• ·•·· REPÚBLICA FEDERATIVADOBRASL \Ainlslérto da Indústria, do Q>ruén:io e do Turismo

lnstftlAo Nacional da Prqxledade lncbllrial

1111121, PI 9104287 A (22) Dalade Depdllto: 0311Ctl91

(43) Dala de Publlcaçlo: 20/04/93 (RPI 1188)

(54\ Título: ProoellOde preparaçlOde 1mWICMllll8lolc11oap, lura d. proleaH1 antlglnlcaa em NCreçõea ou extralol dl origem dlw,911; P,OCN90 de ,_to de cnplulft compeNlllla p,va do­llgem de lnlb-• de prollaH em ftulclol ~ de orlglm divilrsa; procasoo dlo llillamenlo de antrgen01 , lnll- 1111 diagn6dco;~01de~oeq~dlpro1N-1111 mtalol e/ou ftuldDI blol6glooa de origem mlcrDblal, v-'81 ou anln,Lt prac1110 de ~ • quanallcaolo de 1nlbldõre1 de proleaHI em c,Julal, exlr eloU llukloa bloldglcol dl origem micrablel, vegetal ou anlrnol: p,_.10 de preparaçlo de .._. .. para diagnóstico e Klls para dagn61llco

(71) Deoositante(sl: Laboratc1rto c111mu~Mo11c1Mr lnalllúlO de 'eloli.lca Cerlóe b,aga, Filha UFRJ (BRIRJ)

(72) lnventor(es): .a.11a Sc11n11a1n

(74) Procurador: NHza-Kover

(57) Resumo: Trata-N de plOCIIJO de prepara,;lo de lmu­noenollo em que proll- antiglnlcu 11D caplUrmu de axtraloe celulares ou fluido• bloldglcol de origem di-, por lnlbldoree de proleue pr6-lblOMCIDI em 1uporl81 adlldoa, esndo em esgulela utiizadao corno antigene, em reações lmuncldglcu. O lmunoenulo pormli. -r eloU quantiftcar lllllleorpoe conlra a ,,,_ ,,.,.. lura. No lormalo de lmunoenaalo compelllvo, o rMlodo llllffllla daleclar ou dosar lnlb-• de pro-• em aoluç&,1 bloklglcU. O plOCIIIO pode esr --do •m qualquer ela- de pro1o-. • elictlcia e slllelividadll Cla captura por um dado Inibidor sendo -·

(SI) 1nta": 001N l3IIJII

1 1

CE D I N ICllllll oa:a .,,.,11111

Relatório Descritivo da Patente de In­

vencão: •Processo de preparacão de imunoensaios de captura

de proteases antigênicas em secreções ou extratos de origem

diversa; Processo de imunoensaio de captura competitiva pa-

05 ra dosagem de inibidores de protease em fluidos biológicos

de origem diversa; Processo de isolamento de ant!genos de

interesse em diagnóstico; Processo de deteccão e quantifi­

cacão de proteases em extratos e/ou fluidos biológicos de

origem microbial, vegetal ou animal; Processo de deteccão e

10 quantificacão de inibidores de proteases em cêlulas, extra­

tos e/ou fluidos biológicos de origem microbial, vegetal ou

animal; Processo de preparacio de reagente para diagnóstico

e kits para diagnóstico•.

A presente invencão torna dispensável a

15 purificacão prévia de proteases antigênicas para finalida­

des de imunoensaio. Além disso, pode substituir com vanta­

gem ensaios de captura concebidos com anticorpos monoclo­

nai& contra as referidas proteases já que os soros a serem

testados e o inibidor utilizado como reagente de captura

20 são obtidos da mesma espécie animal, por conseguinte mini­

mizando as reacões inespec!fica& frequentemente mediadas

por anticorpos naturais contra determinantes heterólogos. o

- 2 - •••• •• • •• • •• .. •••• • • • • •• • ••

os

• •• • • • • • • • • • • •• ••• • • • •••• • • • • • • • • • • • •••• •• • •• •• • •••• ••

)104287 ensaio, uma vez padronizado na forma de imunoenaaio de com­

petição, permite dosar oa nlveia de determinados inibidores

e/ou·proteaaea em extratos celulares ou fluidos inflamató­

rios.

