Frequência de polimorfismos nos genes responsáveis pela ... · absorção, distribuição,...

VERA KIM

Frequência de polimorfismos nos genes responsáveis pela

absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) de

medicamentos na população brasileira

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências

Programa de Ciências em Gastroenterologia

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Suzane Kioko Ono

(Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018/11, de 1 de novembro de 2011.

A versão original está disponível na Biblioteca FMUSP)

São Paulo

2018

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

©reprodução autorizada pelo autor

Responsável: Eidi Raquel Franco Abdalla - CRB-8/4901

Kim, Vera

Frequência de polimorfismos nos genes

responsáveis pela absorção, distribuição, metabolismo

e excreção (ADME) de medicamentos na população

brasileira / Vera Kim. -- São Paulo, 2018.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo.

Programa de Ciências em Gastroenterologia.

Orientadora: Suzane Kioko Ono.

Descritores: 1.Farmacogenética 2.Genes de

absorção, distribuição, metabolismo e excreção

3.Polimorfismo de nucleotídeo único 4.Sequenciamento

de nova geração 5.Brasil 6.Hepatite C

USP/FM/DBD-209/18

À Deus e aos meus pais.

AGRADECIMENTOS

A Profa. Dra. Suzane Kioko Ono, que aceitou como sua aluna de doutorado

e por sua paciência em orientar este trabalho com muitos desafios. Obrigada

pelos seus conselhos e ensinamentos.

Ao Prof. Dr. Flair Jose Carrilho, pelo apoio e suporte neste trabalho.

A Dra. Vanusa Barbosa da Divisão de Farmácia por autorizar a coleta dos

pacientes auxiliando a condução do trabalho.

Aos amigos do Hospital das Clínicas: Julia, Mariana, Denise, Chris, Felipe,

Ramon, Larissa, Victor e Rodrigo, meus agradecimentos pelo apoio e

suporte na condução deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Yujin Hoshida (Icahn School of Medicine at Mount Sinai - EUA),

agradeço por me receber em seu laboratório para realizar o doutorado

sanduíche. Aos amigos que fiz: Billie, Dassi, Naoto, Atsushi, Takaaki, Thijs,

Won-min, Sai e Sofia.

A todos os pacientes que doaram seu tempo para participarem deste

trabalho.

À equipe do laboratório de Sequenciamento em Larga Escala da Rede

PREMiUM: Dra. Suely Marie, Dra. Miriam Nishi, Dra. Luciana Montenegro,

Dra. Amanda Narcizo, Dr. Antonio Lerario e Dra. Mariana Funari.

Meus agradecimentos à CAPES (processo 1399290), Programa de

Doutorado Sanduíche no Exterior (PDSE) (processo 88881.132608/2016-01),

Fundação de Amparo à pesquisa de São Paulo (processo 2015/16291-0) e

Alves de Queiroz Family Fund for Research pelo suporte financeiro, sem os

quais esse trabalho não seria possível.

“O zombador busca sabedoria e nada encontra,

mas o conhecimento vem facilmente

ao que tem discernimento.”

Provérbios 14:6

NORMALIZACAO ADOTADA

Esta tese esta de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento

desta publicação:

Referencias: adaptado de International Committee of Medical Journals

Editors (Vancouver).

Universidade de Sao Paulo. Faculdade de Medicina. Divisao de Biblioteca e

Documentacao. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi,

Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragao, Suely Campos Cardoso,

Valeria Vilhena. 3a ed. Sao Paulo: Divisao de Biblioteca e Documentacao;

2011.

Abreviaturas dos títulos dos periodicos de acordo com List of Journals

Indexed in Index Medicus.

Sumário

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos Lista de figuras Lista de tabelas 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 1

1.1 Farmacogenética .............................................................................. 1

1.2 Polimorfismo de nucleotideo único ................................................... 2

1.3 Genes de absorção distribuição, metabolismo e excreção (ADME) . 2

1.3.1 Enzimas metabolizadoras da fase I ............................................... 2

1.3.1.1 Citocromo P450 (CYP P450) ................................................... 3

1.3.1.2 Monoxigenases contendo flavina (FMO) ................................. 5

1.3.2 Enzimas metabolizadoras da fase II .............................................. 5

1.3.2.1 UDP-glucuronyltransferases (UGT) ......................................... 6

1.3.2.2 Glutationa S-transferase (GST) ............................................... 7

1.3.2.3 N-Acetyltransferases (NAT) ..................................................... 8

1.3.3.1 Cassete de ligação de ATP (ABC) ........................................ 11

1.3.3.2 Transportadores de soluto (SLC) .......................................... 12

2. OBJETIVOS........................................................................................... 13

2.1 Objetivo primário ............................................................................. 13

2.2 Objetivo secundário ................................................................... 13

3. MÉTODOS ............................................................................................ 14

3.1 Questões éticas .............................................................................. 14

3.2 População ....................................................................................... 15

3.3 Casuística ....................................................................................... 15

3.4 Construção do painel customizado ................................................. 15

3.5 Processamento das amostras......................................................... 19

3.7 Extração de DNA genômico (DNAg) ............................................... 19

3.8 Quantificação e Fragmentação das amostras ................................ 20

3.9 Purificação das amostras ................................................................ 21

3.10 Hibridização e captura das bibliotecas .......................................... 23

3.11 Adição de índices e amplificação das bibliotecas ......................... 24

3.12 Sequenciamento de nova geração ............................................... 26

3.13 Análise de bioinformática .............................................................. 26

3.14 Controle de qualidade ................................................................... 27

4. RESULTADOS ...................................................................................... 28

4.1 Amostras do estudo ........................................................................ 28

4.2 Caracterização das amostras ......................................................... 29

4.3 Frequência do alelo menor de enzimas metabolizadoras da Fase I 30

4.4 Frequência do alelo menor de enzimas metabolizadoras da Fase II

.............................................................................................................. 31

4.5 Frequência do alelo menor transportadores ................................... 32

5. DISCUSSÃO.......................................................................................... 37

6. CONCLUSÕES ...................................................................................... 46

REFERÊNCIAS ........................................................................................... 47

ANEXOS ...................................................................................................... 59

Anexo A – Aprovação CAPPesq ........................................................... 59

Anexo B – