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FERNANDO MELLO FRÓES DA FONSECA

Papel da atividade física na expressão gênica das vias

proliferativas e de angiogênese na próstata e suas implicações

na prevenção da hiperplasia prostática benigna: estudo

experimental

SÃO PAULO

2017

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências

Programa de Urologia

Orientador: Prof. Dr. Alberto Azoubel Antunes

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

©reprodução autorizada pelo autor

Fonseca, Fernando Mello Fróes da Papel da atividade física na expressão gênica dasvias proliferativas e de angiogênese na próstata esuas implicações na prevenção da hiperplasiaprostática benigna : estudo experimental / FernandoMello Fróes da Fonseca. -- São Paulo, 2017. Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina daUniversidade de São Paulo. Programa de Urologia. Orientador: Alberto Azoubel Antunes.

Descritores: 1.Hiperplasia prostática 2.Exercício3.Obesidade 4.Resistência à insulina 5.Indutores daangiogênese 6.Expressão gênica

USP/FM/DBD-470/17

Dedicatória

Dedicatória

Ao meus pais, Fernando e Janice, por me darem o amor, carinho e educação necessários para o cumprimento adequado da minha jornada nesta vida. Sei o sacrifício que fizeram para que eu pudesse usufruir de oportunidades que

vocês não tiveram. Seus valores e condutas sempre me serviram de exemplo e me motivaram a ser uma pessoa melhor.

A minha irmã Bianca, que sempre torceu pela minha felicidade e pelas

minhas conquistas. Tenha certeza que também torço por você.

A minha esposa Mariana, pelo companheirismo e paciência durante esta jornada acadêmica, cujo início coincide com nosso primeiro encontro neste

mundo. Posso dizer que me sinto um homem realizado e uma pessoa melhor ao final dessa jornada e você é a principal razão disso.

Agradecimentos

Agradecimentos

Ao meu orientador, Prof. Dr. Alberto Azoubel Antunes, pela honra em me receber como aluno, pelos constantes ensinamentos e por ter me abraçado

como parte de sua família. Sua busca por excelência me estimulou a trazer o conhecimento científico para um nível muito acima do que pensei ser capaz

de conseguir.

Ao Prof. Dr. Miguel Srougi, pela oportunidade de ser testemunha ocular de um pequeno ponto na linha de sua extraordinária história de vida, e que,

apesar do seu imenso conhecimento científico, as suas atitudes e qualidades como ser humano é o que levo de mais importante nesse período de

aprendizado.

A Profa. Dra. Sabrina Reis, pelos constantes ensinamentos e por me acolher em seu coração. Amiga e irmã que encontrei nesta vida, um dos exemplos

mais puros de bondade e caráter que já presenciei. Você é uma pessoa verdadeiramente iluminada. Nossos encontros sempre me trazem paz e

alegria.

Ao colega Dr. André Oliveira, pela parceira no desenvolvimento e execução deste projeto. Sua visão acadêmica e científica foi de grande auxílio para o

sucesso desse desafio.

Aos colegas Dr. Fábio Oliveira, Dr. Luiz Araújo, Dr. Renan Éboli, Dr. Paulo Conti, Dr. Adriano Nesrallah, Dr. Fernando Almeida, Dr. Karlo

Biolo e Dr. Marco Nunes, que, em maior ou menor grau, fizeram parte da família que me acolheu em São Paulo e o laço de amizade criado nesse

período é uma das grandes riquezas gravadas em minha alma.

Aos queridos amigos do LIM 55, Nayara, Vanessa, Ísis, Denis e Iran, chefiados pela Profa. Dra. Kátia Ramos Leite, professora por quem tenho muita admiração e carinho. A ajuda de todos vocês foi fundamental para o

meu crescimento acadêmico e pessoal.

Aos colegas da Faculdade de Educação Física da Universidade de São Paulo, especialmente a Profa. Dra. Edilamar Oliveira, Fátima, Vander,

Marcele, Katt e Ney. A realização deste estudo seria impossível sem a ajuda de vocês. A maneira como me acolheram e me ajudaram de maneira tão

Agradecimentos

altruísta é extremamente louvável e portanto expresso meu sincero agradecimento.

Aos colegas do grupo da próstata do Hospital das Clínicas da FMUSP, especialmente o Dr. Paulo Cordeiro, Dr. Mario Paranhos, Dr. Alexandre Iscaife, Dr. Elcio Nakano, Dr. Eduardo Muracca e Dr. Elias Chedid, por

compartilhar experiências e valiosos ensinamentos.

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro na concessão de bolsa de doutorado sob o número

2015/02335-5 e financiamento da pesquisa sob o número 2014/08368-0.

A Deus, por me conceder as ferramentas necessárias para o meu aprimoramento espiritual.

Epígrafe

Epígrafe

“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina” (Cora Coralina)

Normatização adotada

Normatização adotada

Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento de

sua publicação:

Referências: adaptado de InternationalCommitteeof Medical JournalsEditors

(Vancouver).

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A.L.Freddi, Maria

F.Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria

Vilhena. 3ª ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.

Abreviatura dos títulos e periódicos de acordo com ListofJournalsIndexed in

Index Medicus.

Sumário

Sumário

Lista de abreviaturas

Lista de tabelas

Lista de figuras

Resumo

Abstract

1. INTRODUÇÃO............................................................................... 1

1.1 Considerações gerais.................................................................... 2

1.1.1 Hiperplasia Prostática Benigna...................................................... 2

1.1.2 Síndrome metabólica..................................................................... 4

1.1.3 Síndrome metabólica e HPB.......................................................... 5

1.1.4 Atividade física e HPB................................................................... 12

1.1.5 Justificativa..................................................................................... 13

2. OBJETIVOS................................................................................... 15

3. MÉTODOS..................................................................................... 17

3.1 Tipo de estudo............................................................................... 18

3.2 Local e época................................................................................. 18

3.3 Modelo experimental...................................................................... 18

3.4 Intervenção.................................................................................... 18

3.5 Análise da expressão gênica......................................................... 26

3.6 Análise de apoptose por hibridização in situ (TUNEL)................... 27

3.7 Análise estatística.......................................................................... 28

4. RESULTADOS............................................................................... 29

4.1 Considerações iniciais................................................................... 30

4.2 Efeitos da dieta hiperlipídica.......................................................... 30

4.3 Efeitos da atividade física.............................................................. 33

4.4 Análise da expressão gênica......................................................... 35

4.5 Análise de apoptose por hibridização in situ (TUNEL)................... 37

5. DISCUSSÃO.................................................................................. 40

5.1 Modelo experimental...................................................................... 41

5.2 Consumo de oxigênio.................................................................... 44

5.3 Vias proliferativas e de angiogênese............................................. 45

5.4 Análise de apoptose...................................................................... 49

5.5 Considerações finais e perspectivas futuras................................. 50

Sumário

6. CONCLUSÕES.............................................................................. 52

7. REFERÊNCIAS.............................................................................. 54

APÊNDICES

Listas

Lista de siglas e abreviaturas

Akt Proteína quinase B

DHT Dihidrotestosterona

DM Diabetes Mellitus

FEO2 Fração expirada efluente de oxigênio

FIO2 Fração de oxigênio do ar ambiente

FGF Fator de crescimento de fibroblastos

GPER1 Receptor de estrogênio acoplado à proteína G

GSK-3 Glicogênio sintase quinase 3

HDL Lipoproteína de alta densidade

HIF-1 Fator 1 induzido por hipóxia

HOMA Modelo de avaliação da homeostase

HPB Hiperplasia prostática benigna

IGF1 Fator de crescimento semelhante a Insulina do tipo 1

IGF1R Receptor do IGF1

IGFBP Proteína ligadora do IGF1

IL Interleucina

IMC Índice de massa corporal

IRS1 Substrato do receptor de insulina

LDL Lipoproteína de baixa densidade

LDLox Lipoproteína de baixa densidade oxidada

LOX-1 Receptor da lipoproteína de baixa densidade oxidada 1

MAPK Proteíno-quinase ativada por mitógenos

mTOR Proteína alvo da rapamicina em mamíferos

PF Pressão de fluxo

PI3K Fosfatidilinositol 3-quinase

SM Síndrome Metabólica

STUI Sintomas do trato urinário inferior

TNF- Fator de necrose tumoral alfa

VEGF Fator de crescimento vascular endotelial

VEGFR1 Receptor de VEGF do tipo 1

VEGFR2 Receptor de VEGF do tipo 2

VO2 Consumo de oxigênio

VO2máx Consumo máximo de oxigênio

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Primers utilizados para quantificação dos genes

selecionados para estudo.................................................. 27

Tabela 2 - Dados morfométricos (resultados expressos em média) .. 32

Tabela 3 - Dados pressóricos e análise sérica (resultados

expressos em média)......................................................... 34

Tabela 4 - Parâmetros de consumo de oxigênio (resultados

expressos em média)......................................................... 35

Lista de Figuras

Figura 1 - Potenciais mecanismos relacionados a HPB/STUI com a

SM....................................................................................... 08

Figura 2 - Simplificação da via proliferativa do IGF1 na próstata........ 10

Figura 3 - Divisão esquemática dos grupos estudados....................... 20

Figura 4 - Treinamento aquático dos grupos 1 e 2.............................. 21

Figura 5 - Esteira adaptada em gaiola metabólica para mensuração

do consumo de oxigênio..................................................... 23

Figura 6 - Dissecção da próstata e separação dos lobos ventrais...... 25

Figura 7 - Dissecção da gordura retroperitoneal (A e B) e

epididimária (C)................................................................... 25

Figura 8 - Consumo semanal individual de ração (gramas)................ 31

Figura 9 - Dados morfométricos dos grupos estudados...................... 32

Figura 10 - Dados Dados de análise sérica dos grupos estudados................. 34

Figura 11 - Efeitos da atividade física na expressão gênica em ratos

com dieta padrão (Grupo 1 vs grupo 3)

Linha de base: Média de expressão gênica dos ratos do

grupo 3 (SED+DP).............................................................. 36

Figura 12 - Efeitos da atividade física na expressão gênica em ratos

com dieta hiperlipídica (grupo 2 vs grupo 4)

Linha de base: Média de expressão gênica dos ratos do

grupo 4 (SED+DHL)............................................................ 37

Figura 13 - Número de apoptoses a cada 10 campos de grande

aumento (HPF).................................................................... 38

Figura 14 - Lâminas de tecido prostático submetidas à hibridização in

situ (TUNEL) de ratos submetidos à atividade física e

dieta padrão (A e B), rato sedentário com dieta padrão

(C) e sedentário com dieta hiperlipídica (D)........................ 39

Resumo

Resumo

Fonseca FMF. Papel da atividade física na expressão gênica das vias proliferativas e de angiogênese na próstata e suas implicações na prevenção da hiperplasia prostática benigna: estudo experimental [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017. Introdução: O sedentarismo e obesidade têm sido descritos como fatores de risco relevantes para o desenvolvimento de hiperplasia prostática benigna (HBP). No presente trabalho investigamos o papel da atividade física nas vias proliferativas e de angiogênese da próstata e sua relação na prevenção da HPB. Métodos: Foram utilizados nesse experimento ratos machos Wistar com oito semanas de idade, divididos aleatoriamente em quatro grupos: 1. atividade física (AF) e dieta normal; 2. AF e dieta rica em gorduras; 3. Sedentários com dieta normal; 4. Sedentários e dieta rica em gorduras. Alimentos e água foram fornecidos ad libitum. Os ratos dos Grupos 1 e 2 foram submetidos a um protocolo de treinamento de natação por 10 semanas, executado cinco vezes por semana com duração de 60 minutos por dia. No final do protocolo, as glândulas prostáticas foram dissecadas, pesadas e armazenadas. Medimos os níveis de expressão gênica do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF1), do genes relacionados ao eixo proliferativo IGF1/PI3K/Akt e dos genes relacionados à hipóxia e angiogênese através do método de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e do índice apoptótico tecidual por hibridização in-situ (TUNEL). Resultados: Após 10 semanas, os grupos 1 e 2 apresentaram menor gordura visceral quando comparados aos grupos 3 (29,4 vs 37,96 gramas, p<0,05) e 4 (31,87 vs 41,96 gramas, p<0,05), respectivamente. AF diminuiu o crescimento da próstata em ratos com dieta normal (grupo 1 vs grupo 3, p<0,05), mas este achado não foi evidenciado em ratos alimentados com dieta rica em gorduras (grupo 2 vs grupo 4). Quando comparados os ratos com dieta normal (grupo 1 vs grupo 3), os genes relacionados ao IGF1, IRS1 e Akt foram subexpressos na próstata de ratos submetidos a AF (médias de 0.22, 0.04 e 0.27 respectivamente). Esses padrões de expressão também foram evidenciados quando comparamos ratos com dieta rica em gorduras (grupo 2 vs grupo 4), mas a subexpressão de IGF1 foi menos pronunciada (p<0,001). AF aumentou a expressão de genes relacionados à angiogênese (HIF-1α, VEGF, VEGFR e mTOR) quando comparamos ratos submetidos a dieta rica em gorduras (grupo 2 vs grupo 4). O índice apoptótico (número de apoptoses/10 HPF) foi maior em ratos submetidos a AF (9,0 vs 2,0, grupo 1 vs grupo 3, p=0,07), (9,0 vs 1,43, grupo 1 vs grupo 4; p<0,05). Conclusão: A atividade física inibe a expressão gênica do eixo proliferativo IGF1/Akt na próstata tanto em ratos normais quanto em ratos com dieta rica em gorduras, estimula a angiogênese em ratos com dieta rica em gorduras e estimula a apoptose prostática. Esses achados podem estar relacionados à prevenção de HPB

Descritores: hiperplasia prostática; exercício; obesidade; resistência à insulina; indutores da angiogênese; expressão gênica

Abstract

Abstract

Fonseca FMF. Role of physical activity on gene expression of proliferative and angiogenic pathways on prostate, and their implications on prevention of prostatic benign hyperplasia: experimental study [Thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2017.

