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Expressão da proteína TauA e Construção de um Modelo para o Regulador do Operon tauABCD de Xanthomonas

axonopodis pv. citri

Bolsista José Caetano da Silva Filho

Estudante de Ciências Biológicas da Universidade Federal da Paraíba

Orientador

Profª Drª Andrea Balan / LNBio

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Expressão da proteína TauA e Construção de um Modelo para o regulador do operon tauABCD de Xanthomonas

axonopodis pv. citri

Bolsista José Caetano da Silva Filho

Estudante de Ciências Biológicas da Universidade Federal da Paraíba

Orientador

Profª Drª Andrea Balan / LNBio

2011

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AGRADECIMENTOS

- Aos meus pais, por tudo que fizeram e fazem por mim; - À minha esposa, por sua paciência, compreensão e, principalmente, apoio; - À Dra. Andrea Balan, que me escolheu para participar do 20º Programa Bolsas de Verão, dando-me a oportunidade de aperfeiçoar e aumentar meus conhecimentos dentro da Biologia Molecular Estrutural; - A todo o pessoal que compõe o grupo de Transportadores ABC do LNBio (Carol, Cristiane, Letícia e Jéssica), que sempre me ajudaram (e me aturaram) no dia-a-dia. Mas de maneira especial, quero agradecer à Vanessa Pegos que, mesmo estando ocupada com sua tese de mestrado, me deu todo o apoio necessário para o desenvolvimento dos experimentos de bancada; e, também, agradecer ao Alexandre Moutran, pelos conhecimentos transmitidos com relação à Bioinformática; - Ao meu orientador na UFPB, Plínio Delatorre, que me ensinou (e ensina), com suas loucuras, a trabalhar com Ciência. Mais ainda, por me proporcionar um grande e valioso aprendizado na Biologia Molecular Estrutural. E agradecer também porque, sem dúvida, sem a sua orientação eu não poderia ter participado desse momento que vem mudando meu modo de pensar e fazer Ciência. - À professora da UFPB Dra. Tatiane Santi-Gadelha, que também muito contribuiu para que eu estivesse aqui; - A todos os amigos bolsistas que durante esses quase dois meses de convivência proporcionaram grandes momentos de alegrias, sorrisos, troca de conhecimento e, especialmente, de “birita”; - À Vilmara Congílio, que sempre esteve disposta a ajudar, cuidar...Na verdade não há palavras que possam descrever o quão importante essa pessoa foi para nós; - A todos aqueles do LNBio/LNLS/CTBE que direto ou indiretamente ajudaram a todos os bolsistas (de maneira especial ao Roberto Medeiros e ao André Ambrósio); E - Aos companheiros do futebol João Carlos, Cláudio, “Messi”, Matheus...e todos os outros que me proporcionaram fazer uma das coisas que mais amo.

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SUMÁRIO

Sumário

RESUMO....................................................................................................................... ............................7

1. INTRODUÇÃO...............................................................................................................................9 1.1 Permeases................................................................................................................ .....................11 1.2 Domínios de Ligação a Nucleotídeos (NBDs)................................................................12

1.3 Proteínas Periplasmáticas.....................................................................................................13 1.4 Sistemas de captação e transporte de compostos sulfonados...............................14 1.5 Regulação da internalização e dessulfonação de compostos sulfonados.........16 2. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 19

3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................... ....20

3.1 Procedimentos de Bancada...................................................................................................20 3.1.1 Transformação.......................................................................................................... ..............20

3.1.2 Expressão.................................................................................................................... ..............20 3.1.3 Extração................................................................................................... ..................................21 3.1.4 Purificação............................................................................................................ ....................22 3.1.5 Western Blott...........................................................................................................................22 3.2 Análises de Bioinformática....................................................................................................22 3.2.1 Busca pelo regulador do operon tau de X. axonopodis e por proteínas com enovelamento similar para a construção de modelos......................................................22 3.2.2 Alinhamento........................................................................................................ .....................23 3.2.3 Construção do modelo................................................................................................... ......23 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................................24 4.1 Procedimentos de Bancada...................................................................................................24 4.2 Análises de Bioinformática....................................................................................................31 4.2.1 O modelo Xac3339 se ajusta ao enovelamento característico de reguladores transcricionais do tipo LysR.........................................................................................................33 4.2.2 O N-terminal de Xac3339 é fortemente positivo.....................................................34 4.2.3 Xac3339 apresenta conservação de resíduos de aminoácidos que interagem com o sulfato.......................................................................................................................................35 5. CONCLUSÕES..............................................................................................................................37

6. PERSPECTIVAS................................................................................................................. ..........37 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................................................38

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RESUMO

Xanthomonas axonopodis pv. citri é uma bactéria gram-negativa causadora do cancro cítrico, uma fitopatologia que afeta plantas como a laranja. A sobrevivência dessas bactérias depende da disponibilidade ambiental de enxofre, o qual, sob a forma inorgânica de sulfato, é precursor na biossíntese de cisteína. Estudos em E. coli indicam que a internalização desse e de outros nutrientes depende da atividade de um transportador ABC, constituído por dois domínios transmembranas de transporte e dois citoplasmáticos de ligação e hidrólise do ATP. Além disso, há a presença de um componente periplasmático, responsável pela especificidade e unidirecionalidade do transporte. Em condições de depleção ambiental de sulfato, genes inicialmente silenciados são expressos para a captação de sulfonatos e alcano sulfonatos, fontes orgânicas de enxofre. Um dos compostos assimilados quando dessa carência é a taurina, cuja captação está ligada à atividade do operon tauABCD. Este, como outros operons relacionados à síntese de cisteína, são regulados pelas proteínas CysB e Cbl, dois representantes da família LysR, a maior de fatores transcricionais em procariotos. Estudos desenvolvidos com o genoma de X. axonopodis indicaram a presença de um operon que, supostamente, apresenta a mesma funcionalidade que aquele encontrado em E. coli. Esse operon tauABCD de X. axonopodis é composto por sete genes que codificam os componentes periplasmático, permease, de hidrólise do ATP e os acessórios (redutase, oxigenases e regulador). Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo principal expressar e purificar o componente periplasmático do operon, a TauA. Concomitante a isto, objetivou-se construir um modelo estrutural para o regulador do operon, procurando, assim, entender como que se dá seu mecanismo de ação. A expressão da TauA foi realizada em células das linhagens BL21 (DE3), BL21 (AI) e ARTIC de E. coli portadoras do vetor pET28a. A indução foi realizada com IPTG 0,1mM a 37°C, 18°C e 4°C durante 2 horas, 18 horas e 48 horas, respectivamente, a 200rpm. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade a níquel (Ni2+). Para construir o modelo do regulador, fez-se o BLAST das estruturas de CysB de Klebsiella aerogenes (PDB 1AL3) e Cbl de E. coli (PDB 2FYI) contra o genoma de X. axonopodis. O resultado foi alinhado com as duas estruturas pelo programa CLUSTALW. A criação do modelo foi realizada através do programa MODELLER, onde utilizou-se, além da CysB e da Cbl, a proteína ModE de E. coli (PDB 1B9M) como molde para o N-terminal. A TauA mostrou-se ser expressa um pouco mais eficientemente sob indução a 18°C, embora tenha se comportado de maneira instável, impossibilitando sua purificação. As análises de bioinformática mostraram que em X. axonopodis há a presença de apenas um regulador, a proteína CysB, que é codificada pelo gene Xac3339. Essa proteína mostrou possuir conservação seqüencial e estrutural no sítio de ligação e no enovelamento de Rossmann com aquelas de E. coli e K. aerogenes. O N-terminal do modelo construído mostrou-se ser bastante positivo, corroborando a ideia de que é nessa região que encontra-se o sítio de interação com o DNA. PALAVRAS-CHAVE: Xanthomonas axonopodis pv. citri; transportador ABC; operon tauABCD; TauA; regulador transcricional; CysB e Cbl.

