FRAN˙OISE HÉL¨NE VAN DE SANDE LEITEguaiaca.ufpel.edu.br/bitstream/123456789/2279/1/Dissert... ·...

FRANÇOISE HÉLÈNE VAN DE SANDE LEITE

DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE BIOFILME PARA ESTUDOS DE DESMINERALIZAÇÃO DO ESMALTE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento: Dentística).

Orientador: .Prof. Dr. Maximiliano Sérgio Cenci Co-Orientador: Prof. Dr. Rafael Guerra Lund

Pelotas, 2009

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Banca Examinadora: Prof. Dr. Maximiliano Sérgio Cenci Profª. Drª. Marisa Maltz Turkienicz Prof. Dr. Rafael Ratto de Moraes Profª. Drª. Elenara Ferreira de Oliveira (suplente)

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Dedicatória

A minha mãe

Ao meu irmão

Ao meu padrasto (in memoriam)

Minhas molas propulsoras,

Inspiração constante na minha existência,

Dedico este trabalho,

O meu esforço,

O meu melhor,

O meu amor

.

4

Agradecimentos

Ao meu Orientador Prof. Dr. Maximiliano S Cenci, por sua natureza calma e

de efeito calmante, por seu empenho e apoio constantes, por sua naturalidade em

transmitir, instigar e produzir conhecimento. Agradeço por ter tido no orientador um

amigo, de espírito irreverente, questionador e gentil. E no amigo, um orientador, que

literalmente atravessa um oceano se assim preciso for! É Max, não são 100

palavras, mas SEM palavras para agradecer!!! Obrigada!

À colega de mestrado Marina S Azevedo. Minha companheira na incubação

dos �babyfilmes�! Com toda certeza eles tiveram duas mamães, uma biológica e uma

adotiva! Sua contribuição a este trabalho foi inesgotável, inestimável, indispensável!

Acima de tudo, agradeço a convivência com você, o seu bom humor, o seu

temperamento, a sua constante disposição e a sua amizade. Muito obrigada!

À Profª Drª Elenara F de Oliveira, por seu valioso incentivo e orientação em

meus primeiros passos de volta à vida acadêmica. Aquele período foi essencial à

minha formação. Obrigada por todos os ensinamentos, discussões, oportunidades, e

por despertar em mim um �carinho� especial pela Cariologia. As clínicas de

extensão, o estágio e as reuniões em torno de um mate, são sempre lembrados com

imenso carinho. Obrigada pelo apoio, pela confiança e pela amizade!

Ao Prof. Dr. Flávio F Demarco, Coordenador do Programa de Pós-Graduação

em Odontologia, por extrair o melhor das pessoas, por seu empenho, por sua

sagacidade e por sua contribuição marcante a todos os alunos da pós-graduação.

Flávio, agradeço sobretudo o seu exemplo, um verdadeiro modelo de liderança

construtiva.

5

À Professora Drª Tatiana Pereira-Cenci, por todas as contribuições diretas e

indiretas ao meu trabalho, e à minha formação durante o mestrado. Pelo exemplo de

pessoa, pesquisadora e professora � sem dúvida a melhor primeira-dama que uma

orientada poderia querer.

Ao meu Co-orientador Prof. Dr. Rafael G Lund, por sua dedicação ao

Laboratório de Microbiologia, por sua disposição a me ajudar, por todos os

incentivos e por suas palavras amigas.

Aos Professores Flávio e Rogério, pelas colaborações realizadas na

qualificação deste trabalho.

À secretária do Programa de Pós-Graduação em Odontologia (PPGO),

Josiane Silva, por sua competência, por sua solicitude, por seu carinho e atenção. O

PPGO não seria o mesmo sem você!

Aos técnicos dos laboratórios, Tatiana, D. Leda, Graça, Sr. Airton, Sr

Gilberto, Marcelo, que me auxiliaram tantas vezes, nas mais diversas tarefas. A

presença e o trabalho de vocês foram fundamentais. Muito obrigada!

Aos queridos Professores Sousa e Neno, com os quais eu tive a honra de

aprender e o prazer de trabalhar. Obrigada por TUDO!

A todos os alunos de graduação que me ajudaram na execução deste

trabalho, especialmente o Vinícius. Agradeço de todo o coração!

Aos meus colegas e amigos de pós-graduação Aline, Bianca, Caroline E, Carolina P, Eliana, Fabiana, Fabrício, Francine, Genara, Giana, Glória, Gregori, Laura, Luciano, Marcos, Marcus, Marília B, Marília G, Raquel, Renata B, Renata F, Rodrigo, Sandrina, Sílvia, Sônia, Thiago, Tino (César). Obrigada por todas as

experiências compartilhadas, foi uma honra conviver com vocês.

Aos professores por sua contribuição com minha formação profissional e

pessoal, Profª. Adriana E, Profª. Adriana S, Prof. Alexandre, Profª. Ana, Profª.

6

Dione, Profª. Elaine, Prof. Evandro, Prof. Josué, Profª. Márcia, Prof. Marcos P,

Prof. Marcos T, Prof. Mário, Profª. Noéli, Prof. Rudimar, Profª. Sandra, ... Dentre

tantos outros.

Ao Grupo de Estudos de Cariologia, Microbiologia e o Estudo do Flúor,

por todas as discussões, foi um belíssimo aprendizado.

Aos alunos de graduação que tanto me ensinaram sobre ensinar.

Aos meus amigos pela belíssima amizade, o carinho de vocês foi sentido

mesmo quando não pude estar presente.

Aos meus familiares, pelo apoio e incentivo, mesmo à distância.

Ao Centro de Desenvolvimento e Controle de Biomateriais (CDC-Bio) na

pessoa do Prof. Dr. Evandro Piva.

Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia na pessoa do Prof. Dr.

Flávio F Demarco.

À Faculdade de Odontologia na pessoa da Profª. Drª. Márcia B Pinto.

À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior

(CAPES) pelo financiamento das minhas atividades de pós-graduação.

À Universidade Federal de Pelotas por meio do seu Magnífico Reitor, Prof.

Dr. César Borges.

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Notas preliminares

A presente dissertação foi redigida segundo o Manual de Normas para Dissertações,

Teses e Trabalhos Científicos da Universidade Federal de Pelotas de 2006,

adotando o Nível de Descrição 4 � estruturas em Artigos, que consta no Apêndice D

do referido manual. Disponível no endereço eletrônico:

(http://www.ufpel.tche.br/prg/sisbi/documentos/Manual_normas_UFPel_2006.pdf).

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Resumo LEITE, Françoise Hélène van de Sande. Desenvolvimento de um modelo de biofilme para estudos de desmineralização do esmalte. 2009. 90f. Dissertação (Mestrado) � Programa de Pós Graduação em Odontologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Os objetivos deste estudo foram avaliar a desmineralização do esmalte em resposta a condições cariogênicas induzidas por diversos regimes de exposição a sacarose em um modelo de biofilme de microcosmos, e verificar se o modelo testado apresentaria efeito dose-resposta ao tratamento com clorexidina. Os biofilmes de microcosmo foram originados de saliva e crescidos sobre discos de esmalte bovino em placas de micropoços. Foi utilizado um meio definido enriquecido com mucina (DMM), suplementado com concentrações de sacarose que variaram de 0,075% a 1%, sob regimes de exposição contínua � modelo estático, ou intermitente � modelo semi-dinâmico (40min a 6h de exposição). As placas foram incubadas em condição de anaerobiose por até 10 dias sob temperatura controlada de 37°C. As trocas dos meios foram realizadas diariamente. A acidogenicidade dos biofilmes foi obtida através de leituras de pH dos sobrenadantes no meio; as alterações/ perda de dureza na superfície do esmalte (%PDS) foram calculadas através de leituras de dureza superfícial do esmalte antes e após os tratamentos. Os resultados indicaram que a acidogenicidade decorrente dos diferentes regimes de exposição a sacarose afetaram a dureza superficial do esmalte. A dureza do esmalte não foi alterada sob exposição a baixa concentração de sacarose (estático-0,075%). O %PDS do esmalte sob exposições de 0,15% de sacarose no meio foram tempo-dependentes; a perda mineral foi significativa no regime estático, enquanto que no regime semi-dinâmico (6h) não houve alteração de dureza significativa. Em concentrações de 0,5% de sacarose este efeito tempo-dependente para exposição também foi observado na alteração de dureza do esmalte. Exposições de 40min a 3h de sacarose no meio (até 10 dias) não induziram um %PDS significativo em esmalte. Contudo, com o aumento do tempo de exposição para 6h uma perda mineral significativa foi observada em esmalte. Ainda, com 0,5% em regime estático, a perda mineral foi severa, comprometendo a integridade da superfície do esmalte, independentemente dos períodos de exposição avaliados (4, 7 e 10 dias). A erosão da superfície nesta condição excluiu a possibilidade de avaliar o %PDS, sugerindo que a exposição a um pH baixo (4.3), mantido de forma constante, promoveria lesões de erosão no lugar de lesões subsuperficiais de cárie. As exposições de 0,5% e 1% de sacarose no regime semi-dinâmico (6h) induziram um %PDS significativo em esmalte. A avaliação de dose-resposta do modelo foi realizada em um regime - semi-dinâmico 1% de sacarose. Após 24h de crescimento dos biofilmes, foi realizado o tratamento com solução de clorexidina em concentrações que variaram de 0,012 a 0,12% ou com um controle (solução salina estéril) durante 1 min. O

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tratamento foi aplicado antes do desafio com sacarose durante 3 dias. Verificou-se que a acidogenicidade dos biofilmes e as alterações de dureza do esmalte foram dose-dependentes aos tratamentos com clorexidina. Como conclusão, dentro das limitações de estudos laboratoriais, o modelo de biofilme foi capaz de responder aos diferentes níveis de desafios cariogênicos e demonstrar um efeito de dose-resposta a clorexidina, sendo apropriado para utilização como um modelo pré-clínico para testar o potencial anticariogênico de tratamentos e para estudos desmineralização. Palavras-chave: Placa Dental. Biofilmes. Esmalte Dentário. Desmineralização. In Vitro.

10

Abstract

LEITE, Françoise Hélène van de Sande. Development of an in vitro biofilm model for enamel demineralization studies. 2009. 90f. Dissertação (Mestrado) � Programa de Pós Graduação em Odontologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. The aims of this study were to evaluate enamel demineralization response to cariogenic conditions induced by several sucrose regimens in microcosm biofilms, and to test the model with a dose-response evaluation to chlorhexidine. Microcosm biofilms derived from plaque enriched saliva were grown on bovine enamel discs in multi-well plates fed with defined medium enriched with mucin (DMM), which was supplemented with sucrose concentrations that ranged from 0.075% to 1%. Sucrose exposure occurred all day in batch culture or in a semi-continuous fed (40 min to 6 h). Plates were incubated anaerobically for up to 10 days at 37°C. DMM was replaced daily. Data from acidogenicity of biofilms were collected as pH readings from medium supernatants and the percentual surface hardness change (%SHC) was obtained by enamel surface hardness readings before and after treatments. The results from sucrose regimens indicated that acidogenicity of biofilms affected enamel surface hardness. Under low sucrose concentration exposures (batch-0.075%) enamel hardness was not affected. Exposures to 0.15% sucrose were time-dependent, as enamel surface experienced mineral loss in batch but not in semi-continuous (6 h) fed. With 0.5% sucrose concentration a time-dependent exposure effect was also observed in enamel hardness change. Exposures from 40 min to 3 h sucrose-fed (up to 10 days) did not caused significant %SHC in enamel, but increasing the exposure time to 6 h induced significant mineral loss. Under 0.5%-batch severe damage to enamel surface was noted, irrespective of the time-points evaluated (4, 7 and 10 days). The resulting eroded surfaces excluded the possibility of SH evaluation, and suggested that the constant low pH (4.3) would promote erosion lesions instead of subsurface carious lesions. Exposures to 0.5% and 1% in 6 h sucrose-fed induced significant %SHC in enamel. The dose-response evaluation was performed in one regimen - semi-continuous 1% sucrose. After 24h of grown, biofilms were treated with chlorhexidine in concentrations that ranged from 0.012 to 0.12% or a control (sterile saline solution) during 1 min. Treatment was applied before sucrose-fed for 3 days. Biofilm acidogenicity and the changes in enamel hardness were dose-responsive to chlorhexidine treatments. In conclusion, within the limitations of laboratorial studies the biofilm model assessed promoted dose-response effect to chlorhexidine and to different sucrose feeding protocols, being suitable as a pre-clinical model for testing the anticariogenic potential of treatments and for demineralization studies.

Keywords: Dental Plaque. Biofilms. Dental Enamel. Demineralization. In Vitro.

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Lista de Figuras

Projeto

Figura 1 � Técnica de confecção dos discos de esmalte

....................... 30

Figura 2 � Ensaio in vitro de biofilme pela técnica de microcosmos ...... 32

Figura 3 � Técnica de confecção de cavidades nos discos de esmalte 37

Relatório de campo

Figura 1 � Representação esquemática dos estudos Piloto 1, 2 e

Experimento I ......................................................................................... 52

Figura 2 � Ensaio in vitro de biofilme de microcosmos pela técnica de

micro-placas ........................................................................................... 54

Artigo

Figure 1 � Experiment II � pH ................................................................ 67

Figure 2 � Experiment III � pH ��.. 68

Figure 3 � Experiment I � %SHC ........................................................... 69

Figure 4 � Experiment II � %SHC .......................................................... 70

Figure 5 � Experiment III - %SHC .......................................................... 71

12

Lista de Tabelas Artigo

Table 1 Experiment I. DMM supernatants pH readings are presented

for sucrose regimens and control up to 4, 7 and 10 days

....................... 66

Table 2 Descriptive statistics for microbial recovery from growth under

different sucrose regimens

��.................��...........�.. 72

Table 3 Descriptive statistics for microbial recovery from growth after

chlorhexidine treatments

��................................................... 73

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Lista de abreviaturas e siglas

% Percentual °C Graus Celsius [ ] Concentração BHI Brain Heart Infusion

CDC-Bio Centro de desenvolvimento e controle de biomateriais

CHX Chlorhexidine CLX Clorexidina

DMM Defined medium with mucin � meio definido enriquecido com mucina

Eh Potencial redox et al. e outros FO Faculdade de Odontologia G Grama H Hora µg/mL Microgramas por mililitro µm Micrometro mg/mL Miligramas por mililitro Min Minuto mL Mililitros Mm Milímetro mol L-1 Mol por litro ou molar DS Dureza de superfície N Número de espécimes PDS Perda de dureza de superfície pH Potencial de hidrogênio iônico RPM Rotação por minuto

RTF Reduced transport fluid - meio de transporte reduzido

S Segundo SH Surface Hardness SHC Surface Hardness Change UFPel Universidade Federal de Pelotas UFC Unidades formadoras de colônias X Vezes

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Sumário

Resumo .................................................................................................. 8

Abstract ..................................................................................................

10

1 Introdução Geral

................................................................................. 16

2 Projeto ................................................................................................. 20

3 Relatório de campo ............................................................................

3.1 Aspectos éticos ............................................................................... 3.2 Condições gerais ............................................................................ 3.3 Experimentos

................................................................................... 3.3.1 Piloto 1 .......................................................................................... 3.3.2 Piloto 2 .......................................................................................... 3.3.3 Experimento 1

............................................................................... 3.5 Rotinas laboratoriais .......................................................................

50 50 50

50 50 51 51

52 52 53

15

3.5.1 Coleta e processamento de saliva

.............................................. 3.5.2 Protocolo de crescimento e obtenção dos biofilmes ...............

3.6 Alterações no projeto original ��. 55

3.6.1 Dificuldades encontradas ��.. 55

3.6.2 Revisão da literatura .................................................................... 55

4 Artigo ................................................................................................... 56

5 Conclusões

.........................................................................................

81

Referências ............................................................................................

82

Apêndices .............................................................................................. 86

Anexo ..................................................................................................... 89

16

1 INTRODUÇÃO GERAL

Componentes dotados de propriedades antibacterianas/ anticariogênicas

têm sido amplamente desenvolvidos e investigados acerca de sua efetividade em

exercer uma proteção aos tecidos dentais (CENCI et al., 2008; IMAZATO et al.,

2003; SARRETT, 2005; LI et al., 2009; KIELBASSA et al., 2003).

Para avaliação pré-clinica de componentes, soluções ou materiais

biologicamente ativos é necessário que sejam utilizados modelos de estudo com

habilidade para caracterizar o seu potencial antimicrobiano/ anticariogênico,

avaliando a capacidade de inibir a desmineralização, de ativar a remineralização, e a

sua ação antimicrobiana. A adequação de um modelo de estudo é baseada na sua

capacidade de reproduzir as características do sistema que pretende investigar

(WIMPENNY, 1997). Logo, deve-se tentar reproduzir os desafios cariogênicos ao

qual o tecido dentário será exposto em condições clínicas, mimetizando as

interações complexas destes com os biofilmes dentais (WHITE, 1995).