Introduction: Sedentarism and obesity have been reported as relevant risk factors for the development of benign prostatic hyperplasia (BPH). In the present work we investigated the role of physical activity in proliferative and angiogenic pathways on prostate and implications for BPH prevention. Methods: Male Wistar rats with eight weeks old were used in this experiment, randomly divided into four groups: 1. physical activity (PA) and normal diet; 2. PA and high fat diet; 3. sedentary (S) and normal diet; 4. S and high fat diet. Food and water were provided ad libitum. The rats in the Groups 1 and 2 were submitted to a swimming training protocol for 10 weeks, executed five times a week with duration of 60 minutes per day. At the end of the protocol, prostate glands were dissected, weighted and stored. We measured prostatic gene expression levels of insulin-like growth factor 1 (IGF1), IGF1/PI3K/Akt proliferative axis and genes related to angiogenesis through the quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method, and apoptotic index (TUNEL). Results: After 10 weeks, groups 1 and 2 had less visceral fat when compared to the groups 3 (29,4 vs 37,96 grams; p<0,05) and 4 (31,87 vs 41,96 grams; p<0,05), respectively. According to prostate weight, PA decreased prostate growth in normal fed rats (group 1 vs group 3, p<0,05), but this finding was not shown in high fat fed rats (group 2 vs group 4). When comparing normal fed rats (group 1 vs group 3), IGF1, IRS1 and Akt genes were less expressed in prostate of rats submitted to PA (means 0.22, 0.04 and 0.27 respectively). Those patterns of expressions were also shown when we compared high fat fed rats (group 2 vs group 4), but the IGF1 downregulation was less pronounced (p<0,001). PA increased the expression of angiogenic related genes (HIF-1α, VEGF, VEGFR and mTOR) when comparing rats submitted to high fat diet. Apoptotic index (number of apoptosis per 10 HPF) was higher in rats submitted to PA (9,0 vs 2,0; group 1 vs group 3; p=0,07), (9,0 vs 1,43; group 1 vs group 4; p<0,05). Conclusion: PA seems to inhibit IGF1/Akt proliferative axis on prostate in both normal and high fat fed rats, stimulates angiogenesis in high fed rats, and increase prostatic apoptosis. These findings can be related to BPH prevention.

Descriptors: prostatic hyperplasia; exercise; obesity; insulin resistance; angiogenesis inducing agents; gene expression

1 Introdução

Introdução 2

1.1 Considerações Gerais

1.1.1 Hiperplasia Prostática Benigna

A hiperplasia prostática benigna (HPB) é uma doença altamente

prevalente em homens maduros, sendo encontrada em cerca de 40% dos

homens na quinta década e em até 90% dos homens na nona década de vida

1. Apesar de alguns homens com esta condição não manifestarem sintomas, a

HPB se caracteriza primordialmente pelo desenvolvimento progressivo de

sintomas relacionados ao trato urinário inferior (STUI) 2. Estes sintomas são

classificados em sintomas de armazenamento (aumento da frequência urinária,

noctúria, urgência e disúria) e sintomas de esvaziamento (hesitação,

intermitência, jato partido, jato fraco, sensação de esvaziamento incompleto e

gotejamento terminal).

O impacto da HPB sobre os STUI foi bem avaliado por estudos

populacionais norte-americanos utilizando o escore internacional de sintomas

prostáticos da Associação Americana de Urologia 3. No estudo da saúde dos

homens de Flint (Flint Men’s Health Study) os STUI de intensidade média ou

grave estiveram presentes em 26% e 42% dos homens entre 40 a 49 anos e

50 a 59 anos, respectivamente 4. Outras análises mostram que cerca de 75%

dos homens com 70 anos ou mais apresentarão pelo menos um STUI

relacionado à HPB 5. No nosso meio, uma recente análise envolvendo quase

mil homens com média de idade de 61 anos submetidos a um programa de

detecção de câncer de próstata no Hospital das Clínicas da Universidade de

Introdução 3

São Paulo demonstrou que 48% deles apresentavam STUI, de intensidade

moderada a grave, relacionados à HPB 6.

A HPB pode comprometer de forma significativa a qualidade de vida

dos homens por alterar os padrões do sono e as atividades diárias 7. Ademais,

devido a seu caráter progressivo, pode evoluir com complicações como

retenção urinária, insuficiência renal aguda, infecções urinárias de repetição,

litíase vesical e necessidade de cirurgia 8. As taxas de progressão da doença

aumentam com a idade, com a gravidade dos STUI, com o aumento do volume

prostático, com o aumento dos níveis séricos de antígeno prostático específico

e com a redução na velocidade do fluxo urinário 8, 9. Nos Estados Unidos, a

HPB é responsável por um total de 12 milhões de consultas médicas eletivas e

cerca de 120.000 cirurgias por ano 10.

Apesar de amplamente estudados, os mecanismos moleculares que

envolvem o componente glandular e estromal da próstata levando à HPB não

são adequadamente compreendidos. Durante muitos anos, a busca por

fatores etiológicos para o desenvolvimento da HPB e dos STUI se concentrou

em causas não modificáveis, incluindo predisposição genética, alterações nos

hormônios sexuais e alterações na musculatura vesical relacionadas à idade 11,

12, 13, 14. Entretanto, observações recentes indicam que distúrbios metabólicos

sistêmicos também podem contribuir de maneira importante na patogênese da

HPB 15.

Introdução 4

1.1.2 Síndrome Metabólica

A síndrome metabólica (SM) representa uma doença complexa,

descrita como a combinação de várias alterações metabólicas inter-

relacionadas, incluindo obesidade central, dislipidemia, hiperglicemia,

hipertensão arterial e resistência periférica a insulina 16, 17. A SM está

diretamente associada à doença aterosclerótica, insuficiência coronariana e

diabetes mellitus (DM) do tipo 2, acarretando um elevado custo sócio-

econômico para inúmeros países, sendo hoje considerada uma epidemia

mundial 18.

A prevalência da SM aumenta linearmente dos 20 aos 50 anos de

idade, quando então atinge um platô. Estima-se que a prevalência da SM se

encontra em 25% no Brasil e acima de 40% nos Estados Unidos 19. A síndrome

se desenvolve como resultado de hábitos alimentares inadequados e

sedentarismo, que estão associados à resistência periférica à insulina e

obesidade. A resistência à insulina ocorre quando há uma diminuição na

capacidade de resposta dos tecidos periféricos (músculos, tecido adiposo e

fígado) ao estímulo da insulina, com concomitante hiperinsulinemia e produção

de fator de crescimento semelhante a insulina do tipo 1 (IGF1) no fígado

através da estimulação do eixo somatotrópico 20. IGF1 é considerado um

potente estimulador de mitose e inibidor de apoptose em vários tecidos 21.

Obesidade central é também considerada como um componente

importante para progressão da SM. O tecido adiposo visceral secreta várias

Introdução 5

substâncias bioativas conhecidas como adipocitocinas, que por sua vez podem

induzir resistência à insulina, além de possuírem efeitos pró-inflamatórios,

criando um estado de inflamação crônica em vários tecidos do corpo. Níveis

circulantes de citocinas, incluindo leptina, fator de necrose tumoral alfa (TNF-

), interleucina (IL) 6 e 8, proteína C reativa e fibrinogênio estão tipicamente

elevados em pacientes obesos e com DM do tipo 2. Ao contrário, um hormônio

chamado adiponectina apresenta níveis séricos diminuídos em pessoas com

acúmulo de gordura visceral. A adiponectina estimula o metabolismo da glicose

e a oxidação de ácidos graxos no músculo, elevando a sensibilidade à insulina

no fígado 20, 22.

1.1.3 Síndrome Metabólica e HPB

A SM tem sido associada a um aumento do risco de desenvolvimento

de STUI e HPB em vários estudos observacionais. Dentre os 2.372 homens

que participaram do estudo NHANES III (National Health and Examination

Survey), aqueles que possuíam ao menos 3 componentes da SM

apresentavam uma elevação de 80% no risco de desenvolverem STUI quando

comparados com aqueles que não possuíam nenhum componente da

síndrome 23. Em uma coorte de 158 pacientes com STUI relacionados à HPB

foi notado que homens com algum componente da SM possuíam próstatas

com volume maior e taxas de crescimento anuais de volume prostático mais

elevadas 24.

Introdução 6

Um estudo longitudinal realizado na Universidade da Califórnia evidenciou a

relação direta entre alguns componentes da SM e o desenvolvimento de HPB e

STUI. Nesta análise, cada elevação de 1 kg/m2 no índice de massa corporal

(IMC) se correlacionou a um aumento de 0,41 ml no volume da próstata dos

indivíduos estudados. Pacientes obesos apresentaram um risco 3,5 vezes

maior de possuírem próstatas acima de 40 gramas na ressonância magnética

quando comparados a indivíduos não obesos. Neste mesmo estudo, homens

com glicemia de jejum elevada e com DM eram 2,5 e 3 vezes mais propensos

a apresentar STUI, respectivamente 25. Da mesma forma, uma análise de mais

de 16.000 espécimes de prostatectomia radical confirmou essa relação direta

entre SM e HPB. A análise multivariada revelou que cada aumento de 1 kg/m2

de IMC antes da cirurgia estava associado a um aumento de 0,45 gramas no

volume prostático total 26. Um recente estudo retrospectivo avaliando pacientes

com indicação para tratamento cirúrgico por HPB mostrou que a prevalência de

SM foi maior em pacientes com HBP do que nos controles (58 vs. 41%; p =

0,007), e em comparação com o grupo controle, os pacientes com HBP

apresentaram níveis mais altos de colesterol, LDL, insulina e índice HOMA,

mas níveis mais baixos de HDL e estradiol 27.

Apesar destas evidências clínicas, os mecanismos responsáveis por

essa relação de causa e efeito ainda precisam ser esclarecidos. Acredita-se

que vários componentes da SM podem ser responsáveis pelo desenvolvimento

de HPB nesses indivíduos, principalmente fatores relacionados à resistência

insulínica, obesidade e hipercolesterolemia. A Figura 1 resume os principais

mecanismos potenciais que relacionam a HPB com a SM 28.

Introdução 7

O aumento da resistência periférica à insulina pode influenciar o

crescimento da próstata e a piora dos STUI através do aumento do tônus do

estroma prostático por elevação da atividade simpática induzida pela

hiperinsulinemia, ou a potencial ligação da insulina diretamente no tecido

prostático e indução do seu crescimento 29, 30. A ação do IGF1 induzida pela

hiperinsulinemia tem se mostrado particularmente importante para o

crescimento da próstata e seu desenvolvimento, e alterações na via de

sinalização do IGF1 foram anteriormente descritas em linhas de células

estromais da próstata derivadas de pacientes com HBP 31. O IGF1 é uma

proteína composta por 70 aminoácidos e é produzida primariamente no fígado,

cuja biossíntese é controlada pelo hormônio do crescimento 32. Em contraste

com a insulina, o IGF1 também pode ser produzido localmente em vários

tecidos, e é considerado um hormônio com potencial função parácrina ou

autócrina, além de sua função endócrina. No caso da próstata, o IGF1

endógeno é produzido somente em células do estroma prostático, não sendo

encontrado no tecido epitelial, quando analisamos células de tecido prostático

hiperplásico 33. A ação do IGF1 na próstata é desencadeada através de sua

ligação com um receptor específico, o IGF1R, encontrado na parede de células

epiteliais da próstata. Portanto, esse hormônio habitualmente atua de forma

parácrina através da ligação do IGF1 produzido no estroma com o IGF1R

localizado no epitélio, ou então de forma endócrina, através da ligação do IGF1

sérico em seu receptor específico. O nível sérico de IGF1 biodisponível

também pode sofrer elevação em virtude da queda dos níveis séricos das

proteínas ligadoras do IGF1 (IGFBPs) secundária ao aumento da insulina

sérica. Em uma análise de 1454 homens inseridos no Prostate Cancer

Introdução 8

Prevention Trial, o nível sérico de uma das proteínas ligadoras do IFG1

(IGFBP3) se correlacionou inversamente ao risco de HPB, e a relação

IGF1/IGFBP3 estava diretamente associada ao risco de HPB, principalmente

em homens com sobrepeso 34.

Figura 1- Potenciais mecanismos relacionando a HPB/ STUI com a

SM

As principais vias de sinalização ativadas pela ligação do IGF1 com o

IGF1R na próstata e outros tipos de órgãos são a cascata de proteíno-quinase

ativada por mitógenos (MAPK) e a cascata da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)

/ proteina quinase B (Akt) 35. O IGF1R ativado é conectado à via da MAPK

através de proteínas adaptadoras do substrato do receptor de insulina (IRS1),

que ativam as quinases ERK1 e ERK2, da familia MAPK, com subsequente

fosforilação e ativação de fatores de transcrição que resultam em respostas

Introdução 9

celulares de diferenciação e proliferação 36. IRS1 também pode acoplar seu

receptor ativo à PI3K com subsequente recrutamento da Akt. Os efeitos em

cascata da ativação da via PI3K/Akt incluem proteção de apoptose e aumento

da proliferação celular devido, em parte, à fosforilação e inibição de proteínas,

tais como glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3). A fosforilação da ciclina D1 por

GSK-3 desencadeia a redistribuição de ciclina D1 a partir do núcleo para o

citoplasma, permitindo a progressão da fase G1 do ciclo celular e consequente

proliferação celular 37. A Figura 2 mostra um desenho esquemático desta via

proliferativa na próstata.

O mecanismo pelo qual a obesidade pode promover a HPB também não

é totalmente conhecido. Uma possível explicação é a de que a obesidade induz

um estado de inflamação sistêmica e estresse oxidativo, como descrito

anteriormente, e a inflamação representa um importante papel no

desenvolvimento e progressão da HPB. Estudos têm revelado que a presença

de algumas citocinas no tecido prostático estimula a produção de fatores de

crescimento e inibem a apoptose das células prostáticas 38, 39. A produção de

quimiocinas pró-inflamatórias, tais como IL-6 e IL-8, promovem a hiperplasia

das células epitetiais da próstata através da ação proliferativa direta da IL-8 ou

através da liberação de outros fatores de crescimento, como FGF-2, gerando

um processo de proliferação por inflamação crônica. Esse processo é

modulado através da ação do colesterol LDLox em seu receptor específico

(LOX-1) localizado no estroma da próstata, e aparentemente os andrógenos

inibem essa ação. Nas células prostáticas humanas in vitro, a

dihidrotestosterona atenuou a secreção de IL-8 induzida por LDLox através da

Introdução 10

supressão da expressão do receptor LOX-1 40, 41. Em estudo semelhante, um

efeito protetor da dihidrotestosterona sobre a inflamação e secreção de fatores

de crescimento também foi observado em células prostáticas humanas in vitro

42.

Figura 2- Simplificação da via proliferativa do IGF1 na próstata

A obesidade pode ainda promover uma desregulação dos hormônios

sexuais masculinos por aumento da aromatização da testosterona nos tecidos

periféricos, alterando a relação entre testosterona e estrogênio, contribuindo

Introdução 11

para a patogênese da HPB 25. Um estudo prospectivo com seguimento de 5

anos avaliou a incidência e progressão de LUTS em 780 pacientes com idade

entre 35 e 80 anos, evidenciando que um nível sérico de estradiol mais elevado

e um menor nível sérico de testosterona foram fatores preditores para maior

chance de progressão de LUTS de armazenamento e esvaziamento 43. Os

estrogênios estimulam a resposta inflamatória em células prostáticas humanas,

principalmente através da ativação do GPER1. Em estudo avaliando células

prostáticas do estroma humano, o 17β-estradiol aumentou a secreção de IL-8,

que foi diminuída com o uso de antagonista de GPER1. Já a presença de um

agonista da GPER1 induziu a secreção de IL-8 44. Adicionalmente um estudo

experimental demonstrou que a reposição de testosterona preveniu os efeitos

na próstata de inflamação, fibrose e hipóxia induzidos pela síndrome

metabólica 45.

Outro potencial mecanismo responsável pela relação entre SM e HPB

é a isquemia prostática crônica. Evidências clínicas e experimentais têm

demonstrado que a presença de fatores de risco cardiovasculares em

pacientes com HPB está associada com um aumento do índice de resistividade

das artérias periuretrais e capsulares da próstata. O aumento nesse índice de

resistividade, por sua vez, foi associado a um aumento do volume prostático

total e do volume da zona de transição da próstata 46, 47. Ademais, um estudo

experimental em coelhos submetidos a um estado de isquemia pélvica crônica

induzida por lesão endotelial das artérias ilíacas revelou um aumento na

contração da musculatura lisa prostática e mudanças estruturais na próstata 48.

Um estudo de cultura celular também demonstrou que células estromais da

Introdução 12

próstata respondem à hipóxia com o aumento da produção de diversos fatores

de crescimento, sugerindo um possível vínculo com a patogênese da HPB 49.

Estes achados convergem para a hipótese de que fatores de risco

cardiovasculares podem causar hipóxia prostática, que por sua vez estimula o

crescimento da glândula. Este crescimento pode levar a um aumento adicional

na resistência vascular, criando um ciclo vicioso.

1.1.4 Atividade física e HPB

Consensos internacionais recomendam que a obesidade seja o principal

foco de intervenção para SM. Estudos revelam que a perda de peso,

juntamente com um regime de atividade física leve ou moderada (cerca de 30

minutos por dia) reduz as taxas de triglicerídeos e eleva o colesterol HDL,

reduz a pressão arterial e a resistência à insulina 50. Considerando, portanto,

que exista uma possível relação causal entre SM e HPB, tem sido sugerido que

a prevenção da SM através de medidas comportamentais pode ter um efeito

positivo nos sintomas e na progressão da HPB.

Desta forma, diversos estudos clínicos têm apontado para um vínculo

entre altos níveis de atividade física e um menor risco de HPB/STUI. Um

desses estudos acompanhou uma coorte de 1.019 homens com idade entre 40

e 70 anos por nove anos e revelou que altos níveis de atividade física (maior

versus menor quartil) estiveram associados a um risco 50% menor de HPB 51.

Em uma análise transversal de 2.797 homens participantes do estudo NHANES

Introdução 13

III (Third National Health and Nutrition Examination Survey), todos os níveis de

atividade física moderada e intensa estiveram inversamente associados com os

STUI de forma significativa. De modo contrário, indivíduos sedentários

apresentaram um risco duas vezes maior de desenvolver STUI em relação à

indivíduos ativos 52. Finalmente, uma meta-análise revelou que indivíduos que

possuem uma rotina de atividade física regular podem apresentar menor risco

de desenvolver HPB/STUI. Através da análise de 11 estudos envolvendo

43.083 homens, os autores observaram que oito estudos mostraram uma

relação inversa, dois estudos uma relação nula e um estudo uma relação

equívoca entre atividade física e HPB/STUI. A análise conjunta dos dados

revelou que homens engajados em uma rotina de atividade física leve,

moderada ou intensa apresentaram uma redução de 25 a 30% no risco de

HPB/STUI em relação a indivíduos com um estilo de vida sedentário 53. Apesar

dessas evidências clínicas consistentes, nenhum estudo clínico randomizado

até o presente momento avaliou o papel da atividade física no desenvolvimento

de STUI ou da HPB. Além disso, os mecanismos biológicos através dos quais a

atividade física pode influenciar o desenvolvimento da HPB/STUI ainda são

desconhecidos.

1.1.5 Justificativa

Em virtude da alta prevalência da HPB na população geral, é de suma

importância o correto entendimento de fatores potencialmente modificáveis

para o seu desenvolvimento. Para isso, o primeiro passo para o conhecimento

Introdução 14

dos mecanismos pelos quais a atividade física atua no metabolismo da

próstata e de que forma a SM participa desse processo é o de criar condições

de estudo próximas do ideal através de um modelo experimental, incluindo um

modelo de atividade física e de SM.

2. Objetivos

Objetivos 16

Objetivo Primário

- Avaliar experimentalmente o papel da atividade física nas vias

moleculares de proliferação relacionadas à SM e vias de

angiogênese na próstata de ratos com dieta normal e dieta

hiperlipídica.

Objetivo Secundários

- Avaliar o papel da atividade física na apoptose de células prostáticas

de ratos com dieta normal e dieta hiperlipídica.

- Validação de modelo murino experimental de atividade física.

3. Métodos

Métodos 18

3.1 Tipo de estudo

Estudo experimental controlado.

3.2 Local e época

O estudo foi realizado no Biotério da Faculdade de Medicina da USP,

no Biotério da Faculdade de Educação Física da USP e no Laboratório de

Investigação Médica 55 da USP (LIM-55) desde o primeiro semestre de 2014.

3.3 Modelo experimental

Foram utilizados no experimento 28 ratos machos do tipo Wistar (200-

220 gramas), com 8 semanas de idade. Os animais foram condicionados por 1

semana antes do experimento com dieta padronizada e ingestão de água ad

libidum. Todos os animais foram submetidos a ciclos invertidos de 12/12 horas

de claro-escuro e condicionados a uma temperatura de 24-27ºC.

3.4 Intervenção

Os ratos foram randomizados em 4 grupos de 07 animais e alocados

em gaiolas com três a cinco animais cada. No grupo 1 e grupo 2

Métodos 19

implementamos um modelo de atividade física, e no grupo 3 e 4 os animais

foram submetidos a uma rotina sedentária (manutenção dos animais em

gaiolas com enriquecimento ambiental).

Nos grupos 1 e 2 as cobaias foram submetidas a um programa de

atividade física através de protocolo de treinamento aquático descrito

previamente na literatura (54). No grupo 1, foi oferecido aos animais a dieta

padrão AIN-93 (Pragsoluções Biociências, Jaú - SP) composta por 62% amido,

14% proteínas, 10% sacarose, 4% óleo de soja e vitaminas e minerais em

dosagem padrão durante doze semanas. No grupo 2, foi oferecida às cobaias

uma dieta hiperlipídica (Pragsoluções Biociências, Jaú - SP) composta por 36%

amido, 14% proteínas, 30% gorduras (banha de porco), 10% sacarose, 4%

óleo de soja, além de vitaminas e minerais em dosagem padrão durante as

mesmas doze semanas, com o intuito de induzir a SM.

Nos grupos 3 e 4, os animais foram submetidos a uma rotina

sedentária durante as mesmas doze semanas. Em analogia aos grupos 1 e 2,

as cobaias do grupo 3 ingeriram dieta padrão, e as do grupo 4 dieta

hiperlipídica (Figura 3).

Métodos 20

Figura 3- Divisão esquemática dos grupos estudados

As cobaias selecionadas para a rotina de atividade física foram

submetidas a sessões de treinamento aquático durante o ciclo escuro, 60

minutos por dia, 5 dias por semana, por 10 semanas consecutivas, em uma

piscina adaptada para ratos contendo água morna (30-32ºC). A duração e a

intensidade do exercício foram aumentadas gradualmente até que as cobaias

fossem capazes de realizar o exercício durante 60 minutos utilizando um peso

na cauda equivalente a 5% de seu peso corporal (Figura 4). Após esse período

de adaptação, a intensidade e duração do treinamento foram constantes até o

término do período de 10 semanas. Os animais foram pesados semanalmente

e o peso na cauda ajustado pelas variações de peso. Este protocolo de

natação foi descrito previamente como de intensidade leve a moderada e de

longa duração, com o intuito de aumentar a capacidade oxidativa muscular 54,

Métodos 21

55. Os animais selecionados para a rotina sedentária permaneceram em gaiolas

padrão durante todo o período do estudo, se movimentando livremente.

Figura 4- Treinamento aquático dos grupos 1 e 2

Na 10ª e 11ª semana de experimento, os animais foram submetidos a

adaptação em esteira de exercício e no tubo de contenção do aparelho de

mensuração da pressão arterial sistêmica não invasiva (tail-cuff).

Posteriormente, na 12ª semana do experimento, cada animal realizou o teste

de consumo máximo de oxigênio (VO2máx) através de esteira adaptada em

gaiola metabólica hermética com capacidade de mensuração da concentração

de oxigênio, com o intuito de mensurar o condicionamento físico dos animais

(Figura 5). Após 30 minutos de repouso na esteira adaptada, o consumo de

oxigênio (VO2) basal foi mensurado. O VO2 foi coletado através da análise do

gás expirado durante um protocolo de teste de exercício progressivo,

aumentando a velocidade da esteira em 3 metros por minuto a cada 3 minutos,

Métodos 22

e terminando no momento em que o VO2máx do animal foi atingido. O VO2máx

foi definido como o VO2 que não elevou mais de 5% a captação de oxigênio

mesmo após o aumento da carga de exercício. O influxo e o efluxo das

concentrações de oxigênio foram mensurados continuamente através de um

analisador apropriado (S-3A/I, Ametek, Pittsburgh, PA, USA). O VO2 foi

calculado utilizando o fluxo de oxigênio através da gaiola metabólica (PF),

definido como 6 litros/minuto, a fração expirada efluente de oxigênio (FEO2), a

fração de oxigênio do ar ambiente (FIO2) e o peso do animal, através da

fórmula descrita a seguir:

VVOO22 ((mmll//KKgg//mmiinn)) == PPFF ** ((FFIIOO22 –– FFEEOO22))//PPeessoo

Métodos 23

Figura 5- Esteira adaptada em gaiola metabólica para mensuração

do consumo de oxigênio

O VO2 de reserva foi calculado através da seguinte fórmula:

VVOO22 rreesseerrvvaa ((mmll//KKgg//mmiinn)) == VVOO22mmááxx –– VVOO22 bbaassaall

A pressão arterial sistólica também foi medida neste período através do

método tail-cuff (Kent Scientific, Torrington, CT, USA), método que consiste em

envolver um sensor na base da cauda do animal e mensurar a pressão

insuflando um cuff acoplado a um sensor até a pressão de 200 mmHg, e

Métodos 24

desinsuflando continuamente com o intuito de detectar a pressão sistólica não

invasiva no momento da detecção do pulso arterial previamente ocluído.

No dia 90 do experimento os ratos foram anestesiados com 1,2 g/kg de

uretano através de injeção intraperitoneal, submetidos a coleta de sangue e

sacrificados por decapitação. As amostras sanguíneas foram coletadas através

da saída livre do sangue da região cervical imediatamente após o sacrifício,

posteriormente centrifugadas e o soro armazenado em tubos de eppendorf a -

80ºC. Através do soro foi realizada análise da glicemia, colesterol total, LDL,

HDL, triglicerídeos, insulina, testosterona total, DHT e IGF1 pelo teste de Elisa.

Após o sacrifício e a coleta de sangue, foi realizada a extração da

próstata, seguida de dissecção e pesagem, além de dissecção e pesagem da

gordura epididimária e retroperitoneal (Figuras 6 e 7). Os lobos prostáticos

ventrais foram separados e preservados em formol para análise de apoptose

pelo método de TUNEL (Terminal dUTP Nick-End Labeling), além de

preservação em RNA-later para análise de expressão gênica da via

proliferativa de IGF1 / Akt (IGF1, IGF1R, IRS1, PI3K, MAPK e Akt), além de

expressão gênica de fatores relacionados à hipóxia e angiogênese (HIF-1α,

VEGF, VEGFR1, VEGFR2 e mTOR).

O descarte de animais seguiu a orientação da cartilha de orientação de

descarte de resíduos no sistema FMUSP-HC.

Métodos 25

Figura 6- Dissecção da próstata e separação dos lobos ventrais

Figura 7- Dissecção da gordura retroperitoneal (A e B) e epididimária (C)

Métodos 26

3.5 Análise da expressão gênica

A expressão dos genes estudados foi avaliada a partir da extração do

RNA do tecido prostático, síntese do cDNA a partir do RNA e análise posterior

do cDNA utilizando a metodologia de transcrição reversa seguida de reação

em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) (plataforma

Abi7500) utilizando-se o protocolo TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City,

CA). Experimentos iniciais de quantificação absoluta com o gene controle ß2

microglobulina (B2M) validaram o cDNA antes da realização dos experimentos

de quantificação dos genes de interesse. Para quantificação relativa dos genes

em estudo normalizamos a expressão destes em relação à expressão do gene

controle B2M. Como grupo controle, estudamos as amostras de tecido

prostático de ratos sedentários. Para calcular a expressão relativa dos genes

alvo foi utilizado o método ∆∆CT, que utiliza a seguinte fórmula: ∆∆CT = (CT do

gene alvo, amostra de próstata de rato ativo – CT do controle endógeno,

amostra de rato ativo) – (CT do gene alvo, amostra de rato sedentário – CT do

controle endógeno, amostra de rato sedentário). O número de vezes que

ocorre a mudança da expressão gênica é calculado como 2 -∆∆CT. A Tabela 1

descreve os genes estudados.