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1. INTRODUÇÃO

Xanthomonas spp. são bactérias classificadas como gram-negativas, sendo, assim, caracterizadas por uma dupla camada lipídica localizada externamente à membrana plasmática (figura 1). Entre estas duas membranas encontra-se um espaço preenchido por proteoglicanos que é denominado de periplasma ou espaço periplasmático, onde encontram-se diversas macromoléculas, dentre as quais destacam-se aquelas relacionadas à internalização de nutrientes (abordadas mais adiante).

Dentre as diversas espécies que compõem o gênero, há grande destaque para a Xanthomonas axonopodis pv. citri, uma vez que a mesma está relacionada ao desenvolvimento do cancro cítrico (figura 2), uma fitopatologia que afeta plantas economicamente importantes, como a laranja e o limão, provocando o aparecimento de lesões salientes em folhas, frutos e ramos (NETO et al., 2006).

FIGURA 1 Comparação entre as superfícies celulares de uma bactéria gram-positiva e uma gram-negativa. Nota-se, nessa segunda, a diminuição da espessura da camada de peptidoglicano em relação à primeira, além da presença do espaço periplasmático ou periplasma entre a membrana externa (ausente na gram-positiva) e a plasmática. Disponível em...

FIGURA 2 Lesões provocadas pela X. axonopodis pv. citri em fruto e folha de laranja (Citrus sp.). No fruto, a patologia manifesta-se, inicialmente, sob a forma de manchas amarelas, com um ponto marrom no centro, que vão crescendo aos poucos. Essas manchas são salientes, embora superficiais, parecidas com verrugas. Nas folhas, os sintomas iniciais são os mesmos, embora, em sua fase mais avançada, seja caracterizada por lesões corticosas com centro marrom e um anel amarelo em volta (NETO et al., 2006). Disponível em...

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Como todo organismo vivo, as Xanthomonas spp. precisam interagir com o meio circunvizinho, tanto para a aquisição de metabólitos importantes para sua sobrevivência como para a liberação de substâncias de defesa ou que possam ocasionar algum dano. Nesse sentido, a interação organismo-ambiente pode ser realizada de diversas formas, dentre as quais pode-se destacar o papel de proteínas transportadoras que medeiam tanto a importação como a exportação de substâncias.

Dentre os mais diversos transportadores, há especial interesse para aqueles que formam o chamado sistema transportador ABC (ATP-Binding Cassette), que utilizam a energia proveniente da hidrólise do ATP para dirigir a translocação de substratos através da membrana plasmática (LOCHER, 2008). Em humanos, defeitos genéticos nessas proteínas estão relacionadas com o desenvolvimento de muitos processos patológicos, como a fibrose cística (DEAN et al., 2003 – citado por CHEN et al., 2003). Além disso, sua superexpressão em células tumorais contribui para o processo de resistência a múltiplas drogas (CHEN et al., 1986 – citado por CHEN et al., 2003), tornando muitos tratamentos quimioterápicos ineficazes.

A organização estrutural de um sistema transportador ABC consiste, basicamente, de dois domínios transmembranas (TMDs – TransMembrane Domains), que formam homo- ou heterodímeros, e dois domínios citosólicos de ligação e hidrólise do ATP, chamados de domínios de ligação a nucleotídeos (NBDs – Nucleotide-Binding Domains). A despeito dessa conservação estrutural, transportadores ABC podem ser divididos em três categorias funcionais: importadores, presentes apenas em procariotos e que relacionam-se à internalização de uma grande variedade de nutrientes, como mono- e oligossacarídeos, íons orgânicos e inorgânicos, aminoácidos, peptídeos e vitaminas; exportadores, distribuídos ubiquamente por todos os reinos de seres vivos e que estão envolvidos na secreção de diversas moléculas, como peptídeos, lipídios, drogas hidrofóbicas, polissacarídeos e proteínas, incluindo algumas toxinas, como a hemolisina; e um terceiro grupo que não desempenha função de transporte, estando relacionados à tradução do mRNA e ao reparo do DNA (DAVIDSON et al., 2008).

Importadores e exportadores apresentam outras diferenças entre si além dos organismos nos quais são encontrados. Nos primeiros, por exemplo, quando estamos tratando de bactérias gram-negativas, há um quinto elemento que compõe o sistema: a proteína ligadora de substrato (SBP – Substrate-Binding Protein), localizada no espaço periplasmático, que é um monômero com dois subdomínios que dá especificidade e afinidade ao transporte (apresentado mais adiante). A figura 3 esquematiza as diferenças básicas existentes entre importadores e exportadores.

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Como o presente trabalho aborda um sistema importador presente em bactérias gram-negativas, as descrições estruturais de cada componente de um transportador ABC serão direcionadas para essa categoria, embora, quando conveniente, comparar-se-á-lo com os exportadores.

1.1 Permeases

Os TMDs formam o canal por onde o substrato, captado pela proteína periplasmática, passa para ser internalizado. Esses constituintes do transportador são compostos por alfa-hélices que, nos diferentes sistemas de transporte, apresentam variações seqüenciais e estruturais, refletindo a diversidade de substratos translocados (DAWSON et al., 2007). Normalmente, cada domínio possui o mesmo número de hélices, onde, para os importadores, existem entre 8 e 20 e para o exportadores há o número fixo de 12 (MOUSSATOVA et al., 2008). Contudo, alguns transportadores ABC são assimétricos, com cada domínio apresentando um número distinto de hélices, como, por exemplo, no sistema transportador de maltose (MalEFGK), onde uma subunidade contem 8 hélices e a outra 6 (MOUSSATOVA et al., 2008).

De acordo com Hollenstein e colaboradores (2007), apesar da variação estrutural existente entre as permeases de diferentes sistemas de transporte, algumas regiões apresentam certa conservação, tanto em sua sequência de resíduos de aminoácidos como em sua arquitetura. Por exemplo, o alinhamento da estrutura primária da TMD de A. fulgidus com aquelas que constituem os importadores de molibdato, sulfato e fosfato de outras gram-negativas (figura 4) revelou grande conservação nas regiões “gate”, que formam um tipo de bloqueio entre a cavidade das TMDs (provável caminho para a translocação do substrato) e o espaço periplasmático.

FIGURA 3 Importadores e exportadores da superfamília ABC. Como demonstrado na figura à esquerda, a captação de nutrientes dirigida pela hidrólise do ATP necessita da presença de uma proteína solúvel presente no periplasma. Por outro lado, a liberação de substâncias (figura à direita) ocorre sem o auxílio dessa proteína. Além disso, nota-se que no exportadores, as NBDs e TMDs estão fusionadas, enquanto nos importadores não. Adaptado de LOCHER, 2008.

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FIGURA 4 Alinhamento das regiões “gate” de TMDs de diferentes organismos. Essas regiões que “fecham” a cavidade na região de interface entre as TMDs e a proteína periplasmática apresentam grande conservação sequencial e estrutural. Destaque, em preto, para a F200, o resíduo mais conservado. Adaptado de HOLLENSTEIN et al., 2007.

1.2 Domínios de ligação a nucleotídeos (NBDs)

Diferentemente das TMDs, esses domínios apresentam grande conservação estrutural e sequencial. Cada domínio contem dois subdomínios: um relacionado estruturalmente à proteína RecA e outro denominado de “helical”. Ambos domínios, ainda, apresentam motivos bem conservados, dentre os quais os mais importantes são os P-loops (ou Walker A motifs), localizados no subdomínio RecA e o LSGGQ motif (referência ao resíduos de aminoácidos constituintes), localizados no subdomínio “helical”. O arranjo dos subdomínios é tal que o P-loop de um domínio está “em contato” com o LSGGQ motif do outro, criando, assim, dois sítios para a ligação do ATP (figura 5) (LOCHER, 2008).

