Fluídos Biológicos 2

Análise do Fluído Seminal e Espermograma

Prof. Dr. Luís Gustavo R. Fernandes

Espermatogênese

Revisão dos tipos celulares dos túbulos seminíferos e do espaço

intersticial

extraído, enquanto dispnível, de: http://academic.pgcc.edu/~aimholtz/AandP/206_ONLINE/Repro/malerepro1.html

VISÃO MICROSCÓPICA DO TESTÍCULO

extraído, enquanto disponível, de: http://academic.pgcc.edu/~aimholtz/AandP/206_ONLINE/Repro/malerepro1.html

Células reprodutoras (espermatogônias,

espermatócitos, espermátides e

espermatozóides) e células

sustentaculares (Sertoli)

Tipos celulares nos túbulos seminíferos

TÚBULO SEMINÍFERO E TIPOS CELULARESmembrana basal

Seminiferous tubules form the mass of the testes and are the sites of spermatogenesis. Seminiferous tubules are composed of a thick layer of spermatogenic cells (most numerous) and sustentacular (Sertoli) cells which rest on a basement membrane. The spermatogenic cells--spermatogonia, primary spermatocytes, secondary spermatocytes, spermatids and spermatozoa--represent different cell stages in spermatogenesis (setas amarelas). The outlines of sustentacular cells are not distinct. Maturing spermatozoa are found embedded, head first, in the sustentacular cells, which provide mechanical support, protection and possibly nutrition for the developing spermatozoa.

células sustentaculares (Sertoli)

extraído, enquanto disponível, de: http://trc.ucdavis.edu/mjguinan/apc100/modules/Reproductive/mammal/testis3/test is6.html

espermatogônias

espermatócitos primários espermatócitos secundários espermátides

http://www.cvm.okstate.edu/instruction/mm_curr/histology/MR/HiMRP4.htm

É o processo pelo qual as células-tronco se desenvolvem em espermatozóides maduros. Existem 3 fases: (1) Espermatocitogênese, (2) Meiose, and (3) Espermiogênese.

Espermatogênese

1. Espermatocitogênese (também chamada mitose): células-tronco (espermatogônia do Tipo A) dividem-se mitoticamente e produzem as células que irã se diferenciar (espermatogônia do Tipo B).  

compartimento basal

2. Meiose: Células em prófase da 1ª divisão meiótica são os espermatócitos primários. Estes, ao completarem a divisão meiótica são chamados espermatócitos secundários. Rapidamente ocorre a 2ª divisão meiótica, originando as espermátides.

http://www.cvm.okstate.edu/instruction/mm_curr/histology/MR/HiMRP4.htm

Espermatogênese

compartimento basal

compartimento apical ou adluminal

É o processo pelo qual as células-tronco se desenvolvem em espermatozóides maduros. Existem 3 fases: (1) Espermatocitogênese, (2) Meiose, and (3) Espermiogênese.

Espermatogênese

3. Espermiogênese: é a metamorfose das espermátides esféricas a espermatozóides alongados. Durante a espermiogênese é formado o acrossoma e o flagelo.

compartimento basal

compartimento apical ou adluminal

É o processo pelo qual as células-tronco se desenvolvem em espermatozóides maduros. Existem 3 fases: (1) Espermatocitogênese, (2) Meiose, and (3) Espermiogênese.

http://www.cvm.okstate.edu/instruction/mm_curr/histology/MR/HiMRP4.htm

EspermiogêneseAs mudanças durante a espermiogênese envolvem transformações da espermátide esférica a

espermatozóide maduro: (1) formação do acrossoma, (2) mudanças nucleares, (3) desenvolvimento do flagelo, (4) reorganização do citoplasma e organelas celulares e (5) o

processo de liberação da cél. de Sertoli (espermiação).

http://www.endotext.org/male/male1/maleframe1.htm

extraído, enquanto disponível, de: http://rbp.fmrp.usp.br/didatico/Embriologia-Propedeutico/embrio__propedeutico%202004_tema1.PDF

EspermiogêneseAs mudanças durante a espermiogênese envolvem transformações da espermátide esférica a

espermatozóide maduro: (1) formação do acrossoma, (2) mudanças nucleares, (3) desenvolvimento do flagelo, (4) reorganização do citoplasma e organelas celulares e (5) o

processo de liberação da cél. de Sertoli (espermiação).

