Ana Carolina Bazan de Carvalho

Expressão da resistência à múltiplas drogas em células-tronco

mesenquimais do cordão umbilical humano

Dissertação apresentada à Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo

para obtenção do título de Mestre

em Ciências

Programa de Ciências Médicas

Área de Concentração: Distúrbios do Crescimento Celular, Hemodinâmicos e da Hemostasia

Orientador: Prof. Dr. Sergio Paulo Bydlowski

SãoPaulo

2013

Ana Carolina Bazan de Carvalho

Expressão da resistência à múltiplas drogas em células-tronco

mesenquimais do cordão umbilical humano

Dissertação apresentada à Faculdade de

Medicinda da Universidade de São Paulo

para obtenção do título de Mestre

em Ciências

Programa de Ciências Médicas

Área de Concentração: Distúrbios do Crescimento Celular, Hemodinâmicos e da Hemostasia

Orientador: Dr. Sergio Paulo Bydlowski

SãoPaulo

2013

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Carvalho, Ana Carolina Bazan de

Expressão da resistência à múltiplas drogas em células-tronco mesenquimais do

cordão umbilical humano / Ana Carolina Bazan de Carvalho. - São Paulo, 2013.

Dissertação (mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Ciências Médicas. Área de concentração: Distúrbios do Crescimento

Celular, Hemodinâmicos e da Hemostasia.

Orientador: Sergio Paulo Bydlowski.

Descritores: 1.Células-tronco multipotentes 2.Cordão umbilical 3.Geleia de

Wharton 4.Genes MDR 5.Células-tronco adultas

USP/FM/DBD-282/13

DEDICATÓRIA

À minha querida família,

na figura de meus pais Alda Reni e Evandro,

de meu irmão Evandro Júnior e

minha filha Amelie

AGRADECIMENTOS

À Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para

superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas incertas e me suprir em

todas as minhas necessidades.

Ao Prof. Dr. Sérgio Paulo pela oportunidade concedida e orientação da

realização deste trabalho.

À minha família, pelo carinho, paciência e incentivo.

À futura Dra. Rita de Cássia Cavaglieri, por sua ajuda e colaboração. Por

acreditar no futuro deste projeto e contribuir para o meu crescimento

profissional. Você é um exemplo a ser seguido.

À minha grande amiga Denise Chaves pela amizade, consideração e pelos

momentos revigorantes de sua companhia.

Aos meus amigos de laboratório André Luiz, Carolina Romão, Natália, Paula,

Carolina Macedo, Cleide Apolônio e Andréa Celestino que sempre estiveram do

meu lado dando força e apoio.

À Dra Adriana de Aguiar Debes, por todos os conhecimentos, lições

concedidas, e, sobretudo, pela amizade concedida durante estes anos.

À minha grande amiga e companheira de quarto Brigitte Bazan, por estar ao

meu lado nos momentos tristes e felizes, por bagunçar e rasgar os meus

artigos e anotações, e, acima de tudo, pelo carinho nas horas ininterruptas

deste trabalho.

Agradeço Jorge e Debora por me ajudar nos experimentos executados.

Aos pacientes, cuja contribuição viabilizou a execução deste trabalho.

EPÍGRAFE

Sempre que houver alternativas, tenha cuidado. Não opte pelo conveniente, pelo confortável, pelo respeitável, pelo socialmente aceitável, pelo honroso. Opte pelo que faz o seu coração vibrar. Opte pelo que gostaria de fazer, apesar de todas as consequências.

Osho

SUMÁRIO

Lista de Abreviaturas e símbolos Lista de Figuras Lista de Tabelas Resumo Summary

1. INTRODUÇÃO................................................................................... 1

1.1. Células-tronco........................................................................ 1

1.1.1 Células-tronco Embrionárias ................................................... 4

1.1.2 Células-tronco Adultas............................................................. 6

1.1.3. Células-tronco Hematopoiéticas ............................................. 8

1.1.4. Células-tronco mesenquimais ................................................. 9

1.2. Fontes de células-tronco..................................................... 11

1.3 Propriedades imunomodulatórias ....................................... 12

1.3. Envelhecimento das CTM ..................................................... 13

1.4. Aplicação da CTM ................................................................. 13

1.5. Cordão Umbilical Humano (CUh) como fonte de CTM...... 16

1.6. Resistência às Múltiplas Drogas – MDR ............................. 19

1.6.1. P-glicoproteína (P-gp) …………………………………………… 21

1.6.2. LRP - Lung resistance-related protein ………………………... 25

2. OBJETIVOS ...................................................................................... 28

3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................... 29

3.1. Casuística .............................................................................. 29

3.2. Detalhamento da Coleta...................................................... 29

3.3. Processamento da amostra e Isolamento da CTM............ 30

3.4. Curva de crescimento ........................................................ 33

3.5. Ensaios de Plasticidade celular......................................... 33

3.5.1. Diferenciação Osteogênica.................................................... 34

3.5.2. Diferenciação Adipogênica..................................................... 34

3.6. Ensaio de viabilidade celular.............................................. 35

3.7. Caracterização das CTM por citometria de fluxo.............. 36

3.8. Biologia Molecular para a caracterização das CTM ......... 39

3.8.1. Extração de RNA..................................................................... 39

3.8.2. Expressão dos genes de indiferenciação por RT-PCR ........... 40

3.8.3. Condições das reações de RT-PCR ....................................... 40

3.8.4. RT-PCR em tempo real ........................................................... 41

3.9. Análises Estatísticas ............................................................ 42

4. RESULTADOS .................................................................................. 43

4.1. Cultivo e Processamento ..................................................... 43

4.2. Curva de crescimento celular .............................................. 44

4.3. Ensaios de Diferenciação ..................................................... 45

4.3.1. Diferenciação Osteogênica ..................................................... 45

4.3.2. Diferenciação Adipogênica ...................................................... 46

4.4. Ensaio de viabilidade celular ............................................... 47

4.5. Imunofenotipagem................................................................. 49

4.6. Expressão dos genes de indiferenciação celular ............. 51

4.6.1. RT-PCR ................................................................................... 51

4.6.2. RT-PCR em tempo real ........................................................... 53

5. DISCUSSÃO....................................................................................... 55

6. CONCLUSÃO..................................................................................... 63

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................. 64

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ATP Adenosine Triphosphate

α-MEM alpha- Modified Eagle Medium

ABC ATP-Binding Cassette

ATV Associate Tripsine Versene

CT Célula-Tronco

CTA Célula-Tronco Adulta

CTE Célula-Tronco Embrionária

CTM Célula-Tronco Mesenquimal

CTH Célula-Tronco Hematopoiética

CFU-F Unidades Formadoras de Colônias de Fibroblastos

CUh Cordão Umbilical Humano

DOX Doxorrubicina

DNA Deoxyribonucleic Acid

DMEMHG Meio de Eagle modificado por Dulbecco Alta Glicose

DNTP Desoxiribonucleotídeo

DPEC Dietilpirocarbonato

DT Doubling Time

DMEMF12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12

DMSO Dimetilsulfóxido

FITC Fluorescein Isothiocyanate

GUSB Glucuronidase Beta

GW Geleia de Wharton

HLA-DR Human leucocyte associated (Antígeno leucocitário humano)

IC50 Inhibitory Concentration

LRP Lung Resistance Protein

MCI Massa Celular Interna

MDR Multidrug Resistance

MES-DX MEX-SA/DX5 (Linhagem comercial de sarcoma uterino resistente à doxorubicina)

MHC Major Complexo of Histocompatibility (Complexo Principal de Histocompatibilidade)

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

Oct-4 Octamer-binding Transcription Factor 4

PE Phycorythrin

P-Gp P-glicoproteína

PBS Phosphate Buffer Saline

RNA Ribonucleic Acid

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

SFB Soro Fetal Bovino

VCR Vincristina

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema ilustrativo da classificação das células-tronco

Figura 2 - Esquema ilustrativo de CTE extraídas do ICM

Figura 3 - Esquema ilustrativo da estrutura da P-glicoproteína, demonstrando a disposição dos domínios transmembrana no ambiente extracelular e intracelular, sendo estes ligados ao nucleotídeo ATP

Figura 4 - Drogas relacionadas ao mecanismo de resistência da P-gp

Figura 5 - Esquema ilustrativo da estrutura tridimensional dos vaults

Figura 6 - Técnica de isolamento de CTM de CUH por explante. Acondicionamento do cordão (A.1), fragmentação do cordão (A.2 e A.3), arranjo em placa de cultura dos fragmentos (A.4). Em B são apresentas células na passagem 0 e na décima passagem mostrando a diferença na confluência

Figura 7 - Visualização por microscopia ótica (aumento 40x) de CTM do CUh indiferenciadas. A) CTM em começo de expansão. B) CTM em confluência

Figura 8 - Regressão exponencial de quatro amostras de CTM do CUH, realizada no período de 24, 48, 72 e 96 horas

Figura 9 - Diferenciação celular das CTM derivadas de cordão umbilical em linhagem osteogênica

Figura 10 - Diferenciação celular das CTM derivadas de cordão umbilical em linhagem audiogênica

Figura 11 - Curva de viabilidade celular das células MES-DX (controle positivo), e CTM do CUh submetidas a diferentes concentrações de doxorrubicina

Figura 12 - Concentração de doxorrubicina (nM) necessária para inviabilizar 50% da população celular de linhagens de controle de resistência (MEX-DX, n=1) e CTM do CUh (n=4) submetidas a diferentes concentrações de doxorrubicina

Figura 13 – Resultados demonstrados em porcentagem de células positivas dos 11 marcadores avaliados (n=16)

Figura 14 – Resultado demonstrativo em histograma da imunofenotipagem das CTM derivadas do cordão umbilical humano

Figura 15 - Amplificação das amostras de CTM do CUh do gene endógeno Gusb (n=20). Células N-TERA foram utilizadas como controle positivo da reação

Figura 16 - Amplificação das amostras de CTM do CUh do gene Nanog (n=20). Células N-TERA foram utilizadas como controle positivo da reação

Figura 17 - Curva padrão utilizada para a padronização da reação. A) gene MDR1; B) gene LRP; C) gene GUSB. Quanto maior o coeficiente de correlação menos variável é a expressão gênica

Figura 18 - Expressão relativa das amostras de CTM de CUh para os genes MDR-1 e LRP

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Anticorpos monoclonais utilizados na caracterização das células-tronco por citometria de fluxo

Tabela 2 - Relação das sequências utilizadas

Tabela 3 - Relação das sequências utilizadas para a expressão de MDR1 e LRP

Tabela 4 - Expressão relativa das amostras de CTM de CUh para os genes MDR-1 e LRP

RESUMO

Carvalho, ACB. Expressão da Resistência à Múltiplas Drogas em Células-Tronco Mesenquimais de Cordão Umilical Humano [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2013.