Na ausência dos nucleotídeos, os domínios apresentam um espaço na sua interface, ao passo que a ligação dos ATPs promove sua aproximação (LOCHER, 2008). Essa ligação, portanto, é acompanhada de uma mudança conformacional nas NBDs, a qual é transmitida para as TMDs, permitindo, assim, a translocação do substrato (DAWSON et al., 2007). O mecanismo proposto para essa transmissão de mudança conformacional é de que no estado livre de ATP as NBDs encontram-se abertas e as TMDs com a cavidade fechada para o espaço periplasmático e aberta para o citoplasma. Na ocorrência da ligação, as NBDs fecham-se e a cavidade das TMDs torna-se fechada para o citoplasma e aberta para o periplasma (MOUSSATOVA, 2008).

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FIGURA 5 Esquematização das conformações das NBDs nos estados ligado e “desligado”. O arranjo dos subdomínios (P-loop/LSGGQ motif) é chamao “head-to-tail”, onde há a formação de dois sítios para a ligação do ATP. Na ausência desse nucleotídeo (esquerda), a interface entre os dois domínios apresenta um espaço (“gap”). Quando da ligação do ATP, uma mudança conformacional aproxima os dois domínios, ficando, aquela molécula, “sandwiched” entre as NBDs. Adaptado de LOCHER, 2008.

É interessante destacar que a relação NBD-TMD pode ocorrer de diferentes formas, de modo que os sistemas ABC podem ser divididos em três classes funcionais. Na primeira classe encontram-se principalmente os exportadores, caracterizados pela fusão entre TMDs e NBDs, de modo que cada um destes é um subdomínio de um domínio. Na classe 2 estão presentes sistemas ABC que não possuem, pelos aparentemente, função transportadora, uma vez que contem TMDs. Na última classe encontram-se os importadores que apresentam quatro domínios ou cadeias polipeptídicas independentes (DAVIDSON et al., 2008).

1.3 Proteínas periplasmáticas

O quinto componente do sistema ABC é encontrado apenas em importadores e, portanto, em procariotos. Sua atividade pode ser desempenhada com concentrações muito baixas de ligantes, da ordem de 0,01 a 1 µM. Assim, essas proteínas dão afinidade e especificidade ao transporte de substratos (DAVIDSON et al., 2008).

Muitas proteínas periplasmáticas são específicas para um único ligante ou para um grupo de ligantes estruturalmente relacionados, como maltose e maltodextrinas. Por outro lado, algumas dessas proteínas podem ser bastante versáteis no que diz respeito à especificidade, podendo interagir com substratos não relacionados estruturalmente. Essa especificidade é mediada, primariamente, pelas interações de hidrogênio entre os resíduos e o ligante. Portanto, a capacidade de distinção entre um substrato ou outro depende do pH do meio (e, consequentemente, do estado de ionização do ligante), bem como do tamanho deste. Assim, por exemplo, uma proteína ligadora de fosfato distingue este ligante de um sulfato devido à presença de resíduos carregados que fazem interação com oxigênios protonados (DAVIDSON et al., 2008) .

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Estas proteínas são monoméricas, apresentando dois domínios globulares (lobos) que estão conectados por uma ou mais cadeias polipeptídicas. Um dos domínios ou lobos é denominado N e o outro C, devido à presença das regiões N e C terminais, respectivamente. Estudos estruturais e cinéticos indicam que cada periplasmática apresenta apenas um sítio de ligação a substrato, localizado entre os dois domínios. Na ausência de interação, os lobos encontram-se separados, havendo uma cavidade entre eles. Quando da presença do substrato, esses lobos aproximam-se, encerrando o ligante (figura 6) (DAVIDSON et al., 2008).

FIGURA 6 Estruturas da proteína ligadora de maltose nos estados ligado e “desligado”. Em azul, destaca-se a estrutura na conformação aberta (PDB: 1ANF), enquanto a conformação fechada, encerrando o ligante, está em rosa (PDB: 1OMP). Adaptado de DAVIDSON et al., 2008.

É válido destacar que o mecanismo de liberação do substrato deve envolver a interação entre a proteína periplasmática e os domínios TMDs. Nesse sentido, Davidson e colaboradores (2008) destacam essas interações para a proteína ligadora de maltose, mostrando que o lobo C interage com a MalF e o N com a MalG.

Davidson e colaboradores (2008), ainda, destacam o papel de ativação da hidrólise do ATP desempenhada por proteínas periplasmáticas, demonstrando que os sistemas transportadores de maltose e histidina aumentam de 6 a 10 vezes a hidrólise do nucleotídeo na presença do substrato, embora o estado livre de ligante ainda possa estimular.

Devido à alta especificidade demonstrada pelas periplasmáticas, trabalhos tem procurado desenvolver processos biotecnológicos a partir desta característica. Assim, por exemplo, Shrestha e colaboradores (2001) demonstraram a produção de um sistema de sensibilidade a sulfato baseado na mudança conformacional apresentada por sua proteína ligadora.

1.4 Sistema de captação e transporte de compostos sulfonados

O crescimento de células bacterianas depende da disponibilidade ambiental de enxofre, o qual, encontrado principalmente sob a forma inorgânica

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de sulfato (SO4-), atua como precursor na biossíntese de cisteína (van der PLOEG & EICHHORN, 2001).

Quando há depleção desse íon, um conjunto de genes, inicialmente silenciado, passa a ser expresso. Kertesz e colaboradores (1993) demonstraram, através de eletroforese bidimensional, que a expressão desses genes produz cerca de oito proteínas que, quando da disponibilidade do íon, não encontram-se presentes em células de E. coli, Pseudomonas putida e Staphylococcus aureus. Dentre essas proteínas, que em conjunto são denominadas de “SSI (Starvation-Sulfate Induced) proteins”, estão a proteína ligadora de sulfato (Sbp – Sulfate-Binding Protein) e a O-acetylserina liase, as quais participam da via de formação da cisteína a partir da redução do sulfato (KREDICH, 1996 – citado por VAN DER PLOEG et al., 1999).

A expressão dessas proteínas permite que as bactérias utilizem outras fontes de enxofre, como alcanossulfonatos (alifáticos ou aromáticos) e ésteres de sulfato, que são formas orgânicas desse nutriente, seja em condições aeróbicas ou anaeróbicas (SEITZ & LEADBETTER 1995; COOK et al. 1998 e KERTESZ 2000 – citados por VAN DER PLOEG & EICHHORN, 2001).

Dentre esses genes expressos, pode-se destacar aqueles que constituem os operons ssuEADCB (VAN DER PLOEG et al., 1999) e tauABCD (VAN DER PLOEG et al., 1996), que permitem a captação de alcassulfonatos aromáticos e/ou de cadeias longas e da taurina e/ou alcanossulfonatos de cadeia curta, respectivamente. A taurina (ácido 2-aminoetanossulfônico) é um composto que, em bactérias, é metabolizado pela ação de uma transaminase ou de uma desidrogenase. Há indícios de que essa molécula, presente em concentrações milimolares em tecidos de mamíferos, atue como antioxidante, ao reagir com o ácido hipocloroso (HOCl), como um neurotransmissor ou, ainda, como um anti-inflamatório (CUNNINGHAN et al., 1998).

Os genes dos sistemas ssuABC e tauABC codificam proteínas que constituem um sistema importador do tipo ABC, onde ssuA e tauA codificam as proteínas periplasmáticas e ssuC/tauC e ssuB/tauB os domínios transmembranas e as proteínas ligadoras ao ATP, respectivamente. Por sua vez, os genes ssuD e ssuE codificam, respectivamente, uma monoxigenase dependente de FMNH2 e uma redutase; tauD codifica uma dioxigenase que cataliza a incorporação de um oxigênio à molécula de taurina, promovendo a liberação de sulfido, que será convertido em cisteína (EICHHORN et al., 1997). A figura 7 esquematiza o funcionamento dos sistemas SsuEADCB e TauABCD.

