Aluno: Eliane de Oliveira SilvaTítulo: “Estudos sobre o metabolismo microbiano de naftoquinonas e avaliação da citotoxicidade dos metabólitos obtidos”Orientador: Profa. Dra. Niege Araçari Jacometti Cardoso furtadoData da Defesa: 07/02/2014

RESUMOSILVA, E. O. Estudos sobre o metabolismo microbiano de naftoquinonas e avaliação da citotoxicidade dos metabólitos obtidos. 2014. 187f. Tese (Doutorado). Faculdade de ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. - Muitas naftoquinonas como o lapachol, podem ser encontradas em plantas da família Bignoniaceae e são conhecidas por desempenharem diversas atividades biológicas, acompanhadas, entretanto, por efeitos indesejáveis. A atividade citotóxica apresentada pelas naftoquinonas está relacionada ao aparecimento de espécies reativas de oxigênio in vivo que causam severo estresse oxidativo no interior das células. O isolapachol e a atovaquona são análogos estruturais do lapachol, sendo que a atovaquona é comercializada como fármaco para o tratamento de malária e certos tipos de pneumonia. Devido ao grande potencial biológico apresentado pelas naftoquinonas, várias tentativas no sentido de obtenção de derivados desprovidos de efeitos colaterais vêm sendo realizadas. Além disso, a determinação da segurança e eficácia dos fármacos está intimamente ligada ao estudo da formação de derivados in vivo por ocasião do metabolismo. A utilização de fungos filamentosos na predição do metabolismo que os fármacos sofreriam após administração oral, bem como de bactérias do trato gastrointestinal, pode contribuir substancialmente para a elucidação da rota metabólica de fármacos fornecendo informações sobre a geração de substâncias farmacologicamente ativas, inativas ou tóxicas e ainda sobre a produção de substâncias capazes de inibir a biotransformação de outros fármacos. Estudos de biotransformação também podem contribuir para a obtenção de novos esqueletos químicos. Dessa forma, o presente trabalho relata estudos do metabolismo microbiano do lapachol e do seu sal de potássio por bactérias do trato gastrointestinal e fungos filamentosos, além da correlação desses com as reações que ocorrem quando o isolapachol e a atovaquona são utilizados como substratos para os mesmos micro-organismos. Os experimentos de biotransformação utilizando lapachol e seu sal de potássio foram conduzidos por até dez dias, em diferentes meios de cultura, empregando-se quatro linhagens de bactérias presentes no trato gastrointestinal, além de 11 linhagens de fungos filamentosos. Foram obtidos sete metabólitos, sendo dois inéditos e dois anteriormente detectados em estudos sobre o metabolismo do lapachol em mamíferos. Durante a realização dos experimentos com o fungo filamentoso Aspergillus brasiliensis verificou-se a capacidade desse fungo em mimetizar uma reação muito importante em química orgânica, conhecida como oxidação de Hooker. As condições mais promissoras para a biotransformação do lapachol foram utilizadas nos estudos com a atovaquona e o isolapachol. A biotransformação da atovaquona possibilitou, pela primeira vez, a caracterização estrutural de um metabólito desse fármaco. Já os estudos realizados com o isolapachol permitiram inferências sobre a especificidade enzimática apresentada pelos micro-organismos avaliados. Todos os metabólitos obtidos foram submetidos aos ensaios de citotoxicidade frente a linhagens celulares normais e tumorais, o que possibilitou obter conclusões sobre a relação estrutura-atividade e sobre a citotoxicidade seletiva apresentada pelos metabólitos. Destaca-se o resultado obtido com um dos metabólitos do lapachol, α-xiloidona, o qual se mostrou mais tóxico para a linhagem tumoral que o lapachol e não apresentou toxicidade frente à linhagem normal. O metabólito obtido a partir da biotransformação da atovaquona apresentou maior toxicidade não seletiva que a substância de partida. Palavras-chave: Naftoquinona, Biotransformação, Citotoxicidade.

ABSTRACTSILVA, E. O. Microbial metabolism studies of naphthoquinones and cytotoxicity evaluation of the obtained metabolites. 2014. 187f. PhD tesis. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. Several naphthoquinones, as lapachol, can be found in the Bignoniaceae family and they present several biological activities with some unwanted effects. The cytotoxic activity displayed by naphthoquinones is correlated to the presence of reactive oxygen species, which are formed in vivo and cause severe oxidative stress within cells. Isolapachol and atovaquone are structural analogs of lapachol, and atovaquone is in the market as a drug for the treatment of malaria and some types of pneumonia. Because of the great biological potential presented by naphthoquinones, several studies have been carried out to obtain derivatives without side effects. Furthermore, the drug safety and efficacy are closely related to the study of the formation of in vivo derivatives during metabolism. The filamentous fungi and the bacteria from the gastrointestinal tract can be used in the prediction of drug metabolism after oral administration, which is an interesting tool to elucidation of the metabolic pathway of drugs, providing information on the generation of pharmacologically active, inactive or toxic substances and still on the production of compounds able to inhibit the biotransformation of other drugs. Biotransformation studies can also contribute to the obtention of new chemical skeletons (hits). Thus, the present work reports the study about the microbial metabolism of lapachol and its potassium salt by filamentous fungi and bacteria from the gastrointestinal tract, beyond the correlation of the reactions that occur when the isolapachol and atovaquone are used as substrates for the same microorganisms. The biotransformations of lapachol and its potassium salt were evaluated for up to ten days, in different culture media, catalyzed by four bacteria from the gastrointestinal tract and 11 filamentous fungi strains. Seven metabolites were obtained, from which two are new and two were previously detected in the mammals metabolism of lapachol. The filamentous fungus Aspergillus brasiliensis showed to be capable of mimicking the Hooker oxidation, an important organic chemistry reaction. The best conditions for the lapachol biotransformation have been used in the studies with isolapachol and atovaquone. The atovaquone biotransformation provided, for the first time, the structural characterization of a metabolite from this drug. The studies with isolapachol allowed inferences about the enzyme specificity shown by the evaluated microorganisms. All obtained metabolites were submitted to cytotoxicity assays against human cancer and tumoral cell lines. Several conclusions about the structure activity relationship and about the selective cytotoxicity showed by the metabolites were taken. It should be highlighted the obtained result with a lapachol metabolite, α-xyloidone, which showed to be more toxic than lapachol against tumoral cell line and did not show cytotoxicity to normal cell line. The atovaquone metabolite displayed higher toxicity than pattern structure, and this activity was not selective. Key words: Naphthoquinone, Biotransformation, Cytotoxicity

Aluno: Lucas Rossi Sartori Título: “Avaliação do metabolismo in vitro da budleína A e correlatos”Orientador: Prof. Dr. Norberto Peporine LopesData da Defesa: 07/02/2014

RESUMOSARTORI, L. R. Avaliação do metabolismo in vitro da budleína A e correlatos. 2013. 111p. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.A busca por novos fármacos inspirados em substâncias de origem natural é uma estratégia conhecida e há tempos utilizada. As lactonas sesquiterpênicas (LST) são um grupo de substâncias amplo e diverso com várias atividades farmacológicas descritas, e cuja característica estrutural determinante é a de um esqueleto principal contendo 15 átomos de carbono e um anel lactônico. O mecanismo de ação das LST está intrinsicamente relacionado com reações de adição do tipo Michael frente a biomoléculas, provocando alquilações. Há na literatura estudos aprofundados sobre a química medicinal das LST, entretanto pouco há sobre o metabolismo desse grupo de substâncias em ambientes fisiológicos. Neste sentido, este trabalho é focado no estudo do metabolismo e também das vias de fragmentação por eletrospray da budleína A, que possui estrutura química do tipo furanoeliangolido, e pertence à classe dos germacranolidos. Foram realizados ensaios in vitro utilizando-se os modelos de oxidação biomimética com metaloporfirina, microssomas hepáticos e metabolismo pela microbiota intestinal de ceco de porco (pig cecum model), sendo nos dois últimos testado também o correlato 4 ,5-dihidro-2’,3’-epoxi-15-desoxigoyazensolido. O estudo de fragmentação também abordou a comparação entre budleína A e a centraterina - um estereoisômero que se diferencia apenas pela orientação da cadeia lateral ligada ao C-8 - em espectrômetros distintos e com suporte de métodos computacionais para cálculos de energia (Gaussian 03 em base B3LYP/6-31G(d)). Nos estudos de fragmentação observou-se a diferença de intensidade dos sinais para íons fragmento comuns às duas LST (m/z 275, 257 e 83), além da presença do íon fragmento de m/z 293 apenas para a budleína A, permitindo a diferenciação destes isômeros por meio de espectrometria de massas com ionização por eletrospray, sem a necessidade de ressonância de magnética nuclear. Os produtos de oxidação detectados na reação com metaloporfirinas acusaram a epoxidação na cadeia lateral envolvendo C-2’ e C-3’ com a formação de diastereoisômeros. No ensaio com microssomas não foram detectados produtos para a budleína A, enquanto que para a substância correlata observou-se a abertura do epóxido na cadeia lateral e adição de uma hidroxila, formando um diol vicinal. No modelo de ceco de porco observaram-se a formação de adutos de LST com o aminoácido cisteína, os quais foram posteriormente degradados pela ação da microbiota intenstinal, dando origem a diversos metabólitos compostos pela LST e partes de cisteína. Sendo assim, este trabalho lança bases para a maior compreensão do metabolismo de LST do tipo furanoeliangolido em modelos distintos e também contribui para os estudos de espectrometria de massas para este tipo de substância, além de descrever uma ferramenta analítica útil na diferenciação de dois estereoisômeros.Palavras-chave: Lactona sesquiterpênica, budleína A, modelo do ceco de porco, estereoisômeros, microssomas, metaloporfirinas, metabolismo biomimético

ABSTRACTSARTORI, L. R. Evaluation of the in vitro metabolism of budlein A and correlates. 2013. 111p. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.The search for new drugs inspired on compounds from natural products is a wellknown strategy with several successful cases. Sesquiterpene lactones (STL) are a wide and diversified group of compounds which has already many pharmacological activities reported. Their fundamental moiety includes a skeleton containing 15 carbons and a lactone ring and the mechanism of action is related to Michael addition type reactions with biomolecules, promoting alkylation. There are a high amount of studies regarding the medicinal chemistry of the STL, however there are few information about the metabolism of these compounds under physiological environments. On this way, the aims of this work are focused on the study of themetabolism as well as the fragmentation pathways of budlein A, which is a furanoheliangolide and belongs to the germacranolides class. On this work the following experiments were carried out: in vitro oxidative metabolism with metalloporphyrin and microsomes; intestinal metabolism by using the pig cecum model (microbiota). For microsomes and intestinal metabolism the compound 4 ,5-dihydro-2’,3’-epoxy-15-deoxy-goyazensolide was also applied. Fragmentation studies compared the fragmentation patterns of budlein A and centratherin – which is a stereoisomer with -orientation for the side chain bonded at C-8 – by using differentspectrometers being supported by computational methods for energies calculations (Gaussian 03 at level B3LYP/6-31G(d)). For the fragmentation studies it was observed the difference of signal intensities for fragment ions which are common for both STL (m/z 275, 257 e 83), moreover the ion m/z 293 was detected only for budlein A, allowing the differentiation between these isomers by electrospray ionization mass spectrometry instead nuclear magnetic resonance. The reactions with metalloporphyrin yielded two diastereoisomers of the STL with an epoxide at the side chain between C-2’and C-3’. On the microsome assay any product was detected for budlein A, while for the correlated compound the epoxide ring was opened and ahydroxyl was added at C-3’, forming a vicinal diol. On the pig cecum model it was observed the formation of adducts due to the reaction of the STL and the amino acid cysteine. These adducts were later degraded by the action of the microbiota yielding different metabolites composed by STL and residues of cysteine. Thus, this work may contribute to the improvement of the knowledge about the metabolism of STL furanoheliangolide type in different models as well as for the studies regarding the mass spectrometry of this type of compound. The development of a useful analytical tool for the differentiation of two isomers was also an important achievement.Keywords: sesquiterpene lactone, budlein A, pig cecum model, stereoisomers, microsome, metalloporphyrin, biomimetic metabolism

Aluno: Ricardo Augusto Pereira de Pádua Título: “Caracterização estrutural e funcional das isoformas da enzima fumarato hidratase de Trypanosoma cruzi”Orientador: Prof. Dr. Maria Cristina Nonato CostaData da Defesa: 14/03/2014RESUMOPEREIRA DE PÁDUA, R. A. Caracterização estrutural e funcional das isoformas da enzima fumarato hidratase de Trypanosoma cruzi. 119 f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado que ao infectar seres humanos causa a doença de Chagas, uma doença tropical negligenciada que afeta milhões de pessoas no mundo todo. As fumarato hidratases (FH), ou fumarases, são enzimas que catalisam a reação estéreo-específica reversível de hidratação do fumarato em S-malato, e foram recentemente consideradas essenciais para a viabilidade do parasito Trypanosoma brucei, sugerindo seu potencial como alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos tripanocidas. O presente trabalho visou à caracterização funcional, bioquímica, biofísica e estrutural das fumarases de T. cruzi (TcFHs) e humana (HsFH) de forma a avaliar o papel das TcFHs para o parasito Trypanosoma cruzi, mapear o mecanismo de ação e identificar as diferenças entre TcFHs e a enzima humana de forma a serem exploradas no planejamento de inibidores seletivos às fumarases do parasito. Análise das sequências mostrou que TcFHs pertencem à classe I das fumarases (enzimas diméricas dependentes de ferro) e não são homólogas à HsFH que pertence a classe II (tetraméricas independentes de ferro). Estudos de localização celular confirmaram a existência de duas fumarases em T. cruzi, uma citosólica (TcFHc) e uma mitocondrial (TcFHm), e experimentos de nocaute gênico sugeriram que essas enzimas são essências para o parasito. A caracterização cinética das enzimas TcFHc, TcFHm e HsFH mostrou que as fumarases de T. cruzi são sensíveis ao oxigênio enquanto a enzima humana se mantém ativa em condições aeróbicas. Estudos de ressonância eletrônica paramagnética mostraram a presença de um cluster de ferro-enxofre, sensível a oxidação por oxigênio, envolvido no mecanismo enzimático das enzimas TcFHs. Modelos estruturais das TcFHs, construídos por homologia à estrutura cristalográfica da fumarase de Leishmania major, foram comparados à estrutura cristalográfica obtida para a fumarase humana e as diferenças entre as duas estruturas foram utilizadas no planejamento de ligantes seletivos às fumarases do parasito. O ligante planejado inibiu a fumarase citosólica de T. cruzi na faixa de 1 μM e não apresentou efeito na atividade da enzima humana. Testes in vivo demonstraram o efeito tripanocida do inibidor provavelmente por interferir na produção de ATP pela mitocôndria do T. cruzi. Os resultados obtidos com o desenvolvimento desse projeto apresentam uma proposta inovadora no desenvolvimento de novas terapias contra a doença de Chagas, o uso da enzima fumarase como alvo macromolecular, assim como apresenta um inibidor potente e seletivo para a enzima do parasito a ser utilizado como protótipo no desenvolvimento de fármacos contra Trypanosoma cruzi. A síntese de moléculas análogas ao inibidor de forma a melhorar suas propriedades farmacológicas encontra-se em andamentoPalavras-chave: Fumarase, Fumarato hidratase, T. cruzi, doença de Chagas, inibidor seletivo, estrutura cristalográfica.

