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Extrao, Purificao e Caracterizao da Leucina Aminopeptidase de

Spinacia oleracea

Gonalo Figueir1

1Departamento Cincias da Vida, Faculdade de Cincias e Tecnologia, Universidade de Coimbra.

Abstract A leucina Aminopeptidase (LAP) uma protease sernica que pode ser encontrada em diferentes organismos, tais

como o Spinacia oleracea (espinafre) e o Solanum tuberosum (batata). Utilizando folhas de espinafre e com o objetivo

de purificar esta protena, procedeu-se precipitao das protenas presentes no extrato inicial com sulfato de

amnia a 75% e dilise. Aps isto, de forma a obter a protena purificada realizou-se uma cromatografia de troca

aninica em QAE-Sephadex. Caraterizou-se esta protena procedendo a uma eletroforese em gel de

poliacrialamida 12.5% (SDS-PAGE), na qual obteve-se uma banda com massa molecular aparente de 60kDa, que

permitiu confirmar que a protena em estudo homohexamrica; e a uma zimografia, em que no obteve-se

qualquer degradao da gelatina, j que a protena era muito pesada (360 kDa) e possua uma reduzida densidade

de carga. A utilizao da L-leucina p-nitroanilina (Leu-pNa) como substrato da leucina Aminopeptidase,

possibilitou a realizao do estudo da atividade cataltica da enzima, do qual no se conseguiu obter o Km e Vmx.

Por ltimo, a purificao desta enzima teve um rendimento de 1,5 e um grau de pureza mximo de 0,98.

Palavras-chave: Leucina Aminopeptidase, Spinacia oleracea, espinafre, extrao, purificao, caracterizao, cromatografia de troca aninica

Introduo As aminopeptidases (EC 3.4.11.1-15) pertencem

ao grupo das exopeptidases, e, portanto, catalisam a

hidrlise da ligao peptdica no terminal amnico (N-

terminal) de protenas ou peptdeos. Estas enzimas

encontram-se amplamente distribudas pelo reino das

plantas e animal, sendo importantes em diversas

funes ao nvel celular, como por exemplo a

maturao de protenas e degradao hormonal e no-

hormonal de peptdeos. A classificao das diferentes

aminopeptidases feita de acordo com o nmero de

aminocidos clivados a partir do N-terminal do

substrato; a sua especificidade pelo substrato; a

localizao da enzima; a suscetibilidade a certos

inibidores (por exemplo a bestatina); a necessidade de

ies metlicos como cofatores; e, por fim, com o pH a

que a enzima possui maior atividade cataltica, isto , o

seu pH timo [1, 3, 5 e 16].

Das vrias aminopeptidases, a leucina

aminopeptidase (LAP; 3.4.11.1) catalisa a hidrlise de

resduos de leucina no N-terminal das protenas e

peptdeos. No entanto, a esta enzima no especfica

para o aminocido de leucina, j que tambm catalisa a

hidrlise de outros aminocidos hidrofbicos, como

por exemplo a arginina e a metionina. Esta enzima

considerada, estruturalmente, um homohexmero

(Figura 1) com uma massa molecular de 360 kDa, pelo

que cada subunidade possui um peso molecular de 60

kDa [3 e 7]. Em diferentes organismos, a estrutura

primria das subunidades muito semelhante,

nomeadamente no terminal carboxlico (C-terminal),

onde o zinco se encontra ligado, desta forma esta

enzima apresenta uma elevada conservao quer ao

nvel estrutural (especificidade do substrato) quer ao

nvel cataltico (mecanismo de reao catalisada).

Nas plantas a caracterizao da LAP, ao nvel

estrutural e funcional, tem sido realizada durante anos,

assim sendo que ela encontra-se melhor caraterizada

no tomate [7]. Esta enzima, na maioria das plantas,

participa em diversas funes fisiolgicas tais como na

defesa, no transporte de recetores de auxina e na

meiose. No entanto a sua principal funo sintetizar

novas protenas, organizando de forma diferente os

aminocidos de uma dada protena, e degradar

protenas no-funcionais (processo conhecido como

turnover). Devido a esta funo estas enzimas so,

Figura 1 Estrutura tridimensional da LAP e representao a cores das 6 subunidades que a constituem.

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muitas vezes, designadas como enzimas de

manuteno celular [7 e 11].

