FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA V2

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FERMENTAO ALCOLICA .................................................................................... 9 Microbiologia Bsica.................................................................................................... 9 Leveduras ................................................................................................................. 9 Morfologia da clula............................................................................................. 9 Forma da clula ................................................................................................ 9 Tamanho da clula ............................................................................................ 9 Estrutura da clula .............................................................................................. 10 Parede celular ................................................................................................. 10 Membrana citoplasmtica ou Plasmalema ..................................................... 10 Ncleo............................................................................................................. 11 Vacolos ......................................................................................................... 11 Mitocndria .................................................................................................... 12 Citoplasma ...................................................................................................... 13 Cpsulas .......................................................................................................... 13 Reproduo ......................................................................................................... 13 Reproduo vegetativa ................................................................................... 13 Reproduo por esporos ................................................................................. 14 Fisso .............................................................................................................. 14 Leveduras contaminantes ou nativas .................................................................. 14 Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras....................... 17 Nutrio e crescimento das leveduras ................................................................ 19 Bactrias ................................................................................................................. 20 Morfologia das clulas bacterianas..................................................................... 20 Forma das bactrias ........................................................................................ 20 Dimenses da clula bacteriana...................................................................... 21 Estrutura bacteriana ............................................................................................ 21 Membrana citoplasmtica ou protoplasmtica ............................................... 23 Citoplasma ...................................................................................................... 23 Material celular ............................................................................................... 23 Flagelos........................................................................................................... 24 Cpsulas .......................................................................................................... 24 Reproduo bacteriana ....................................................................................... 24 Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana ............................................ 26

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Caracterizao e Classificao dos Microrganismos.......................................... 27 Classificao em Nvel de Gnero.................................................................. 28 Classificao em Nvel de Espcie ................................................................. 29 Grupos Relevantes em Usinas de Acar e lcool ............................................ 30 Estudo do fenmeno da floculao......................................................................... 37 Medida da Floculao......................................................................................... 39 Monitoramento e interpretao dos dados do laboratrio industrial .......................... 40 Tabela para interpretao das anlises laboratoriais............................................... 41 Procedimentos ........................................................................................................ 43 Fatores que afetam o desempenho fermentativo ........................................................ 47 Glicerol ................................................................................................................... 48 cido succnico ...................................................................................................... 49 cido actico .......................................................................................................... 49 Biomassa................................................................................................................. 50 Estequiometria da fermentao .............................................................................. 50 Carboidratos de reserva .......................................................................................... 50 Espcie de levedura ................................................................................................ 51 Identificao de leveduras pela tcnica da cariotipagem.................................... 52 Permanncia de leveduras tradicionais no processo fermentativo ..................... 53 Seleo de linhagens para fermentao industrial .............................................. 53 Nutrio mineral da levedura ................................................................................. 54 Principais nutrientes e suas funes ................................................................... 55 Potssio ........................................................................................................... 55 Magnsio ........................................................................................................ 55 Clcio .............................................................................................................. 55 Zinco ............................................................................................................... 56 Mangans ........................................................................................................ 56 Ferro ............................................................................................................... 56 Cobre .............................................................................................................. 56 Molibidenio, Cobalto e Boro .......................................................................... 56 Nitrognio ....................................................................................................... 56 Fsforo ............................................................................................................ 57 Enxofre ........................................................................................................... 58

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Inibidores da fermentao ...................................................................................... 58 Alumnio ............................................................................................................. 58 Sulfito ................................................................................................................. 59 Temperatura ........................................................................................................ 59 pH ....................................................................................................................... 60 Contaminao bacteriana.................................................................................... 61 MATRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAO ALCOLICA ................................. 62 Caldo: composio, pr-tratamento, controle de qualidade ....................................... 62 Composio ............................................................................................................ 62 Pr-tratamento do caldo .......................................................................................... 63 Processos de tratamento ......................................................................................... 63 Processo de tratamento do caldo para destilaria 1 ........................................... 63 Processo de tratamento do caldo para destilaria 2 ........................................... 64 Processo de tratamento do caldo para destilaria 3 ........................................... 64 Processo de tratamento do caldo para destilaria 4 ........................................... 64 Controle de qualidade do caldo .............................................................................. 65 Mel final: composio, armazenamento e controle de qualidade. .............................. 65 Composio ............................................................................................................ 65 Armazenamento ...................................................................................................... 66 Controle de qualidade ............................................................................................. 66 CONTROLE MICROBIOLGICO MICROSCOPIA ............................................... 67 Microscpio tico ....................................................................................................... 67 Microscopia de Campo Claro ................................................................................. 67 Parte mecnica .................................................................................................... 68 Parte ptica ........................................................................................................ 68 Recomendaes para uso do microscpio tico ................................................. 68 Antes de iniciar o uso. .................................................................................... 68 Ajuste da Dioptria........................................................................................... 69 Manuteno do equipamento .............................................................................. 69 Mtodo de determinao da viabilidade celular de leveduras .................................... 70 Especificaes da cmara de NEUBAUER............................................................ 71 Preparo das solues............................................................................................... 72 Soluo estoque de Eritrosina............................................................................. 72

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Tampo Fosfato .................................................................................................. 72 Soluo de trabalho ............................................................................................ 73 Procedimento analtico ........................................................................................... 73 Clculos .................................................................................................................. 74 Viabilidade celular.............................................................................................. 74 Contagem de clulas em brotamento .................................................................. 74 Populao de Leveduras ..................................................................................... 74 Exerccios ........................................................................................................... 75 Mtodo para contagem de bactrias ao microscpio tico ......................................... 75 Preparo das solues............................................................................................... 77 Soluo A - sulfato azul de nilo - 2,0% .............................................................. 77 Soluo B - azul de metileno - 0,20% ................................................................ 77 Soluo de trabalho ............................................................................................ 77 Procedimento analtico ........................................................................................... 78 Amostras de caldos, PCTS, primrio e misto ..................................................... 78 Amostras de vinho bruto e levedo tratado .......................................................... 78 Clculos .............................................................................................................. 79 Exerccios ........................................................................................................... 79 Teste de Gram............................................................................................................. 80 Preparo das solues............................................................................................... 80 Soluo de cristal violeta .................................................................................... 80 Soluo de safranina ........................................................................................... 81 Soluo de iodo-lugol ......................................................................................... 81 Procedimento analtico ........................................................................................... 81 Para Microrganismos em Suspenso Lquida..................................................... 81 Para Microrganismos de Cultivos Slidos ......................................................... 82 Tcnica de Colorao ......................................................................................... 82 Interpretao ........................................................................................................... 83 Quantificao .......................................................................................................... 84 Deteco de esporos ................................................................................................... 84 Preparo das solues............................................................................................... 85 Soluo de verde malaquita .................................................................................... 85 Soluo de safranina ............................................................................................... 85

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Procedimento analtico ............................................................................................... 85 Interpretao/Quantificao dos Esporos ............................................................... 86 Teste de Floculao .................................................................................................... 87 Procedimento Analtico .......................................................................................... 87 Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos, atravs da variao da acidez .. 88 Preparo das solues............................................................................................... 89 Soluo estoque de actidiona (inibidor de leveduras). ....................................... 89 Soluo estoque de Antimicrobianos ................................................................. 89 Procedimento analtico ........................................................................................... 89 Determinao da acidez .......................................................................................... 90 Determinao da acidez sulfrica (inicial e final) das amostras. ...................... 90 Clculo ................................................................................................................ 91 Interpretao dos resultados ............................................................................... 91 Exemplo .................................................................................................................. 92 Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos por spectrofotometria ............... 92 Preparo das Solues Estoque ................................................................................ 92 Meios de Cultivo .................................................................................................... 93 Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer, 1961) ..................................................... 93 Meio de Cultivo ( GLT) ..................................................................................... 93 Preparo do Inculo ................................................................................................. 94 Realizao do Teste ................................................................................................ 94 Leitura da Densidade ptica ( D. O . ) ................................................................... 95 Interpretao dos Resultados .................................................................................. 95 Relao de materiais necessrios para instalao do laboratrio de controle microbiolgico microscopia .................................................................................... 96 Equipamentos ......................................................................................................... 96 Vidraria ................................................................................................................... 96 Reagentes ................................................................................................................ 96 Outros ..................................................................................................................... 97 Pipetadores automticos ......................................................................................... 97 Modelos de boletim para o controle microbiolgico por microscopia ....................... 97 Matria-prima ......................................................................................................... 97 Moenda ................................................................................................................... 98

