MÉTODOS DE EXAMES PARASITOLÓGICO

MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE PARASITAS NAS FEZES

a) Hoffmann - baseado na sedimentação espontânea das fezes após duas horas. É um método específico para pesquisa de Schistosoma mansoni, porém por mostrar-se altamente eficiente também nas pesquisas de protozoários, este método é amplamente utilizado para a pesquisa dos demais parasitas.

b) Baermann & Moraes - Método baseado no Hidrotermotropismo das larvas de Strogilóides stercoralis.

c) Direto :O método direto é específico para a pesquisa de trofozoítos nas fezes (forma adulta dos protozoários).

d) Kato e Stoll - Métodos para contagem de ovos de Helmintos.

e) Willis (flutuação em salina saturada)

f) MIF sedimentação

g) Teste da fita adesiva (pesquisa de Oxiúrus)

São inúmeros os métodos de exames coprológicos descritos na literatura, os quais podem ser qualitativos ou quantitativos, apresentando diferentes sensibilidades na detecção de ovos e larvas de helmintos e cistos de protozoários. Descrevemos a seguir alguns dos métodos e soluções utilizados de rotina em laboratórios para análise.

A coleta:

Cada amostra deve conter no mínimo as seguintes informações: nome do paciente, número de identificação, nome do médico, data e horário de coleta.

O recipiente deve ser limpo e seco, com a boca larga, de capacidade aproximada de 250ml para que possa conter uma amostra significativa e que tenha vedação hermética

Fezes obtidas de vaso sanitário não podem ser aproveitadas, porque a água e a urina poderiam destruir as formas trofozoíticas.

Fezes excretadas no solo não podem ser aproveitadas, porque larvas de vida livre e outros contaminantes do solo poderiam confundir o diagnóstico (principalmente veterinário).

Os recipientes com amostras fecais de pacientes com AIDS devem ser protegidos por um invólucro de plástico e identificados com etiqueta vermelha ou HIV positivo.

Os trofozoítos de protozoários morrem e se degeneram fora do corpo humano.

O tempo recomendado para amostras líquidas é 30 minutos, enquanto das amostras pastosas é o de uma hora após a evacuação.

Fezes formadas podem ser examinadas após um dia.

Fixação:

Fixador de Schaudinn:

Usado na preservação de fezes frescas ou amostras da superfície da mucosa intestinal;

Esta solução fixadora é usada para a preparação de esfregaços permanentes corados para demonstração de protozoários intestinais;

Solução de Lugol:

Lugol 2,0 g

Iodeto de Potássio - KI 4,0 g

Água destilada Completar para 100 ml

Conservantes de fezes:

MIF (Mertiolato, Iodo e Formaldeído)

Glicerina 5 ml

Formaldeído (40%) 25 ml

Mertiolato (ou mercurocromo) 0,1% 200 ml

Água destilada 200 ml

Solução de lugol 43 ml

Total 473 ml

Solução Mertiolato-Iodo-Formaldeído (MIF)

Este método permite obter ao mesmo tempo a preservação e a coloração de quase todos os estágios dos protozoários, de ovos e larvas de helmintos que se encontram nas fezes.

Este procedimento também permite o exame direto a fresco do material fecal ou depois de várias semanas, sem a necessidade de outra coloração

Vantagens:

Além de fixador, é corante;

Fácil preparo;

Útil em trabalhos de campo;

Adequado para os métodos de concentração

Desvantagens:

Inadequado para a preservação da morfologia de trofozoítos de protozoários.

O iodeto interfere com outros métodos de coloração;

O iodeto pode causar distorção em protozoários.

SAF (Acetato de Sódio, Ácido Acético e Formaldeído)

Acetato de Sódio 15 g

Ácido Acético 20 ml

Formadeído (40%) 40 ml

Água destilada 925 ml

Total 1.000 ml

MÉTODO DIRETO

Utilizado para pesquisa de cistos de protozoários e ovos de helmintos. método pouco sensível e só apresenta resultados positivos em infecções massivas. Procedimento: Adicionar solução de lugol às fezes, preparar a lâmina e observar direto ao microscópio em aumento de 100X e 400X.

Específico para a pesquisa de Trofozoítos em fezes frescas.