INTRODUÇÃO: As células-tronco mesenquimais (CTM) são células adultas multipotentes capazes de se diferenciarem em várias linhagens celulares. Estudos com CTM derivadas do cordão umbilical humano (CUh), mais especificamente da Geleia de Wharton (GW), tem demonstrado um grande potencial para a terapia de reposição celular e regeneração tecidual. O papel dos genes de resistência a múltiplas (MDR) drogas, tais como ABCB1 e LRP é bem conhecido nos processos de regulação, fisiologia e defesa. Entretanto, nenhum estudo demonstrou ainda a presença desses genes nas CTM da GW do CUh. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar a expressão de Pg-p e LRP em CTM derivadas da GW. MATERIAIS E MÉTODOS: CTMs da GW isoladas de CUh (n = 20) foram caracterizadas quanto ao seu estado indiferenciado por: citometria de fluxo; expressão de genes Oct-4 e Nanog por RT-PCR e capacidade de diferenciação adipogênica e osteogênica in vitro. Foi analisado ainda a expressão dos genes ABCB1 e LRP por RT-PCR em tempo real de células indiferenciadas. A resistência a doxorrubicina (DOX) foi determinada através do ensaio de MTT nessas mesmas amostras. RESULTADOS: As CTM da GW do CUh apresentaram positividade para marcadores de superfície presentes nas CTM, tais como, CD29, CD44, CD90 e CD105. Os genes de indiferenciação celular Oct-4 e Nanog foram expressos em todas as amostras, que também foram capazes de se diferenciar em adipócitos e osteócitos, comprovando assim que essas células são CTM. Com relação à Pg-p, o gene ABCB1 não amplificou em 18 amostras sendo que somente 2 apresentaram baixa expressão gênica. O gene LRP amplificou de forma intensa em todas as amostras analisadas. CONCLUSÃO: Concluímos que as CTM derivadas da GW do CUh apresentam um elevado nível de expressão de LRP, sugerindo que este gene pode estar envolvido no processo de regulação das células-tronco mesenquimais, bem como na fisiologia e defesa celular.

Descritores: Células-tronco multipotentes, cordão umbilical, geleia de Wharton, genes MDR, células-tronco adultas.

SUMMARY

Carvalho, ACB. Multidrug Resistance Expression in Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord [Dissertation]. Sao Paulo: Faculty of Medicine, University of SãoPaulo, in 2013.

INTRODUCTION: Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent adult cells that can differentiate into various cell lineages. Studies with MSC derived from human umbilical cord (hUC), more specifically from Wharton jelly (WJ), have shown great potential for cellular replacement therapy and tissue regeneration. The role of multidrug resistance genes, such as ABCB1 and LRP is well known in the regulation, physiology and cellular defense. However, the presence of these genes in the MSC of the WJ from hUC was not demonstrated yet. The aim of this study was to analyze the expression of Pg-p and LRP in MSCs derived from WJ. MATERIALS AND METHODS: The MSC from WJ were isolated from hUC (n = 20) and were characterized by: flow cytometry; Oct-4 and Nanog gene expression by RT-PCR and adipogenic and osteogenic in vitro differentiation capability of these cells. It was also analyzed gene expression of ABCB1 and LRP by real time RT-PCR of undifferentiated cells. Doxorubicin (DOX) resistance was determined by MTT assay in all the samples. RESULTS: MSC WJ from hUC was positive for MSC surface markers, such as CD29, CD44, CD90 and CD105. The undifferentiated cell genes Oct-4 and Nanog were expressed in all samples, which were also capable to differentiate into adipocytes and osteocytes, proving that these cells are MSC. Concerning to Pg-p, the ABCB1 gene, 18 samples didn’t show any amplification product (no expression) while 2 showed little gene expression. The LRP gene amplified intensely in all samples. CONCLUSION: We conclude that MSC derived from the WJ hUC have a high level of LRP expression, suggesting that this gene may be involved in the regulation of mesenchymal stem cells as well as in physiology and cellular defense.

Keywords: Multipotent stem cells, umbilical cord, Wharton jelly, genes, MDR adult stem cells.

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Células-tronco (CT)

Conceitualmente, as CT apresentam três características fundamentais:

1) autorreplicação ilimitada, ou seja, capacidade de multiplicar-se gerando

cópias idênticas à célula original; 2) capacidade de se diferenciar em diferentes

linhagens celulares; 3) capacidade de reconstituir funcionalmente, in vivo, um

tecido lesado (Pittenger et al, 1999; Verfaillie et al., 2002; Okamoto & Campos,

2004; Pasqualotto, et al., 2007).

Em indivíduo adulto, os tecidos possuem CT que permitem a renovação

e reparação, total ou parcial desses tecidos. Exemplos da capacidade de se

renovar constantemente são a epiderme e o sangue, sendo que o tecido

hepático pode ser renovado por completo. Enquanto que outros tecidos, como

por exemplo, o tecido muscular apresenta um potencial de reparo bastante

reduzido. (Pasqualotto et al., 2007).

De acordo com sua capacidade de diferenciação, leva-se em

consideração toda a sua hierarquia quanto à plasticidade que apresentam

durante o desenvolvimento natural de um organismo. Sendo geralmente

classificadas em totipotente, pluripotente, multipotente ou unipotente

(Takahashi & Yamanaka, 2006; Lanza et al., 2009) (Figura 1).

2

Figura 1 - Esquema ilustrativo da classificação das células-tronco.

As células totipotentes são consideradas as células mestras do corpo,

pois originam todos os tecidos de um organismo, inclusive a placenta e os

anexos embrionários (Lanza et al., 2009). Células pluripotentes são células

capazes de originar os três folhetos embrionários, sendo estes, ectoderma,

mesoderma e endoderma. Estas células derivam da massa celular interna

(MCI), o blastocisto embrionário (Sylvester & Longaker, 2004; Hochedlinger &

Plath, 2009).

Totipotente

Pluripotente

Multipotente

Unipotente

3

Células multipotentes são células com capacidade de originar um

número limitado de células, ou seja, são células mais diferenciadas e presentes

no indivíduo adulto. Estas são determinadas de acordo com o órgão as quais

residem, participando muitas vezes da regeneração tecidual local (Gage et al.,

2000). Entretanto, com o avanço das pesquisas, a existência desta categoria

na classificação das CT tem sido cada vez mais questionada, visto que células

antes avaliadas como multipotentes, a exemplo das células-tronco neurais, têm

se revelado pluripotentes (Clarke et al., 2000).

Por fim, existem também as células classificadas como unipotentes,

conhecidas como células progenitoras, que podem ser encontradas em quase

todos os tecidos do organismo adulto, com elevada capacidade replicativa, mas

originando apenas um tipo celular, portanto, são responsáveis por boa parte da

regeneração tecidual (Takahashi & Yamanaka, 2006; Lanza et al., 2006).

Entre uma CT e suas células diferenciadas existe um tipo celular

intermediário chamado de célula amplificadora transitória, que apresenta o

potencial de proliferação diminuída e uma restrita capacidade de diferenciação.

A existência destas células amplificadoras transitórias proporciona um

esclarecimento de como um tecido pode manter uma constante produção de

células diferenciadas a partir de um pequeno número de CT locais (Slack et al.,

2000).

De um modo geral, as CT podem ser classificadas em embrionárias

(CTE) ou adultas (CTA). As CTEs são derivadas da camada interna do embrião

no estágio de blastocisto e possuem capacidade de dar origem a mais de 200

tipos celulares. As CTAs estão presentes em órgãos ou tecidos diferenciados e

4

são responsáveis pela manutenção da integridade dos tecidos, pelo reparo

diante de lesões e pela remodelação dos tecidos (Zago; Covas, 2006).

1.1.1. Células-tronco Embrionárias

As CTEs são encontradas em estágios iniciais pós-fertilização. O

oócito,fertilizado ou zigoto, descendentes das duas primeiras divisões são

totipotentes. Após quatro dias, tais células dão início ao processo de

especialização e formam o blastocisto, uma formação circular oca, que

apresenta um aglomerado de células no seu interior denominada massa interna

do blastocisto, e deste local se obtém as CTEs (Sylvester & Longaker, 2004).

As MCIs podem ser retiradas e cultivadas, dando origem a linhagens de

CTEs, que têm a capacidade de diferenciar-se nos tecidos do adulto pela

técnica de transferência do núcleo somático (chamado também de clonagem).

Esse método possibilita a criação de uma célula pluripotencial a partir de uma

célula somática. O núcleo de uma célula adulta é retirado e transferido para um

oócito do qual o próprio núcleo foi removido. Essa célula híbrida pode ser

estimulada a se dividir, originando na MCI semelhante à blástula de um

embrião normal. Dessa MCI podem ser retiradas células que, sob condições

apropriadas, diferenciam-se em muitos (ou todos) tecidos do organismo

(Figura 2) (Thomson et al., 1998).

As CTE, se cultivadas em condições apropriadas, podem ser mantidas

em seu estado indiferenciado por múltiplas divisões celulares (Tiscornia &

Belmonte, 2010). Por outro lado, estas células também podem ser induzidas a

diferenciar-se in vitro, simulando o desenvolvimento de um embrião pré-

5

implantado ou então podem percorrer um caminho específico de diferenciação

em tipos celulares desejados.

Fonte: http://www.lance-ufrj.org/ceacutelulas-tronco.html

Figura 2 - Esquema ilustrativo de CTE extraídas do MCI.

Para caracterizar as CTE humanas exibem diversos marcadores que

são comuns às células pluripotentes, tais como o Rex-1, Cripto/TDGF1,

DNMT3B, SOX-2, EBAF e Thy-1, CD9, CD24, Oct-4, Fosfatase Alcalina,

Nanog, os antígenos específicos de estágio embrionário, SSEA-3 e SSEA-4,

além de exibirem altos níveis da enzima telomerase. Esta enzima é

responsável pela inibição da senescência celular através do reagrupamento

dos telômeros cromossômicos após as divisões (Trounson et al., 2006),

Essas propriedades das CTEs levaram ao seu uso como instrumento de

6

pesquisa e como fonte de tecidos para transplante (Hwang, 2007). Entretanto,

questões éticas em relação à sua obtenção e utilização ainda estão em

considerações (Guan et al. 1999; Odorico et al., 2001; Rippon et al., 2008).

1.1.2. Células-tronco Adultas

O primeiro grupo a relatou sobre as CTA foi de Ferrari e colaboradores

em 1998. Este grupo demonstrou que as CT derivadas de medula óssea

migraram para as áreas de lesão no músculo e originaram novas células

musculares. Essas células possuem a capacidade de gerar tipos celulares que

compõem o tecido e órgãos específicos onde estão situadas (Ferrari et al.,

1998).

As CTA podem ser obtidas dos mais diversos tecidos como medula

ósseaa, tecido adiposo, polpa de dente, músculo, tecido hematopoiético,

neural, gastrointestinal, epidermal, hepático, vascular, muscular, pancreático

(Spees et al., 2003), cordão umbilical, entre outros (Kim et al., 2004; Lee et al.,

2004).

Estas células possuem um potencial de diferenciação celular mais

limitada do que as CTE. São classificadas como multipotente e são

responsáveis pela remodelação, manutenção da integridade e pelo reparo de

tecidos específicos (Bajada et al., 2008).

As CTAs estão em estado quiescente ou de baixa proliferação,

predominantemente nas fases G0 e G1 do ciclo celular, localizando-se em

regiões específicas denominadas de nichos celulares. Esta característica é

necessária para a manutenção da indiferenciação por períodos prolongados

7

para protegê-la do esgotamento prematuro em condições de estresse e

restringir a divisão celular devido à propensão a erros na síntese de DNA

(Heissig et al., 2005; Brittan et al., 2002; Kim et al., 2005).

Supõe-se que existem sinais presentes somente no microambiente

nativo de cada tipo de CT, atuando como sistema regulatório do ciclo celular,

modulando a divisão, adesão, retenção, “homing”, mobilização e manutenção

da indiferenciação ou diferenciação celular (Díaz-Flores et al., 2006; Lanza et

al., 2009).