ABSTRACTPEREIRA DE PÁDUA, R. A. Structural and functional characterization of Trypanosoma cruzi fumarate hydratase isoforms. 119 f. Thesis (Doctorate). School of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto – University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Trypanosoma cruzi is a flagellate protozoan parasite that infects humans and causes Chagas disease, a tropical neglected disease that affects millions of people worldwide. Fumarate hydratases (FH), or fumarases, are enzymes responsible for the reversible stereo-specific hydration of fumarate into S-malate, and were recently considered to be essential to Trypanosoma brucei viability, suggesting, therefore, a potential role for FHs as macromolecular targets to the drug development against trypanosomatids. The present work focused on the functional, biochemical, biophysical and structural characterization of T. cruzi fumarases (TcFHs) and human fumarase (HsFH) to evaluate TcFHs role for T. cruzi, map the reaction mechanism and identify and exploit differences between the parasite and host enzymes in order to design selective inhibitors to the parasite enzyme. Sequence analysis revealed that TcFHs belong to class I fumarases (dimeric and iron-sulfur containing enzymes) and are not homologous to HsFH which belongs to class II fumarases (tetrameric iron independent enzymes). Cellular sub-localization studies confirmed the presence of a cytosolic and a mitochondrial fumarases in T. cruzi and gene knockout experiments suggested TcFHs are essential to the parasite. The kinetic characterization showed that TcFHs activity is highly sensitive to oxygen whereas HsFH activity remained stable in aerobic conditions. Electron paramagnetic experiments further revealed the presence of an iron-sulfur cluster highly sensitive to oxidation and involved in the catalytic mechanism in both TcFHm and TcFHc. TcFHs structural models, built by homology modeling using the Leishmania major fumarase crystal structure as template, were compared to the HsFH crystal structure and the differences were used to design a selective ligand to the parasite fumarases. The designed ligand showed to inhibit TcFHc with an IC50 of 1 μM and showed no effect on the human fumarase activity. In vivo assays using T. cruzi epimastigotes demonstrated the trypanocidal effect of the designed inhibitor probably caused by stalling ATP production. The results obtained with the development of this project represent an innovative proposal on the development of new therapies against Chagas disease, the use of fumarase enzyme as a macromolecular target, as well as present a potent and selective inhibitor to the parasite enzyme to be further used as a prototype in the development of drugs against Chagas disease. The synthesis of inhibitor analogues with optimized pharmacological properties are currently in progress.Keywords: fumarase, fumarate hydratase, Chagas disease, selective inhibitors, crystal structure.

Aluno: Tales Alexandre da Costa e Silva Título: “Produção e imobilização de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii para aplicações biotecnológicas”Orientador: Prof. Dr. Wanderley Pereira de OliveiraData da Defesa: 16/04/2014

RESUMOCOSTA-SILVA, T. A. Produção e imobilização de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii para aplicações biotecnológicas. 2014. 231f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.O objetivo desse trabalho foi avaliar estratégias de imobilização de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii através do uso de suportes não convencionais (subprodutos agroindustriais e quitosana). Investigou-se o uso de equipamentos de secagem (estufa, leito de jorro, leito fluidizado, liofilizador e “spray dryer”) para desidratação dos derivados imobilizados obtidos. A imobilização por ligação covalente, usando glutaraldeído, epicloridrina e metaperiodato de sódio como agentes ligantes, apresentou valores para retenção da atividade enzimática superiores à imobilização por adsorção e encapsulação. Nos ensaios de imobilização utilizando glutaraldeído e secagem em leito de jorro, os melhores valores obtidos foram para a celulose microcristalina com retenção da atividade enzimática de 179,1%, seguido da casca de arroz 173,9%. A palha de milho foi o melhor suporte na imobilização covalente e secagem em estufa, com retenção de mais de 100% da atividade enzimática inicial. Na secagem por liofilização houve destaque para a casca de arroz (163,6%) seguida de palha de milho (157,2%) e cana de açúcar (154,6%). Utilizando quitosana como suporte e secagem em leito fluidizado, o valor para a retenção da atividade enzimática foi de 93,9% empregando-se o glutaraldeído como agente ligante. Na secagem do sistema quitosana-lipase em estufa a retenção da atividade enzimática foi de 68,2% e para secagem por liofilização esse valor foi superior a 80,0%. Realizou-se a caracterização dos materiais utilizados como suportes e estes apresentaram área superficial relativamente alta, elevada porosidade e estrutura constituída de macroporos. Estas características foram importantes por proporcionar a obtenção da enzima imobilizada com alta retenção da atividade catalítica. Alguns parâmetros bioquímicos e cinéticos da lipase na forma livre foram diferentes da lipase imobilizada. A alteração mais evidente foi a afinidade ao substrato (Km), que se mostrou dependente do protocolo de imobilização utilizado. Avaliou-se o potencial de aplicação biotecnológica dos derivados imobilizados que apresentaram maior retenção da atividade enzimática. Para a lipase imobilizada em casca de arroz o rendimento de transesterificação (produção de biodiesel) foi superior a 96,0% após 72 horas de reação enquanto que para as microesferas de quitosana esse valor foi atingido após 120 horas. Os produtos obtidos da transesterificação do óleo de coco estão de acordo com a especificação da Agência Nacional de Petróleo (ANP). Na avaliação da atividade de esterificação, a máxima concentração de butirato de butila foi obtida após 6 horas de reação, correspondendo a uma taxa de conversão de aproximadamente 99,0%, quando utilizou-se quitosana como suporte. Para o uso da casca de arroz, a máxima concentração de butirato de butila foi obtida também após 6 horas de reação, correspondendo a uma taxa de conversão de 92,5%. Este trabalho demonstrou que suportes de baixo custo permitiram a obtenção de derivados imobilizados com características semelhantes àqueles obtidos com o uso de polímeros sintéticos, os quais apresentaram excelente potencial para síntese de biodiesel e de butirato butila.Palavras-chave: Lipase; Imobilização de enzimas, Secagem, Subprodutos agroindustriais, Quitosana.Produção e imobilização de lipases produzidas pelo fungo endofítico C. kikuchii ii

ABSTRACTCOSTA-SILVA, T.A. Production and immobilization of lipases produced by the endophytic fungus Cercospora kikuchii for biotechnological applications. 2014. 231f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.The objective of this study was to evaluate strategies for immobilization of lipases produced by the endophytic fungus Cercospora kikuchii through the use of unconventional supports (agroindustrial by-products and chitosan). The use of different drying process (oven, spouted bed, fluidized bed, freeze drying and spray drying) for dehydration of immobilized derivatives obtained by adsorption, covalent binding and encapsulation was investigated. The covalent immobilization (using glutaraldehyde, epichlorohydrin and sodium metaperiodate as crosslinking agents) was the best process for the enzymatic activity retention. For covalent immobilization using glutaraldehyde and spouted bed drying, the best values were obtained for microcrystalline cellulose with enzymatic activity retention of 179.1%, followed by rice husk and corn straw with 173.9% and 169.8%, respectively. Corn stover was the best support in the covalent immobilization and oven drying, with retention 100.0% of the initial enzyme activity. For freeze-drying rice husk was the best support (163.6%) followed by corn stover (157.2%), sugar cane bagasse (154.6%) and corn cob (129.5%). Utilizing chitosan as support and fluidized bed drying, the value for the retention of enzymatic activity was 93.9% employing glutaraldehyde as activating agent. For chitosan-lipase drying using oven, the enzymatic activity retention was 68.2% and using freeze-drying the retention of enzymatic activity was higher than 80.0%. The support characterization was carried out and showed high surface area, high porosity and macropore structure. These characteristics were important for providing immobilized derivatives with high catalytic activity retention. Some biochemical and kinetic parameters of lipase in free form were different from the immobilized lipase. The most important changes was the substrate affinity (Km) which was dependent of immobilization protocol used. The last experimental part of this study was the biotechnological applications of the best immobilized derivatives produced. For the immobilized lipase onto rice husk the transesterification yield (biodiesel production) was above 96.0% after 72 hours of reaction while for the use of chitosan microspheres this value was reached after 120 hours. The viscosity values for the biodiesel samples are in accordance with specifications recommended by Brazilian Petroleum Agency (ANP) to be used as biofuel. The immobilized derivatives catalytic power was measured in terms of esterification activity too. The maximum concentration for butyl butyrate was obtained after 6 hours, corresponding to conversion rate of 99.0% when chitosan was used as support. Using rice husk, the maximum butyl butyrate concentration was obtained after 6 hours of reaction, corresponding to conversion rate of 92.5%. This work demonstrated that cheap supports are biocompatible with lipases, rendering immobilized derivatives with characteristics similar to or better than those previously obtained with synthetic polymers. The immobilized derivatives showed excelente potential for biodiesel production and butyl butyrate synthesis.Keywords: Lipase, Enzyme immobilization, Drying, Agroindustrial by-products, Chitosan.

Aluno: Rodrigo Molina Martins Título: “Influência de micro e nanopartículas lipídicas sólidas na eficácia de formulações fotoprotetoras bioativas”Orientador: Prof. Dr. Luis Alexandre Pedro de FreitasData da Defesa: 22/04/2014RESUMOMARTINS, R. M. Influência de micro e nanopartículas lipídicas sólidas na eficácia de formulações fotoprotetoras bioativas. 2014. 181f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014O presente trabalho teve o objetivo de desenvolver uma formulação tópica contendo os filtros solares benzofenona-3 e avobenzona microencapsulados em associação com filtro solar não encapsulado octocrileno e nanoparticulas lipídicas sólidas contendo rutina (formulação completa) e avaliar a eficácia fotoquimiopreventiva dessa formulação usando biópsias de pele humana e pele reconstruída in vitro. Microparticulas lipídicas sólidas contendo grandes quantidades de filtros solares, benzofenona-3 e avobenzona foram obtidas pela técnica do spray congealing com propriedades adequadas para aplicação tópica. Além disso, o processo de microencapsulação foi capaz de diminuir a penetração de benzofenona-3 na pele, aumentar a estabilidade da avobenzona frente à radiação ultravioleta A e a capacidade fotoprotetora desses filtros microencapsulados em formulações tópicas quando expostos a radiação ultravioleta. Nanopartículas lipídicas sólidas contendo o flavonóide rutina foram produzidas pelo processo de homogeneização a alta pressão e suas condições foram otimizadas pelo método da desejabilidade rendendo nanopartículas lipídicas sólidas com tamanho médio de 74,22 ±2,77 nm, índice de polispersividade de 0,161±0,03 e eficiência de encapsulação de 98,90 ±0,25 %. Em adição, as nanopartículas mostraram serem capazes de proteger a viabilidade celular de fibroblastos de ratos L929 irradiados com radiação ultravioleta A e B. Para a eficácia fotoquimiopreventiva a formulação completa foi capaz de evitar/diminuir a formação de células apoptóticas, caspase-3, dímeros de ciclobutanodipirimidina, metaloproteinases e peroxidação lipídica em pele humana e pele reconstruída expostos a UVB. O processo tecnológico de microencapsulação e nanoencapsulação dos ativos avaliados mostrou ser eficaz, não comprometendo as propriedades de fotoproteção dos filtros solares e rutina, apresentando resultados similares ou melhores do que as formulações contendo os ativos na forma livre. Portanto, o desenvolvimento de formulações contendo ativos microencapsulados e nanoencapsulados é uma alternativa interessante para o emprego em produtos comerciais para proteção solar, por diminuir as características indesejáveis como penetração e instabilidade, melhorando as propriedades fotoprotetoras e evitando a necessidade de desenvolver novos compostos com propriedades fotoprotetoras.Palavras-chaves: micropartículas lipídicas sólidas, nanopartículas lipídicas sólidas, filtro solar, pele reconstruída, pele humana.