Neste trabalho efetuado, utilizou-se folhas de

espinafre da espcie Spinacia oleracea de forma a extrair

a enzima LAP, que encontra-se localizada no citosol,

mais precisamente no estroma dos cloroplastos desta

planta. Neste organismo, a atividade cataltica da LAP

mximo a pH 8,5 possuindo tambm um ponto

isoeltrico de 6,2. Ao possuir uma temperatura tima

no intervalo 4 60C, esta enzima pode ser

considerada termoestvel. A ativao desta enzima

pode ser feita na presena de caties metlicos como o

Mn2+ e Zn2+. Sendo, portanto, uma metaloenzima, esta

pode ser inibida por agentes quelantes como o EDTA,

a amastatina e a betastina [14]. Utilizando compostos

sintticos, principalmente amino acil-p-nitroanilina,

como por exemplo a Alanina p-nitroanilina, a Leucina

p-nitroanilina e a Lisina p-nitroanilina possvel

estudar cineticamente esta enzima [14]. Durante o

processo de extrao e purificao desta enzima a

partir da Spinacia oleracea, pensa-se que os pigmentos

podero ser os principais contaminantes.

Materiais e Mtodos Material. As folhas de espinafres frescos (Spinacia

oleracea) foram fornecidas pela docente responsvel

pela cadeira de Laboratrios de Enzimologia e

Qumica de Protenas, a Professora Paula Verssimo.

As solues tampo utilizadas no decorrer deste

projeto, nomeadamente, tampes 50 mM e 100 mM

Tris-HCl pH 8, foram preparadas pelo grupo de

trabalho, enquanto que as restantes solues, reagentes

e materiais de laboratrio foram disponibilizados pelo

Departamento de Cincias da Vida da Universidade de

Coimbra.

Preparao do extrato inicial. Fez-se a lavagem

das folhas escolhidas, e a tiragem das nervuras. No

final deste procedimento a massa total obtida foi de

221.5 g. Aps isto, procedeu-se triturao das folhas

em 170 mL de tampo 100mM Tris-HCl pH 8, de

forma obter uma soluo homognea, que foi filtrada

atravs de 8 camadas de gaze. Posteriormente

realizao de uma centrifugao a 8000 x g durante 10

minutos a 4C, desprezou-se o pellet, j que nele se

encontravam clulas intactas e organelos densos. Desta

mesma centrifugao obteve-se um sobrenadante com,

aproximadamente, 248 mL, dos quais 50 mL foram

armazenados para ensaios enzimticos e, cerca, de 198

mL utilizados para os restantes passos de purificao

da enzima.

Purificao da enzima Leucina

aminopeptidase. Com o objetivo de purificar a

enzima em estudo iniciou-se por precipitar as protenas

existentes no extrato inicial, de volume 198 mL, e por

realizar uma dilise, de acordo com Noriyuki Ogiwara

et al [12]. Nesta referncia a precipitao foi feita a uma

saturao 70%, no entanto adicionou-se 102.2 g de

(NH4)2SO2 ao extrato inicial, sob agitao constante,

obtendo, assim, uma saturao de 75%. Seguidamente

efetuou-se uma centrifugao a 10000 x g durante 12

minutos, na qual o pellet obtido foi recolhido e

guardado a 4C, para posterior utilizao.

Em seguida, o precipitado foi ressuspenso em 15

mL de tampo 100 mM Tris-HCl pH 8 e dialisado

overnight. Para a execuo da dilise foi usado uma

membrana de celofane semi-permevel, na qual

continha a nossa ressuspenso, num gobel com, cerca

de, 1 L de tampo 100 mM Tris-HCl pH 8, para que a

nossa protena no sofresse um choque osmtico. A

suspenso dialisada foi centrifugada a 7000 x g durante

10 minutos, com finalidade de remover o material

insolvel na mesma. O sobrenadante resultante desta

centrifugao foi recolhido e apresentava um volume

de 25 mL. Deste volume, 10 mL foram guardados para

ensaios enzimticos e os restantes 15 mL foram

aplicados na cromatografia de troca aninica, que

representa o passo seguinte do processo de

purificao.

