Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo – Illy Gomes – Larissa Pessoa – Mayck Barbosa – Rosa

Viana –

Exames realizados na área de Genética Médica

Universidade Federal do PiauíCampus de Parnaíba

Disciplina: Práticas em Biomedicina IProfessora: France Keiko N. Yoshioka

Biomedicina 2012-02

• Genética MédicaBiologia Molecular

Citogenética

Genética Médica no Brasil

Aplicações• Testes genéticos pré-natais,• Testes de pacientes sintomáticos;• Testes de indivíduos assintomáticos;• Com risco potencial de desenvolver

mutações.

Introdução

Distúrbios genéticos

Cromossômico Estruturais

Numéricas

Gênico

Deleção Adição

InversãoTranslocação

Distúrbios genéticos

A nível cromossômico

Estruturais

Numéricas

Exames laboratoriais referentes à:

Cariotipagem

CariotipagemPasso I

• Colheita – punção venosa,

• Cultivo;

• Adição de agentes estimulantes da mitose in vitro;

• Inibir a mitose em metáfase;

• Ruptura da célula e do núcleo celular;

• Coloração e visualização em lâmina.

Passo II• Cromossomos organizados pelo tamanho e posição do centrômero

→Acrocêntricos - NORs

→Submetacêntricos

→Metacêntricos

Técnicas de coloração do cariótipo

• Bandeamentos G

• Bandeamento Q

• Bandeamento R

• Bandeamento C

• Bandeamento de alta resolução (pró-metafásico)

• Cariotipagem espectral (SKY)

• Células nucleadas,• Amostras sangue periférico, sangue fetal, líquido

amniótico;• Pareamento dos cromossomos homólogos;• Rápido, fácil e baixo custo;• Permite a contagem do número de cromossomos;• Permite avaliar a qualidade dos preparados

cromossômicos.

Coloração convencional

Técnica mais usada; tratamento com tripsina (desnaturante proteico) e coloração com Giemsa

Cada par de cromossomas cora segundo um padrão de bandas clara e escuras (bandas G)

Coloração com quinacrina mostarda (ou outros semelhantes); observação ao microscópio de fluorescência

Cromossomas coram segundo um padrão de bandas brilhantes e opacas (bandas Q = bandas G)

Desnaturação térmica e salina seguida de coloração com Giemsa ou flurocromo( Acridina)

Bandas escuras e claras (bandas R) estão invertidas relativamente ao bandeamento G e Q

Bandeamento G

Bandeamento Q

Bandeamento R

Síndrome de Down

Bandeamento G

Bandeamento Q

Bandeamento R

• Coloração que contém heterocromatina constitutiva ;

• Partes: centrômeros e partes dos cromossomos e braços longos dos cromossomos 1,9,16 e Y.

Bandeamento C

Procedimentos especiais

Infertilidade

Síndrome de DiGeorge

• Usado com técnicas de bandeamentos G ou R,• Estágios iniciais da mitose, prófase e pró –

metáfase;• Útil principalmente para microdeleções

cromossômicas -anomalias estruturais ;• Revelam mais bandas que os métodos que usam

a fase Metáfase.

Bandeamento de alta resolução

Cariotipagem espectral (SKY)

• Cromossomos de uma

célula de uma só vez,

• Cores fluorescentes;

• 24 diferentes espectros

fluorescentes sendo o 23

ª e 24ª para o

cromossomo X e Y;

• Coloração genômica total ;

• Sistema de computador

para análise de imagem.

ATAXIA

O que essas técnicas nos permitem diagnosticar?

→Euploidia múltiplo exato do conjunto cromossômico

(tetraploidia)

→Aneuploidia qualquer outro número que não seja

múltiplo do conjunto genômico (monossomia , trissomia)

• Síndrome de Down (trissomia do 21)

• Síndrome de Edward (trissomia do 18)

• Síndrome de Patau (trissomia do 13)

• Síndrome de Turner (monossomia do cromossomo

X)

Translocações recíprocas – troca de segmentos entre cromossomos

Distúrbios genéticos A nível gênico

Deleção Adição

InversãoTransição

Exames laboratoriais referentes à:

FISH - hibridização in situ por fluorescência

• Preparação de sondas específicas de DNA.• Kits pelos laboratórios de citogenética.

• Preparação das sondas:

→ Método direto→ Método indireto

• Preparação dos cromossomos.

• Preparação das lâminas.

• Desnaturação da sonda e do DNA cromossômico → aquecimento em solução de formamida (70C).

• Leucemia Mieloide Crônica (LMC)→ Cromossomo Filadélfia

FISH - Aplicações

FISH - Aplicações• Síndrome Cri-du-chat Microdeleção

Detecção de aneuploidias – Trissomia do 21

PCR Extração e purificação do DNA

1. Tampão de extração (EDTA, SDS em pH básico),

2. Adicionar Proteinase K;

3. Adicionar RNAse;

4. Adicionar Fenol;

6. Adicionar Clorofórmio/ álcool isoamílico;

8. Adicionar Acetado de Na 3M e etanol gelado.

• DNA molde,

• Primers (delimitam a sequência a ser

amplificada);

• DNA polimerase (Taq polimerase);

• dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);

• Tampão contendo pH de ação da DNA

polimerase;

• Cloreto de magnésio (íons Mg2+).

Componentes básicos necessários para

realização de uma reação de PCR:

Desnaturação

Hibridização dos primes

Extensão

A técnica da PCR

Cuidados especiais nas reações de PCR

• A alta sensibilidade.• Qualquer sequência alvo de DNA pode ser

amplificada por PCR.• Inclusão de controles em cada experimento.