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Fermentao ........................................................................................................... 98 CONTROLE MICROBIOLGICO PLAQUEAMENTO .......................................... 99 Introduo ................................................................................................................... 99 Esterilizao ............................................................................................................... 99 Esterilizao por Calor mido - Autoclave ........................................................... 99 Constituio da Autoclave ................................................................................ 101 Operao da autoclave .......................................................................................... 101 Esterilizao por Calor Seco ................................................................................ 102 Esterilizao por calor seco Estufa ................................................................ 103 2.1.2 Operao da estufa .............................................................................. 103 Esterilizao por Filtrao .................................................................................... 103 MEIOS de CULTIVO .................................................................................................. 104 Plate Count Agar (P C A - Agar Padro) Bactrias Aerbios Mesfilas Totais .. 104 gar- Man, Rogosa & Sharpe (MRSA) - Bactrias Lcticas Totais .................... 105 Extrato de Levedura- Peptona- Dextrose - gar (YEPD + A) Leveduras .......... 105 Meio Mayeux & Colmer Teste de Sensibilidade ............................................... 105 Meio de Cultivo G. L .T. Teste de Sensibilidade .................................................. 106 INIBIDORES de CRESCIMENTO MICROBIOANO Solues Estoque ............... 106 Bactrias ................................................................................................................... 106 Leveduras ................................................................................................................. 106 MTODOS PARA CONTAGEM DE CLULAS VIVEIS: LEVEDURAS E BACTRIAS ................................................................................................................ 107 Plaqueamento por Incorporao ou Profundidade (Mtodo Pour Plate) .............. 107 Diluio em srie ...................................................................................................... 107 Tcnica de plaqueamento ......................................................................................... 108 Clculo do nmero UFC/ml. .................................................................................... 108 Plaqueamento de Superfcie (Mtodo Spread Plate)............................................. 109 Clculo do nmero de UFC/ml............................................................................. 110 Avaliao da Populao Microbiana por Filtrao em Membrana. ......................... 110 Procedimento analtico ......................................................................................... 112 Clculo do nmero de UFC/ml............................................................................. 112 Cultivo por Estrias .................................................................................................... 113 Procedimento analtico ......................................................................................... 113

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Cultivo em PetriFilm ............................................................................................. 114 Procedimento analtico ......................................................................................... 114 Clculo do nmero de UFC/ml............................................................................. 115 OUTRAS ANLISES .................................................................................................. 115 Avaliao da Floculao da Levedura ...................................................................... 115 Procedimento Analtico .................................................................................... 116 FLOCULAO DAS CLULAS DE LEVEDURAS ................................................ 117 Floculao da levedura pela bactria Lactobacillus fermentum ............................... 119 Aspectos gerais ..................................................................................................... 120 Aspectos genticos ............................................................................................... 122 Ao de ons ......................................................................................................... 123 Aspectos fsico-qumicos...................................................................................... 124 Aspectos qumicos ................................................................................................ 124 Mecanismos de floculao ................................................................................... 124 Hidrofobicidade celular .................................................................................... 124 Ligao tipo-lectina .......................................................................................... 125 Reconciliao dos dois mecanismos ................................................................ 125 Cofloculao levedura-bactria ............................................................................ 125 Ao de bactrias .................................................................................................. 126 Consideraes importantes ................................................................................... 127 CIDO LTICO .......................................................................................................... 128 Produo de cidos por microrganismos .................................................................. 128 Histrico ............................................................................................................... 128 Consideraes Gerais ........................................................................................... 129 Bactrias lticas ................................................................................................ 129 Requerimentos nutricionais .............................................................................. 130 Caractersticas da colnia ................................................................................. 130 Tolerncia acidez: .......................................................................................... 130 Padres de fermentao de carboidratos em bactrias lticas .............................. 130 Bactrias homofermentativas ........................................................................... 130 Bactrias heterofermentativas .......................................................................... 131 Principais bactrias lticas .................................................................................... 131 TIPOS DE FERMENTAO ALCOLICA.............................................................. 131

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Fermentao descontnua ou batelada ...................................................................... 131 Conduo da fermentao .................................................................................... 131 Providencias preliminar para partida ................................................................ 131 Partida e sistemas de partida............................................................................. 132 Partida com tubo de cultura pura .................................................................. 133 Partida com leite de fermento selecionado ................................................... 135 Partida com fermento prensado .................................................................... 137 Controle operacional da fermentao contnua ........................................................ 138 Introduo e estratgias ........................................................................................ 138 Interpretao dos parmetros do laboratrio ........................................................ 139 Critrios de dimensionamento da fermentao alcolica ......................................... 140 Dornas................................................................................................................... 140 Resfriamento de dornas ........................................................................................ 142 Centrfugas de fermento ....................................................................................... 144 Tratamento do fermento p-de-cuba.................................................................. 145 PERDAS DURANTE O PROCESSO.......................................................................... 145 Qualidade da cana-de-acar .................................................................................... 146 Lavoura ................................................................................................................. 146 Carregamento, transporte e recepo.................................................................... 147 Armazenamento: ptio e barraco ........................................................................ 147 Lavagem ............................................................................................................... 148 Preparo e extrao ................................................................................................ 148 Caldo e mosto ........................................................................................................... 149 Aquecimento e decantao ................................................................................... 149 Resfriamento do mosto ......................................................................................... 151 Fermentao ............................................................................................................. 151 Centrifugao ........................................................................................................... 151 Tempo de aproveitamento ........................................................................................ 152

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FERMENTAO ALCOLICAMicrobiologia BsicaLevedurasA palavra levedura traz imediatamente mente a idia "fermentao", pois os dois termos tm sido muito associados atravs da histria. Entretanto, o desenvolvimento do conceito de levedura pode ser considerado como tendo tido incio por volta de 1680 (Van Leeuwenhoek). Mas foi somente aps os estudos do gnio Pasteur, em 1876, que se caracterizou a individualidade da levedura como um organismo vivo com caractersticas prprias.

Morfologia da clulaForma da clulaA clula da levedura pode apresentar vrias formas, as quais podem ser os resultados da maneira de reproduo vegetativa bem como das condies de cultivo e idade da cultura. As formas que mais comumente so encontradas so esfrica, globosa, ovide e alongada, embora existam certas leveduras com formas altamente caractersticas. Entretanto, dizer que uma determinada forma de clula caracterstica de uma dada espcie ou gnero, no significa que em uma populao de leveduras todas as clulas apresentaro aquela forma, mas pelo menos em um determinado perodo do desenvolvimento celular as clulas tero uma forma caracterstica.

Tamanho da clulaO tamanho da clula de levedura tambm variado, mas numa cultura jovem o tamanho da clula pode ser bem uniforme em algumas espcies ou extremamente heterogneo em outras. Estas disparidades podem ser usadas para diferenciao entre espcies e algumas vezes at mesmo entre linhagens da mesma espcie. De uma maneira geral as leveduras industriais variam consideravelmente no que se refere s suas dimenses, com limites desde 1 a 5 m de largura e 5 a 30 m de comprimento.

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Estrutura da clulaA maioria das investigaes feitas sobre as estruturas da clula de levedura baseada em trabalhos feitos com Saccharomyces cerevisiae. As informaes sobre a citologia da levedura tm sido obtidas por observaes diretas com o microscpio ptico, tcnicas de colorao da clula para componentes especficos, microscopia eletrnica de transmisso de cortes ultrafinos das clulas, bem como atravs da microscopia de varredura. As principais micro-estruturas da clula de levedura so: a parede celular, a membrana citoplasmtica ou plasmalema, o ncleo, um ou mais vacolos e a mitocndria.

Parede celularA parede celular pode ser vista com um simples microscpio ptico (campo claro) como uma linha externa da clula. Embora um pouco elstica, sua rigidez responsvel pela forma particular que a clula apresenta. Com o microscpio eletrnico de varredura, quando a clula ntegra observada pode-se verificar perfeitamente a presena das cicatrizes dos brotamentos na parede celular. A parede celular das leveduras fina nas clulas jovens, espessando-se com a idade. Os principais constituintes da parede celular de Saccharomyces cerevisiae so os polissardeos glicano (30 a 34%) e manano (30%). Basicamente a parede celular do gnero Saccharomyces consiste de trs camadas: a camada interna de glucana insolvel em alcali; a camada intermediria de glucana solvel em alcali e a camada exterior de glicoprotena na qual o carboidrato a manana fosforilada. Na parede celular so encontrados ainda outros compostos, como lipdeos e heteropolissacardeos, dependendo do gnero e espcie considerados. As protenas so constituintes constantes das paredes celulares das leveduras. Saccharomyces cerevisiae apresenta 6 a 8% de protenas, parte das quais provavelmente enzimas, j que invertases e outras hidrolases foram identificadas na parede celular. As concentraes em lipdeos variam de 8,5 a 13,5%. A quantidade de quitina tambm varia com a espcie sendo que Saccharomyces cerevisiae apresenta entre 1 a 2% deste composto; j a glicosamina foi encontrada em pequenas quantidades nas paredes das leveduras.

Membrana citoplasmtica ou Plasmalema

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Esta estrutura localizada diretamente abaixo da parede celular e tem uma importante funo na entrada seletiva de nutrientes do meio de crescimento. Ela protege tambm a clula de perder compostos de baixo peso molecular por vazamento do citoplasma e ela representa a "matriz" sobre a qual os compostos da parede celular so depositados durante o crescimento da clula. Na composio qumica do plasmalema encontrada uma mistura complexa de lipdeos neutros (mono, di e triglicerdeos), esterois livres e esterificados (principalmente ergosterol), esfingolipdeos complexos, glicerofosfatideos, neutro e cido glicolipdeos. Os cidos graxos nos vrios componentes so de cadeia longa (C16 - C26) com o cido olico (C18:1) sendo o cido graxo mais importante.