A cromatografia de troca aninica foi efetuada

utilizando uma coluna de 50 x 10 mm de QAE-

Sephadex, que um trocador forte, e o seu equilbrio

foi realizado com tampo 50 mM Tris-HCl pH 8. Aps

este equilbrio foram aplicados os 10 mL de dialisado e

recolheu-se um volume de 12 de mL, que designou-se

por carregamento. Ao realizar lavagens com o mesmo

tampo foram recolhidas fraes de 2 mL.

Paralelamente, fez-se a leitura das absorvncias a 280

nm destas fraes usando um espectrofotmetro

UV/visvel. Iniciou-se a eluio com um gradiente

crescente de NaCl (0-1M) depois de se observar que

valor de absorvncia era inferior a 0,1. Para tal, usaram-

se, cerca de, 16 mL de soluo de NaCl (com

concentrao 1 M) e um volume igual de tampo de

equilbrio. Durante esta eluio, continuou-se a

recolher fraes 2 mL e a realizar as leituras da

absorvncia a 280 nm.

Ensaios Enzimticos. Com o objetivo de

estudar a atividade proteoltica da LAP monitorizou-se

espectrofotometricamente, durante 2 minutos a 405

nm, a formao do produto da reao catalisada. Este

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procedimento ocorreu em conformidade com Bernard

Erlanger et al [6]. O substrato usado nos diversos

ensaios enzimticos foi a L-leucina p-nitroanilina, e

portanto a libertao p-nitroanilina foi detetada por

espectrofotometria [15].

Para cada passo de purificao (extrato inicial,

precipitao com (NH4)2SO2 e cromatografia de troca

aninica) realizou-se um ensaio enzimtico. No extrato

inicial, na precipitao e no carregamento utilizou-se

40 L de amostra e 10 L de substrato, enquanto para

as pools usou-se um volume superior de amostra, 200

L. Tal como Bernard Erlanger et al [6], considerou-se

que o coeficiente de extino molar, a 405 nm, para

pNa de 8800 M-1cm-1, valor este usado nos clculos

da atividade especfica e total.

Estudo da Cintica Enzimtica. Foram,

igualmente, realizados ensaios enzimticos, nos quais

variou-se a concentrao de substrato, com o objetivo

de calcular os parmetros cinticos da enzima (Km e a

Vmx), tal como Zoran Vujcic et al [15]. Tendo em

conta que a soluo de Leu-pNa usada possua uma

concentrao de 10 mg/mL, as concentraes

utilizadas variaram entre os 884 M e 72.2 M.

Quantificao. A concentrao das protenas

nas amostras foi determinada atravs do mtodo do

Bio-Rad, que baseado no mtodo de Bradford (1976)

[2]. No entanto alterou-se o comprimento de onda de

absoro para o valor mais prximo da 595 nm a que

espectrofotmetro conseguia ler, a 655 nm. Optou-se

como protena padro a IgG, j que abrange uma maior

gama de concentraes que a BSA e a nossa protena

encontrava-se a concentraes relativamente elevadas.

Eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE).

A eletroforese SDS-PAGE foi efetuada segundo o mtodo de Laemmli modificado (1970) [9], utilizando uma concentrao de 12,5% em poliacrilamida no gel de separao, e 4% no gel de concentrao.

As amostras a aplicar no gel foram preparadas com uma soluo desnaturante (8M Ureia, 4% SDS, 200mM Tris-HCl pH 8.0, 2% mercaptoetanol, 0,01% Bromofenol azul) numa diluio de 1:1.

A corrida eletrofortica decorreu durante aproximadamente 1 hora, tendo sido aplicado uma voltagem de 180V. Aps a eletroforese, o gel foi revelado com Coomassie Blue R-250, de forma a verificar a eficcia da purificao.

Zimografia. Paralelamente eletroforese, foi

realizada tambm uma zimografia para as mesmas

amostras, de acordo com Lebber [10]. Foi utilizado

nesta tcnica um gel de poliacrilamida a 12,5% e uma

concentrao final de gelatina (substrato de proteases)

de 1 mg/mL. Como o objetivo principal desta tcnica

detetar atividade proteoltica, as amostras foram

aplicadas no gel numa diluio 1:1 com tampo de

carregamento (125 mM Tris-HCl pH 6,8 contendo 4%

SDS (v/v) e 20% glicerol (v/v)).

A zimografia ficou a correr juntamente com a

eletroforese, a 180 V durante 1 hora, em tampo de

eletroforese. Posteriormente corrida, o gel foi lavado

duas vezes com tampo de renaturao (0,25% (v/v)

Triton X-100 em tampo 100 mM Tris-HCl pH 7,5).

Cada lavagem durou, cerca de, 15 minutos e utilizou 50

mL de tampo de renaturao. Aps isto, o tampo de

renaturao foi substitudo por tampo fresco e

procedeu-se incubao overnight. No final, lavou-se o

gel com gua destilada e revelou-se com Coomassie

Blue R-250, de modo anlogo ao efetuado para a

eletroforese.

aA utilizao do Mtodo de Bradford permitiu determinar a concentrao proteica.

bA utilizao da Leu-pNa como substrato da enzima LAP permitiu detetar a atividade enzimtica, a pH 8.

1 Unidade de atividade = 1 mol pNa formada/min. pNA (=405nm)=8800 M-1cm-1

Tabela 1: Passos purificao da Leucina Aminopeptidase de folhas de espinafre Spinacia

oleracea.

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Resultados e Discusso Purificao da Leucina Aminopeptidase

O processo de purificao da enzima LAP

encontra-se sumariado na tabela 1.

A partir de 221,5 g de folhas de espinafre extraiu-

se a enzima, obtendo uma concentrao proteica de

8,57 mg/mL (tabela 1).

A fase seguinte consistiu na precipitao com

(NH4)2SO2 a 75%, seguida de uma centrifugao e

dilise. A adio do sal permitiu a precipitao de

protenas, diminuindo as interaes entre estas e a gua

(processo designado por salting-out), enquanto a dilise

promoveu sada do sal, utilizando uma membrana

semipermevel. Este passo de purificao teve como

objetivo principal concentrar a nossa protena e

podemos verificar, pela tabela 1, isso mesmo (C =23.9

mg/mL). No entanto, devido grande descida de

rendimento (100% para 14.4%) pode-se considerar

que esta etapa foi o passo limitante do processo de

purificao da LAP. Esta diminuio deveu-se

precipitao da grande parte das protenas, incluindo a

LAP.

Finalmente, seguiu-se a cromatografia de troca

aninica, em que utilizou-se como matriz a QAE

Sephadex. Esta matriz sendo um quaternrio amino-

etil (QAE), isto , que possui carga positiva, permitiu a

ligao forte de protenas com carga oposta. O

equilbrio da coluna foi feita com tampo 50 mM Tris-

HCl pH 8, e a este pH a nossa protena apresenta carga

negativa, j que o seu ponto isoelctrico 6,2. A

interao da protena com a nossa coluna possibilitou

que ficasse retida, facilitando a eliminao de outras

protenas. Para retirar a LAP da coluna efetuou-se uma

eluio com NaCl em tampo de equilbrio por

gradiente continuo (0 1 M). Ao analisarmos o perfil

cromatogrfico (Figura 2) apercebemo-nos que com as

lavagens com tampo 50 mM Tris-HCl pH 8 existiu a

diminuio da absorvncia a 280 nm, ou seja a sada de

protenas que no se fixaram coluna da matriz. Aps

aplicao do gradiente de sal, a absorvncia a 280 nm

aumentou existindo, portanto, a sada da nossa

protena. Podemos tambm notar que os valores de

absorvncia ultrapassaram o limite a que o

espectrofotmetro conseguia ler (Abs (280nm) = 3),

no sendo possvel observar a existncia de um pico de

absoro. Obtiveram-se estes valores, porque

possivelmente existia contaminao com pigmentos.

Assim, tornou-se necessrio efetuar clculos de

atividade total para cada frao para concluir onde se

encontrava a nossa protena (Figura 2).

Aps os clculos de atividade total, resolveu-se

formar duas pools: a 1 Pool foi formada a partir

fraes 48 54 mL, dando um volume total de 8 mL;

enquanto a 2 Pool foi formada a partir das fraes 56

e 58 mL, dando um volume total de 4 mL. Pela tabela

1, verificamos que a juno das fraes no permitiu a

purificao da protena, originando um grau de pureza

0,98 para a 1 pool e 0,68 para 2 pool. Estes valores

no foram superiores a 1, j que existia contaminao

com outras protenas. Pela tabela 1, pode-se ver, ainda,

que existiu uma perda significativa de protenas ao

longo do processo de purificao, pois a 1 Pool e 2

Pool apresentaram, respetivamente, um rendimento de

1.5% e 0,2%, valores estes muito baixos.