Progressos recentes no entendimento so­

bre a natureza bioqulmica, estrutural e funcional de antl­

genoa parasitários tem revelado que algumas proteaaea, em

particular as enzimas pertencentes à auperfamllia da papal­

na, são antigénicas em uma alta proporção de hospedeiros

10 infectados (revistos por Arnholdt & Scharfatein, Res. Inunu­

nolo. 1421146, 1991). Anticorpos contra enzimas proteollti­

caa foram observados em indivlduos e animais infectados com

Trypanoaoma cruzi, Schiatoaoma manaoni, e Leiahmania. Esta

reatividade foi analisada maia detalhadamente com a glico-

15 proteina GP57/51 do T. cruzi (Scharfstein e col. J. Inunu­

nol. 137:1336, 1986). Este antlgeno, mais recentemente

identificado como tiol proteinaae (Murta e col., Mol. Bio­

chem. Parasit. 43:27, 1990), efetivamente possui proprie-

dadea diagnósticas (Scharfstein e col., J. Inununol.

20 131:972, 19831 Scharfstein e col., Amer. J. Trop. Med. Hyg.

, 34:1153, 19851 Gazzinelli e col., Infect. Immun. 58:1437,

19901 e pedido de patente 8304073 e 8603630, INPI).

A idéia de desenvolver um ensaio de cap­

tura utilizando inibidores de protease foi elaborada com

25 base no pressuposto de que, de modo geral, (a) determinan­

tes antigénicos e (b) sltioa de interação com inibidores

devem se localizar preferencialmente em domlnios· distintos

• • • • •

- 3 - •••• •• • • • • • • • ••• • •••• ••

• •• • •• •• • ••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••••••

~104287 e relativamente independentes das proteases. O alinhamento

das sequências descritas para diversas proteases eucarióti­

cas evidencia a existência de regiões bastante bem conser­

vadas entre espêcies filogenéticamente distantes. AS se-

OS quências mais conservadas incluem (1) os res!duos importan­

tes para a atividade enzimática e (11) os res!duos de con­

tato com os inibidores naturais destas enzimas. No caso

particular da GP57/51 do T. cruzi, dados recentes sugerem

que os principais determinantes antigênicos (reconhecidos

10 por anticorpos) encontram-se predominantemente na extensão

e-terminal da protease, ou seja, localizam-se fora do dom!­

nio central onde se situa a triade catal!tica e os sub-s!­

tios de interação com o substrato. A pressuposição de que

os principais epitopos estão localizados em dom!nios rela-

15 tivamente distantes do dom!nio central os experimentos des­

critos a seguir, e que propiciaram a concepção de uma nova

modalidade de imunoens~io de captura. A cisteino proteinase

do T. cruzi (GP57/51) e seus inibidores, a cistatina e e

cininogênio,_ foram escolhidos como modelos para verificação

20 desta hipótese de trabalho. A escolha da cistatina e é fun­

damentada por análise da estrutura tridimensional de cris­

tais obtidos entre este inibidor e a enzima papaina, proto­

tipo da familia das tiol proteases. Segundo um modelo de

25 atracamento recentemente proposto (Bode e col., EMBO J.

7:2593, 1988), a cistatina e apresenta uma protuberância

que se ajusta precisamente no interior de uma fenda que se­

para os dom!nios direito e esquerdo da papaina, estabele-

- 4 - •••• •• • • • • • • • ••• • •••• •• .: ···.: . ·· .. ··. ···: • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• • 9i 0428 7

cendo contatos com res!duos e/ou estruturas secundárias al­

tamente conservadas entre os diferentes membros da auperfa­

mllia, inclusive na própria GP57/51. ! portanto razoável

pressupor que anticorpos anti-cisteinil proteases tenham

05 diflcil acesso ao interior da fenda. Por conseguinte, os

seus epitopos dominantes devem se localizar em regiões su­

ficientemente distantes do s!tio de atracamento da cistati­

na e, possibilitando a formação de complexos tri-molecula­

res. Essa separação funcional entre dom!nios (1) implicados

10 na interação com inibidores naturais e de (11) epitopos do­

minantes, pode também ocorrer com outras classes de protea­

ses. Em tese, a relativa independência dessas funções pode

ser prejudicada por outros fatores, por exemplo, pelo tama­

nho do inibidor (ex. 2-macroglobulina), e/ou por modifica-

15 ções conformacionais na protease induzidas pela interação

com o inibidor, neste caso, estas alterações poderiam re­

sultar no mascaramento ou destruição de epitopos localiza­

dos em regiões mais distantes da protease.