ABSTRACTMARTINS, R. M. Influence of solid lipid micro and nanoparticles on the efficacy of bioactive photoprotective formulations. 2014. 181f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014This study aimed the pharmaceutical development of a topical formulation containing an association of microencapsulated sunscreens benzophenone-3 and avobenzone, free sunscreen octocrylene and rutin flavonol solid lipid nanoparticles (complete formulation). This formulation was assessed for photochemoprotective ability using human skin obtained surgically and reconstructed human skin. Solid lipid microparticles containing large amounts of sunscreens benzophenone-3 and avobenzone were obtained by the spray congealing technique under conditions that allowed the manufacture of microparticles with suitable properties for topical application. The microencapsulation conditions were also able to reduce the penetration of benzophenone-3 through the skin, enhanced the stability of avobenzone against the ultraviolet radiation (UVR) and increased the photoprotective ability of both filters in topical formulations exposed to UVR. Solid lipid nanoparticles containing rutin were produced by the high pressure homogenization process whose conditions were optimized using the desirability method, yielding nanoparticles with size of 74.22 ± 2.77 nm, polispersivity index of 0.161 ± 0.03 and encapsulation efficiency of 98.90 ± 0.25%. In addition, the nanoparticles were able to avoid the death of L929 mice fibroblasts exposed to UVR A and B. For the photochemopreventive ability studies, the complete formulation was able to reduce/avoid the induction of apoptotic cells, caspase-3, CPDs, metalloproteinases and lipid peroxides in human skin obtained surgically and reconstructed human skin in vitro exposed to UVB.Thus, the micro and nanoencapsulation solved some intrinsic problems related to sunscreens and rutin without, however, compromising their photohemoprotective ability, since the results showed similar or better efficacy when compared to the formulations containing actives in free form. Therefore, the development of formulations containing microencapsulated and nanoencapsulated compounds is an interesting alternative for employment in commercial products for sun protection by decreasing the undesirable characteristics, such as penetration and instability, improving the photoprotective properties and avoiding the need to develop new compounds with photoprotective characteristics.Keywords: solid lipid microparticles, solid lipid nanoparticles, sunscreens, reconstructed skin, human skin.

Aluno: Fernanda Oliveira das ChagasTítulo: “Cultura mista, manipulação química e genética de micro-organismos: estratégias para a diversificação do metabolismo secundário”Orientador: Profa. Dra. Monica Tallarico PupoData da Defesa: 24/04/2014RESUMOCHAGAS, F. O. Cultura mista, manipulação química e genética de micro-organismos: estratégias para a diversificação do metabolismo secundário. 2014. 339p. Tese. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Recentes estudos genômicos têm mostrado que vários fungos e bactérias possuem um potencial biossintético superior à quantidade de metabólitos secundários já isolados desses micro-organismos. A descoberta de produtos naturais inéditos e bioativos é limitada pela impossibilidade dos micro-organismos expressarem todas as suas rotas biossintéticas em laboratório. Assim, estratégias alternativas para induzir a produção de produtos naturais microbianos são necessárias. A utilização de culturas mistas de micro-organismos é uma estratégia que vem sendo recentemente utilizada, na tentativa de mimetizar condições mais naturais de crescimento. Além disso, a adição de moduladores químicos e epigenéticos às culturas microbianas também pode potencialmente estimular a produção de compostos de interesse, seja por ativar mecanismos celulares em resposta à condição de estresse, ou por alterar a taxa de transcrição de certos genes, em função de mudanças no grau de enovelamento da cromatina. Alternativamente, a indução de certos genes, e até mesmo a diversificação do metabolismo secundário, podem ser conseguidos através de engenharia genética, pela manipulação direta de genes de interesse. A linhagem endofítica Alternaria tenuissima SS77, selecionada para os experimentos de modulação química e epigenética, teve seu metabolismo secundário alterado após o tratamento com diferentes moduladores. Provavelmente, o efeito observado ocorreu em função de uma eliciação inespecífica dos diferentes moduladores. Além disso, o cultivo misto desse fungo com o fungo endofítico Nigrospora sphaerica SS67, isolada da mesma planta hospedeira (Smallanthus sonchifolius), levou ao isolamento de dois novos policetídeos, da classe das perilenequinonas, juntamente com um já relatado na literatura científica. Para realizar os cultivos microbianos mistos, envolvendo uma linhagem bacteriana e uma fúngica, três linhagens de actinobactérias e cinco de fungos, todos endofíticos da planta Lychnophora ericoides, foram selecionadas. Alterações no perfil metabólico da cultura mista de Phomopsis sp FLe6 com Streptomyces albospinus RLe7 foram as mais evidentes e por isso a maioria das investigações foram focadas nessa cultura mista. Várias condições de cultivo foram testadas e diferentes resultados foram obtidos. Em alguns casos, o desenvolvimento da linhagem fúngica foi inibido pela bacteriana, e em outros, foi observado o inverso. Da mesma forma, houve acentuada inibição da produção de alguns metabólitos secundários na presença da linhagem desafiadora, mas também foi verificada a eliciação de outros. Os extratos das culturas simples desses micro-organismos também apresentaram relativas alterações nos perfis metabólicos em função das condições de cultivo. Os metabólitos produzidos pelo fungo Phomopsis sp FLe6 e pela actinobactéria Streptomyces albospinus RLe7 foram isolados e caracterizados. Os resultados mostram que as interações entre os micro-organismos endofíticos são bastante complexas, estando sujeitas a ação de diversos fatores externos que muitas vezes não podem ser pré-determinados. Por isso, estabelecer um cultivo misto adequado, do ponto de vista da eliciação da produção de metabólitos secundários, pode requerer uma série de tentativas. Ainda assim, os resultados almejados podem ser conseguidos utilizando essa estratégia. Diferentemente das linhagens endofíticas, manipuladas quimicamente através de diferentes estratégias, a linhagem sequenciada de Fusarium heterosporum ATCC 74349, foi manipulada geneticamente para a construção de um gene biossintético híbrido pks-nrps, contendo a porção nrps do gene híbrido

da equisetina e um pks críptico de Aspergillus fumigatus. Era esperado que a linhagem hibridizada fosse capaz de produzir o metabólito secundário geneticamente planejado, entretanto, após seu cultivo, esse produto não foi detectado nos extratos, e as possíveis razões são discutidas. Ainda que os resultados esperados não tenham sido obtidos, estudos que contribuam para a ampliação do entendimento das megassintases fúngicas são de extrema valia. Palavras-chave: biossíntese de produtos naturais, culturas mistas de endofíticos, engenhariagenética de fungos filamentosos, metabolismo secundário, modulação química e epigenética.

ABSTRACTCHAGAS, F. O. Mixed culture, chemical and genetic manipulation of microorganisms: strategies for diversifying the secondary metabolism. 2014. 339p. Thesis. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Recently, genetic studies have shown that several bacteria and fungi hold a greater biosynthetic potential than the amount of secondary metabolites isolated from these microorganisms. The discovery of novel bioactive natural products is limited by the inability of microorganisms to express all their biosynthetic pathways in laboratory conditions. Therefore, alternative strategies to induce the production of microbial natural products are required. Mixed cultures of microorganisms are a strategy that has been used to mimic more natural conditions of growth. Furthermore, the addition of chemical and epigenetic modulators to the microbial cultures can also stimulate the production of compounds by activating cellular mechanisms in response to stress conditions or by changing the transcription rate of certain genes, due to changes in the chromatin folding. Alternatively, the induction of some genes, and even the diversification of secondary metabolism, can be achieved by genetic engineering, by manipulating genes of interest. The endophytic strain Alternaria tenuissima SS77, which was selected for the experiments of chemical and epigenetic modulation, had changed its secondary metabolism after treatment with different modulators. Probably, the observed effect was due to a nonspecific elicitation of those modulators. Moreover, the mixed cultures of this fungus with the endophytic fungus Nigrospora sphaerica SS67, isolated from the same host plant (Smallanthus sonchifolius), led to the isolation of two new polyketides, belonging to perylene quinone class, along with another one already reported in the scientific literature. Three strains of actinobacteria and five fungi, all endophytes of Lychnophora ericoides, were selected to grow in microbial mixed cultures comprising one bacteria and one fungus. Changes in the metabolic profile of the mixed culture of Phomopsis sp. FLe6 with Streptomyces albospinus RLe7 were the most obvious, and then further studies were focused on this mixed culture. Many culture conditions were analyzed and different results were obtained. In some cases, the development of the fungal strain was inhibited by bacteria, and in other cases was observed the opposite. Similarly, there was a remarkable inhibition of the production of certain secondary metabolites in the presence of the challenging strain, but the eliciting of others was also observed. The extracts of the single cultures of these microorganisms also showed changes in metabolic profiles due to culture conditions. The metabolites produced by the fungus Phomopsis sp. FLe6 and the actinobacteria S. albospinus RLe7 were isolated and characterized. The results show that interactions between endophytic microorganisms are quite complex and are influenced by various external factors that often can not be previously

determined. Therefore, establishing a suitable mixed culture to elicit the production of secondary metabolites may require some attempts. Still, the expected results can be achieved using this strategy. Unlike the endophytic strains, that was chemically manipulated by different strategies, the sequenced strain Fusarium heterosporum ATCC 74349 was genetically manipulated to construct a hybrid PKS-NRPS biosynthetic gene containing the NRPS portion of the hybrid gene of equisetin and a cryptic PKS gene of Aspergillus fumigatus. It was expected that hybridized strain could be able to produce the secondary metabolite genetically planned, however, after its cultivation, this product was not detected in any extracts, and some possible reasons are discussed. Although the expected results have not been obtained, studies that contribute to increasing the understanding of fungal megasynthases are extremely valuable. Keywords: biosynthesis of natural products, mixed culture of endophytes, genetic engineeringof filamentous fungi, secondary metabolism, chemical and epigenetic modulation.

Aluno: Lílian Pereira FrancoTítulo: “Acoplamento quantum dot/complexos nitrosilos de Rutênio em transferência eletrônica vetorial e em análise de imagem. Aspectos químicos e biológicos relacionados à produção de óxido nítrico”Orientador: Prof. Dr. Roberto Santana da SilvaData da Defesa: 24/04/2014ResumoFRANCO, L. P. Acoplamento quantum dot/complexos nitrosilos de Rutênio em transferência eletrônica vetorial e em análise de imagem. Aspectos químicos e biológicos relacionados à produção de óxido nítrico. 2014. 185 f. Tese (Doutorado - Programa de Pós-graduação em Química e FísicaBiológica) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - SP, 2014.Oxido nítrico (NO) é uma molécula que participa de várias atividades fisiológicas no organismo, entre as quais incluem-se ação vasodilatadora e antitumoral. Entretanto sua resposta biológica é dependente da concentração, que quando alta apresenta citotoxicidade. Um fator limitante para sua aplicação em sistemas biológicos é seu curto tempo de meia vida no organismo, o que direcionou os estudos de complexos de rutênio-nitrosilo (RuNO) como doadores de NO. Complexos RuNO apresentam interesse especial devido suas propriedades termoestáveis e fotoquímicas. O uso da luz como um estímulo externo torna-se vantajoso pela capacidade de controlar-se a localização, o tempo de liberação da droga e a dosagem. A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido aplicada na terapia clínica contra o câncer. TFD depende da concentração de oxigênio para a produção de espécies reativas, o que é limitado em alguns tipos de tumores devido a hipóxia. Os Pontos quânticos (PQs), semicondutor nanocristalino, destacam-se como materais funcionais com propriedade ópticas únicas dependentes do tamanho. Podem atuar como antenas na captação de luz e fotossensibilização de complexos rutênio-nitrosilo para a liberação de moléculas bioativas. Neste trabalho descrevemos a síntese e caracterização de diferentes PQs (CdS, CdSe e CdTe) utilizando diferentes agentes passivantes (ATG, TOPO e AMP)e a síntese e caracterização do complexo rutênio-nitrosilo cis-[Ru(NO)(4-amp)(bpy)2]3+ (4-amp= 4-aminopiridina; bpy = 2,2’ bipiridina. Estudos das propriedades fotofísicas e avaliação fotoquímica da interação entre PQ e RuNO foram realizados como também a avaliação da atividade citotóxica desta associação sobre cultura de células de melanoma murino B16-F10. As medidas das propriedades fotofísicas demonstraram interação pela supressão da fluorescência analisada pela equação de Stern-Volmer. Pela determinação do número de sítios de ligação ( 2) e a constante de ligação (kb) verificou-se que a interação entre as espécies apresentaram supressão da emissão em um gráfico não linear de Stern-Volmer resultante do processo de agregação entre os compostos. Os dados obtidos corroboram para o mecanismo proposto, demonstrando que cada PQ540 interage com duas moléculas de RuNO. Ainda observou-se que, sob irradiação na região do visível, em 532 nm, aumenta-se o número de mols de NO liberado de no mínimo 6 vezes quando irradiado na presença de PQs comparado à irradiação do complexo sozinho em solução. O processo de transferência eletrônica fotoinduzida foi proposto como o mecanismo fotoquímico para a liberação de NO, enquanto que o processo de transferência de energia mostrou-se desfavorável devido a não sobreposição entre os espectros de absorção do complexo nitrosilo e o espectro de emissão do PQ. As análises de imagem fluorescentes demonstraram o potencial dos PQs como marcadores celulares. As concentrações utilizadas nos experimentos não demonstraram toxicidade sobre as células de melanoma murino na ausência de luz. Porém quando irradiadas, apresentaram citotoxicidade parcial. Portanto, essatransferência pode ocorrer pela redução do NO+ para NO0, seguida pela liberação de NO ou por fotoaquação e consequente fotoredução do nitrito em solução.Palavras-chave: 1. Quantum dot 2. Complexos de Rutênio 3. Transf. Eletrônica

AbstractFRANCO, L. P. Coupling quantum dot / nitrosyl ruthenium complex in electron transfer vector and image analysis. CHemical and biological aspects related to production of nitric oxide.. 2014. 185 f. Thesis (Ph.D. - Postgraduate program in Physical and Biological Chemistry) - Faculty of Pharmaceutical Science of Ribeirao Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto- SP, 2014.Nitric oxide (NO) is a molecule involved in many physiological activities inhuman body among them include vasodilator and antitumoral. However, the biological response is concentration dependent and in high concentrations it causes cytotoxicity. A limiting factor for biological applications is the short half-life of NO in the body which has led to the research of nitrosyl ruthenium complexes (RuNO) as NO donors. RuNO complexes are of special interest because of their thermal stability and photochemical properties. The use of light as an external stimulus is advantageous as we can track the location, timing of drug release and dosage. Photodynamic therapy (PDT) has been used in clinical therapy for cancer treatment. PDT depends on oxygen concentrations for reactive oxygen species production what is limited in some types of tumors because of hypoxia. The Quantum dots (QDs), semiconductor nanocrystal, as functional materials, possess unique optical size-dependent properties. QDs can act as antennas in capturing light and photosensitizing ruthenium- nitrosyl complexes for release of bioactive molecules. In this work we describe the synthesis and characterization of different PQs (CdS, CdSe and CdTe) using different passivating agents (TGA, TOPO and MPA), the synthesis and characterization of ruthenium- nitrosyl complex cis-[Ru(NO)(4- amp)( bpy )2]3+ (4 -amp = 4 - aminopyridine; bpy = 2,2 ’bipyridine). The photophysical properties and photochemical evaluation from the interaction between QD and RuNO were done as well the citotoxicity activity from thi association on murine melanoma cell line B16-F10 . Measurements of photophysical properties show interactions by the quenching of fluorescence plotted with the Stern-Volmer equation. By determining the number of binding sites (2) and the binding constants ( kb ) it was found that the interaction between the species presented an emission suppression in a nonlinear curve Stern- Volmer plot resulted by the aggregation process between both compounds. The data corroborates the proposed mechanism that QD540 interacts with two molecules of RuNO. It was also observed that under irradiation in the visible region, 532 nm, that moles of NO released increases at least 6 times when irradiated in the presence of QDs compared to the irradiation of the RuNO complex alone in solution. The process of photo induced electron transfer was proposed as the mechanism for photochemicalrelease of NO while the process of energy transfer was deemed unfavorable due to no overlap between nitrosyl complex absorption and the QD emission spectrum. The fluorescence image analysis demonstrated the potential of QDs as cell markers. The concentrations used in the experiments have not shown toxicity on murine melanoma cells in the absence of light. However when irradiated, QDs exhibited partial cytotoxicity. Therefore, this transfer may occur by the reduction of NO+ to NO0, followed by the release of NO or photoaquation and subsequent photoreduction of nitrite in solution.Key-words: 1. Quantum dot 2. Ruthenium complex 3. Electronic transfer

Aluno: Ricardo Pereira RodriguesTítulo: “Caseína quinase 1 como alvo para o planejamento de fármacos em mal de Alzheimer”Orientador: Prof. Dr. Carlos Henrique Tomich de Paula da SilvaData da Defesa: 09/05/2014

RESUMORODRIGUES, R. P. Caseína quinase 1 como alvo para o planejamento de fármacos em mal de Alzheimer. 2014. 98f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva, caracterizada pela perda de neurônios corticais e subcorticais. Padrões patológicos da doença de Alzheimer incluem a presença de lesões neurofibrilares que consistem no acúmulo da proteína β-amilóide e dos emaranhados neurofibrilares, decorrentes da hiperfosforilação da proteína Tau.Apenas dois grupos principais de fármacos são utilizados para o tratamento da DA, osinibidores colinesterásicos e antagonistas do receptor N-metil-D-aspartato. Entretanto, a fosforilação de proteínas pelas proteínas cinases constituem um dos principais mecanismos pelos quais as células se utilizam para regular seu metabolismo e demais funções e desequilíbrios nestas atividades estão relacionados a uma infinidade de doenças. O número elevado de isoformas de proteínas cinases 1 (CK1) encontradas na DA e sua associação em marcadores de lesões neurodegenerativas indicam sua participação nas etapas finais da degeneração, comum tanto à DA quanto a outras desordens neurodegenerativas. A abordagem da proteína CK1 como alvo terapêutico para a DA é promissora uma vez que os compostos usuais utilizados para diminuir a produção de β-amilóide também bloqueiam a quebra de outras proteínas, causando graves efeitos colaterais. Cada vez mais as ferramentas de bioinformática vêm sendo utilizadas como auxílio na redução de custos e tempo para as pesquisas. Dentre estas técnicas destaca-se a triagem virtual, que reúne um conjunto de técnicas utilizadas de forma sequencial com o objetivo de selecionar compostos protótipos para os alvos desejados. Neste trabalho, foram utilizadas técnicas de triagem virtual baseada em ligantes e estrutura, a partir de uma base de 500 mil compostos, selecionando 35 compostos com perfil de atividade inibitória para a enzima CK1. Destes, os compostos 24, 25, 36, 39 41 e 42 apresentaram resultados significativos com relação ao potencial de inibição da enzima CK1δ. Entre aqueles que já foram submetidos a ensaios de inibição enzimática, 25 apresentou seletividade para CK1δ, com 40% de inibição. Para aqueles compostos com melhor potencial de inibição à concentração de 10 μM será determinado o IC50 e uma extensa análise dos resultados será realizada futuramente.Palavras-chave: Caseína cinase 1, triagem virtual, Alzheimer

ABSTRACTRODRIGUES, R. P. Casein kinase 1 as a target for drug design in Alzheimer's disease. 2014. 98f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by loss ofcortical and subcortical neurons. Pathological patterns of Alzheimer's disease include the presence of neurofibrillary lesions consisting of the accumulation of amyloid-β protein and the neurofibrillary tangles, resulting of hyperphosphorylated Tau protein. Only two major groups of drugs are used for treatment of AD, cholinesterase inhibitors and antagonists of Nmethyl- D-aspartate receptor. The phosphorylation of proteins by protein kinases constitute one of the major mechanisms which cells use to regulate their metabolism and imbalances in these activities are related to a series of diseases. The high number of isoforms of protein kinase 1 (CK1) found in AD and its association with neurodegenerative markers of indicate their participation in the final stages of degeneration, common to both AD and other neurodegenerative disorders. The approach of CK1 protein as a therapeutic target for AD is promising as the usual compounds used to reduce the production of amyloid-β also block the breakdown of other proteins, causing severe side effects. Increasingly, bioinformatics tools have been used as an aid in reducing costs and time to research. Among these techniques highlights the virtual screening, which includes a set of techniques used sequentially with the aim of select compounds prototypes for the desired target. Ligand and structure-based virtualscreening techniches from a 500 thousand database resulted in 35 selected with inhibitory profile for CK1 enzyme were used in this study. The compounds 24, 25, 36, 39 41 and 42 hadsignifican potential for CK1δ enzyme inhibition. Among those submitted to enzyme inhibition assays, compound 25 showed selectivity for CK1δ , with 40 % inhibition. For those compounds with the best inhibitory concentration at 10 mM and the IC50 will be given an extensive analysis of the results will be held in the future . Keywords: Casein kinase, virtual screening, Alzheimer.

Aluno: Marília Oliveira de AlmeidaTítulo: “Avaliação do efeito de moduladores epigenéticos na biossíntese de produtos naturais em fungos”Orientador: Profa. Dra. Monica Tallarico PupoData da Defesa: 02/07/2014RESUMOALMEIDA, M. O. Avaliação do efeito de moduladores epigenéticos na biossíntese de produtos naturais em fungos. 2014. 211f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.A manipulação seletiva de alvos epigenéticos usando pequenas moléculas inibidoras das enzimas histona-desacetilases (HDACs) e DNA metiltransferases (DNMTs) é uma estratégia para estimular a expressão das vias biossintéticas e a produção de novos metabólitos secundários em fungos. Neste trabalho, inibidores de histonadesacetilases (butirato de sódio, ácido hidroxâmico suberoilanilida e ácido valproico) e inibidores de DNA metiltransferases (5-azacitidina, hidralazina, procaína e procainamida) foram suplementados em culturas líquidas e sólidas dos fungos endofíticos Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 e Chaetomium globosum VR10, das linhagens comerciais Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 e Chaetomium globosum ATCC 56726 e do fitopatógeno Botrytis cinérea B0510. O fungo endofítico H. corrugata FLe8.2, em meio PDB, produziu o composto 2-(2-metoxifenil)-4H-piran-4-ona, e sua cultura em meio Czapek suplementada com hidralazina levou ao isolamento de 3-metil-1,2,4-triazolo[3,4-a]-ftalazina. O tratamento de F. oxysporum SS46 e F. oxysporum ATCC MYA 4623 com hidralazina em meio Czapek levou ao isolamento de um novo composto, 2H-[1,2,4]triazino[3,4-a]-ftalazina. Nestas culturas houve biotransformação da hidralazina pelos fungos, provavelmente como mecanismo de desintoxicação. Ainda, a hidralazina teve um efeito inibidor sobre a biossíntese do ciclohexadepsipeptídeo beauvericina em F. oxysporum SS46. Nas culturas de C. globosum VR10 em meio Czapek os inibidores de HDACs e de DNMTs suprimiram a biossíntese de chaetoglobosinas. A adição de ácido valproico na cultura de C. globosum VR10 em meio PDB eliciou a produção da chaetoviridina B. A adição de 5-azacitidina nas culturas de C. globosum VR10 em meio sólido PDA não modificou a produção da chaetoglosina A. A produção de chaetoviridina B por C. globosum ATCC 56726 em meio PDA foi inibida na menor concentração de 5-azacitidina, 50 M, e retomada na concentração de 150 M. O tratamento de B. cinerea B0510 com ácido hidroxâmico suberoilanilida SAHA levouà biossíntese de um novo composto, ácido 5-benzil-2,3-di-hidroxi-3-isopropil-4-oxotetrahidrofuran-2-carboxílico, o qual também foi isolado da linhagem geneticamente modificada B. cinerea Bc ΔSTC2. No geral, considerando as linhagens fúngicas estudadas, os resultados mostram que a adição de moduladores químicos que atuam em mecanismos epigenéticos promove mudanças no perfil de metabólitos secundários.Palavras-chave: produtos naturais microbianos, biossíntese, moduladores epigenéticos, fungos endofíticos, fungo fitopatogênico.

ABSTRACTALMEIDA, M. O. Evaluation of the effect of epigenetic modifiers in the biosynthesis of fungal natural products. 2014. 211f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.The selective manipulation of epigenetic targets using small molecule inhibitors of histone deacetylase (HDAC) and DNA methyltransferase (DNMT) activities is a strategy to elicit the expression of biosynthetic pathways and production of new secondary metabolites in fungi. In this work, HDAC inhibitors (sodium butyrate, suberohydroxamic acid and valproic acid) and DNMT inhibitors (5-azacitidine, hydralazine, procaine and procainamide) were supplemented in liquid and solid cultures of the endophytic fungi Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 and Chaetomium globosum VR10, of the commercial fungal strains Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 and Chaetomium globosum ATCC 56726 and of the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea B0510. The endophytic fungus H. corrugata FLe8.2 produced 2-(2-methoxyphenyl)-4H-pyran-4-one in PDB medium, while in the presence of hydralazine in Czapek medium the fungus produced 3-methyl-1,2,4-triazolo[3,4-a]-phthalazine. Treatment of F. oxysporum SS46 and F. oxysporum ATCC MYA 4623 with hydralazine in a Czapek medium led to the isolation of new compound, 2H-[1,2,4]triazino[3,4-a]-phthalazine. Hydralazine was biotransformed by these three fungi probably as a detoxification strategy. In addition, hydralazine also inhibited the biosynthesis of the cyclodepsipeptide beauvericin by F.oxysporum SS46. HDAC and DNMT inhibitors suppressed chaetoglobosins’ biosynthesis by C. globosum VR10 cultures in Czapek medium. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum VR10 was elicited by acid valproic in PDB medium. The production of chaetogosin A by C. globosum VR10 in PDA medium has not been affected by 5-azacitidine. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum ATCC 56726 in PDA medium was inhibited in the presence of lower concentration 5-azacitidine (50 M) and recovered in the higher concentration (150 M). Treatment of B. cinerea B0510 with suberohydroxamic acid led to the biosynthesis of the new compound 5-benzyl-2,3-dihydroxy-3-isopropyl-4-oxotetrahydrofuran-2-carboxylic acid, which was also isolated from the genetically modified strain B. cinerea Bc ΔSTC2. Results showed that chemical compounds that act in epigenetic mechanisms can induce changes in the secondary metabolite profiles in the fungal strains studied in this work. Keywords: microbial natural products, biosynthesis, epigenetic modifiers, endophytic fungi, pathogenic fungus.

Aluno: Cristiane Teixeira Vilhena BernardesTítulo: “Avaliação das atividades antimicrobiana, antisséptica e esterilizante de extratos e metabólitos de Baccharis dracunculifolia D. C. e Pinus elliottii Engelm.”Orientador: Prof. Dr. Jairo Kenupp BastosData da Defesa: 19/09/2014RESUMOBERNARDES,C.T.V. Avaliação das atividades antimicrobiana, antisséptica e esterilizante de extratos e metabólitos de Baccharis dracunculifolia DC e Pinus elliottii Engelm. 2014. 167p. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Baccharis dracunculifolia, conhecida popularmente como “alecrim do campo” é um arbusto lenhoso, nativo das regiões sul, sudeste e centro-oeste do Brasil, muito utilizada na medicina popular como agente anti-inflamatório e no tratamento de doenças gastrointestinais e úlceras, sendo relatadas ainda atividades antibacteriana, antifúngica e antiparasitária. Pinus elliottii é uma espécie exótica, que foi introduzida no sudeste brasileiro como espécie de reflorestamento e se espalhou rapidamente. As plantas desse gênero são ricas em componentes fenólicos e terpenos, dos quais alguns diterpenos apresentam atividade antimicrobiana. Com a ressurgência de micro-organismos resistentes à ação dos antimicrobianos, há interesse em se investigar novas substâncias para o tratamento de infecções tópicas e sistêmicas, bem como o desenvolvimento de produtos antissépticos ou esterilizantes, para serem empregados em ambientes domésticos, industriais e hospitalares. No presente estudo foram obtidos os extrato das partes aéreas e raízes de B. dracunculifolia (Extrato BD e BD-R) por meio de processo de maceração em solução hidroalcoólica 96:4 e o extrato do lavado glandular das folhas de B. dracunculifolia (BD-L). Os extratos foram submetidos a diferentes modalidades cromatográficas e avaliações antimicrobianas. O Extrato BD foi submetido a fracionamento em HSCCC (cromatografia de contracorrente em alta velocidade) associado a CLAE-PREP, fornecendo a flavona hispidulina, o flavononol aromadendrina 4’-O-metil éter e o fenilpropanoide ácido p-cumárico. A Fração BD-RH foi submetida a fracionamento por coluna clássica e duas das frações resultantes foram submetidas a processo de recristalização fornecendo os triterpenos óxido de baccharis e o friedelanol. Frações do extrato BD-L foram submetidas a fracionamento por cromatografia líquida a vácuo (CLV) e coluna clássica, resultando em 30 frações que foram submetidas a CLAE-PREP, fornecendo a flavanona isosakuranetina e o flavonol 3– O – metil - kaempferol. Obteve-se também o extrato da resina de P. elliottii que foi submetido à hidrodestilação em Clevenger para a retirada de sua fração volátil e o decocto restante foi particionado com AcOEt o que possibilitou a obtenção do extrato da resina de P. elliottii (extrato PE). O extrato foi submetido a CLAE-PREP fornecendo o ácido deidroabiético. Para os extratos BD e PE foram determinadas as atividades frente as micobactérias M. avium, M. kansasii, M. smegmatis, M. tuberculosis e M. bovis, utilizando-se a metodologia para determinação da concentração inibitória mínima (CIM). Ambos os extratos apresentaram-se ativos frente as micobactérias testadas, exceto o extrato de B. dracunculifolia frente a M. smegmatis. Avaliaram-se também as atividades antibacteriana e antifúngica do extrato das folhas de B. dracunculifolia, suas frações e substâncias isoladas, bem como de padrões comerciais de B. dracunculifolia. Foram também avaliados o extrato BD-L e o extrato BD-R, bem como o extrato PE e a substância majoritária isolada do mesmo. As atividades foram avaliadas para determinação da CIM frente às bactérias S. aureus, P. aeruginosa, S. choleraesuis, E. coli, B. subtilis, H. pylori e aos fungos T. mentagrophytes e C. albicans. Nenhum extrato, ou fração de B. dracunculifolia foi ativo frente às bactérias Gram negativas e somente a substância isosakuranetina foi ativa frente a S. choleraesuis, mas sem capacidade bactericida. O extrato PE foi ativo frente a todos os micro-

organismos avaliados, exceto E. coli. O ácido deidroabiético, isolado do mesmo, foi ativo frente a todos os micro-organismos, exceto as bactérias Gram negativas. Avaliou-se também a associação dos extratos de B. dracunculifolia, suas frações, bem como o extrato de P. elliottii, em concentrações sub-inibitórias em associação aos antimicrobianos de uso comercial, frente aos mesmos micro-organismos avaliados para a determinação da CIM. Observou-se uma interação negativa dos extratos e frações de B. dracunculifolia com o antifúngico cetoconazolque apresentou valores de CIM mais elevados quando associado aos extratos e frações em comparação ao observado sem a associação. Apenas o extrato da resina de PE reduziu os valores de CIM quando associado ao cetoconazol. Já quando associados ao antifúngico fluconazol observou-se uma interação benéfica entre todos os extratos e frações avaliados, observando-se como melhor resultado a redução dos valores de CIM de 512 g/mL para 2 g/mL quando o fluconazol foi associado à fração F. AcOEt BD (50 g/mL), reduzindo também os valores de CFM de 512 g/mL para 64 g/mL, o que indica a possibilidade de associação entre o antifúngico comercial e os extratos BD e PE como uma nova abordagem frente a crescente resistência aos antimicrobianos disponíveis no mercado. Avaliou-se também o potencial desinfetante bactericida da solução hidroalcoólica de B. dracunculifolia a 0,2% em álcool 40º GL, a qual foi efetiva frente às bactérias S. aureus, P. aeruginosa, S. choleraesuis e E. coli. Avaliou-se também a atividade desinfetante fungicida frente a T. mentagrophytes, das soluções hidroalcoólicas a 0,2% à 40ºGL de B. dracunculifolia e de P. elliotti, bem como da solução hidroalcoólica 40ºGL, como controle. Ambas apresentaram-se ativas e o controle não foi ativo contra os micro-organismos avaliados. Os extratos a 0,2% em álcool 40ºGL foram melhores do que os observados na determinação da CIM. Portanto, sugere-se que o álcool 40ºGL esteja agindo como um adjuvante possibilitando melhor atividade ao extrato. As soluções de B. dracunculifolia e de P. elliotti separadas e em associação foram avaliadas para determinar a atividade desinfetante esporocida frente aos micro-organismos B. subtilis e C. sporogenes, mas não foram ativas. Conclui-se que as duas plantas avaliadas apresentam potencial para o desenvolvimento de produtos antimicrobianos, destacando-se o efeito sinérgico dos extratos em associação com o fluconazol.Palavras chave: B. dracunculifolia, P. elliottii, antimicrobiano, esterilizante

ABSTRACTBERNARDES, C. T. V. Evaluation of the antimicrobial, antiseptic and sterilant activities of extracts and metabolites from Baccharis dracunculifolia DC and Pinus elliottii Engelm. 2014. 167 p. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Baccharis dracunculifolia (Asteraceae) popularly known as “alecrim do campo” is a woody shrub, native from the southeast of Brazil, widely used in folk medicine for the treatment of inflammatory and gastrointestinal diseases. Antibacterial, antifungal and anti-parasitic activities were also reported. Pinus elliottii is an exotic species that was introduced in southeast of Brazil as a reforestation specie and spread rapidly. Pinus plants are rich in phenolic components and terpenes, and some diterpenes display antimicrobial activity. With the resurgence of antimicrobial resistant microorganisms, there is a growing interest in investigating new substances for the treatment of topical and systemic infections, as well as the development of sterilizing or antiseptic products to be used in domestic, industrial and hospital. In the present study we have obtained the extracts of aerial parts (BD) and roots (BD-R) of B. dracunculifolia, by maceration process using aqueous ethanol 96:4, along with its leaves rinsed extract (BD- L). The extracts were submitted to different chromatographic techniques and the obtained fractions and isolated compounds were submitted to

antimicrobial evaluation. The BD extract was partitioned using an apparatus for high-speed countercurrent chromatography, followed by preparative HPLC, furnishing the flavone hispidulin, flavononol aromadendrin-4-O-metyl-ether and the phenylpropanoid p-coumaric acid. The BD-RH fraction was subjected to fractionation by classical column and two of the resulting fractions were subjected to recrystallization process furnishing the triterpenes baccharis oxide and friedelinol. Fractions from BD-L extract were submitted to fractionation by vacuum liquid chromatography (CLV), classical column and preparative HPLC furnishing the flavanone isosakuranetin and flavonol 3 - O - methyl - kaempferol. The P. elliottii the resin was subjected to hydrodistillation in Clevenger for the separation of its volatile fraction, and decoction water was partitioned with EtOAc to furnish the fixed components fraction of P. elliottii resin (PE extract), which was submitted to preparative HPLC to furnish dehydroabietic acid. The activity of BD and PE extracts were determined against Mycobacterium avium, M. kansasii, M. smegmatis, M. tuberculosis and M. bovis, using the methodology for determining the minimum inhibitory concentration (MIC). Both extracts showed activity against all mycobacteria tested, except for the BD extract against M. smegmatis. It was also evaluated the antibacterial and antifungal activities of the B. dracunculifolia extract, fractions, isolated and commercial available compounds along with BD-R, BD-L and dehydroabietic acid. The antimicrobial activities were evaluated by MIC determination against the bacterias S. aureus, P. aeruginosa, S. choleraesuis, E. coli, B. subtilis, H. pylori and fungi T. mentagrophytes and C. albicans. Neither extract nor B. dracunculifolia fraction were active against Gram negative microorganisms, except isosakuranetin that was active against S. choleraesuis, but not with bactericidal activity. PE extract was active against all microorganisms assessed, except for E. coli. The dehydroabietic acid was active against all microorganisms except for Gram negative bacteria. B. dracunculifolia extract were combined with P. elliottii extract, as well as in sub-inhibitory concentrations, in combination with antimicrobial drugs, against the same tested microorganisms. It was observed a negative interaction of all extracts and fractions of B. dracunculifolia with the antifungal ketoconazole, which displayed higher MIC values when combined. Only PE extract lead to a reduction in MIC values in combination with ketoconazole. However, for antifungal fluconazole all samples diminished the MIC values. The best result was observed when fluconazole was associated with BD EtOAc fraction (50 g/mL) leading to a reduction of MIC values from 512 g/mL to 2 g/mL, which should be consider for further development to face antimicrobial resistance. It was assessed the potential bactericidal disinfectant potential of B. dracunculifolia extract 0.2% in 40 ºGL alcohol, which was effective against S. aureus, P. aeruginosa, S. choleraesuis and E. coli. I was also evaluated the disinfectant fungicidal activity of the hydroalcoholic solutions of 0.2% B. dracunculifolia and. P. elliottii, extracts in 40º GL, as well as the 40 ºGL alcohol solution as control. Both extracts solutions were active against T. mentagrophytes, and the control was not active. The activities of 0.2% extracts in alcohol 40 º GL were better than those observed in the MIC determination without ethanol. Therefore, it is suggest that ethanol 40º GL is acting as an adjuvant allowing better activity of the extract. Solutions of B. dracunculifolia and P. elliottii extracts, alone and in combination were inactive in the sporicidal disinfectant assay against B. subtilis and C. sporogenes. Overall, the two plants have the potential for the development of antimicrobial products, especially with regards to the synergistic effect of the extracts in combination with fluconazole.Keywords: B. dracunculifolia, P. elliottii, antimicrobial, sterilant.

Aluno: Joel Gonçalves de SouzaTítulo: “Avaliação do potencial da associação de dendrímeros e iontoforese para a administração ocular de fármacos”Orientador: Profa. Dra. Renata Fonseca Vianna LopezData da Defesa: 22/09/2014RESUMOSOUZA, J.G. Avaliação do potencial da associação de dendrímeros e iontoforese para a administração ocular de fármacos. 2014. 137f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.A administração tópica de colírios é a maneira mais conveniente de se tratar doenças oculares. O grande desafio para a tecnologia farmacêutica é garantir que o fármaco administrado nessa forma farmacêutica chegue ao local de ação em concentrações adequadas, com efeitos adversos reduzidos, tempo de ação prolongado e dose única. Para tanto, o desenvolvimento de sistemas de liberação e de estratégias adequadas de administração tornam-se necessários. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da iontoforese na penetração ocular de dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) de geração 4, com diferentes grupos superficiais (PAMAM G4, catiônico e PAMAM G3.5, aniônico), preparar complexos desses dendrímeros com um anti-inflamatório modelo, a dexametasona (Dexa), e avaliar a influência da associação de dendrímeros e iontoforese na penetração corneal da Dexa em modelos ex vivo e in vivo. Complexos Dexa-PAMAM foram obtidos e caracterizados por espectroscopia de infravermelho e ressonância magnética nuclear (H1-RMN, 13C-RMN e DOSY), espalhamento dinâmico de luz e espectroscopia UV/vis para avaliar a formação dos complexos, seu tamanho e potencial zeta, além de alterações na solubilidade da Dexa. A velocidade de liberação da Dexa dos complexos foi verificada por estudos de liberação in vitro utilizando membrana sintética. A penetração e distribuição dos PAMAMs na córnea e sua influência na penetração da Dexa foi avaliada ex vivo utilizando córnea de porco, microscopia confocal de varredura a laser (MCVL) e cromatografia de ultra performance aliada a um detector de massas para quantificação do fármaco permeado. A citotoxicidade dos PAMAMs foi avaliada em cultura de células epiteliais da retina e células epiteliais da córnea. Por fim, verificou-se in vivo a influência da iontoforese e dos PAMAMs sobre a quantidade de Dexa no humor aquoso de olhos de coelhos. Os estudos de caracterização indicaram que a Dexa foi incorporada aos PAMAMs e que esses complexos apresentaram cerca de 50 nm de tamanho médio pela técnica de NTA, com a presença de partículas pequenas e agregadas quando dispersos em meio fisiológico e potencial zeta de + 6,4 mV e -18,5 mV para Dexa-PAMAM G4 e Dexa-PAMAM G3.5, respectivamente. A solubilidade aparente da Dexa aumentou 3,9 e 10,3 vezes nos complexos com PAMAM G4 e PAMAM G3.5, respectivamente. O PAMAM G3.5 e PAMAM G4 diminuiram 82 e 1,7 vezes, respectivamente, o coeficiente de difusão da Dexa. Os estudos ex vivo indicaram que a iontoforese foi capaz de direcionar os dendrímeros para dentro da córnea, além de aumentar 2,9, 5,6 e 3,0 vezes a quantidade de Dexa permeada a partir das formulações que continham Dexa livre, Dexa-PAMAM G4 e Dexa-PAMAM G3.5, respectivamente. Aumentou também a quantidade de Dexa retida na córnea em aproximadamente 2 vezes para todas as formulações. Os experimentos de citotoxicidade evidenciaram a maior toxicidade do PAMAM G4 e sua dependência da concentração e tempo de incubação. Por fim, os experimentos in vivo mostraram que a iontoforese aumentou a concentração de Dexa no humor aquoso cerca de 2, 2,5 e 6,6 para a Dexa livre, Dexa-PAMAM G4 e Dexa-PAMAM G3.5, respectivamente. Portanto, a associação de dendrímeros PAMAM com a iontoforese representa uma estratégia promissora para a administração tópica direcionada e sustentada de fármacos na córnea.Palavras-chave: dendrímero PAMAM; iontoforese; administração ocular tópica, dexametasona, córnea, microscopia confocal.

ABSTRACTSOUZA, J.G. Evaluation of the combination of dendrimers and iontophoresis for ocular drug administration. 2014. 137f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Topical administration of eye drops is the most convenient way for treatment of eye diseases. The challenge for the pharmaceutical technology is to ensure that the drug administered in the eye drops reaches the site of action in appropriate concentrations with reduced side effects, prolonged effect and single dose. Therefore, the development of drug delivery systems and appropriate strategies become necessary. The objective of this work was to evaluate the influence of iontophoresis in the ocular penetration of generation 4 polyamidoamine dendrimers (PAMAM) with different surface groups (PAMAM G4, cationic, and PAMAM G3.5, anionic), prepare complexes of these dendrimers with an anti-inflammatory drug model, dexamethasone (Dexa), and evaluate the influence of dendrimers and iontophoresis association on Dexa cornea penetration using ex vivo and in vivo models. Dexa-PAMAM complexes were obtained and characterized by infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance (H1-NMR, 13C-NMR and DOSY), dynamic light scattering and UV/VIS spectroscopy to evaluate the formation of the complexes, their size and zeta potential, as well as changes in drug solubility. Dexa release rate from complexes was determined from the in vitro release studies using synthetic membrane. The penetration and distribution of PAMAMs into the cornea and their influence in the ex vivo Dexa penetration was assessed using pig’s cornea, confocal scanning laser microscopy (CSLM) and ultra performance chromatography coupled to a mass spectrometer for quantification of the drug permeated. PAMAMs cytotoxicity was assessed in culture of retina epithelial cells and cornea epithelial cells. Finally, the influence of iontophoresis and PAMAMs on Dexa concentration in the aqueous humor of rabbit eyes was evaluated in vivo. The characterization results showed that Dexa was incorporated to PAMAMs and that these complexes had an average size of approximately 50 nm using the NTA technique, with the distribution of small particles and aggregates when dispersed in physiological medium. The zeta potential of Dexa-PAMAM G4 and Dexa PAMAM G3.5 complexes were +6.4 mV and -18.5 mV, respectively. PAMAM G4 and G3.5 PAMAM enhanced Dexa solubility by 3.9 and 10.3-fold, respectively. PAMAM G3.5 and PAMAM G4 decreased by 82 and 1.7-fold Dexa diffusion coefficient. The ex vivo studies indicated that iontophoresis directed dendrimers into the cornea, increasing the amount of Dexa permeated by 2.9, 5.6 and 3.0-fold for the formulations containing free Dexa, Dexa-PAMAM G4 and Dexa-PAMAM G3.5, respectively. Iontophoresis also increased approximately 2-fold the amount of drug retained into the cornea for all formulations. The cytotoxicity experiments revealed that PAMAM G4 toxicity was dependent on the concentration and incubation time. Finally, the in vivo experiments showed that iontophoresis increased Dexa concentration in the aqueous humor by 2, 2.5 and 6.6-fold for free Dexa, Dexa-PAMAM G4 and Dexa-PAMAM-G3.5, respectively. Therefore, the combination of iontophoresis with PAMAM dendrimers represents a promising strategy for targeted and sustained topical drug delivery to the cornea.Keywords: PAMAM dendrimer; iontophoresis; topical ocular administration, dexamethasone, cornea, confocal microscopy.

Aluno: Daniel Petinatti PavariniTítulo: “Investigação multidisciplinar da biossíntese de sesquiterpenos voláteis bioativos deLychnophora ericoides (Vernonieae: Asteraceae)”Orientador: Prof. Dr. Norberto Peporine LopesData da Defesa: 29/09/2014ResumoPAVARINI, D.P. Investigação multidisciplinar da biossíntese de sesquiterpenos bioativos de Lychnophora ericoides. (Vernonieae: Asteraceae) 2011. 150f. Tese de Doutorado-Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto, 2014.Lychnophora (Vernonieae: Asteraceae) é um gênero micro-endêmico dos “campus rupestris” do bioma Cerrado. Os extratos foliares de Lychnophora ericoides (“Arnica-da-serra”) são usados na terapêutica popular principalmente como analgésico. Seus óleos essenciais são quimicamente ricos em sesquiterpenos. Tais compostos, principalmente os de esqueletos bisabolano e cadinano são produtos biossintéticos do precursor cátion nerolidila. Óleos essenciais de folhas de L. ericoides são bioativos frente a invertebrados do Táxon Acari. Um de seus componentes majoritários, o orto-acetoxi bisabolol, é antinociceptivo em ensaios in vitro. Terpenos são valorizados pela indústria de química fina, haja vista sucessos como Taxol® e Acheflan®. Nossos objetivos em Fitoquímica e Ciências Farmacêuticas se alinham a esse interesse. As terpeno-sintases (TerpS) envolvidas na biossínteses dos compostos são ainda alvo de pesquisas com em Bioquímica. Sua identificação é frequentemente conclusivaem diversos aspectos. Como exemplo, citamos a compreensão dos mecanismos davariabilidade metabólica temporal em espécies nativas e selvagens e os avanços nabioengenharia de Produtos Naturais (PN). Frente a este cenário de fronteira estemanuscrito traz um resumo da investigação que objetivou determinar se há diversas isoformas de TerpS operando na produção temporalmente variável de sesquiterpenos bioativos em tecidos foliares de Lychnophora ericoides ou se não as há. Acessamos diferentes amostras selvagens de L. ericoides in situ. Nossos esforços em responder a questão supracitada foram divididos em tarefas, a seguir: (1) Determinação da fração rica em sesquiterpenos inspirada na “Química Analítica Verde”; (2) MALDI imaging das proteínas das folhas; (3) Estratégia “omics” combinada na identificação e clonagem das TerpS. Visitamos campos de ocorrência (CampO) georreferenciados bem como desconhecidos. O desenvolvimento de método de quantificação por Headspace-SPME permitiu uma comparação rápida e livre de solventes de amostras vegetais mínimas (10 mg). A separação e identificação foi conduzida por Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). As amostras de Diamantina, CampO mais Boreal de todos, apresentam a maior quantidade dederivados bisabolano. A hidrodestilação do material vegetal excedente ao HS-SPME forneceu óleos essenciais para o isolamento de moléculas. Dados espectrais diversos fundamentam a descrição de um derivado cadinano, o 11-dehidro cadinol, entre outros. O MALDI imaging determinou como exequível a geração de imagens moleculares em folhas de L. ericoides. Foram geradas imagens subepidermais dos íons com m/z que se assemelham a cadinano e bisabolano synthases (CadS and BS). A limitação do emprego da técnica é a determinação previa da massa nominal da proteína nativa. Polyacrylamide Gel Electrophoresis (1D-PAGE) gerou mapas de proteínas separadas por tamanho (A, B, C, e D) (30KDa>m/z <80KDa). A digestão com tripsina das bandas geraram peptídeos para análise em MS. Íons resultantes alimentaram o algorítimo MASCOT. Uma isoforma de germacrano-sintase foi identificada. Prospecção de genes codificadores com o cDNA (Ubiquitina +) determinou uma BS, de comprimento 1600pb, amplificada com primers de design para genes de Helianthus spp. A BS de L. ericoides foi clonada. Concluindo, destacamos dois pontos. (1) O controle enzimático na produção dos sesquiterpenos poderá enfim ser averiguada a nível do transcriptoma. (2) A busca pela produção biotecnológica de PN sofreu um pequeno incremento. Esperamos ter

contribuído humildemente na produção sustentável de PN e por conseguinte na preservação da biodiversidade. Palavras Chave:(1) Terpenos (2) HS-SPME (3) Antinociceptivos (4) MALDI imaging (5) clonagem

ABSTRACTPAVARINI, D.P. Multilevel investigation of bioactive sesquiterpene biosynthesis from Lychnophora ericoides (Vernonieae: Asteraceae) 2011. 150p. PhD Thesis-Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, “University of São Paulo”. Ribeirão Preto, 2014.Lychnophora (Vernonieae: Asteraceae) is micro endemic to “campus rupestris” from Brazilian “Cerrado”. Leaves extracts of Lychnophora ericoides (“Arnica-da-serra”) are used as folk medicine and mainly as wound healer. Its essential oils were chemically profiled as sesquiterpene-rich. Such sesquiterpenes, both bisabolene-like and cadinane-like carbon skeletons, are derivatives of the nerolidyl cation. L. ericoides leaves essential oils are bioactive against invertebrate Acari. An anti-hypernociceptive ability of its component orto-acetoxy bisabolol was also displayed in vitro. Terpenes are valuable in fine chemistry industry, e.g. Taxol® and Acheflan®. Our phytochemical and pharmaceutical goals are aligned to such an interest. Terpene synthases (TerpS) behind their biosynthesis are target of researches in plant sciences and biochemistry. Identification of TerpS often led to conclusions with diverse impacts. Fundamental concepts on time-dependent shifts of terpene productions in wild type species and advances towards plant metabolites bioengineering are examples. Facing such a frontier field we share here an abstract for the investigation aimed to determine whether there were many isoforms of sesquiterpene synthases operating at leaves tissues in Lychnophora ericoides shift-able production of bioactive sesquiterpenes or whether there were not. We have accessed different in situ samples of L. ericoides. Efforts to answer the above question were sectioned as follows: (1) “Green-Analytical-Chemistry” oriented profiling of sesquiterpene-rich fraction; (2) MALDI imaging of proteins in leaves; (3) Combined “omics” approaches towards identifying TerpS and gene cloning. We visited both known and novel L. ericoides sites of occurrence (SoO). The development of a quantitative Headspace-Solid Phase Micro Extraction (HS-SPME) method enabled a rapid and solvent-free comparison of minimized samples (10mg). Separation and identification were carried out using Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). Samples harvested in Diamantina, Northern Most SoO, accumulate the highest amount of bisabolene-like derivatives. Hydrodistillation of leftovers material from HS-SPME yield essential oils used to purify unknown compounds. Based on a diverse spectra collection we report a novel cadinane-like derivative, one 11dehydro Cadinol. MALDI imaging has been determined as suitable for imaging proteins in L. ericoides. In a prospective fashion we generate sub-epidermal images of ions within the m/z frame comprising reported isoforms of both cadinane and bisabolane synthases (CadS and BS). The limitation to its use is the awareness of molecular weight of targeted native proteins. Polyacrylamide Gel Electrophoresis (1D-PAGE) protein mapping determined broad bands of protein distribution in different mass ranges (A, B, C, and D) (30KDa> m/z <80KDa). Bands tryptic digestion, followed by sample clean up, generated peptide pools feasible for MS. The output ions data feed MASCOT algorithm. A germacrane synthase could have been identified. When prospecting encoding genes, viable cDNA (Ubiquitin +) was used. A BS, lengthened 1600bp, was amplified with BS primers designed for Helianthus spp. genes. BS presented in L. ericoides was successfully cloned. In conclusion we headline two topics. (1) Hypothetical enzymatic control of the sesquiterpenes production can now be further investigated at transcriptome level. (2) The seek of a platform that guarantee natural products production in a controlled system has been moved forward. Future production of valued compounds can slightly rely in our humble contribution to support biodiversity conservation. Key Words: (1) Terpenes (2) HS-SPME (3) Anti-nociception (4) MALDI imaging (5) cloning

Aluno: Silvia de SiqueiraTítulo: “Avaliação fotoquimiopreventiva do extrato de maçã e da rutina em modelos de pele in vitro e in vivo”Orientador: Profa. Dra. Maria José Vieira FonsecaData da Defesa: 24/10/2014RESUMOSIQUEIRA, S. Avaliação fotoquimiopreventiva do extrato de maçã e da rutina em modelos de pele in vitro e in vivo. 2014. 179 p. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Diversos estudos têm demonstrado que os danos causados pela exposição da pele à radiação ultravioleta (RUV) são relacionados aos fotodanos ao DNA, geração de espécies reativas de oxigênio e ativação de mediadores do processo inflamatório. Há, portanto, um crescente interesse pelo uso de antioxidantes com potencial fotoquimiopreventivo, como o extrato de maçã e a rutina. O modelo mais utilizado para avaliação de agentes fotoquimiovreventivos é a exposição de camundongos sem pelos à RUV. Porém, os esforços para diminuir ou mesmo evitar a utilização de animais em ensaios científicos tem levado a busca por métodos alternativos à experimentação animal. Na primeira etapa desse trabalho visou-se a otimização de parâmetros relativos ao processo de extração do pó da maçã, bem como a caracterização do extrato obtido e da rutina. Assim, as condições de extração da maçã otimizadas foram tempo de extração de 22 h, teor de etanol no solvente de 60 % (p/p) e proporção solvente:planta de 18 (p/p). A concentração dos ativos presentes na maçã levou ao extrato enriquecido com polifenóis da maçã (EEPM), que apresentou elevada atividade antioxidante in vitro e teor de rutina de 6,1 ± 0.3 μg/g de extrato. Ambos os ativos apresentaram baixa ou nenhuma toxicidade contra os fibroblastos MRC5, bem como protegeram os fibroblatos contra a morte induzida pela RUV e inibiram a formação de peróxidos lipídicos gerados pelas células irradiadas no tratamento com 4000 e 100 μg/mL de EEPM e rutina, respectivamente. Na segunda etapa desse trabalho visou-se a avaliação do potencial fotoquimiopreventivo do EEPM e da rutina adicionados a uma formulação tópica em modelos de biópsia de pele humana e pelehumana reconstruída in vitro e de camundongo sem pelos in vivo. O EEPM (1,25 %) e a rutina (0,75 %) em formulação foram avaliados quanto à retenção cutânea in vitro utilizando célula de difusão vertical de Franz e, embora não tenha sido possível detectar compostos do EEPM, foi demonstrado que 2,04 ± 0,19 μg/cm2 da rutina ficou retida na biópsia de pele humana. Na avaliação da eficácia fotoquimiopreventiva em modelos de pele humana in vitro o EEPM e a rutina adicionados em formulação foram capazes de evitar/diminuir a formação de sunburn cells, a indução de caspase-3, dímeros de ciclobutanodipirimidina, metaloproteinases e peroxidação lipídica em pele exposta à RUV. Quanto a atividade funcional in vivo, o extrato enriquecido com polifenóis da maçã apresentou leve efeito inibidor do infiltrado inflamatório induzido pela RUV, enquanto que tanto a rutina como o extrato inibiram a depleção dos níveis de GSH endógeno, o que sugere uma potente atividade fotoquimiopreventiva para estes princípios ativos. Estes resultados são promissores e apontam para o uso do EEPM e da rutina na prevenção/tratamento dos danos induzidos pela RUV na pele.Palavras chave: Polifenóis da maçã, otimização da extração, cultura de fibroblastoshumanos, formulação tópica, biópsia de pele humana, pele humana reconstruída,camundongo sem pelos e radiação ultravioleta

ABSTRACTSIQUEIRA, S. Photochemoprotective evaluation of apple extract and rutin in in vitro and in vivo skin models. 2014. 179 p. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Several studies have shown that the ultraviolet radiation (UVR) - induced skin damage are related to DNA photolesions, generation of reactive oxygen species and activation of inflammatory mediators. Therefore, there is an increasing interest in the use of antioxidants with photochemoprotective potential, such as apple extract and rutin. The most used model for evaluation of photochemoprotective agents is the exposure of hairless mice to UVR. However, efforts to reduce or even avoid the use of animals in scientific trials has pursued for alternative methods to replace/reduce animal testing. The first step of this work aimed to optimize parameters for the extraction of apple powder and the characterization of the obtained extract and rutin. Thus, the optimized apple extraction conditions were extraction time of 22 h, ethanol content of 60% (w/w) and plant:solvent ratio of 18 (w/w). The apple extract concentration led to an enriched apple polyphenols extract (EEPM), which showed strong in vitro antioxidant activity and rutin content of 6.1 ± 0.3 μg / g. The actives showed low or no toxicity against MRC5 fibroblasts, protected these cells against UVR – induced death and inhibited lipid peroxidation in irradiated cells (treatment with 4000 and 100 μg/mL of EEPM and rutin, respectively). The second step of this study aimed to evaluate the photochemoprotective potential of EEPM and rutin added in a topical formulation and assayed in in vitro models of human skin biopsy and human reconstructed skin and in vivo hairless mouse. The EEPM (1.25%) and rutin (0.75%) formulations were evaluated for skin retention in vitro using the Franz diffusion cell and, although it was not possible to detect compounds of EEPM, rutin was retained in the human skin biopsy (2.04 ± 0.19 mg/cm2). As regard the The photochemoprotective efficacy in in vitro models of human skin, EEPM and rutin formulations were able to prevent/reduce the formation of sunburn cells, induction of caspase-3, cyclobutane pyrimidine dimers, matrix metalloproteinases and lipid peroxidation in skin exposed to UVR. As for in vivo functional activity, EEPM showed a slight inhibitory effect of UVR-induced inflammatory infiltrate, while both EEPM and rutin completely inhibited endogenous GSH levels depletion. These results are promising and suggest the use of EEPM and rutin in the prevention/treatment of ultraviolet radiationinduced damage to the skin.Keywords: Apple polyphenols, optimization of extraction, cultured human fibroblasts, topical formulation, human skin biopsy, human reconstructed skin, hairless mouse and ultraviolet radiation

Aluno: Joane Kathelen Rustiguel BonalumiTítulo: “Caracterização estrutural e avaliação de aspectos funcionais de galectinas humanas do grupo tandem-repeat”Orientador: Profa. Dra. Maria Cristina Nonato CostaData da Defesa: 12/11/2014

RESUMORUSTIGUEL BONALUMI, J. K. Caracterização estrutural e avaliação de aspectos funcionais de galectinas do grupo tandem-repeat. 2014. 180f. Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.No vasto âmbito das macromoléculas biológicas, as lectinas correspondem a um grupo proteico relacionado com a capacidade de reconhecer estruturas de carboidratos e glicoconjugados. Dentro desse grupo de proteínas, estão as galectinas, cujos domínios (CRDs) apresentam afinidade específica por carboidratos do tipo β-galactosídeos, As galectinas são encontradas em uma grande variedade de células e tecidos animais, e estão envolvidas em diversos processos celulares relacionados a resposta imune e inflamatória. O grupo tandem-repeat das galectinas é formado por proteínas que apresentam dois CRDs distintos conectados por um peptídeo de ligação. Em nosso trabalho, uma abordagem multidisciplinar através do uso de técnicas biofísicas, cristalografia, e de localização celular foram aplicadas às proteínas humanas galectina-4 (hGal4) e as diferentes isoformas da galectina-12 (hGal12), como um passo importante para o entendimento dos mecanismos dependentes ou não de carboidratos que conferem ao grupo tandem-repeat das galectinas uma diversidade de funções intra e extra celulares. Durante o desenvolvimento do presente projeto, o protocolo de expressão heteróloga e purificação da hGal4 foi desenvolvido, assim como o protocolo de expressão e purificação para os domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2 foram otimizados. Ensaios de termofluor foram utilizados para avaliar o perfil de estabilidade térmica para cada um dos modelos. Os resultados sugerem que, embora a proteína hGal4 possua dois domínios, o processo de desenovelamento da hGal4 segue o perfil de um processo de uma única etapa, e que os domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2 comunicam-se entre si. Os estudos de termofluor também permitiram a identificação de novos ligantes para hGal4. A estrutura cristalográfica dos domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2 foram determinadas a 1,48 e 2.46 Å de resolução, respectivamente. Com base nas estruturas cristalográficas, o uso de ferramentas de modelagem e dinâmica molecular permitiram construir um modelo para hGal4, onde os domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2 se encontram compactados e interagem entre si através do peptídeo de ligação. Foi também possível construir um modelo de interação da hGal4 e o dissacarídeo LacNac, em que foram identificados diferentes arranjos estruturais para o ligante frente aos domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2. Essa diferença corrobora os estudos que relatam a diferença de especificidade dos CRDs. Além do trabalho abordando a hGal4, foram realizadas incessantes tentativas de desenvolver um protocolo de expressão heteróloga para as diferentes isoformas e domínios independentes da galectina-12 humana (hGal12). Foram desenvolvidas inúmeras construções para sistemas de expressão em Escherichia coli e baculovírus em células de inseto, sem sucesso. Modelos estruturais construídos para os diferentes domínios da hGal12 não permitiram a identificação das bases estruturais que possam justificar a instabilidade da proteína em solução. Anticorpos policlonais contra o domínio hGal12-CRD2 foram utilizados para a realização de estudos de localização celular em células HL-60, onde foi possível identificar a presença da hGal12 na superfície das gotas de lipídio, organelas responsáveis pelo armazenamento de energia e o processo de catabolismo celular. Com base na alta insolubilidade observada para a hGal12, a sua localização em gotas de lipídeos sem que haja a presença de peptídeos de endereçamento, a divergência evolutiva da hGal12 quando comparada com outras galectinas do mesmo grupo e o fato de um dos CRDs

não apresentar os requerimentos estruturais básicos para ligar carboidratos, nos leva a especular se essa proteína estaria, na verdade, sendo expressa como parte de um heterocomplexo proteico, que estabilizaria a estrutura da hGal12 e a endereçaria para as gotas de lipídeo. Em nossa hipótese, o domínio hGal12-CRD1 teria papel importante no reconhecimento dos glicanos da superfície da gota de lipídeo, enquanto que o domínio hGal12-CRD2, poderia, durante a evolução, ter perdido a capacidade de se ligar a carboidrato, mas manteve o arranjo estrutural estável para exercer outras funções, como favorecer a interação com outros parceiros macromoleculares. Devido ao importante papel desempenhado pelas galectinas em inúmeros processos celulares, acreditamos que os resultados aqui obtidos representam uma importante contribuição no entendimento do papel que as galectinas hGal4 e hGal12 exercem nos diferentes eventos celulares, além de fornecem ferramentas experimentais para desenvolvimento futuros estudos funcionais.Palavras-chave: galectinas, domínio de reconhecimento de carboidratos, cristalografia de proteínas

ABSTRACTRUSTIGUEL BONALUMI, J. K. Structural characterization and evaluation of functional aspects of human galectins from tandem-repeat group. 2014. 180f. Thesis of Doctoral. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.From the broad spectrum of macromolecules, the lectins correspond to a proteic group related to the ability to recognize carbohydrates and glycoconjugates. Within this group of proteins, the galectins display specific affinity for β-galactosides. Galectins are found in a variety of cell types and are involved in several biological phenomena related to immune response and inflammation. The tandem-repeat group of galectins consists of proteins with two distinct CRDs (carbohydrate recognition domains) connected by a peptide linker. In our work, a multi-technique approach that includes the use of biophysical techniques, crystallography, and cell location studies, was applied to both human galetin-4 (hGal4) and human galectin-12 (hGal12), as an important step towards the understanding of mechanisms dependent or not dependent on carbohydrates that confer to the tandem-repeat group of galectins a high diversity in terms of intra and extracellular functions. During the development of the present project, the protocol for heterologous expression and purification for hGal4 was developed, as well as the protocols for expression and purification for the domains hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2 were optimized. Thermofluor assays were used to evaluate the thermal stability profile for each protein model. The results suggest that even though hGal4 is a two domain protein, the unfold process follows a one-step profile, with the two domains hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2 communicating to each other. Thermofluor studies also allowed the identification of new ligands for hGal4. The crystallographic structure of hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2 domains were determined at 1.48 e 2.46 Å resolution, respectively. The crystallographic structures, together with homology modeling and molecular dynamics allowed the building of a structural model for hGal4, where both domains hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2 are found compacted and interacting to each other.. A model for the interaction between hGal4 and the disaccharide LacNac was also built, where different conformations for hGal4-CRD1 and hGal4-CRD2 domains were identified. Those results are in agreement with previous findings that describe differences in terms of specificity by the CRDs. In addition to hGal4 studies, several attempts have been made towards the development of a protocol for expression of hGal12 isoforms and its CRD domains. Several constructs have been developed and innumerous expression experiments both in Escherichia coli and insect cells have been performed with no success.

Structural models built for the CRD domains did not allow the identification of structural basis in order to justify protein instability. Anti-Policlonal hGal12-CRD2 antibodies were used to perform cell location studies on HL-60 cells, where hGAL12 was found to be localized on the surface of lipid droplets, organelles responsible for energy storage and catabolism. Considering the insolubility displayed by hGal12, its location on lipid droplets with no identified signal peptide, the evolutionary divergence of hGal12 compared to tandem-repeat proteins, and the fact that hGal12-CRD2 does not present the structural requirements for carbohydrate binding, we speculate if hGal12 is in fact expressed as part of a protein complex that could both stabilize hGal12 structure and guide it to the lipid droplets. In our hypothesis, the hGal12-CRD1 domain would have an important role in recognizing the glycans located on lipid droplets, whereas hGal12-CRD2, could have lost the ability of binding carbohydrate but preserved the stable structural arrangement in order to favor the interaction with other macromolecular partners. Due to crucial roles displayed by galectins in innumerous biological process, we believe that our results represent an important contribution for the understanding of hGal4 e hGal12 proteins roles within the cell, besides providing experimental tools for the development of further functional studies.Keywords: galectins, Carbohydrate recognition domais, protein crystallography

Aluno: Erika Cristina Vargas de OliveiraTítulo: “”Orientador: Prof. Dr. Juliana Maldonado MarchettiData da Defesa: 26/11/2014RESUMOOLIVEIRA, E.C.V., Desenvolvimento de nanoemulsões contendo ácido ursólico para otimização do tratamento da doença de Chagas. 2014. 73p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto – SP, 2014.Mais de cem anos após a descoberta da doença de Chagas esta permanece vitimando milhares de pessoas. Antes restrita à America Latina, hoje já é motivo de alerta na Europa e EUA. Causada pelo parasita Tripanosoma cruzi, é uma doença silenciosa, com graves complicações sistêmicas. Há 40 anos existem somente dois medicamentos para tratamento de Chagas, porém, estes não tratam a fase crônica e possuem efeitos colaterais severos. Nos últimos anos houve progresso no desenvolvimento de novos fármacos com atividade tripanocida e muitas pesquisas têm sido conduzidas neste âmbito cujo principal alvo ainda são os produtos naturais.O ácido ursólico é um terpeno de origem natural que já demonstrou ter importante ação tripanocida além de hepatoprotetora e antitumoral, porém, a hidrofobicidade deste composto é um desafio na produção de formas farmacêuticas que o veicule. As nanoemulsões têm aplicação na indústria cosmética e de medicamentos devido a vantagens como maior capacidade de solubilização em relação às emulsões convencionais permitindo a incorporação de fármacos pouco solúveis em água na fase oleosa além de maior estabilidade conferida pelo tamanho diminuto dos glóbulos e aumento da disponibilidade do fármaco. O método para análise do ácido ursólico por CLAE foi validado e mostrou-se seletivo, linear na faixa de 1,0 a 50,0 μg mL-1, com limite de detecção e quantificação correspondentes à 0,34 e 1,0 μg mL-1, respectivamente. A nanoemulsão desenvolvida apresentou estabilidade durante os 90 dias de teste, evidenciada pelos resultados obtidos nas análises por turbidimetria e índice de Ostwald ripening, porém, foi observada precipitação deste ao longo do tempo notadamente na concentração de 1 mg/mL. Aparentemente o fenômeno está relacionado à temperatura e a mudança desta variável para 30°C durante a emulsificação, foi eficaz para que não fosse mais observada diminuição nos valores de fármaco quantificado. Os ensaios de espectroscopia do infravermelho e espectrometria de massas permitiram verificar que o fármaco não reage com os demais componentes da formulação e não sofre degradação no período de tempo e nas condições estudadas O ensaio in vitro do perfil liberação demonstrou que o fármaco foi imediatamente liberado da nanoemulsão o que não ocorreu quando comparado com a mistura física. Os ensaios de atividade biológica demonstraram que o sistema é seguro para a linhagem celular testada e apresenta boa atividade tripanocida para formas amastigotas.Palavras chave: 1. Nanoemulsões; 2. Ácido ursólico; 3. Doença de Chagas

