacilos Gram -
C6P
10-3 CABA 800 D
T2 T1
Colonia cremosa, forma
circular, color beige.
Bacilos Gram -
C7P 10-4B 500 D T4 T1 Colonia cremosa, forma
circular, color beige.
Bacilos Gram -
C8P 10-2A 500 D T1
T1
Colonia cremosa, forma
circular, color beige.
Bacilos Gram -
C9P 10-1B 500 DM2
T1
Colonia cremosa, forma
irregular, color beige.
Bacilos Gram +
Nota: Características físicas de las cepas estudiadas. Por: Quiroz, 2019.
8.5. Caracterización bioquímica
A las nueve cepas seleccionadas se les realizó la caracterización bioquímica, permitiendo obtener
su capacidad metabólica (Tabla 9).
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 52
Tabla 9.
Caracterización bioquímica de las cepas seleccionadas en medio de cultivo Agar King B.
Prueba Bioquímica
Cep
a
Oxid
asa
Cat
alas
a
Cit
rato
de
Sim
mons
TS
I
IA
Sulf
uro
Indol
Movil
idad
Tio
gli
cola
to
Pru
eba
Rojo
Met
ilo
Voges
-Pro
skau
er
Man
itol
Mac
Conkey
C1P + - + A KK - - - AE - - - -
C2P + - + A KK - - - ANAF - - - -
C3P + - + D KK - - - AE - - - -
C4P + - + A KK - - - AE - - - -
C5P + - + C KK - - - ANAF - - - -
C6P + - + B KK - - - ANAF - - - -
C7P + - + A KK - - - ANAF - - - -
C8P + - + A KK - - - ANAF - - - -
C9P + - - C KA - - - ANAF - - - +
Nota: Caracterización bioquímica de las cepas, + (positivo), - (negativo), A (sin fermentación
de azúcar), B (control: No viro a ningún color), C (fermenta glucosa, pero no fermenta lactosa, ni
sacarosa), D (fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa), KK (Descarboxilación de la lisina: Positivo),
KA (Descarboxilación de la lisina: Negativa, fermentación glucosa), AE (aerobio estricto), ANAF
(anaerobio facultativo). Por: Quiroz, 2019.
Todas las cepas presentaron oxidasa positiva, catalasa negativa, rojo de metilo, Voges-
Proskauer y Manitol negativo, MacConkey negativo para las 8 primeras cepas, medio de cultivo
selectivo para bacterias Gram negativas, la C9P, creció sobre agar MacConkey debido a que se
trata de un microorganismo bacilo Gram positivo que fermenta la glucosa y es anaerobio
facultativo, las C1P a la C8P presentaron descarboxilación de la lisina positivo, C1P, C3P y C4P
son microorganismos aerobios estrictos, es decir, las cepas restantes son anaerobios facultativos,
es decir, crecen en todo el medio de cultivo tioglicolato, todas las cepas presentan sulfuro, indol y
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 53
movilidad negativa, las cepas C1P, C2P, C4P, C7P y C8P no fermentan azucares, C5P y C9P
fermentan la glucosa y C3P fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa, por último la cepa C9P no usa
el citrato como fuente de carbono.
8.6 Conservación de la cepa
Se realizó la preservación de las cepas por congelación a largo plazo, en caldo Infusión Cerebro
Corazón –BHI-, adicionado con 20% glicerol estéril y almacenadas en viales estériles a -18°C.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 54
Conclusiones
• Se aportó insumos para el macroproyecto “Comportamiento de las características físicas,
químicas y microbiológicas en suelos de vocación agrícola artificialmente contaminados con
Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero del Municipio de Cumaral (Meta)”, aportando
información de las características físicas y químicas de un suelo del piedemonte llanero
contaminado artificialmente con diferentes volúmenes de diésel y la capacidad de solubilización
de fosfatos que tienen las cepas nativas aisladas a partir de los reactores.