0

10

20

30

40

50

60

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 700

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5A

tivi

dad

e to

tal (

x10

-3U

)

Volume de eluio (mL)

Ab

s a

28

0 n

m

Figura 2 Cromatograma da Cromatografia de troca aninica em QAE-Sephadex do extrato proteico obtido da precipitao com sulfato de amnia a 75% e da dilise. As absorvncias a 280 nm das fraes foram medidas na lavagem tampo 50 mM Tris-HCl pH 8

( ) e aps o gradiente de sal 0 1 M ( ). A atividade total ( ) foi calculada graas degradao do substrato de Leu-pNa, que foi monitorizada a 405 nm. Os ensaios enzimticos realizados durante 3 minutos possuam: 200 L de amostra, 20 L de substrato e 800 L de tampo 50mM Tris-HCl pH8.

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No carregamento, os valores de rendimento

(8,8%) e do grau de pureza (1,35) foram superiores aos

das pools, o que significa que nem toda a LAP aplicada

na coluna interagiu com a matriz da QAE-Sephadex,

sendo, por isso, recolhida logo ao incio da

cromatografia. Este acontecimento pode ser explicado

devido existncia de uma grande quantidade proteica

no precipitado (239 mg) comparativamente aos

nmero de locais de ligao na matriz, que no foram

os suficientes. Assim, seria necessria aplicar um

volume menor de precipitado na coluna, ou fazer um

coluna com um volume maior de matriz, para que fosse

possvel a reteno de toda a protena aplicada. Pensa-

se, ainda, que a existncia dos principais contaminantes

(os pigmentos fotossintticos) possa ter influenciado

estes valores, pois estes podem ocupar os locais de

ligao, impossibilitando a interao da LAP com a

nossa matriz.

Para verificar a eficcia do processo de purificao

fez-se uma SDS-PAGE, e os resultados desta

encontram-se na Figura 3.

Como dito anteriormente a enzima em estudo

possui uma estrutura homohexamrica, e cada

monmero tem um peso molecular de 60 kDa.

Quando a enzima se encontra num ambiente

desnaturante, neste caso na presena de SDS, esta

dissocia-se nas suas subunidades. Podemos, ento,

corresponder na Figura 3 a banda de peso molecular

aparente de 60kDa ao monmero da enzima.

Podemos, tambm, constatar que a nossa enzima se

encontra presente em todos os passos de purificao,

incluindo o carregamento, pelo que houve perdas da

LAP ao longo deste processo. Portanto conseguiu-se

purificar de forma parcial a protena LAP.

Se compararmos a intensidade das bandas do poo

B com as de E, por exemplo, observamos que a

concentrao proteica diminuiu ao longo do processo

de purificao, nomeadamente de 8.57 mg/mL para

1.63 mg/mL.

Para alm da banda da LAP, conseguimos

observar outras bandas correspondentes a outras

protenas que no se conseguiram eliminar. As bandas

que se encontram na zona dos 32 kDa podero

corresponder protena light-harvesting chlorophyll a

(LHCPa) (36 kDa) e protena light-harvesting

chlorophyll b (LHCPb) (32 kDa), que so complexos

que possuem clorofilas e outras molculas

fotossensveis e, por isso, apresentam um mximo de

absoro nos 400-500 nm [4].

De forma avaliar atividade proteoltica da LAP

efetuou-se uma zimografia, e os resultados desta

encontram-se na Figura 4.

Com o objetivo de estudar a atividade da LAP a

zimografia utiliza condies no-desnaturantes, desta

forma a LAP no se dissocia nas suas formas

monomricas, mantendo, por isso, a estrutura

homohexamrica (360 kDa). Ao analisarmos os

resultados, podemos verificar que nossa enzima no

degradou a gelatina, como devia. Isto poder ter

ocorrido devido ao seu grande peso molecular de 360

kDa e sua baixa densidade de carga a pH 8,8, retendo-

Figura 3 Eletroforese em condies desnaturantes (SDS) das amostras enzimticas nos diferentes passos de purificao de LAP. Poo A Padro de pesos moleculares: 5 L; Poo B Extrato inicial: 10 L; Poo C Precipitado com sulfato de amnia 75%: 10 L; Poo D Carregamento: 10 L; Poo E, F 1 Pool: 10 L e 5 L, respetivamente; Poo G, H 2 Pool: 10 L e 5 L, respetivamente.