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FIGURA 7 Captação e dessulfonação da taurina e de outros alcanossulfonatos pelos sistemas TauABCD e SsuEADCB de E. coli. Alcanossulfonatos alifáticos de cadeias longas são internalizados e dessulfonados pelas proteínas do sistema Ssu (via à esquerda). Esta última etapa envolve a atividade sincronizada da SsuE e da SsuD, onde a primeira, a partir da oxidação do NAD(P)H, reduz uma molécula de FMN a FMNH2, a qual é um cofator para a atividade monooxigenase da SsuD. A via mostrada à direita representa a assimilação e dessulfonação da taurina e de alcanossulfonatos alifáticos de cadeia curta. Esta etapa ocorre através da ação da TauD, que utiliza como substratos a taurina e o α-cetoglutarato. É interessante destacar que, apesar do sistema TauABC também realizar o transporte de outros alcanossulfonatos, a dessulfonação destes parece ocorrer não pela TauD, mas sim pela SsuD. Adaptado de VAN DER PLOEG et al., 2001.

1.5 Regulação da internalização e dessulfonação de compostos sulfonados

Os genes que participam da via de biossíntese da cisteína são regulados pelas proteínas CysB e Cbl, dois representantes da família de fatores transcricionais LysR, a maior de procariotos. Essa família foi descrita inicialmente por Henikoff e colaboradores (1988), os quais demonstraram que seus membros apresentam grande conservação sequencial e estrutural na região N-terminal, onde está localizado o motivo HTH (Helix-Turn-Helix), responsável pela interação dessas proteínas com o DNA. Além disso, esses reguladores caracterizam-se por (1) dependerem de um co-indutor para a execução de suas atividades e (2) por sua autorregulação negativa, ou seja, a proteína CysB, por exemplo, interage com a região promotora de seu próprio gene codificante (cysB) para inibir sua expressão. Nesse contexto, Ostrowski & Kredich (1991) demostraram que em Salmonella typhimurium, CysB inibe sua própria expressão ao se ligar em uma região compreendida entre as posições -10 e 36 de seu gene. Ao comparar esse sítio de ligação da CysB (CBS-B – CysB-Binding Site of cysB) com aqueles descritos para os promotores de cysJIH e cysK (MONROE et al., 1990) de E.coli e S. typhimurium (figura 8), esses autores verificaram que a sequência consenso TTATT é de fundamental importância para a ligação de CysB.

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FIGURA 8 Comparação entre as regiões de ligação de CysB nos promotores de cysB, cysJIH e cysK de S. typhimurium e E. coli. Destaque para a região consenso TTATT, que aparece pelo menos uma vez nas sequências analisadas. Adaptado de OSTROWSKI & KREDICH, 1991.

VAN DER PLOEG e colaboradores (1997), caracterizaram a atividade regulatória das proteínas CysB e Cbl sobre o operon tauABCD em E. coli, demonstrando que a primeira possui dois sítios de ligação e a segunda apenas um. Interessantemente, como os próprios autores afirmam, a localização desses sítios são incomuns para membros da família LysR: o primeiro sítio de CysB localiza-se cerca de 200 pb antes do códon inicial, ao passo que o segundo encontra-se mais próximo (cerca de 120 pb). Este último sobrepõe-se ao sítio de Cbl, o que indica que, segundo os autores, Cbl é a primeira a interagir com o promotor, apresentando a função de facilitar a ligação de CysB ao seu segundo sítio. A figura 9 esquematiza os três sítios de ligação.

A co-indução da CysB é realizada pela O-acetilserina. Na presença de cisteína, sulfato ou tiossulfato, a atividade da enzima responsável pela formação desse co-indutor é inibida, de modo que o regulador LysR não é ativado e assim não há expressão, por exemplo, dos operons ssuEADCB e tauABCD. Por esse

FIGURA 9 Sítios de ligação de CysB e Cbl nas regiões promotoras do operon tauABCD de E. coli. O primeiro sítio de ligação da CysB (CysB-BS1), o segundo (CysB-BS2) e o de Cbl (Cbl-BS) estão localizados entre as posições -221 e -183, -121 e -11 e -112 e -68, respectivamente. O tamanho do segundo sítio para CysB indica, provavelmente, que mais de uma molécula interage com o DNA. Adaptado de VAN DER PLOEG et al., 1997.

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motivo, as proteínas descritas por Henikoff e colaboradores (1988) são identificadas apenas sob condições de depleção do sulfato. Há indícios, também, de que a inibição da atividade da CysB seja efetuada diretamente através da competição entre o tiossulfato e o co-indutor pela interação com a proteína (TYRREL et al., 1997).

Diante de tudo isso, é interessante destacar que, apesar de sua importância, pouco se sabe a respeito da captação de compostos sulfonados pelo fitopatógeno X. axonopodis pv. citri.

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2. OBJETIVOS

- Analisar a expressão da proteína TauA sob diferentes condições; - Purificar a TauA através de cromatografia de afinidade a metal imobilizado; - Identificar e caracterizar por meio de procedimentos de bioinformática o regulador do operon tau.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Procedimentos de bancada

3.1.1 Transformação

Quatro linhagens distintas de E. coli foram utilizadas para verificar qual (ou quais) seria (m) a (s) mais adequada (s) para a expressão da TauA. 100 µl das células de BL21 (DE3), BL21 (AI), ARTIC e ΔSlyD, estabelecidas previamente como competentes, foram incubadas, cada uma, com 2µl do vetor pET28a, o qual continha o gene codificador da TauA, que estava sob o controle do bacteriófago T7. A incorporação do plasmídeo às células se deu por eletroporação. Após sua recuperação, as células de cada linhagem foram plaqueadas em 20 ml de meio de cultura contendo LB (proporção 1: 1: 0,5: 1,2 de NaCl, triptona, extrato de levedura e ágar, respectivamente) e o antibiótico canamicina (50mg/ml), na proporção 1: 1000 em relação ao LB. O vetor, além de possuir o gene de interesse (tauA), continha uma sequência codificadora de uma proteína que dá resistência ao antibiótico. As células, então, foram postas em estufa 37ºC durante 18 horas para proliferação. Não se fez controles positivos nem negativos.

3.1.2 Expressão

Inicialmente, fez-se o pré-inóculo, onde as células de cada cultura foram submetidas à proliferação de meio de cultura líquido (sem ágar) durante 18 horas a 37°C e sob agitação de 200rpm. Após esse período, uma alíquota de cada cultura foi coletada e posteriormente adicionada a um volume maior de meio de cultura para produzir o inóculo. A proliferação ocorreu sob agitação de 200 rpm a 37°C durante duas horas ou a 30°C durante três horas. Esse intervalo de tempo indica, normalmente, que as células estão entrando na chamada “fase logarítmica” do crescimento. Quando as células atingiram esse ponto, realizou-se a indução da expressão com a aplicação de IPTG 0,1mM na proporção de 1: 100 com relação ao meio de cultura (a figura 1 esquematiza o mecanismo pelo qual o IPTG promove a expressão dos genes alvos nas células portadoras do vetor pET28a). Para saber se as células atingiram a fase logarítmica, coletava-se uma alíquota de 1ml de cada amostra e a submetia a um espectrofotômetro com comprimento de onda de 600nm. A fase era atingida quando a absorbância da amostra era de 0,5. Como controle, utilizava-se 1ml de meio de cultura. A incubação do IPTG com as células dava-se sempre sob agitação de 200 rpm, variando o tempo de acordo com a temperatura: para a indução ocorrida sob 37°C , o intervalo de tempo era de 2 horas, enquanto que para aquelas de 18°C e 4°C, era de 18 e 48 horas, respectivamente. Após o período de indução, retirava-se 1ml de cada amostra e verificava-se sua absorbância, analisando quanto que as células proliferaram. Antes e depois da indução, ainda, coletava-se uma alíquota de 1ml da amostra com menor absorbância (conforme mostrado em “resultados”), objetivando verificar se houve ou não a indução/expressão da

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proteína. A alíquota coletada antes da indução foi denominada de T0 e aquela após, de T2.