extraído, enquanto disponível, de: http://academic.pgcc.edu/~aimholtz/AandP/206_ONLINE/Repro/malerepro1.html

Espermatogênese

http://fisiologia.med.up.pt/teoricoprtc.html

EPIDÍDIMO

http://microanatomy.net/Male_Reproductive/Lecture_40_Male_Reproductive_Childs_4_slides_per_page.pdf

Epidídimo

EPIDÍDIMO

CAPACITAÇÃO DO ESPERMATOZÓIDEALTERAÇÃO FUNCIONAL DO ESPERMATOZÓIDE QUE OCORRE NA TROMPA UTERINA. REQUER UM TEMPO PARA QUE OCORRA (2 OU ATÉ >6 HORAS).

PELO MENOS DOIS FÊNOMENOS SÃO IMPORTANTES:

O AUMENTO DA TAXA DE BATIMENTO DO FLAGELO E A ACELERAÇÃO DO MOVIMENTO DO ESPERMATOZÓIDE

REAÇÃO ACROSSÔMICA NO SPTZ QUE PERMITE A FUSÃO COM O OVO: FRAGMENTAÇÃO E PERDA DO ACROSSOMA, COM A LIBERAÇÃO DE ENZIMAS E PROTEASES QUE PERMITIRÃO AO SPTZ PENETRAR E SE FUNDIR AO OVO.

O ENTENDIMENTO DESTES MECANISMOS É IMPORTANTE PARA A FERTILIZAÇÃO IN VITRO.

No que consiste a análise do sêmen● Uma avaliação da espermatogênese e espermiogênese.

Análise descritiva tradicional:● interpretação baseada em distribuições populacionais de

características, portanto, propenso a erros de interpretação no nível individual.

● Abordagem moderna é avaliar com relação a: ● diagnóstico de lesões específicas;● indicadores de potencial disfuncional e / ou funcional. ● Exige a compreensão da relevância da patofisiologia

relacionada a alteração esperma ● Em qualquer caso, os resultados devem ser precisos e

confiáveis.

Por que realizar as análises?● Diagnóstico de esterilidade● Diagnóstico da infertilidade ● O prognóstico para a fertilidade ● Identificar as opções de tratamento:

● tratamento cirúrgico ● tratamento médico ● tratamento de reprodução assistida

● Portanto = um teste de triagem para ajudar a gestão direta.

Coleta da Amostra● Para um resultado significativo, amostras de sêmen deve ser sempre

coletadas em condições padronizadas: ● o recipiente tem que ser estéril e sabe não ser spermotoxic (ou

seja fornecido pelo laboratório) ● o homem deve ter tido 3 - 5 dias de abstinência ● o homem deve ter lavado as mãos antes da coleta

(principalmente se a análise microbiológica é solicitada) ● O homem não deve ter usado lubrificantes ● a amostra deve ser mantida a 37 °C até que a análise se inicie.

De preferência dentro de 30 minutos, mas absolutamente dentro de 60 min, após ejaculação

Processamento da Amostra● A amostra deve ser misturada cuidadosamente durante o

período de liquefação● A amostra NUNCA deve ser centrifugada (a única exceção

é para a preparação de material fixado para avaliação de concentração)

● A amostra nunca deve ser "passada por agulha" - se for demasiado viscoso para trabalhar com, um volume conhecido de solução tampão de esperma (não PBS) que deve ser adicionado e misturado suavemente a amostra.

● O volume adicionado deve ser incluído no cálculo da concentração espermática

Avaliação Macroscópica

● Aparência ● Odor ● Liquefação ● Volume ● Viscosidade ● pH

Avaliação Macroscópica

Homogenizar a amostra, ainda no frasco de recolha coleta, suavementeObserve os seguintes aspectos: ● Cor (normal = branco ao cinza-amarelo) - se houver

sangue presente, ela pode variar do rosa ao marrom ● Opacidade / translucidez (= normal tende a opaco) ● Se há a presença de filamentos de muco ou aglomerados

de células

Avaliação Macroscópica● Diferentes pessoas têm diferentes habilidades para sentir

o cheiro de sêmen, e isso não pode ser padronizado ● No entanto, quando a tampa é retirada do frasco de

recolha, deve notar-se que há um forte cheiro de urina ou da putrefação

● As amostras recolhidas após um período de abstinência prolongada (isto é, de várias semanas) são susceptíveis de ter um forte odor