Neste invento será demonstrado que pro-

20 teases que apresentem s!tios de ligação para seus inibido­

res em regiões suficientemente distanciadas dos epitopos

dominantes podem ser detectadas por métodos imunológicos,

tal como ilustrado pelo kit descrito à seguir. Dependendo

da afinidade do inibidor pela protease em questão, qualquer

25 um dos componentes do par pode ser utilizado como agente

capturante do outro, sob a condição de que o capturante se­

ja antigênico, e de que antissoros contra o componente cap-

- s - •••• •• • • • • • • • ... • •••• ••

• •• • •• •• • ••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• • 9.104287

turado sejam disponíveis. O sistema descrito abaixo foi

preparado utilizando cistatina e recombinate humana, ou ci­

ninogênio humano purificado como reagente de captura do an­

tígeno GPS7/51. o kit obtido pode ser aplicado na sorodiag-

05 nose da Doença de Chagas, conforme demosntrado por métodos

imunoenzimáticos (dados apresentados nas figuras 1-7). Pla­

cas de poliestireno ou de material plástico equivalente

forma forradas com concentrações crescentes de cistatina

humana recombinante (Fig. li ou com cininogênio humano pu-

10 rificado (Fig. 3). Qualquer um desses inibidores é capaz de

capturar a GP57/51 de extratos de T. cruz!, de modo dose­

dependente (Fig. 2 ilustrada com cistatina e como reagente

de captura). Os dados apresentados na figura 4 demonstram

que a captura da GP57/Sl de extratos diluídos é mais efi-

15 ciente com cininogênio do que com a cistatina e, possivel­

mente devido a maior avidez da interação, já que o cinino­

gênio apresenta 2 domínios funcionais de ligação para tiol

proteinases. Controles de especificidade da ligação confir­

mam a seletividade da captura pelo inibidor de fase sólida

20 (Fig. 6). As reações sorológicas observadas com um painel

de soros humanos confirmam que o reagente capturado exibe

as propriedades sorológicas anteriormente descritas para o

antígeno purificado (Scharfstein e col., J. Immunol.

131:972, 1983; Scharfstein e col., Amer. J. Trop. Med. Hyg.

2S , 34: 1153, 198S), isto é, sensibilidade e especificidade.

O presente invento torna dispensável a purificação da

GPS7/Sl ou da GP25 tal como dsecrita em pedidos de patente

- 6 - •••• •• • • • • • • • ... • •••• ••

• •• • •• • ••••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• •

910428? nteriores (8304073 e 8603630, INPI). A reação com um anti-

corpo monoclonal anti-GP57/51 (Fig. 5) comprova que o ant!­

geno foi efetivamente capturado pelos inibidores acima re•

feridos. Experiências adicionais indicam que cisteino pro-

05 teinases de Leishmania também podem ser detectados pelo

imunoensaio de captura. Assim, soros de animais crônicamen•

te infectados por L. m. amazonensis reagem fortemente com

ant!genos capturados de lisados de amastigotes de L.M. ama­

zonensis (Fig. 5), justamente o estágio de desenvolvimento

10 do parasita que expressa as quantidades maiores de tiol

proteinases. Esses dados demonstram que tiol proteinases de

leishmania aio antigênicas, e que podem ser utilizadas em

sorologia.

O fato de que cistatina, ou cininogênio,

15 são altamente eficazes na captura de proteinases prove­

nientes de extratos parasitários de origem diversa (neste

caso_ilustrado para T. cruzi e Leishmania) e consistente

com a proposição de que estas enzimas tem origem lisosomal.

Efetivamente, sabe-se que enzimas lisosomais como catepsina

20 L e s ligam-se fortemente à esses inibidores. ! provável

que a aplicação deste imunoensaio a extratos provenientes

de outros parasito& conduza a identificação de novas tiol

proteinases, abrindo novas frentes para o desenvolvimento

de drogas de interesse médico e veterinário.

25 Além destas potenciais aplicações, -e

poss!vel que imunoensaios de captura preparados com extra­

tos alergênicos brutos possam permitir um monitoramento de

- 7 - •••• •• • • • • • • • ••• • •• • • • •

• •• • •• •• • ••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• •

9104287 IgE especificas contra proteases alergênicas, algumas delas

já descritas na literatura. Em todas estas posslveis apli­

cacões, a escolha de um deteminado inibidor como agente

capturante determina a priori a classe de proteinase que

05 procura-se detectar. Assim sendo, é posslvel que a utiliza­

cão de inibidores seletivos contra serino proteases venha

se mostrar igualmente eficaz como reagente de captura, e

assim por diante em relacão as outras classes de enzimas

proteollticas. A utflizacão dos inibidores de protease com

10 a finalidade de purificacão de proteinases antigênicas é

uma extensão natural das reinvindicacões apresentadas. No

caso da GP57/51, o emprego de cistatina e ou do cininogênio

em colunas de afinidade propicia sua obtencão em estado pu-

15

rificado, e em quantidades preparativas.