Os biofilmes dentais podem ser definidos como comunidades microbianas

intimamente associadas e protegidas por uma matriz polimérica extracelular de

origem salivar e bacteriana (BOWDEN; LI, 1997; MARSH, 2005). A seleção e

sucessão microbianas (teoria ecológica da placa) ocorrem conforme a

disponibilidade de nutrientes e substrato, e a tolerância ao meio � o pH e a

concentração de oxigênio (BRADSHAW; MCKEE; MARSH, 1989; BOWDEN; LI,

1997; RUBY; BARBEAU, 2002). O biofilme se desenvolve seletivamente como uma

unidade estruturada para o aproveitamento energético, onde nutrientes, enzimas,

oxigênio e produtos metabólicos permeiam os espaços entre os agregados

microbianos (DAVEY; O'TOOLE G, 2000; DONLAN; COSTERTON, 2002).

A partir do exposto, a seleção de um modelo de estudo apropriado deverá

estar inserida neste contexto.

Ensaios in vitro simplificados, como desafios físico-químicos, culturas

planctônicas e culturas em monocamadas, podem ser adequados para avaliações

preliminares (SISSONS, 1997). Contudo, frente à complexidade mencionada,

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colocam-se aquém, e podem não predizer os resultados encontrados em avaliações

subseqüentes (TEN CATE, 2006). Isto ocorre, em parte, porque a organização

microbiana em biofilmes favorece o desenvolvimento e a manutenção dos

ecossistemas (DAVEY; O'TOOLE G, 2000). Possivelmente, a penetração/ação de

agentes antimicrobianos é dificultada pela natureza estrutural da matriz

(ANDERSON; O'TOOLE, 2008). Além disso, sua efetividade é diminuída em

situações de inatividade ou baixa atividade metabólicas, comumente observadas em

biofilmes (ANWAR; STRAP; COSTERTON, 1992; ANDERSON; O'TOOLE, 2008).

A utilização de modelos de estudo intra-orais (intra-oral models) (SISSONS,

1997) possibilita a extração de informações relevantes (MARSH, 1995; WIMPENNY,

1997). Não obstante, estes modelos exibem características que os limitam, tais

como o número e a adesão dos participantes, questões relacionadas a variáveis não

controláveis e dificuldade para reprodutibilidade (FEJERSKOV; NYVAD; LARSEN,

1994; TEN CATE, 1994). A aplicação destes modelos é adequada para confirmação

de evidências laboratoriais, que sobretudo, justifiquem o uso em voluntários.

Em virtude das dificuldades inerentes aos modelos de estudo citados, surgiu

a necessidade de desenvolver modelos de biofilme em laboratório que pudessem

suprir os questionamentos e concomitantemente apresentarem-se inseridos em um

ambiente controlado (SISSONS, 1997; MCBAIN, 2009). Os primeiros modelos in

vitro que pretendiam reproduzir as condições da microbiota oral foram delineados de

forma simplificada, onde dentes extraídos eram submetidos a um meio

bacteriológico ou a uma mistura de saliva e pão (TANG et al., 2003). As tentativas

para desenvolver estes modelos de estudo falharam até que alguns princípios

fossem respeitados, como o controle da temperatura e pH, a condição atmosférica, o

meio nutritivo e o controle da contaminação (TANG et al., 2003).

Atualmente vários experimentos têm sido realizados respeitando estas

condições, explorando distintas metodologias e tecnologias (SISSONS, 1997;

MCBAIN, 2009). Os biofilmes podem ser formados em sistemas de cultura onde as

exposições ao meio nutritivo são disponibilizadas de forma contínua ou intermitente,

caracterizando modelos estáticos (batch), semi-dinâmicos (semi-continuous ou fed-

batch) ou dinâmicos (continuous) (MCBAIN, 2009).

Os sistemas dinâmicos para o desenvolvimento de biofilmes em superfícies,

como discos de esmalte e de hidroxiapatita, requerem a utilização de equipamentos

sofisticados. Muitos destes de difícil construção, manuseio e manutenção

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(GUGGENHEIM et al., 2004; MCBAIN, 2009). Para investigações que exijam o

crescimento dos biofilmes durante várias semanas, onde o objeto de estudo é o

próprio biofilme (como sua dinâmica de formação e maturação) estes sistemas

parecem os mais adequados (TANG et al., 2003; TEN CATE, 2006). No entanto, o

desenvolvimento de um modelo para avaliação de propriedades

antimocrobianas/anticariogênicas deve possibilitar a condução de vários estudos de

curta duração. Desta forma, estes sistemas tornam-se inadequados para o propósito

(MCBAIN, 2009; GUGGENHEIM et al., 2004).

Os sistemas estático e semi-dinâmico apresentam metodologias que

viabilizam a construção deste modelo. Os biofilmes podem ser formados em placas

de micro-poços (GUGGENHEIM et al., 2004; FILOCHE; SOMA; SISSONS, 2007)

permitindo seu crescimento de forma individualizada, sobre o substrato que for

conveniente. Várias condições podem testadas nas placas concomitantemente, e

diversos experimentos realizados em um curto período de tempo.

Outra diferença metodológica se refere à origem e a diversidade das

espécies microbiológicas envolvidas. Os biofilmes podem ser formados a partir de

espécies selecionadas ou de microcosmo (MCBAIN, 2009). Os modelos com

espécies previamente estabelecidas, podem ser culturas puras (uma única espécie

de microorganismo) (TOTIAM et al., 2007), ou um consórcio definido (duas ou mais

espécies) (SHU et al., 2000). Enquanto microcosmos são biofilmes com

comunidades microbianas complexas originadas do ecossistema natural, neste

contexto a saliva ou a placa/biofilme dental (CENCI et al., 2009; WIMPENNY, 1997).

A seleção de uma ou mais espécies normalmente pressupõem a

investigação de fatores individuais ou coletivos das espécies envolvidas, onde a

manipulação de uma única variável pode ser monitorada. (WIMPENNY, 1997).

Todavia, quando se deseja maior aproximação ao comportamento natural, com

manutenção da heterogeneidade microbiana durante a formação dos biofilmes, os

experimentos originados de microcosmos são mais fiéis, mantendo a complexidade

do inóculo original (MCBAIN, 2009; FILOCHE et al., 2008).

Consequentemente, a resposta às variáveis impostas, como diferentes

concentrações de princípios antimicrobianos, por exemplo, pode ser mais bem

estabelecida. Isto pode ser demonstrado por avaliações decorrentes de

experimentos realizados in situ, os quais apontaram a importância na relação entre o

potencial cariogênico do biofilme e a produção de polissacarídeos, em detrimento à

19

importância quantitativa de estreptococos mutans no biofilme (TENUTA et al., 2006).

O potencial cariogênico de outras bactérias presentes no meio bucal pode ser

subestimado quando são selecionadas algumas espécies para a formação de

biofilmes (KLEINBERG, 2002).

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo de biofilme de

microcosmo que possibilitasse a avaliação de propriedades anticariogênicas de

soluções antissépticas, com ênfase na capacidade de detectar diferenças em perda

mineral proporcionada por diferentes tratamentos. Cabe salientar que até o presente

momento nenhum modelo de biofilme de microcosmos em placas de cultura foi

validado para estudos de des e re-mineralização. Para construção do modelo,

modificações foram realizadas em um modelo previamente desenvolvido (FILOCHE;

SOMA; SISSONS, 2007), a fim de adequá-lo para estudos de perda mineral.

Regimes estáticos e semi-dinâmicos para suplementação de sacarose, em diversas

concentrações, foram investigados com intuito de observar a cariogenicidade dos

biofilmes e o efeito decorrente em esmalte bovino. Após, uma concentração e um

regime de suplementação de sacarose foi estabelecido para experimentação do

modelo em um estudo de dose-resposta à clorexidina.

20

2 PROJETO

1 INTRODUÇÃO

A cárie persiste como um problema de saúde pública na maioria dos países

industrializados (PETERSEN et al., 2005). Sua distribuição e severidade se

apresentam de forma polarizada (PETERSEN et al., 2005), relacionada às

desigualdades econômicas e sociais existentes (NERI; SOARES, 2002). Isto pode

ser evidenciado no Brasil, onde os indivíduos menos atingidos pelos programas de

saúde e atenção odontológica (BARROS; BERTOLDI, 2002; NARVAI et al., 2006),

apresentam a maior concentração de lesões não tratadas (NARVAI et al., 2006).

Neste contexto, todos os métodos preventivos e terapêuticos são importantes para

tentar atingir a população com maior equidade (CURY et al., 2004).

Uma parte do tratamento da cárie frequentemente inclui a utilização de

materiais odontológicos. Estes devem auxiliar no controle local da doença, agindo

como coadjuvantes à adequação do meio bucal. Os materiais disponíveis

atualmente para esta finalidade (WIEGAND; BUCHALLA; ATTIN, 2007), como os

cimentos de ionômero de vidro convencionais, apresentam reduzidas propriedades

mecânicas ao estresse oclusal. Outros, como as resinas modificadas e os cimentos

ionoméricos modificados, apresentam custo elevado e potencial anticariogênico

reduzido. Além disso, o mecanismo de ação destes materiais é baseado na

liberação de fluoretos (WIEGAND; BUCHALLA; ATTIN, 2007), havendo uma

carência de materiais com mecanismos adicionais de potencial inibidor de cárie ou

do acúmulo de biofilme (SARRETT, 2005).

Materiais dotados de propriedades anticariogênicas e antimicrobianas

poderiam ser fortes auxiliares no tratamento e prevenção da cárie dentária, bem

como das suas lesões. Frequentemente, as falhas restauradoras são atribuídas ao

diagnóstico de lesões cárie adjacentes às restaurações (CARs) (FONTANA;

GONZALEZ-CABEZAS, 2000; BRUNTHALER et al., 2003; MJOR, 2005),

comumente referidas como cárie secundária. Estas lesões são etiológica e

21

histologicamente idênticas às lesões primárias (THOMAS et al., 2007), e se discute

se sua formação estaria relacionada à presença (e a dimensão) de fendas � gaps �

na interface dente/ material restaurador (MJOR; MOORHEAD; DAHL, 2000; TOTIAM

et al., 2007). Neste contexto, o desenvolvimento de materiais restauradores de baixo

custo, e propriedades anticariogênicas expressivas, poderia contribuir para terapias

preventivas e curativas.

Para viabilizar o desenvolvimento e o emprego de novos materiais, é

necessário que sejam utilizados modelos de estudo com habilidade para caracterizar

o seu potencial anticariogênico, avaliando a capacidade de inibir a desmineralização,

de ativar a remineralização, e a sua ação antimicrobiana. A adequação de um

modelo de estudo para esta finalidade deve levar em consideração que as

características do meio oral interferem no comportamento dos materiais e terapias

odontológicas (FUCIO et al., 2008). Soma-se a isso a necessidade de reproduzir os

desafios cariogênicos ao qual o conjunto tecido dentário/ material será exposto,

mimetizando as interações complexas destes com os biofilmes dentais, as quais

ocorrem na clinicamente cavidade bucal (WHITE, 1995).

Os biofilmes dentais podem ser definidos como comunidades microbianas

intimamente associadas entre si e protegidas por uma matriz polimérica extracelular

de origem salivar e bacteriana (BOWDEN; LI, 1997; OVERMAN, 2000; MARSH,

2005; THOMAS; NAKAISHI, 2006). A seleção e sucessão microbianas (teoria

ecológica da placa) ocorrem conforme a disponibilidade de nutrientes e substrato, e

a tolerância ao meio � o pH e a concentração de oxigênio (BRADSHAW; MCKEE;

MARSH, 1989; MARSH; BRADSHAW, 1997; RUBY; BARBEAU, 2002). O biofilme

se desenvolve seletivamente como uma unidade estruturada para o aproveitamento

energético, onde nutrientes, enzimas, oxigênio e produtos metabólicos permeiam os

espaços (poros) entre os agregados microbianos (DAVEY; O'TOOLE G, 2000;

OVERMAN, 2000).

A partir do exposto, a seleção de um modelo de estudo apropriado, o qual

tenha a capacidade de mimetizar os eventos mediados pelo biofilme dental que

ocorrem em condições clínicas, deverá estar inserida neste contexto. Ensaios in vitro

simplificados, como desafios físico-químicos, culturas planctônicas e culturas em

monocamadas, podem ser adequados para avaliações preliminares (SISSONS,

1997). Contudo, frente à complexidade mencionada, colocam-se aquém, e podem

não predizer os resultados que serão encontrados em avaliações subseqüentes

22

(TEN CATE, 2006). Isto ocorre, em parte, porque a organização microbiana em

biofilmes favorece o desenvolvimento e a manutenção dos ecossistemas (DAVEY;

O'TOOLE G, 2000). Possivelmente, a penetração/ação de agentes antimicrobianos é

dificultada pela natureza estrutural da matriz (ANDERSON; O'TOOLE, 2008). Além

disso, sua efetividade é diminuída em situações de inatividade ou baixa atividade

metabólicas, comumente observadas em biofilmes (ANWAR; STRAP; COSTERTON,

1992; ANDERSON; O'TOOLE, 2008).

A utilização de modelos de estudo em animais e in situ possibilitam a

extração de informações relevantes (MARSH, 1995). No entanto, estes modelos

exibem características que os limitam, tais como diferenças inerentes às espécies

(WEINBERG; BRAL, 1999) e alto custo no caso do primeiro, e no segundo,

dificuldades referentes ao número e adesão dos participantes, questões

relacionadas às variáveis não controláveis e dificuldade para reprodutibilidade

(FEJERSKOV; NYVAD; LARSEN, 1994; TEN CATE, 1994; SISSONS, 1997).

Sobretudo, modelos de estudo em animais têm encontrado uma forte restrição

relativa a questões éticas. Assim, estes modelos se aplicariam após a obtenção de

evidências que justifiquem o uso de modelos em animais ou em voluntários.

Em virtude das dificuldades inerentes aos modelos citados, surgiu a

necessidade de desenvolver modelos in vitro que pudessem suprir os

questionamentos e concomitantemente apresentarem-se inseridos em um ambiente

controlado (SISSONS, 1997), o que é essencial para o avanço em pesquisa que

antecede a experimentação clínica (TANG et al., 2003). Atualmente, vários

experimentos têm sido realizados respeitando estas condições, e diferindo em

relação à origem e a diversidade das espécies microbiológicas envolvidas. As

metodologias desenvolvidas obtêm a formação de biofilmes a partir de uma única

espécie de microorganismo (ALTMAN et al., 2006), mais de uma espécie (consórcio)

(SHU et al., 2000) ou de microcosmos (a partir de inóculo de saliva, por exemplo)

(ANDERSON et al., 2002).

Cada modelo tem uma finalidade que o justifica. No entanto, quando se

deseja maior fidelidade ao comportamento natural, onde há interação e sucessão

microbiana durante a formação do biofilme, os modelos de biofilmes originados de

microcosmos (biofilmes complexos) são mais fiéis para reproduzir as relações entre

os ecossistemas in vitro (SISSONS, 1997; WIMPENNY, 1997; PRATTEN; SMITH;

WILSON, 1998; DONLAN; COSTERTON, 2002; TEN CATE, 2006).

23

Consequentemente, a resposta às variáveis impostas, como diferentes

concentrações de princípios antimicrobianos, por exemplo, pode ser mais bem

estabelecida neste tipo de modelo. Isto pode ser demonstrado por avaliações

decorrentes de experimentos realizados in situ, os quais apontaram a importância na

relação entre o potencial cariogênico do biofilme e a produção de polissacarídeos,

em detrimento à importância quantitativa de estreptococos mutans no biofilme

(TENUTA et al., 2006). O potencial cariogênico de outras bactérias presentes no

meio bucal pode ser subestimado quando são selecionadas algumas espécies para

a formação de biofilmes (KLEINBERG, 2002).

Dentre uma gama de aplicações, modelos de biofilme in vitro permitem que

as propriedades dos materiais restauradores possam ser analisadas sob diferentes

condições, as quais alteram a composição do biofilme, e podem modificar os efeitos

do material no local. Pontos importantes podem ser explorados, compreendendo: a

facilidade de estabelecer controles e limitar variáveis, a verificação de efeitos

decorrentes da patogenicidade do biofilme (níveis de desafio cariogênico, por

exemplo), permitir a replicação das amostras, reprodutibilidade, entre outras

vantagens de metodologias in vitro. Notadamente, a facilidade e rapidez com a qual

ensaios pré-clinicos podem ser realizados com esses métodos são relevantes para o

estudo e desenvolvimento de materiais restauradores.

24

2 PROPOSIÇÃO

2.1 OBJETIVO GERAL

Esta dissertação de mestrado tem como objetivo geral desenvolver um

modelo de biofilme in vitro para avaliar propriedades anticariogênicas de materiais

restauradores.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1)Revisar a literatura relevante reportando as metodologias utilizadas para o

desenvolvimento de modelos de biofilmes complexos.

2)Realizar o desenvolvimento de um modelo de biofilme in vitro.para testar

materiais restauradores.

3)Investigar o potencial antimicrobiano/ anticariogênico de um material a

base de mineral trióxido agregado (MTA) desenvolvido para uso como restaurador

direto, utilizando o modelo de biofilme.

2.3 HIPÓTESE

O modelo de biofilme desenvolvido será capaz de reproduzir um desafio

cariogênico, produzindo lesões de subsuperfície em esmalte com padrão de dose-

resposta a sacarose, e terá habilidade para avaliar o potencial anticariogênico de

soluções antisépticas e materiais restauradores.

25

3 METODOLOGIAS UTILIZADAS PARA O DESENVOLVIMENTO DE BIOFILMES

COMPLEXOS - REVISÃO DA LITERATURA

3.1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

O desenvolvimento de biofilmes complexos in vitro possibilita a investigação

das mudanças que ocorrem na sua dinâmica de formação e composição frente a

exposições a diferentes tratamentos em um ambiente controlado. Desta forma, os

eventos locais que caracterizam fatores com potencial cariogênico ou

anticariogênico podem ser analisados e compreendidos de forma mais completa,

muito além da observação isolada de eventos teciduais e bacteriológicos. O

desenvolvimento destes biofilmes pode ser alcançado a partir de metodologias e

tecnologias distintas. Os biofilmes podem ser formados em sistemas de cultura onde

as exposições são impostas de forma contínua ou intermitente, caracterizando

modelos estáticos ou dinâmicos. Outra variação diz respeito ao tempo que os

biofilmes serão crescidos, havendo ou não limitação espacial (volume) deste

crescimento. A possibilidade de mensurar o pH e o Eh (potencial redox), assim como

outras aferições que podem ser obtidas durante o período, varia nos dispositivos

empregados.

A adequação do modelo estará vinculada aos eventos que se deseja

observar. Dessa forma, uma revisão acerca de métodos e tecnologias que podem

ser empregados para obtenção e estudo de biofilmes complexos é relevante. Além

disso, poderá contribuir na orientação do delineamento experimental e para justificar

os recursos destinados para obtenção de equipamentos nesta linha de pesquisa.

3.2 OBJETIVOS

Revisar comparativamente as metodologias e tecnologias empregadas para

o desenvolvimento de biofilmes complexos. Analisar as possibilidades/ vantagens e

limitações/ dificuldades de cada método utilizado.

26

3.3 MATERIAL E MÉTODO 3.3.1 Delineamento

Esta revisão será do tipo narrativa. Terá como objetivo produzir um texto

para a fundamentação da dissertação além de gerar uma publicação em revista

especializada, tendo como público-alvo final pesquisadores, estudantes e

profissionais interessados na temática biofilmes polimicrobianos. Os tipos de estudo

a serem revisados compreenderão outras revisões (sistemáticas ou narrativas) e

artigos primários neste tema, cujo foco seja o desenvolvimento de modelos de

biofilmes complexos. A estratégia de busca dos estudos a serem revisados

envolverá busca nas principais bases de dados (Pubmed, Medline, Biblioteca

Cochrane, ISI web, EMBASE e Scielo). Os dados coletados serão dispostos em

forma de tabelas e figuras, com o objetivo de facilitar o entendimento e possibilitar a

comparação dos métodos de avaliação utilizados na literatura revisada.

27

4 METODOLOGIA PARA O DESENVOLVIMENTO DE BIOFILMES COMPLEXOS

IN VITRO


As alterações no equilíbrio do hospedeiro que se refletem no biofilme são

complexas, e encontram relação com a grande diversidade de microorganismos

presentes na cavidade bucal (FILOCHE; SOMA; SISSONS, 2007). As interações

que modulam a patogenicidade do biofilme são recriadas em modelos de biofilmes

complexos, conferindo maior realidade ao modelo proposto do que os obtidos de

uma ou mais espécies selecionadas (SISSONS; WONG; SHU, 1998; TEN CATE,

2006). Além disso, o desenvolvimento de biofilmes originados de microcosmos

permite o estudo dos ecossistemas envolvidos pela possibilidade de observação

frente às condições impostas, sem as limitações e dificuldades inerentes a modelos

de estudo in situ e in vivo. Este modelo disponibiliza um volume de biofilme

adequado para as avaliações e permite acompanhar seu crescimento com acesso

facilitado durante todo o processo. Ainda, o modelo proposto apresenta um

comportamento (pH e taxa de crescimento) similar aos observados em biofilmes

naturais (SISSONS; WONG; CUTRESS, 1995). No entanto, embora modelos de

microcosmos venham sendo usados como rotina para pesquisas na Cariologia, não

foi ainda desenvolvido e validado um modelo in vitro para avaliação do potencial

anticariogênico de materiais restauradores.

Adicionalmente, outros aspectos como a avaliação do efeito dose-resposta

de fármacos e antimicrobianos nesses modelos permanece relativamente

inexplorada.

4.2 OBJETIVOS

Esta fase do estudo tem por objetivo conduzir experimentos para testar o

protocolo de obtenção de um biofilme complexo (microcosmos) desenvolvido em

28

placas de cultura de células e a resposta ao meio de incubação (saliva artificial -

DMM), frente à presença ou ausência de suplementação por sacarose. Serão

verificados: o pH, a formação e composição do biofilme compatível com o

desenvolvimento de lesão de cárie. Além disso, serão observadas alterações em

esmalte, submetido aos meios com e sem desafio cariogênico.

4.3 MATERIAL E MÉTODOS

4.3.1 Aspectos éticos

O projeto será encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade

de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas (FO-UFPel/ RS). Os voluntários

assinarão um termo de consentimento livre e esclarecido, a fim de autorizar sua

participação no estudo (Apêndices).

4.3.2 Cálculo da amostra

O cálculo amostral será realizado no programa Sigmastat® (Versão 3.01,

Systat Software Inc.) a partir de dados obtidos em uma avaliação preliminar do

modelo. Os dados serão analisados com ANOVA (análise de variância)

considerando os seguintes parâmetros: poder do estudo de 80%, erro tipo alfa de

5%, valores da diferença entre as médias e os desvios padrão para avaliação de

dureza e análises no biofilme. Os doadores voluntários de saliva para a pesquisa,

serão considerados como blocos estatísticos para análise, enquanto as unidades

experimentais serão representadas pelos biofilmes crescidos individualmente em

cada espécime.

4.3.3 Delineamento experimental

Será realizado um estudo in vitro, completamente aleatorizado, no qual

serão formados biofilmes em placas de micro-poços sobre discos de esmalte bovino,

tendo como inóculo saliva (microcosmos) de 2 voluntários adultos e saudáveis. Os

biofilmes serão crescidos independentemente por até 10 dias sobre 3 discos para

cada inóculo (n=3), sendo que 3 experimentos serão realizados para cada

29

combinação tipo de saliva/ meio, para avaliações em 3 períodos de formação dos

biofilmes. Os fatores em estudo serão os tipos de saliva (em 2 níveis/ indivíduos);

concentração de sacarose no meio DMM (0,15% e 0,5%); e tempo de crescimento

(3, 6 e 10 dias). As análises serão compostas por: aferições diárias de pH para

verificação do potencial cariogênico do biofilme; determinação de desmineralização

por dureza de superfície e longitudinal; composição microbiológica do biofilme

(diluição e plaqueamento).

4.3.4 Obtenção e preparo das amostras de tecido dentário (Figura 1)

Após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa, amostras de esmalte

serão obtidas de incisivos bovinos irrompidos e livres de falhas, obtidos em um

frigorífico local. Os dentes serão raspados, limpos e armazenados em água

destilada (-20ºC). Para obtenção de discos de esmalte de 5mm de diâmetro e

2,5mm de espessura, o terço médio vestibular será seccionado em furadeira

industrial com broca de núcleo de diamante (tipo trefina) em velocidade de 400

RPM. Para finalização será realizada planificação da superfície com discos de lixa

(granulometria 600, 1200, e 1500) e polimento com feltro e pasta diamantada em

politriz. Todos os procedimentos durante a confecção dos discos serão realizados

sob refrigeração por água. Será realizada avaliação de dureza inicial (descrita

adiante, na análise de perda mineral). A base (dentina) e as laterais do disco serão

isoladas com esmalte para unhas (marca cidade etc), deixando apenas a superfície

do esmalte exposta. Por fim, as amostras serão autoclavadas e armazenadas em

solução estéril a -20ºC até utilização. A esterilização em autoclave será realizada

conforme protocolo padrão, à 121ºC por 15 a 30 minutos, a 15 libras de pressão. O

controle de eficácia será realizado com indicador biológico (bacillus

stearothermophilus).

30

4.3.5 Confecção de saliva artificial � meio caldo

A obtenção do meio DMM (meio definido enriquecido com mucina) será

realizada conforme protocolo descrito anteriormente por Wong & Sissons (2001), o

qual contém mucina gástrica de suíno (2,5g/l), uréia (1.0mmol/l), sais (em mmol/l: de

CaCl2, 1,0; MgCl2, 0,2; KH2PO4, 3,5; K2HPO4, 1,5; NaCl, 10,0; KCl, 15,0; NH4Cl,

2,0), mistura de 21 aminoácidos livres, 17 vitaminas e fatores de crescimento. O

meio contém aminoácidos para o equivalente em proteína/ peptídeo (em mmol/l) em

concentrações baseadas nas da saliva humana: alanina (1,95), arginina (1,30),

asparagina (1,73), ácido aspártico (1,52), cisteína (0,05), ácido glutâmico (5,41

mmol/l), glutamina (3,03), glicina (1,95), histidina (1,08), isoleucina (2,38), leucina

(3,68), serina (3,46), treotonina (1,08), triptofano (0,43), tirosina (2,17), valina (2,38),

e caseína (5,0g/l). Para caracterizar desafio cariogênico, sacarose será acrescida ao

2,5 mm

5 mm

Figura 1. Técnica de confecção dos discos de esmalte. A.Dentes fixados com guta percha para corte em furadeira industrial com broca de núcleo de diamante (tipo trefina). B.Disco de 5mm de diâmetro. C.Sequência de discos de lixa e feltro para planificação e acabamento do disco de esmalte. D.Discos de esmalte padronizados. E.Isolamento da base e lados do disco com esmalte de unhas.

A

B

C

DE

31

meio na concentração de 0,5%, enquanto que para crescimento sem o desafio, a

concentração será de 0,15% (FILOCHE et al., 2008).

4.3.6 Coleta e processamento da saliva

Será realizada coleta de 20mL de saliva estimulada por filme de parafina

(Parafilm �M"®, American National CanTM, Chicago, IL, EUA) de três doadores

saudáveis (envolvidos na pesquisa). Os doadores suspenderão a higiene oral por

24h e a alimentação por 2h previamente à coleta de saliva. A saliva será depositada

em um coletor graduado estéril, transportada em gelo ao Laboratório de

Microbiologia (FO-UFPel). Então, a saliva será filtrada através de lã de vidro estéril,

armazenada em um recipiente estéril e homogeneizada em vortex (FILOCHE;

SOMA; SISSONS, 2007). Serão separadas da saliva coletada de cada voluntário

duas alíquotas, uma para quantificação microbiana (dados expressos em UFC/ mL),

e a outra será centrifugada (5.000g, a 4ºC por 5min) o sobrenadante será eliminado

e o precipitado será congelado para futuras análises microbianas.

4.3.7 Crescimento microbiano e formação de biofilme (Figura 2)

A saliva preparada será inoculada sobre os discos de esmalte em placas de

micro-poços (24 poços), em um volume de 400µL por poço. Após 1 hora, a saliva

será delicadamente aspirada da base dos poços, e 1,8mL de saliva artificial - meio

DMM previamente preparado - será adicionado em cada micro-poço. A amostra de

cada doador será dividida aleatoriamente em três grupos. Destes, um grupo

(controle) não receberá suplementação de sacarose no meio DMM. Nos dois outros

grupos, a adição de sacarose será efetuada no meio, nas concentrações de 0.15% e

0.5% respectivamente (FILOCHE et al., 2008). Os procedimentos serão realizados

em triplicatas.

Os biofilmes serão formados independentemente sobre os discos de esmalte

bovino. As placas serão incubadas em condição atmosférica de anaerobiose (80%

N2, 10% CO2 e 10% H2), sob temperatura controlada (37ºC) por um período de até

10 dias, e mantidas em repouso na incubadora. O meio será renovado diariamente.

Precedendo o momento de cada renovação, as placas serão agitadas

32

cuidadosamente, o sobrenadante será removido e pH (pHmetro - Analion PM608

plus, São paulo, SP) (FILOCHE et al., 2007).

1 hora

1,8 mL DMM

Renovação do meio a cada 24 h

Aspiração do inóculo

pH

3º, 6º e 10º dia

Análise do biofilme

37°C

80%N2 10% CO2 10% H2

Dureza do esmalte

SonicaçãoRTF

Discos de esmalte

Figura 2. Ensaio in vitro de biofilme pela técnica de microcosmos. A.Inoculação com saliva(microcosmos) nos discos de esmalte individualizados nas placas de micropoços durante 1h emrepouso. B.Aspiração do inóculo e adição do meio (DMM, DMM + 0,5% sacarose ou DMM + 0,15%sacarose) (1,8mL).C.Incubação das placas em anaerobiose à 37°C, renovação e mensuração do pHdos meios em intervalos de 24h. D.Sonicação das amostras no 3º, 6º e 10º dias para homogeneização erealização de análises no biofilme (quantificação através de diluição e plaqueamento). Avaliaçõesquantitativas de dureza (de superfície e longitudinal) nos discos de esmalte.

A

B

C

D

DMM DMM

Sacarose0,15%0,5%

DMM

400 µL inóculo

(microcosmos)

33

4.3.8 Análise dos Perfis Microbianos/ Crescimento da Placa

Após 3, 6 e 10 dias, os discos de esmalte serão removidos dos poços com

pinça estéril, e as células não aderidas serão removidas gentilmente por lavagem

com solução salina estéril (2mL) (THURNHEER et al., 2003). Então, os discos serão

colocados em tubos contendo 1mL RTF (meio de transporte reduzido), e sonicados

(Sonicador Vibra Cell - Sonics and Materials, Danbury,CT, USA) com potência de

40W, amplitude de 5%, usando 6 pulsos de 9,9s cada (BOWEN; PRUCHNO;

BELLONE, 1986) para obtenção do biofilme em suspensão homogênea.

Será realizada diluição seriada das suspensões de biofilme para contagem de

microrganismos totais, estreptococos do grupo mutans, lactobacilos (TENUTA et al.,

2006), cândida, e acidúricos totais. As suspensões serão diluídas em RTF em séries

até 1:107 e imediatamente inoculadas em duplicata nos seguintes meios de cultura:

Ágar sangue para microrganismos totais; Ágar mitis salivarius com 0,2 unidades de

bacitracina/mL (MSB), para quantificação de estreptococos do grupo mutans (GOLD;

JORDAN; VAN HOUTE, 1973); Ágar Rogosa SL para lactobacilos; CHROMagar

Cândida para quantificação e diferenciação presuntiva de espécimes de cândida; e

BHI com pH ajustado a 4,7 para quantificação de microorganismos totais acidúricos.

As placas serão incubadas em condição de anaerobiose (80% N2, 10% CO2 e 10%

H2), a 37ºC por 96h. As unidades formadoras de colônia serão contadas e os

resultados expressos em UFC/mg de espécime de biofilme (peso úmido) e em

porcentagem de estreptococos do grupo mutans, de lactobacilos, cândida e

microrganismos acidúricos totais em relação aos microrganismos totais cultiváveis.

Após remoção da alíquota da suspensão microbiana inicial (original) para

quantificação, o espécime será removido da suspensão, e esta será centrifugada. O

sobrenadante será desprezado e o precipitado será armazenado a -80ºC para

análises futuras.

4.3.9 Análise da alteração de dureza nos discos de esmalte

Será realizada uma avaliação de dureza superficial média inicial para obter

valores de referência e buscar uma padronização das amostras de esmalte. Após

cada fase de crescimento dos biofilmes, nas diferentes condições impostas ao meio,

a dureza de superfície do esmalte dos discos será mensurada novamente, e uma

34

média para cada espécime será calculada. Estas análises serão realizadas de

acordo com Cury et al. (2000) e a perda (em relação à dureza inicial) da dureza da

superfície será calculada percentualmente (%PDS). As indentações serão realizadas

com cargas de 50- ou 25-grama por 5s, para %PDS e MST, respectivamente.

4.3.10 Tratamento estatístico

De posse dos resultados experimentais deste projeto, o método estatístico

será escolhido com base na aderência ao modelo de distribuição normal e igualdade

de variância. Para todos os testes será considerado o valor p < 0,05 como

estatisticamente significativo. Os voluntários serão considerados como unidades

experimentais e blocos estatísticos, a fim de diminuir a variabilidade do experimento.

Será empregado o programa SigmaStat (Versão 3.01, Systat Software Inc.).

35

5 METODOLOGIA PARA INVESTIGAR O POTENCIAL ANTIMICROBIANO/

ANTICARIOGÊNICO DE UM MATERIAL RESTAURADOR � MTA � UTILIZANDO O MODELO DE BIOFILME IN VITRO.


O desenvolvimento de materiais restauradores odontológicos de baixo custo,

propriedades anticariogênicas expressivas e propriedades biomecânicas indicativas

de bom desempenho clínico podem ser um forte auxiliar em ações preventivas e

terapêuticas junto à Rede Nacional de Atenção e Serviços em Saúde.

Os materiais a base de mineral trióxido agregado (MTA) vem sendo utilizados

para diversas finalidades em odontologia, dentre elas: obturações retrógradas

(SAUNDERS, 2008); tratamento endodôntico de dentes com formação apical

incompleta (ERDEM; SEPET, 2008; WITHERSPOON et al., 2008); proteção do

complexo dentinopulpar e capeamento pulpar direto (AEINEHCHI et al., 2007; MIN

et al., 2008). A aplicação dos materiais a base de MTA é fundamentada nas suas

excelentes propriedades biológicas, tais como biocompatibilidade, indução de

deposição óssea e dentinária, e de reparo apical (WITHERSPOON, 2008).

A modificação do MTA, por adição de componentes capazes de melhorar

suas propriedades biomecânicas e de manipulação tornando-o passível de uso

como material restaurador além de protetor pulpar, parece ser promissora,

especialmente se aliada aos potenciais efeitos antimicrobiano e inibidor de

desmineralização/ favorecedor de remineralização. Neste sentido, um material

restaurador inovador a base de trióxido mineral agregado está sendo desenvolvido

no laboratório CDC-Bio da Faculdade de Odontologia (UFPel). Assim, parte da

avaliação do material será realizada no modelo de biofilme proposto. A observação

do potencial antimicrobiano/ anticariogênico deste material será realizada,

contribuindo para observação e idealização das propriedades do material.

36

5.2 OBJETIVOS

Avaliação comparativa do potencial antimicrobiano/ anticariogênico de um

material restaurador em desenvolvimento � MTA experimental, sob condições

cariogênicas no modelo de biofilme proposto.

• Avaliar a presença de cárie adjacente à restauração (CARS)

• Verificar a inibição de crescimento de microorganismos acidúricos e

acidogêncios.

5.3 MATERIAL E MÉTODOS

5.3.1 Delineamento experimental

Será realizada indução de cárie por crescimento de biofilme e adição de

sacarose no meio (DMM 0,5% sacarose), no modelo de biofilme in vitro. Os biofilmes

serão crescidos por até 10 dias sobre 5 discos de esmalte bovino para cada

saliva/tipo de material (n=5), sendo que 3 experimentos serão realizados para cada

combinação tipo de saliva/ tipo de material. Os fatores em estudo serão tipos de

saliva (em 3 níveis/ indivíduos); e tipos de material (em 4 níveis: cimento de

ionômero de vidro, cimento de ionômero de vidro modificado por resina, MTA e MTA

experimental). Os biofilmes serão formados independentemente sobre discos de

esmalte bovino restaurados, os quais serão individualizados nos poços das placas.

As avaliações serão compostas por: aferições diárias de pH (potencial cariogênico);

determinação de desmineralização por dureza de superfície e longitudinal (%PDS e

MST); composição microbiológica do biofilme (diluição e plaqueamento); e análise

bioquímica do biofilme.

5.3.2 Obtenção e preparo das amostras de tecido dentário

As amostras de esmalte serão obtidas, esterilizadas e preparadas em discos

conforme descrito anteriormente. Serão preparadas cavidades padronizadas (2mm

de diâmetro e 1,5mm de profundidade) centralizadas nos discos de esmalte. Para

37

delimitar o diâmetro e a profundidade da cavidade, uma ponta diamantada do tipo

topo plano com stop será utilizada (2294 � KG Sorensen) (Figura 3). Todos os

procedimentos serão executados sob refrigeração constante por água.

Previamente à restauração das cavidades, os discos receberão profilaxia e

lavagem com spray água/ar.

5.3.3 Confecção das restaurações com ionômero de vidro

O material será manipulado conforme as especificações do fabricante. As

restaurações serão confeccionadas utilizando seringa Centrix, e o material será

inserido em um único incremento. Uma matriz de poliéster será pressionada através

de uma lamínula de vidro a fim de planificar a superfície. Após a geleificação do

material (tempo conforme especificação do fabricante), as amostras receberão

polimento com seqüência de discos de lixa e de feltro em politriz, este último,

associado às pastas para polimento (Diamond ACI e II - FGM).

5.3.4 Confecção das restaurações com ionômero de vidro modificado por resina

O material será manipulado conforme as especificações do fabricante. Os

espécimes serão tratados com o Vitremer Primer (3M - ESPE) seguindo as

instruções do fabricante. As restaurações serão confeccionadas utilizando seringa

Centrix em um único incremento. Para obtenção de uma superfície plana, uma

matriz de poliéster será pressionada na superfície do material, sob uma lamínula de

2 mm

1,5 mm

AB

Figura 3. Técnica de confecção de cavidades nos discosde esmalte. A.Abertura das cavidades com pontadiamantada topo plano com stop (2294 - KG Sorensen) em alta rotação. B.Cavidades padronizadas (2mm de diâmetro por 1,5mm de profundidade).

38

vidro, sendo então imediatamente fotoativado por 40 segundos com o aparelho

fotopolimerizador (Radii® LED Curing Light, SDI, Austrália) com intensidade de

1400mW/cm2. Imediatamente após, as amostras receberão polimento com

seqüência de discos de lixa e de feltro em politriz, este último, associado às pastas

para polimento (Diamond ACI e II - FGM). Após o polimento será aplicado o selante

de superfície (Vitremer Glazer).

5.3.5 Confecção das restaurações com MTA e MTA experimental

O material será manipulado conforme as especificações do fabricante. As

restaurações serão realizadas em incremento único com auxílio de um porta-

amálgama, e a adaptação do material na cavidade será realizada através de

condensadores de amálgama. O acabamento será realizado conforme descrito para

os materiais anteriores, após o tempo de presa final (15min) sob uma gaze úmida.

Os procedimentos para o MTA experimental serão realizados conforme orientação

dos pesquisadores envolvidos no desenvolvimento do material.

Todos os blocos restaurados serão armazenados em água destilada a 37ºC até o

momento de esterilização das amostras. Antecedendo a próxima fase (incubação),

todas as amostras serão esterilizadas através de radiação gama (Faculdade de

Medicina - UFPel) (RODRIGUES; CURY; NOBRE DOS SANTOS, 2004).

5.3.6 Análise dos Perfis Microbianos/ Crescimento da Placa

Será realizada diluição seriada das suspensões de biofilme para contagem

de microrganismos totais, estreptococos do grupo mutans, lactobacilos (TENUTA et

al., 2006), cândida, e acidúricos totais, conforme descrição prévia.

5.3.7 Análise da perda mineral nos blocos de esmalte

Após cada fase de crescimento dos biofilmes, o percentual de

alteração/perda de dureza de superfície do esmalte dos discos será calculado a

partir dos valores obtidos nas leituras de dureza inicial e final, esta última, obtida

após os tratamentos. Após a avaliação das superfícies, os discos serão seccionados

39

no centro, longitudinalmente, para determinar a dureza de secção transversal (MST)

(CURY; REBELLO; DEL BEL CURY, 1997). Esta determinação será realizada de

acordo com Cury et al. (2000), mas as indentações serão realizadas em 10, 20, 30,

40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 e 200 µm da superfície externa do esmalte.

Os valores de MST serão utilizados para o cálculo da área integrada de

desmineralização (∆S) para cada tratamento (SOUSA et al., 2009). As análises

serão realizadas com um microdurômetro Future-Tech FM acoplado a um indentador

Knoop. As indentações serão realizadas com cargas de 50- ou 25-grama por 5s,

para %PDS e MST, respectivamente.

5.3.8 Análise bioquímica do biofilme dental

Uma parte das amostras dos biofilmes serão separadas e congeladas (-

80°C) para a análise bioquímica. Elas serão pré-pesadas em microtubos (± 10µg).

Para análise da composição inorgânica, 0,5M HCl será adicionado a um tubo na

proporção de 0,5mL/10mg placa (peso úmido). Depois de uma extração por 3 horas

em temperatura ambiente sob constante agitação, o mesmo volume de TISAB II pH

5,0 (contendo 20g de NaOH/L) será adicionado ao tubo como tamponante (BENELLI

et al., 1993; CURY; REBELLO; DEL BEL CURY, 1997). As amostras serão

centrifugadas (11.000g) por 6min e o sobrenadante será aproveitado para

determinação da presença de F ácido-solúvel, que será analisada com um eletrodo

seletivo de íons e um analisador de íons.

5.3.9 Tratamento estatístico

De posse dos resultados experimentais, o método estatístico será escolhido

com base na aderência ao modelo de distribuição normal e igualdade de variância.

Para todos os testes será considerado o valor p < 0,05 como estatisticamente

significativo. Será empregado o programa SigmaStat (Versão 3.5, Systat Software

Inc.).

40

Referências

AEINEHCHI, M.; DADVAND, S.; FAYAZI, S.; BAYAT-MOVAHED, S. Randomized controlled trial of mineral trioxide aggregate and formocresol for pulpotomy in primary molar teeth. Int Endod J, v.40, n.4, p.261-267, Apr. 2007. ALTMAN, H.; STEINBERG, D.; PORAT, Y.; MOR, A.; FRIDMAN, D.; FRIEDMAN, M.; BACHRACH, G. In vitro assessment of antimicrobial peptides as potential agents against several oral bacteria. J Antimicrob Chemother, v.58, n.1, p.198-201, Jul. 2006. ANDERSON, G. G.; O'TOOLE, G. A. Innate and induced resistance mechanisms of bacterial biofilms. Curr Top Microbiol Immunol, v.322, p.85-105. 2008. ANDERSON, S. A.; SISSONS, C. H.; COLEMAN, M. J.; WONG, L. Application of carbon source utilization patterns to measure the metabolic similarity of complex dental plaque biofilm microcosms. Appl Environ Microbiol, v.68, n.11, p.5779-5783, Nov. 2002. ANWAR, H.; STRAP, J. L.; COSTERTON, J. W. Establishment of aging biofilms: possible mechanism of bacterial resistance to antimicrobial therapy. Antimicrob Agents Chemother, v.36, n.7, p.1347-1351, Jul. 1992. BARROS, A.; BERTOLDI, A. Desigualdades na utilização e no acesso a serviços odontológicos: uma avaliação em nível nacional. Ciência & Saúde Coletiva, v.7, n.4, p.709-717. 2002. BENELLI, E. M.; SERRA, M. C.; RODRIGUES, A. L., JR.; CURY, J. A. In situ anticariogenic potential of glass ionomer cement. Caries Res, v.27, n.4, p.280-284. 1993. BOWDEN, G. H.; LI, Y. H. Nutritional influences on biofilm development. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.81-99, Apr. 1997. BOWEN, M. B.; PRUCHNO, C.; BELLONE, C. J. Characterization of a concanavalin A supernatant-derived idiotype-specific T helper cell factor. J Immunol, v.136, n.4, p.1295-1302, Feb 15. 1986.

41

BRADSHAW, D. J.; MCKEE, A. S.; MARSH, P. D. Effects of carbohydrate pulses and pH on population shifts within oral microbial communities in vitro. J Dent Res, v.68, n.9, p.1298-1302, Sep. 1989. BRUNTHALER, A.; KONIG, F.; LUCAS, T.; SPERR, W.; SCHEDLE, A. Longevity of direct resin composite restorations in posterior teeth. Clin Oral Investig, v.7, n.2, p.63-70, Jun. 2003. CURY, J. A.; REBELLO, M. A.; DEL BEL CURY, A. A. In situ relationship between sucrose exposure and the composition of dental plaque. Caries Res, v.31, n.5, p.356-360. 1997. CURY, J. A.; TENUTA, L. M.; RIBEIRO, C. C.; PAES LEME, A. F. The importance of fluoride dentifrices to the current dental caries prevalence in Brazil. Braz Dent J, v.15, n.3, p.167-174. 2004. DAVEY, M. E.; O'TOOLE G, A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev, v.64, n.4, p.847-867, Dec. 2000. DONLAN, R. M.; COSTERTON, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev, v.15, n.2, p.167-193, Apr. 2002. ERDEM, A. P.; SEPET, E. Mineral trioxide aggregate for obturation of maxillary central incisors with necrotic pulp and open apices. Dent Traumatol, v.24, n.5, p.e38-41, Oct. 2008. FEJERSKOV, O.; NYVAD, B.; LARSEN, M. J. Human experimental caries models: intra-oral environmental variability. Adv Dent Res, v.8, n.2, p.134-143, Jul. 1994. FILOCHE, S. K.; COLEMAN, M. J.; ANGKER, L.; SISSONS, C. H. A fluorescence assay to determine the viable biomass of microcosm dental plaque biofilms. J Microbiol Methods, v.69, n.3, p.489-496, Jun. 2007. FILOCHE, S. K.; SOMA, D.; VAN BEKKUM, M.; SISSONS, C. H. Plaques from different individuals yield different microbiota responses to oral-antiseptic treatment. FEMS Immunol Med Microbiol, Jul 16. 2008. FILOCHE, S. K.; SOMA, K. J.; SISSONS, C. H. Caries-related plaque microcosm biofilms developed in microplates. Oral Microbiol Immunol, v.22, n.2, p.73-79, Apr. 2007. FONTANA, M.; GONZALEZ-CABEZAS, C. Secondary caries and restoration replacement: an unresolved problem. Compend Contin Educ Dent, v.21, n.1, p.15-18, 21-14, 26 passim; quiz 30, Jan. 2000. FUCIO, S. B.; CARVALHO, F. G.; SOBRINHO, L. C.; SINHORETI, M. A.; PUPPIN-RONTANI, R. M. The influence of 30-day-old Streptococcus mutans biofilm on the surface of esthetic restorative materials--an in vitro study. J Dent, v.36, n.10, p.833-839, Oct. 2008.

42

GOLD, O. G.; JORDAN, H. V.; VAN HOUTE, J. A selective medium for Streptococcus mutans. Arch Oral Biol, v.18, n.11, p.1357-1364, Nov. 1973. KLEINBERG, I. A mixed-bacteria ecological approach to understanding the role of the oral bacteria in dental caries causation: an alternative to Streptococcus mutans and the specific-plaque hypothesis. Crit Rev Oral Biol Med, v.13, n.2, p.108-125. 2002. MARSH, P. D. The role of microbiology in models of dental caries. Adv Dent Res, v.9, n.3, p.244-254; discussion 255-269, Nov. 1995. MARSH, P. D. Dental plaque: biological significance of a biofilm and community life-style. J Clin Periodontol, v.32 Suppl 6, p.7-15. 2005. MARSH, P. D.; BRADSHAW, D. J. Physiological approaches to the control of oral biofilms. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.176-185, Apr. 1997. MIN, K. S.; PARK, H. J.; LEE, S. K.; PARK, S. H.; HONG, C. U.; KIM, H. W.; LEE, H. H.; KIM, E. C. Effect of mineral trioxide aggregate on dentin bridge formation and expression of dentin sialoprotein and heme oxygenase-1 in human dental pulp. J Endod, v.34, n.6, p.666-670, Jun. 2008. MJOR, I. A. Clinical diagnosis of recurrent caries. J Am Dent Assoc, v.136, n.10, p.1426-1433, Oct. 2005. MJOR, I. A.; MOORHEAD, J. E.; DAHL, J. E. Reasons for replacement of restorations in permanent teeth in general dental practice. Int Dent J, v.50, n.6, p.361-366, Dec. 2000. NARVAI, P. C.; FRAZAO, P.; RONCALLI, A. G.; ANTUNES, J. L. Dental caries in Brazil: decline, polarization, inequality and social exclusion. Rev Panam Salud Publica, v.19, n.6, p.385-393, Jun. 2006. NERI, M.; SOARES, W. Social inequality and health in Brazil. Cad Saude Publica, v.18 Suppl, p.77-87. 2002. OVERMAN, P. R. Biofilm: a new view of plaque. J Contemp Dent Pract, v.1, n.3, p.18-29, Aug 15. 2000. PETERSEN, P. E.; BOURGEOIS, D.; OGAWA, H.; ESTUPINAN-DAY, S.; NDIAYE, C. The global burden of oral diseases and risks to oral health. Bull World Health Organ, v.83, n.9, p.661-669, Sep. 2005. PRATTEN, J.; SMITH, A. W.; WILSON, M. Response of single species biofilms and microcosm dental plaques to pulsing with chlorhexidine. J Antimicrob Chemother, v.42, n.4, p.453-459, Oct. 1998. RODRIGUES, L. K.; CURY, J. A.; NOBRE DOS SANTOS, M. The effect of gamma radiation on enamel hardness and its resistance to demineralization in vitro. J Oral Sci, v.46, n.4, p.215-220, Dec. 2004.