NcleoO ncleo das clulas de levedura no facilmente visto ao microscpio ptico (campo claro) quando as clulas so preparadas para observao em suspenso aquosa. Por outro lado, ao microscpio de contraste de fase, o ncleo pode ser observado em leveduras desenvolvidas em meio nutritivo contendo 18-21% de gelatina. Os exames de cortes ultrafinos mostram que o ncleo das leveduras uma organela bem definida, circundada por uma membrana nuclear semipermevel, com funes metablicas e reprodutivas. O ncleo composto de uma parte opticamente densa, o nuclolo, e uma poro menos densa que contm o material cromatnico. Alm do DNA, o ncleo contm vrias categorias de RNA e um tipo de polifosfato com uma cadeia de 20 a 40 resduos de ortofosfato. Durante a formao do brotamento das leveduras a diviso do ncleo acompanhada por alongamento e constrio deste, a qual acontece naturalmente no pescoo do broto. Ambos, nuclolo e a poro contendo cromatina se dividem e so incorporados no ncleo das duas novas clulas.

VacolosQuando as clulas de levedura so vistas ao microscpio de contraste, usualmente pode-se observar um ou mais vacolos de diferentes tamanhos (0,3 - 3,0 m de dimetro). Eles tm geralmente aparncia (forma) esfrica e so mais transparentes a um feixe de luz que o citoplasma que os circunda. Quando as clulas so colocadas em meio nutritivo e comeam a emitir brotamentos os grandes vacolos se dividem por constrio em numerosos pequenos vacolos. Durante o desenvolvimento do broto os vacolos so distribudos entre as clulas me e filha (brotamento). Depois de

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completado o processo de brotamento os pequenos vacolos podem se fundir para formar novamente grandes vacolos. Ao microscpio eletrnico pode-se observar que o vacolo cercado por uma simples membrana, a qual dada a sua constituio est relacionada ao transporte de substncias armazenadas no vacolo. Uma grande variedade de compostos de alto e baixo peso molecular pode entrar no vacolo. Por exemplo, no vacolo podem ser encontrados polimetafosfatos (volutina), purinas, derivados de purina de baixa solubilidade formando cristais, os quais apresentam ativo movimento Brawniano e, portanto conhecidos como "dancing bodies". Tambm uma grande poro dos aminocidos livres da levedura armazenada no vacolo e tem sido sugerida inclusive a presena de lipdeos nos vacolos. Os vacolos servem tambm como vesculas de armazenamento para vrias enzimas hidrolticas, incluindo proteases, ribonucleases e esterases. Quando em condies adversas, o vacolo pode se romper e o processo de autlise da clula acontecer. A existncia de hidrolases nos vacolos tambm sugere que estes sejam os lisossomos celulares (compartimento onde se do a ciso e sntese de macromolculas). Os vacolos tambm funcionam como reservatrio energtico, com os materiais acima temporariamente no metabolizados.

MitocndriaAs mitocndrias ocorrem como organelas membranas-limitadas que, ao exame microscpico tm a aparncia de filamentos pregueados com dimetro de 0,3 a 1 m e comprimento de at 3 m. Em Saccharomyces elas esto geralmente localizadas bem prximas periferia da clula, mas em leveduras aerbias obrigadas elas esto mais distribudas atravs do citoplasma. O nmero de mitocndria pode variar de um a vinte por clula. Durante o brotamento celular as mitocndrias tambm se dividem e so distribudas entre a clula me e a filha. Estas organelas so envolvidas por uma membrana externa e outra interna as quais formam as cristas que se estendem dentro do estroma mitocondrial. As mitocndrias so ricas em lipdeos, fosfolipdeos e ergosterol. Elas contm tambm DNA, RNA e protenas, incluindo RNA polimerase e um grande nmero de enzimas respiratrias participando no ciclo do TCA e transporte de eltrons. Uma vez que as mitocndrias contm as enzimas respiratrias, sua principal funo a de converso aerbia de energia. Sob condies anaerbias de fermentao de glucose ou mesmo sob condies

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aerbias em altas concentraes de glucose (5-10%) as mitocndrias parecem se degenerar, transformando-se na chamada promitocndria, com cristas pouco desenvolvidas, o que faz com que diminua a capacidade respiratria. Por outro lado, a respirao pode ser restabelecida facilmente pela diminuio da concentrao de glucose e arejamento das clulas.

CitoplasmaO citoplasma a matriz na quais todas as organelas discutidas at agora esto localizadas. Ele contm grandes quantidades de ribosoma, polifosfato e os polissacardeos de reserva, glicognio e trealose, enzimas glicolticas, etc. De 1,0 a 5,0% de DNA da levedura podem estar presentes no citoplasma.

CpsulasAlgumas leveduras so cobertas por um material extracelular limoso, viscoso e aderente, que a substncia capsular. A maior parte das cpsulas de leveduras tem composio polissacardica, incluindo heteropolissacardeos e substncias semelhantes ao amido.

ReproduoReproduo vegetativaAs leveduras podem se reproduzir por esporulao, por gemulao (brotamento) ou por fisso. O mtodo mais comum o da gemulao onde forma-se um tubo a partir do vacolo nuclear, adjacente ao ncleo da clula-me, orientando para um ponto da parede celular mais prxima do vacolo. Ali, forma-se uma pequena protuberncia na superfcie mais externa da clula, produzida por um enfraquecimento local da parede celular existente. O tubo passa para a protuberncia, que aumenta de volume e se enche com material nuclear e citoplasmtico da clula-me. A parede do broto contm apenas material recentemente sintetizado. Quando a gmula estiver com tamanho aproximado ao da clula-me, o aparelho nuclear de ambas as clulas se reorienta, de modo que os entrossomos de cada unidade sejam vistos no ponto de unio. Completada a diviso nuclear, forma-se uma parede transversal, de modo semelhante ao que ocorre nas leveduras em diviso. Durante sua vida uma clula madura produz, por gemulao, uma mdia de 24 clulas-filhas. As gemulaes sucessivas so sempre formadas em locais diferentes na superfcie celular, permanecendo cicatrizes das gmulas como resultado deste processo de reproduo.

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Reproduo por esporosA formao de esporos sexuados em leveduras de grande importncia biolgica. A esporulao constitui uma fase do ciclo sexual da levedura, isto , alternncia da condio haplide (1n cromossomos) e diplide (2n cromossomos). Este ciclo permite a levedura sofrer recombinaes genticas, mutao, hibridao e seleo; processos esses que levam as mudanas evolucionrias (melhoramento gentico). geralmente conhecido que condies de aerobiose so essenciais para esporulao, uma vez que pouco ou nenhum esporo so formados sob condies anaerbias (fermentao). O nmero de esporos pode variar para uma espcie particular, embora a maioria das leveduras forme um nmero mximo definido de esporos em cada asco. Em algumas leveduras o nmero mximo oito. Mas na maioria das leveduras ascosporogenas (Saccharomyces cerevisiae) o nmero mximo de esporos quatro por asco, embora ascos com dois ou trs esporos sejam comuns nesta espcie.

Fisso Durante este processo reprodutivo a levedura aumenta de tamanho ou se alonga, o ncleo se divide e as duas clulas-filhas so formadas. Durante os perodos de rpida multiplicao, as clulas podem se dividir sem se separarem, formando-se cadeias de clulas. Este processo de reproduo caracterstico para o gnero Schizosaccharomyces.

Leveduras contaminantes ou nativasA presena de leveduras contaminantes (selvagem) tem trazido srios problemas para a fermentao, tanto na produo de vinhos como na fabricao de cerveja, e, at mesmo na produo de fermento prensado para panificao. Esses contaminantes podem trazer problemas graves no que se refere ao processo fermentativo e, principalmente a deteriorao do produto final, provocando o aparecimento de sabores e aromas que descaracterizam totalmente a bebida. Na produo de lcool a partir do melao e/ou do caldo de cana-de-acar a presena de leveduras contaminantes tem sido pouco ou raramente mencionada. Entretanto, nas safras 84/85 at 88/89, embora no se tenha feito testes especficos, em algumas destilarias a presena de clulas de levedura com caractersticas diferentes (forma, tamanho, tipo de colnias) daquelas da levedura alcolica foi constatada.

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A proporo destas leveduras em relao levedura alcolica tem variado bastante, desde algumas clulas at quase total dominncia. A origem destas leveduras contaminantes (selvagem) varivel, destacando-se como principais, o melao, o xarope, a gua de lavagem de cana e o prprio solo. Essas leveduras podem chegar as dornas de fermentao tanto na forma vegetativa como de esporos. A predominncia de uma ou de outra forma vai depender do tipo de processo empregado pela indstria, ou seja, com ou sem tratamento trmico do caldo (aquecimento, decantao, concentrao, etc.). Os efeitos da presena de leveduras contaminantes na fermentao alcolica podem ser sentidos pelo abaixamento do rendimento da fermentao, maior tempo de fermentao, maior formao de espumas pelo aumento da viscosidade, etc. A maior ou menor intensidade desses fatores vai depender das caractersticas fisiolgicas da espcie de levedura contaminante, ou seja, se Saccharomyces ou no

Saccharomyces. O caso encontrado por ns (Fermentec) mais impressionante, foi na fermentao contnua da Usina Vale do Rosrio (Morro Agudo), onde a levedura selvagem provocou srios prejuzos. Sua forma era diferente da levedura industrial (TA, no caso) e as clulas filhas no se soltavam da clula me, formando verdadeiros cachos. A quantidade de espuma era intensa e foi necessrio modificar todo o processo para poder continuar produzindo lcool. Esta levedura foi identificada (Barre, Montpellier, Frana) como sendo uma Candida krusei. Esta levedura foi encontrada no caldo, na gua de refrigerao das dornas, e por incrvel que parea, na vinhaa. A passagem pelo aparelho de destilao no conseguia elimin-la completamente. Assepsia rigorosa, monitoramento constante, controle da temperatura de aquecimento do caldo e controle da temperatura da fermentao foram as maneiras que conjuntamente se conseguiu contornar o problema. Na safra 88/89, ocorreram dois casos de contaminao com levedura selvagem entre os clientes da Fermentec, com srios problemas para o processo. Em ambas as indstrias houve um grande aumento do tempo de fermentao e uma sensvel diminuio do rendimento, uma vez que a levedura contaminante dominou completamente o processo. Um levantamento feito por plaqueamento, mostrou que esta levedura se encontrava disseminada em todo o processo, que era oriunda da cana e que estava passando pelo tratamento trmico uma vez que a temperatura de aquecimento era igual ou inferior a 100C.