ABSTRACTOLIVEIRA, E.C.V. Development of nanoemulsions containing ursolic acid to optimize the treatment of Chagas disease. 2014. 73p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto – SP, 2014.Over a hundred years after the discovery of Chagas disease it remains victimizing thousands of people. Previously restricted to Latin America, today is reason for alert in Europe and USA. Caused by the parasite Trypanosoma cruzi, is a silent disease, with severe systemic complications. For more than 40 years, there are only two drugs to treat Chagas disease, however, these do not have an effect on the the chronic phase and have severe side effects. In recent years there has been progress in the development of new drugs with trypanocidal activity and many researches have been conducted in this area whose main target is still natural products. Ursolic acid is a naturally occurring terpene that has already shown to have important trypanocidal action besides antitumor and hepatoprotective, however, the hydrophobicity of this compound is a challenge to produce proper delivery systems. Nanoemulsions find use in the cosmetic industry and medicine due to advantages such as greater solubilizing capacity compared to conventional emulsions enabling the incorporation of sparingly soluble drugs in water in the oily phase besides greater stability conferred by the diminutive size of the droplets and increased availability of the drug. The chromatographic method to quantify ursolic acid was validated and shown to be selective, linear in the range from 1.0 to 50.0 μg mL-1, with a limit of detection and quantification corresponding to 0.34 and 1.0 μg mL-1, respectively. The developed nanoemulsion was stable throughout the 90 days of testing, as evidenced by the results obtained from the analysis by turbidimetry and Ostwald ripening index, however, precipitation was observed over time particularly at a concentration of 1 mg/ml. Apparently the phenomenon is related to temperature and the change of this variable to 30°C during emulsification was successful in that it was no longer observed decrease in the amounts of quantified drug. Infrared spectroscopy and mass spectrometry results allowed to verify that the drug does not react with other components of the formulation and do not suffer degradation in the time period under the studied conditions. The in vitro release profile showed that the drug was immediately released from the nanoemulsion which was not observed with the physical mixture. The biological activity assays showed that the system is safe for the tested cell line and shows good trypanocidal activity for amastigotes. Keywords: 1. Nanoemulsions; 2. Ursolic acid; 3. Chagas disease

Aluno: Zumira Aparecida Carneiro Título: “Avaliação de atividade tripanocida in vitro e in vivo do composto 5-hidroxi-3-metil-5-fenil-pirazolina-1-(S-benzilditiocarbazato) em meio aquoso e em sistema de liberação de droga”Orientador: Prof. Dr.Victor Marcelo DeflonData da Defesa: 12/12/2014RESUMOCARNEIRO, Z. A. Avaliação de atividade tripanocida in vitro e in vivo do 5-hidroxi-3-metil-5-fenil-pirazolina-1-(S-benzilditiocarbazato) em meio aquoso e em sistema de liberação de droga, 2014. 152f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.O parasita Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é o causador da doença de Chagas e continua sendo um grave problema de saúde pública, principalmente nas regiões mais pobres da América Latina. Na busca por novas drogas terapêuticas contra T. cruzi, nós avaliamos a atividade do composto 5-hidroxi-3-metil-5-fenil-pirazolina-1-(S-benzilditiocarbazato) (H2bdtc) tanto in vitro quanto in vivo. Esta espécie foi caracterizada por análise elementar, espectroscopia UV-visível, infravermelho, RMN e espectrometria de massas. Nos experimentos biológicos, o composto H2bdtc em suspensão e/ou encapsulado em nanopartícula lipídica sólida (NLS) foi comparado com um dos medicamentos empregados atualmente, o benzonidazol (BZN). Utilizando-se o composto H2bdtc encapsulado em NLS observou-se: (a) redução de forma eficaz da parasitemia em camundongos, em concentração 100 vezes mais baixa do que aquela normalmente empregada para Benzonidazol (clinicamente aplicada a uma concentração de 400 μmol kg-1 dia-1); (b) diminuição da inflamação e das lesões de fígado e do coração e (c) resultou em 100,0% de sobrevivência dos camundongos infectados com T. cruzi após 60 dias. Para fins de elucidação do possível mecanismo de ação do composto H2bdtc, estudo de interação com o DNA e com a albumina do soro Humano (HSA) foram realizados. Baseado nos dados relacionados à atividade tripanocida in vitro e in vivo do composto H2bdtc, este pode ser tomado como potente agente tripanocida e o estudo desenvolvido neste projeto pode concorrer ao uso de H2bdtc como possível nova droga a ser utilizada contra Doença de Chagas.Palavras Chaves: Ditiocarbazato, Doença de Chagas, Nanopartículas lipídicas sólidas.

ABSTRACTCARNEIRO, Z. A. In Vitro and In Vivo Trypanocidal Activity of 5-hydroxy-3-methyl-5-phenyl-pyrazoline-1-(S-benzyldithiocarbazate) (H2bdtc) free and loaded in drug delivery system. 2014. 152f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.The parasite Trypanosoma cruzi causes Chagas disease, which remains a serious public health concern and continues to victimize thousands of people, primarily in the poorest regions of Latin America. In the search for new therapeutic drugs against T. cruzi, here we have evaluated both the in vitro and the in vivo activity of 5-hydroxy-3-methyl-5-phenyl-pyrazoline-1-(S-benzyldithiocarbazate) (H2bdtc). This compound was characterized by elemental analysis, UV-visible spectroscopy, infrared, NMR and mass spectrometry. Biological experiments were conducted with H2bdtc as a free compound or encapsulated into solid lipid nanoparticles; we compared the results with those achieved by using the currently employed drug, benznidazole. H2bdtc encapsulated into solid lipid nanoparticles (a) effectively reduced parasitemia in mice at concentrations 100 times lower than that normally employed for benznidazole (clinically applied at a concentration of 400 μmol kg-1 day-1); (b) diminished inflammation and lesions of the liver and heart; and (c) resulted in 100,0% survival of mice infected with T. cruzi. Biological mechanism elucidation of H2bdtc compound was analyzed based on the interaction with DNA and Human Serum Albumin (HSA). Based on the data related to the in vitro and in vivo trypanocidal activity of H2bdtc it was taken as potent trypanocidal agent. Studies developed on this project allow concluding that H2bdtc is a possible new drug to be used against Chagas Disease.Keywords: Dithiocarbazate, Chagas Disease, Solid lipid nanoparticles.

Aluno: Rafael de FelícioTítulo: “Produtos naturais marinhos: isolamento e identificação de metabólitos inéditos a partir de fungos endofíticos e cianobactérias utilizando técnicas de eliciação química epigenética e desreplicação via redes moleculares”Orientador: Profa. Dra. Hosana Maria Debonsi Data da Defesa: 15/12/2014

RESUMOde FELÍCIO, R. Produtos naturais marinhos: isolamento e identificação de metabólitos inéditos a partir de fungos endofíticos e cianobactérias utilizando técnicas de eliciação química epigenética e desreplicação via redes moleculares. 2014. 183f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Os produtos naturais marinhos são apontados com uma das fontes de substâncias bioativas mais importantes para a descoberta de novos fármacos. Neste ambiente, os organismos estão em constante interação ecológica por meio da produção de metabólitos secundários. Fungos endofíticos e cianobactérias representam grupos de micro-organismos que realizam a biossíntese de substâncias com características químicas únicas e atividades biológicas potentes. Entretanto, quando retirados de seu habitat natural, esses seres microbianos geralmente perdem sua capacidade metabólica através de um fenômeno denominado silenciamento gênico, no qual genes biossintéticos deixam de ser transcritos devido a motivos ainda indeterminados. Esse mecanismo genético é intermediado, dentre outros fatores, pelas enzimas DNAmetiltransferase (DNA-MT) e Histona-desacetilase (HDAC). Deste modo, seus inibidores têm sido utilizados com sucesso para promover a eliciação de substâncias que não seriam produzidas em condições laboratoriais. Outra importante abordagem na pesquisa de produtos naturais têm sido a desreplicação baseada na fragmentação (MS/MS) para identificação de substâncias ou análogos. As redes moleculares (molecular networking) constituem uma nova abordagem na qual dados de espectrometria de massas são agrupados de acordo com as semelhanças entre os padrões de fragmentação, formando famílias de moléculas, permitindo a rápida visualização do perfil químico de várias amostras ao mesmo tempo. Deste modo, este trabalho apresenta o isolamento e identificação de metabólitos inéditos a partir de fungos endofíticos e cianobactérias oriundos do ambiente marinho. Para isto, técnicas de eliciação epigenética foram utilizadas em ambos os grupos de organismos, e adesreplicação via redes moleculares foi utilizada em cianobactérias. Fungos endofíticos associados à macroalga vermelha Bostrychia tenella foram alvo de estudos químicos e epigenéticos. As linhagens Xylaria sp. e Nigrospora oryzae foram submetidas ao cultivo em meio sólido arroz, o que resultou no isomento da substância citocalasina D e de um derivado potencialmente inédito da griseofulvina. A linhagem Penicillium decaturense foi cultivada em meio líquido PDB resultando no isolamento da 10,11-deidrocurvularina e possíveis análogos. Experimentos com inibidores epigenéticos (butirato de sódio e procaína) promoveram a modulação do perfil químico desta linhagem, ao estimular a produção de metabólitos não expressos em condições normais de cultivo. Ainda, a linhagem Acremonium sp. produziu váriassubstâncias quando cultivada em meio de líquido Czapek sob a influência de procaína, sendo uma delas potencialmente inédita e derivada da classe de metabólitos das brevianamidas. Frações orgânicas da cianobactéria Schizothrix sp., coletada no Panamá, foram analisadas em LC-MS/MS e os dados gerados foram utilizados para a criação de redes moleculares. Este estudo resultou na identificação dos metabólitos barbamida, hectoclorina, curacinas A e D, curazole, acetato de malingamida D, dolastatina 10 e carmaficina B. Ainda, análogos das substâncias curazole, dolastatina D e dois análogos inéditos das carmaficinas foram propostos. A cianobactéria Moorea producens JHB, coletada na Jamaica, foi submetida ao cultivo sob influência do composto butirato de sódio, e produziu dois metabólitos inéditos, propostos de

acordo com os dados de fragmentação, como sendo derivados da jamaicamida e da hectoclorina, num tipo de biossíntese cruzada. Portanto, este trabalho confirma os fungos endofíticos e cianobactérias marinhos como promissores quanto a exploração do metabolismo secundário.Palavras-chave: Xylaria, Nigrospora, Penicillium, Acremonium, Molecular networking,Moorea producens.

ABSTRACTde FELÍCIO, R. Marine natural products: isolation and identification of unknown metabolites from endophytic fungi and cyanobacteria through chemical epigenetic elicitation and dereplication via molecular networking. 2014. 183f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.Marine natural products are pointed out as one of the most important sources of bioactive compounds for drug discovery. In this environment, organisms are in constantly interaction ecological through the production of secondary metabolites. Endophytic fungi and cyanobacteria represent groups of microorganisms that perform biosynthesis of substances with unique chemical features and potent biological activities. However, when removed from their natural habitat, these microbial beings generally lose their metabolic capacity through a phenomenon called gene silencing, in which biosynthetic genes are no longer transcribed due to reasons still undetermined. This genetic mechanism is brokered, among other factors, by the enzyme DNA methyltransferase (DNA-MT) and histone deacetylase (HDAC). Thus, their inhibitors have been used successfully to promote the elicitation of substances that would not be produced under laboratory conditions. Another important approach in the natural products research field have been dereplication based on the fragmentation (MS/MS) for the identification of substances or analogues. The molecular networking is a new approach in which data from mass spectrometry are grouped according to the similarities between the patterns of fragmentation, forming families of molecules, allowing rapid visualization of the chemical profile of several samples simultaneously. Thus, this work presents the isolation and identification of novel metabolites from endophytic fungi and cyanobacteria originating from the marine environment. For this propose, epigenetic elicitation techniques were used in bothgroups of organisms and the molecular networks via dereplication was used in cyanobacteria. Endophytic fungi associated with red seaweed Bostrychia tenella were subjected to chemical and epigenetic studies. Xylaria sp. and Nigrospora oryzae strains were cultured in solid medium rice, resulting in isolation of substance of cytochalasin D and a potentially novel derivative of griseofulvin. Penicillium decaturense strain was grown in PDB liquid medium resulting in the isolation of 10,11-deidrocurvularina and possible analogues. Experiments with epigenetic inhibitors (sodium butyrate and procaine) promoted the modulation of the chemical profile of this strain, to stimulate the production of metabolites not expressed under normal culture conditions. Moreover, Acremonium sp. produced various substances when grown in liquid medium under the influence of Czapek procaine, one of novel and potentially derived from the class of metabolites brevianamides. Organic fractions of the cyanobacteria Schizothrix sp., collected in Panama, were analized by LC-MS/MS and the data generated were used to create molecular networks. This study resulted in the identification of metabolites barbamide, hectochlorin, curacins A and D, curazole malyngamide D acetate, dolastatin 10 and

carmaphycin B. Also, analogs of curazole, dolastatin 10 and carmaphycins A and B have been proposed. Cyanobacteria Moorea producens JHB, collected in Jamaica, was grown under the influence of sodium butyrate, and produced two new proposed metabolites in accordance with the fragmentation data as being derived from jamaicamide and hectochlorin, in a sort ofcrossed biosynthesis. Therefore, this work corroborates marine endophytic fungi and cyanobacteria as promising for exploration of secondary metabolism.Keywords: Xylaria, Nigrospora, Penicillium, Acremonium, Molecular networking,Moorea producens.