● Liquefação é a quebra da porção de gel do plasma seminal - as enzimas para isso estão no fluido prostático

● Uma amostra com liquefacção incompleta tem um material gelatinoso em uma base líquida - isto pode ser visto quando a amostra é homogenizada para a avaliação da aparência

Avaliação Macroscópica● Viscosidade está relacionada com a natureza do fluido da amostra

inteira:● A viscosidade ou consistência da amostra liquefeita pode ser

estimada por gentil aspiração do sêmen em pipetas de 5 ml, seguida de fácil gotejamento.

– Normal quando gotas são formadas. – No caso de viscosidade anormal verifica-se no processo de

gotejamento a formação de um filamento de mais de 2 cm. – O aumento da consistência pode estar relacionado com disfunção

prostática por inflamação crônica. A consistência anormal também pode intervir na avaliação de várias características do sêmen, tais como a motilidade, concentração ou determinação de anticorpos antiespermatozóides.

● O volume da amostra deve ser medido para permitir uma determinação precisa do número de espermatozóides

● Isto é mais facilmente avaliada usando uma pipeta volumétrica descartável

● Depois da avaliação do volume amostra é medida a viscosidade

Avaliação Bioquímica● PH

● pH é importante porque o esperma morre a pH <6,9 ● O pH do sêmen liquefeito normalmente é determinado usando tiras de

teste (faixa de pH 6,5-10,0) ● Costumamos medir o pH após volume e viscosidade - tocando a

pipeta volumétrica já vazia (teste de volume) para a tira de teste● O intervalo de pH normal é de 7,2-8,4 ● Desordens inflamatórias das glândulas acessórias pode levar a um pH

fora desta faixa ● Ácido cítrico: pode indicar, função prostática - níveis baixos podem indicar

disfunção ou obstrução do ducto prostático ● Zinco: marcador para a função prostática - ensaio colorimétrico (OMS) ● Frutose: marcador para a função da vesícula seminal, e é um substrato

para o metabolismo do esperma - ensaio espectrofotométrico (OMS)● α-Glucosidase: secretada exclusivamente pelo epidídimo e por isso é um

marcador para a função do epidídimo - ensaio espectrofotométrico (OMS)

Análises das Amostras a Fresco● As características avaliadas são:

● Motilidade ● Agregação de espermatozóides (aglomeração aleatória) -

"alguns" é normal, mas os grandes grupos (cada um com centenas de esperma) é anormal

● Espermaglutinação (entre locais específicos) - pode sugerir a presença de anticorpos anti-espermatozóides.

● Células redondas: deve ser <1 por 40 × campo (~ 1.000 mil / ml). Se mais abundante, um teste de leucócitos deve ser executado

● As células epiteliais: geralmente presentes em pequeno número: Eritrócitos não devem estar presentes

● Detritos: partículas menores do que a cabeça de esperma, podem ser abundantes

● Bactérias e protozoários: presença indica infecção

Determinação da Concentração de Espermatozoides

● Contagem de esperma = número total de espermatozóides no ejaculado● Concentração espermática = número de espermatozóides por ml

(não "densidade", a qual é uma expressão de massa / unidade de volume) ● Método mais preciso é a diluição volumétrica em hemocitômetro

● Deve-se usar uma pipeta de deslocamento positivo ● Fazemos um 1 + 19 de diluição com uma solução fixadora (permite que as

avaliações sejam lote - normalmente contados dentro de dois dias)● Fixar a lamínula hemocitômetro sobre as câmaras ● ~ 10 ul de ambas as câmaras ● Deixar em câmara úmida durante 10-15 minutos ● Conte com um objetiva × 20 microscopia de de contraste de fase● O número de quadrados avaliados depende do número de

espermatozóides contados no primeiro quadrado grande:

– Se <10 contadas, toda a rede é avaliada – Se 10-40 contados 10 quadrados são avaliados – Se> 40 contados, 5 quadrados são avaliados

First large square counted

Cálculo da Concentração● Se as contagens das duas câmaras não estão dentro de 5% de

sua média (ou seja, a diferença> 1/20 de sua soma): descarte, homogenizar novamente a amostra, e contar novamente

● Se os dois pontos estão em concordância, então a soma das duas contagens é dividido pelo fator de correção:

● Se 2 × 25 quadrados contados, divida a soma por 10 ● Se 2 × 10 quadrados contados, dividir a soma por 4 ● Se 2 × 5 quadrados contados, divida a soma por 2 ● Isto dá a concentração de espermatozóides em milhões por

ml ● A contagem de esperma = concentração × volume total

Fontes de Erro para Contagem● Representante alíquota de ejaculação?