• Las características físicas y químicas permitieron determinar el tipo de suelo de estudio,
como inceptisol, ya que presentó textura Franco arcillo arenosa (FArA), densidad aparente ideal
para el tipo de suelo, densidad real dentro de los parámetro normales para el suelo FArA, porosidad
satisfactoria, pH fuertemente ácido afectando la disponibilidad de fósforo volviéndolo insoluble,
la presencia del diésel en el suelo disminuyo los valores de pH, CE, P, S, Ca, K, CIC, Na, Fe, Zn
y Cu en los diferentes tratamientos y aumento los valores de MO, Al+H, Al, Mg, Mn, B y TPH.
• Se logró determinar que las bacterias del género Pseudomonas sp. tienen una gran
viabilidad y alta capacidad para solubilizar fosfatos, el 78% pertenecen al reactor artificialmente
contaminado con 500 ml de diésel, demostrando así que las cepas seleccionadas tienen mayor
capacidad de solubilizar fosfato en esa concentración, sin embargo, dicha capacidad no depende
de la concentración de diésel.
• Se puede concluir que la solubilidad de fosfatos no se puede medir solamente con el
diámetro de halo, ya que C3P tuvo el diámetro de halo más alto (32 mm) y no está dentro de los
índices más altos de solubilización. La C8P tuvo el I.S. más alto con un valor de 11 y C9P el más
bajo con un valor de 1.428.
• Las bacterias del género Pseudomonas sp. y Bacillus sp, están presentes en el suelo
inceptisoles del piedemonte llanero, demostrando a la vez la capacidad para solubilizar fosfato en
condiciones de contaminación de diésel a diferentes concentraciones, siendo una gran alternativa
para permitir la biodisponibilidad de este nutriente esencial a las plantas.
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 55
Discusión de Resultados y Recomendaciones
La caracterización física mostró que la clase textural era Franco arcillo arenoso (FArA),
considerando que los resultados se encontraban entre el rango de arena (≥45%), limo (<28%) y
arcilla (20-35%) (Matrero, 2014), además concuerda con los estudios realizados en el piedemonte
llanero, la densidad aparente es ideal para el tipo de suelo según la USDA, la densidad real se
encuentra dentro de los rangos reportados por Jamioy (2011) y González (2014) en el piedemonte
llanero y la porosidad es satisfactoria según Kaurichev (1984).
Las variables químicas se vieron afectadas por la contaminación del diésel a diferentes
concentraciones, el 61.11% (pH, CE, P, S, Ca, K, CIC, Na, Fe, Zn y Cu) de las variables
disminuyeron sus valores, el otro 38.88% (MO, Al+H, Al, Mg, Mn, B y TPH) aumentaron sus
valores. El pH en todos los tratamientos estuvo en fuertemente ácido según SSDS (2017) afectando
la disponibilidad de fósforo volviéndolo insoluble (Jaramillo, 2002), la CE es no salino aceptable
para el crecimiento de los cultivos (USDA, 1999) y el intercambio catiónico es bajo debido al pH
ácido (González, 2014).
Según González (2014) los valores de fósforo para los diferentes tratamientos son bajos,
demostrando así que la contaminación del diésel afecta negativamente el fósforo disponible en el
suelo, por otra parte el pH controla la disponibilidad de los nutrientes de la planta, afectando la
solubilidad y por lo tanto el desarrollo de la planta, la mayor solubilidad para el fósforo se
encuentra entre 5.6 y 6.6 (Jaramillo, 2002), valores superiores a los encontrados en los diferentes
tratamientos, por lo que la solubilidad de fósforo por parte de la planta se puede ver afectada.
De las nueve cepas recibidas, previamente identificadas como Pseudomonas sp, y Bacillus sp,
presentaron la capacidad de solubilizar fosfatos sobre medio Pikovskaya, el 89% se identificaron
como bacilos Gram negativos, pertenecientes al género bacteriano Pseudomonas sp. a excepción
de C9P que es un bacilo Gram positivo perteneciente al género bacteriano Bacillus sp,
comprobando la viabilidad de estos géneros bacterianos para solubilizar fosfato como se menciona
en los estudios realizados por Constanza et al (2014), Lara et al (2011), (Patiño & Sanclemente,
2014) y (Sánchez, García, Romero, & Bonilla, 2014), estos géneros bacterianos no solo tienen la
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 56
capacidad de solubilizar fósforo en ambientes naturales, sino también en suelos contaminados a
diferentes concentraciones de diésel como se demuestra en el presente estudio.