Diferentes grupos de pesquisa, como por exemplo de Takahashi &

Yamanaka, descreveram a presença do gene Oct-4 em CTA. Este marcador é

utilizado como um marcador de células indiferenciadas, cuja expressão foi

fortemente relacionada às populações de células-tronco totipotentes e

pluripotentes ao longo do desenvolvimento, como em óvulos fertilizados,

blastômeros da mórula, células da massa interna do blastocisto, epiblasto e

ectoderme primitiva. Ainda não está totalmente elucidada a função do Oct-4,

porém, já está constatado que a perda da sua funcionalidade leva

terminantemente à diferenciação celular (Takahashi & Yamanaka, 2006).

Outro marcador que possui a propriedade de manutenção da

indiferenciação de CTE é o Nanog. No entanto, ainda não se sabe exatamente

sobre sua função, mas sabe-se que a perda da sua expressão, também

acarreta na diferenciação celular. Muito além de apenas funções em comum, já

está claro que Oct-4 e Nanog formam uma colaboração transcricional

interdependente, onde regulam a expressão um do outro, e juntos a de outros

genes (Lanza et al., 2009).

8

Baseado nestas propriedades, Yamanaka introduziu via retroviral, a

combinação dos genes Oct-4, Nanog, Sox2 e Lin28, em células somáticas e

reprogramou estas à pluripotência; (Alison et al., 2009).

As CTA são divididas em CT hematopoiética (CTH) e CT estromais ou

mesenquimais (CTM). Tanto as CTH quanto as CTM já estão bem descritas na

literatura a presença das mesmas na medula óssea, no sangue periférico e no

sangue de cordão umbilical, onde correspondem aproximadamente a 0,1-1%

do total de células (Yang et al; 2012).

1.1.3. Células-tronco Hematopoiéticas

Há, pelo menos, 50 anos, as CTHs são as que estão mais bem

caracterizadas entre as CT estudadas, o que levou à sua utilização terapêutica

no transplante de MO (Gowdak et al, 2004).

A CTH é definida como uma célula com grande capacidade de auto

renovação e potencial proliferativo, o que possibilita a sua diferenciação em

células progenitoras de todas as linhagens sanguíneas e a reconstituição da

população hematopoiética a partir de uma única célula (Lim et al, 2000), e,

após o nascimento, as CTH localizam-se preferencialmente na medula óssea

(Godin & Cumano, 2002).

O processo de diferenciação das CTHs em linhagens de células

maduras e diferenciadas (eritrócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos,

monócitos linfócitos B, T e NK) é definido como hematopoese. Em um adulto

normalmente é produzido bilhões de células sanguíneas diariamente (Morrison

et al., 1995).

9

Uma combinação de marcadores de superfície tem sido usada para

identificar a CTH humana ou, pelo menos, uma subpopulação precursora

hematopoiética primitiva. A presença do antígeno CD34 é o principal marcador

dessa população. Sendo que a combinação CD34+CD38- caracteriza-se como

CTH. Também são utilizados outros marcadores de superfície celular como o c-

kit (CD117) (Ishikawa et al, 2003; Sutherland et al, 1996; Gratama et al, 1998) e

o CD90 (Thy-1) que está envolvido na sinalização da transdução gênica

(Humeau et al., 1996).

1.1.4. Células-tronco mesenquimais

As CTM vêm despertando grandes interesses devido à

multipotencialidade, facilidade de expansão e isolamento in vitro, tornando

assim uma alternativa terapêutica atrativa com um amplo espectro de

aplicações clínicas no contexto de terapia celular. A relevância deste tipo

celular cresceu exponencialmente nos últimos anos em razão ao seu grande

potencial de uso na regeneração de tecidos e órgãos lesados, como vem

sendo evidenciado em muitos estudos clínicos e pré-clínicos. (Minguell, Erices

e Conget, 2001).

Friedenstein na década de 1970 constatou a primeira evidência concreta

de que células precursoras não hematopoiéticas estavam presentes na medula

óssea. Este estudo demonstrou uma população de células presentes na

medula óssea caracterizada pelo seu formato fusiforme, pela formação de

colônias de células semelhantes a fibroblastos, chamadas de unidades

formadoras de colônias de fibroblastos (CFU-F) e pela sua aderência à

10

superfície plástica. Posteriormente, diversos trabalhos demonstraram que as

células isoladas pelo método de Friedenstein eram multipotentes e podiam se

diferenciar em osteoblastos, condroblastos, adipócitos e mesmo em mioblastos

(Friedenstein, 1970).

As CTM, que possuem morfologia fibroblastoide, são também chamadas

de células estromais de medula óssea, ou ainda de células estromais

mesenquimais multipotentes. De acordo com a International Society for Cellular

Therapy, para caracterizar uma célula como CTM é fundamentalmente preciso

que esta célula tenha algumas características, como a aderência ao plástico

sob condições de cultura padrão, o potencial de se diferenciar in vitro em

osteoblastos, adipócitos e condroblastos e que expressem os marcadores de

superfície CD105, CD73 e CD90, e não expressem os marcadores de

superfície CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79 ou CD19, e HLA-DR. No

entanto, ainda é impossível suprir em laboratório todos os fatores extrínsecos

produzidos e originados no nicho fisiológico de uma CT, tendo em vista que

uma CT fora do seu ambiente original não se comporta da mesma maneira que

em seu nicho (Horwitz et al., 2002).

As CTM com características biológicas semelhantes às CTH têm sido

isoladas de vários outros órgãos e tecidos como sangue periférico, sangue de

Cordão umbilical (CUh), endotélio e subendotélio da veia do CUh, membranas

sinoviais, o que sugere a existência de uma extensa rede de CTM no

organismo. Estas células também podem ser isoladas de vários tecidos

adultos, como tecido adiposo, músculo e derme (Zuk et al. 2001, Young et al.

2001).

11

As CTM têm um grande potencial para ser utilizado como terapias

celulares, tendo em vista sua facilidade de obtenção, expansão e

diferenciação, além de relativa aceitação do ponto de vista ético (Baksh, et al

2003; Stute et al., 2004).

1.2 Fontes de células-tronco

A medula óssea é composta por dois sistemas que produzem linhagens

de células distintas: o sistema hematopoiético e o tecido conectivo (estromal)

que oferece suporte, e está associado ao sistema hematopoiético. A interação

destas duas linhagens proporciona a formação de nichos, que promove o

processo de diferenciação das CTHs, sendo regulados pela interação direta

das células e por fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas, que são

produzidos por várias células hematopoiéticas e não hematopoiéticas

(Janowska-Wieczorek et al., 2001).

O sangue do CUh e placentário constitui uma fonte abundante de CTs

com um elevado potencial proliferativo e migratório, tal capacidade parece ser

maior quando comparada com os progenitores da medula óssea. Constitui

também uma fonte alternativa de CTH, podendo ser efetiva para o transplante.

As CT do CUh são mais imaturas e o sangue do CUh e placentário é altamente

enriquecido com progenitores celulares hematopoiéticos, mesenquimais e

endoteliais (Haas, Weidner Winkler; 2005).

12

1.3. Propriedades imunomodulatórias

Um número cada vez maior de evidências vem demonstrando que as

CTM possuem a capacidade de modular o sistema imunológico, podendo

desempenhar atividades imunomodulatórias importantes para a manutenção de

tolerância periférica, tolerância a transplantes, autoimunidade, evasão tumoral

e tolerância materno-fetal (Nauta e Fibbe, 2007). Os efeitos imunomodulatórios

das CTM têm sido estudados em diversos modelos experimentais relacionados

à imunidade a aloenxertos, autoimunidade e imunidade aos tumores, bem

como em alguns ensaios clínicos de terapia celular (Lazarus et al., 2005).

As CTM são tidas como hipoimunogênicas por expressarem baixos

níveis de moléculas de MHC classe I e não expressarem moléculas de MHC

classe II e nem moléculas co-estimulatórias. Porém, Le Blanc e cols.

demonstraram que as moléculas de MHC classe II estão presentes no meio

intracelular e sua expressão na superfície da célula pode ser induzida por IFN-γ

(Le Blanck et al., 2003).

Foi também demonstrado que as CTM possuem a habilidade de

amenizar a produção de 1-2 por células, fator que ocasiona a diminuição da

formação de células-T citotóxicas (CD8). Essa inibição afeta a proliferação de

células T induzida por aloantígenos, mitógenos, assim como por anticorpos

para CD3 e CD28 (Nauta & Fibbe 2007).

Além disso, estas células possuem habilidade quimiotática e de

migração para áreas de lesão ou inflamação, propriedade conhecida como

homing (Aggarwal et al., 2005; Pittenger et al., 2005).

13

1.4. Envelhecimento das CTM

O envelhecimento é um processo bastante complexo, por esta razão, o

conhecimento de seu mecanismo celular permite que as CTMs possam ser

isoladas e caracterizadas com a integridade necessária. As CTA podem

apresentar aproximadamente de 50 a 60 divisões antes de virarem

senescentes. Esta aptidão replicativa é também conhecida como o “limite de

Hayflick”, sendo esta expressão estabelecida por Leonardo Hayflick em 1965,

para relatar o processo resultante do progressivo encurtamento dos telômeros

(Roobrouck et al. 2008). Este encurtamento dos telómeros foi estudado durante

o cultivo in vitro e observaram que as CTM humanas normalmente param de

proliferar antes de 40 duplicações populacionais (population doublings), quando

se tornam maiores e mais achatadas (Bruder et al. 1997).

A idade do doador das CTM também é um fator relevante. As CTM

derivadas de doadores idosos apresentam menores percentuais de

proliferação, alterações no seu potencial de diferenciação bem como menor

passagem celular e uma morfologia mais larga e achatada (Baksh et al. 2004,

Stolzing et al., 2008; Roobrouck et al., 2008).

1.5. Aplicação da CTM

A facilidade de isolamento e expansão em cultura, multipotencialidade,

propriedades imunomodulatórias e capacidade de migrar para sítios de

inflamação quando injetadas por via intravenosa, as CTM se tornaram um

grande destaque e tem despertado um grande interesse em sua utilização em

terapias celulares para o tratamento de diversas doenças (Chapel et al. 2003).

14

As CTM estão sendo estudadas em tratamento de doenças cardíacas

isquêmicas e degenerativas, lesões ósseas, condrais, tendinosas, pulmonares,

da medula espinhal, do sistema nervoso central, do fígado e em doenças

genéticas como a osteogênese imperfeita (Zago; Covas, 2006).

Seu potencial de diferenciação em múltiplas linhagens, sua sensibilidade

elevada a moléculas sinalizadoras específicas e uma relativa facilidade de

manuseio in vitro as tornam ferramentas importantes para a engenharia de

tecidos, e para terapias celulares (Caplan e Bruder, 2001; Nardi e Da Silva

Meirelles, 2006).

Estas células podem diferenciar-se em tipos celulares não-

mesenquimais in vitro, como neurônios e in vivo como células neurais e

hepatócitos além de exibir a tendência em adquirir características tecidual-

específicas quando co-cultivadas com tipos celulares especializados ou quando

expostas a extratos teciduais in vitro, como células de câncer gástrico, células

secretoras de insulina e hepatócitos (Lange et al., 2005; Woodbury et al., 2000;

Kopen et al., 1999; Sato et al., 2005).

As CTM também demonstram potencial para o tratamento de doenças

caracterizadas pela deficiência gênica através da modificação das mesmas,

para que aumente a expressão do produto gênico em questão, e também pode

ser utilizada quando a deficiência genética puder ser suprida por seu

patrimônio genético. Insere-se no segundo caso a tentativa bem sucedida de

correção da osteogênese imperfeita (doença genética causada pela deficiência

da produção de colágeno tipo) em crianças utilizando-se transplante de medula

óssea de doadores compatíveis (Horwitz et al., 1999; Horwitz et al., 2001).