MATERIAL

1. Fezes recém emitidas 2. Lâmina e lamínula de vidro 3. Espátula de madeira 4. Solução de NaCl a 0,85%

Aplicar diretamente na lâmina de vidro pequena quantidade de fezes frescas fazendo misturar com algumas gotas de solução salina fisiológica, homogeneizando suavemente. Cobrir com lamínula e observar imediatamente ao microscópio.

MÉTODO DE HOFFMAN, PONS & JANER ou HPJ – (Sedimentação espontânea)

Utilizado na pesquisa de cistos de protozoários e ovos de helmintos.

Método baseado na sedimentação espontânea, específico para a pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni, porém é altamente eficiente e amplamente utilizado para a pesquisa de todos os parasitas.

MATERIAL NECESSÁRIO

1. Cálice de decantação 2. Peneira 3. Gaze dobrada em 4 4. Água corrente ou destilada 5. Espátula de madeira (tipo abaixador de língua) 6. Lâmina e lamínula

Tomar cerca de 4 g de fezes recém emitidas, dissolvê-las no próprio recipiente de coleta (frasco padrão para coleta de amostra) utilizando um pouco de água. Transferir o material dissolvido para um cálice de decantação fazendo filtrar em peneira contendo gaze em 4. Completar até ¾ do volume de água e deixar repousar em superfície firme e livre de vibrações por no mínimo 2 horas.

Retirar o sedimento com um canudo ou pipeta Pasteur e transferir para lâmina de vidro adicionando 2 gotas de solução de Lugol e cobrindo com lamínula. Observar ao microscópio em objetiva de 10x.

Técnica Prática:

1. Dissolver cerca de 4g de fezes em 10 ml de H2O em frasco pequeno

2. Filtrar em gaze dobrada em quatro, utilizando um cálice de sedimentação

3. Completar o cálice com água e homogeneizar com bastão de vidro.

4. Deixar em repouso de 2 a 24 horas.

5. Com uma pipeta de pasteur, retirar uma amostra do fundo do vértice do cálice.

6. Examinar ao microscópio, adicionando uma gota da solução de lugol.

MÉTODO DE WILLIS

FLUTUAÇÃO SIMPLES (flutuação em salina saturada)

Essa técnica se baseia na propriedade que alguns ovos de helmintos apresentam de flutuarem na superfície de uma solução de densidade elevada e de aderirem ao vidro. Este procedimento é específico para a pesquisa de ovos de Ancilostomídeos.

1. A solução saturada de cloreto de sódio é feita adicionando aproximadamente 40g de NaCl a 100mL de água sob aquecimento até o ponto em que o sal não se dissolva mais na água. A densidade desta solução deve ser de aproximadamente 1,20g/mL.

2. Colocar uma quantidade de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em uma pequena cuba contendo uma parte de solução saturada de cloreto de sódio, dissolver as fezes nesta solução e acrescentar água até a borda.

3. Colocar sob a borda da cuba uma lâmina de vidro quase tocando a solução saturada e deixar de 30 a 45 minutos . Após este tempo, inverter a lâmina rapidamente e observar ao microscópio.

Técnica Prática:

1. Dissolver cerca de 5g de fezes em uma solução saturada de NaCl.

2. Filtrar em gaze dobrada em quatro em frasco de Borrel (frasco comum)e completar com a solução saturada de NaCl até formar um menisco convexo na boca do frasco.

3. Colocar uma lâmina por sobre as bordas do frasco para uq efique em contato com o líquido ao menos por 5 minutos.

4. Retirar a lâmina sem escorrer o líquido e examinar ao microscópio.

MÉTODO DE FAUST – (Centrífugo-flutuação)

Utilizado na pesquisa de cistos de protozoários e ovos de helmintos.

1. Dissolver cerca de 5g de fezes em 10ml de água e filtrar em gaze dobrada em quatro.

2. Depositar o material em tubo cônico de centrífuga e centrifugar a 1500 rpm por 2 minutos.

3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender novamente em 10 ml de água.

4. Repetir os passos 2 e 3 até que o sobrenadante apresente-se claro.

5. Adicionar 10 ml de sulfato de zinco (ZnSO2) 33 %, densidade 1.180, homogenizar e centrifugar a 1500 rpm por 2’.

6. Recolher com alça de platina a película superficial, adicionar uma gota da solução de lugol e observar ao microscópio.

MÉTODO DE RITCHIE

Utilizado na pesquisa de cistos de protozoários.