Métodos 27

Tabela 1- Primers utilizados para quantificação dos genes selecionados para estudo

Primer Ensaio Primer Ensaio

IGF1 Rn00710306_m1 HIF-1α Rn00577560_m1

IGF1R Rn00583837_m1 VEGF Rn01511601_m1

IRS1 Rn02132493_s1 VEGFR-1 (Flt-1) Rn00570815_m1

Akt Rn00690900_m1 VEGFR-2 (KDR) Rn00564986_m1

PI3K Rn00564547_m1 mTOR Rn00693900_m1

MAPK3 Rn00820922_g1 B2M Rn560865_m1

3.6 Análise de apoptose por hibridização in-situ (TUNEL)

Este ensaio foi realizado nas células da porção ventral da próstata dos

ratos dos quatro grupos, através de marcação com TdT-FragEL™ DNA

Fragmentation Detection Kit (Cat. Nº QIA33-1EA). As lâminas com tecido

prostático foram desparafinizadas e reidratadas com xileno e etanol,

permeabilizadas com Proteinase K e submetidas a inativação de peroxidases

endógenas utilizando peróxido de hidrogênio a 9% e então lavadas em TBS

(tris-buffered saline) e incubadas em solução tampão de equilíbrio em

temperatura ambiente. Posteriormente, as secções foram incubadas com a

enzima TdT (terminal deoxynucleotidyltranferase) Reaction Mixture à 37ºC por

1 hora e meia em câmara úmida. Após a lavagem com TBS, a revelação da

reação de hibridização in situ foi realizada com diaminobenzidina. As lâminas

com as células marcadas foram digitalizadas e analisadas por uma única

Métodos 28

médica patologista (Dra. Kátia Leite) e quantificadas a cada 10 campos de

grande aumento (High Power Field – HPF).

3.7 Análise estatística

As variáveis quantitativas foram resumidas através da média e desvio

padrão. Para análise estatística foi utilizado o teste t de Student para análise

univariada e ANOVA para análise multivariada, através do software SPSS 19.0.

Em toda a análise estatística foi adotado um nível de significância de 5%

(p<0,05).

4. Resultados

Resultados 30

4.1 Considerações iniciais

Durante as 12 semanas do experimento, os animais não apresentaram

intercorrências clínicas ou sintomas de doenças infecto-contagiosas. Todo o

protocolo de treinamento físico foi realizado sem interrupções. O rato 11,

pertencente ao grupo 2, faleceu na última semana do treinamento físico

durante o exercício, provavelmente por afogamento. Os órgãos abdominais

foram retirados logo após o falecimento e utilizados no estudo, entretanto não

foi possível a realização da coleta de sangue.

O consumo de ração dos ratos submetidos a dieta hiperlipídica (grupos

2 e 4) foi menor quando comparados aos ratos de dieta padrão (grupos 1 e 3),

e essa diferença foi notada durante as 12 semanas (Figura 8).

Os dados morfométricos e as análises séricas estão resumidos nas

tabelas 2 e 3.

4.2 Efeitos da Dieta Hiperlipídica

A dieta hiperlipídica administrada por 12 semanas não alterou

significativamente o ganho de peso ou a quantidade de gordura epididimária e

retroperitoneal. Os ratos submetidos à dieta hiperlipídica apresentaram

próstatas menores, sobretudo quando comparamos apenas os ratos

sedentários (1.38 vs 1.08 gramas; grupo 3 vs grupo 4; p<0,05). Essa diferença

Resultados 31

não foi evidenciada na comparação de ratos ativos (1,11 vs 1,17 gramas; grupo

1 vs grupo 2) (Tabela 2; Figura 9).

A pressão arterial sistólica foi semelhante entre os 4 subgrupos

estudados. A glicemia de jejum, os níveis séricos de insulina e o índice de

resistência periférica à insulina (índice HOMA) se elevaram em ratos com dieta

hiperlipídica quando comparados aos grupos de dieta padrão. Os níveis de

colesterol e triglicerídeos não se elevaram em virtude da dieta hiperlipídica,

pelo contrário, os maiores níveis de triglicerídeos foram observados nos ratos

sedentários de dieta padrão. Os níveis séricos de testosterona não se

alteraram em virtude da dieta hiperlipídica e a dieta hiperlipídica se

correlacionou com uma redução dos níveis de DHT e IGF1 quando

comparamos os ratos sedentários (grupo 3 vs grupo 4) (Tabela 3; Figura 10).

Figura 8- Consumo semanal individual de ração (gramas)

Resultados 32

Tabela 2- Dados morfométricos (resultados expressos em média)

AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ = p < 0.05

Figura 9- Dados morfométricos dos grupos estudados

Grupo 1 (AF + DP)

(n=07)

Grupo 2 (AF + DHL)

(n=07)

Grupo 3 (SED + DP)

(n=07)

Grupo 4 (SED + DHL)

(n=07)

Peso Corporal (g)

Inicial

Semana 12

312,43

526,31

321,90

531,74

337,33

598,96

354,04

611,61

Ganho de Peso (g) 213,89 § £

209,84 # ‡

261,63 257,57

Gordura Epididimária (g) 14,06 § £

15,26 # ‡

19,74 20,38

Gordura Retroperitoneal (g) 15,35 £ 16,62 18,23 21,58

Peso da próstata (g) 1,11 § 1,17 1,38

† 1,08

AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. § = p < 0.05 grupo 1x3; £ = p <0.05

grupo 1x4 ; # = p < 0.05 grupo 2x3; ‡ = p <0.05 grupo 2x4; † = p <0.05 grupo 3x4.

Resultados 33

4.3 Efeitos da Atividade Física

Os ratos submetidos à atividade física ganharam menos peso quando

comparados aos animais sedentários, e a gordura abdominal (epididimária e

retroperitoneal) foi menor nos ratos ativos. A atividade física reduziu o peso da

próstata em ratos de dieta padrão (1,11 vs 1,38 gramas; grupo 1 vs grupo 3;

p<0,05), mas não exerceu influência em ratos com dieta hiperlipídica (1,17 vs

1,08 gramas; grupo 2 vs grupo 4; p>0,05) (Tabela 2; Figura 9).

A atividade física não exerceu influência na glicemia de jejum quando

comparamos os grupos sedentários paralelos (grupo 1 vs grupo 3; grupo 2 vs

grupo 4), mas a insulina sérica e o índice HOMA dos ratos ativos foi mais baixo

após as 12 semanas do estudo, sem significância estatística (grupo 1 vs grupo

3; grupo 2 vs grupo 4). Os níveis de triglicerídeos foram reduzidos pela

atividade física, sobretudo em ratos com dieta padrão (71,43 vs 111,32; grupo

1 vs grupo 3; p<0,001). O níveis séricos de DHT foram reduzidos pela atividade

física quando comparamos os ratos de dieta padrão (grupo 1 vs grupo 3), e o

nível de IGF1 se elevou em virtude da atividade física quando comparamos

ratos submetidos à dieta hiperlipídica (grupo 2 vs grupo 4) (Tabela 3; Figura

10).

Resultados 34

Tabela 3- Dados pressóricos e análise sérica (resultados expressos em média)

Grupo 1 (AF + DP)

(n=07) Grupo 2 (AF + DHL)

(n=07) Grupo 3 (SED + DP)

(n=07) Grupo 4 (SED + DHL)

(n=07)

PA sistólica 115,44 113,40 110,38 117,57

Glicemia 106,86 * £ 123,33

# 104,86

† 129,29

Insulina 4,15 £ 4,87 5,15 6,05

Índice HOMA 1,10 £ 1,49 1,33

† 1,96

Colesterol 63,50 * § 54,95

# 71,74

† 61,34

LDL 2,69 2,75 4,39 2,73

HDL 46,53 38,58 45,08 45,19

Triglicerídeos 71,43 § 68,08

# 111,32

† 67,11

Testosterona 0,89 0,77 0,79 0,95

DHT 0,12 § 0,15 0,21

† 0,13

IGF1 2,11 2,48 ‡ 2,65

† 1,40

AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ = p < 0.05 grupo 1x2; § = p < 0.05

grupo 1x3; £ = p <0.05 grupo 1x4; # = p < 0.05 grupo 2x3; ‡ = p <0.05 grupo 2x4; † = p <0.05 grupo 3x4.

AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ = p < 0.05

Figura 10- Dados de análise sérica dos grupos estudados

Resultados 35

A atividade física alterou o consumo de oxigênio basal entre os grupos

de dieta hiperlipídica (26,95 vs 20,75; grupo 2 vs grupo 4; p<0,05), e o

consumo máximo de oxigênio foi maior em ratos submetidos à atividade física,

sobretudo nos ratos do grupo 2 (65,53 vs 57,13; grupo 2 vs grupo 4; p<0,05).

O consumo de oxigênio de reserva não foi alterado pelo protocolo de

atividade física. Os dados estão resumidos na tabela 4.

Tabela 4- Parâmetros de consumo de oxigênio (resultados expressos em média)

Grupo 1 (AF +

DP)

(n=06)

Grupo 2 (AF +

DHL)

(n=05)

Grupo 3 (SED +

DP)

(n=07)

Grupo 4 (SED +

DHL)

(n=06)

VO2 basal (ml/Kg/min) 22,12 26,95 * # 21,80 20,75

VO2 máx (ml/Kg/min) 60,23 65,53 * # 56,06 57,13

VO2 reserva

(ml/Kg/min)

38,10 38,59 34,26 36,38

AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ = p < 0.05 grupo 2x3; # = p < 0.05

grupo 2x4.

4.4 Análise da expressão gênica

Quando comparamos os animais submetidos à dieta padrão (grupo 1

vs grupo 3 ; Figura 11), a expressão gênica do IGF1 , IRS1 e Akt foi menor nas

próstatas de ratos submetidos à atividade física (0.22 , 0.04 e 0.27 vezes,

respectivamente), com padrão homogêneo de expressão. Estes padrões de

expressão gênica desencadeados pela atividade física também foram

evidenciados quando comparamos ratos que ingeriram dieta hiperlipídica

(grupo 2 vs grupo 4 ; Figura 12) , mas a subexpressão do IGF1 foi menos

pronunciada (p<0,001). A expressão gênica de PI3K e MAPK3 não foi

Resultados 36

influenciada pela atividade física tanto em ratos com dieta padrão quanto em

ratos com dieta hiperlipídica.

A atividade física se associou a uma superexpressão heterogênea de

HIF-1α, receptores de VEGF e de mTOR, além de leve subexpressão

heterogênea de VEGF, quando comparamos ratos submetidos à dieta padrão

(grupo 1 vs grupo 3; Figura 11). Quando comparamos ratos submetidos à dieta

hiperlipídica (grupo 2 vs grupo 4; Figura 12), a atividade física elevou a

expressão gênica de HIF-1α, VEGF, VEGFR1 e mTOR de forma homogênea.

Figura 11- Efeitos da atividade física na expressão gênica em ratos com

dieta padrão (Grupo 1 vs grupo 3) Linha de base: Média de expressão gênica dos ratos do grupo 3 (SED+DP)

Resultados 37

Figura 12- Efeitos da atividade física na expressão gênica em ratos com

dieta hiperlipídica (grupo 2 vs grupo 4) Linha de base: Média de expressão gênica dos ratos do grupo 4 (SED+DHL)

4.5 Análise de apoptoses por hibridização in situ (TUNEL)

O número de apoptoses por cada 10 campos de grande aumento (High

Power Field - HPF) identificado no processo de hibridização in situ (TUNEL) foi

maior nas próstatas de ratos submetidos à atividade física na comparação

entre ratos submetidos à dieta padrão (9,0 vs 2,0; grupo 1 vs grupo 3; p=0,07),

Resultados 38

mostrando uma diferença marginal, e entre os grupos extremos (9,00 vs 1,43;

grupo 1 vs grupo 4; p<0,05) (figuras 13 e 14). Apesar do número de apoptoses

também ter sido numericamente superior entre os animais do grupo 2 (AF +

DHL) em comparação com os grupo 3 e 4, não observamos significância

estatística (6,17 vs 2,00; grupo 1 vs grupo 3; p=0,78 6,17 vs 1,43; grupo 1 vs

grupo 4; p=0,52).

Figura 13- Número de apoptoses a cada 10 campos de grande aumento

(HPF) AF: Atividade física; SED: Sedentários; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ p < 0.05 grupo 1x4; # p = 0.07 grupo 1x3

Resultados 39

Figura 14- Lâminas de tecido prostático submetidas à hibridização in situ

(TUNEL) de ratos submetidos à atividade física e dieta padrão (A e B), rato sedentário com dieta padrão (C) e sedentário com dieta hiperlipídica (D)

5. Discussão

Discussão 41

5.1 Modelo experimental

De uma maneira geral, os estudos experimentais necessitam de um

critério extremamente cuidadoso na escolha do modelo experimental a ser

estudado, a fim de criar o melhor ambiente possível para a análise da

intervenção desejada. Em nosso experimento, selecionamos um modelo animal

que possui um metabolismo prostático semelhante à próstata de humanos,

principalmente relacionado à HPB, e um protocolo de atividade física validado

por vários estudos, entretanto ainda desconhecido em nosso grupo de

pesquisa.

Os únicos animais que sabidamente podem desenvolver HPB

espontaneamente são o chimpanzé e o cão. A próstata do chimpanzé guarda

grande semelhança com a próstata de humanos, entretanto, chimpanzés não

são modelos experimentais úteis e o desenvolvimento de HPB se dá de forma

esporádica e em idade avançada, à semelhança dos humanos 56. Apesar de

vários estudos terem avaliado a próstata de cães, a HPB nesses animais se

desenvolve tipicamente após 8 anos de idade, limitando o estudo dessa

patologia específica. Além disso, o uso dos animais anteriormente citados

suscita questionamentos éticos relevantes 57.

Roedores têm sido classicamente utilizados como modelos

experimentais há décadas para avaliação de vários órgãos, tornando sua

utilização atrativa para o estudo da próstata, tanto pela semelhança do

metabolismo dos roedores em comparação com humanos, quanto pela

facilidade em se trabalhar com este modelo experimental. Vários estudos

anteriores utilizaram este modelo para análises da próstata e avaliações de

Discussão 42

parâmetros da síndrome metabólica. Além disso, roedores são ótimos modelos

experimentais de atividade física, tanto para protocolos de corrida em esteira

ou protocolos de treinamento aquático. Entretanto, algumas considerações

precisam ser resaltadas para análise de qualquer resultado extraído de

próstatas de roedores. A anatomia da próstata de roedores não se assemelha

à próstata de humanos, sendo a primeira dividida em quatro estruturas

lobulares distintas: lobo ventral, anterior, dorsal e lateral. Essas estruturas se

encontram em posição intraperitoneal, cobertos por uma fina cápsula

prostática, e tipicamente não causam compressão uretral quando aumentam

de volume, ao contrário da próstata de humanos, onde a uretra pode sofrer

compressão pelo aumento do volume da zona de transição 58. Atualmente é

consenso entre os autores que os lobos prostáticos de roedores não possuem

correlação embriológica ou anatômica com a próstata de humanos 59.