Variacões técnicas podem ser feitas com

o objetivo de ligar irreversivelmente as proteases aos ini­

bidores de fase sólida, minimizando a possibilidade de que

a protease possa ser elulda do poco nas etapas subsequentes

do imunoensaio. compostos polimerizadores como glutoraldei-

20 do podem assegurar a fixacão do antlgeno capturado no ini-

bidor, sem que haja necessariamente destruicão dos epitopos

relevantes. Alternativamente, inibidores sintéticos que sa­

bidamente promovem reacões covalentes com cisteinil-protei•

nases, tal como ocorre com derivados peptldicos das diazo-

25 metanas (Meirelles e col., submetido a publicacão), pode­

riam ser acoplados à resinas adequadas, sendo em seguida

utilizados como reagentes de captura. A escolha dos resl-

8 - •••• •• • .. • •• • • - • • • • •• • •• • •• • • • • • • • • • • .. ... • • • •••• • • • • • • • • • • • •••• •• • •• •• • •••• •• 910428?

duos de ácido aminados da porção pept!dica do inibidor é

determinante para a seletividade e eficiência da inativação

enzimática, tendo em vista que esses res!duos devem se aco­

modar nos sub-s!tios de catálise para que o composto possa

05 alquilar a cisteina catal!tica da proteinase. Variando-se a

sequência pept!dica do inibidor, obtem-se maior seletivida­

de de ligação para a enzima desejada. Esse principio, uma

vez generalizado para outras classes de protease (ex. seri•

no proteases), pode permitir a triagem de enzimas antigêni-

10 casem função das caracterlsticas estruturais dos seus

sub-sltios, e do mecanismo de ação, portanto, introduzindo

maior seletividade ao reagente de captura.

Como aplicação adicional do teste de

captura, pode-se prever sua utilização para detecção e do-

15 sagem de qualquer protease de interesse em extratos celula­

res ou fluidos biológicos de origem diversa, dependendo da

disponibilidade de um inibidor adequado para captura e de

acesso a antissoro monoespeclfico entra a protease que se

pretende investigar. De modo análogo, a inversão dos compo-

20 nentes do ensaio viabiliza a detecção e dosagem inibidores

de protease pré-definidos em fluidos biológicos, na medida

em que anticorpos forem disponlveis.

Imunoensaios de captura do tipo descrito

para Doença de Chagas podem ter aplicação mais ampla, se

25 forem utilizados na forma de ensaio de captura competitiva

(Fig. 7). Neste caso, a dosagem de inibidores do tipo cis­

tatina C ou cinicogênio pode ser feita diluindo-se a fonte

•••• • • • • •

- 9 - •••• •• • • • • • • • ••• • •••• ••

• •• • •• • ••••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• • 9104287

de protease em soluções que contenham concentrações variá­

veis de soro, ou de qualquer outra solução biológica de in­

teresse. A presença do inibidor na fase fluida resulta em

bloqueio quantitativo da ligação da protease de referência

os ao inibidor de fase sólida, diminuindo por conseguinte a

intensidade da reação com o anticorpo de referência, detec­

tada por ELISA. A dosagem desses inibidores no plasma de

pacientes politraumatizados pode ter importãncia clinico­

laboratorial, podendo ser feita com o par protease-inibidor

10 GPS7/Sl e cistatina e (ou cininogênio) ou com qualquer pro­

tease funcionalmente compatlvel (ex. papaina, catepsina L,

catepsina S). Inibidores de outras classes de protease po­

dem ser dosados, utilizando-se o im,smo principio.

Descrição de reagentes para diagnóstico

15 de Chagas utilizando inibidores de cisteino proteinases pa­

ra captura do antlgeno GPS7/51 de T. cruzi. D

Reagente de captura: cistatina e

recombinante diluida a o.s ug/ml em salina fosfatada

humana

10.01

M) pH 7.2, preparada imediatamente antes do plaqueamento,

20 cininogenio humano purificado diluido a 10 ug/ml no tampão

acima referido.

Fonte de antiqeno: Extrato de epimasti­

gote, fração citossilica diluida na faixa de 41-200 ug/ml,

no tampão acima, e suplementada com O.OS% Tween 20. O ex-

25 trato contém uma mistura de inibidores de protease (1 nM

PMSF, 20 ug/ml TLCK e 20 ug/ml TPCK) que não interferem com

a interação da GP57/51 com cistatina e ou cininogênio. AI-

- 10 - •••••• • • • • • • • ... • •••• ••

• •• • •• •• • ••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• • 9104287

ternativamente, usa-se uma fracão de extrato acima, obtida

após precipitacão com 601 de sulfato de amônia saturada.

Preparacões obtidas após precipitacão do extrato com tampão

acetato 0.1 M, pH s, foram testados com resultados idênti-

05 coa.

10

Imuno conjugado: anticorpo anti-IgG hu­

mana (purificado por afinidade) conjugado com peroxidase

(Sigma Chem. co., st. Louis. MO) diluldo 1: 3,000 em tampão

PBS-Tween 20 o.os,. Revelador, OPD (orthopohenilenediamine

o.4 mg/ml, e H202 301 dilulda em tampão citrato 33 mM pH

SI.