43

RUBY, J.; BARBEAU, J. The buccale puzzle: The symbiotic nature of endogenous infections of the oral cavity. Can J Infect Dis, v.13, n.1, p.34-41, Jan. 2002. SARRETT, D. C. Clinical challenges and the relevance of materials testing for posterior composite restorations. Dent Mater, v.21, n.1, p.9-20, Jan. 2005. SAUNDERS, W. P. A prospective clinical study of periradicular surgery using mineral trioxide aggregate as a root-end filling. J Endod, v.34, n.6, p.660-665, Jun. 2008. SHU, M.; WONG, L.; MILLER, J. H.; SISSONS, C. H. Development of multi-species consortia biofilms of oral bacteria as an enamel and root caries model system. Archives of Oral Biology, v.45, n.1, p.27-40, Jan. 2000. SISSONS, C. H. Artificial dental plaque biofilm model systems. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.110-126, Apr. 1997. SISSONS, C. H.; WONG, L.; CUTRESS, T. W. Patterns and rates of growth of microcosm dental plaque biofilms. Oral Microbiol Immunol, v.10, n.3, p.160-167, Jun. 1995. SISSONS, C. H.; WONG, L.; SHU, M. Factors affecting the resting pH of in vitro human microcosm dental plaque and Streptococcus mutans biofilms. Arch Oral Biol, v.43, n.2, p.93-102, Feb. 1998. SOUSA, R. P.; ZANIN, I. C.; LIMA, J. P.; VASCONCELOS, S. M.; MELO, M. A.; BELTRAO, H. C.; RODRIGUES, L. K. In situ effects of restorative materials on dental biofilm and enamel demineralisation. J Dent, v.37, n.1, p.44-51, Jan. 2009. TANG, G.; YIP, H. K.; CUTRESS, T. W.; SAMARANAYAKE, L. P. Artificial mouth model systems and their contribution to caries research: a review. J Dent, v.31, n.3, p.161-171, Mar. 2003. TEN CATE, J. M. In situ models, physico-chemical aspects. Adv Dent Res, v.8, n.2, p.125-133, Jul. 1994. TEN CATE, J. M. Biofilms, a new approach to the microbiology of dental plaque. Odontology, v.94, n.1, p.1-9, Sep. 2006. TENUTA, L. M.; RICOMINI FILHO, A. P.; DEL BEL CURY, A. A.; CURY, J. A. Effect of sucrose on the selection of mutans streptococci and lactobacilli in dental biofilm formedin situ. Caries Res, v.40, n.6, p.546-549. 2006. THOMAS, J. G.; NAKAISHI, L. A. Managing the complexity of a dynamic biofilm. J Am Dent Assoc, v.137 Suppl, p.10S-15S, Nov. 2006. THOMAS, R. Z.; RUBEN, J. L.; TEN BOSCH, J. J.; FIDLER, V.; HUYSMANS, M. C. Approximal secondary caries lesion progression, a 20-week in situ study. Caries Res, v.41, n.5, p.399-405. 2007.

44

THURNHEER, T.; GMUR, R.; SHAPIRO, S.; GUGGENHEIM, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol, v.69, n.3, p.1702-1709, Mar. 2003. TOTIAM, P.; GONZALEZ-CABEZAS, C.; FONTANA, M. R.; ZERO, D. T. A new in vitro model to study the relationship of gap size and secondary caries. Caries Res, v.41, n.6, p.467-473. 2007. WEINBERG, M. A.; BRAL, M. Laboratory animal models in periodontology. J Clin Periodontol, v.26, n.6, p.335-340, Jun. 1999. WHITE, D. J. The application of in vitro models to research on demineralization and remineralization of the teeth. Adv Dent Res, v.9, n.3, p.175-193; discussion 194-177, Nov. 1995. WIEGAND, A.; BUCHALLA, W.; ATTIN, T. Review on fluoride-releasing restorative materials--fluoride release and uptake characteristics, antibacterial activity and influence on caries formation. Dent Mater, v.23, n.3, p.343-362, Mar. 2007. WIMPENNY, J. W. The validity of models. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.150-159, Apr. 1997. WITHERSPOON, D. E. Vital pulp therapy with new materials: new directions and treatment perspectives--permanent teeth. J Endod, v.34, n.7 Suppl, p.S25-28, Jul. 2008. WITHERSPOON, D. E.; SMALL, J. C.; REGAN, J. D.; NUNN, M. Retrospective analysis of open apex teeth obturated with mineral trioxide aggregate. J Endod, v.34, n.10, p.1171-1176, Oct. 2008.

45

Orçamento Despesas com materiais de consumo

MATERIAIS ODONTOLÓGICOS DE CONSUMO

QUANTIDADE VALOR UNITÁRIO

VALOR TOTAL

(R$) Touca franzida c/ 100 (Fava) 2 8,10 16,20Máscara c/ 50 (Best Fabril) 3 6,50 19,50Luvas de procedimento c/ 100 (Supermax) 5 13,50 67,50Sobre-luvas c/ 100 (MCE) 1 5,80 5,80Cera utilidade (Epoxiglass) 1 9,00 9,00Rolo papel grau cirúrgico 10cmX100m (Medstéril Investmar)

1 62,80 62,80

Microbrush c/ 100 (KGbrush KG Sorensen) 2 6,50 13,00Ácido fosfórico 37% (Magic Acid Vigodent) 1 5,90 5,90Sistema Adesivo (ADPER Single Bond 2 - 3M ESPE)

1 98,90 98,90

Resina Composta (Z250 - 3M ESPE) 2 81.00 162,00Cimento de Ionômero de Vidro (Vitrebond - 3M ESPE)

2 325,00 650,00

Cimento de ionômero de vidro modificado por resina (Vitremer 3M ESPE)

2 308,00 616,00

Mineral trióxido agregado (MTA 1g � Ângelus) 2 284,40 568,80Broca carbide (KG Sorensen) 20 3,90 78,00Ponta diamantada (KG Sorensen) 20 4,20 84,00Fita de matriz de aço (X mm) (Injecta) 20 1,50 30,00Ponteiras descartáveis para seringa Centrix, pct c/ 20

2 39,30 78,60

TOTAL 2.566,00

PAPELARIA Quantidade Valor Unitário Valor Total (R$)

Caixa de papel 500 fls. 95g/ m2 / tam. A4 para impressão em jato de tinta

1 15,00 15,00

Cartucho de tinta para impressora Deskjet 820 2 30,00 60,00Fita adesiva larga 1 5,00 5,00TOTAL 80,00

MATERIAIS DE CONSUMO LABORATORIAL

Quantidade Valor Unitário Valor Total (R$)

Anaerobac c/ 10, Probac 10 105,60 1.056,00Placa p/ cultura de tecidos fundo chato c/ tampa estéril 24 poços, TPP

100 3,54 354,00

46

Placa de petri descartável 90 x 15mm c/ 10, J. Prolab

100 1,99 199,00

Pipetas graduadas descartáveis 10 26,94 269,40Ponteira cor amarela 20 a 200µl pct. c/ 1000, Axygen T200Y

10 26,94 269,40

Ponteira cor natural 20 a 300µl pct. c/ 1000, Axygen T350-C

10 29,05 290,50

Ponteira cor azul 100 a 1000µl pct. c/ 1000, Axygen T1000-B

10 29,05 290,50

Rack c/ 96 ponteiras 0,5 a 10µl, Axygen 1 6,26 6,26Rack c/ 96 ponteiras 20 a 200µl, Axygen 1 6,26 6,26Rack c/ 96 ponteiras 20 a 300µl, Axygen 1 7,08 7,08

Rack c/ 96 ponteiras 100 a 1000µl, Axygen 1 7,08 7,08

Filtro Millex GV 0,22µm 25mm c/ 25, Millipore JBR610021

4 221,10 884,4

TOTAL 3.639,88

REAGENTES E MEIOS DE CULTURA Quantidade Valor Unitário Valor Total (R$)

Agar Mitis Salivarius c/ 500g, Acumedia 3 204,50 613,50Agar tryptic soy c/ 500g, Acumedia 1 112,58 112,58Agar base sangue columbia c/ 500g, Acumedia 1 139,10 139,10Rogosa SL Agar c/ 500g, Difco cód. 0480-17 1 1228,80 1228,80Caldo cérebro e coração (BHI) c/ 500g, Acumedia

1 100,93 100,93

Agar cérebro e coração c/ 500g, Acumedia 1 155,05 155,05Chromagar cândida c/ 500g, Difco 1 887,90 887,90Agar sabouraud dextrose 4% c/ 500g, Acumedia 1 69,50 69,50Caldo tryptic soy c/ 500g, Acumedia 1 91,95 91,95Reagentes para confecção de DMM � saliva artificial

4.610,00

TOTAL 8.009,31 Despesas com capital

MATERIAL PERMANENTE PARA LABORATÓRIO

QUANTIDADE VALOR UNITÁRIO

VALOR TOTAL

(R$) Bico de Busen c/ registro 3 39,00 117,00

Espátula de aço inox c/ colher 150 mm 2 8,00 16,00

Micropipeta monocanal vol. Variável 0,1 a 2µl, mod. LM-2, HTL

1 254,40 254,40

Micropipeta monocanal vol. Variável 0,5 a 10µl, mod. LM-10, HTL

1 254,40 254,40

Micropipeta monocanal vol. Variável 10 a 100µl, mod. LM-100, HTL

1 219,40 219,40


1 219,40 219,40


1 228,30 228,30

Pêra pipetadora 3 vias verde, 60ml 1 19,70 19,70

47

Pêra pipetadora 3 vias borracha, 100ml 1 9,89 9,89Jarra p/ anaerobiose em PVC rígido cap. 3,5Lt. Mod. JA0401, Permution

1 210,00 210,00

Jarra p/ anaerobiose em acrílico transparente cap. 3,5Lt. Mod. JA0402, Permution

2 380,30 760,60

Barra magnética lisa, 5x15mm, mod. FS5X15 1 6,83 6,83Barra magnética lisa, 7x30mm, mod. FS730 1 8,09 8,09TOTAL 2.324,01

VIDRARIA Quantidade Valor

Unitário Valor Total (R$)

Frasco p/ reagente em vidro transparente graduado, c/ tampa azul rosqueavel autoclavavel cap. 50ml, Boeco

5 13,86 69,30


5 10,05 50,25


5 12,40 62,00


5 17,50 87,50


1 274,70 274,70

Balão volumétrico c/ tampa polietileno cap. 50ml, Satelit

1 15,98 15,98


1 17,54 17,54


1 20,20 20,20


5 21,20 106,00


5 26,62 133,10

Proveta graduada de vidro c/ base hexagonal plástica cap. 25ml, Satelit

1 7,63 7,63


1 8,00 8,00


2 8,39 16,78


1 18,30 18,30


2 25,17 50,34


1 33,56 33,56

TOTAL 971,18

EQUIPAMENTOS Quantidade Valor Unitário

Valor Total

48

(R$) Homogenizador de soluções (sangue) cap. 22 tubos, mod. AP-22, Phoenix

1 611,60 611,60

Mesa agitadora microprocessada mod. Q225M, Quimis 1 2928,30 2928,30Agitador de tubos Vortex mod. QL-901 1 385,00 385,00Contador de colônias digital, mod. CP600 1 1.490,00 1.490,00Centrífuga de Microtubos eppendorf 1 899,00 899,00Agitador magnético c/ aquecimento, mod. 752A 1 1.267,00 1.267,00TOTAL 7.580,9OUTROS Quantidade Valor

Unitário Valor Total (R$)

Espátula para inserção de resina Thompson 1 47,00 47,00Bandeja inox 40,5x30,5x5,5 � Coraldent GC 20 2 21,00 42,00TOTAL 89,00

OUTROS TIPOS DE DESPESA (CUSTEIO E DIVULGAÇÃO)

Valor Total (R$)

Congressos (SBPQO, ORCA) 3.500,00Passagens 3.000,00TOTAL 6.500,00

TOTAL - CONSUMO 14.295,19TOTAL - PERMANENTE 10.876,09TOTAL - OUTROS 6.589,00TOTAL 31.760,28

Fontes de financiamento

PRODOC/ CAPES (R$12.000,00 ano); Edital Universal/ CNPQ (R$19.986,00);

recursos dos pesquisadores.

49

Cronograma

PERÍODO

2008 2009 2010 ATIVIDADES A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M Pesquisa bibliográfica

X X X X X X X X X X X X X X X X

Submissão ao CEP

X

Qualificação X

Aquisição dos materiais

X X X X

Pilotos X X

Preparo dos dentes

X X X

Experimento 1 X X


X X

Experimento 2 X X


X X

Avaliação dos espécimes

X X X X X

Descrição dos resultados

X X X X X

Análise estatística

X X X X

Redação dos artigos

X X X X X

Redação da dissertação

X X

Defesa da dissertação

X

50

3 RELATÓRIO DE CAMPO

3.1 Aspectos éticos

O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas (FO-UFPel/ RS) sob

parecer nº. 076/2009. Os voluntários assinaram um termo de consentimento livre e

esclarecido, a fim de autorizar sua participação no estudo. (Apêndices)

3.2 Condições gerais

O modelo de biofilme in vitro descrito por Filoche et al. (FILOCHE; SOMA;

SISSONS, 2007) foi utilizado com modificações. O estudo foi completamente

aleatorizado. Os biofilmes foram formados independentemente em placas 24 de

micro-poços (TPP - Techno Plastic Products, Trasadingen, SU) sobre discos de

esmalte bovino, tendo como inóculo saliva humana para obtenção de microcosmos.

Foi utilizado um meio de crescimento análogo à saliva - meio definido enriquecido

com mucina (DMM) (WONG; SISSONS, 2001). A confecção do meio foi realizada

com componentes da marca Sigma (Sigma Chemical Co., St Louis, Montana, EUA),

exceto pelos sais (Vetec Química Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ).

A construção do modelo foi desenvolvida em 3 etapas, descritas a seguir e

representadas esquematicamente. (Figura 1)

3.3 Experimentos

3.3.1 Piloto 1 (P1)

Os biofilmes foram crescidos por até 10 dias, em duplicatas para cada

condição avaliada. Os fatores em estudo foram: a concentração de sacarose no

51

meio DMM (0,15% e 0,5%); o regime de suplementação por sacarose (Estático -

DMM com sacarose durante todo o período de formação dos biofilmes; semi-

dinâmico � com sacarose durante diferentes intervalos de tempo); e o tempo de

crescimento dos biofilmes (4, 7 e 10 dias). Foram 6 condições de meio (DMM, DMM

estático 0,15% e 0,5%, DMM semi-dinâmico 0,5% em 40min, 1h30min, 3h) X 3 time-

points (4, 7, 10) X 2 (duplicatas), num total de 36 biofilmes formados em 36 discos

de esmalte. As análises foram compostas por: aferições diárias de pH para

verificação do potencial cariogênico do biofilme; e determinação de

desmineralização por dureza de superfície.

3.3.2 Piloto 2 (P2)

Os biofilmes foram crescidos por até 10 dias, em triplicatas para cada

condição avaliada. Os fatores em estudo foram: a concentração de sacarose no

regime estático (DMM com 0,075% e 0,15% de sacarose); a concentração de

sacarose no regime Semi-Dinâmico (DMM com 0,15%, 0,5% e 1% de sacarose); e o

tempo de crescimento dos biofilmes (5 e 10 dias). Foram 6 condições de meio

(DMM, estático com 0,075% e 0,15%, semi-dinâmico com 0,15%, 0,5% e 1%) X 2

time-points (5, 10) X 3 (triplicatas). Formando 36 biofilmes (36 discos de esmalte) no

total. As análises foram compostas por: aferições diárias de pH; determinação de

desmineralização por dureza de superfície; e composição microbiológica do biofilme

(diluição e plaqueamento).

3.3.3 Experimento I (Exp I)

O Experimento I foi realizado para avaliação de dose-resposta do modelo. A

condição para formação dos biofilmes foi selecionada do Piloto 2, regime semi-

dinâmico � DMM com 1% de sacarose. Os biofilmes foram crescidos

independentemente por 5 dias, em quadruplicatas para cada condição avaliada. Os

fatores em estudo foram as diferentes concentrações de clorexidina (0,012%, 0,03%,

0,06% e 0,12%; lote: cs 0050508, Pharma Nostra, Anápolis, GO) utilizadas como

tratamento (imersão em 2ml de clorexidina durante 1 min/ por dia) nos biofilmes. O

experimento foi repetido de forma independente. Foram 5 tratamentos (4

concentrações de clorexidina e 1 controle) X 1 tempo de crescimento X 4

52

(quadruplicatas) X 2 (repetições). No total, 40 biofilmes foram formados nesta

condição. As análises foram compostas por: aferições diárias de pH; determinação

de desmineralização por dureza de superfície; e composição microbiológica do

biofilme através de diluição e plaqueamento.

DMM com adição de sacarose

0,075%

DMM - 18h e DMM com sacarose � 6h

0,15%

0,5%

0,012% CLX 0,06% CLX 0,03% CLX 0,12% CLX

2 inóculos

1%

0,15%

DMM - 18h e DMM com 1% sacarose � 6h

DMM

0

2 inóculos

Regime Estático Regime Semi-Dinâmico


DMM com adição de sacarose DMM e DMM com sacarose 0,5%

40min

1h 30min

3h

23h 20min

22h 30min

21h

0,15% 0,5%

DMM

CONTROLE

Clorexidina (CLX)

DMM com adição de sacarose

0,075%

DMM - 18h e DMM com sacarose � 6h

0,15%

0,5%

0,012% CLX 0,06% CLX 0,03% CLX 0,12% CLX

2 inóculos

1%

0,15%

DMM - 18h e DMM com 1% sacarose � 6h

DMM

0

2 inóculos



DMM com adição de sacarose DMM e DMM com sacarose 0,5%

40min

1h 30min

3h

23h 20min

22h 30min

21h

0,15% 0,5%

DMM

CONTROLE

Clorexidina (CLX)

3.5 Rotinas laboratoriais

3.5.1 Coleta e processamento da saliva

Foi realizada a coleta de saliva estimulada por filme de parafina (Parafilm

�M"®, American National CanTM, Chicago, Illinois, EUA) de um voluntário adulto e

saudável (M.S.A.), que não havia estado sob terapia antibiótica por 1 ano. O doador

suspendia a higiene oral por 24h previamente às coletas, que foram realizadas no

período matutino (em jejum). A saliva era depositada em um coletor graduado estéril

e transportada em gelo ao Laboratório de Microbiologia (FO-UFPel). Uma alíquota

de saliva (0,5mL) foi separada para quantificação microbiana (UFC/mL). O restante

foi homogeneizado em agitador de tubos tipo Vortex e imediatamente utilizado como

Figura 1. Representação esquemática dos estudos Piloto 1, 2 e Experimento I.