- Homogênea sêmen (mista)?- Alíquota de amostra precisos (viscosidade)?- Duplicar alíquota?

● Diluição precisa:

- volumes de alíquota de amostra e diluente?- Armazenamento (hermético) /ligação do esperma para frasco?- AmostragemSecundária de : - mistura de alíquota diluída?- Duplicar as alíquotas?

● Preparação de contar câmaras:

- qualidade da câmara boa / fabricação?- Câmara carregada corretamente e / ou tampa de vidro colocada corretamente?- Número mínimo adequado de células?- Repetição de contagens duplicadas?

● Cálculos corretos?- Precisão dos resultados?-Incerteza de medição conhecido?

Interpretação● Valores de referência para: ● Concentração de espermatozóides é> 20 × 106 espermatozóides / ml● Contagem de esperma é> 40 × 106 espermatozóides por ejaculado● A concentração espermática persistentemente baixo é associado

com diminuição da fertilidade ● Se um homem tem uma concentração de esperma <5 × 106

espermatozóides / ml, a OMS recomenda a avaliação de anormalidades numéricas e estruturais dos cromossomos sexuais

● Azoospermia pode indicar uma falha de espermatogênese ou bloqueio (s) no trato

Análise da Morfologia do Espermatozóide

● Morfologia é ainda mais importante do que a motilidade e concentração

● Devido ao pequeno tamanho da cabeça de esperma humano, deve usar um esfregaço seco ao ar, que foi corado

● O melhor método é o Papanicolaou ● As amostras preparadas são avaliadas utilizando uma objetiva de

imersão em óleo 100 × sob a ótica de campo brilhantes ● A OMS recomenda que 200 espermatozóides sejam contados por

amostra (2 × 200 é melhor) ● Campos para a contagem deve ser selecionado de forma aleatória ● Ao contar, lembre-se sobre a distribuição normal

Análise da Morfologia● Até mesmo as "boas" amostras terão <20% formas normais ● Mas nós sabemos que os espermatozóides a partir dessas

amostras podem fertilizar ovos - assim a morfologia serve de alguma ajuda?

● Sim, é, mas há algumas coisas para pensar: – O resultado indica uma probabilidade, não uma absoluta – Você tem que contar 2000 esperma de discriminar de forma

confiável 3% e 5% ("critérios rigorosos" de corte de 4%) – A gama dinâmica de 4 - 15% não é muito grande, e significa

que é difícil fazer uma avaliação significativa – Então, nós usamos um "índice" extra para a avaliação da

morfologia

Índice de Teratozoospermia ● O Índice de Teratozoospermia é uma expressão do número médio de

anormalidades por esperma anormal ● Cada célula do esperma é avaliada por uma anormalidade na cabeça,

o pescoço / peça intermediária, ou na cauda, e para uma gotícula citoplasmática

● Se ele não tem qualquer destas anormalidades, é "normal" ● Se ele tem uma anormalidade, é "anormal", e marcar cada

anormalidade. ● Então, se uma célula tem uma cabeça anormal e cauda, é contado

como uma célula, e duas anormalidades ● Então, ( total anormalidades) / (total de espermatozóides ) = TZI ● TZI> 1,80 foi associado com o esperma pobre capacidade de

fertilização in vivo e in vitro

Variations of normal head shape

Small / large head Tapering heads

Pyriform heads Vacuolatedhead

Asymmetricinsertion

Distendedmidpiece

Thinmidpiece

Cytoplasmicdroplet

Coiledtail

Shorttail

Hairpintail

Benttail

Terminal droplet

Duplicatetail

Conjoinedform

Non-insertedtail

Amorphous forms

Constricted Reducedacrosome

Densestaining

Análise da Motilidade● Esta é a primeira avaliação feita sobre a preparação úmida