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As caractersticas bsicas diferenciais desta levedura contaminante eram clulas alongadas com brotamento exclusivamente unipolar (apical). O problema foi resolvido pela troca de todo o fermento em processo e a elevao da temperatura de aquecimento do caldo para 105 - 110C. Testes realizados com meios diferenciais pelo setor de Microbiologia da Fermentec e pelo Instituto National De La Recherche Agronomique da Frana (INRA) mostraram que esta levedura no pertencia ao gnero Saccharomyces, e segundo Barre, era uma Candida krusei de linhagem diferente da encontrada na Vale do Rosrio. Durante as safras 91/92 a 97/98 vrias outras leveduras contaminantes foram isoladas e caracterizadas de amostras de mosto de alimentao e vinho bruto de clientes da Fermentec. Atravs de testes de assimilao e fermentao de carboidratos, segundo o procedimento da taxonomia numrica descrito por GRIFFITHS (1981) foram encontradas Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces capensis, Saccharomyces bayanus, Candida krusei, Pichia ohmeri, Trichosporum brassicae, Torulaspora pretoriensis e Kluyveromyces vanudenii entre outras.

FOTO - 1 e 2: Clulas vegetativas e colnias de Saccharomyces cerevisiae

FOTO - 3 e 4: Clulas vegetativas e colnias de Saccharomyces chevalieri

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FOTO - 5 e 6: Clulas vegetativas e colnias de Kluyveromyces vanudenii

FOTO - 7 e 8: Clulas vegetativas e colnias de Candida krusei

Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras.Em biotecnologia corrente o emprego do termo fermentao para definir reaes microbianas. No conceito bioqumico, se o substrato for completamente oxidado diz-se que h respirao e se o substrato for parcialmente degradado acarretando a formao de metablitos diz-se que h fermentao. A levedura como entidade viva independente, realiza a fermentao do acar com o objetivo de conseguir a energia qumica necessria sua sobrevivncia, sendo o etanol apenas e to somente um subproduto desse processo. Se o homem pretende beneficiar-se dessa habilidade metablica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam propiciar s leveduras, condies ideais para que as mesmas trabalhem a seu favor, isto , com maior eficincia na produo de etanol. A clula de levedura possui compartimentaes para adequao de sua atividade metablica. A fermentao alcolica (gliclise anaerbia) ocorre no citoplasma, enquanto que a oxidao total do acar (respirao) se d na mitocndria. A transformao do acar (glicose) at resultar em etanol e CO2 envolve 12 reaes em seqncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especfica. Tais enzimas sofrem aes de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas, inibidores, substncias do prprio metabolismo, pH, temperatura, etc.), alguns que estimulam, outros que reprimem a ao enzimtica, afetando assim o desempenho do processo.

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O objetivo primordial da levedura ao metabolizar anaerobicamente o acar, gerar uma forma de energia qumica (ATP) que ser empregada na realizao dos diversos trabalhos fisiolgicos (absoro, excreo, etc.) e biossnteses, necessrios manuteno da vida, crescimento e multiplicao, perpetuando assim a espcie. O etanol e o CO2 resultantes se constituem em produtos de excreo, sem utilidade metablica para a clula em anaerobiose. Entretanto o etanol e outros produtos de excreo podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em condies de aerobiose. Em termos energticos a respirao muito mais eficiente (produo de ATP) do que a fermentao, motivo pelo qual, a oxigenao permite uma maior multiplicao da levedura. Durante a fermentao, na seqncia de reaes de produo de ATP, intrnsecas formao de etanol, rotas metablicas alternativas aparecem para propiciar a formao de materiais necessrios produo da biomassa (polissacardeos, protenas, cidos nuclicos, etc.) bem como para a formao de outros produtos de interesse metablico, relacionados direta ou indiretamente com a adaptao e sobrevivncia, os quais desviam esqueletos carbnicos provenientes do acar, reduzindo a produo de etanol. ele, o glicerol, os cidos orgnicos (principalmente o succnico e o actico), que conjuntamente com a biomassa so quantitativamente os principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilbrio do redox celular em anaerobiose. A fermentao alcolica um processo no oxidativo, sem a participao do oxignio molecular (O2), e, portanto, para se manter o equilbrio de redox celular, todo NADH formado (em reaes de oxidao) deve ser consumido em reaes de reduo, acopladas produo de etanol e de glicerol.

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Denise '95

RESPIRAO

CICLO DE KREBS

CADEIA RESPIRATRIA

Figura 3: Esquema da fermentao (em anaerobiose) e da respirao, quando a clula est sob aerobiose e aparecem as mitocndrias ativas (no destaque).

Nutrio e crescimento das levedurasAs leveduras exigem diversos ons inorgnicos (minerais) em concentraes tanto micro como milimolar para manifestarem timos crescimento e rendimento fermentativo. Deficincias ou concentraes elevadas de tais minerais, ou seja, um desequilbrio entre os nutrientes minerais, provoca alteraes metablicas significativas. De todos os elementos encontrados na levedura apenas alguns so considerados essenciais sendo que muitos deles aparecem fortuitamente dependendo da composio do meio no qual a levedura cresceu.

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As necessidades de N, P e S so as mais facilmente justificveis por integrarem constituintes celulares tanto estruturais quanto metabolicamente ativos. J os ons minerais esto predominantemente implicados na atividade enzimtica. Assim o mineral pode funcionar como o centro cataltico de uma enzima (Zn, Co, Mn e Cu), como ativador ou estabilizador da funo enzimtica (K, NH4, Mg), como mantenedor de um controle fisiolgico (pela ao antagnica exercida entre ons), e ainda do ponto de vista estrutural, atuando como neutralizador de foras eletrostticas em diversas unidades celulares aninicas (K, Ca, Mg e Zn neutralizando cargas negativas do DNA, RNA, protenas, membranas fosfolipdicas e fosfomananas da parede celular). Embora se possam postular concentraes timas para cada elemento, existe uma vasta gama de interaes entre os nutrientes minerais resultando que tal concentrao tima altamente dependente da concentrao de outros minerais no meio. Para tornar a situao mais complexa, alguns ons atuam como antagnicos minimizando efeitos inibitrios de outras espcies inicas e por outras inter-relaes metablicas que determinam a quantidade absorvida do on e os efeitos conseqentes. Igualmente, pode-se considerar que a necessidade de um elemento qualquer pode ser diminuda, se o mosto empregado na indstria, geralmente complexo, apresentar o produto final de uma reao catalizada por uma metalo-enzima. Isso ocorre quando o mosto apresenta aminocidos, bases nitrogenadas e outros compostos orgnicos e que so utilizados pela levedura, tornando desnecessria a sntese dos mesmos. Por outro lado, os mostos empregados na indstria podem conter agentes quelantes, sequestrantes e absorventes os quais reduzem a concentrao efetiva de espcies inicas. Assim, minerais de argila, cidos hmicos, aminocidos, protenas, cidos orgnicos, polifenis, cido ftico, polifosfatos e outros materiais coloidais, complexam diversos ons com diferentes afinidades. Os elementos minerais que afetam negativamente a levedura podem ser classificados como elementos txicos, como o caso do alumnio.

Bactrias

Morfologia das clulas bacterianasDas caractersticas principais das clulas bacterianas destacam-se suas dimenses, forma, estrutura e arranjo celular, os quais constituem a morfologia da clula.

Forma das bactrias

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Apesar de existirem milhares de espcies bacterianas, os organismos isolados podem apresentar uma das trs formas gerais: elipsoidal/esfrica, bastonetes e espiralada/helicoidal. As clulas bacterianas elipsoidal-esfricas denominadas de cocos podem apresentar

os seguintes tipos de arranjos: As clulas bacterianas cilndricas ou em bastonetes (bacilos) no se dispem de acordo com os padres encontrados entre os cocos, mas podem se apresentar isolados, aos pares (diplobacilos) e em cadeias (estrepto bacilos). Em alguns casos esses arranjos no constituem padres morfolgicos caractersticos, mas devida a etapa de crescimento ou s condies de cultura. De um modo geral essas duas formas de bactrias so as mais comuns entre os contaminantes nas indstrias do acar e do lcool.

Dimenses da clula bacterianaA unidade de medida da clula bacteriana o micro, que equivale a 10-3 mm. As formas esfricas (cocos) variam de tamanho de 0,5 m a 1,0 m de dimetro. J as bactrias em forma de bastonetes (bacilos) variam de 1,0 m a 5,0 m de comprimento de 0,3 m a 1,0 m de largura. Estas caractersticas podem ser usadas para a caracterizao das espcies bacterianas.