53

inóculo. Para cada experimento, a coleta de saliva foi realizada no momento de sua

utilização.

3.5.2 Protocolo de obtenção e crescimento dos biofilmes (Figura 2)

A saliva foi inoculada sobre os discos de esmalte em placas de 24 micro-

poços, em um volume de 400µL por poço. Após 1h em repouso sob temperatura

ambiente, a saliva foi delicadamente aspirada da base dos poços, e 1,8mL de meio

DMM (com ou sem sacarose) foram adicionados em cada micro-poço. Destes, o

grupo controle não recebeu suplementação de sacarose no meio (DMM). Nos

grupos de regime semi-dinâmico, a adição de DMM com sacarose foi efetuada nos

tempos (40min, 1h30min, 3h, 6h) e concentrações (0,15%, 0,5%, 1%) determinadas

em cada piloto/experimento e as placas foram incubadas. Após o período de desafio

cariogênico os discos eram enxaguados através de imersão em 2mL de solução

salina estéril, inseridos em uma nova placa contendo DMM, e novamente incubados.

Os grupos de regime receberam DMM com as concentrações de sacarose

estabelecidas (0,075%, 0,15% e 0,5%) durante todo o experimento. Os biofilmes

foram formados independentemente sobre os discos de esmalte suspensos em

dispositivos de fio ortodôntico, em cada micro-poço. As placas foram incubadas em

condição atmosférica de anaerobiose (5-10% CO2 e menos que 1% O2) em jarras

(Probac do Brasil produtos Bacteriológicos Ltda., Santa Cecília, SP) com geradores

de anaerobiose (Anaerobac- Probac) sob temperatura controlada (37ºC), e mantidas

em repouso na incubadora. Os meios, DMM com e sem adição de sacarose, foram

renovados diariamente. Após cada renovação, foi realizada a leitura de pH (pHmetro

� Quimis Aparelhos Científicos Ltda, Diadema, SP; eletrodo V621 � Analion,

Ribeirão Preto, SP) do sobrenadante, individualmente em cada micro-poço

(FILOCHE; SOMA; SISSONS, 2007). Após os tempos pré-determinados (time-

points) nos pilotos e experimento (4, 7 e 10 dias; 5 e 10 dias; 5 dias), os discos de

esmalte foram removidos dos poços com pinça estéril, e as bactérias não aderidas

foram removidas gentilmente por lavagem em 2mL de solução salina estéril

(THURNHEER et al., 2003). Os biofilmes foram removidos da superfície de esmalte

com lâminas plásticas esterizadas, depositados em micro-tubos estéreis pré-

pesados contendo esferas de vidro. Os tubos foram novamente pesados para que o

volume apropriado (1 mL/mg de biofilme, w/w) de meio de transporte reduzido (RTF)

54

fosse adicionado. A homogeneização da suspensão de biofilme foi realizada com

agitação em Vortex durante 2min. No Experimento I, uma variação foi realizada no

protocolo de remoção dos biofilmes. Estes experimentos foram realizados em

duplicatas. Na primeira, os biofilmes foram coletados como descrito anteriormente.

Na segunda, os discos de esmalte foram depositados dentro dos micro-tubos (com

esferas de vidro) contendo 1mL de RTF e vortexados por 2min.

pH

A

DC

B

E

FG

H

I

Figura 2. Ensaio in vitro de biofilme de microcosmos pela técnica de microplacas.A.Inserção individualizada dos discos em placas de 24 micro-poços. B.Inoculação com 400 µL de saliva durante 1h em repouso. C.Aspiração do inóculo. D.Adição de 1,8mL de DMM (com ou sem sacarose conforme cada delineamento experimental). E.Incubação das placas em anaerobiose à 37°C. F.Renovação ou troca dos meios (intervalos de 24h para regimes Estáticos e após períodos estabelecidos nos Semi-Dinâmicos). G.Mensuração do pH dos meios após cada troca. H.Remoção de bactérias não aderidas (solução salina estéril). I.Coleta dos biofilmes (apenas biofilme ou disco com biofilme) após cada time-point para avaliações. J.Dispersão e homogeneização dos biofilmes em RTF com agitação em vortex (2min).

J

Saliva

Solução Salina

1,8mL

400µL

Troca dos meios

Coleta do Biofilme


Homogeneização do Biofilme com o

RTF

pHpH

A

DC

B

E

FG

H

I

Figura 2. Ensaio in vitro de biofilme de microcosmos pela técnica de microplacas.A.Inserção individualizada dos discos em placas de 24 micro-poços. B.Inoculação com 400 µL de saliva durante 1h em repouso. C.Aspiração do inóculo. D.Adição de 1,8mL de DMM (com ou sem sacarose conforme cada delineamento experimental). E.Incubação das placas em anaerobiose à 37°C. F.Renovação ou troca dos meios (intervalos de 24h para regimes Estáticos e após períodos estabelecidos nos Semi-Dinâmicos). G.Mensuração do pH dos meios após cada troca. H.Remoção de bactérias não aderidas (solução salina estéril). I.Coleta dos biofilmes (apenas biofilme ou disco com biofilme) após cada time-point para avaliações. J.Dispersão e homogeneização dos biofilmes em RTF com agitação em vortex (2min).

JJ

Saliva

Solução Salina

1,8mL

400µL

Troca dos meios

Coleta do Biofilme


Homogeneização do Biofilme com o

RTF

55

3.6 Alterações no projeto original

3.6.1 Dificuldades encontradas

Em virtude do tempo despendido na adequação do Laboratório de

Microbiologia e obtenção de equipamentos necessários à pesquisa, o cronograma

previsto para iniciação dos experimentos foi alterado. Além disso, as investigações

realizadas nos experimentos piloto foram expandidas, afim de estabelecer a

resposta do esmalte a diversas concentrações e regimes de exposição a sacarose

de uma forma mais elucidativa do que havia sido prevista no projeto. Desta forma, o

experimento previsto para o teste de materais restauradores no modelo proposto

não foi realizado.

3.6.2 Revisão da literatura

A revisão da literatura foi realizada para fundamentação da dissertação. No

entanto, não foi redigida na forma de artigo pois revisões com o mesmo escopo

haviam sido recentemente publicadas.

56

4 ARTIGO Título: Development of an in vitro biofilm model for enamel demineralization and dose-response studies §

Françoise H. van de Sande*, Marina S. Azevedo, Rafael G. Lund, Maximiliano S.

Cenci

Dentistry School, Federal University of Pelotas, Brazil

Adress Rua Gonçalves Chaves, 457, Pelotas, RS, Brasil. 96015-560.

Tel./Fax: +55-53-3222-6690.

E-mail: [email protected]

§ Artigo formatado segundo as normas do periódico Archives of Oral Biology

57

ABSTRACT

The general aim of this study was to develop a laboratorial model to test

anticariogenic potencial of therapies. Specific aims were to evaluate enamel

demineralization response to cariogenic conditions induced by several sucrose

regimens in microcosm biofilms, and after setting the nutritional condition, to test the

model with a dose-response evaluation to chlorhexidine. Biofilms were initiated from

human saliva and grown up to 10 days on bovine enamel discs in multi-well plates

with defined medium with mucin (DMM), which was supplemented with sucrose

concentrations that ranged from 0.075% to 1%. Sucrose exposure occurred under

batch or semi-continuous fed. Data from acidogenicity of biofilms were collected as

pH readings from DMM supernatants and the percentual surface hardness change

(%SHC) was obtained by enamel surface hardness readings before and after

experimental runs. The results from sucrose regimens indicated that acidogenicity of

biofilms affected enamel surface hardness. Under low sucrose concentration

exposure (batch-0.075%) enamel hardness was not affected. Exposures to 0.15%

sucrose were time-dependent, as enamel surface experienced mineral loss in batch

but not in semi-continuous (6 h) fed. With 0.5% sucrose concentration a time-

dependent exposure effect was also observed in enamel hardness change.

Exposures from 40 min to 3 h sucrose-fed (up to 10 days) did not caused significant

%SHC in enamel, but increasing the exposure time to 6 h induced significant mineral

loss. Also, under 0.5%-batch severe damage to enamel surface was noted,

irrespective of the time-points evaluated (4, 7 and 10 days). The resulting eroded

surfaces excluded the possibility of %SHC evaluation, and suggested that the

constant low pH would promote erosion lesions instead of subsurface carious

lesions. Exposures to 0.5% and 1% under 6 h sucrose-fed induced similar %SHC in

58

enamel. The dose-response evaluation to chlorhexidine solution (concentrations from

0.012 to 0.12%) was taken in one regimen (semi-continuous 1% sucrose) and both

biofilm acidity and enamel mineral loss were dose-responsive to treatments. Overall,

the biofilm model assessed promoted dose-response effect to chlorhexidine and to

different sucrose feeding protocols, being suitable as a pre-clinical model for testing

the anticariogenic potential of treatments and for demineralization studies.

Keywords: biofilm, microcosm, dental plaque, demineralization, caries

59

1. Introduction

Biofilm communities naturally formed in loco are often difficult to investigate

and for most experimental conditions they present several uncontrolled variables or

ethical issues. The development of methodologies that provide the establishment of

biofilms under controlled conditions has been useful to study natural processes more

accurately.1

Laboratory-based experimental biofilm model systems have been extensively

developed. Several devices were built for this purpose, as the Constant Depth Film

Fermentor (CDFF)2, the Multiple Sorbarod Device (MSD)3, and the Multi-plaque

Artificial Mouth (MAM)4. These systems require the use of sophisticated continuous

culture equipments, some of them not commercially available neither easily

constructed. Although they provide the growth of biofilms up to several weeks, for

short-term biofilm-related studies (as anticariogenic properties) simpler methods

should be preferred.1,5 Systems where biofilms are developed on multi-well plates

seem to be advantageous alternatives to rapidly obtain results when several tests

and conditions need to be addressed.5

With respect to the microbial composition of biofilms, investigations have

focused on single-species biofilms6-8, multispecies biofilms with a predefined

community composition9-12, or microcosm biofilms.3,13-15 Each approach harbours

specific questions to be answered.1

Microcosms can be described as ecosystems that are used to mimic naturally

formed biofilms.1,16 For studies concerning supragingival plaque, a microcosm

implies the use of dental plaque or human saliva as source of inoculum for an in vitro

device.17

60

To verify anticariogenic and antibacterial properties of treatments under a

closest clinical scenario, biofilms derived from microcosm may be preferred. For

resembling dental biofilm microbial composition, they evolve under heterogenic and

diverse microbial composition. Their growth is driven by the availability of nutrients18

and atmosphere condition, and selection is not restricted from few species or groups.

Biofilm models developed in microplates were described by Guggenheim12

and Filoche19. These models are of interest because they allow biofilm growth under

simple, but controlled laboratory conditions. In this later model, which was a

microcosm model, it was shown that sucrose exposure significantly affected the

species` composition in the biofilm, similarly to what occurs in vivo and others in vitro

models19. Differences in the cariogenicity of plaque biofilms were addressed,

suggesting that the microplate model would be suitable to investigate caries-related

conditions. However, biofilms were grown over ThermanoxTM coverslips19 and no

effect from biofilm acidogenicity could be extrapolated to dental hard tissues.

In the present study a microcosm biofilm developed in micro-plates was used

to establish a model suitable for evaluation of the enamel demineralization response

to cariogenic conditions. To set the model, enamel served as substrate and biofilms

were formed under exposure to several sucrose concentrations and supplementation

regimens. Additionally, to verify if the model was dose-responsive to treatments, an

evaluation with Chlorhexidine was performed.

61

2. Materials and Methods

Ethical approval was granted by the Ethics Committee of the Dentistry School

of the Federal University of Pelotas (Pelotas, RS, Brazil).

2.1. Experimental conditions

The microcosm biofilm model described by Filoche et al.19 was used, with

modifications in this study. Human saliva was used as inoculum to provide biofilms

representative of microorganisms found in human supragingival plaque (microcosm

dental plaque). Enamel discs were used as substrate and the nutrient growth media

used for the experiments was a defined medium enriched with mucin (DMM)20. Two

independent experiments were carried out as pilot studies aiming to evaluate and set

the conditions before establishing the model. In both, biofilms were grown up to 10

days and two major conditions of cariogenic challenge were designed. Biofilms were

grown under DMM supplemented with sucrose all time in batch culture, or DMM with

and without sucrose in a semi-continuous fed-batch regimen. Different sucrose

concentrations were made for both conditions.

In Experiment I, 36 biofilms were grown; replicates (n=2) were evaluated in

three time-points (4, 7 and 10 days) and sucrose concentration was 0.15% or 0.5% in

batch and 0.5% in semi-continuous fed. Time of sucrose supplementation in semi-

continuous subgroups was 40 min, 1 h 30 min or 3 h, daily. In Experiment II, 36

biofilms were grown; replicates (n=3) were evaluated in two time-points (5 and 10

days). Biofilms were grown in batch under 0.075% or 0.15% sucrose

supplementation and in semi-continuous under 0.15%, 0.5% or 1% sucrose-fed for 6

h daily.

62

Then, in Experiment III one condition of the cariogenic challenge was selected

- semi-continuous 1% sucrose-fed; 40 biofilms were grown in two independent

experiments (n=20) up to 5 days. Replicates (n=8) were evaluated under different

concentrations of chlorhexidine treatment to assess the dose-response of the biofilm

model. Control groups were biofilms supplied with DMM in the pilot studies

(Experiment I and II) and no chlorhexidine treatment in Experiment III.

2.2. Enamel Discs

Enamel discs (5 mm diameter and 2 mm thickness) were obtained from

recently extracted bovine central incisors. A cylindrical diamond-coated drill (trephine)

was used perpendicular to the buccal surface of the teeth. Dentine and enamel

surfaces were wet ground with 400 and 800/1200/1500/2000-grit silicon carbide

papers, respectively. Both surfaces were plan- parallel. A nail varnish was applied on

the sides (enamel/dentine) and bottom (dentine) of the disc, leaving only the buccal

enamel surface exposed. The discs were fixed with a holder prepared with

orthodontic wire and kept in a vertical position during the experimental procedures.

They were autoclaved21 and kept at 4°C (humid atmosphere) until use.

2.3. Saliva collection

For each experimental run, fresh stimulated saliva was collected from a

healthy subject (female, aged 26), who had not been under antibiotic therapy for at

least one year. Fifty mL of saliva was collected in the morning (during fasting) and

the volunteer abstained from oral hygiene for 24 hours prior to collection. One aliquot

of the saliva was taken to determine the baseline microbial composition (CFUs/mL).

63

2.4. Inoculation Procedure and Microcosm Growth

Enamel discs were transferred aseptically into sterile wells (24-well tissue

culture plate; TPP - Techno Plastic Products, Trasadingen, SU) and 400 µL of fresh

homogenised saliva was dispensed onto each enamel disc. After one hour at room

temperature (22 ± 3 °C) the saliva was aspirated and 1.8 mL of growth media was

added according to the experiments and groups. DMM with 0.075%, 0.15% or 0.5%

sucrose into batch groups and DMM with 0.15%, 0.5% or 1% sucrose in semi-

continuous groups. In this last condition, after the sucrose-fed, discs were dip

washed for 10 s in sterile saline solution and transferred to a new plate with DMM.

The negative control group was supplied with DMM for all the experimental period.

Plates were incubated in an environment of 5-10% CO2, less than 1% O2 (Anaerobac

- Probac do Brasil produtos Bacteriológicos Ltda., Santa Cecília, SP, Brazil), in

anaerobic jars (Probac do Brasil produtos Bacteriológicos Ltda) for up to 10 days at

37°C without shaking. The growth media was replaced daily for all conditions.

Preceding media replacements, the plates were gently shaken and the discs

transferred to a new plate where fresh medium was added. For the Experimental

Model (III), biofilms were formed under semi-continuous 1% sucrose-fed up to 5

days. Treatments consisted in one minute immersion in 2mL of 0.012- 0.03- 0.06 or

0.12% chlorhexidine (CHX) solution freshly prepared (cs 0050508, Pharma Nostra �

Anápolis, GO, Brazil). Exposures started at the second day of the experiment and

were applied before the cariogenic challenge. After treatments, discs were dip

washed for 10 s in sterile physiological saline. The control group was treated with

sterile physiological saline under the same protocol. Final exposure to antimicrobial

agent occurred at day 4. For all experiments, after the experimental periods, discs

64

were cleaned with tooth brush and distilled water and kept at 4°C in microtubes

(humid atmosphere) until demineralization analysis.