Soros de referência: pool de soros cha­

gásicos crônicos, diluldo 1:2 com glicerol. e preservado no

15 congelador. Pool de soros normais, mesmas condicões.

Descrição do imunoensaio enzimático ba­

seado na captura da cisteinil proteinase do T. cruzi por

cistatina e ou cininogêncio

Volumes de 0.1 ml de solucões de cista-

20 tina e humana recombinante, o.s ug/ml, em PBS 0.01 M pH

7.2, foram adcionadas a placas de poliestireno e incubadas

durante cerca de 18 horas a 4 oc. Dois pocos são tratados

apenas com tampão diluente, para fins de controle de rea­

cão. Os poços são lavados e submetidos a 4 ciclos de blo-

25 queio e lavagem, de 15 minutos a temperatura ambiente, com

PBS suplementado com Tween 20 a O.OS\ e BSA a 1 mg/ml. Em

seguida, os poços foram esvaziados e tratados em seguida

- 11 - •••••• • • • • • • • ••• • •••• ••

.: .... : .. . ..... • • • • • • • • • • . . . .... .• ..... . • • • • • • • • ••• •• • •••• •• • 910428?

com extratos brutos de T. cruzi (epimastigotes), ou com 41

ug/ml de PA2, uma preparação obtida por fracionamento par­

cial daquele, dilu!da em tampão PBS-Tween 20 o.os,, por 2

horas a 37 oc. Os poços sensibilizados com a fonte de ant!-

05 geno são contados em seguida lavados com tampão de bloqueio

gelado, 3 ciclos de 5 minutos cada, e em seguida indivi­

dualmente incubados com os soros (1) positivos de referên­

cia (2) negativos de referência e (3) teste, previamente

dilu!dos com o tampão PBS-0.051 Tween 20, na diluição dese-

10 jada, a faixa escolhida podendo variar de 1:10 a 1:100, em

função dos n!veis de sensibilidade e especificidade deseja­

dos. A reação antigeno-anticorpo pode ser realizada na fai­

xa de temperatura de 4-37 oC, por 1 hora. Os poços são la­

vados em seguida com o tampão PBS-0.051 Tween 20, apÓs o

15 que são incubados com imunoconjugados peroxidase-anti IgG

humana dilu!dos a 1:3000 no mesmo tampão. A reação decorre

por 1 hora, podendo ser realizada na faixa de temperatura

de 4-37oc. Após 3 ciclos de lavagem conforme descrito na

etapa anterior, os poços são tratados com uma solução de

20 orto fenileno diamina (OPD) o.4 mg/ml, e H202 301 dilu!da

na proporção de 1:2500 em tampão citrato-fosfato 33 mM pH

s.o, gelado. A reação é interrompida com H2S04 6 N, e a

leitura spectrofotométrica é feita em monitor de ELISA no

25

comprimento de onda de 492 nM.

Reagentes para o ensaio de captura com­

petitiva preparado com a finalidade de titular cininogê­

nio/cistatina C no soro: Os regentes são os mesmos descri-

- 12 -

toa acima.

•••• •• • • • • • • • ••• • •••• •'!

.: .... : ........ ···: • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• • 9104287

Descrição do imunoenaaio de captura com­

petitiva para finalidades de dosagem de cininogênio e/ou

ciatatina C: Conforme descrito no ensaio de captura direta,

05 exceto pelo fato de que a fonte de protease é dilulda pre­

viamente em soluções de tampão PBS-Tween 20 0.051 previa­

mente suplemnetadaa com concentrações decreacentea de soro

teste ou soro referência. D

REIVINDICAÇÕES

•••• •• • • • • • • • ... • ...... .. • •• • •• •• • ••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • •• • •• • •••• •• • 9104287

1. Processo de preparação de imunoen­

saios de captura de proteases antigénicas em secreções ou

extratos de origem diversa, caracterizado pelo fato de que

05 certos inibidores de proteases, devido a sua alta afinidade

de ligação por estas enzimas, são utilizados cmo agentes

capturantes ao serem adsorvidos ou covalentemente acoplados

a suportes sólidos, a presença da protease sendo posterior­

mente detectada por métodos imunoenzimãticos, radioisomé-

10 tricoa ou de aglutinação de part!culas de natureza diver-

sas.

2. Processo de acordo com a reivindica­

ção 1, caracterizado pelo fato de que os inibidores captu­

rantes são isolados de fontes naturais ou produzidos por

15 métodos de engenharia genética ou s!ntese qu!mica.

20

3. Processo de acordo com a reivindica­

ção 1, caracterizado pelo fato de que a reação entre a pro­

teinase antigénica e o inibidor envolve ligações revers!­

veis ou covalentes.