A linhagem de roedores escolhida levou em consideração a chance de

indução de SM e capacidade de extrapolação de dados para a espécie

humana. Optamos por estudar linhagens heterogênicas pois esses animais

possuem grande variabilidade gênica, devido aos cruzamentos aleatórios,

assim como ocorre com a espécie humana, ou seja, produzindo populações

naturais. Nos seres humanos, o rápido desenvolvimento de obesidade e SM é

mais comumente relacionado ao o aumento da ingestão calórica e falta de

atividade física, adicionado a predisposição genética. Portanto, seria de maior

interesse o estudo de um modelo de SM induzida pela maior ingestão

alimentar, ao invés do estudo de roedores com alterações genéticas. Vários

estudos prévios avaliaram a indução de SM nos roedores heterogênicos mais

utilizados em estudos experimentais, como Wistar e Sprague Dawley,

Discussão 43

entretanto alguns estudos falharam em demonstrar a indução de parâmetros

de SM em linhagens de Sprague Dawley 60. Além disso, Ratos Wistar são mais

ativos que roedores da linhagem Sprague Dawley, fato que poderia influenciar

o protocolo de atividade física.

A indução de SM tem sido classicamente realizada em roedores

através de modificações na dieta. A dieta hiperlipídica e a dieta rica em frutose

são as mais utilizadas para esse fim. Vários estudos demonstraram que a dieta

rica em frutose é capaz de induzir hiperglicemia, aumento da resistência

periférica à insulina e hipertensão arterial 61. Nosso grupo realizou um estudo

piloto em ratos Wistar que evidenciou uma baixa aceitação da dieta rica em

frutose, com importante perda de peso dos animais. De maneira semelhante, a

dieta hiperlipídica induz vários parâmetros da síndrome metabólica em ratos,

como hiperglicemia, aumento da resistência à insulina, dislipidemia e

obesidade, entretanto existe uma grande variabilidade de dietas hiperlipídicas

nos estudos publicados, com concentrações de gorduras que variam entre 30-

55% 62. A dieta escolhida para o nosso estudo se baseou em uma pesquisa

que comparou a indução da síndrome metabólica em ratos Wistar com 6

semanas de idade por um período de 12 semanas, através de várias dietas

hiperlipídicas, demonstrando que a dieta com 30% de gordura animal (banha

de porco) induziu com mais eficiência os parâmetros da síndrome, em virtude

da maior concentração de ácidos graxos saturados 63.

A dieta hiperlipídica administrada ao final do nosso estudo não

desenvolveu nos ratos todas as características clínicas da SM, elevando

apenas a glicemia e a resistência periférica à insulina. Não desencadeou

alterações significativas no perfil lipídico, pressão arterial e ganho de peso,

Discussão 44

além de proporcionar queda do IGF1 e DHT séricos, achados que não

condizem com o esperado em um modelo de SM. Entendemos que o curto

tempo de protocolo da dieta (12 semanas) pode ter influenciado os resultados,

já que alguns parâmetros da síndrome, como hipertensão arterial, não

aparecem até pelo menos 1 ano de dieta. Entretanto, outros estudos utilizando

protocolos de dieta de 12 semanas foram suficientes para desenvolver a

grande parte das características da síndrome. Talvez o fato mais relevante

para a falha em induzir a síndrome de maneira adequada tenha sido a baixa

ingesta de ração por parte dos ratos com dieta hiperlipídica em comparação

com ratos de dieta padrão, achado este que não condiz com outros estudos

que utilizaram esta ração específica 63. Em razão dessa inconsistência nos

resultados dos parâmetros da SM encontrados nos animais do nosso estudo,

optamos por não realizar comparações de expressão gênica entre ratos com

dieta hiperlipídica e dieta padrão (grupo 1 vs grupo 2; grupo 3 vs grupo 4), já

que o modelo de SM do nosso estudo não parece padronizado para realização

dessa análise comparativa. Além disso, a análise dos efeitos da atividade física

nos grupos de ratos submetidos à dieta hiperlipídica devem ser apreciados com

cautela em virtude das considerações citadas acima.

5.2 Consumo de oxigênio

O consumo basal e o consumo máximo de oxigênio são marcadores da

capacidade de metabolização do oxigênio pelos tecidos, e por isso quanto

maiores são seus valores, maior o condicionamento físico dos animais. Em

nosso estudo, os ratos ativos de dieta hiperlipídica apresentaram um maior

Discussão 45

consumo basal e maior consumo máximo de oxigênio (VO2máx), e estes

dados ajudam a validar o protocolo de atividade física implementado, aliado ao

fato dos ratos ativos terem ganhado menos peso corporal ao final do

experimento. Apesar do consumo máximo de oxigênio ter sido numericamente

maior no subgrupo de ratos ativos com dieta normal quando comparado aos

ratos sedentários (grupo 1 vs grupo 3), essa diferença não foi estatisticamente

significante. Esse resultado não é incomum em protocolos curtos de natação

de intensidade leve ou moderada, como no estudo em questão, pois

comumente o acréscimo de consumo não se eleva mais do que 10% nos ratos

ativos em relação aos sedentários, ao contrário de protocolos mais intensos,

que podem alterar em quase 30% o consumo máximo de oxigênio, tornando

mais fácil a comprovação de alguma diferença estatística significante 64. O fato

do teste de consumo se realizar em uma esteira de treino pode influenciar o

resultado quando analisamos ratos submetidos a protocolo aquático, já que

alguns ratos que são bons nadadores podem não ser bons corredores.

5.3 Vias proliferativas e de angiogênese

A atividade física suprimiu a expressão gênica de IGF1 endógeno,

IRS1 e Akt, de maneira uniforme, sem supressão gênica de PI3K, sugerindo

inibição da via proliferativa de IGF1/PI3K/Akt, já que a ativação da Akt

representa uma das fases finais da cascata de proliferação e é dependente da

ativação de PI3K. A supressão dessa via não foi acompanhada por uma queda

do IGF1 sérico, sugerindo que a supressão da via de sinalização de

Discussão 46

IGF1/PI3K/Akt foi provavelmente ocasionada pela diminuição da ação

parácrina do IGF1 produzido no estroma prostático, e não por um mecanismo

endócrino atuando diretamente no epitélio. A diminuição da insulina sérica e da

resistência periférica à insulina provocadas pela atividade física também podem

explicar parcialmente a supressão dessa via, já que receptores de insulina

presentes no epitélio da próstata também podem estimular essa via

proliferativa, ainda que em intensidade muito menor do que a estimulação

desencadeada pelo IGF1. A supressão gênica do IRS1 não se acompanhou da

supressão gênica da MAPK, podendo indicar que a atividade física não atuou

na inibição dessa via de sinalização. Entretanto, outros genes relacionados a

proteínas dessa via não foram estudados para confirmar esse achado e a

expressão heterogênea de MAPK pode ser reacional à forte supressão gênica

de IRS1.

Apesar de estudos anteriores já terem demonstrado como a via de

IGF1/PI3K/Akt pode induzir proliferação prostática, os efeitos da inibição desta

via na próstata são pouco estudados. Um estudo experimental murino

avaliando os efeitos da inibição desta via demonstrou que o uso de um inibidor

de PI3K/Akt induziu menor proliferação e maior índice de apoptose em tecido

prostático normal 65. Nosso estudo é pioneiro na avaliação dos efeitos da

atividade física nesta via proliferativa.

A atividade física associou-se a uma maior expressão gênica de fatores

de hipóxia (HIF1-α) e angiogênese (VEGF, VEGFR1 e mTOR), quando

analisamos ratos submetidos à dieta hiperlipídica. Essa diferença não foi

percebida na comparação entre ratos de dieta normal, com padrão de

expressão heterogêneo do VEGF e HIF-1α. De acordo com nosso

Discussão 47

conhecimento, este é o primeiro estudo que avalia os efeitos da atividade física

no processo de hipóxia e angiogênese de tecido prostático não tumoral. A

síndrome metabólica sabidamente pode danificar a função microvascular e

diminuir a densidade dos capilares de vários órgãos, e estudos prévios

indicaram diminuição do fluxo sanguíneo prostático e aumento da resistência

vascular em pacientes com HPB, quando comparados com pessoas sadias.

Além disso, pacientes com doenças vasculares apresentam uma maior

redução do fluxo prostático e maior gravidade dos sintomas relacionados a

HPB em relação a pacientes sem doenças vasculares 66. Recentemente,

Machado et al demonstrou que a atividade física é capaz de restaurar a função

microvascular de órgãos de ratos com SM, como músculo esquelético e pele 67,

fato que pode indicar que esse processo pode também ocorrer no tecido

prostático.

A atividade física está relacionada com a ativação de mTOR em vários

tecidos corporais, como músculo esquelético 68-70, coração 71 e cérebro 72, 73,

trazendo benefícios diversos para o correto funcionamento e longevidade

desses órgãos. A ativação de mTOR está intimamente ligada a estimulação de

fatores de angiogênese e hipóxia, como VEGF e HIF-1α, e frequentemente

esta estimulação está associada a proliferação e progressão de algumas

neoplasias 74, 75

.

O aumento da expressão de fatores de angiogênese na próstata não

necessariamente induz proliferação do tecido prostático no caso da atividade

física. Um estudo avaliando os efeitos da atividade física em um modelo murino

de câncer de próstata (C57BL/6), demonstrou que a atividade física estimulou

as vias de sinalização de MEK/MAPK e mTOR, com subsequente elevação dos

Discussão 48

níveis protéicos intratumorais de HIF-1α e VEGF, além de inibição dos níveis

de Akt, de maneira similar aos achados encontrados em nosso experimento.

Esses achados se associaram a uma hipervascularização e melhora da

perfusão tumoral. Entretanto, os ratos submetidos a atividade física mantiveram

o mesmo volume tumoral dos ratos controle, além de uma menor taxa de

envolvimento linfonodal (36%) e de metástases à distância (34%) nos ratos

ativos 76. Os achados aparentemente paradoxais encontrados nesse estudo

ainda não estão esclarecidos, mas podem indicar uma importante diferença na

forma como o HIF-1α é ativado em diferentes situações. Em condições

normais, está bem estabelecido que os tumores sólidos em geral possuem

vascularização aberrante que dificulta o fornecimento de oxigênio e a remoção

de metabólitos da glicólise, causando hipóxia tecidual e subsequente ativação

de HIF-1α. Esse processo estimula cascatas de angiogênese através da

estimulação de VEGF, em um esforço para manter o suprimento de oxigênio

intratumoral. Paradoxalmente, esse processo causa angiogênese patológica e

não produtiva, com formação de vasos aberrantes e queda na oxigenação e

perfusão, criando um ciclo vicioso com hipóxia, consequente invasão tumoral e

metástase 77. No estudo de Jones et al, a estimulação do HIF-1α induzida pela

atividade física foi associada a um desfecho oposto: melhora na perfusão e

vascularização tumoral, indicando um processo de angiogênese produtivo e

fisiológico que não está associado a um processo de indução de hipóxia

tecidual patológica como descrito anteriormente em situações de repouso,

podendo em parte explicar a menor taxa de progressão tumoral e menor índice

de metástases.

Discussão 49

De maneira semelhante, a hipóxia tecidual local também pode

desempenhar papel importante na progressão da HPB, induzida por estresse

oxidativo, achado este marcante em pacientes com síndrome metabólica,

levando à diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos e

neovascularização. Em resposta à hipóxia, células estromais prostáticas

podem estimular a produção de vários fatores de inflamação e proliferação,

como VEGF, FGF-2, FGF-7, e IL-8 78, 79. Portanto, um processo de

angiogênese produtivo e fisiológico provocado pela atividade física também

poderia prevenir hipóxia tecidual patológica em um tecido hiperplásico por

mecanismo semelhante ao encontrado no tecido neoplásico.

5.4 Análise de apoptose

A fragmentação do DNA representa uma característica essencial da

morte celular por apoptose. O ensaio de TUNEL (Terminal dUTP Nick-End

Labeling) permite identificar células em apoptose através da detecção de

fragmentos de DNA por microscopia. Os fragmentos de DNA resultantes da

quebra do DNA genômico podem ser identificados por marcação de

terminações 3’-OH livres, através de uma reação enzimática que catalisa a

incorporação de nucleotídeos marcados.

A atividade física parecer estimular o processo de apoptose celular na

próstata, achado que pode ser parcialmente explicado pela inibição da via

PI3K/Akt, já que esta via pode atuar na modulacão da proteína Bcl-2, que

regula o processo de apoptose 80. A fragmentação do DNA identificada pelo

Discussão 50

TUNEL representa uma fase tardia do processo de apoptose. Nesse caso, uma

avaliação futura das vias intrínseca e extrínseca do processo de apoptose pode

esclarecer em que momento a atividade física interfere no processo de

apoptose celular. A análise do Bcl-2 e das caspases podem ajudar a esclarecer

esse mecanismo.

5.5 Considerações finais e perspectivas futuras

Este é um trabalho original, sendo o primeiro a avaliar o papel da

atividade física na via proliferativa de IGF1/Akt e na via de angiogênese na

próstata, fato que irá auxiliar no melhor entendimento da prevenção do HPB,

principalmente em pacientes com síndrome metabólica. Os achados deste

estudo, aliado às evidências dos estudos observacionais, dão embasamento

teórico para recomendar a prática de atividade física como importante

prevenção de HPB.

O entendimento recente da importância de fatores responsáveis pela

indução de HPB em pacientes com síndrome metabólica, como a via

inflamatória, traz à tona a necessidade do estudo dos efeitos da atividade física

na modulação desta via. Há necessidade de aprimoramento do modelo

experimental de síndrome metabólica em nosso grupo de pesquisa, além da

escolha de um modelo experimental de HPB que seja adequado para o estudo

dos efeitos da síndrome metabólica e atividade física. Após estudos recentes

evidenciando o papel dos receptores de estrogênio e dos receptores de LDLox

na inflamação prostática de pacientes com síndrome metabólica,

Discussão 51

consideraremos em experimentos futuros a possibilidade de indução de

inflamação prostática com tamoxifeno, um modulador seletivo do receptor de

estrogênio, ou através da modulação do receptor de LDLox (LOX-1), para

aprofundar os estudos dos efeitos da síndrome metabólica na próstata e suas

implicações na prevenção da HPB.

6. Conclusões

Conclusões 53

A atividade física inibiu a expressão gênica do eixo proliferativo

IGF1/Akt na próstata tanto em ratos com dieta padrão quanto em ratos com

dieta hiperlipídica, e estimulou a expressão gênica de fatores de hipóxia e

angiogênese em ratos com dieta hiperlipídica.

A atividade física estimulou a apoptose de células prostáticas de ratos

com dieta padrão e dieta hiperlipídica, evidenciado pelo aumento do índice de

apoptose na hibridização in-situ (TUNEL).

O protocolo de treinamento melhorou a condição física dos animais

treinados, evidenciado pelo maior consumo máximo de oxigênio e menor

ganho de peso ao final do treinamento.

7. Referências Bibliográficas

Referências Bibliográficas 55

1. Berry SJ, Coffey DS, Walsh PC, Ewing LL. The development of human

benign prostatic hyperplasia with age. J Urol. 1984;132(3):474-9.

2. Wei JT, Calhoun E, Jacobsen SJ. Urologic diseases in America project:

benign prostatic hyperplasia. J Urol. 2005;173(4):1256-61.

3. Barry MJ, Fowler FJ, O'Leary MP, Bruskewitz RC, Holtgrewe HL, Mebust

WK, et al. The American Urological Association symptom index for benign

prostatic hyperplasia. The Measurement Committee of the American

Urological Association. J Urol. 1992;148(5):1549-57; discussion 64.

4. Sarma AV, Wei JT, Jacobson DJ, Dunn RL, Roberts RO, Girman CJ, et al.

Comparison of lower urinary tract symptom severity and associated bother

between community-dwelling black and white men: the Olmsted County

Study of Urinary Symptoms and Health Status and the Flint Men's Health

Study. Urology. 2003;61(6):1086-91.

5. Platz EA, Smit E, Curhan GC, Nyberg LM, Giovannucci E. Prevalence of

and racial/ethnic variation in lower urinary tract symptoms and noncancer

prostate surgery in U.S. men. Urology. 2002;59(6):877-83.

6. Antunes AA, Srougi M, Dall'oglio MF, Vicentini F, Paranhos M, Freire GC.

The role of BPH, lower urinary tract symptoms, and PSA levels on erectile

function of Brazilian men who undergo prostate cancer screening. J Sex

Med. 2008;5(7):1702-7.


7. Welch G, Weinger K, Barry MJ. Quality-of-life impact of lower urinary tract

symptom severity: results from the Health Professionals Follow-up Study.

Urology. 2002;59(2):245-50.

8. McConnell JD, Roehrborn CG, Bautista OM, Andriole GL, Dixon CM,

Kusek JW, et al. The long-term effect of doxazosin, finasteride, and

combination therapy on the clinical progression of benign prostatic

hyperplasia. N Engl J Med. 2003;349(25):2387-98.

9. Crawford ED, Wilson SS, McConnell JD, Slawin KM, Lieber MC, Smith JA,

et al. Baseline factors as predictors of clinical progression of benign

prostatic hyperplasia in men treated with placebo. J Urol.

2006;175(4):1422-6; discussion 6-7.

10. Vuichoud C, Loughlin KR. Benign prostatic hyperplasia: epidemiology,

economics and evaluation. Can J Urol. 2015;22 Suppl 1:1-6.

11. Walsh PC, Hutchins GM, Ewing LL. Tissue content of dihydrotestosterone

in human prostatic hyperplasis is not supranormal. J Clin Invest.

1983;72(5):1772-7.

12. Gormley GJ, Stoner E, Bruskewitz RC, Imperato-McGinley J, Walsh PC,

McConnell JD, et al. The effect of finasteride in men with benign prostatic

hyperplasia. The Finasteride Study Group. N Engl J Med.

1992;327(17):1185-91.


13. Sanda MG, Beaty TH, Stutzman RE, Childs B, Walsh PC. Genetic

susceptibility of benign prostatic hyperplasia. J Urol. 1994;152(1):115-9.

14. Sciarra A, Mariotti G, Salciccia S, Autran Gomez A, Monti S, Toscano V,

et al. Prostate growth and inflammation. J Steroid Biochem Mol Biol.

2008;108(3-5):254-60.

15. Parsons JK. Modifiable risk factors for benign prostatic hyperplasia and

lower urinary tract symptoms: new approaches to old problems. J Urol.

2007;178(2):395-401.

16. Alberti KG, Zimmet PZ. Definition, diagnosis and classification of diabetes

mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of

diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med.

1998;15(7):539-53.

17. Expert Panel on Detection Ea, and Treatment of High Blood Cholesterol in

Adults. Executive Summary of The Third Report of The National

Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection,

Evaluation, And Treatment of High Blood Cholesterol In Adults (Adult

Treatment Panel III). JAMA. 2001;285(19):2486-97.

18. Kassi E, Pervanidou P, Kaltsas G, Chrousos G. Metabolic syndrome:

definitions and controversies. BMC Med. 2011;9:48.


19. Gupta A, Gupta V. Metabolic syndrome: what are the risks for humans?

Biosci Trends. 2010;4(5):204-12.

20. Duvnjak L, Duvnjak M. The metabolic syndrome - an ongoing story. J

Physiol Pharmacol. 2009;60 Suppl 7:19-24.

21. Ngo TH, Barnard RJ, Leung PS, Cohen P, Aronson WJ. Insulin-like growth

factor I (IGF-I) and IGF binding protein-1 modulate prostate cancer cell

growth and apoptosis: possible mediators for the effects of diet and

exercise on cancer cell survival. Endocrinology. 2003;144(6):2319-24.

22. Huang PL. A comprehensive definition for metabolic syndrome. Dis Model

Mech. 2009;2(5-6):231-7.

23. Rohrmann S, Smit E, Giovannucci E, Platz EA. Association between

markers of the metabolic syndrome and lower urinary tract symptoms in

the Third National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III).

Int J Obes (Lond). 2005;29(3):310-6.

24. Hammarsten J, Högstedt B, Holthuis N, Mellström D. Components of the

metabolic syndrome-risk factors for the development of benign prostatic

hyperplasia. Prostate Cancer Prostatic Dis. 1998;1(3):157-62.


25. Parsons JK, Carter HB, Partin AW, Windham BG, Metter EJ, Ferrucci L, et

al. Metabolic factors associated with benign prostatic hyperplasia. J Clin

Endocrinol Metab. 2006;91(7):2562-8.

26. Kopp RP, Han M, Partin AW, Humphreys E, Freedland SJ, Parsons JK.

Obesity and prostate enlargement in men with localized prostate cancer.

BJU Int. 2011;108(11):1750-5.

27. Rył A, Rotter I, Miazgowski T, Słojewski M, Dołęgowska B, Lubkowska A,

et al. Metabolic syndrome and benign prostatic hyperplasia: association or

coincidence? Diabetol Metab Syndr. 2015;7:94.

28. De Nunzio C, Aronson W, Freedland SJ, Giovannucci E, Parsons JK. The

correlation between metabolic syndrome and prostatic diseases. Eur Urol.

2012;61(3):560-70.

29. Eom CS, Park JH, Cho BL, Choi HC, Oh MJ, Kwon HT. Metabolic

syndrome and accompanying hyperinsulinemia have favorable effects on

lower urinary tract symptoms in a generally healthy screened population. J

Urol. 2011;186(1):175-9.

30. Anderson EA, Hoffman RP, Balon TW, Sinkey CA, Mark AL.

Hyperinsulinemia produces both sympathetic neural activation and

vasodilation in normal humans. J Clin Invest. 1991;87(6):2246-52.


31. Cohen P, Peehl DM, Baker B, Liu F, Hintz RL, Rosenfeld RG. Insulin-like

growth factor axis abnormalities in prostatic stromal cells from patients

with benign prostatic hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab.

1994;79(5):1410-5.

32. Daughaday WH, Rotwein P. Insulin-like growth factors I and II. Peptide,

messenger ribonucleic acid and gene structures, serum, and tissue

concentrations. Endocr Rev. 1989;10(1):68-91.

33. Barni T, Vannelli BG, Sadri R, Pupilli C, Ghiandi P, Rizzo M, et al. Insulin-

like growth factor-I (IGF-I) and its binding protein IGFBP-4 in human

prostatic hyperplastic tissue: gene expression and its cellular localization.

J Clin Endocrinol Metab. 1994;78(3):778-83.

34. Neuhouser ML, Schenk J, Song YJ, Tangen CM, Goodman PJ, Pollak M,

et al. Insulin-like growth factor-I, insulin-like growth factor binding protein-3

and risk of benign prostate hyperplasia in the prostate cancer prevention

trial. Prostate. 2008;68(13):1477-86.

35. LeRoith D, Roberts CT. The insulin-like growth factor system and cancer.

Cancer Lett. 2003;195(2):127-37.

36. Adams TE, Epa VC, Garrett TP, Ward CW. Structure and function of the

type 1 insulin-like growth factor receptor. Cell Mol Life Sci.

2000;57(7):1050-93.


37. Muise-Helmericks RC, Grimes HL, Bellacosa A, Malstrom SE, Tsichlis PN,

Rosen N. Cyclin D expression is controlled post-transcriptionally via a

phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent pathway. J Biol Chem.

1998;273(45):29864-72.

38. Nickel JC, Downey J, Young I, Boag S. Asymptomatic inflammation and/or

infection in benign prostatic hyperplasia. BJU Int. 1999;84(9):976-81.

39. Furukawa S, Fujita T, Shimabukuro M, Iwaki M, Yamada Y, Nakajima Y, et

al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic

syndrome. J Clin Invest. 2004;114(12):1752-61.

40. Vignozzi L, Gacci M, Cellai I, Santi R, Corona G, Morelli A, et al. Fat

boosts, while androgen receptor activation counteracts, BPH-associated

prostate inflammation. Prostate. 2013;73(8):789-800.

41. Vignozzi L, Rastrelli G, Corona G, Gacci M, Forti G, Maggi M. Benign

prostatic hyperplasia: a new metabolic disease? J Endocrinol Invest.

2014;37(4):313-22.

42. Vignozzi L, Cellai I, Santi R, Lombardelli L, Morelli A, Comeglio P, et al.

Antiinflammatory effect of androgen receptor activation in human benign

prostatic hyperplasia cells. J Endocrinol. 2012;214(1):31-43.


43. Martin S, Lange K, Haren MT, Taylor AW, Wittert G, Study MotFAMA.

Risk factors for progression or improvement of lower urinary tract

symptoms in a prospective cohort of men. J Urol. 2014;191(1):130-7.

44. Comeglio P, Morelli A, Cellai I, Vignozzi L, Sarchielli E, Filippi S, et al.

Opposite effects of tamoxifen on metabolic syndrome-induced bladder and

prostate alterations: a role for GPR30/GPER? Prostate. 2014;74(1):10-28.

45. Vignozzi L, Morelli A, Sarchielli E, Comeglio P, Filippi S, Cellai I, et al.

Testosterone protects from metabolic syndrome-associated prostate

inflammation: an experimental study in rabbit. J Endocrinol.

2012;212(1):71-84.

46. Chen IH, Tong YC, Cheng JT. Metabolic syndrome decreases tissue

perfusion and induces glandular hyperplasia in the fructose-fed rat

prostate. Neurourol Urodyn. 2012;31(4):600-4.

47. Tsuru N, Kurita Y, Masuda H, Suzuki K, Fujita K. Role of Doppler

ultrasound and resistive index in benign prostatic hypertrophy. Int J Urol.

2002;9(8):427-30.

48. Azadzoi KM, Babayan RK, Kozlowski R, Siroky MB. Chronic ischemia

increases prostatic smooth muscle contraction in the rabbit. J Urol.

2003;170(2 Pt 1):659-63.


49. Berger AP, Kofler K, Bektic J, Rogatsch H, Steiner H, Bartsch G, et al.

Increased growth factor production in a human prostatic stromal cell

culture model caused by hypoxia. Prostate. 2003;57(1):57-65.

50. Grundy SM, Cleeman JI, Daniels SR, Donato KA, Eckel RH, Franklin BA,

et al. Diagnosis and management of the metabolic syndrome: an

American Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institute

Scientific Statement. Circulation. 2005;112(17):2735-52.

51. Meigs JB, Mohr B, Barry MJ, Collins MM, McKinlay JB. Risk factors for

clinical benign prostatic hyperplasia in a community-based population of

healthy aging men. J Clin Epidemiol. 2001;54(9):935-44.

52. Rohrmann S, Crespo CJ, Weber JR, Smit E, Giovannucci E, Platz EA.

Association of cigarette smoking, alcohol consumption and physical

activity with lower urinary tract symptoms in older American men: findings

from the third National Health And Nutrition Examination Survey. BJU Int.

2005;96(1):77-82.

53. Parsons JK, Kashefi C. Physical activity, benign prostatic hyperplasia, and

lower urinary tract symptoms. Eur Urol. 2008;53(6):1228-35.

54. Medeiros A, Oliveira EM, Gianolla R, Casarini DE, Negrão CE, Brum PC.

Swimming training increases cardiac vagal activity and induces cardiac

hypertrophy in rats. Braz J Med Biol Res. 2004;37(12):1909-17.


55. Barretti DL, Magalhães FeC, Fernandes T, do Carmo EC, Rosa KT,

Irigoyen MC, et al. Effects of aerobic exercise training on cardiac renin-

angiotensin system in an obese Zucker rat strain. PLoS One.

2012;7(10):e46114.

56. Steiner MS, Couch RC, Raghow S, Stauffer D. The chimpanzee as a

model of human benign prostatic hyperplasia. J Urol. 1999;162(4):1454-

61.

57. Berry SJ, Strandberg JD, Saunders WJ, Coffey DS. Development of

canine benign prostatic hyperplasia with age. Prostate. 1986;9(4):363-73.

58. Aaron L, Franco OE, Hayward SW. Review of Prostate Anatomy and

Embryology and the Etiology of Benign Prostatic Hyperplasia. Urol Clin

North Am. 2016;43(3):279-88.

59. Shappell SB, Thomas GV, Roberts RL, Herbert R, Ittmann MM, Rubin MA,

et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and

classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the

Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology

Committee. Cancer Res. 2004;64(6):2270-305.

60. Stark AH, Timar B, Madar Z. Adaptation of Sprague Dawley rats to long-

term feeding of high fat or high fructose diets. Eur J Nutr. 2000;39(5):229-

34.


61. Tran LT, Yuen VG, McNeill JH. The fructose-fed rat: a review on the

mechanisms of fructose-induced insulin resistance and hypertension. Mol

Cell Biochem. 2009;332(1-2):145-59.

62. Fellmann L, Nascimento AR, Tibiriça E, Bousquet P. Murine models for

pharmacological studies of the metabolic syndrome. Pharmacol Ther.

2013;137(3):331-40.