● Se> 10-15% dos espermatozóides são aglutinadas, apenas avaliar o esperma de natação livre (e note que este no formulário de relatório)

● Uma avaliação de repetição deve ser feita em uma preparação segunda molhado

● Não estimar, contar (> 4 campos e 200 espermatozóides por prep) Use um objetivo × 40, e óptica de contraste de fase

● Faça uma seleção aleatória dos campos que são avaliados

● Avaliar os campos que são longe da borda lamela

● Contar apenas esperma aqueles que estavam em campo em um momento no tempo (você tem que ser rápido!)

● Deve haver um acordo em 10% entre as duplicatas

● % Motilidade = a proporção de espermatozóides com movimento de cauda

● Avaliação progressão = grau de progressão mostrado pela maioria do esperma:

● este pode ser de 0 (todas imóveis) a 4 (todos com progressão rápida), ou a partir de uma (progressão rápida) a d (todos imóveis)

● Motilidade contagem diferencial = proporção de espermatozóides em cada uma das quatro classes de motilidade (rápido progressiva; lenta e progressiva; não progressiva; imóveis)

●Classificação de motilidade diferencial é baseado na distância nadada ao longo do tempo:

● Progressiva rápida:> 25 um / s

● Lento e progressivo: 5 - 25 um / s Não progressiva: <5 um / s

● Imóvel: nenhum movimento flagelar

● A cabeça do espermatozóide é de cerca de 5 um de comprimento, para que o esperma rápido ter um ganho líquido de 5 comprimentos de cabeça / segundo

●Alternativamente, podemos usar um monitor de vídeo com uma grade para as avaliações de motilidade diferenciais

● Cada quadrado é o equivalente a 25 × 25 ^ m (um micro-estágio medidor é usado para configurar isso)

●Os valores de referência da OMS para motilidade são:

● 50% ou mais com motilidade progressiva, ou25% ou mais com motilidade progressiva rápida

● Assumindo que todos os fatores de coleta e de laboratório têm sido controladas, resultado motilidade deficiente pode ter implicações negativas para a fertilidade.

● No entanto, isto deve ser confirmado por uma análise do sêmen de repetição, e os resultados devem ser interpretados com o resto dos resultados da análise de sêmen

Interpretação da Motilidade

Fontes de Erro dos Ensaios de Motilidade● As definições foram implementados corretamente? ● Os funcionários são treinados para classificar progressão? ● Controle de qualidade interno? ● Como a velocidade / progressão é avaliada?● Efeito da temperatura: motilidade

● % = mínimo% Progressiva = ligeiro% = Rápida muito grande

● Alíquotas de amostra representativa? ● Número adequado de espermatozóides contados? ● Repetibilidade da contagem duplicatas? ● Cálculos efetuados corretamente? ● Precisão dos resultados?Incerteza dos resultados?

Ensaios de Vitalidade● Utilizado em amostras com motilidade total baixa (<50%) ● Distingue entre as amostras com o esperma vivo, mas imóveis

(por exemplo, síndrome de Kartagener), e aqueles com lotes de espermatozóides mortos (pode resultar de: a senescência esperma; exposição a detergentes ou lubrificantes, ou anticorpos espermotóxicos)

● Também permite verificar a precisão das avaliações de motilidade: % vivos deve ser ligeiramente maior que% móveis

● Geralmente realizada utilizando um corante vital, tal como eosina Y, com um contracorante (nigrosina) - embora poderia utilizar uma sonda de DNA fluorescente, tal como H33258.

Análises Pós-VasectomiaPara determinar a concentração de esperma quando nenhum / poucos esperavam:centrifugar o máximo da amostra quanto possível (1000 g durante 15 min) num tubo de centrífuga cónico descartável - note o volume exacto usadoRemover a maior parte do sobrenadante - volume nota removidoFaça pelo menos cinco preps molhadas (10 ul de sedimento ressuspenso em uma lamela 22 × 22mm)Pesquisar pelo menos 5 preps molhadasSe qualquer coisa que se parece com um espermatozóide é visto - o relatório "não é clara"A decisão final é da responsabilidade do patologista