15

As propriedades imunomodulatorias são outras características que

também fazem das CTMs uma boa candidata a agente terapêutico, quando

estas são utilizadas no tratamento de um paciente com doença do enxerto

contra o hospedeiro, e também seus efeitos tróficos, que podem ser úteis para

o tratamento de acidentes vasculares cerebrais (Le Blanc et al, 2004).

O conceito de terapia para doenças do coração por meio da geração de

um novo tecido miocárdico funcional era considerado fisiologicamente

improvável, porém recentemente, as CT derivadas de medula óssea têm sido

utilizadas para testar a possibilidade de regeneração deste tecido. Diversos

autores têm ilustrado que a injeção intracoronariana de CTM da medula óssea

pode desempenhar uma estratégia simples e promissora para o tratamento de

doenças do coração. No entanto, ainda não está claro se a população

responsável por esse efeito é a de CTH, CTM ou de progenitores diferenciados

(Orlic et al., 200;, Ohnishi et al., 2007).

A CTM influencia diretamente a homeostase óssea, pela taxa de

geração de osteoblastos e pela produção de fatores que afetam o balanço

osteoblasto/osteócito. Enxertos ósseos de vários tipos (autólogos, homólogos,

próteses) podem ser utilizados para a reconstrução de defeitos esqueléticos,

cada um deles apresentando vantagens e desvantagens (Niemeyer et al.

2006). As CTMs autólogas têm sido utilizadas em conjunto com matrizes

reabsorvíveis para a reconstituição de lesões ósseas. Em modelos caninos, de

coelhos e de ovelhas, a regeneração de defeitos ósseos foi muito melhor nos

grupos que receberam a matriz colonizada com CTM, do que nos grupos que

receberam somente a matriz (Bruder et. al.,1998).

16

1.5. Cordão Umbilical Humano (CUh) como fonte de CTM

O CUh tem sido um grande motivador de diversos estudos,

principalmente aqueles que têm como objetivo analisar o potencial de suas

células para a substituição e regeneração de tecidos. Uma vez considerada

uma excelente fonte de CT, as quais podem ser terapeuticamente benéficas

através de transplantes autólogos (Petsa et al, 2009).

O CUh possui duas artérias e uma veia cercada de um tecido conectivo

mucoide, a Geleia de Wharton (GW), sendo que as CTMs podem ser isoladas

tanto da GW quanto do vaso (Ishige et al, 2009).

As CTM do CUh de recém-nascidos são jovens e, portanto,

provavelmente, possuem uma proliferação potente e maior capacidade de

diferenciação. Outras vantagens do uso das CT do CUh é a fácil

disponibilidade do CUh de recém-nascido e o potencial de armazenagem em

nitrogênio liquido em um banco de tecidos para utilização quando necessário

(Liu et al, 2010). O CUh pode ser facilmente obtido sem causar dor e, o seu

procedimento de coleta, evita problemas éticos e técnicos (Wu et al., 2009).

Esse material biológico, que é considerado um resíduo médico nas salas de

parto, é obtido após o parto de um recém-nascido a termo, a partir de uma

amostra que seria inevitavelmente descartada, sendo um procedimento

simples, não invasivo, indolor e sem prejuízo para a mãe ou para a criança

(Secco et al., 2008; Malgieri et al., 2010).

Dois tipos de CT têm sido isolados do CUh até agora, as células

progenitoras hematopoiéticas do sangue dos vasos sangüíneos e as CTM da

GW (Alaminos et al, 2010).

17

O sangue do CUh possui particularidades vantajosas pela sua

disponibilidade, sendo elas não invasividade e potencial para terapia baseada

em células autólogas. Entretanto a oferta das CTM quando isolada da GW é

muito maior em relação a oferta de CTM do sangue do CUh (Ishige et al, 2009).

As células do sangue de CUh são boas substitutas das células

progenitoras hematopoiéticas derivadas da medula óssea devido à imaturidade

apresentadas por estas células dos recém nascidos. A imaturidade das células

está associada com a menor imunogenicidade, o que reduz a reatividade do

enxerto-versus-hospedeiro, quando comparado com os enxertos derivados de

CT de medula óssea. Além disso, o uso das células do sangue de CUh em

estudos básicos e aplicações clínicas não levantam questões éticas (MalgierI et

al., 2010).

Assim, como a medula óssea se apresenta como fonte de CTh, que são

aptas para transplante, o sangue do CUh parece ser também uma promissora

fonte de CTM, mas em menor número de oferta de CTM. Portanto, o sangue do

CUh parece não ser fonte ideal de CTM para uso clínico (Ishige et al, 2009). O

emprego de CTM isolada da parede da veia do CUh apresenta diversas

vantagens em relação ao uso de medula óssea, entre elas: disponibilidade de

doadores e uma alta capacidade proliferativa destas células. Sendo assim, uma

fonte potencial de CTM bastante promissora é a GW (Fukuchi et al, 2004).

A GW é um tecido conectivo gelatinoso, composto por miofibroblastos,

fibras colágenas e proteoglicanas. As fibras colágenas, pequenas e

entrelaçadas, feixes de tecidos arranjados para formar um contínuo esqueleto

mole encerra os vasos umbilicais. A GW possui pouco colágeno, outro

18

indicador do estado primitivo deste tecido. Também se pode encontrar um

abundante glicosaminoglicano, o ácido hialurônico, que forma um gel hidratado

ao redor dos fibroblastos e fibrilas de colágeno mantendo a arquitetura do

tecido do cordão e protegendo-o da pressão (Yang et al, 2012).

A população de CT na matriz da GW está localizada perto dos vasos do

CUh, estas são denominadas células perivasculares do CUh. Estas células,

que tem complexo de histocompatibilidade (MHC) de classe II negativo, não

somente expressam um fenótipo imunoprivilegiado e imunomodulador, mas o

seu MHC de classe I expressa níveis que podem também ser manipulados

fazendo destas uma potente fonte de células para terapias baseadas em CTM.

Além disso, as CT perivasculares do CUh podem ser coletadas após o

nascimento, armazenadas criogenicamente, descongeladas e expandidas para

uso terapêutico (Baksh et al, 2007).

Na GW também pode se encontrar células como fibroblastos, que

possuem propriedades similares às propriedades das CTM e podem

representar uma rica fonte de células primitivas. Assim como células estromais

da medula óssea, as CTMs provenientes da GW são plástico aderentes,

positivamente para marcadores de CTM e negativamente para marcadores de

linhagens hematopoiéticas. As células da GW podem ser expandidas mais do

que CTM antes que sua multiplicidade seja comprometida (Angelucci et al,

2010).

19

1.6. Resistência às Múltiplas Drogas – MDR

A resistência a múltiplas drogas (MDR) foi primeiramente observada em

cânceres humanos. A quimioterapia e radioterapia são os principais

tratamentos para cânceres sistêmicos. No entanto, em alguns casos, a maior

parte dos cânceres metastáticos se apresenta resistente à quimioterapia ou,

responde ao tratamento inicialmente e, posteriormente retorna como um câncer

que adquiriu resistência. Esse fenômeno recebeu esta denominação por

abranger um amplo espectro de agentes citotóxicos, descrito na década de

1960 (Kessel et al, 1968).

Este mecanismo pode ser definido como a habilidade das células

neoplásicas de sobreviverem à exposição a agentes tóxicos em doses

máximas toleradas por tecidos normais. Geralmente existe uma resistência

simultânea a uma variedade de agentes citotóxicos que apresentam diferentes

sítios de ação e estruturas químicas diversas (Ginn et al.,1996; Raaijmakers et

al., 1998).

Os mecanismos de resistência representam diversas formas de proteção

celular do organismo, podendo estar presentes na maioria das células normais,

mas também podem ser aplicados em diversos tipos de células tumorais. Os

mecanismos melhor caracterizados e citados pela literatura são aqueles

relacionados à redução no acúmulo intracelular de drogas, como o da P-gp e a

proteína relacionada à resistência pulmonar (LRP) (Bergman et al., 2003).

As drogas relacionadas ao fenótipo MDR geralmente são alcalóides ou

antibióticos originados de plantas ou fungos, assim como compostos

citotóxicos, incluindo, entre outras, antraciclinas como a daunorubicina e

20

doxorubicina (DOX), alcalóides da Vinca como vincristina (VCR) e vimblastina,

epipodofilotoxinas (teniposídeo e etoposídeo), antibióticos (actinomicina D),

anti-microtúbulos (colchicina e podofilotoxina) e inibidores de síntese proteica

(Gottesman e Pastan, 1993).

Os membros da subfamília MDR pertencem a uma grande família de

transportadores, denominados transportadores ABC. Estes apresentam

domínios transmembrânicos ligados ao transporte de substâncias, para dentro

ou fora das células, contra o gradiente de concentração, movidas a partir da

hidrólise de ATP. Em condições fisiológicas, as bombas ATPases são

fundamentais na defesa tecidual, excretando compostos tóxicos e metabólitos,

além de transportarem inúmeros substratos como íons, peptídeos,

aminoácidos, açúcares, lipídios, fosfolipídeos, colesterol e outros compostos

hidrofóbicos, através das membranas plasmática e intracelulares (Cousar et al,

2013). Estes transportadores são vastamente estudados por estarem

associados à resistência a drogas. Nos mamíferos, as proteínas ABC são

divididas em sete sub-famílias, sendo estas agrupadas e nomeadas de acordo

com a quantidade e combinações dos seus domínios, transmembrana e

relacionados ao consumo de ATP (Dean et al., 2001)

Os transportadores ABC geralmente são compostos por quatro

domínios, sendo dois citoplasmáticos, ligados ao nucleotídeo, e dois

compostos por seis α-hélices transmembranas. Estes transportadores podem

ser formados por apenas uma cadeia polipeptídica ou na forma de duas

proteínas separadas, que necessitam formar homo ou heterodímeros para

promover um transporte funcional ( Stavrovskaya & Stromskaya, 2008).

21

Nestas células foram encontradas expressas uma série de importantes

proteínas de transporte, principalmente, alguns membros da família de

transportadores ABC (ATP-binding cassette) como a P-glicoproteína (P-gp), e a

proteína MRP1, onde estudos relataram que elas seriam as causadoras de

resistência a drogas. A proteína LRP (Lung Resistance Related Protein) da

família MVP (major Voult protein) em trabalhos recentes, também tem sido

analisada por ser um dos mecanismos de resistência mais frequentes. No

entanto as funções fisiológicas dessas proteínas em células indiferenciadas

ainda não foram completamente elucidadas (Gottesman e Pastan, 1993,

Raaijmakers et al., 1998).

1.6.1. P-glicoproteína (P-gp)

Em diversos trabalhos, foi observado que células que apresentavam o

fenótipo de resistência a múltiplas drogas apresentavam também um aumento

na expressão da P-gp (onde P significa permeabilidade). Diversos estudos

demostraram que a P-gp age sobre uma grande quantidade de substratos que

apresentam como característica comum apenas o fato de serem, em geral,

lipofílicos e anfipáticos. O quadro 1 lista os substratos já descritos para a P-gp.

São conhecidas várias isoformas da glicoproteína P, classificadas em classes I,

II e III. As classes I e II estão relacionadas com a MDR, enquanto a classe III

está envolvida no transporte de fosfolipídios (Van Helvoort et al. 1996).

Camundongos, ratos e hamsters apresentam as três classes de Pgp. Em

humanos, são descritas duas isoformas, MDR1 (classe I) e MDR3 (classe III)

22

codificadas, respectivamente, pelos genes ABCB1 e ABCB4 (Gottesman &

Pastan, 1993).

A P-gp é uma proteína de transmembrana de 170 k, o gene que a

codifica é o ABCB1, também conhecido como MDR1 (multi-drug resistance). O

mesmo é constituído por 28 éxons e se localiza no cromossomo 7. A gp-P é um

transportador completo composto por 12 segmentos de transmembrana

dividido em dois domínios, cada um deles ligado a um domínio de união de

ATP. A incorporação de um substrato ao sítio de ligação de alta afinidade

resulta na hidrólise de ATP, causando uma mudança conformacional que

transporta o substrato a um sítio de menor afinidade e logo o libera para o

espaço extracelular (Sauna et al., 2001) (Figura 3).

Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010040422010001000027&script=sci_

Figura 3 - Esquema ilustrativo da estrutura da P-glicoproteína, demonstrando a

disposição dos domínios transmembrana no ambiente extracelular e

intracelular, sendo estes ligados ao nucleotídeo ATP.

23

Possui conformação de estrutura dupla, onde cada metade da molécula

contém um domínio ligado a um nucleotídeo. É composta de seis domínios

transmembrana hidrofóbicos, onde supostamente são as vias por onde as

moléculas atravessam a membrana. A hidrólise do ATP gera várias mudanças

conformacionais nestes caminhos, permitindo a abertura do poro em toda a

profundidade da bicamada lipídica, por onde ocorre o trânsito de substratos

(Dean et al., 2001; Zhou et al., 2006).

A P-gp funciona como uma bomba de efluxo dependente de energia,

que resulta em uma diminuição no acúmulo intracelular de agentes citotóxicos

em células tumorais (Van Helvoort et al., 2003).

A P-gp pode ser expressa nas células hepáticas, túbulos renais,

membranas apicais do epitélio intestinal, trofoblastos da placenta, túbulos

renais e barreira hematoencefálica, glândulas adrenais, células natural killer

(NK), CTH, linfócitos T e B e células dendríticas apresentadoras de antígenos

(DC) (Johnstone et al., 2000).

24

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S01000422010001000027&script=sci_artte

Figura 4 – Fármacos relacionadas ao mecanismo de resistência da P-gp

25

1.6.2. LRP - Lung resistance-related protein

A princípio, a proteína LRP foi identificada em células de linhagem de

câncer de pulmão resistentes a antraciclinas que não apresentavam um

aumento de expressão de ABCB1. O gene lrp, que codifica a proteína LRP,

está localizado na região cromossomal 16p11.2, próximo ao gene da proteína

ABCC1. Ao contrario das proteínas ABCB1 e ABCC1, essa proteína de 100

kDa não possui fragmentos transmembrana ou sítios de ligação de ATP, não

sendo, portanto, tida como um membro da superfamília ABC (Izquierdo et al.,

1998; Swerts et al., 2006).

A LRP é membro da família MVP (Major V cuja função ainda não está

totalmente esclarecida, entretanto, acredita-se que ela esteja envolvida no

transporte de substâncias para fora do núcleo e/ou para dentro de vesículas, o

que sugere que ela exerça um papel nos processos de detoxificação (Swerts et

al., 2006).

Devido a semelhanças, a proteína MRP a proteína LRP foi denominada

como “Vaults”, que são organelas citoplasmáticas localizadas na membrana

nuclear e no poro nuclear. Considera-se que as “vaults” estejam envolvidas nos

transportes vesicular e nucleocitoplasmático de drogas (figura 4) (Ohno et al.,

2001). As “vaults” são complexos de ribonucleoproteínas, cujas dimensões

atingem 35X65 nm. Assim sendo, as “vaults” são as maiores

ribonucleoproteínas relatadas até o momento. Estruturas com morfologia e

dimensões análogas foram apontadas em células de mamíferos, aves, anfíbios,

peixes, moluscos e protozoários. Sabe-se que as “vaults” são altamente

26

conservadas entre os eucariotos, sugerindo assim, uma atividade celular

fundamental (Cheng et al., 2000) (Figura 5).

A LRP também parece estar envolvida no transporte intracelular de

substâncias para o funcionamento normal da célula, como por exemplo,

hormônios, ribossomos e RNA mensageiro (mRNA). Esta proteína é expressa

em diversos tecidos humanos normais, sendo que os seus níveis de expressão

são bastante inconstante entre os diferentes tecidos e indivíduos. Elevados

níveis de expressão são observados no tecido epitelial dos brônquios e trato

digestivo, bem como nos queratinócitos, córtex adrenal e macrófagos. Uma

superexpressão de LRP também pode ser encontrada em muitas células de

linhagem tumoral caracterizadas por uma quimioresistência intrínseca ou

adquirida, o que indica que a regulação positiva do gene lrp pode ser uma

forma de reação dessas linhagens à exposição a agentes citotóxicos (Izquierdo

et al., 1998; Swerts et al., 2006).

27

Fonte: http://www.nature.com/emboj/journal/v28/n21/full/emboj2009274a.html

Figura 5 - Esquema ilustrativo da estrutura tridimensional dos vaults

28

2. OBJETIVOS

O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão dos genes de

resistência a múltiplas drogas em células-tronco mesenquimais do cordão

umbilical humano.

Mais detalhadamente, os objetivos podem ser descritos como:

1) Isolar as células perivasculares da GW do CUh;

2) Analisar e caracterizar a capacidade de proliferação dessas células;

3) Analisar e caracterizar o fenótipo, por citometria de fluxo, bem como o

genótipo através expressão de Oct-4 e Nanog dessas células;

4) Analisar e caracterizar a capacidade de diferenciação destas células;

5) Avaliar a expressão gênica de moléculas relacionadas à resistência a

múltiplas drogas, sendo estas os genes MDR1 e LRP.

29

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Casuística

Os CUh de recém-nascidos foram obtidos de gestantes submetidas ao

processo de parto no Serviço de Obstetrícia do Hospital das Clínicas da

FMUSP. A coleta foi executada com o auxílio de uma equipe de médicos e

enfermeiros especializados, não apresentando riscos para a mãe e/ou para o

feto. É importante ressaltar que esse material biológico é descartado na maioria

das vezes pelo hospital.

A coleta foi realizada mediante autorização da gestante com o termo de

consentimento livre e esclarecido.

O presente estudo foi realizado no Laboratório de Genética e

Hematologia Molecular – LIM31, previamente aprovado pelo Comitê de Ética

do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da FMUSP e pela Comissão de

Ética e Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo (CAPPesq). O patrocínio financeiro deste projeto

está vinculado ao projeto de pesquisa nº 573861/2008-0 do CNPq.

Foram utilizadas 20 amostras (n=20) de recém-nascidos em condições

saudáveis e isentos de problemas genéticos.

3.2. Detalhamento da Coleta

O cordão umbilical (CU) de recém-nascidos a termo foi coletado

imediatamente após o trabalho de parto. O processamento desta amostra

iniciou-se com a retirada de todo o sangue presente nas veias e na artéria e o

CU foi transferido para uma solução de tampão PBS (Phosphate Buffer Saline-

30

Sigma-Aldrich®, EUA) numa concentração 1:2 (v:v), com o anticoagulante

citrato trissódico 3 mg/ml (Merck Chemicals, Brazil), penicilina 100U/ml e

estreptomicina 100 μg/ml (Sigma-Aldrich®, EUA).

Em seguida, o frasco contendo a amostra com a solução tampão

suplementada foi submetido a uma intensa agitação, a fim de que o tampão

penetre em todo o interior dos vasos, promovendo sua limpeza e remoção total

do sangue. Este procedimento é repedido de três a quatro vezes, ou até que a

amostra esteja totalmente limpa e isenta de impurezas.

3.3. Processamento da amostra e Isolamento da CTM

Após a coleta, todo o procedimento foi realizado de forma estéril dentro

de uma câmara de fluxo laminar.

Após a lavagem com a solução tampão foi realizada a lavagem externa

do cordão com etanol 70% por aproximadamente 30 segundos. Em seguida, o

CU foi aberto com o auxílio de bisturi e pequenos fragmentos com

aproximadamente 0,5 cm2 foram colocados em placas de cultura para

promover o crescimento através da técnica conhecida como explante (figura 5).

As placas com o tecido picotado foram transferidas para uma estufa de

CO2 5% a 37°C por aproximadamente 10 minutos, ou até o tecido aderir. Logo

após, foi adicionado meio de cultura α-MEM (Sigma-Aldrich®, EUA),

suplementado com 20% de soro fetal bovino (SFB; Gibco, Brasil), penicilina

100U/ml, estreptomicina 100 μg/ml (Sigma-Aldrich®, EUA) e acondicionadas

em incubadora a 37o C com atmosfera de CO2 a 5% (Thermo Forma, EUA).

31

Figura 6 - Técnica de isolamento de CTM de CUh por explante. Acondicionamento do cordão (A.1), fragmentação do cordão (A.2 e A.3), arranjo em placa de cultura dos fragmentos (A.4). Em B são apresentas células na passagem 0 e na decima passagem mostrando a diferença na confluência.

Os explantes foram mantidos na placa de cultura por aproximadamente

de 10-15 dias, sendo que o meio de cultura foi trocado a cada três dias. Com o

auxílio de uma pinça cirúrgica os fragmentos de explante foram retirados. Após

32

as células aderidas atingirem uma confluência de 70 a 80%, as garrafas foram

lavadas com 5 ml de PBS, para que a cultura fique isenta de meio

suplementado. As células foram dissociadas do plástico com o auxilio de ATV

(solução de tripsina e EDTA; Instituto Adolfo Lutz, SP, Brasil) e mantidas a 37oC

por aproximadamente 4 min ou até se soltarem. Após o desprendimento

celular, foram lavadas com meio de cultura suplementado com SFB 20% para

inativar a ação do ATV e em seguida transferidas para tubos de 15 mL e

levadas para centrifugação a 595,8g por 5 minutos.

Seguindo o protocolo específico para o cultivo já estabelecido pelo

nosso laboratório, as CTM foram plaqueadas em garrafas de 75 cm2 e

incubadas com meio de cultura α-MEM (Sigma-Aldrich®, EUA), suplementado

com 20% de soro fetal bovino (SFB; Gibco, Brasil), penicilina 100U/ml,

estreptomicina 100 μg/ml (Sigma-Aldrich®, EUA), determinado este meio como

meio completo. As garrafas foram mantidas em incubadora a 37oC com

atmosfera de CO2 a 5% (Thermo Forma, EUA). A tripsinização celular foi

realizada a cada 4 e 5 dias, ou até que a garrafa estivesse com

aproximadamente 80-90% de confluência.

As amostras foram observadas durante todas as passagens e a cada

troca de meio com o auxilio de um microscópio invertido para determinar a

integridade e a confluência celular.

As contagens foram feitas em câmara de Neubauer (Optik Labor,

Alemanha), com o corante de exclusão Azul de Tripan (Sigma- Aldrich®, EUA),

que é internalizado pelas células com membranas lisadas, tingindo as células

mortas de azul. Estes procedimentos são cruciais para determinar a densidade

33

de inóculo e o período ideal da utilização da população isolada nos

experimentos posteriores.

3.4. Curva de crescimento

As CTM do CUh foram avaliadas quanto ao seu tempo de dobramento

pelo método colorimétrico de MTT. As células foram inoculadas em placas de

96 poços por amostra com uma densidade de 0,5x103; 1x103 e 5x103, sendo

que cada densidade foi plaqueada em três poços.