3.1.3 Extração

Após o período de indução, as linhagens foram submetidas à centrifugação durante 20 minutos. O sobrenadante, então, foi desprezado e o centrifugado congelado a -20°C por igual intervalo de tempo. Em seguida, ressuspendeu-se o centrifugado, primeiramente, com o tampão A (10mM TRIS-HCl pH 7.4; 100mM NaCl; 1mM EDTA e 0,5 mM PMSF) e, posteriormente, com o B (tampão A + 2% TRITON X-100). Após a ressuspensão com o A, adicionou-se benzamidina 3mM, um inibidor de protease, e lisozima 100mg/ml (proporção de 1: 10000 em relação ao volume de indução), deixando-se incubar em gelo por cerca de 30min. Na sequência, realizou-se o procedimento da sonicação, onde as amostras foram submetidas a pulsos infra-sônicos para o rompimento das membranas externa e plasmática. Posteriormente a isso, as amostras foram novamente centrifugadas. No entanto, após essa etapa, o sobrenadante (agora denominado extrato 1 ou E1) não foi desprezado, mas sim congelado a -20°C. O centrifugado, então, foi ressuspendido com o tampão B, sendo, na sequência, submetido à sonicação. Após, efetuou-se outra centrifugação, onde o sobrenadante (denominado extrato 2 ou E2) e o centrifugado foram congelados (-20°C).

Após os procedimentos de expressão e extração, as amostras obtidas (T0, T2, E1, E2 e centrifugado) foram analisadas sob SDS-PAGE 12%.

FIGURA 10 Esquematização da expressão de genes alvo induzida por IPTG em células portadoras do vetor pET28a. No DNA genômico da célula hospedeira (painel superior), o gene codificador da RNA polimerase do bacteriófago T7 está sob o controle de um promotor lac, o qual encontra-se inibido pelo repressor lac. A adição de IPTG “desliga” a repressão do promotor, permitindo a transcrição da polimerase, a qual, quando formada, irá ligar-se ao promotor T7, localizado no DNA plasmidial (painel inferior), que controla a transcrição do gene alvo. O IPTG, ainda, promove o “desligamento” da repressão do promotor T7, efetuado, também, por um repressor lac. Adaptado de pET System Manual, 2003.

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3.1.4 Purificação

A TauA foi expressa em todas as condições com uma cauda de seis histidinas na região N-terminal para a sua posterior purificação em cromatografia de afinidade a metal imobilizado, realizada com os extratos solúveis em coluna de afinidade ao níquel (Ni2+) após incubação por uma hora a temperatura de 4°C. A eluição da proteína foi realizada com diferentes concentrações de imidazol: 10mM, 20mM, 50mM, 100mM, 200mM e 500mM. Após isso, as amostras (flow, eluições e resina) foram submetidas a SDS-PAGE.

3.1.5 Western blot

Membrana de PVDF, previamente tratada com metanol, foi posta sobre cinco papéis de filtro (9 x 6 cm), os quais foram, inicialmente, mergulhados em tampão de transferência (0,58g tricina; 1, TRIS; 0,074g SDS – adição de água miliQ até o volume de 160ml). Sobre o PVDF colocou-se o gel de acrilamida e sobre este mais cinco papéis de filtros. A amostra foi posta para “correr” durante uma hora a 75 V. Enquanto isso, preparou-se a solução bloqueadora (1g leite desnatado e 50ml TBS). Após a corrida, colocou-se a membrana na solução bloqueadora e deixou-se incubando “overnight” a 4°C sob leve agitação. No dia seguinte, após a incubação, descartou-se a solução bloqueadora e incubou-se a membrana com a solução contendo o anticorpo primário (0,1g leite desnatado; 8ml TBS; 2ml anticorpo primário), deixando-se incubar a temperatura ambiente sob leve agitação por duas horas. Terminado esse período, recuperou-se a solução e fez-se a lavagem da membrana, deixando-a em 10ml de TBS durante três sessões de 10min cada. Após a lavagem, adicionou-se a solução contendo o anticorpo secundário (0,1g leite desnatado; 10ml TBS e 2µl anticorpo secundário), deixando-se incubar por duas horas a temperatura ambiente e sob leve agitação. Terminada a incubação, lavou-se a membrana da mesma forma que anteriormente. Em seguida realizou-se a revelação, onde usou-se 10ml de TFA, 66µl de NBT e 33µl de BCIP (incubação até o aparecimento de bandas – ver resultados).

3.2 Análises de Bioinformática

3.2.1 Busca pelo regulador do operon tau de X. axonopodis e por proteínas com enovelamento similar para a construção de modelos

Uma vez que o regulon cys e os reguladores do operon tau de E. coli são bem conhecidos (van der PLOEG et al., 1999; van der PLOEG et al., 1996; MONROE et al., 1990), foi possível usar as sequências de aminoácidos das proteínas CysB de Klebsiella aerogenes e Cbl de E. coli para buscar, através do programa BLASTP (banco de dados “não-redundante”), sequências similares no genoma de X. axonopodis.

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3.2.2 Alinhamento

As sequências de aminoácidos das proteínas estudadas foram obtidas no formato FASTA e submetidas ao programa CLUSTALW para o alinhamento.

3.2.3 Construção do modelo

As estruturas de CysB (PDB 1AL3) e Cbl (PDB 2FYI) depositadas no banco de dados de proteínas (Protein Data Bank - www.rscb.org) contém informações somente de uma região das mesmas (TYRREL et al., 1997; STEC et al., 2006), a qual não inclui os 88 resíduos de aminoácidos iniciais que contem o motif HTH (Helix-Turn-Helix), responsável pela interação dos reguladores com o DNA (HENIKOFF, 1988). Entretanto, por modelagem molecular com a proteína ModE (PDB 1B9M), conseguiu-se propor a estrutura completa da proteína OxyR, outro membro da família LysR (ZAIM & KIERZEK, 2003). A figura 11 destaca a região N-terminal com o motif HTH e um modelo de sua interação, na forma dimérica, com o DNA. Assim, levando-se em consideração que a arquitetura desses reguladores transcricionais é bastante conservada, realizou-se a construção do regulador do operon tauABC de X. axonopodis a partir das estruturas tridimensionais de CysB, Cbl e ModE, utilizando, para tanto, o programa MODELLER.

FIGURA 11 Região N-terminal do modelo para o regulador OxyR (A) e sua interação com o DNA (B). O motif HTH (A), em azul, é constituído pelas hélices 2 e 3. A hélice 4 exerce papel fundamental na formação do dímero, como mostrado em (B). Adaptado de ZAIM & KIERZEK, 2003.

(A) (B)

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Procedimentos de Bancada

Após a transformação das células, ou seja, de sua infecção pelo vetor pET28a, que contem a sequência codificadora da TauA, as células das quatro linhagens foram plaqueadas em 20ml de meio de cultura contendo LB e canamicina. A proliferação ocorreu em estufa 37°C durante 18 horas. Terminado esse período, verificou-se que apenas três das linhagens proliferaram. As placas contendo células ΔSlyD não indicaram que houve crescimento.

O resultado da transformação indicou que apenas as células de BL21 (DE3), BL21 (AI) e ARTIC proliferaram, de modo que o procedimento de expressão ocorreu com essas linhagens. Nessa etapa, coletou-se duas colônias de cada linhagem, as quais foram denominadas AR-1 e AR-2 (ARTIC), AI-1 e AI-2 [BL21 (AI)] e DE3-1 e DE3-2 [BL21 (DE3)]. Todas as amostras foram submetidas às mesmas condições de indução: 200rpm de agitação a 37°C durante 8 horas. Como descrito em “materiais e métodos”, antes e depois da adição de IPTG coletou-se uma alíquota de 1ml de cada amostra (T0 e T2, respectivamente), as quais foram submetidas a SDS-PAGE para verificar quais as linhagens que expressaram a TauA. Apenas as linhagens DE3 e ARTIC mostraram expressão da nossa proteína de interesse em T2, ou seja, após a indução (dados não mostrados).