Estrutura bacterianaO exame da clula bacteriana mostra estruturas, as quais so esquematizadas abaixo. Algumas dessas estruturas aparecem apenas em certas espcies, outras so mais caractersticas de uma espcie de que de outra, mas a parede celular e o citoplasma so naturalmente comuns a maioria das clulas bacterianas.

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Parede celularEsta se encontra externamente delicada membrana citoplasmtica e devido a sua rigidez prpria mantm a forma caracterstica da clula mesmo quando esta submetida a condies fsicas extremas (altas presses osmticas ou temperaturas abaixo de zero). A parede celular representa uma poro significativa do peso seco total da clula, podendo ser responsvel por 10 a 40% do peso seco do microrganismo. Ela parece ter uma funo importante na diviso e crescimento celulares, uma vez que a clula bacteriana desprovida de parede celular (protoplasto) incapaz de promover a diviso ou crescimentos normais. Vrias substncias so encontradas na parede celular bacteriana como, por exemplo, o cido diaminopimlico (DPA), o cido murmico e o cido teicico. Estas substncias so tpicas das bactrias. Outros compostos principais da parede celular das bactrias so aminocidos, acares aminados, carboidratos e lipdeos. Todas estas substncias so reunidas para formar substncias polimricas complexas que formam a estrutura da parede celular, como o caso do composto polimrico conhecido como peptidoglicano, responsvel pela rigidez da parede celular. Nas bactrias Gram negativas o peptoglicano constitui uma frao menor do total da parede celular do que nas bactrias Gram positivas, mas de um modo geral a parede celular das clulas Gram negativas quimicamente mais complexa. O contedo lipdico das bactrias Gram negativas consideravelmente maior do que a dos organismos Gram positivos.

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Acredita-se que a funo da parede celular seja a de proporcionar uma moldura rgida que suporte e proteja as entidades protoplasmticas mais sensveis.

Membrana citoplasmtica ou protoplasmticaA membrana citoplasmtica ou protoplasmtica ou simplesmente membrana plasmtica est situada imediatamente abaixo da parede celular, separando esta do material citoplasmtico. Trata-se de uma membrana de real importncia e sendo semipermevel e seletiva, controla a passagem de nutrientes e de resduos para dentro e para fora da clula, respectivamente. Nesta so encontrados tambm vrias enzimas responsveis por diversas funes celulares, como transporte de eltrons e fosforilao oxidativa. Desta forma qualquer modificao (leso) da membrana citoplasmtica poder resultar em morte da clula, sem, contudo, provocar alteraes morfolgicas que possam ser verificadas ao microscpio comum.

CitoplasmaEste representa todo o material celular contido dentro da membrana citoplasmtica. Nele pode-se distinguir uma rea de aparncia granular rica em cido ribonucleico (rea citoplasmtica), uma rea rica em cido desoxiribonucleico (ADN) (rea nuclear ou cromatnica) e uma rea fluida com nutrientes dissolvidos. O cido ribonucleico juntamente com protenas forma corpsculos ou macromolculas densamente aglomeradas por todo o citoplasma. Estas partculas ribonucleoproteicas so denominadas de ribossomos. Nenhum vacolo tem sido observado no contedo citoplasmtico, mas vrias outras incluses podem ser encontradas atravs de tcnicas microscpicas especiais. Dentre estas se incluem grnulos de amido, de pigmentos, polmero de fsforo inorgnico, etc. Acredita-se que geralmente os grnulos podem servir como fonte de material nutritivo de reserva.

Material celular Embora as bactrias no possuam o ncleo tpico das clulas de animais e vegetais superiores, dentro do citoplasma so encontrados corpsculos que so considerados como estrutura nuclear, onde encontrado o ADN da clula bacteriana. Entretanto deve-se usar o termo ncleo, uma vez que se trata de uma forma primitiva de ncleo. O ncleo da clula bacteriana pode ser revelado pelo corante

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de Feulgen, o qual especfico para ADN, ou pela microscopia eletrnica, uma vez que menos denso que o citoplasma. No h evidncia de uma membrana separando o ncleo do citoplasma e durante a replicao do ncleo bacteriano no se tem observado o aparelho mittico, tpico das clulas superiores. FlagelosOs apndices muito finos, semelhantes a cabelos, que se exteriorizam atravs da parede celular e se originam de uma estrutura granular imediatamente abaixo da membrana citoplasmtica so denominados de flagelos. Nem todas as bactrias possuem flagelos, mas pode-se generalizar que muitas espcies de bacilos o apresentam e raramente eles ocorrem em cocos e lactobacilos. Os flagelos so muito pequenos para serem vistos em seu estado natural, pelo microscpio ptico. Uma vez que os flagelos so responsveis pela mobilidade das bactrias e que nem todas as bactrias so flageladas, conclui-se que existem espcies mveis e imveis. O mtodo exato pelo quais os flagelos movimentam a clula bacteriana no conhecido. Uma das hipteses diz que as cadeias proticas se contraem e se relaxam produzindo um movimento ondulatrio que puxa ou empurra o organismo. Outra sugere um mecanismo rotatrio, a partir de uma extremidade fixa, de uma hlice relativamente rgida. A mobilidade pode ser facilmente observada pela microscopia com preparao em gota pendente.

CpsulasAlgumas bactrias esto envoltas por uma substncia viscosa que forma uma camada de cobertura ou envelope ao redor da clula. Estas estruturas so designadas como cpsula ou camada limosa. As cpsulas representam um envoltrio protetor e podem servir tambm como reservatrio de alimentos armazenados e como locais de despejo de substncias de escria. As bactrias capsuladas so responsveis pelo aparecimento de certos prejuzos em processos industriais uma vez que este material de natureza polissacardica pertencentes a diversos tipos como o dextrano, a dextrina, o levano e a celulose.

Reproduo bacterianaDurante o crescimento bacteriano o processo mais comum de diviso celular (multiplicao) a fisso binria, onde uma nica clula se divide em duas, aps o

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desenvolvimento de uma parede celular transversal. Essa diviso da clula um tipo de reproduo assexual. O tempo necessrio para que a clula se divida ou para que a populao duplique conhecido por tempo de gerao, o qual pode variar de 15 a 20 minutos at algumas horas. O tempo de gerao depende da espcie bacteriana e das condies ambientais, ou seja, as bactrias so capazes de crescer numa ampla faixa de condies fsicas, podendo utilizar alimentos muito diferentes, mas seu crescimento timo requer condies especficas para uma dada espcie. Entretanto a fisso binria no o nico processo de reproduo das bactrias. Muitas espcies bacterianas pertencentes a vrios gneros (Bacillus, Clostridium) so capazes de formar, sob certas condies, ou como meio de disseminao da espcie, unidades celulares conhecidas como esporos. Esses esporos so formados no interior

das clulas e portanto so denominados de endosporos. Eles contm somente parte dos constituintes celulares e a sua posio e forma na clula so importantes critrios na classificao dos bacilos. Nas espcies do gnero Bacillus somente um esporo formado por clula, e quando este germina resulta uma nica clula bacteriana. A germinao dos esporos geralmente requer a presena de um aminocido especfico e pode ocorrer somente aps o esporo ter sofrido a ao de fatores fsicos (choque trmico). A resistncia dos esporos bacterianos as altas temperaturas varivel de espcie para espcie, e de um modo geral, temperaturas ao redor de 80C ou mais so apenas suficientes para provocar a germinao dos mesmos. importante mencionar que as bactrias capazes de formar esporos, podem crescer e multiplicar-se por muitas geraes como clulas vegetativas, mas num determinado momento do desenvolvimento pode ocorrer no interior do citoplasma vegetativo, a sntese de um novo protoplasma, que dar origem ao esporo.

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A composio qumica do esporo tpica e todos os esporos bacterianos contm grandes quantidades de cido dipicolnico (5 a 10%), grandes quantidades de clcio, peptidoglicano, os quais formam um complexo Ca- cido dipicolnico-peptoglicano que constitui a camada cortical do esporo. Comparados com as formas vegetativas, os esporos so extremamente resistentes aos agentes fsicos e qumicos adversos. Esta capacidade de sobrevivncia pode ser atribuda sua parede ou capa impermevel a qual por sua vez est associada ao complexo cido dipicolnico-clcio.

Ciclo normal de crescimento da cultura bacterianaQuando se inocula um meio de cultura com certo nmero de bactrias e se observa o nmero de clulas a intervalos regulares por mais ou menos 24 horas, verifica-se que inicialmente parece no haver crescimento, em seguida h um rpido aumento da populao e depois h uma diminuio do nmero de clulas. Esses perodos so conhecidos como fases do crescimento bacteriano, e so assim denominados: lag fase, fase logartmica ou exponencial, fase estacionria e fase de declnio ou de morte.