As amostras foram incubadas nas mesmas condições acima citadas e

cada placa foi processada após o período de 24, 48, 72 e 96 horas. Após cada

período foram adicionados 10 µL de MTT às placas e as mesmas foram

incubadas por 4 horas em estufa a 37o C a 5% de CO2. Consecutivamente, as

placas foram centrifugadas a 2094,2x g por 10 minutos, o meio foi aspirado, e

os cristais formados foram diluídos em DMSO (Mosmann 1983).

A leitura da da densidade ótica foi feita por espectrofotometria em leitor

de placas (BioTek ELx 800) em 570 e 620nm, sendo que são utilizadas as

diferenças entre as absorbâncias dos respectivos comprimentos de onda. Os

dados obtidos foram analisados no programa GraphPad Prism 5 e realizada

uma curva de regressão exponencial para determinar o tempo de duplicação

celular para cada CTM.

3.5. Ensaios de plasticidade celular

Cerca de 5x103 células foram semeadas em placas de 6 poços para

realização de cada ensaio de diferenciação celular. O protocolo teve início no

momento em que as culturas atingiam aproximadamente 70-80% de

34

confluência. Neste momento, todo o meio de cultura foi substituído por um meio

de indução próprio para cada diferenciação. Os respectivos meios foram

trocados de duas a três vezes por semana durante aproximadamente 15 dias.

As células foram mantidas em incubadora a 37°C com 5% de CO2. Após a

indução completa a diferenciação celular foi confirmada por meio de

colorações.

3.5.1. Diferenciação Osteogênica

Foi utilizado meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium High Glucose

(DMEMHG) contendo 20% de SFB e 1% de antibióticos suplementado com

dexametasona 5 mM, ascorbato-2-fosfato 50mM e β-glicerofosfato 10 mM

(todos da Sigma-Aldrich®, EUA).

Para visualizar a produção de cálcio pelas células tratadas e confirmar o

protocolo de diferenciação óssea foram realizadas as colorações com

Vermelho de Alizarina e von Kossa (todos da Sigma-Aldrich®, EUA).

3.5.2 Diferenciação Adipogênica

Foi utilizado meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium Nutriente,

Mistura F-12 (DMEM/F-12) com 20% SFB e 1% de antibióticos suplementado,

contendo dexametasona 1 μM, isobutilmetilxantina 0,5 mM, indometacina 200

mM e insulina 10 μg/ml (Sigma-Aldrich®, EUA).

A diferenciação adipogênica foi confirmada pela visualização do acúmulo

de vacúolos lipídicos citoplasmáticos através da coloração de Oil Red O

(Sigma-Aldrich®, EUA).

35

3.6. Ensaio de viabilidade celular

As CT do CUh foram avaliadas quanto à sua resistência ao

quimioterápico doxorrubicina por meio do método colorimétrico de MTT (3-(4,5

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide).

Resumidamente, as células foram inoculadas com 1x103 células/poço

em placa de 96 poços (TPP Flat 96 Well Plate). Após a aderência destas

células ao plástico foram submetidas a 8 concentrações diferentes da diluição

seriada de DOX, que variaram de 0,0625 a 10000 nM. Em seguida, cada placa

foi incubada em estufa com 5% de CO2 a 37oC. Após o período 72 horas de

incubação foi acrescentado 50 μL das diluições 2x aos poços correspondentes.

O controle positivo da reação foi realizado através do uso de DMSO para

induzir morte celular de 100% e o controle negativo da reação foi realizado

somente com o meio de cultura celular.

Após 24 horas de incubação, foi observada a sua confluência nos poços

e acrescentado 10 μL de solução de MTT (Sigma-Aldrich®, EUA) a 5mg/ml. Em

seguida, foram incubadas nas mesmas condições acima citadas, por um

período de 4 horas, até a completa absorção de MTT pelas células e sua

redução pelas mitocôndrias das células viáveis. O produto resultante desta

metabolização é o acumulado em forma de cristais no interior das células.

Após a incubação, as placas foram centrifugadas a 3000 rpm por 10

minutos e o sobrenadante foi descartado. Estes cristais foram diluídos com

álcool isopropílico (Merck, Alemanha), dando origem a uma coloração azul, que

varia de acordo o numero de células em cada poço (Mosmann et al, 1983).

A leitura das concentrações finais foi obtida por espectrofotometria em

leitor de placas (BioTek ELx 800) em 570 e 620nm, sendo que foram utilizadas

36

as diferenças entre as absorbâncias dos respectivos comprimentos de onda.

Os dados obtidos foram analisados no GraphPad Prism 5 software

(GraphPad,Inc.).

3.7. Caracterização das CTM por citometria de fluxo

A caracterização das populações presentes nas amostras do cordão

umbilical foi determinada pela técnica de citometria de fluxo. A identificação dos

antígenos foi realizada através da utilização de diferentes anticorpos

monoclonais conjugados com 2 tipos de fluorocromos: isotiocianato de

fluoresceína (FITC, do inglês fluorescein isothyocyanate) e ficoeritina (PE, do

inglês phycoeritin).

Controles das marcações inespecíficas foram utilizados para realizar a

calibração do equipamento, bem como a análise dos resultados e definição da

positividade das amostras. Todos os anticorpos utilizados neste projeto foram

adquiridos pela empresa Caltag (Invitrogen, Brasil) e estão descritos na tabela

1.

Seguindo o protocolo já estabelecido previamente pelo laboratório (LIM-

31), as células foram obtidas através da tripsinização celular e quantificadas

como descrito anteriormente. 5x105 de células em 500 uL de meio de cultura

completo foram transferidas para tubos específicos utilizados no citometro

(Becton Dickinson, EUA). As células foram ressuspendidas em 1mL de PBS

gelado e centrifugadas por 5 minutos a 1200 rpm.

Após as células serem lavadas as mesmas foram ressuspendidas em

200uL de PBS e os anticorpos conjugados com os fluorocromos foram

incubados por um período de 15 minutos em campo escuro em temperatura

37

ambiente. Em seguida, foram acrescentados 2 mL de PBS e realizada uma

nova centrifugação de 5 minutos à 1200 rpm. O precipitado celular foi

homogeneizado e ressuspenso em 500 uL de solução de formaldeído a 1%

(Sigma-Aldrich, EUA). Por fim, as amostras foram estocadas em geladeira ao

abrigo da luz até o momento da leitura no citometro de fluxo, sendo este tempo

para analise de no máximo 24 horas.

As células foram adquiridas e a intensidade da fluorescência foi captada

pelo citometro de fluxo no aparelho FacScaliburTM (Becton Dickinson, EUA) e

os dados foram analisados no CELLQuestTM (Becton Dickinson, EUA). Para

cada amostra foi realizada uma aquisição de 30,000 eventos. Os resultados

foram fornecidos e analisados na forma de histograma e em percentual da

população celular com reação positiva para cada anticorpo.

38

Tabela 1 - Anticorpos monoclonais utilizados na caracterização das células-tronco por citometria de fluxo.

Anticorpo Especificidade Fluorocrômo

conjugado Diluição

CD14 Macrófagos e Células Dendríticas PE 1:100

CD29 Células Tronco Mesenquimais PE 1:100

CD31 Células Endoteliais FITC 1:100

CD34 Célula Tronco Hematopoiética FITC 1:100

CD44 Células Tronco Mesenquimais PE 1:100

CD45 Pan-Leucocitários FITC 1:100

CD86 Células-T FITC 1:100

CD90 Células Tronco Mesenquimais FITC 1:100

CD105 Células Tronco Mesenquimais PE 1:100

CD117 Células Tronco Hematopoiéticas PE 1:100

CD133 Células Tronco Hematopoiéticas, Células

Tronco Cancerígenas e Células Progenitoras PE 1:100

39

3.8. Biologia Molecular para a caracterização das CTM

3.8.1. Extração de RNA

A extração de RNA foi realizada pelo método do Trizol (Invitrogen,

Carlsbad, CA, EUA), onde as CT foram coletadas e contadas após

centrifugação a 1600 rpm por 5 min em temperatura ambiente. Em seguida, foi

adicionado 1ml de Trizol para cada 1-4 x 106 células que foram bem

homogeneizadas com o auxílio de uma pipeta. Logo após foi adicionado 200μl

de clorofórmio para cada ml de Trizol e agitado por 15 segundos. Após a

agitação, as células foram incubadas por 3 minutos a 25°C, centrifugadas a

12.000 x g por 15 min a 4°C e a fase aquosa foi transferida para um novo tubo

previamente esterilizado por luz ultravioleta. Foram adicionados, em seguida,

500μl de isopropanol para cada ml de Trizol utilizado inicialmente, e incubadas

por 10 minutos a 25°C, centrifugada 12.000 x g por 10 minutos a 4°C. Por fim,

o sobrenadante resultante foi descartado.

Logo após, foi adicionado etanol 75% em água tratada com DEPC

(dietilpirocarbonato) ao precipitado, em um volume final de 1mL para cada ml

Trizol usado e em seguida agitado em vórtex por 15 segundos foram

centrifugadas a 7.500 x g por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi novamente

descartado e o precipitado foi secado por 15 minutos em temperatura ambiente

e então foram adicionados 50 μl de água tratada com DEPC para

ressuspensão.

A amostra de RNA total foi armazenada em freezer -80°C até o momento

do uso.

40

3.8.2. Expressão dos genes de indiferenciação por RT-PCR

Para comprovar a presença de CTs nas populações isoladas, foi

determinada a expressão dos genes de indiferenciação Oct-4, Nanog e o gene

endógeno Gusb, por meio da técnica de RT-PCR (Reverse Transcription

Polymerase Chain Reaction).

Tabela 2 - Relação das sequencias utilizadas para a expressão de indiferenciação celular

3.8.3. Condições das reações de RT-PCR

Cada reação foi feita com 1,5 mM de MgCl2, aproximadamente 1 U de

Taq DNA polimerase, 10 mM de Tris HCl, 60 mM de KCl, 200 μM de cada

desoxirribonucleotídeo trifosfato (dNTP). Concentração mínima de 1 μg de

cDNA foi utilizado para cada reação. Todos os primers senso e antissenso

foram ressuspensos em água tratada com DEPC.

As condições ideais para a reação de PCR foram: 95oC por 5 minutos

para a desnaturação, em seguida a amplificação por 35 ciclos consistindo de

Gene Sequencia

Oct-4 5’ - aag cga tca agc agc gac tat -3' 5' - gga aag gga ccg agg agt aca - 3'

Nanog 5' - caa agg caa aca acc cac tt - 3’ 5' - tct gct gga ggc tga ggt at - 3'

Gusb 5’ - gaa aat acg tgg ttg gag agc tca tt - 3’ 5’ - ccg agt gaa gat ccc ctt ttt aa - 3’

41

desnaturação a 94oC por 30 segundos, hibridização dos primers de 55oC a

65oC por 30 segundos e extensão a 72oC por 1 minuto e uma etapa de

extensão final a 72oC por 8 minutos.

Os produtos da PCR foram analisados através de um gel de agarose 2%

corado com brometo de etídeo (0,1 μg/ml) (ambos da Sigma-Aldrich®, EUA)

visualizado em transiluminador de luz ultravioleta.