Assim sendo, desenvolveu-se uma nova indução apenas com essas duas linhagens, aplicando esse procedimento para quatro amostras de ARTIC e oito de DE3. Nesse caso, submeteu-se as amostras a três condições de indução: as células ARTIC foram induzidas a 4°C durante dois dias, enquanto que quatro amostras de DE3 foram induzidas a 37°C durante 2 horas e as outras quatro a 18°C durante 18 horas. O inóculo das BL21 (DE3) ficou sob agitação a 37°C durante duas horas, enquanto aquele das ARTIC ficou a 30°C durante três horas. Antes da indução, analisou-se a absorbância de cada amostra (tabela 1) para verificar se as mesmas atingiram o início da fase logarítmica, caracterizada pelo valor de 0,5. Ainda, antes e depois da indução, coletou-se as alíquotas para T0 e T2 das amostras que apresentaram menor absorbância em cada condição. Após o período de indução para cada condição, efetuou-se o procedimento da extração, como descrito em “materiais e métodos”. Nesse caso, coletou-se as alíquotas E1, E2 e centrifugado. Ao final dessa etapa, submeteu-se as alíquotas de cada condição (T0, T2, E1, E2 e centrifugado) a SDS-PAGE. Conforme apresentado na figura 12, todas as condições mostraram-se favoráveis à expressão da TauA, embora aquela ocorrida a 18°C tenha sido um pouco mais eficaz que as outras.

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FIGURA 12 SDS-PAGE dos testes de expressão. A TauA (38 KDa), apresentou expressão em todas as condições testadas, embora aquela onde induziu-se as células de BL21 (DE3) a 18ºC tenha se mostrado um pouco mais eficaz para a solubilização da proteína (seta).

TABELA 1 Absorbâncias das amostras antes da adição de IPTG. ABSORBÂNCIA 1 e ABSORBÂNCIA 2 representam as absorbâncias mensuradas 70 e 100 minutos, respectivamente, após o inicio do inóculo para as células BL21 (DE3). Para as células ARTIC, ABSORBÂNCIA 1, ABSORBÂNCIA 2 e ABSORBÂNCIA 3 foram mensuradas 110, 130 e 150 minutos, respectivamente, após o início do inóculo. As amostras em negrito representam aquelas das quais coletou-se a alíquota de 1ml para T0.

Amostras ABSORBÂNCIA 1 ABSORBÂNCIA 2 ABSORBÂNCIA3

Meio - - -

DE3-1 37ºC 0, 145 0, 574 -

DE3-2 37ºC 0, 217 0, 646 -

DE3-3 37ºC 0, 196 0, 623 -

DE3-4 37ºC 0, 228 0, 614 -

DE3-1 18ºC 0, 247 0, 514 -

DE3-2 18ºC 0, 282 0, 576 -

DE3-3 18ºC 0, 234 0, 535 -

DE3-4 18ºC 0, 285 0, 580 -

AR-1 0, 310 0, 440 0, 540

AR-2 0, 318 0, 467 0, 579

AR-3 0, 288 0, 425 0, 532

AR-4 0, 304 0, 395 0, 507

45 kDa 35 kDa

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A partir desse resultado, utilizou-se quatro recipientes com 500ml cada para o procedimento de indução em larga escala, verificando-se, antes e depois da adição de IPTG, a absorbância das amostras (tabela 2). Em seguida, coletou-se T0 e T2 das amostras com menor absorbância e, posteriormente, realizou-se a extração da TauA. As alíquotas obtidas foram então submetidas a SDS-PAGE (figura 13A). Após a aplicação desse procedimento, onde viu-se que a proteína encontrava-se solúvel, efetuou-se sua purificação, conforme descrito em “materiais e métodos”. Ao final, submeteu-se as alíquotas obtidas a SDS-PAGE, onde, de acordo com a figura 13B, verificou-se que a proteína, possivelmente, sofreu degradação, como indicado pela presença de bandas espessas abaixo do local normalmente ocupado pela TauA. Além disso, esta, mesmo sob eluição seriada com concentrações crescentes de imidazol, permaneceu presa à resina.

FIGURA 13 Expressão e purificação da TauA induzida a 18ºC. (A) Extração indicou que houve pouca expressão da proteína na forma solúvel (retângulo vermelho). (B) A proteína não foi purificada, uma vez que, aparentemente, houve degradação, haja vista a presença de duas bandas localizadas abaixo da posição na qual se esperaria encontrá-la (retângulo vermelho). A seta indica que a proteína ficou presa à resina.

Como o resultado da purificação não foi satisfatório, realizou-se outro procedimento de indução, utilizando, neste caso, 1l de meio de cultura para o crescimento das células, o qual foi dividido em dois recipientes com 500ml cada. Essa etapa ocorreu sob as mesmas condições de agitação, temperatura e tempo descritas anteriormente. Os valores das absorbâncias das amostras antes e depois da indução estão indicados na tabela 3. As alíquotas de T0 e T2 foram coletadas a partir das amostras com menores valores. Posteriormente a isso, efetuou-se a extração da proteína, obtendo-se, assim , as alíquotas de E1, E2 e centrifugado. As alíquotas, então, foram submetidas a SDS-PAGE. Como demonstrado na figura 14B, a proteína, aparentemente, não havia solubilizado, uma vez que sua expressão ficou mais evidente em T2. Para verificar se realmente não houve solubilização, submeteu-se o SDS-PAGE da extração a um western blot, conforme descrito em “materiais e métodos”. Como visto na figura 14A, esse procedimento demonstrou que a proteína foi expressa apenas em T2.

(A) (B)

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TABELA 3 Absorbâncias das amostras antes (T0) e depois (T2) da adição de IPTG. Absorbância 1 e absorbância 2 indicam que os valores foram obtidos 70 e 100 minutos, respectivamente, após o início do inóculo. Os valores em negrito indicam as amostras das quais se retirou as alíquotas de 1ml para T0 e T2.

Devido à obtenção do resultado negativo mostrado acima, resolveu-se fazer uma nova indução, mas agora sob duas das condições testadas inicialmente: a 37°C (2 horas) e 18°C (18 horas). Os valores das absorbâncias antes e depois da adição do indutor, bem como as amostras que serviram para a coleta de T0 e T2, estão indicados na tabela 4. Terminado o período de indução

T0 T2

Amostras ABSORBÂNCIA 1 ABSORBÂNCIA 2 ABSORBÂNCIA

Meio - - -

Recipiente 1 0, 132 0, 591 1, 804

Recipiente 2 0, 110 0, 570 1, 812

FIGURA 14 Western Blot (A) e SDS-PAGE (B). A TauA estava sendo expressa, embora apresentasse um comportamento instável. Nesse caso, por exemplo, os dois procedimentos (A e B) indicaram que a proteína expressou apenas em T2 (setas), ao passo que em testes anteriores a mesma apresentou-se um pouco solúvel. (C) SDS-PAGE que foi incubado com a membrana, mostrando que todo o seu conteúdo foi transferido.