63. Buettner R, Parhofer KG, Woenckhaus M, Wrede CE, Kunz-Schughart LA,

Schölmerich J, et al. Defining high-fat-diet rat models: metabolic and

molecular effects of different fat types. J Mol Endocrinol. 2006;36(3):485-

501.

64. Rodrigues B, Figueroa DM, Mostarda CT, Heeren MV, Irigoyen MC, De

Angelis K. Maximal exercise test is a useful method for physical capacity

and oxygen consumption determination in streptozotocin-diabetic rats.

Cardiovasc Diabetol. 2007;6:38.

65. Jin P, Wang YH, Peng YG, Hu S, Lu Q, Yang LY. [Effect of PI3K/AKT

inhibitor on benign prostate hyperplasia and its mechanism: an

experimental study]. Zhonghua Nan Ke Xue. 2010;16(12):1068-75.

66. Berger AP, Deibl M, Leonhartsberger N, Bektic J, Horninger W, Fritsche

G, et al. Vascular damage as a risk factor for benign prostatic hyperplasia

and erectile dysfunction. BJU Int. 2005;96(7):1073-8.


67. Machado MV, Vieira AB, Nascimento AR, Martins RL, Daleprane JB,

Lessa MA, et al. Physical exercise restores microvascular function in

obese rats with metabolic syndrome. Metab Syndr Relat Disord.

2014;12(9):484-92.

68. Baar K, Esser K. Phosphorylation of p70(S6k) correlates with increased

skeletal muscle mass following resistance exercise. Am J Physiol.

1999;276(1 Pt 1):C120-7.

69. Terzis G, Georgiadis G, Stratakos G, Vogiatzis I, Kavouras S, Manta P, et

al. Resistance exercise-induced increase in muscle mass correlates with

p70S6 kinase phosphorylation in human subjects. Eur J Appl Physiol.

2008;102(2):145-52.

70. Drummond MJ, Fry CS, Glynn EL, Dreyer HC, Dhanani S, Timmerman

KL, et al. Rapamycin administration in humans blocks the contraction-

induced increase in skeletal muscle protein synthesis. J Physiol.

2009;587(Pt 7):1535-46.

71. Kemi OJ, Ceci M, Wisloff U, Grimaldi S, Gallo P, Smith GL, et al.

Activation or inactivation of cardiac Akt/mTOR signaling diverges

physiological from pathological hypertrophy. J Cell Physiol.

2008;214(2):316-21.


72. Fang ZH, Lee CH, Seo MK, Cho H, Lee JG, Lee BJ, et al. Effect of

treadmill exercise on the BDNF-mediated pathway in the hippocampus of

stressed rats. Neurosci Res. 2013;76(4):187-94.

73. Stoica L, Zhu PJ, Huang W, Zhou H, Kozma SC, Costa-Mattioli M.

Selective pharmacogenetic inhibition of mammalian target of Rapamycin

complex I (mTORC1) blocks long-term synaptic plasticity and memory

storage. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(9):3791-6.

74. Hudson CC, Liu M, Chiang GG, Otterness DM, Loomis DC, Kaper F, et al.

Regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha expression and function by

the mammalian target of rapamycin. Mol Cell Biol. 2002;22(20):7004-14.

75. Guba M, von Breitenbuch P, Steinbauer M, Koehl G, Flegel S, Hornung M,

et al. Rapamycin inhibits primary and metastatic tumor growth by

antiangiogenesis: involvement of vascular endothelial growth factor. Nat

Med. 2002;8(2):128-35.

76. Jones LW, Antonelli J, Masko EM, Broadwater G, Lascola CD, Fels D, et

al. Exercise modulation of the host-tumor interaction in an orthotopic

model of murine prostate cancer. J Appl Physiol (1985). 2012;113(2):263-

72.

77. Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer.

2003;3(10):721-32.


78. Yoo TK, Cho HJ. Benign prostatic hyperplasia: from bench to clinic.

Korean J Urol. 2012;53(3):139-48.

79. Vital P, Castro P, Ittmann M. Oxidative stress promotes benign prostatic

hyperplasia. Prostate. 2016;76(1):58-67.

80. Herrmann JL, Bruckheimer E, McDonnell TJ. Cell death signal

transduction and Bcl-2 function. Biochem Soc Trans. 1996;24(4):1059-65.

Apêndices

Apêndices

Aprovação do comitê de ética em pesquisa da USP

Participação em congresso

1. American Urological Association (AUA) – New Orleans, USA – 2015

MP31-17

Artigo científico submetido

The Prostate

Physical activity prevents the proliferation of prostatic tissue by inhibiting the

IGF-1/Akt pathway and stimulation of angiogenesis. an experimental study

in rats.

Apêndices

Apêndices

Title: Physical activity prevents the proliferation of prostatic

tissue by inhibiting the IGF-1/Akt pathway and stimulation of

angiogenesis: an experimental study in rats.

Authors: Fernando Mello Froes Fonseca 1, Andre Matos de Oliveira 1, Sabrina

Thalita Reis 1, Nayara Isabel Viana 1, Edilamar Menezes Oliveira 2, Katia

Ramos Moreira Leite 1, William Carlos Nahas 1, Miguel Srougi 1, Alberto

Azoubel Antunes 1.

Affiliations:

1 - Laboratory of Medical Research – LIM 55, Urology, University of Sao Paulo

Medical School – Sao Paulo – Brazil.

2 - School of Physical Education and Sport, University of Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brazil.

Correspondence should be addressed to F.M.F.F.:

Fernando Mello Froes Fonseca Av. Dr. Arnaldo, 455, sala 2145 – Sao Paulo – Brazil CEP: 01246-903

55-61-30617183 [email protected]

Funded by: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), number 2015/02335-5

Disclosures: None

Apêndices

Background: Sedentarism and obesity have been reported as relevant risk

factors for the development of benign prostatic hyperplasia (BPH). In the

present work we investigated the role of physical activity in proliferative and

angiogenic pathways on prostate and implications for BPH prevention.

Methods: Male Wistar rats with eight weeks old were used in this experiment,

randomly divided into four groups: 1. physical activity (PA) and normal diet; 2.

PA and high fat diet; 3. sedentary (S) and normal diet; 4. S and high fat diet.

Groups 1 and 2 were submitted to a swimming training protocol for 10 weeks.

At the end of the protocol, prostate glands were dissected. We measured

prostatic gene expression levels of insulin-like growth factor 1 (IGF-1), IGF-

1/PI3K/Akt proliferative axis and genes related to angiogenesis through the

quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method, and

apoptotic index (TUNEL). Results: After 10 weeks, groups 1 and 2 had less

visceral fat when compared to the groups 3 (29,4 vs 37,96 grams; p<0,05) and

4 (31,87 vs 41,96 grams; p<0,05), respectively. When comparing normal fed

rats (group 1 vs group 3), IGF-1, IRS1 and Akt genes were less expressed in

prostate of rats submitted to PA (means 0.22, 0.04 and 0.27 respectively).

Those patterns of expressions were also shown when we compared high fat fed

rats (group 2 vs group 4), but the IGF1 downregulation was less pronounced

(p<0,001). PA increased the expression of angiogenic related genes (HIF-1α,

VEGF, VEGFR and mTOR) when comparing rats submitted to high fat diet.

Apoptotic index (number of apoptosis per 10 HPF) was higher in rats submitted

to PA (9,0 vs 2,0; group 1 vs group 3; p=0,07), (9,0 vs 1,43; group 1 vs group 4;

p<0,05). Conclusions: PA seems to inhibit IGF-1/Akt proliferative axis on

Apêndices

prostate in both normal and high fat fed rats, stimulates angiogenesis in high

fed rats, and increase prostatic apoptosis. These findings can be related to BPH

prevention.

Key words: prostatic hyperplasia; exercise; obesity; insulin resistance;

gene expression

Apêndices

Introduction

Metabolic syndrome has been associated with an increased risk of

benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) in

several observational studies (1-4). It is believed that several components of

metabolic syndrome, such as obesity and diabetes mellitus, may be responsible

for the development of BPH, such as changes in serum concentrations of

estradiol and testosterone, the induction of cell proliferation by insulin and

insulin-like growth factor (IGF-1) in the prostatic tissue through specific

receptors, and the release of pro-inflammatory substances in the prostatic

tissue stimulated by obesity, such as ox-LDL and adiponectin (5-7). The action

of IGF-1 is particularly important for prostate growth and development, and

changes in the IGF-1 signaling pathway have been described in prostatic

stromal cell lines derived from patients with BPH (8).

In this context, the prevention of metabolic syndrome through lifestyle

changes such as physical activity may have a beneficial effect on the symptoms

and progression of BPH. Several clinical studies have pointed to an association

between high levels of physical activity and a lower risk of BPH/LUTS (9,10).

Despite consistent clinical evidence, no randomized clinical study has evaluated

the role of physical activity in the development of BPH/LUTS. Moreover, the

biological mechanisms through which physical activity may influence the

development of BPH/LUTS are unknown. Therefore, it is of utmost importance

to evaluate how physical activity influences the molecular pathways of prostatic

proliferation, such as the IGF-1/Akt proliferative pathway and angiogenesis

pathways, in addition to their influence in the process of apoptosis.

Apêndices

Materials and methods

Male 8-week-old Wistar rats (200-220 g) were used in the experiment.

The rats were randomized into 4 groups and allocated to cages with 3 to 5

animals each. In groups 1 and 2 the animals were subjected to a 12-week

program of physical activity through an aquatic training protocol previously

described in the literature (11), and in groups 3 and 4, the animals were

subjected to a sedentary routine, remaining in cages for the entire study, but

moving freely.

This swimming protocol was previously described as having mild to

moderate intensity and long duration with the aim of increasing muscular

oxidative capacity. In groups 1 and 3, the animals were fed a standard AIN-93

diet consisting of 62% starch, 14% proteins, 10% sucrose, 4% soy oil, and

vitamins and minerals at standard dosing for 12 weeks. In groups 2 and 4, the

animals were fed a high-fat diet consisting of 36% starch, 14% proteins, 30% fat

(pork lard), 10% sucrose, 4% soy oil, in addition to vitamins and minerals at

standard dosing for the same 12-week period.

At the end of the physical activity protocol, the rats were anesthetized

with 1.2 g/kg of urethane through intraperitoneal injection, blood samples were

collected, and the animals were sacrificed, with subsequent excision of the

prostate, bladder, and epididymal and retroperitoneal fat. The ventral prostatic

lobes were separated and preserved for the analysis of apoptosis using

terminal dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay, and molecular analysis (gene

expression) of IGF-1, IGF-1 receptor (IGF-1R), insulin receptor substrate

Apêndices

(IRS1), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), protein kinase B (Akt) and mitogen-

activated protein kinase (MAPK), for the analysis of the IGF-1/Akt proliferative

pathway, and angiogenesis-related factors, including vascular endothelial

growth factor (VEGF), VEGF receptors (VEGFR1, VEGFR2), hypoxia-inducible

factor 1 (HIF-1α) and the mammalian target of rapamycin protein (mTOR).

The TUNEL assay was performed in the cells of the ventral portion of the

prostate of rats from the four groups, through labeling with the TdT-FragEL™

DNA Fragmentation Detection Kit (Cat. Nº QIA33-1EA), and quantified for

every 10 high-power fields (HPFs). The slides with prostatic tissue were

deparaffinized and rehydrated with xylene and ethanol, permeabilized,

subjected to endogenous peroxidase inactivation, and labeled with the TdT

Reaction Mixture. The labeled cells were counted.

Gene expression was evaluated through RNA extraction from prostatic

tissue, cDNA synthesis from the RNA, and subsequent analysis of the cDNA

using reverse transcription followed by quantitative real-time polymerase chain

reaction (qRT-PCR) (ABI7500 platform) using the TaqMan® protocol (Applied

Biosystems, Foster City, CA). Initial experiments of absolute quantification with

the ß2 microglobulin (B2M) control gene validated the cDNA before the

experiments for quantification of the gene of interest. For the relative

quantification of the genes under study, we normalized their expression relative

to the expression of the control gene B2M. As the control group, we studied the

prostatic tissue samples from the sedentary rats. To calculate the relative

expression of the target genes, we employed the ∆∆CT method, which uses the

following formula: ∆∆CT = (CT of the target gene, active rat prostate sample –

CT of endogenous control, active rat sample) – (CT of the target gene,

Apêndices

sedentary rat sample – CT of the endogenous control, sedentary rat sample).

The number of times when change in gene expression occurred was calculated

as 2 -∆∆CT. The primers used for quantification of the genes selected for the

study are listed in Table 1.

For statistical analysis, Student's t-test was used for univariate analysis

and ANOVA for multivariate analysis, using SPSS 19.0 software. A significance

level of 5% was adopted for all statistical analyses (p<0.05).

Results

The rats engaging in physical activity gained less weight than the

sedentary animals, and the active rats had less abdominal fat (epididymal and

retroperitoneal). Physical activity reduced the prostate weight in rats fed a

standard diet (group 1 vs group 3: 1.11 vs 1.38 g; p<0.05) but did not have an

effect on rats fed a high-fat diet (group 2 vs group 4: 1.17 vs 1.08 g; p>0.05).

Serum insulin and the homeostasis model assessment (HOMA) index were

lower for the active rats after the 12 weeks of the study but without statistical

significance (group 1 vs group 3; group 2 vs group 4). Triglycerides were

reduced by physical activity, especially in rats fed a standard diet (group 1 vs

group 3: 71.43 vs 111.32; p<0.001). Serum dihydrotestosterone (DHT) was

reduced with physical activity when we compare the rats fed the standard diet

(group 1 vs group 3), and serum IGF-1 increased with physical activity when we

compared the rats fed a high-fat diet (group 2 vs group 4). The morphological

data and serum concentrations are summarized in Tables 2 and 3.

Apêndices

When we compared to the animals fed a standard diet (group 1 vs group

3; Figure 1), the gene expression of IGF-1, IRS1 and Akt was lower in the

prostate of rats engaging in physical activity (ratios of 0.22, 0.04, and 0.27,

respectively), with a homogeneous pattern of expression. These patterns of

gene expression triggered by physical activity were also observed when we

compared to rats fed a high-fat diet (group 2 vs group 4; Figure 2), but the

downregulation of IGF-1 was less pronounced (p<0.001). The gene expression

of PI3K and MAPK3 was not influenced by physical activity either in rats fed a

standard diet or in rats fed a high-fat diet.