4. Processo de diagnóstico imunológico,

a partir do processo de preparação de imunoensaio de captu-

- 2 - •••• •• . . . . • • • ••• • •• •• • •

• •• • •• • •• • • ••• •• •• • ••• • • • • •

• • • •••• • • • ••• •• • •• • • • • • • • • • • • •••• •• •

9104287 ra conforme descrito na reivindicação 1, caracterizada pelo

fato de que as substâncias antigenocas detectadas são pro­

teases capturadas por inibidores apropriados.

s. Processo de acordo com a reivindica­

OS ção 4, caracterizado pelo fato de que os ant!genos captura­

dos são de origem infecciosa ou são alergênicos.

10

6. Processo de acordo com a reivindica-

ção s, caracterizado pelo fato de que o ant!geno capturado

é uma tiol proteinase do trypanosoma cruz!.

7. Processo de acordo com a reivindica­

ção 6, caracterizado pelo fato de que a tiol proteinase e

a GP57/51 de origem natural ou recombinante, e/ou formas

modificadas das mesmas.

e. Processo de acordo com a reivindica-

15 çio 4, caracterizado pelo fato de que o ant!geno capturado

é uma tiol protease de Leishmania sp.

9. Processo de acordo com a reivindica­

ção 4, com a finalidade de detectar e/ou quantificar prote­

ases definidas em fluidos inflamatórios, secreções diver-

20 sas, ou extratos de células neoplãsicas, caracterizado pelo

fato de as referidas proteases serem identificada por anti­

corpos monoespec!ficos.

10. Processo de imunoensaio de captura

competitiva para dosagem de inibidores de protease em flui-

25 dos biológicos de origem diversa, caracterizado pelo fato

de que as soluções contendo inibidores idênticos e/ou fun­

cionalmente compat!veis ao capturante de fase sólida, ini-

- 3 - •••• •• • • • • • • • ••• • •• • • • •

9104287 .: .... : .. .. . ... . . . . . . : . .. . . . • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• •

bem quantitativamente a ligação da protease antigênica ao

suporte sólido.

11. Processo de acordo com a reivindica­

ção 10, caracterizado pelo fato de que os inibidores são

05 cistatina ou cininogênio.

12. Processo de acordo com a reivindica­

ção 10, caracterizado pelo fato de que as proteases são

pertencentes a superfamllia da papaina.

13. Processo de isolamento de ant!genos

10 de interesse em diagnóstico, caracterizado pelo fato de que

15

inibidores de protease de origem natural e/ou produzidos

por mêtodos de engenharia genética e/ou s!ntese qulmica são

acoplados em resinas com o objetivo de purificar por afini­

dade o ant!geno para aplicação em kits diagnósticos.

14. Processo de acordo com a reivindica­

ção 13, caracterizado pelo fato de que cistatina, cininogê­

nio e/ou inibidores naturais e/ou sintéticos, revers!veis e

especlficos para proteases da superfamllia da papaina são

utilizados em coluna de afinidade, com o objetivo de puri-

20 ficar o antigene para utilizá-lo subsequentemente em kits

de diagnóstico.

15. processo de detecção e quantificação

de proteases em extratos e/ou fluidos biológicos de origem

microbial, vegetal ou animal, caracterizado pelo fato de

25 que as ditas proteases antigênicas capturadas por inibidor

de protease conhecido, adsorvido ou acoplado a suporte só­

lido, sendo a identificação feita por anticorpos anti-pro-

- 4 - •••••• • • • • • • • ••• • •••• ••

9104287 • •• • •• •• • ••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• •

tease presentes em antissoros produzidos contra células

e/ou extratos a serem investigados.

16. Processo de detecção e quantificação

de inibidores de proteases em células, extratos e/ou flui-

OS dos biológicos de origem microbial, vegetal ou animal, ca­

racterizado pelo fato de que os ditos inibidores são captu­

rados por proteases conhecidas, adsorvidas ou acopladas em

suportes sólidos, sendo a identificação feita por anticor­

pos anti-inibidor presentes em antissoros produzidos contra

10 células, extratos e/ou fluidos biológicos.

17. Processo de preparação de reagente

para diagnóstico, caracterizado pelo fato de ser constitui­

do de cistatina e humana recombinante, ou cistatina e de

ovo de galinha, ou de cininogênio humano purificado prepa-

lS rados em tampão convencional respectivamente nas concentra­

ções de 1 ug/ml, 10 ug/ml e 10 ug/ml, adicionadas em placas

plástica usualmente empregados para adsorver ant!genos em

ensaios imunoenzimáticos, durante 12 horas a 4 oc, e subme­

tidos a ciclos de lavagem e bloqueio em tampão constitu!do

20 de PBS contendo o.os, TWeen, o suporte forrado sendo subse­

quentemente sensibilizado com uma fonte de ant!geno bruto

ou parcialmente fracionado do organismo de interesse, por

um per!odo de 2 horas a 37 oc, após o que as placas são no­

vamente lavadas com PBS-0.0SI TWeen.