(A) (B)

(C)

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para ambas as condições, realizou-se o procedimento da extração, onde obteve-se E1, E2 e centrifugados, os quais, juntamente com T0 e T2 foram submetidos SDS-PAGE. Além disso, nessa etapa da extração, adicionou-se 3ml do “determil”, um detergente produzido pela EMBRAPA, ao E1 (37°C), objetivando verificar se o mesmo facilitaria a solubilização da proteína. Como demonstrado na figura 15, a TauA foi expressa em T0 e T2 para ambas as condições. E1 (sem “determil”) e E2 da indução a 37°C mostraram pouca expressão, ao passo que o E1 contendo determil apresentou melhor resultado. E1 e E2 da indução a 18°C, nesse caso, também não mostraram resultados satisfatórios, estando em desacordo com resultados apresentados anteriormente. Os centrifugados apresentaram muita expressão, indicando, mais uma vez, que houve pouca solubilização da TauA. TABELA 4 Absorbâncias das amostras antes (T0) e depois (T2) da adição de IPTG. Absorbância 1 e absorbância 2 indicam que os valores foram obtidos 70 e 100 minutos, respectivamente, após o início do inóculo. Os valores em negrito indicam as amostras das quais se retirou as alíquotas de 1ml para T0 e T2.

T0 T2

Amostras ABSORBÂNCIA 1 ABSORBÂNCIA 2 ABSORBÂNCIA

Meio - - -

DE3-1 37ºC 0, 092 0, 508 1, 590

DE3-2 37ºC 0, 120 0, 520 1, 516

DE3-1 18ºC 0, 128 0, 505 1, 772

DE3-2 18ºC 0, 196 0, 548 1, 797

37ºC 18º

C

FIGURA 15 SDS-PAGE das expressões a 37ºC e 18ºC com extração contendo determil. Como destacado pelo retângulo vermelho, a extração realizada com tampão A e determil permitiu uma melhor solubilização da TauA induzida a 37°C. Em contrapartida, a indução a 18°C, que anteriormente tinha sido mais eficaz, não mostrou resultado satisfatório.

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Após a aplicação do SDS-PAGE, realizou-se a purificação das amostras, onde todos os extratos foram reunidos para serem aplicados à coluna cromatográfica. Posteriormente à eluição seriada, submeteu-se as alíquotas obtidas a SDS-PAGE, onde, conforme demonstrado na figura 16, verificou-se que não houve purificação, uma vez que a TauA ficou retida na resina e que nenhuma banda surgiu nos poços onde colocou-se as alíquotas advindas das eluições.

FIGURA 16 SDS-PAGE da purificação realizada após extração com determil. Apesar da extração com determil ter dado um resultado relativamente satisfatório, a purificação da TauA não ocorreu, ficando evidente, nesse caso, pela presença de proteína na resina (retângulo vermelho) e pela ausência de bandas nas eluições com imidazol.

Novamente, tentando solucionar o problema da solubilização e da purificação, realizou-se outra indução, onde, desta vez, se utilizou uma quantidade menor de meio de cultura (200ml dividido em quatro recipientes). O pré-inóculo cresceu durante 18 horas a 37°C sob agitação de 200rpm. O inóculo, por sua vez, proliferou sob as mesmas condições de agitação e temperatura, mas durante duas horas. 80 minutos após seu início, mediu-se a absorbância das amostras, obtendo os valores mostrados na tabela 5. 60 minutos após a obtenção desse primeiro conjunto de valores realizou-se a segunda medição de absorbância, onde verificou-se que três, das quatro amostras, tinham passado da fase logarítmica. Assim, retirou-se a alíquota de T0 da amostra com menor absorbância (recipiente três) e, então, aplicou-se o indutor às amostras, as quais ficaram incubadas a 18°C durante 18 horas e sob agitação de 200rpm. Após o período de indução, verificou-se a absorbância das amostras e retirou-se a alíquota de T2 do recipiente dois.

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TABELA 5 Absorbâncias das amostras antes (T0) e depois (T2) da adição de IPTG. Absorbância 1 e absorbância 2 indicam que os valores foram obtidos 70 e 100 minutos, respectivamente, após o início do inóculo. Os valores em negrito indicam as amostras das quais se retirou as alíquotas de 1ml para T0 e T2.

Seguindo-se a indução, efetuou-se a extração da proteína, onde à ressuspensão com tampão B foram adicionados 3ml de “determil”, obtendo-se as alíquotas E1, E2 e centrifugado. Na sequência, realizou-se o procedimento da purificação. Nesse caso, antes da aplicação da eluição seriada, os extratos foram unidos um com o outro e incubados sob baixa agitação com 400µl de resina por uma hora. As alíquotas obtidas foram, então, submetidas a SDS-PAGE. Como mostrado na figura 17, novamente não houve purificação, uma vez que a proteína não apareceu nas eluições, embora, pelos menos aparentemente, ela não tenha ficado presa à resina.

FIGURA 17 Expressão e purificação da TauA utilizando tampão B com determil para extração. Como visto no SDS-PAGE da expressão (esquerda), não houve aparecimento de bandas para T0, possivelmente por haver pouco “pellet” após sua centrifugação. Entretanto, esse procedimento, aparentemente melhorou a solubilização em relação aos outros testes, como pode ser visto em E1 e E2 (retângulo vermelho), embora, ainda, não se tenha conseguido purificar (direita). Apesar disso, a proteína não ficou na resina, indicando que essa metodologia possa ser aperfeiçoada futuramente.

T0 T2

Amostras ABSORBÂNCIA 1 ABSORBÂNCIA 2 ABSORBÂNCIA

Meio - - -

Recipiente 1 0, 165 0, 675 2, 245

Recipiente 2 0, 162 0, 625 2, 022

Recipiente 3 0, 106 0, 564 2, 332

Recipiente 4 0, 161 0, 670 2, 227

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4.2 Análises de Bioinformática

Devido à falta de resultados satisfatórios com os procedimentos de extração e purificação da TauA, desenvolveu-se um trabalho de bioinformática, onde objetivamos construir um modelo para o regulador do operon tauABC de X. axonopodis (figura 18). Seu funcinamento, bem como sua regulação, é bem caracterizada em E. coli (VAN DER PLOEG, 1996; VAN DER PLOEG, 1997), embora pouco se saiba a seu respeito com relação a Xanthomonas.

FIGURA 18 Operon tauABC de X. axonopodis. Esse cluster gênico é composto por sete genes que codificam os componentes do sistema de captação da taurina: transportador ABC (proteína periplasmática, permease e proteína de ligação ao ATP) e proteínas acessórias (redutase, monooxigenases e regulador). Disponível em www.genome.jp/kegg.

Inicialmente, fez-se o BLASTP das sequências de resíduos de aminoácidos de dois reguladores com estrutura já determinada (CysB de K. aerogenes e Cbl de E. coli) contra o genoma de Xanthomonas, onde, em cada caso, escolheu-se analisar apenas os resultados de maior similaridade: para Cbl vs. Xac escolheu-se os dois primeiros e para CysB vs Xac, os três primeiros. A figura 19 mostra o resultado de cada BLAST e as melhores opções estão indicadas na tabela 6.

CysB vs Xac Cbl vs Xac

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FIGURA 19 Resultado do BLASTP. Ao se comparar as sequências de aminoácidos de CysB e Cbl com o genoma de X. axonopodis, viu-se que nesse organismo as proteínas mais similares com Cbl estavam identificadas pelos códigos 643646.1 e 640611.1 (direita – duas primeiras linhas rosas). Para CysB, além destas, o programa mostrou que aquela identificada como 641257.1 apresentava similaridade (esquerda – três primeiras linhas rosas).

TABELA 6 Resultados obtidos a partir do BLASTP das sequências de aminoácidos de CysB e Cbl contra o genoma de X. axonopodis. As proteínas de Xanthomonas que, segundo o programa, apresentaram maior similaridade com CysB e Cbl estão identificadas com seus respectivos códigos na segunda coluna. Como visto, a proteína de código 643646.1 apresentou maior similaridade para os dois reguladores (setas). Como sua função predita é de que atue como CysB, o resultado nos levou a propor que X. axonopodis possui apenas essa molécula como regulador do operon tauABCD.

Nos dois casos, tanto para CysB como para Cbl, o melhor resultado foi para a proteína cuja função predita é a de que atue como CysB (tabela 6) , apresentando 34,4 e 22,2% de identidade de sequências, respectivamente. Essa proteína, de acordo com a plataforma KEGG, é codificada pelo gene Xac3339, cuja localização está mostrada na figura 20. Sendo assim, os resultados sugerem que Xac, diferentemente de E. coli, pode apresentar apenas um dos reguladores do sistema.