1. Idêntico ao método de FAUST até o ítem 4.

2. Adicionar cerca de 8 ml de formol a 10%, homogenizar, descansar por 10’ a 20’.

3. Adicionar cerca de 2 ml de éter, agitar vigorosamente e centrifugar a 1500 rpm por 2’.

4. Desprezar o sobrenadante e examinar o depósito ao microscópio adicionando uma gota da solução de lugol.

MÉTODO DE BAERMANN-MORAES

O método de Baermann baseia-se no Hidrotermotropismo positivo das larvas de Strongyloides stercoralis. Utilizado na pesquisa e isolamento de larvas de Strongyloides sp. de fezes e de larvas de nematóides do solo.

MATERIAL NECESSÁRIO

1. Estante para Baermann

2. Tubos de Hemólise 3. Peneira e gaze 4. Lâminas e lamínulas 5. Tubo de látex e pinça de Mohr 6. Funil 7. Água aquecida a 45ºC

Colocar a água aquecida no funil com o tubo de látex vedado pela pinça de Mohr, quantidade suficiente para tocar a extremidade inferior da peneira contendo as fezes. Depositar pequena quantidade de fezes sobre a peneira contendo gaze e deixar em repouso por 45 a 60 minutos. Após este tempo, soltar a pinça de Mohr e deixar que o material escorra para um tubo de hemólise. Centrifugar o material em baixa rotação e observar o sedimento em objetiva de 10x. Este método é específico para a pesquisa de larvas de S. stercoralis.

MÉTODO DE KATO - KATZ

Utilizado principalmente na pesquisa de ovos de S. mansoni e outros helmintos.

Utilização do Kit (quantitativo - OPG):

1. Depositar uma pequena quantidade de fezes sobre uma folha de papel higiênico colocando a tela por cima e pressionando com a paleta.

2. Colocar sobre uma lâmina de vidro a placa de plástico e depositar no centro do orifício as fezes que ultrapassaram as malhas da tela (40 - 60 mg).

3. Comprimir as fezes no orifício da placa até completá-lo.

4. Sobrepor a lamínula de celofane (embebida em verde malaquita) e inverter a preparação realizando pressão com o polegar sobre a lâmina até obter uma uniformidade do material.

5. Deixar em repouso por cerca de 60 minutos a temperatura ambiente.

6. Contar todos os ovos encontrados e multiplicar o total por 24, resultando em ovos/grama de fezes.

MIF SEDIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA

1. Misturar o material fecal fixado pelo MIF.

2. Filtrar a suspensão através de gaze dobrada em 4 e colocar o filtrado em tubo cônico de sedimentação com capacidade de 125mL.

3. Adicionar água corrente, se necessário, até completar ¾ do volume do copo cônico . Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2 horas.

4. Decantar com cuidado 2/3 do sobrenadante sem perder o sedimento. Ressuspender o sedimento com água corrente e deixar em repouso por mais uma hora.

5. Esse procedimento de lavagem pode ser repetido até que o sobrenadante fique relativamente claro.

6. Colher o sedimento e depositá-lo em uma lâmina, fazendo a observação em microscópio.

MÉTODO DE GRAHAM (Método da fita adesiva) COLETA PARA PESQUISA DE ENTEROBIUS VERMICULARIS (TÉCNICA DA FITA ADESIVA OU SWAB PERIANAL NOTURNO) Utilizado na pesquisa de ovos de E. vermicularis Técnica 1. Colocar um pedaço de fita adesiva transparente em uma espátula de madeira tipo abaixador de língua com a parte adesiva voltada para fora 2. Pressionar firmemente a espátula contendo a fita adesiva contra as pregas anais e perianais 3. Colar a fita adesiva em lâmina devidamente identificada 4. No momento da execução do exame, levantar cuidadosamente a fita da lâmina e pingar uma gota de toluol ou xileno e pressionar novamente a fita contra a lâmina. A preparação ficará clara ou levemente corada, tornando os ovos bem visíveis. Só analisar o material imediatamente.. Referências bibliográficas: AMATO NETO, V. & CORRÊA, L.L., 1991. Exame parasitológico das fezes. 5a edição. Sarvier,

São Paulo, SP. 92p. CIMERMAN, B. & CIMERMAN, S., 1999. Parasitologia Humana e seus fundamentos gerais.