Log do nmero de bactrias B

C D A Tempo (h)

A - lag fase B - fase exponencial C - fase estacionria

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D - fase de declnio Fig. 8. Curva de crescimento tpica das bactrias. (A) fase lag; (B) fase log (logartmica); (C) fase estacionria; (D) fase de morte ou de declnio. (Pelczar, Reid, Chan - 1981, vol. 1) Na fase lag no significa que as clulas estejam em repouso ou dormentes; ao contrrio durante esta fase as clulas aumentam de tamanho, so fisiologicamente ativas e esto sintetizando novo protoplasma. As bactrias no novo meio podem ser deficientes em enzimas ou coenzimas que devem ser sintetizadas em quantidades suficientes para o funcionamento timo da maquinaria qumica da clula. Ao final da fase lag cada organismo se divide, no entanto como nem todos os indivduos completaram sua etapa lag simultaneamente ocorre um aumento gradual da populao at o trmino desta fase, quando todas as clulas passam a ter capacidade de diviso em tempos regulares. Na fase logartmica ou exponencial as clulas se dividem firmemente, num ritmo constante. A populao grandemente uniforme em termos de composio qumica, atividade metablica e outras caractersticas fisiolgicas. Na fase estacionria a populao permanece constante durante certo tempo, talvez como resultado da completa cessao das divises ou do equilbrio entre o ritmo de reproduo e o equivalente ritmo da morte. A tendncia para o fim do crescimento pode ser atribuda a uma srie de cirscuntncias, particularmente exausto de alguns nutrientes e, com menos freqncia, a produo de produtos txicos. Na fase de declnio ou de morte, as bactrias passam a morrer mais rapidamente do que a produo de novas clulas. Vrias condies contribuem para a morte bacteriana; as mais importantes so a depleo de nutrientes essenciais e o acmulo de substncias inibidoras como os cidos.

Caracterizao e Classificao dos MicrorganismosAs comparaes das caractersticas de grande nmero de microrganismos resultam num sistema de agrupamento das espcies semelhantes. Por fim, cria-se um grupo com caractersticas muito semelhantes, que considerado como uma espcie e recebe um nome especfico, isto , o microrganismo adquire um nome. Por serem individualmente to pequenos que no podem ser visualizados sem ajuda de um microscpio, no prtico trabalhar com um nico microrganismo.

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Por esta razo comum se trabalhar com culturas puras, ou seja, cultura que consiste de uma nica espcie de microrganismos, originada do crescimento de uma nica clula microbiana. Se dois ou mais tipos crescem juntos tem-se uma cultura mista. Antes de se identificar e classificar um microrganismo, suas caractersticas devem ser determinadas com detalhes adequados. As principais a serem determinadas ou observadas, incluem as seguintes:a) caractersticas culturas: os nutrientes exigidos para o crescimento e as condies

fsicas do ambiente que favorecem o desenvolvimento.b) caractersticas morfolgicas: as dimenses das clulas, seus arranjos, a

diferenciao e a identificao de suas estruturas.c) caractersticas metablicas: a maneira pela qual o microrganismo desenvolve os

processos qumicos vitais.d) caractersticas de composio qumica: a identificao dos principais e tpicos

constituintes qumicos da clula.e) caractersticas antignicas: a deteco de componentes especiais da clula que

fornecem evidncia de semelhana entre as espcies.f) caractersticas genticas: a anlise da composio do cido desoxiribonucleico

(ADN), assim como a determinao das relaes entre o ADN isolado de diferentes microrganismos. Uma vez que as caractersticas de um microrganismo tenham sido adequadamente determinadas e catalogadas, possvel identific-lo pela consulta a livros de referncia que contm descries das espcies microbianas (exemplo: BergeysManual of Determinative Bacteriology). Entretanto comum, mesmo hoje, descobrir

que o organismo que est sendo pesquisado muito diferente de qualquer um dos que foram descritos anteriormente e pode, de fato, tratar-se de uma nova espcie. Alm disso, quanto mais informaes forem coletadas sobre os microrganismos existentes, as idias a respeito de seus agrupamentos podem sofrer modificaes.

Classificao em Nvel de Gnero

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A morfologia celular ainda uma caracterstica muito importante na descrio dos gneros de bactrias. Assim as bactrias so divididas em bastonetes e cocos. A diviso celular em um ou dois planos importante na diferenciao dos cocos. Uma caracterstica importante na diferenciao de bactrias em nvel de gnero o tipo de fermentao da glicose em condies padronizadas ( suprimento ilimitado de glicose e de fatores de crescimento como aminocidos, vitaminas e disponibilidade limitada de oxignio). Nessas condies as bactrias so divididas em dois grupos: (1) homofermentativo, envolvendo aquelas que convertem glicose quase exclusivamente a cido lctico e (2) heterofermentativa, as que formam, alm de cido lctico , cido actico, gs carbnico e etanol. Crescimento a determinadas temperaturas usado pra distinguir cocos. Enterococcus crescem a 10C e 45C, Lactococcus e Vagococcus a 10C, mas no a 45C eEstreptococcus no cresce a 10C e a 45C varivel conforme a espcie. Lactococcus e Estreptococcus.

A

tolerncia a 6,5% de sal pode ser usada para distino entre Enterococcus, A tolerncia a acidez e alcalinidade pode ser usada para distino entre os gneros. Os Enterococcus so considerados bem tolerantes a pH extremos. A formao de diferentes ismeros de cido lctico na fermentao da glicose pode ser usada para distinguir Leuconostoc e Lactobacillus heterofermentativos. Os Leuconostoc produzem apenas cido D - lctico e os Lactobacillus DL-lctico. Os Pediococcus e Aerococcus so morfologicamente idnticos, mas os Pediococcus so mais tolerantes a cidos e crescem em condies estritamente anaerbias. Deve-se considerar que h superposio nos fentipos entre os diferentes gneros, e exees as caractersticas consideradas tpicas so bastante freqentes entre as bactrias. Assim a identificao segura destas bactrias requer mtodos sofisticados, envolvendo um nmero grande de provas bioqumicas.

Classificao em Nvel de EspcieAs anlises das caractersticas fenotpicas so ainda importantes na classificao preliminar e no conhecimento de algumas propriedades importantes do ponto de vista industrial. Algumas caractersticas importantes em nvel de classificao de espcie so: (1) tolerncia a pH e sal, (2) crescimento a determinadas temperaturas, (3) configurao do cido lctico produzido, (4) fermentao de diferentes carboidratos, (5) hidrlise da arginina, (6) formao de acetona (teste Voges Proskauer), (7) tolerncia a sais de bile, (8) tipo de hemlise, (9) produo extracelular de polissacardeos, (10) demanda de fatores de crescimento, (11) presena de certas

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enzimas, (12) caractersticas de crescimento no leite e (13) tipificao sorolgica. Outras caractersticas incluem a taxonomia molecular e quimiotaxonomia, como (1) tipo de peptidoglicanas de cido diamnicos, (2) presena e tipo de cidos teicicos, (3) presena e tipo de menaquinonas, (4) relao de G + C no DNA, (5) composio de cidos graxos e (6) mobilidade eletrofortica de desidrogenase do lactato.

Grupos Relevantes em Usinas de Acar e lcoolVeremos a seguir a descrio de algumas espcies dos diferentes gneros de bactrias que frequentemente so encontradas como contaminantes do processo de produo de acar e lcool.Espcie Bacteriana Bacillus subtilis Caractersticas Morfolgicas e Citolgicas Caractersticas Fisiolgicas Produtos do metabolismo

Bastonetes (2,0-3,0 m x 0,70,8 m), isolados e raramente em cadeias, esporulados, esporo elptico central, Gram (+) e com mobilidade.

Aerbios ou anaerbios facultativos, catalase (+), T tima 30-37c (mnima 5-20C). Fermentao da glucose com produo de 2,3 butanodiol + acetona + CO2, levana extracelularmente de sacarose, ativo em pH 5,5 - 8,5.

Bacillus brevis

Bastonetes (1,5-4,0 m x 0,81,2 m), isolados e raramente em cadeias, esporulados, esporo elptico central ou terminal, Gram (+) e com mobilidade. Bastonetes (2,0-5,0 m x 1,21,5 m), tendncia formar pequenas cadeias tranadas, esporulados, esporos elptico central, Gram (+) e com mobilidade.

Aerbios, catalase (+), T tima 30-35C (mnima 10-35C e mxima 40-60C), cido de glucose (v).

Bacillus megaterium

Aerbios, catalase (+), T tima 30C (mnima 3-20C e mxima 35-45C). cido de glucose.

Espcie Bacteriana

Caractersticas Morfolgicas e Citolgicas

Caractersticas Fisiolgicas Produtos do metabolismo

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Bacillus coagulans

Bastonetes (2,5-5,0 m x 0,61,0 m), principalmente isolados, esporulados, esporo elptico central ou terminal, Gram (+) e com motilidade.

Aerbios ou anaerbios facult., catalase (+), T tima 35-40C (mnima 15-25C e mxima 5560C, pH mnimo p/ cresc. 4,05,0, c. de glucose, fermentao de glucose com produo de c. ltico + 2,3 butanodiol + acetona + c. actico + etanol.

Bacillus stearothermophilus

Bastonetes (2,0-4,0 m x 0,5esporulados, esporo oval terminal, Gram (+) e com motilidade. Bastonetes (0,5-0,9 m de largura e comprimento muito varivel), isolados e/ou aos pares, Gram (+), no esporulados, raramente com motilidade.

Aerbios, catalase (+), T tima mxima 65C). cido de glucose.