3.8.4. RT-PCR em tempo real

Para estudar a expressão dos genes de resistência a múltiplas drogas

em CTM foi realizada a técnica de PCR em tempo real para os genes mdr-1 e

lrp, utilizando como gene endógeno o gene gusb. Para a quantificação relativa

foi realizada uma curva de calibração com diluições seriadas do RNAm da

célula K562-Lucena, que apresenta alta sobre expressão destes genes.

As amplificações foram realizadas em duplicatas e as reações

preparadas com os reagentes do kit SuperScript® III Platinum SYBER Green®

qRT-PCR (InvitrogenTM, EUA). Foi utilizado o equipamento ABI Prism 7500

Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems, EUA). As condições de

programação dos ciclos foram de 95oC - 5 minutos; 40 ciclos: 95oC - 15

segundos; 60oC - 30 segundos. A leitura de fluorescência emitida foi detectada

ao final de cada ciclo, entre 520 e 670 nm, sendo a intensidade de

fluorescência diretamente proporcional à quantidade de produto amplificado.

Os dados foram analisados pelo Sequence Detection Software (SDS) v 1.3

(Applied Biosystems, EUA).

42

Tabela 3 - Relação das sequencias utilizadas para a expressão de MDR1 e LRP

3.9. Análises estatísticas

As análises estatísticas utilizadas neste projeto foram realizadas através

do software GraphPad Prism 5 (GraphPad, Inc). Foram calculadas as médias

e os desvios padrão e as comparações foram realizadas dependendo do

parâmetro necessário, sendo elas pela ANOVA – one way e t-Teste Mann

Whitney.

Gene Sequencia

LPR 5’ - ggg ttg tgc cca tca cca cc - 3’ 5’ - ggt ccg cgg atg agc cag tgg - 3’

MDR-1 5’ - gtt caa act tct gct cct ga - 3’ 5’ - ccc atc att gca ata gca gg - 3’

43

4. RESULTADOS

4.1. Cultivo e processamento

A partir das amostras CUh, foram obtidas colônias de células aderentes

à superfície de cultivo. Quanto à morfologia, as células mostraram-se

alongadas e fibroblastoides, durante todo o período que permaneceram em

cultivo (Figura 7).

As células isoladas demonstraram modificação no seu comportamento

em cultivo, após números avançados de passagens, com a ocorrência de

diminuição na viabilidade celular e estagnação do crescimento. Sendo assim,

foi estabelecido que os experimentos posteriores fossem efetuados com

células entre a 2a e 5a passagem, suficientes para selecionar populações com

morfologia homogênea, obtenção de números consideráveis de células, e

evitar riscos de diferenciação celular espontânea devido ao cultivo prolongado.

Figura 7 - Visualização por microscopia ótica (aumento 40x) de CTM do CUh indiferenciadas. A) CTM em começo de expansão. B) CTM em confluência.

A B

44

4.2. Curva de crescimento celular

Através do experimento de curva de crescimento foi determinado o

tempo de duplicação celular, conhecido como tempo de dobramento (“doubling

time – DT”). Quatro amostras de CUh foram utilizadas para este experimento.

O tempo de duplicação obtido foi de 36 ± 5,97 horas. Dados representativos

estão expressos na Figura 8.

Figura 8 - Regressão exponencial de quatro amostras de CTM do CUH, realizada no período de 24, 48, 72 e 96 horas.

45

4.3. Ensaios de diferenciação

4.3.1 Diferenciação Osteogênica

Outra forma de ter certeza de que as células estudadas são realmente

células-tronco é caracterizando-as através da diferenciação celular.

Após as células serem plaqueadas foram diferenciadas com meio

específico para a diferenciação osteogênica, e todas as amostras

demonstraram características de formação de cristais de cálcio na superfície

visualizados por meio da coloração com vermelho de Alizarina (Figura 9).

Figura 9 - Diferenciação celular das CTM derivadas de cordão umbilical em linhagem osteogênica

46

4.3.2 Diferenciação Adipogênica

Após o período de 10 dias de indução específica para a diferenciação

adipogênica. Estas células demonstraram características de células adiposas,

ou seja, presença de vacúolos lipídicos citoplasmáticos e isto foi visualizado

por meio da coloração específica por Oil Red-O (Figura 10).

Figura 10 - Diferenciação celular das CTM derivadas de cordão umbilical em linhagem adipogênica

47

4.4. Ensaio de viabilidade celular

As CTM do CUh foram incubadas com diferentes concentrações de

doxorubicina (DOX), o resultado foi expresso como porcentagem de células

viáveis em função da concentração de DOX. Por meio de uma regressão no

linear foi determinado o IC50 de cada célula e comparada com a linhagem de

sarcoma uterino MES-DX resistente a DOX. Os resultados mostraram que as

populações de CTM do CUh tem algum grau de resistência a doxorrubicina,

sendo que algumas amostras apresentaram um meio da resistência da

linhagem MES-DX. Figura representativa com 4 curvas das 20 amostras

analisadas e também da célula MÊS-DX (Figura 11 e 12).

Figura 11 - Curva de viabilidade celular das células MES-DX (controle positivo), e CTM do CUh submetidas a diferentes concentrações de doxorrubicina.

GW 2 GW 7 GW 4 GW 9 MÊS-DX

48

GW

2

GW

4

GW

7

GW

9

MES-D

X0

1000

2000

3000

Valores de IC50

DO

X(n

M)

Figura 12 – Analise de valores de IC50 em amostras de CTM de coredão umbilical após estimuladas com doxorrubicina (nM). Controle positivo da amostra foi realizado em células MEX-DX.

Valores de IC50

GW 2 GW 4 GW 7 GW 9

49

4.5. Imunofenotipagem

As CTM do CUh apresentaram positividade para os marcadores CD29,

CD44, CD90, CD105 e negatividade para a expressão dos marcadores CD14,

CD31, CD34, CD45, CD86, CD177, CD133.

Figura 13 representa a média da porcentagem de expressão de cada

marcador nas 20 amostras estudadas. Foi selecionado uma amostra para

ilustrar a população selecionada bem como o histograma de cada marcador,

uma vez que todas as amostras apresentaram o mesmo perfil de expressão

para cada marcador analisado (Figura 14).

Figura 13 – Resultados demonstrados em porcentagem de células positivas dos 11 marcadores avaliados (n=20).

CD14

CD29

CD31

CD34

CD44

CD45

CD86

CD90

CD10

5

CD11

7

CD13

30

20

40

60

80

100

Célu

las P

osit

ivas

(%)

50

Figura 14 – Resultado demonstrativo em histograma da imunofenotipagem das CTM derivadas do cordão umbilical humano.

IgG1 FITC IgG1 PE

CD29 PE CD44 PE CD90 FITC 9 PE

CD105 PE

CD31 FITC CD34 FITC CD117 FITC 9 PE

CD14 PE CD45 FITC CD86 FITC 9 PE

CD133 PE

51

4.6. Expressão dos genes de indiferenciação celular

4.6.1. RT-PCR

As amostras de CUh foram analisadas quanto a caracterização da

expressão gênica de indiferenciação celular. As 21 amostras utilizadas neste

experimento apresentaram positividade para os genes Oct-4 e Nanog. As

células N-TERA foram utilizadas como controle positivo da reação uma vez que

a positividade desses genes já é bem conhecida. Para verificar a pureza do

material utilizado para este experimento foi realizado a amplificação da mesma

alíquota de água utilizada para as amostras (Figura15 e 16).

Figura 15 - Amplificação das amostras de CTM do CUh do gene endógeno Gusb (n=20). Células N-TERA foram utilizadas como controle positivo da reação.

Oct-4

Gusb

Controle + 2 7 8 9 10 11 13 14 15

H2O 13 15 19 20 21 30 31 32 33 34 35 36

Oct-4

Gusb

52

Figura 16 - Amplificação das amostras de CTM do CUh do gene Nanog (n=20). Células N-TERA foram utilizadas como controle positivo da reação.

Controle 2 9 11 14 20 8 15 10 7 + Nanog

Gusb

H2O 13 15 19 20 21 30 31 32 33 34 35 36

Nanog

Gusb

53

4.6.2. RT-PCR em tempo real

RT-PCR em tempo real foi realizado com amostras de CTM de CUh bem

como na N-TERA para verificar a expressão relativa dos genes MDR1 e LRP,

utilizando o GUSB como gene endógeno.

Figura 17 - Curva padrão utilizada para a padronização da reação. A) gene MDR1; B) gene LRP; C) gene GUSB. Quanto maior o coeficiente de correlação menos variável é a expressão gênica.

MDR1

LRP

GUSB

Coeficiente de variação

98%

Coeficiente de variação

89%

Coeficiente de variação

90%

54

A amplificação do gene MDR1 foi obtida nas células N-TERA,

confirmando assim a qualidade dos primers utilizados bem como a técnica

realizada. Do gene MDR1 somente 2 amostras amplificaram e ainda assim

fracamente. Com relação ao gene LRP foi observado em 16 amostras de 19 no

total. Resultados estão expressos na tabela 4.

Tabela 4 - Expressão relativa das amostras de CTM de CUh para os genes MDR-1 e LRP

Gene

Paciente MDR1 LRP

GW2 0,00 13,80

GW 7 0,00 5,60

GW 8 0,00 9,70

GW 9 0,00 0,00

GW 10 0,00 0,00

GW 11 0,00 20,70

GW 13 0,00 4,40

GW 14 0,00 13,60

GW 15 0,00 4,30

GW 19 0,00 0,00

GW 20 0,00 13,10

GW 21 0,00 1,90

GW 30 0,00 6,40

GW 31 0,06

GW 32 0,00

GW 33 0,00

GW 34 0,03 1,80

GW 35 0,00

GW 36 0,00

Média 0,005 6,807

Desv.Padrão 0,015 6,198

N-TERA 1,00 3,30

55

5. DISCUSSÃO

O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão dos genes de

resistência a múltiplas drogas em CTM do CUh. Para isto o trabalho foi

segmentado em duas partes: parte I foi realizada a caracterização das células

isoladas do processamento das amostras de CUh quanto à presença de CTM e

a parte II foi analisada a expressão gênica de proteínas relacionadas à

resistência a múltiplas drogas como P-gp e LRP e observado o comportamento

destas células frente ao quimioterápico doxorrubicina.

Os resultados da caracterização das células da GW demonstraram que

a população de células isolada pela técnica de explante de CUh coletados e

processados durante o presente estudo, possuem propriedades de CTM tais

como, morfologia fibroblastóide e aderência à superfície de cultivo; expressão

de marcadores de superfície de origem mesenquimal, bem como, a ausência

de marcadores de linhagens hematopoiéticos ou endoteliais; capacidade de

diferenciação in vitro em tecidos adiposo e ósseo após tratamento específico; e

a expressão de genes típicos de células indiferenciadas como Oct4 e Nanog.

Estes mesmos resultados foram descritos anteriormente por diferentes grupos,

dentre eles, Angelucci e colaboradores, onde observaram a presença de

células com morfologia fibroblastóide provenientes da GW bem como a

aderência ao plástico e o elevado nível de expressão de marcadores presentes

nas CTM (Angelucci et al, 2010). Baksh e colaboradores em um dos seus

estudos realizados em 2007, comparando as CTM derivadas de medula óssea

com as CTM derivadas de GW de CUh, observaram que as CTM derivadas da

56

GW também possuem um elevado potencial de expansão (Baksh et al, 2007,

Angelucci et al, 2010).