Physical activity was associated with heterogeneous overexpression of

HIF-1α, VEGF receptors and mTOR, in addition to a small heterogeneous

underexpression of VEGF, when we compared rats fed a standard diet (group 1

vs group 3; Figure 1). When we compared rats fed a high-fat diet (group 2 vs

group 4; Figure 2), physical activity increased the gene expression of HIF-1α,

VEGF, VEGF receptors, and mTOR in a homogeneous manner.

The number of apoptotic cells for each 10 HPFs identified in the in situ

hybridization method (TUNEL) was higher in the prostate of rats engaging in

physical activity, either when comparing rats fed a standard diet (group 1 vs

group 3: 9.0 vs 2.0; p=0.07), showing a marginal difference, or between the

extreme groups (group 1 vs group 4: 9.0 vs 1.43; p<0.05) (Figure 3). Although

the number of apoptotic cells was also numerically higher among animals in

group 2 (PA + HFD) compared with groups 3 and 4, we did not observe

statistical significance.

Apêndices

Discussion The main signaling pathways activated by the binding of IGF-1 to IGF-1R

in the prostate and other types of cells are the MAPK cascade and the PI3K/Akt

cascade (12). The activated IGF-1R is connected to the MAPK pathway through

IRS1 adapter proteins that activate kinases ERK1 and ERK2 of the MAPK

family, with subsequent phosphorylation and activation of transcription factors,

resulting in differentiation and proliferation cell responses (13). IRS1 can also

couple its active receptor with PI3K, with subsequent Akt recruitment. The

cascade effects of activation of the PI3K/Akt pathway include protection against

apoptosis and an increase in cell proliferation (14).

In this study, physical activity suppressed the gene expression of

endogenous IGF-1, IRS1, and Akt in a uniform manner, without suppression of

the PI3K gene, suggesting inhibition of the PI3K/Akt proliferative pathway, as

Akt activation represents one of the final phases of the proliferation cascade

and depends on PI3K activation. Suppression of this pathway was not

associated with a reduction in serum IGF-1, suggesting that suppression of the

IRS1/PI3K/Akt signaling pathway was triggered by a decrease in the paracrine

action of IGF-1 produced in the prostatic stroma, and not through an endocrine

mechanism acting directly in the epithelium. The decreases in serum insulin and

peripheral insulin resistance caused by physical activity may also partially

explain the suppression of this pathway since insulin receptors present in the

epithelium of the prostate can also stimulate this proliferative pathway to a

lesser extent than the stimulation triggered by IGF-1.

Apêndices

Physical activity was associated with overexpression of genes for

hypoxia (HIF1-α) and angiogenesis (VEGF, VEGF receptors and mTOR) in

rats fed a high-fat diet. This difference was not observed when we compared

rats fed a standard diet, in which we observed a heterogeneous expression

pattern for VEGF and HIF-1α. To the best of our knowledge, this is the first

study that evaluated the effects of physical activity on the hypoxia and

angiogenesis process in non-tumoral prostatic tissue. Metabolic syndrome

damages the microvascular function and decreases the capillary density of

several organs, and prior studies indicated a reduction in prostatic blood flow

and increase in vascular resistance in patients with BPH compared with

healthy individuals. Moreover, patients with vascular disease present a greater

reduction in prostatic flow and increased severity of BPH-related symptoms

compared with patients without vascular disease (15). Recently, Machado et

al. showed that physical activity can restore the microvascular function of

organs in rats with metabolic syndrome, such as skeletal muscle and skin (16),

a fact that may indicate that this process also occurs in prostatic tissue.

The increased expression of angiogenesis factors in the prostate does

not necessarily induce proliferation of the prostatic tissue when these factors

are stimulated by physical activity. A study evaluating the effects of physical

activity on a murine model of prostate cancer (C57BL/6) showed that physical

activity stimulated the MEK/MAPK and mTOR signaling pathways, with

subsequent elevation of the intratumoral HIF-1α and VEGF, in addition to a

reduction in Akt, similar to our findings. These findings were associated with

hypervascularization and improved tumoral perfusion. However, the rats

engaging in physical activity maintained the same tumoral volume as the

Apêndices

control rats, in addition to a lower rate of lymph node involvement (36%) and

distant metastases (34%) in the active rats (17). The seemingly paradoxical

findings in that study have still not been clarified, but they may indicate an

important difference in the way HIF-1α is activated in different situations.

Under normal conditions, solid tumors generally have an aberrant

vascularization that impairs oxygen supply and the elimination of metabolites

from glycolysis, causing tissue hypoxia and subsequent HIF-1α activation.

This process stimulates angiogenesis cascades through VEGF stimulation in

an effort to maintain the intratumoral oxygen supply. Paradoxically, this

process causes pathological nonproductive angiogenesis, with the formation

of aberrant vessels and a reduction in oxygenation and perfusion, creating a

vicious cycle of hypoxia, consequent tumoral invasion, and metastasis (18). In

the study by Jones et al., HIF-1α stimulation induced by physical activity was

associated with a reverse outcome: improved tumoral perfusion and

vascularization, indicating a productive and physiological angiogenesis

process that is not associated with the induction of pathological tissue hypoxia,

as previously described at rest, and it may partially explain the lower rate of

tumoral progression and lower index of metastases.

Likewise, local tissue hypoxia may also play an important role in BHP

progression induced by oxidative stress, a finding that is relevant in patients

with metabolic syndrome, leading to the differentiation of fibroblasts into

myofibroblasts and neovascularization. In response to hypoxia, the prostatic

stromal cells may stimulate the production of several inflammatory and

proliferative factors, such as VEGF, FGF-2, FGF-7, and IL-8 (19) (20).

Therefore, a productive and physiological angiogenesis process triggered by

Apêndices

physical activity could also prevent pathological tissue hypoxia in a hyperplastic

tissue through a mechanism similar to that found in neoplastic tissue.

Physical activity seems to stimulate the process of cell apoptosis in the

prostate, a finding that may be partially explained by the inhibition of the

PI3K/Akt pathway, as this pathway may act in the metabolism of the Bcl-2

protein (21). The DNA fragmentation identified in the TUNEL assay represents

a late stage of the apoptosis process, making it necessary to understand how

physical activity acts on the intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis in the

prostate.

Conclusions

Physical activity inhibited the gene expression of the IGF-1/AKT

proliferative axis in the prostate in rats fed a normal diet and those fed a high-fat

diet, and it stimulated hypoxia and angiogenesis genes in rats fed a high-fat

diet. These findings may help explain how lifestyle changes may prevent BPH.

Apêndices

References

1. Hammarsten J, Högstedt B, Holthuis N, Mellström D. Components of the metabolic syndrome-risk factors for the development of benign prostatic hyperplasia. Prostate Cancer Prostatic Dis 1998;1(3):157-162.

2. Rohrmann S, Smit E, Giovannucci E, Platz EA. Association between

markers of the metabolic syndrome and lower urinary tract symptoms in the Third National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III). Int J Obes (Lond) 2005;29(3):310-316.

3. Parsons JK, Carter HB, Partin AW, Windham BG, Metter EJ, Ferrucci L,

Landis P, Platz EA. Metabolic factors associated with benign prostatic hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab 2006;91(7):2562-2568.

4. Kopp RP, Han M, Partin AW, Humphreys E, Freedland SJ, Parsons JK.

Obesity and prostate enlargement in men with localized prostate cancer. BJU Int 2011;108(11):1750-1755.

5. Martin S, Lange K, Haren MT, Taylor AW, Wittert G, Study MotFAMA.

Risk factors for progression or improvement of lower urinary tract symptoms in a prospective cohort of men. J Urol 2014;191(1):130-137.

6. Vignozzi L, Gacci M, Cellai I, Santi R, Corona G, Morelli A, Rastrelli G,

Comeglio P, Sebastanelli A, Maneschi E, Nesi G, De Nunzio C, Tubaro A, Mannucci E, Carini M, Maggi M. Fat boosts, while androgen receptor activation counteracts, BPH-associated prostate inflammation. Prostate 2013;73(8):789-800.

7. Vignozzi L, Gacci M, Maggi M. Lower urinary tract symptoms, benign

prostatic hyperplasia and metabolic syndrome. Nat Rev Urol 2016;13(2):108-119.

8. Cohen P, Peehl DM, Baker B, Liu F, Hintz RL, Rosenfeld RG. Insulin-like

growth factor axis abnormalities in prostatic stromal cells from patients with benign prostatic hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab 1994;79(5):1410-1415.

9. Parsons JK, Kashefi C. Physical activity, benign prostatic hyperplasia,

and lower urinary tract symptoms. Eur Urol 2008;53(6):1228-1235. 10. Maserejian NN, Kupelian V, Miyasato G, McVary KT, McKinlay JB. Are

physical activity, smoking and alcohol consumption associated with lower urinary tract symptoms in men or women? Results from a population based observational study. J Urol 2012;188(2):490-495.

Apêndices

11. Medeiros A, Oliveira EM, Gianolla R, Casarini DE, Negrão CE, Brum PC. Swimming training increases cardiac vagal activity and induces cardiac hypertrophy in rats. Braz J Med Biol Res 2004;37(12):1909-1917.

12. LeRoith D, Roberts CT. The insulin-like growth factor system and cancer.

Cancer Lett 2003;195(2):127-137. 13. Adams TE, Epa VC, Garrett TP, Ward CW. Structure and function of the

type 1 insulin-like growth factor receptor. Cell Mol Life Sci 2000;57(7):1050-1093.

14. Muise-Helmericks RC, Grimes HL, Bellacosa A, Malstrom SE, Tsichlis PN, Rosen N. Cyclin D expression is controlled post-transcriptionally via a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent pathway. J Biol Chem 1998;273(45):29864-29872.

15. Berger AP, Deibl M, Leonhartsberger N, Bektic J, Horninger W, Fritsche

G, Steiner H, Pelzer AE, Bartsch G, Frauscher F. Vascular damage as a risk factor for benign prostatic hyperplasia and erectile dysfunction. BJU Int 2005;96(7):1073-1078.

16. Machado MV, Vieira AB, Nascimento AR, Martins RL, Daleprane JB,

Lessa MA, Tibiriçá E. Physical exercise restores microvascular function in obese rats with metabolic syndrome. Metab Syndr Relat Disord 2014;12(9):484-492.

17. Jones LW, Antonelli J, Masko EM, Broadwater G, Lascola CD, Fels D,

Dewhirst MW, Dyck JR, Nagendran J, Flores CT, Betof AS, Nelson ER, Pollak M, Dash RC, Young ME, Freedland SJ. Exercise modulation of the host-tumor interaction in an orthotopic model of murine prostate cancer. J Appl Physiol (1985) 2012;113(2):263-272.

18. Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer

2003;3(10):721-732. 19. Yoo TK, Cho HJ. Benign prostatic hyperplasia: from bench to clinic.

Korean J Urol 2012;53(3):139-148. 20. Vital P, Castro P, Ittmann M. Oxidative stress promotes benign prostatic

hyperplasia. Prostate 2016;76(1):58-67. 21. Herrmann JL, Bruckheimer E, McDonnell TJ. Cell death signal

transduction and Bcl-2 function. Biochem Soc Trans 1996;24(4):1059-1065.

Apêndices

Legends

Figure 1 - Gene expression in rats fed a standard diet (group 1 vs group 3). Baseline: mean gene expression in group 3 rats.

Figure 2 - Gene expression in rats fed a high-fat diet (group 2 vs group 4). Baseline: mean gene expression in group 4 rats.

Figure 3 - Number of apoptotic cells per 10 high-power fields (HPF).

Apêndices

TABLE 1 Primers used for the quantification of the genes selected for the study

Primer Assay Primer Assay

IGF-1 Rn00710306_m1 HIF-1α Rn00577560_m1

IGF-1R Rn00583837_m1 VEGF Rn01511601_m1

IRS1 Rn02132493_s1 VEGFR1 Rn00570815_m1

Akt Rn00690900_m1 VEGFR2 Rn00564986_m1

PI3K Rn00564547_m1 mTOR Rn00693900_m1

MAPK3 Rn00820922_g1 B2M Rn560865_m1

Apêndices

TABLE 2 Morphometric data (results expressed as the mean)

Group 1 (PA + SD) (n=07)

Group 2 (PA + HFD) (n=07)

Group 3 (SED + SD) (n=07)

Group 4 (SED + HFD) (n=07)

Body Weight (g)

Inicial

Week 12

312,43

526,31

321,90

531,74

337,33

598,96

354,04

611,61

Weight gain (g) 213,89

§ £ 209,84

# ‡ 261,63 257,57

Epididymal fat (g) 14,06 § £

15,26 # ‡

19,74 20,38 Retroperitoneal fat (g) 15,35

£ 16,62 18,23 21,58

Prostate weight (g) 1,11 § 1,17 1,38

† 1,08

Bladder weight (g) 0,19 * £ 0,14

# 0,18

† 0,13

PA: physical activity; SED: sedentary; SD: standard diet; HFD: high-fat diet. * p< 0.05 group 1 vs 2; § p < 0.05 group 1 vs 3; £ p <0.05 group 1 vs 4 ; # p < 0.05 group 2 vs 3; ‡ p <0.05 group 2 vs 4; † p <0.05 group 3 vs 4.

Apêndices

TABLE 3 Blood pressure (BP) data and serum analysis (results expressed as the mean ± standard deviation).

Group 1 (PA + SD)

(n=07) Group 2 (PA + HFD)

(n=07) Group 3 (SED + SD)

(n=07) Group 4 (SED + HFD)

(n=07)

Systolic BP (mmHg) 115,44 113,40 110,38 117,57

Glycemia (mg/dL) 106,86 * £ 123,33

# 104,86

† 129,29

Insulin 4,15 £ 4,87 5,15 6,05

HOMA index 1,10 £ 1,49 1,33

† 1,96

Cholesterol 63,50 * § 54,95

# 71,74

† 61,34

LDL 2,69 2,75 4,39 2,73

HDL 46,53 38,58 45,08 45,19

Triglycerides 71,43 § 68,08

# 111,32

† 67,11

Testosterone 0,89 0,77 0,79 0,95

DHT 0,12 § 0,15 0,21

† 0,13

IGF-1 2,11 2,48 ‡ 2,65

† 1,40

PA: physical activity; SED: sedentary; SD: standard diet; HFD: high-fat diet. * p< 0.05 group 1 vs 2; § p < 0.05 group 1 vs 3; £ p <0.05 group 1 vs 4 ; # p < 0.05 group 2 vs 3; ‡ p <0.05 group 2 vs 4; † p <0.05 group 3 vs 4.

Apêndices

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