1,0 m) isolados e em cadeias, 45-50C (mnima 35C e

Lactobacillus fermentum

Anaerbios facultativos, catalase (-), T tima 30-40C (15C (-) e 45C (+)) pH timo 5,5-5,9, heterofermentativos: produo de c. ltico + acetato + etanol + CO2 de glucose, frutose e sacarose.. Anaerbios facultativos, catalase (-), T tima 40C (15C (-) e 45C (+)), homofermentativos: cido ltico de glucose, frutose e sacarose, pH timo: 5,5-5,8. Anaerbios facultativos, catalase (-), T tima 30-40C (15C (+) e 45C (-)), heterofermentativos: cidos de glucose, frutose e sacarose, pH timo: 5,5-5,8.

Lactobacillus delbruecki

Bastonetes (2,0-9,0 m x 0,50,8 m), isolados e/ou em pequenas cadeias, Gram (+) no esporulados, raramente com motilidade.

Lactobacillus plantarum

Bastonetes (3,0-8,0 m x 0,91,2 m), isolados, aos pares e/ou em pequenas cadeias, Gram (+), no esporulados, raramente com motilidade.

Espcie

Caractersticas Morfolgicas

Caractersticas Fisiolgicas -

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Bacteriana Lactobacillus helveticus

e Citolgicas

Produtos do metabolismo

Bastonetes (2,0-6,0 m x 0,61,0 m), isolados, aos pares e/ou em pequenas cadeias, Gram (+), no esporulados, raramente com motilidade.

Anaerbios facultativos, catalase (-), T. tima 30-40C (15C (-) e 45C (+)), heterofermentativos: cido ltico de glucose, frutose, pH timo: 5,5-5,8. Anaerbios facultativos, catalase (-), T tima 30-40C (15C (+) e 45C (-)), heterofermentativos: cidos de glucose, frutose e sacarose, pH timo: 5,5-5,8. Anaerbios facultativos, catalase (-), T tima 30-35C (10C (+) e 45C (-) ), hemofermentativos: produo de cido ltico de glucose, frutose e sacarose.

Lactobacillus brevis

Bastonetes (2,0-4,0 m x 0,71,0 m), isolados e em pequenas cadeias, Gram (+), no esporulados, raramente com motilidade

Lactobacillus yamanashiensis

Bastonetes (2,0-6,0 m x 0,51,0 m) isolados, pares e cadeias, Gram (+), no esporulados e com motilidade

Lactobacillus coryniformis

Bastonetes (1,0-3,0 m x 0,81,1 m) isolados, pares e cadeias, Gram (+), no esporulados e sem motilidade

Anaerbios facultativos catalase (-), T tima 30-35C (10C (+) e 45C (-) ), heterofermentativo facultativo: cido de glucose, sacarose, frutose, maltose, ramnose, manitol, galactose.

Lactobacillus vaccinostercus Bastonetes (1,0-3,0 m x 0,5-

Anaerbios facultativos, catalase (-), T tima 30-35C (15C(-) e 45C (-)), heterofermentativos: cidos de glucose, arabinose, maltose, xilose, galactose, ribose, celobiose.

0,7 m), pares, no esporulado, Gram (+) e sem motilidade

Espcie

Caractersticas Morfolgicas

Caractersticas Fisiolgicas -

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6/7/2011

Bacteriana Lactobacillus viridescens

e Citolgicas

Produtos do metabolismo

Bastonetes (0,7-0,9 m x 2,05,0 m); com extremidades arredondadas; isolados ou aos pares; no esporulados; Gram (+); sem motilidade.

Microaerfilos; catalase (-); oxidase (-); fermentao de glucose (+), frutose e sacarose (+); crescimento a 15C (+); crescimento a 45C (-); heterofermentativas, pH 5,56,2, geralmente com crescimento em pH < 5,0.

Lactobacillus buchneri

Bastonetes (0,7-1,0 m x 2,0curtas; Gram (+); raramente com motilidade; no esporulados.

Anaerbios facultativos; fermentao da glucose (+), frutose (+) e sacarose (V); crescimento a 15C (+); crescimento a 45C (-); pH 5,5-6,2, geralmente com crescimento em pH < 5,0.

4,0 m); isolados e em cadeias heterofermentativos;

Lactobacillus fructivorans

Bastonetes (0,5-0,8 m x 154,0 m); isolados, aos pares e em cadeias; extremidades arredondadas; Gram (+); raramente com motilidade; no esporulados.

Anaerbios facultativos; heterofermentativos; fermentao da glucose (+), frutose (+) e sacarose (V); crescimento a 45C (-); acidfilo (pH favorvel 5,0); no cresce em pH > 6,0; pode utilizar etanol para crescimento.

Lactobacillus fructosus

Bastonetes (0,5-0,8 m x 2,04,0 m); isolados, aos pares e em pequenas cadeias; Gram (+); raramente com motilidade; no esporulados.

Anaerbios facultativos; heterofermentativos; fermentao de glucose (+), frutose (+) e sacarose (-); crescimento a 15C (+); crescimento a 45C (-); pH favorvel 5,5-6,0, cresce em pH < 5,0.

Espcie

Caractersticas Morfolgicas

Caractersticas Fisiolgicas -

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6/7/2011

Bacteriana Lactobacillus acidophilus

e Citolgicas

Produtos do metabolismo

Bastonetes (0,6-0,9 m x 1,56,0 m); isolados, aos pares e em pequenas cadeias; Gram (+); raramente com motilidade; no esporulados.

Anaerbios facultativos; homofermentativos com produo de DL-cido ltico; crescimento a 15C (-); crescimento a 45C (+); fermentao de glucose (+), frutose (+), sacarose (+).

Sporolactobacillus sp

Bastonetes (3,0-5,0 m x 0,7(+), esporulados e com motilidade, esporos elpticos terminais.

Microaerfilos, catalase (-) de frutose, glucose, maltose, rafinose, sacarose, no produz gs. Anaerbios facultativos, T. tima: 20-30C, (mnima 10C e mxima 37C), catalase (-), (-), crescimento em pH 4,8 (-), heterofermentativos: c. de glucose, frutose e sacarose. Formao de dextrana, pH timo 5,5-6,5.

0,8 m) isolados e pares, Gram homofermentativos: cido ltico

Leuconostoc mesenteroides Clulas esfricas e

frequentemente lenticulares (0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m), aos sem motilidade, no esporulados.

pares ou em cadeias, Gram (+), crescimento 10% etanol

Leuconostoc dextranicum

Clulas esfricas ou lenticulares (0,7-1,2 m x 0,50,7 m); aos pares ou cadeias; Gram (+); sem motilidade; no esporuladas.

Anaerbios facultativos; crescimento a 37C (+); fermentao de carboidratos resultando em D (-) cido ltico e etanol ou cido actico ao invs de etanol; catalase (-), oxidase (-); cido de frutose (+), glucose (+), sacarose (+); crescimento em pH 4,8 (-); crescimento em 10% (-).

Espcie Bacteriana

Caractersticas Morfolgicas e Citolgicas

Caractersticas Fisiolgicas Produtos do metabolismo

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Leuconostoc lactis

Clulas esfricas e frequentemente lenticulares (0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m), aos sem motilidade, no esporulados.

Anaerbios facultativos, T tima: 25-30C, (mnima 10C e mxima 40C), catalase (-), (-), crescimento em pH 4,8 (-), formao de dextrana, pH timo 5,5-6,0, heterofermentativos: c. de glucose, frutose e sacarose.

pares ou em cadeias, Gram (+), crescimento 10% etanol

Micrococcus lylae

Clulas esfricas (0,8-1,6 m de ), predominante em ttrades, Gram (+), sem motilidade, no esporuladas, sem cpsula. Clulas esfricas (0,8-1,6 m de ) isoladas, aos pares e ocasionalmente em ttrades e cachos, Gram (+), sem motilidade, no esporuladas, sem cpsula. Cocos (0,6-1,0 m de ), aos pares ou em ttrades, Gram (+), sem motilidade, no esporulado, sem cpsula.

Aerbios (oxidativos), catalase (+), temperatura tima: 3037C, no exibe metabolismo fermentativo.

Micrococcus halobius

Aerbios (Oxidativos), catalase (+), Temperatura tima: 3035C (crescimento 37C (+)), cido de glucose.

Pediococcus parvulus

Anaerbios facultativos, T tima: 30C (crescimento 35C (+), 40C (-)), catalase (-), pH timo 5,0-6,0 (pH 4,0 (+) e 8,5 (-)), homofermentativos: cido ltico de glucose.

Pediococcus pentosaceus

Cocos (0,8-1,0 m de ), aos pares ou em ttrades, Gram (+), sem motilidade, no esporulado, sem cpsula.

Anaerbios Facultativos, T tima: 35C (40C (+), 50C (-), catalase (-), pH timo 5,0-6,0 (pH 4,0 (+) e 8,5 (v)), homofermentativos: cido ltico de glucose e sacarose (v).

Espcie

Caractersticas Morfolgicas

Caractersticas Fisiolgicas -

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Bacteriana Pediococcus acidilactici

e Citolgicas

Produtos do metabolismo

Clulas esfricas (0,6-1,5 m de ); aos pares ou ttrades; isoladas so raras e nunca em cadeias; Gram (+); sem motilidade; no esporuladas.

Anaerbios facultativos; T tima = 40C; crescimento a 50C (+); fermentao de glucose com produo de DL ou L (+) lactato; catalase (-); oxidase (-); crescimento em pH 7,5 (+); cido de sacarose (-).

Staphylococcus xylosus

Clulas esfricas (0,5-1,2 m de ), isoladas, aos pares e ocasionalmente em ttrades, Gram (+), sem motilidade, no esporuladas.

Anaerbios facultativos, T tima: 35-40C (15C (+), 45C (v)),catalase (+), pH timo 7,07,5, metabolismo oxidativo e fermentativo: cidos de glucose, frutose e sacarose. Anaerbios facultativos; catalase (+); gelatinase (+); crescimento entre 18 e 40C (+); tolerncia a at 10% de NaCl; algumas espcies crescem a 45C; colnias negras brilhantes em BairdParker Agar; colnias amarelas/laranja em Staphylococcus medium 110.

Staphylococcus sp

Clulas esfricas (0,5-1,5 m de ); isoladas, aos pares, ttradas e cachos; Gram (+); sem motilidade; no esporuladas.

Lactococcus lactis

Clulas ovais alongadas no sentido das cadeias, com 0,5cadeias, Gram (+), sem motilidade, no esporuladas.

Aerbios ou anaerbios facultativos, T. tima: 30C sensibilidade a penicilina, pH timo: 6,0-7,0 (pH 9,0(+), pH 9,6 (-)), homofermentativos: cido ltico de glucose e sacarose (v).

1,0 m de , aos pares ou em (10C(+), 45C (-), catalase (-),

Espcie Bacteriana

Caractersticas Morfolgicas e Citolgicas

Caractersticas Fisiolgicas Produtos do metabolismo

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Acinetobacter calcoaceticus Bastonetes curtos (1,5-2,5 m

Metabolismo oxidativo, catalase (+), T tima: 30-32C, pH timo: 7,0, resistente a penicilina, resistncia a KCN (), cidos de glucose.

x 1,0-1,5 m), aos pares e em pequenas cadeias, Gram (-), sem motilidade, no esporulados, com ou sem cpsula.Escherichia coli

Bastonetes (1,1-1,5 m x 2,06,0 m); isolados, aos pares; no esporulados; Gram (-),

Anaerbios facultativos; fermentao cido-mista (produo de cidos ltico,

mteis por flagelos peritrigueos actico e frmico, a partir de glucose); T tima = 37C; ou sem motilidade. oxidase (-), fermentao de lactose com produo de gs.

Estudo do fenmeno da floculaoNo estudo de leveduras, o termo floculao normalmente usado para designar o fenmeno reversvel de agrupamento celular que comumente se desenvolve no final da fase exponencial de crescimento ou na fase estacionria. Isto pode ser causado pela ao de propriedades inerentes das clulas, por agentes qumicos ou microbiolgicos. Na fermentao alcolica industrial, as leveduras floculentas esto normalmente presentes como contaminantes das leveduras normais (no floculentas). Nas usinas alcooleiras, a presena de leveduras floculentas em concentrao superior a 12% causa dificuldade significativa na operao de centrifugao do vinho devido ao fenmeno de co-floculao. Nestas condies acentua-se a sedimentao das clulas de leveduras nas dornas e interfere na operao das centrfugas contnuas. O fator responsvel pela floculao de leveduras governado geneticamente. Alm do fator gentico h outros que interferem ou inibem a sua ao. O meio de cultivo tambm interfere na floculao. A anaerobiose reprime a floculao e a aerobiose induz a formao de protena responsvel pela floculao. A diferena da estrutura entre linhagens floculentas e no floculentas no pode ser detectada pela anlise qumica, mas pode ser visualizada por microscopia eletrnica. As clulas floculentas apresentam superfcie fimbriada ou ciliada e as no floculentas, relativamente lisa.

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O mecanismo exato de floculao da levedura no conhecido. Trabalhos realizados com linhagens floculentas mostraram que a manana da parede celular participava da floculao. A interao se estende por toda rea causando distoro da parede no local do contato. O envolvimento da manana indicado por diversos experimentos: (1) A floculao inibida competitivamente por manana. (2) A hidrlise de protena de clulas no floculentas ou floculentas no altera a sua interao com clulas floculentas intactas. Esse componente protico est associado parede celular no podendo ser removido pelo calor ou tratamento qumico. A fora de ligao entre as clulas floculentas pode ser dada pela ponte de hidrognio ou polissacardeos da parede celular e on Ca+2, associada o grupo carboxila da protena da parede celular. possvel que a ligao seletiva de Ca+2 com protena seja mediada por arranjo especfico do grupo carboxila, mas tambm pode ser que o on Ca+2 atue como cofator na ativao da capacidade de ligao da protena com a manana. A floculao dependente do Ca+2 em quantidades mnimas (10-6 a 10-8). Magnsio pode substituir Ca+2, mas depende do pH, e atua somente ao redor de pH 4,0 enquanto que Ca+2 atua a intervalo de pH maior (pH >3,0). Na fermentao alcolica industrial freqente a contaminao por bactrias do gnero Lactobacillus. Algumas dessas bactrias so capazes de provocar a floculao de leveduras como, por exemplo, Lactobacillus fermentum. Esta floculao apresenta algumas caractersticas similares s leveduras floculentas, como susceptibilidade s altas temperaturas, proteinase e pHs extremos, necessidade de ons metlicos e inibio por manose e excesso de ons. O stio susceptvel temperatura e proteinase est localizado na clula bacteriana e no na levedura. Alm disso, h uma relao numrica celular entre a bactria e a levedura onde se consegue o mximo de floculao, indicando que existe um nmero fixo de stios na levedura para formao do agregado. A necessidade de ons Ca+2 para floculao depende do pH sendo que em concentraes elevadas (> 10-1 M) h desfloculao das clulas. Como no caso de leveduras floculentas, a manose causa a desfloculao. J glicose, maltose e sacarose no produzem nenhum efeito. O tratamento trmico aplicado sobre a clula bacteriana provoca a perda da sua capacidade floculadora. No caso da floculao causada por Lactobacillus fermentum o fator responsvel de natureza protica encontrado na clula bacteriana, e a sua interao com clulas de levedura afetada com variao de pH, presena de ons e manose, termolbil e destrudo por proteinase. Uma floculao especfica tambm pode ser causada por L.plantarum. O fenmeno ocorre a pH entre 2,0 e 4,0 e inibido por sais neutros. O

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estudo da mobilidade eletrosttica das clulas de bactrias e levedura mostrou que a floculao era causada pela atrao eletrosttica entre as superfcies celulares de bactrias e leveduras com cargas opostas. A diversidade dos microrganismos e dos agentes envolvidos na floculao do fermento nas dornas de fermentao, bem como o grande volume de mosto manuseado durante a fermentao alcolica industrial, torna o controle do processo de floculao um desafio de grande importncia e dificuldade. Com a elucidao das causas envolvidas neste processo so provveis que se obtenham meios eficientes e econmicos para o controle da floculao.

Medida da FloculaoAlgumas tcnicas medem diretamente a floculao atravs do exame microscpico ou reduo da turbidez da suspenso celular, mas a maioria das tcnicas encontradas em literatura mede indiretamente, usando como parmetro a velocidade ou grau de sedimentao dos flocos formados. Para medir a sedimentao usa-se no geral, a tcnica da absorbncia tanto da parte no floculada (sobrenadante) como do sedimento formado aps a ressuspenso. Nas diversas tcnicas disponveis, essencial a padronizao das etapas para a sua medida porque a floculao afetada por ons e outros componentes do meio, pH, temperatura, grau e forma de agitao. O exame direto do material ao microscpio, embora fornea informaes detalhadas como o nmero de clulas que integram cada floco e o nmero e diversidade de flocos em relao ao total de clulas de levedura, uma tcnica trabalhosa e demorada, alm de estar sujeita a erros individuais do observador. Embora os flocos grandes que se formam sejam visveis a olho n, essa observao fornece resultados apenas qualitativos. J os testes de sedimentao, mesmo os mais simples que se baseiam na observao visual do sedimento formado, fornecem resultados mais consistentes. Assim, as tcnicas mais comumente utilizadas para quantificar a floculao consistem na medida da sedimentao, que uma forma indireta de avaliar o grau de floculao. No geral, a estimativa das clulas do sedimento formado ou remanescente na suspenso aps a sedimentao feita por turbidimetria. A reduo da absorbncia pela formao de agregado celular pode ser medida em espectrofotmetro. A seguir apresentada uma das tcnicas utilizadas para se avaliar a floculao.

a) Condies de cultivo de clulas para o teste de floculao

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As leveduras devem ser cultivadas em caldo YEPD por 24-48 horas a 30C, utilizando como inculo 1% de um cultivo de 24 horas em caldo - YEPD. As bactrias devem ser cultivadas em caldo MRS por 24-48 horas a 30C, utilizando como inculo 1% de um cultivo de 24 horas em caldo - MRS. Aps o crescimento, as clulas sero centrifugadas a 2000 G por 10 minutos a 4C e lavadas duas vezes com soluo EDTA 0,025M, sendo posteriormente ressuspendidas em tampo citrato 0,05M acrescido de EDTA 0,005M, pH 4,5 ou tampo Tris-HCl 10-1 M, pH 7,0 - 7,5.

b) Teste de floculao

Os testes de floculao devem ser realizados de acordo com o mtodo de Stratford & Keenan (1988), adaptado para a utilizao de suspenses mistas de leveduras e bactrias. Sero adicionados em tubos de ensaio