X. axonopodis

(identificação)

Número de resíduos de Aa

Função predita Identidade

(%)

Cobertura (%)

Xac_643646.1 333 Transcriptional regulator CysB-like protein 22,2 95

Xac_640611.1 334 Transcriptional regulator 18,3 87

Xac_643646.1 340 Transcriptional regulator CysB-like protein 34,4 91

Xac_640611.1 345 Transcriptional regulator 23,8 90

Xac_641257.1 344 Oxidative stress transcriptional regulator 24,4 89

Cbl

CysB

33

FIGURA 20 Posição do gene Xac3339 no genoma de X. axonopodis pv. citri. Sua localização corrobora com o resultado do BLAST, uma vez que sendo o primeiro gene do operon do qual faz parte, sua regulação pode ser efetuada pela própria CysB (OSTROWSKI & KREDICH, 1991). O gene Xac3338 é hipotético. Os genes Xac3340 e Xac3341 codificam, respectivamente, as proteínas CysG e CysK, onde a primeira é uma enzima relacionada à redução do sulfito (SPENCER et al., 1993) e a segunda é a cisteína sintase. Disponível em www.genome.jp/kegg.

A partir das sequências de aminoácidos de Xac3339, CysB e Cbl, bem como o da ModE (PDB: 1B9M), efetuou-se o alinhamento através do programa CLUSTALW, obtendo-se o resultado apresentado na figura 21. Como descrito em “materiais e métodos”, ModE foi utilizada para a criação do N-terminal. É interessante notar como as sequências de Xac3339, Cbl e CysB apresentam regiões de grande conservação.

Concluído esta etapa, realizou-se a construção do modelo, onde o arquivo do alinhamento foi “rodado” no programa MODELLER. Após sua execução, foi gerado 5 resultados que representavam as possíveis estruturas da Xac 3339. Aquela que apresentou menor energia (tabela 7) foi escolhida como sendo a mais adequada.

De posse desse resultado, realizou-se a sobreposição das estruturas, objetivando-se analisá-las e compará-las. Essa sobreposição foi realizada através do programa COOT.

TABELA 7 Energia dada pelo programa MODELLER na criação de cada modelo. Como indicado (seta), modelo III apresentou menor energia e, assim, foi escolhido para a próxima etapa do procedimento.

4.2.1 O modelo da Xac3339 se ajusta ao enovelamento característico de reguladores transcricionais do tipo LysR

A estrutura da Xac3339 modelada apresentou um bom ajuste quando comparada com as estruturas usadas como molde, sugerindo que a proteína pode mesmo apresentar o enovelamento característico de reguladores.

MODELOS ENERGIA

Xac_643646.1_I 7668

Xac_643646.1_II 7527

Xac_643646.1_III 7417

Xac_643646.1_IV 7715

Xac_643646.1_V 7726

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Outra característica estrutural encontrada na Xac3339 e que se mantem conservada nas outras duas estruturas diz respeito ao enovelamento Roosmann (figura 21), característico de proteínas que interagem com o DNA. Nesse tipo de estrutura secundária, cinco beta-folhas posicionam-se paralelo e adjacentemente umas em relação às outras, sendo intercaladas por quatro alfa-hélices. Nesse caso, as beta-folhas que participam do enovelamento são, a partir do N-terminal, A, B, C, D e J. As quatro primeiras estão presentes no primeiro domínio alfa/beta, enquanto a última encontra-se no segundo domínio e antiparalelamente às outras. As alfa-hélices que intercalam-se às beta-folhas são I, II, III e VII, estando as três primeiras no primeiro domínio e a quarta no segundo (TYRREL et al., 1997).

4.2.2 O N-terminal da Xac3339 é fortemente positivo O N-terminal da Xac3339, que apresenta-se desenovelado, é bastante

positivo, como mostrado pelo potencial eletrostático na figura 22. Essa relevante positividade está de acordo com sua função, uma vez que é nessa região que o motivo HTH está localizado, o qual é o responsável pela interação com o DNA (ver figura 11)

(A) (B)

(A) (B)

FIGURA 21 Enovelamento de Roosmann. (A) Estruturas sobrepostas da Xac3339, CysB e Cbl, destacando a região que corresponde ao enovelamento de Roosmann em cada proteína. Os reguladores estão coloridos, respectivamente, em verde, cian e vermelho. (B) Alinhamento das três proteínas, sendo destacados os resíduos que correspondem ao enovelamento de cada uma delas.

N-terminal

N-terminal

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4.2.3 Xac3339 apresenta conservação de resíduos de aminoácidos que interagem com o sulfato

A estrutura de CysB apresenta uma molécula de sulfato coordenada em seu sítio de ligação (TYRREL et al., 1997). Como os autores afirmam, a presença dessa molécula no sítio seria decorrente do processo de purificação. Entretanto, devido à semelhança estrutural entre o sulfato e o tiossulfato, um inibidor da atividade desse regulador, pode-se pensar que este ligue-se nessa região. A coordenação envolve doze interações polares, sendo sete provenientes de resíduos de aminoácidos (figura 23) e outras cinco prevenientes de uma rede formada por cinco moléculas de água (não mostrado). As interações realizadas pelos resíduos em CysB são: T100/OG1...SO4/O2; T100/OG1...O3/SO4; T102/OG1...SO4/O3; Q103/NE2...SO4/O2; T149/OG1...SO4/O4; T149/N...SO4/O1 e T202/OG1...SO4/O3. Estes dados foram importantes para que pudéssemos identificar no modelo da estrutura da Xac3339, a presença destes resíduos. Na Xac3339, ao contrário da CysB, a posição 149 é ocupada por uma serina e a T202 não participa da interação com o sulfato (figura 23).

Interessantemente, há uma grande conservação nas três estruturas, conforme observado pelo RMSD (figura 23A), e na sequência dos resíduos envolvidos na interação (figuras 23B e C).

N-terminal

Domínio de ligação ao DNA

(DBD)

N-terminal

N-terminal

(A)

(B)

(C)

T100/T100/T100

T149/S149/S149 T202/T202/T202

T102/T102/T102

Q103/Q103/Q103

SO4

Xac3339 RMSD

1AL3_CysB 1, 22

2FYI_Cbl 1, 90

FIGURA 22 Densidade eletrostática da Xac 3339. (A) Visão da abertura do sítio, onde encontra-se o sulfato (seta). Nota-se a relativa positividade do N-terminal, corroborando a ideia de que esta é a região de interação com o DNA. (B) Visão da base do sítio.

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FIGURA 22 Modelo construído da Xac3339. (A) Resíduos de aminoácidos conservados nas três estruturas e que participam da interação com o sulfato. (B) Sobreposição das três estruturas, destacando as regiões N-terminais de cada uma e, na Xac3339, a região desenovelada que contem o motif HTH, responsável pela ligação ao DNA. (C) Detalhe do sítio de ligação, onde destaca-se os resíduos e suas interação com o sulfato. Nota-se que a T202 da Xac3339 não participa dessa rede.

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5. CONCLUSÕES

- A partir dos testes de expressão foi possível identificar uma condição onde ocorre maior expressão da proteína na sua forma solúvel; - Apesar de solúve,l a TauA apresentou-se bastante instável, e diferentes tampões de purificação devem ser testados; - Foi identificado o gene Xac3339 como o possível regulador transcricional do tipo LysR, confirmado pelo modelo da estrutura tri-dimencional, que apresenta motivos característicos de reguladores.

6. PERSPECTIVAS

- Os resultados serão importantes para a etapa seguinte de caracterização deste operon, que é a produção da proteína ligadora em larga escala e a clonagem e expressão do regulador para estudos funcionais e estruturais.

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