2S 18. Processo de acordo com a reivindica­

ção 17, caracterizado pelo fato de que após o ciclo final

de lavagem adiciona-se fixadores capazes de promover liga-

05

10

15

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ções covalentes entre o inibidor e a protease capturada.

19. Kits para diagnóstico, contendo rea­

gentes obtidos pelo processo de reivindicação 17, caracte­

rizado pelo fato de adicionalmente conter:

a) placas ou tiras de plástico conven­

cionalmente utilizadas para imunoensaio, e sensibilizadas

com o antlgeno capturado.

b) poços de controles sensibilizados

apenas com inibidores.

c) amostras de soro de referência.

d) imunoconjugados anti-traço imunoglo­

bulinas da espécie a ser ivestigada.

e) substratos para as enzimas dos conju­

gados.

f) soluções diluentes. lub) g/ml de cis­

tatina e humana recombinante, ou 10 ug/ml de cicinogênio

humano purificado 5 ug de natureza diversa sensibilizadas.·

FIGURAS

•••• •• • • • • • • • ... • •••• ••

• •• • •• • ••••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• • 910428,

Figura 1: Placas de poliestireno pre­

viamente forradas com concentrações crescentes de cistatina

humana recombinante ou BSA (controle), foram bloqueadas com

05 PBS-0.051 TWeen e foram em seguida incubadas por 2 horas a

37 oC com 41 ug/ml de fração solúvel complexa de T. cruzi.

Os poços foram lavados 13 ciclos, PBS-0.051 TWeen gelado),

e em seguida foram incubados com soros humanos provenientes

de indiv!duos chagásicos ou normais (controle), a reação de

10 anticorpos humanos com GP57/51 capturada pelo suporte sóli­

do foi revelada com imunoconjugado peroxidase anti-IgG hu­

mana e OPD, de acordo com métodos estabelecidos.

Figura 2: ELISA. Titulação da fração T.

cruzi (dilu!das em PBS-0.051 TWeen) sobre placas de polies-

15 tireno previamente forradas com concentrações ótimas de

cistatina ou equivalente de BSA.

Figura 3: ELISA de captura com cininogê­

nio humano. Poços de ~oliestireno forma sensibilizados com

concentrações crescentes de cininogênio ou BSA, antes de

20 serem expostos à extrato bruto de T. cruzi de modo análogo

ao experimento descrito na Fig. 1. Sorologia feita com so­

ros chagásicos e normais. Reação revelada por método imuno­

enzimático, conforme já descrito.

- 1 -•••••• • • • • • • • ... •••• •• •

910428? • •• • •• •• • ••• ·: : : : . . : . . . • • • •••• • •••••• • • • •• • • • • ••• •• • •••• •• •

Figura 41 ELISA de captura. Comparação

da eficácia relativa de cininogênio humano purificado com

ciatatina e humana recombinante. As placas foram forradas·

com concentrações ótimas de cada um doa inibidores, e cada

05 série foi incubada com diluições decrescentes da fração de

T. cruzi. As curvas obtidas evidenciam maior sensibilidade

para o reagente cininogênio.

Figura 5: ELISA de captura com ciatatina

C recombinante. Antigenicidade da tiol proteinaae presente

10 em liaado de L.M. amazonenaia comparada com estrato T. cru­

zi. Soro de camundongos crõnicamente infectados com leiah­

mania. Especificidade da reação demonstrada com anticorpo

monoclonal anti-GP57/51. Colunas negras, poços forrados com

ciatatina e tratados com fonte de proteaae parasitaria.

15 Barras listradas, poços forrados com BSA, e tratados com

fonte de proteaae parasitaria.

Figura 6: ELISA de captura com ciatatina

e recombinante: especificidade da reação aorológica. Amos­

tras individuais de soros humanos chagáaicoa va. soro huma-

20 no normal, foram incubados com poços previamente sensibili­

zados com cisi·atina e recombinante ou BSA, como controle, e

subsequentemente expostos à fonte da proteinase de T. cru­

zi.