Editora Atheneu, Belo Horizonte, MG. 375 p. DE CARLI, G.A. 2001. Parasitologia Clínica: Seleção de Métodos e Técnicas de Laboratório para o

Diagnóstico das Parasitoses Humanas. Editora Atheneu, Rio de Janeiro, RJ. 810 p. FERREIRA, A.W. & ÁVILA, S.L.M., 1996. Diagnóstico laboratorial das principais doenças

infecciosas e auto-imunes. Editora Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro, RJ. 302 p. NEVES, D.P. et alli, 1998. Parasitologia Humana. 10a edição. Editora Atheneu, Belo Horizonte,

MG. 524 p. REY, L., 1991. Parasitologia. 2a edição. Editora Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro, RJ. 731 p. WHO – World Health Organization, 2000. Pranchas para o Diagnóstico de Parasitas Intestinais.

Livraria Editora Santos, São Paulo, SP. 12 p. WHO – World Health Organization, 1999. Procedimentos Laboratoriais em Parasitologia Médica.

Livraria Editora Santos, São Paulo, SP. 114 p.

Quadro comparativo com as principais características dos parasitos mais

comuns encontrados em exames de fezes humanas

Parasito Foto Características

Protistas

Trofozoíto de

Entamoeba

histolytica

12-60 µ, assimétrico, um núcleo

esférico e com cariossoma central.

Trofozoíto de

Entamoeba

histolytica

Esférico, 10-20 µ, 4 núcleos com

cariossoma central e delicada

cromatina periférica. Alguns cistos

podem apresentar cromátides.

Trofozoíto de

Giardia lamblia

9-21x5-15 µ, com formato de pêra,

movies, com inúmeros flagelos, com

dois núcleos centrais característicos.

Cisto de

Giardia lamblia

Oval, 8-12 µ de comprimento e 7-10 µ

de largura. Dois núcleos, que tendem a

se posicionar fora do centro da célula.

Um espaço claro entre a parede celular

e o citoplasma.

Cistos de

Entamoeba coli

10-35 µ, normalmente esférico,

contém 8 ou mais cistos (nem sempre

todos são vistos). Cariossoma

excêntrico, cromatina periférica

grosseira e irregular. Raramente

apresentam cromátides.

Helmintos - Nematoda

Ovos férteis de

Ascaris

(Família Ascarididae)

60x45 µ, Arredondado ou ovóide, com

uma casca espessa. Coberto com uma

camada espessa e irregular chamada

camada mamilonada. Normalmente de

cor marrom.

Ovo decorticado de

Ascaris

Perdeu a camada mamilonada. As

outras características são as mesmas

do ovo fértil.

Ovos férteis de

Ascaris

(Família Ascarididae)

60x45 µ, Arredondado ou ovóide, com

uma casca espessa. Coberto com uma

camada espessa e irregular chamada

camada mamilonada. Normalmente de

cor marrom.

Ovo decorticado de

Ascaris

Perdeu a camada mamilonada. As

outras características são as mesmas

do ovo fértil.

Ovo infértil de

Ascaris

90x40 µ, alongado, casca mais fina e

material interno formado por uma

massa de glóbulos.

Ovos de

Ancilostomídeos

(Família

Ancilostomidae)

Oval, elipsóide, 60x40 µ. Casca muito

fina e transparente. Podem apresentar

uma mórula (esq) ou podem estar

larvados (dir).

Ovos de Enterobius

(Família Oxyuridae)

55x26 µ, Alongado, no formato de um

“D” ao contrário. Casca fina e regular.

São normalmente encontrados

larvados.

Ovos de

Trichuris trichiura

54-22 µ, alongado, em forma de barril,

com opérculo polar.

Helmintos - Plathyhelminthes

Ovos de Taenia

Ovos redondos ou sub-esféricos, com diâmetro de

31 to 43 µm, com uma espessa casca radialmente

estriada, normalmente de cor marrom. Dentro de

cada ovo há um embrião (oncosfera) com 6

ganchos.

Ovos de Hymenolepis

Ovos arredondados ou um pouco ovais, medindo

60 to 80 µm, com uma membrana interna estriada

e uma membrane externa fina, com um grande

espaço entre elas. Possui uma oncosfera com 6

ganchos.

Ovos de

Schistosoma mansoni

Ovos grandes (114 a 180 µm) com um espinho

lateral proeminente na sua porção final. Sua

extremidade inicial é suavemente encurvada.

Quando maduro contém um miracídio em seu

interior.