Possíveis fontes de contaminação da PCR

Amostras biológicas Ponteiras plásticas

Métodos de coleta de amostras

Tubos de reagentes/vidraria

Pessoal do laboratório Reagentes

Ambiente do laboratório/ ar condicionado

Tubos de centrífuga/ centrífuga

Gelo/ nitrogênio líquido Termociclador/ banho-maria/ bloco de aquecimento

Homogenizador de tecidos Transiluminador

RT-PCRComponentes básicos para a realização de uma RT‐PCR

• Transcriptase reversa,

• DNA polimerase;

• Taq polimerase;

• dNTPs;

• Primers;

• Íons Mg2+.

1ª Etapa (37° C)

Transcriptase reversa, DNA polimerase, primers, dNTPs

2ª Etapa (ciclos de 94°, 60°, 72° C)

Taq polimerase, dNTPs, Primers, Íons Mg2+

Eletroforese

• Preparação do gel,

• Aplicação da amostra no gel e separação por

eletroforese.

Procedimentos de Eletroforese

Preparação do gel solidificação Tampão TBE

Remover o pente

Aplicar a amostraLigar a fonte

Transiluminador

Eletroforese• Estudos da relação patógeno-hospedeiro,

• Determinação do peso molecular de proteínas;

• Caracterização de moléculas de ácidos nucléicos;

• DNA recombinante, sequenciamento de

nucleotídeos;

• Mapeamento de fragmentos de restrição;

• Amplificação de DNA.

Aplicações da PCR e Eletroforese

de DNA→ Diagnóstico pré‐natal.• Diagnóstico pré‐natal e detecção de portadores da distrofia

muscular Duchenne envolvendo a triagem de deleções e

duplicações usando a reação em cadeia da polimerase (PCR)

multiplex. O paciente 1 não tem as bandas E e F, deleção dos

éxons 45 ‐ 48. O paciente 2 não tem as bandas f e h e o paciente 3

não tem a banda d.

•PCR ‐ RFLP – polimorfismo de fragmentos de restrição (Análise de mutações)

Aplicações da PCR e Eletroforese de

DNA

→ Diagnóstico de hemoglobina S (HbS).

• Mutação no códon (GAG > GTG) elimina um sítio de restrição da Enzima DdeI ; assim após a digestão o alelo normal gera 3 fragmentos: 201, 88 e 87 pb e o alelo mutante 2 fragmentos: 288 e 88pb.

Southern Blot• É um método de análise de ácidos nucleicos que

permitem mapear fragmentos de DNA de interesse

em uma coleção de fragmentos que é o nosso

genoma.

• Indicado para diagnóstico de doenças e na

identificação de pessoas.

• A metodologia permite a detecção de genes

inteiros ou grande parte deles, assim como

inserções e deleções.

Doença Tipo de mutação Teste

Síndrome do X frágil

Expansão de trinucleotídeos (CGG) na região promotora do gene

FMR1

PCR associado à Southern blot

Distrofia de Becker e

Duchenne

Mutações do tipo deleção e duplicação no gene da

distrofia (DMD).

PCR e Souther blot para detecção de

deleções

Southern BlotDNA digerido por uma enzima de restrição

Separação dos fragmentos em gel de

agarose

Transferência dos fragmentos do gel para uma membrana de nitrocelulose

Membrana com os fragmentos transferidos

Hibridização com sonda marcada radioativamente

Autorradiografia: as bandas correspondem a fragmentos

onde a sonda hibridizou

Northern Blot

• Análise do RNA,

• Desnaturação antes da Eletroforese em gel com

adição de formaldeído;

• Depois da eletroforese o RNA é transferido para

um filtro incubado com uma sonda desnaturada,

marcada que hibridiza o RNA específico;

• Exposição do filtro ao raio X.

Separação dos fragmentos em gel de

agarose

Transferência dos fragmentos do gel para uma membrana de nitrocelulose

Membrana com os fragmentos transferidos

Hibridização com sonda marcada radioativamente

Autorradiografia: as bandas correspondem a fragmentos

onde a sonda hibridizou

Purificação do RNA

Northern Blot

Dot blotTrata-se de uma metodologia que permite

detectar biomoléculas. É uma simplificação da metodologia de Southern blot, northern blot e westhern blot.• Moléculas não são separadas por eletroforese,

• Aplicadas diretamente a um suporte sólido como

um ponto (dot);

• A membrana é submetida ao processo de

desnaturação é hibridizada com a sonda de

interesse. Indicações Em casos em que a mutação investigada é

prevalente na população investigada, ou seja, a mutação de uma base ou um pequeno número de bases é responsável por uma fração significativa de casos da doença naquela população.

Westhern BlotTambém conhecido como protein blotting ou

immunoblotting, é um poderoso e importante método em biologia molecular utilizado para imunodetecção de proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana adsorvente.

A genética médica e o futuro

Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo – Illy Gomes – Larissa Pessoa – Mayck Barbosa – Rosa

Viana –

Obrigada pela atenção!!!

Universidade Federal do PiauíCampus de Parnaíba

Disciplina: Práticas em Biomedicina IProfessora: France Keiko N. Yoshioka

Biomedicina 2012-02

Referências Bibliográficas

• BAMOHAD, J. G. Genética Médica. Elsevier. 2010. capítulo

6. Citogenética Clínica: A base cromossômica da doença

humana.

• NASSBAUM, et al. Tompson & Tompson. Guanabara

Koogan. 2002. Capítulo 9. Fundamentos de citogenética.