Figura 7: ELISA de competição. Titulacão

25 de proteinas séricas humanas relacionadas com

cinogênio/cistatina e. Diluições crescente de soro são mis-

- 2 - •••• •• • • • • • • • ••• • •••• ••

9104287 • •• • •• • ••••• •: : : : . . . . . . • • • •••• • ••••••• • • • • • • • • ••• •• • •••• •• •

turadoa com concentração fixa da fonte de proteaae. Batas

amostras foram em seguida adicionadas à poços previamente

sensibilizados com ciatatina e recombinante. Anticorpos mo­

noclonais anti-GP57/51 foram utilizados para quantificar a

05 GPS57/51 capturada pela cistatina e ou por BSA. Controle

positivo: protease dilulda em PBS-Tween na ausência de ao-

ro.

Figura 1 •••••• • • • • • • • ••• • •••• ••

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--. ., ... , ... ,,,ao,o : anticorpo monoalonal antl-GP57/51

RESUMO

•••• •• • • • • • • • ... • ••••••

9104287 • •• • •• •• • ••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • •••• • • • • • • • • • • • • ••• •• • •••• •• •

Patente de Invenção: •Processo de prepa­

ração de imunoensaios de captura de proteases antigênicas

em secreções ou extratos de origem diversa, Processo de

05 imunoensaio de captura competitiva para dosagem de inibido­

res de protease em fluidos biológicos de origem diversa,

Processo de isolamento de ant!genos de interesse em diag­

nóstico, Processo de detecção e quantificação de proteasea

em extratos e/ou fluidos biológicos de origem microbial,

10 vegetal ou animal, Processo de detecção e quantificação de

inibidores de proteases em células, extratos e/ou fluidos

biológicos de origem microbial, vegetal ou animal, Processo

de preparação de reagente para diagnóstico e kits para

diagnóstico".

15 Trata-se de processo de preparação de

imunoensaio em que proteasea antigênicas são capturadas de

extratos celulares ou fluidos biológicos de origem diversa,

por inibidores de protease pré-absorvidos em suportes sóli­

dos, sendo em seguida utilizadas como ant!geno em reações

20 imunológicas. O imunoensaio permite detectar e/ou quantifi-

car anticorpos contra a protease capturada. No formato de

imunoensaio competitivo, o método permite detectar ou dosar

inibidores de proteases em soluções biológicas. O processo

- 2 -•••• •• • • • • • • • ...

• •••• ••

9104287 • •• • •• • ••••• •• • • • • • • • • • • • • • • •• • : : : ··:· . . : : :

••• •• <I •••• •• •

pode ser desenvolvido em qualquer classe de protease, a

eficácia e seletividade da captura por um dado inibidor

sendo determinada pela constante de associação entre este e

a enzima escolhida. Inibidores naturais, recombinantes ou

05 sintéticos podem ser utilizados como reagentes capturantes

de fase sólida, Reciprocamente, a incorporação de proteases

definidas em suportes sólid_os permite detectar novos inibi­

dores em extratos celulares ou fluidos biológicos comple­

xos, desde que estes possuam determinantes antigenicos. Um

10 novo teste di~gnóstico para a Doença de Chagas,preparado

com o ant!geno GP57/51, a principal ciste!no-proteinase do

protozoário Trypanosoma cruzi, foi concebido utilizando o

referido processo. o ant!geno GP57/51 foi seletivamente

capturado de extratos de epimastigotes por inibidores espe-

15 c!ficos para proteases da superfamilia da papaina, previa­

mente absorvidos em placas de poliestireno, Como reagentes

capturantes de fase sólida foram testados alternativamente

os inibidores cistatina c recombinate, a cistatina C puri­

ficada de ovo de galinha, e o cininogenio humano, As placas

20 contendo o aµt!geno capturado foram lavadas, bloqueadas, e

os anticorpos presentes em soros de pacientes chagásicos ou

anticorpos monoclonais anti-GP57/51 forma revelados por mé­

todos imunoenzimáticos convencionais. Além da aplicação

proposta para o diagnóstico da Doença de Chagas, a invenção

25 pode ser utilizada para (1) monitorar os n!veis plasmáticos

de anticorpos reag!nicos contra proteases alergenicas de

origem parasitária, animal ou vegetal e (2) para detectar e

- ~ - •• •• •• - . . . • • • ••• • • •• • • •

9t 04.2~ 7 " ... . . . .. . ... .. . .. . . . . . ' .. . . . . .. . . . -.... . . . . . . . . . . . .,

••• • • • •••• •• •

dosar proteases especificas em fluidos inflmatórios e ex­

tratos celulares, na medida em que antissoros monoespec!fi­

cos anti-protease forem dispon!veis. No formato de imunoen­

saio competitivo, o invento permite dosar os n!veis de ini-

05 bidores de protease cistatina e e/ou cininogênio, em flui­

dos biológicos. Além do interesse clinico laboratorial, o

processo pode ter aplicação biotecnológica, uma vez que

permite identificar novas proteases ou novos inibidores em

10 microorganismos, extratos ou secreções de origem vegetal ou

animal.