Figura 4 Zimograma obtido em gel de 12,5% de poliacrilamida co-polimirizado com gelatina. Poo A Extrato inicial: 10 L; Poo B - Precipitado com sulfato de amnia 75%: 10 L; Poo C - Carregamento: 10 L; Poo D - 1 Pool: 10 L; Poo E 2 Pool: 10 L.

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se nos poos. A utilizao de um gel com uma

concentrao 12,5% de poliacrilamida (um pequeno

tamanho dos poros relativamente ao tamanho da

protena), tambm, poder ter dificultado a migrao

da nossa protena, o que permite explicar as bandas

transparentes no incio dos poos.

Pode-se confirmar, pela Figura 4, a existncia de

uma protease capaz de degradar a gelatina no

precipitado com sulfato de amnia a 75% (poo B). A

grande concentrao proteica no precipitado (23.9

mg/mL) comparativamente ao resto das amostras,

poder ser a razo pela qual s conseguimos assistir a

degradao da gelatina no precipitado.

Parmetros cinticos.

Para determinar os parmetros cinticos da enzima

LAP, nomeadamente o Km e a Vmx, foram

realizados vrios ensaios enzimticos em que se variou

as concentraes de substrato (884 M; 710 M; 180

M; 72,2 M). Sabe-se que a enzima em estudo segue

uma cintica de Michealis-Menten, desta forma para

obteno dos parmetros utilizou-se um grfico de

Eadie-Hofster (y=mx+b), que permite retirar o Km da

enzima pelo declive da reta (m=-Km) e o Vmx pela

ordenada na origem (b=Vmx). Podemos observar na

Figura 5 que o declive da reta positivo, pelo que nos

d um Km negativo (-21,769). Este valor no

corresponde realidade, j que no possvel existir

uma concentrao negativa de substrato a que a enzima

possua metade da velocidade mxima. Pode-se,

portanto, afirmar, pelos resultados obtidos, que no foi

possvel determinar nem o Km e nem o Vmx da

enzima em estudo.

A Leucina Aminopeptidase pode ser encontrada

em outros organismos que no a Spinacia oleracea, como

referido anteriormente. Esta enzima j foi

caracterizada na Solanum tuberosum, onde possui um Km

igual a 9,25 M [15]. Enquanto que na Fagopyrum

esculentum e na Gonyaulax polyedra, a enzima foi descrita

por possuir um Km igual a 140 M [8 e 13]. Admitindo

que o Km da LAP da Spinacia oleracea ronda estes

valores, as concentraes utilizadas foram maiores que

o Km, pelo que a enzima podia estar a catalisar a reao

de degradao sua velocidade mxima, neste caso

aproximadamente a 1,26 nmol/min.

Concluso 2

Atravs dos resultados obtidos possvel observar

que a LAP do espinafre foi parcialmente purificada,

devido a uma grande perda ao longo do processo de

purificao e existncia de alguns contaminantes aps

a cromatografia, nomeadamente as protenas light-

harvesting chlorophyll.

Na cromatografia efetuada, o carregamento

apresentou um maior grau de pureza e rendimento que

as pools devido ao reduzido tamanho da coluna, pelo

que seria necessrio utilizar um maior volume de

matriz, de forma a permitir uma maior reteno da

LAP e melhores resultados.

de referir que no foi possvel determinar os

parmetros cinticos da enzima, mas

comparativamente com outras LAP de outros

organismos o Km poder ser muito pequeno e

portanto, seria necessrio um espectrofotmetro mais

sensvel para esclarecer esta questo.

Por fim, foi possvel, a partir deste trabalho,

comprovar afirmaes iniciais, como por exemplo a

estrutura homohexamrica da LAP e a sua capacidade

de hidrolisar o substrato sinttico Leu-pNa. Desta

forma, este trabalho contribuiu uma melhor

compreenso da LAP, o que poder ser importante

para futuros estudos relacionados com as suas funes

e possveis aplicaes.

y = 21,769x + 1,0879R = 0,8004

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025

v (n

mo

l/m

in)

v/[S] (nmol/ min/M)

Figura 5 Grfico de Eadie-Hofster da atividade enzimtica da LAP da Spinacia oleracea.

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