2.5. Biofilm supernatant pH readings

After growth media replacements, each well from the discarded plate had its

pH recorded (Quimis 50w � Quimis Aparelhos Científicos Ltda., Diadema, SP, Brazil;

V621 electrode � Analion, Ribeirão Preto, SP, Brazil). Once a day for batch cultures

and twice a day for semi-continuous groups.

2.6. Biofilm microbial composition

After each time-point, discs were gently dip-washed in 2 mL of sterile

physiological saline to remove loosely adherent bacteria and placed over a sterile

tissue to absorb the liquid excess. Dental biofilm formed on enamel discs was

collected individually. They were removed with sterile plastic points and transferred

into a sterile pre-weighted microtube (1.5 mL) containing sterile glass beads. They

were weighted using an analytical balance (AUW220D, Shimadzu, Kyoto, Japan) and

biofilm wet weight was calculated. Reduced transport fluid (RTF) was added (1

mL/mg of biofilm, w/w) and the biofilm was dispersed by vortex for two minutes. Then

it was serially diluted (1:100�10-6) in RFT and 20 µL of the diluted sample was plated

in duplicate onto selective and non-selective media as follows: Brain Heart Infusion

adjusted to pH 7.2 and Blood Agar (for total microorganisms counts); Brain Heart

Infusion adjusted to pH 4.8 (for total aciduric counts); Mitis Salivarius agar (for total

streptococci counts); Mitis Salivarius agar supplemented with 0.2 units of

bacitracin/mL (for mutans streptococci) and Rogosa agar (for total lactobacilli). Plates

were incubated anaerobically for 96 h at 37 °C. The numbers of colony-forming units

65

(CFUs) were determined. Counts on selective plates were based on colony

morphology and verified by Gram-stain and cell appearance using light microscopy.

2.7. Enamel Hardness

Hardness testing of the enamel discs was performed by six indentations,

spaced 100 µm from each other, with a Knoop diamond loaded with 50 g weight for 5

s (Micro Hardness Tester FM 700, Future-Tech Corp., Kawasaki, Japan). The

surface hardness reading was performed before (sound enamel) (SH) and after

experiments (SH2). The percentage of surface hardness change was calculated

[%SHC = 100(SH2 -SH)/SH].

2.8 Statistical analysis

The null hypothesis assumed no differences for the factors treatment group

(experiment I, II and III) or time of biofilm formation (experiment I and II) or

interactions (experiment I and II), considering the response variables under study.

The assumptions of equality of variances and normal distribution of errors were

checked for each variable, and when assumptions were violated, the data were

transformed, or a corresponding non-parametric method was used. Data were

analyzed by Two-way ANOVA, followed by all pairwise comparisons (Tukey�s

method) to identify the specific differences among groups in the experiment 1, or

One-way ANOVA and Tukey�s test (experiment 2) (α = 0.05). Data were analysed

using the SAS software v. 9.0 (SAS Institute Inc., Cary, N.C., USA).

66

3 Results

3.1 Effect of sucrose regimens on pH

For experiment I, descriptive statistics are presented in table (Table 1). Lower

pH mean values from medium supernatants readings were found for 0.5%-batch.

Within semi-continuous subgroups 0.5%-3 h sucrose-fed presented slightly lower pH

mean values than 40 min- and 1 h 30 min-sucrose fed.

In Experiment II, from first to last day, the lowest pH values were found for the

supernatants of 0.5% and 1% after the sucrose-fed (p<0.05). Within the first 5 days,

0.075%-, 0.15%-batch and 0.15%-semi-continuous presented only marginal

differences compared to the control (p>0.05); up to 10 days, all groups were

statistically different from the control (p<0.05). (Figure 1)

Table 1. Experiment I. DMM supernatants pH readings are presented for sucrose regimens and control up to 4, 7 and 10 days. Semi-continuous values presented are from pH readings after the sucrose-fed. batch semi-continuous 0.5% control 0.15% 0.5% 40 min 1 h 30 min 3 h DMM 4 days 6.0 ±0.16 4.3 ±0.04 5.4 ±0.34 5.1 ±0.35 4.8 ±0.04 7.5 ±0.15 7 days 6.5 ±0.18 4.3 ±0.05 5.9 ±0.68 5.9 ±0.88 5.6 ±0.85 7.7 ±0.24 10 days 6.3 ±0.58 4.3 ±0.16 5.8 ±0.67 5.7 ±0.70 5.3 ±0.61 7.5 ±0.41 Values are means ±SD

67

In Experiment III pH readings from the supernatants began before

chlorhexidine treatment was initiated (day 1). Mean pH values after sucrose-fed were

higher for the 0.12% CHX during the treatment period. Most significant differences

were noted at day 4, corresponding to the third day of treatments. (Figure 2)

Figure 1. Experiment II. pH mean values and standard deviationare represented by bars for sucrose regimens - batch and semi-continuous after sucrose-fed - and control. Lowercase anduppercase letters are for comparisons up to 5 days and 10 days,respectively. Distinct letters shows pH values that werestatistically different within treatments (p<0.05).

a A

a a B

b C b C

a D

A

68

3.2 Percentage of surface hardness change (%SHC) in enamel

In experiment I the %SHC was statistically similar within semi-continuous

subgroups and control in all time-points evaluated - 4, 7 and 10 days (p>0.05) (Figure

3). Within batch subgroups, the %SHC of 0.5%-sucrose could not be calculated due

to the impossibility to perform hardness readings after the determined time-points;

with 0.15%-sucrose the %SHC mean values were significantly different in each time-

point (p<0.05). (Figure 3)

Figure 2. Experiment III. pH mean values are represented by shapes foreach chlorhexidine (CHX) treatment and control (saline solution) up to 4days after the 6 h sucrose-fed; day 1 represent pH mean values beforeCHX treatment began and days 2, 3 and 4 are readings from each day oftreatment. Groups connected by vertical lines represent no statisticallysignificant differencesin each day (p>0.05).

69

Sucrose exposure significantly affected %SHC within groups from batch and

semi-continuous biofilm cultures in experiment II (p<0.001). Sucrose exposures of

0.075% -batch and 0.15%-semi-continuous did not differ from the control for %SHC

(p>0.05) (Figure 4). Within semi-continuous conditions, 1% and 0.5% sucrose

exposure presented similar %SHC (p>0.05). (Figure 4)

Figure 3. Experiment I. Mean values and standard deviation ofthe percentage surface hardness change (%SHC) are presentedin bars for sucrose regimens and control up to 4, 7 and 10 days.Distinct letters shows %SHC that was statistically different withintreatments and time-points (p<0.05).

70

In experiment III, chlohrexidine treatment significanly affected %SHC in

enamel. Treatment with 0.12% solution was related to lower %SHC average values,

which were different from the control (p<0.05) but statistically similar to all other CHX

concentrations (p>0.05). (Figure 5)

Figure 4. Experiment II. Mean values and standard deviation ofthe percentage surface hardness change (%SHC) are presented in bars for sucrose regimens and control. Distinct letters shows %SHC that was statistically different within treatments (p<0.05).

71

3.3 Bacterial counts

Total colony-forming units (CFU) per sample are presented with descriptive

statistics for experiments II and III in tables (Tables 2 and 3).

Figure 5. Experiment III. Mean values and standard deviation ofthe percentage surface hardness change (%SHC) are presented in bars for chlorhexidine treatments and control (saline solution). Distinct letters shows %SHC that was statistically different within treatments (p<0.05).

72

Table 2 � Descriptive statistics for microbial recovery from biofilm growth under the different sucrose regimens up to 5 and 10 days.

Control Batch Semi-Dynamic DMM 0.075% 0.15% 0.15% S1 0.15% S2 0.50% 1% S1 1% S2

total 4,8E+04 * 7,5E+05 * 1.3E+04 * 1.3E+06 ±1.2E+06 3.7E+07 ±4.4E+07 6.0E+06 ±4.9E+06 2.4E+08 ±4.6E+08 5.2E+06 ±2.8E+06

streptococci 5.8E+04 ±4.9E+04 2.6E+05 * 2.5E+04 * 3.1E+05 * 1.2E+06 ±5.7E+05 2.7E+06 ±4.1E+06 1.3E+06 ±4.0E+05 6.6E+06 ±4.1E+06

aciduric 4.8E+04 ±6.2E+04 2.9E+04 ±4.5E+04 4.5E+03 ±6.9E+03 5.8E+04 ±6.0E+04 2.4E+04 ±2.0E+04 6.0E+05 ±9.1E+05 4.9E+05 ±7.1E+05 1.4E+06 ±1.1E+06

mutans ND ND ND ND 2.5E+02 * ND ND ND

5 d

lactobacillus ND ND 3.8E+04 * 8.2E+04 ±6,1E+04 8.3E+04 * ND 4.5E+03 * 1.9E+03 ±1,8E+02

total 1.2E+08 ±2.4E+08 ND ND 4.3E+05 ±1.6E+05 3.3E+06 ±2.6E+06 4.4E+06 ±3.1E+06 4.5E+06 ±4.1E+06 1.8E+06 ±3.5E+05

streptococci 2.5E+05 ±3.6E+04 4.5E+04 ±2.8E+04 1.4E+05 * 1.8E+05 ±1.2E+05 7.6E+05 ±5.1E+05 1.5E+06 ±9.0E+05 1.3E+06 ±1.6E+05 8.8E+05 ±4.9E+05

aciduric 6.9E+04 ±4.1E+04 1.3E+04 ±1.4E+04 4.6E+03 ±1.7E+03 1.7E+05 ±1.3E+05 2.7E+04 ±1.8E+04 1.1E+04 ±3.2E+03 5.1E+05 ±8.4E+05 6.4E+05 ±5.7E+05

mutans 3.6E+03 ±4.1E+03 ND 3.5E+02 * 3.0E+04 ±2.9E+04 1.1E+05 ±1.6E+05 4.2E+04 ±1.8E+04 7.3E+04 ±9.5E+04 4.0E+05 ±5.4E+05

10 d

lactobacillus 2.8E+05 ±3.8E+05 ND ND 4.5E+04 * 1.9E+05 * 1.8E+05 ±1.2E+05 ND 1.4E+05 ±7.5E+04

Values are mean ± SD of CFU/mg of biofilm (w/w).

ND - Not Detected

* A single replicate was recovered.

73

Table 3. Descriptive statistics for microbial recovery from biofilms growth 24h after the last chlorhexidine (%) treatment. Control 0.012% 0.03% 0.06% 0.12%

total 1.9E+08 ±1.8E+08 1.7E+08 ±3.9E+07 1.2E+08 ±4.2E+07 8.6E+07 ±5.3E+07 8.5E+07 ±4.0E+07

aciduric 6.2E+07 ±4.5E+07 9.7E+07 ±7.6E+07 4.1E+07 ±3.6E+07 4.0E+07 ±3.2E+07 2.7E+07 ±2.3E+07

mutans 1.7E+05 ±8.8E+04 1.3E+05 * 3.5E+02 * 7.5E+05 ±5.5E+05 1.3E+05 ±5.8E+04

lactobacillus 4.3E+05 * 2.5E+06 ±2.6E+06 1.1E+05 ±1.1E+05 1.1E+06 ±1.8E+06 2.1E+06 ±2.4E+06

Values are means ± SD of CFU/mg of biofilm (w/w)* a single replicate was recovered.

74

4 Discussion

The present study used a microcosm biofilm model to induce cariogenic

activity and caries-like lesions formation in bovine enamel. Only a few studies deals

with pre-clinical models using multi-well plates and a simplified experiment design to

induce cariogenic challenge in vitro5,19, and only one model has been established for

demineralization studies under a reliable clinical-like treatment protocol5. The present

model is the first to study the dose-response effect to sucrose feeding regimens and

antimicrobial treatment on enamel demineralization under microcosm biofilm growth

in a simple method, using multi-well plates and human saliva as inoculum.

Instead of pooling saliva, each microcosm was grown from one single saliva

donor. The relevance of individualizing the microcosm relies on the possibility to

observe inter-individual differences22,23 what may be of interest in further evaluations

that can be performed with this model.

Within sucrose regimens some observations can be highlighted. Under batch

0.5% sucrose supplementation severe damage on enamel surface was noted,

irrespective of the time-points evaluated (4, 7 and 10 days). The resulting eroded

surfaces excluded the possibility of SH evaluation, and suggested that a constant low

pH would promote erosion lesions instead of subsurface carious lesions. The pH

observed for that condition was approximately 4.3 during the whole experiment, and

it is in agreement to the data reported by Filoche et al.19

Furthermore, a semi-continuous sucrose supplementation seemed desirable

to form biofilms with alternated nutritional availability and alternate pH conditions,

allowing demineralization and remineralization periods. Exposures from 40 min to 3 h

sucrose-fed did not cause significant %SHC in enamel compared to the control.

75

Therefore, in experiment II, the time of sucrose exposure was increased to 6 h and a

carious-like lesion developed in enamel maintaining an intact surface.

A dose-dependent response to chlorhexidine was observed in the model, for

both pH and mineral loss variables. The chlorhexidine concentrations used aimed to

produce a bacteriostatic effect24, and treatment was performed for one minute once a

day to simulate a clinical protocol. It is important to highlight that a pre-clinical model

should demonstrate dose-response effect to therapies applied in accordance with

clinical protocols, with short periods of exposure to the treatments and fast

clearance5, which was demonstrated in the present study.

The chlorhexidine treatment was applied after 24 h from inoculation, to allow

biofilm initial establishment. Analysed data revealed that after the first exposure, pH

values arisen, and kept higher than the control, especially for the 0.12% CHX

concentration, which could be associated with a longer effect of the treatment on

bacterial acidogenicity. The CFU counts analysis did not expresse differences among

treatments. Probably this was observed because biofilms were able to recover

(recalcitrance ability)25 as samples were collected after 24 h from the latest CHX

exposure.

A randomized in vivo study reported for the salivary bacterial counts tested,

that reduction of the selected species lasted for 5 h after rinsing with 0.12%

chlorhexidine mouthwashes26. In a different microcosm model, it was shown that in

the first day of chlorhexidine pulses there was a substantial microbial reduction, but

within 4 days (with continued treatments) the viable counts had rapidly recovered27.

Nonetheless it was found an altered bacterial composition27. Those questions can be

further addressed in the presented model by sampling biofilms within different

76

periods after last treatment exposure and more sensitive microorganisms�

identification techniques.

Anticariogenic therapies and dental materials behaviour have been extensively

carried out with single species biofilm models that could be complemented by

microcosm studies. Overall the presented model has considerable potential for use in

studies into the multivariate factors that may affect the cariogenic biofilm grown over

dental surfaces.

In conclusion, different levels of cariogenic activity and demineralization of

enamel surface were shown according to the sucrose regimens. The model with

intermittent sucrose supplementation is appropriate to evaluate the dose-response to

antibiotics and for studies of demineralization. However, further studies should be

carried out to test the model reproducibility and dose-response effect to other

anticariogenic agents.

.

77

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank the undergraduate students, laboratory technicians, and Prof Dr

Evandro Piva head of CDC-Bio (Laboratory Center of Development and Control of

Biomaterials - Faculty of Dentistry, Federal University of Pelotas, Brazil).This study is

based on the first author�s master study (Graduate Program in Dentistry, Restorative

Dentistry Area, Faculty of Dentistry of Pelotas, Federal University of Pelotas, UFPel,

Brazil). The first and second authors received scholarships during this study from

CAPES � DS. PROCAD (251/2007) and PRODOC (420030/0-0) also supported this

study.

78

References

1. A. J. McBain, Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview, Adv Appl Microbiol 69 (2009) pp. 99-132.

2. A. C. Peters and J. W. Wimpenny, A constant-depth laboratory model film fermentor, Biotechnol Bioeng 32 (3) (1988) pp. 263-70.

3. A. J. McBain, C. Sissons, R. G. Ledder, P. K. Sreenivasan, W. De Vizio and P. Gilbert, Development and characterization of a simple perfused oral microcosm, J Appl Microbiol 98 (3) (2005) pp. 624-34.

4. C. H. Sissons, T. W. Cutress, M. P. Hoffman and J. S. Wakefield, A multi-station dental plaque microcosm (artificial mouth) for the study of plaque growth, metabolism, pH, and mineralization, J Dent Res 70 (11) (1991) pp. 1409-16.

5. B. Guggenheim, M. Guggenheim, R. Gmur, E. Giertsen and T. Thurnheer, Application of the Zurich biofilm model to problems of cariology, Caries Res 38 (3) (2004) pp. 212-22.

6. H. Altman, D. Steinberg, Y. Porat, A. Mor, D. Fridman, M. Friedman, et al., In vitro assessment of antimicrobial peptides as potential agents against several oral bacteria, J Antimicrob Chemother 58 (1) (2006) pp. 198-201.

7. L. Daneshmehr, K. Matin, T. Nikaido and J. Tagami, Effects of root dentin surface coating with all-in-one adhesive materials on biofilm adherence, J Dent 36 (1) (2008) pp. 33-41.

8. P. Totiam, C. Gonzalez-Cabezas, M. R. Fontana and D. T. Zero, A new in vitro model to study the relationship of gap size and secondary caries, Caries Res 41 (6) (2007) pp. 467-73.