Teniendo en cuenta los estudios realizados por Niklitscheck (2008), Becerra et al (2011),
Constanza et al (2014) y Lara et al (2011) que obtuvieron índices de solubilización entre 2.4 y 4.2
destacándolos como altos y con buena capacidad de solubilización de fosfatos, se puede afirmar
que la mayoría de las cepas seleccionadas (77.77%) tienen buena capacidad solubilizadora de
fosfatos pertenecientes al género Pseudomonas sp, ya que el índice de solubilización se encuentra
en un rango de 2.875 a 11, por otra parte el 78 % de las cepas estudiadas pertenecen al reactor
artificialmente contaminado con 500 ml de diésel, demostrando así que las cepas seleccionadas
tienen mayor capacidad de solubilizar fosfato en esa concentración, sin embargo dicha capacidad
no depende de la concentración de diésel, como se puede observar en la correlación del índice de
solubilización y la concentración del diésel.
El coeficiente de correlación de Pearson para las características químicas mostró una relación
positiva con altos valores significativos entre el P y la CE, S, K y Na, indicando que al aumentar
una variable la otra también lo hace, además se da una relación negativa entre el P y Al+H, es decir,
cuando disminuye una la otra también. La correlación del índice de solubilización y la
concentración de diésel mostró una relación positiva (0.31) con tendencia a 0, mostrando una
correlación débil, ya que una variable no afecta significativamente a la otra, es decir, la capacidad
de solubilizar el fósforo no está relacionada directamente con la concentración de diésel, ya que
de las 7 cepas que tienen alta capacidad de solubilizar fosfato, 5 pertenecen a la concentración de
500 ml, una a 200 ml y una a 800 ml, demostrando que las bacterias del género Pseudomonas sp,
tienen una alta capacidad para solubilizar fosfatos en ambientes contaminados a diferentes
concentraciones de diésel.
En la investigación realizada se demuestra una vez más la capacidad que tienen las bacterias
del género Pseudomonas sp. para solubilizar fósforo en el suelo, específicamente en el suelo del
piedemonte llanero, siendo una buena opción para biorremediación de suelos contaminados por
hidrocarburos, ya que la solubilización no solo se da en suelos naturales, sino también es suelos
contaminados a diferentes concentraciones de diésel, como se demuestra en el presente estudio,
ayudando a degradar el contaminante como se muestra en los estudios realizados por (Loya, 2013),
(Muñoz, 2016), Narvaez et al (2008) y (Arrieta, 2011).
EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 57
Teniendo en cuenta la pregunta problema y el estudio realizado, la capacidad para solubilizar
fósforo por parte de las Pseudomonas sp. no varía ni depende de la concentración del diésel como
se evidencia en la correlación de Pearson, por lo tanto, las bacterias del género Pseudomonas sp.
tienen una alta capacidad para solubilizar fósforo en el suelo del piedemonte llanero contaminado
a diferentes volúmenes de diésel.
En la investigación realizada se aprueba la hipótesis planteada, ya que, a mayor concentración
de diésel, mayor es el porcentaje de materia orgánica presente en el suelo, como se evidencia en
los estudios realizados por Pérez et al (2015) y Rojas et al (2010) quienes encontraron que una
proporción más alta de diésel aumentó la cantidad de bacterias, además que la variedad de
microrganismos se da en función de la cantidad de diésel, por otra parte la capacidad que tiene las
Pseudomonas sp. para solubilizar fósforo es alta en cualquiera de las concentraciones evaluadas,
aunque la mayoría (el 78 %) de las cepas estudiadas pertenecen a la concentración de 500 ml.
Se recomienda seguir investigando sobre el uso de estas bacterias nativas, a diferentes
concentraciones de diésel y otros combustibles derivados de petróleo, que permitan establecer el
comportamiento de estas.
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