Outro trabalho realizado no inicio dos anos 90 foi realizado pelo grupo de

McElreavey onde observaram que o cultivo das CTM pela técnica de explante

apresentava células aderentes com morfologia fibroblastóide, sendo este um

dos critérios estabelecidos para determinar se uma célula pode ser definida

como célula multipotente. (McElreavey et al, 1991; Dominici et al, 2006). Com

isso, pode-se afirmar que a nossa técnica de isolamento de célula-tronco

derivadas da geleia de Wharton esta de acordo com as características citadas

por outros pesquisadores.

De acordo com a literatura, uma das características típicas das CTMs é

a habilidade de se diferenciarem em células oriundas dos três folhetos

embrionários. Diversos estudos sugerem que ao decorrer das passagens e

tempo em cultura estas células podem sofrer o processo de diferenciação em

diversos tipos celulares (Fauza, 2004; Kim et al., 2007). De acordo com o

trabalho de Kim e colaboradores as CTM derivadas do líquido amniótico ao

decorrer das passagens celulares apresentaram uma variação das

características fenotípicas bem como genotípicas das CTM (Kim et al., 2007).

Sendo assim, para evitar a presença de células de folhetos não mesodérmicos

no presente estudo, foi realizada uma padronização do número de passagens

ideias para a realização dos experimentos. Dessa maneira ficou estabelecido

que as células que se encontravam entre a segunda e quinta passagem

celular, seriam as escolhidas para a realização do presente estudo, uma vez

que foi observada uma diferença fenotípica nas CTM isoladas, bem como uma

57

diminuição da proliferação celular em passagens superiores a cinco. (Dados

não demonstrados).

Outra característica importante para determinar se as células isoladas

são realmente CTM é a plasticidade celular. Neste estudo, as células foram

induzidas por meio da utilização de meio específico para a diferenciação

osteogênica, e todas as amostras demonstraram características de formação

de cristais de cálcio na superfície visualizados por meio da coloração com

vermelho de Alizarina. As CTM também foram induzidas ao processo de

diferenciação adipogênica e todas as amostras demonstraram a presença de

vacúolos lipídicos citoplasmáticos, os quais foram visualizados por meio da

coloração específica por Oil Red-O. Estes resultados estão de acordo com

trabalhos realizados anteriormente pelo grupo de Nekanti. Este grupo relatou a

presença de vacúolos lipídicos em CTM derivadas da GW induzidas ao

processo de diferenciação adipogênica (Nekanti et al, 2010). Jonsdottir-Buch e

colaboradores também detectaram a presença de vacúolos lipídicos em CTM

derivadas de medula óssea por meio da coloração Oil Red-O e a presença de

osteócito pelo corante Vermelho de Alizarina (Jonsdottir-Buch, Lieder,

Sigurjonsson, 2013). Dariolli e colaboradores também constatou a presença de

cristais de cálcio pela coloração vermelho de alizarina em CTM derivadas de

tecido adiposo (Dariolli et al, 2013).

O tempo de dobramento também foi outro aspecto levado em

consideração. Roubelakis e seu grupo fizeram um estudo comparativo das

CTM derivada da medula óssea em relação às CTM derivadas do líquido

amniótico e foi observado um tempo de dobramento médio de 30 horas ± 4

horas (Roubelakis et al, 2007). Recentemente, de Lima Prata demonstrou que

58

células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical apresentavam um

tempo de dobramento de 38h ± 1,7 após serem congeladas. (de Lima Prata,

2012). Outro trabalho que demonstrou o tempo de dobramento em CTM

derivadas da GW foi do grupo de Nekanti, onde obtiveram 35.7 ± 22.5 h

quando cultivadas com o meio de cultura DMEM-HG (Nekanti et al, 2010).

Neste estudo, a CTM da GW cultivada em α-MEM foi possível observar um

tempo de dobramento de aproximadamente 30 horas, assemelhando-se assim

a outros trabalhos.

Para melhor caracterizar as CTM, além de avaliar o potencial de adesão

à superfície do plástico e os ensaios de diferenciação celular, também foi

utilizado um painel longo de anticorpos primários conjugados com fluorocromos

para determinar o perfil da população em questão. Este painel praticamente

excluía a presença de marcadores de células endoteliais (CD31), leucócitos

(CD14, CD45 e CD86) bem como de células-tronco hematopoiéticas (CD34 e

CD117). Em contra partida, as isoladas de GW apresentaram uma positividade

para os marcadores de CTM (CD90, CD105, CD29 e CD44), sendo estes bem

determinados pela literatura. Pittenger e colaboradores, em 1999 constataram

a presença de marcadores positivos para as linhagens mesenquimais em CTM

de medula óssea, como CD29, CD44 e CD90 e a ausência de marcadores de

linhagens hematopoiéticas, como CD14, CD34 e CD45 (Pittenger et al, 1999).

Fu e seu grupo, em 2006 detectou a presença desses mesmos marcadores

para CTM (CD29, CD44 E CD105) e a ausência de marcadores de linhagens

hematopoiéticas CD34 e CD45 em CTM derivadas da GW (Fu et al, em 2006).

Assim como Fu, Zhang e colaboradores demonstraram que as CTM derivadas

59

da GW expressaram marcadores positivos para CTM, CD90 e CD105 e

negativos para CTM, sendo estes CD14, CD45 e CD34 (Zhang et al, 2012).

Outro fator tão importante quanto os citados acima, é a determinação da

presença dos genes Oct-4 e Nanog, sendo estes importantes na manutenção

da plasticidade das células-tronco. Estes genes são expressos em células-

tronco embrionárias e nas células-tronco adultas. Regulam positivamente

genes responsáveis pelo fenótipo indiferenciado, e suprimem a transcrição de

genes indutores de diferenciação. Rodda e colaboradores sugeriram que o

Nanog é intimamente regulado pela expressão do Oct-4 (Rodda et al., 2005).

Diversos estudos demonstraram a presença desses genes, Oct4 e Nanog, em

célula-tronco mesenquimais isoladas de polpa dentária (Sukarawan et al,

2013), de líquido amniótico (Roubelakis et al, 2007) e inclusive em geleia de

Whaton de cor dão umbilical (Nekanti et al, 2010). Seguindo este pressuposto,

o presente estudo comprovou a presença desses genes em todas as amostras.

Com isso, a aderência ao plástico, à morfologia fusiforme, a capacidade

de plasticidade celular in vitro, a imunofenotipagem específica para determinar

as CTM bem como a presença de genes de indiferenciação celular, todos

esses fatores citados permitem dizer que as células isoladas da geleia de

Wharton de cordão umbilical são células possuem características de células-

tronco mesenquimais.

Após a comprovação da presença de células-tronco mesenquimais

derivadas da geleia de Wharton foi realizado o ensaio de viabilidade celular. Os

resultados obtidos mostraram que parte das células incubadas com o

quimioterápico doxorrubicina (DOX) apresentava sensibilidade ao mesmo

quando incubadas em menor concentração. Enquanto que a outra parte as

60

CTM incubadas com dose máxima de DOX apresentava uma resistência a

mesma droga. No entanto, as curvas de viabilidade e o IC50 apresentaram

variação entre as amostras coletadas de diferentes pacientes. Estes dados

sugerem que a resposta das CTM da GW ao quimioterápico doxorrubicina

pode depender de fatores individuais de cada doador.

Em geral, trabalhos mostraram que a doxorrubicina incubadas com

células-tronco promove um dano no DNA. Isto foi demonstrado em células

tronco mesenquimais (Cruet-Hennequart, 2012), em células-tronco

hematopoiéticas (Ito, 2004; Rossi 2007) e também em células-tronco

embrionárias (barta, 2010; Moncilovic, 2009). Li et al, demonstrou em seu

estudo realizado em 2004 que as CTM derivadas da medula óssea podem ser

resistentes à diferentes tipos de quimioterápicos, entre eles, metrotexato,

busulfan, entre outros e sensíveis à algumas drogas como a vincristina, alguns

agentes citotóxicos, entre outros. Ainda que estas células demonstrassem

sensibilidade foi possível observar uma recuperação parcial da população de

CTM (Li et al, 2004). Portanto, pode-se sugerir que pelo menos uma

porcentagem das CTMs derivadas da GW do CUh possuem o genótipo de

resistência à DOX.

Com relação aos genes de resistência a múltiplas drogas, no presente

estudo foi observada uma baixa expressão gênica do ABCB1 ou MDR1 nas

CTM da GW. É possível dizer que a não amplificação do gene MDR1 implique

na produção do seu produto, neste caso a P-gp. Sendo assim, esta proteína

que possui um papel secundário na defesa destas células naturalmente, assim

como a resposta a resistência as drogas (doxorrubicina).

61

Acredita-se que, as proteínas ABCB1 protegem as células-tronco de

uma variedade de genotoxinas e se encontram em máxima atividade nas

células com alta taxa replicativa. Diversos estudos, como o de Garrigues et al

realizado em 2002 e Kim et al realizado em 2007 sugerem que existem uma

relação entre a expressão dos transportadores ABC em células com

metabolismo acelerado, como células cancerosas, ou possivelmente células-

tronco em processo de autorrenovação.(Garrigues et al., 2002; Kim et al.,

2007).

O mecanismo pelo qual a P-gp confere proteção às CTM ainda não está

completamente elucidado. Entretanto, Challen & Little sugeriu em um estudo

realizado em 2006, que a P-gp possui papel fundamental na regulação da

morte celular, bem como a resistência aos quimioterápicos, (Challen & Little,

2006). Entretanto, existem evidências que as células podem também dispor de

outros artifícios para protegê-las. Ate o presente momento nenhum trabalho foi

publicado utilizando CTM de CUh.

Estes dados sugerem que as CTM da GW possuem outros mecanismos

de defesa eficientes contra a toxicidade do quimioterápico, como exemplo a

LRP.

Neste contexto, outro gene analisado foi a LRP. Polioudaki e

colaborados, em 2009 mostraram que a LRP é capaz de promover o transporte

nucleo-citoplasmático de diversos compostos, uma vez que, sua morfologia

peculiar e sua localização no citoplasma nuclear, favorecem esta função

(Polioudaki et al., 2009). Outro estudo, como o de Pessina e colaboradores, em

2011, sugeriram que estes pressupostos trazem novas perspectivas às CTM,

tais como o transporte de medicamentos, que associado à capacidade de

62

migração destas células dentro do organismo e tropismo por fatores

inflamatórios, podendo desta maneira tornar-se uma aplicação clínica muito

importante futuramente (Pessina et al., 2011). Neste contexto, a expressão

gênica da LRP no presente estudo foi alta em todas as amostras analisados.

Sendo assim, a LRP pode ser um fator importante na fisiologia e defesa das

CTM. Entretanto, não se sabe se a alta expressão da LRP é encontrada

naturalmente nas células da GW ou se o ambiente de cultivo levou à

superexpressão desse transportador.

Sendo assim, mais estudos são necessários para melhor esclarecer o

papel do LRP nas células-tronco mesenquimais.

63

6. CONCLUSÃO

A partir dos resultados apresentados conclui-se que:

1) Foi possível isolar as células a partir da geleia de Wharton de recém-

nascidos a termo, sendo estas com características de células-tronco

mesenquimais.

2) A população das células isoladas apresentou características de

células-tronco mesenquimais, determinadas pela presença de

marcadores de membrana celular específicos para célula-tronco

mesenquimal, capacidade de diferenciação celular in vitro, bem como

a expressão de genes de indiferenciação celular.

3) Uma vez que as células-tronco mesenquimais não apresentam

resposta ao agente citotóxico doxorrubicina, é possível que o

mecanismo envolvido seja o acúmulo do gene LRP observado,

levando à resistência a drogas, bem como, atuando na fisiologia e

defesa celular.

64

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