9. S. L. Kinniment, J. W. Wimpenny, D. Adams and P. D. Marsh, Development of a steady-state oral microbial biofilm community using the constant-depth film fermenter, Microbiology 142 ( Pt 3) (1996) pp. 631-8.

10. M. Shu, L. Wong, J. H. Miller and C. H. Sissons, Development of multi-species consortia biofilms of oral bacteria as an enamel and root caries model system, Archives of Oral Biology 45 (1) (2000) pp. 27-40.

79

11. T. Thurnheer, R. Gmur, S. Shapiro and B. Guggenheim, Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque, Appl Environ Microbiol 69 (3) (2003) pp. 1702-9.

12. B. Guggenheim, E. Giertsen, P. Schupbach and S. Shapiro, Validation of an in vitro biofilm model of supragingival plaque, J Dent Res 80 (1) (2001) pp. 363-70.

13. F. Dalwai, D. A. Spratt and J. Pratten, Modeling shifts in microbial populations associated with health or disease, Appl Environ Microbiol 72 (5) (2006) pp. 3678-84.

14. L. Wong and C. H. Sissons, Human dental plaque microcosm biofilms: effect of nutrient variation on calcium phosphate deposition and growth, Arch Oral Biol 52 (3) (2007) pp. 280-9.

15. M. S. Cenci, T. Pereira-Cenci, J. A. Cury and J. M. Ten Cate, Relationship between Gap Size and Dentine Secondary Caries Formation Assessed in a Microcosm Biofilm Model, Caries Res 43 (2) (2009) pp. 97-102.

16. G. Roeselers, B. Zippel, M. Staal, M. van Loosdrecht and G. Muyzer, On the reproducibility of microcosm experiments - different community composition in parallel phototrophic biofilm microcosms, FEMS Microbiol Ecol 58 (2) (2006) pp. 169-78.

17. J. W. Wimpenny, The validity of models, Adv Dent Res 11 (1) (1997) pp. 150-9.

18. E. Zaura and J. M. ten Cate, Dental plaque as a biofilm: a pilot study of the effects of nutrients on plaque pH and dentin demineralization, Caries Res 38 Suppl 1 (2004) pp. 9-15.

19. S. K. Filoche, K. J. Soma and C. H. Sissons, Caries-related plaque microcosm biofilms developed in microplates, Oral Microbiol Immunol 22 (2) (2007) pp. 73-9.

20. L. Wong and C. Sissons, A comparison of human dental plaque microcosm biofilms grown in an undefined medium and a chemically defined artificial saliva, Arch Oral Biol 46 (6) (2001) pp. 477-86.

21. B. T. Amaechi, S. M. Higham and W. M. Edgar, Efficacy of sterilisation methods and their effect on enamel demineralisation, Caries Res 32 (6) (1998) pp. 441-6.

22. R. G. Ledder, P. Gilbert, A. Pluen, P. K. Sreenivasan, W. De Vizio and A. J. McBain, Individual microflora beget unique oral microcosms, J Appl Microbiol 100 (5) (2006) pp. 1123-31.

23. S. K. Filoche, D. Soma, M. van Bekkum and C. H. Sissons, Plaques from different individuals yield different microbiota responses to oral-antiseptic treatment, FEMS Immunol Med Microbiol (2008).

24. L. G. Ribeiro, L. N. Hashizume and M. Maltz, The effect of different formulations of chlorhexidine in reducing levels of mutans streptococci in the oral cavity: A systematic review of the literature, J Dent 35 (5) (2007) pp. 359-70.

80

25. G. G. Anderson and G. A. O'Toole, Innate and induced resistance mechanisms of bacterial biofilms, Curr Top Microbiol Immunol 322 (2008) pp. 85-105.

26. D. Herrera, S. Roldan, I. Santacruz, S. Santos, M. Masdevall and M. Sanz, Differences in antimicrobial activity of four commercial 0.12% chlorhexidine mouthrinse formulations: an in vitro contact test and salivary bacterial counts study, J Clin Periodontol 30 (4) (2003) pp. 307-14.

27. J. Pratten and M. Wilson, Antimicrobial susceptibility and composition of microcosm dental plaques supplemented with sucrose, Antimicrob Agents Chemother 43 (7) (1999) pp. 1595-9.

81

5 CONCLUSÕES

Os resultados do presente estudo permitem inferir que:

- o modelo in vitro de biofilme de microcosmo utilizado permitiu a observação

de diferentes níveis de atividade cariogênica e desmineralização na superfície do

esmalte, de acordo com diferentes exposições ao desafio com sacarose.

- o modelo com suplementação intermitente (6h) de sacarose 1% é adequado

para avaliação de dose-resposta a antimicrobianos e para estudos de

desmineralização.

Contudo, mais avaliações devem ser realizadas para avaliar a

reprodutibilidade do modelo.

82

Referências

ANDERSON, G. G.; O'TOOLE, G. A. Innate and induced resistance mechanisms of bacterial biofilms. Curr Top Microbiol Immunol, v.322, p.85-105. 2008. ANWAR, H.; STRAP, J. L.; COSTERTON, J. W. Establishment of aging biofilms: possible mechanism of bacterial resistance to antimicrobial therapy. Antimicrob Agents Chemother, v.36, n.7, p.1347-1351, Jul. 1992. BERNARDO, M.; LUIS, H.; MARTIN, M. D.; LEROUX, B. G.; RUE, T.; LEITAO, J.; DEROUEN, T. A. Survival and reasons for failure of amalgam versus composite posterior restorations placed in a randomized clinical trial. J Am Dent Assoc, v.138, n.6, p.775-783, Jun. 2007. BOWDEN, G. H.; LI, Y. H. Nutritional influences on biofilm development. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.81-99, Apr. 1997. BRADSHAW, D. J.; MCKEE, A. S.; MARSH, P. D. Effects of carbohydrate pulses and pH on population shifts within oral microbial communities in vitro. J Dent Res, v.68, n.9, p.1298-1302, Sep. 1989. CENCI, M. S.; PEREIRA-CENCI, T.; CURY, J. A.; TEN CATE, J. M. Relationship between Gap Size and Dentine Secondary Caries Formation Assessed in a Microcosm Biofilm Model. Caries Res, v.43, n.2, p.97-102, Mar 24. 2009. CENCI, M. S.; TENUTA, L. M.; PEREIRA-CENCI, T.; DEL BEL CURY, A. A.; TEN CATE, J. M.; CURY, J. A. Effect of microleakage and fluoride on enamel-dentine demineralization around restorations. Caries Res, v.42, n.5, p.369-379. 2008. DAVEY, M. E.; O'TOOLE G, A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev, v.64, n.4, p.847-867, Dec. 2000. DELIGEORGI, V.; MJOR, I. A.; WILSON, N. H. An overview of reasons for the placement and replacement of restorations. Prim Dent Care, v.8, n.1, p.5-11, Jan. 2001. DONLAN, R. M.; COSTERTON, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev, v.15, n.2, p.167-193, Apr. 2002. FEJERSKOV, O.; NYVAD, B.; LARSEN, M. J. Human experimental caries models: intra-oral environmental variability. Adv Dent Res, v.8, n.2, p.134-143, Jul. 1994.

83

FILOCHE, S. K.; SOMA, D.; VAN BEKKUM, M.; SISSONS, C. H. Plaques from different individuals yield different microbiota responses to oral-antiseptic treatment. FEMS Immunol Med Microbiol, Jul 16. 2008. FILOCHE, S. K.; SOMA, K. J.; SISSONS, C. H. Caries-related plaque microcosm biofilms developed in microplates. Oral Microbiol Immunol, v.22, n.2, p.73-79, Apr. 2007. GUGGENHEIM, B.; GUGGENHEIM, M.; GMUR, R.; GIERTSEN, E.; THURNHEER, T. Application of the Zurich biofilm model to problems of cariology. Caries Res, v.38, n.3, p.212-222, May-Jun. 2004. IMAZATO, S.; KINOMOTO, Y.; TARUMI, H.; EBISU, S.; TAY, F. R. Antibacterial activity and bonding characteristics of an adhesive resin containing antibacterial monomer MDPB. Dent Mater, v.19, n.4, p.313-319, Jun. 2003. IMAZATO, S.; KURAMOTO, A.; TAKAHASHI, Y.; EBISU, S.; PETERS, M. C. In vitro antibacterial effects of the dentin primer of Clearfil Protect Bond. Dent Mater, v.22, n.6, p.527-532, Jun. 2006. KIELBASSA, A. M.; SCHULTE-MONTING, J.; GARCIA-GODOY, F.; MEYER-LUECKEL, H. Initial in situ secondary caries formation: effect of various fluoride-containing restorative materials. Oper Dent, v.28, n.6, p.765-772, Nov-Dec. 2003. KLEINBERG, I. A mixed-bacteria ecological approach to understanding the role of the oral bacteria in dental caries causation: an alternative to Streptococcus mutans and the specific-plaque hypothesis. Crit Rev Oral Biol Med, v.13, n.2, p.108-125. 2002. LI, F.; CHAI, Z. G.; SUN, M. N.; WANG, F.; MA, S.; ZHANG, L.; FANG, M.; CHEN, J. H. Anti-biofilm effect of dental adhesive with cationic monomer. J Dent Res, v.88, n.4, p.372-376, Apr. 2009. MARSH, P. D. The role of microbiology in models of dental caries. Adv Dent Res, v.9, n.3, p.244-254; discussion 255-269, Nov. 1995. MARSH, P. D. Dental plaque: biological significance of a biofilm and community life-style. J Clin Periodontol, v.32 Suppl 6, p.7-15. 2005. MARSH, P. D. Dental plaque as a biofilm and a microbial community - implications for health and disease. BMC Oral Health, v.6 Suppl 1, p.S14. 2006. MCBAIN, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Adv Appl Microbiol, v.69, p.99-132. 2009. MJOR, I. A. Clinical diagnosis of recurrent caries. J Am Dent Assoc, v.136, n.10, p.1426-1433, Oct. 2005. MJOR, I. A.; QVIST, V. Marginal failures of amalgam and composite restorations. J Dent, v.25, n.1, p.25-30, Jan. 1997.

84

MJOR, I. A.; TOFFENETTI, F. Secondary caries: a literature review with case reports. Quintessence Int, v.31, n.3, p.165-179, Mar. 2000. OPDAM, N. J.; BRONKHORST, E. M.; ROETERS, J. M.; LOOMANS, B. A. A retrospective clinical study on longevity of posterior composite and amalgam restorations. Dent Mater, v.23, n.1, p.2-8, Jan. 2007. PAPAGIANNOULIS, L.; KAKABOURA, A.; ELIADES, G. In vivo vs in vitro anticariogenic behavior of glass-ionomer and resin composite restorative materials. Dent Mater, v.18, n.8, p.561-569, Dec. 2002. PEREIRA-CENCI, T.; CENCI, M. S.; FEDOROWICZ, Z.; MARCHESAN, M. A. Antibacterial agents in composite restorations for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev, n.3, p.CD007819. 2009. RUBY, J.; BARBEAU, J. The buccale puzzle: The symbiotic nature of endogenous infections of the oral cavity. Can J Infect Dis, v.13, n.1, p.34-41, Jan. 2002. SARRETT, D. C. Clinical challenges and the relevance of materials testing for posterior composite restorations. Dent Mater, v.21, n.1, p.9-20, Jan. 2005. SHU, M.; WONG, L.; MILLER, J. H.; SISSONS, C. H. Development of multi-species consortia biofilms of oral bacteria as an enamel and root caries model system. Archives of Oral Biology, v.45, n.1, p.27-40, Jan. 2000. SISSONS, C. H. Artificial dental plaque biofilm model systems. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.110-126, Apr. 1997. SISSONS, C. H.; CUTRESS, T. W.; HOFFMAN, M. P.; WAKEFIELD, J. S. A multi-station dental plaque microcosm (artificial mouth) for the study of plaque growth, metabolism, pH, and mineralization. J Dent Res, v.70, n.11, p.1409-1416, Nov. 1991. TANG, G.; YIP, H. K.; CUTRESS, T. W.; SAMARANAYAKE, L. P. Artificial mouth model systems and their contribution to caries research: a review. J Dent, v.31, n.3, p.161-171, Mar. 2003. TEN CATE, J. M. In situ models, physico-chemical aspects. Adv Dent Res, v.8, n.2, p.125-133, Jul. 1994. TEN CATE, J. M. Biofilms, a new approach to the microbiology of dental plaque. Odontology, v.94, n.1, p.1-9, Sep. 2006. TENUTA, L. M.; RICOMINI FILHO, A. P.; DEL BEL CURY, A. A.; CURY, J. A. Effect of sucrose on the selection of mutans streptococci and lactobacilli in dental biofilm formedin situ. Caries Res, v.40, n.6, p.546-549. 2006.

85

THURNHEER, T.; GMUR, R.; SHAPIRO, S.; GUGGENHEIM, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol, v.69, n.3, p.1702-1709, Mar. 2003. TOTIAM, P.; GONZALEZ-CABEZAS, C.; FONTANA, M. R.; ZERO, D. T. A new in vitro model to study the relationship of gap size and secondary caries. Caries Res, v.41, n.6, p.467-473. 2007. TYAS, M. J. Placement and replacement of restorations by selected practitioners. Aust Dent J, v.50, n.2, p.81-89; quiz 127, Jun. 2005. WHITE, D. J. The application of in vitro models to research on demineralization and remineralization of the teeth. Adv Dent Res, v.9, n.3, p.175-193; discussion 194-177, Nov. 1995. WIEGAND, A.; BUCHALLA, W.; ATTIN, T. Review on fluoride-releasing restorative materials--fluoride release and uptake characteristics, antibacterial activity and influence on caries formation. Dent Mater, v.23, n.3, p.343-362, Mar. 2007. WIMPENNY, J. W. The validity of models. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.150-159, Apr. 1997. WONG, L.; SISSONS, C. A comparison of human dental plaque microcosm biofilms grown in an undefined medium and a chemically defined artificial saliva. Arch Oral Biol, v.46, n.6, p.477-486, Jun. 2001.

86

Apêndices

87

Apendice 1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE) Eu, _________________________________________RG nº _______________, concordo em participar da pesquisa �DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE BIOFILME PARA AVALIAÇÃO DE POTENCIAL ANTICARIOGÊNICO DE MATERIAIS RESTAURADORES�. Sei que a minha identidade não será revelada, que as informações sobre os exames somente serão vistas pelos pesquisadores e que será mantida a minha privacidade quando da publicação dos dados em revistas de odontologia. As coletas de saliva serão realizados na clínica odontológica da pós-graduação da Faculdade de Odontologia da UFPel, por examinadores, acompanhados por um pesquisador responsável. Os procedimentos realizados durante a pesquisa não oferecem riscos à minha saúde. Os pesquisadores garantem respostas a todas perguntas e esclarecimentos sobre dúvidas. Há a possibilidade de retirada do consentimento e desistência da participação em qualquer momento, mas enquanto estiver participando da pesquisa tenho o compromisso de fornecer informação atualizada e o dever de comparecer às consultas. É assegurada a gratuidade de todas as etapas da presente pesquisa. Este documento será revisado para aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa desta Instituição de atenção à saúde. Data __/__/____. _______________________________________________ Nome e assinatura

88

Apêndice 2

Experimento 1 (experimento III no artigo). Leituras de pH dos sobrenadantes do meio realizadas após a suplementação de 6h com sacarose 1% e após 18h em DMM. O dia 1 corresponde as leituras realizadas antes do tratamento com clorexidina ser iniciado; os dias consecutivos, as leituras após os tratamentos com as respectivas concentrações de clorexidina ou controle. dias 1 2 3 4

Sacarose DMM Sacarose DMM Sacarose DMM Sacarose DMM

controle 4,03 ± 0,01a 7,24 ±0,23ab 4,20 ±0,05a 7,16 ±0,06a 3,96 ±0,01a 7,55 ±0,08a 4,27 ±0,02a 7,92 ±0,06b

0,012% 4,04 ±0,02ab 7,61 ±0,05c 5,48 ±0,37ab 7,30 ±0,05a 4,40 ±0,08a 7,51 ±0,06a 4,45 ±0,06ab 7,79 ±0,06ab

0,03% 4,18 ±0,04ab 7,37 ±0,19bc 6,03 ±0,68ab 7,23 ±0,08a 5,07 ±0,78ab 7,40 ±0,11a 4,64 ±0,20b 7,77 ±0,03a

0,06% 4,19 ±0,02ab 7,05 ±0,09a 6,38 ±0,11ab 7,15 ±0,11a 5,74 ±0,40ab 7,46 ±0,07a 4,94 ±0,20c 7,81 ±0,07ab

0,12% 4,21 ±0,02b 7,22 ±0,05ab 6,62 ±0,04b 7,31 ±0,08a 6,46 ±0,10b 7,56 ±0,05a 6,35 ±0,16d 7,81 ±0,08ab

Valores expressam as médias ± DP. Em colunas, as diferenças estatísticamente significativas entre os tratamentos p<0,05 estão representadas por letras distintas em cada dia após 6h em sacarose e 18h em DMM.

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Anexo

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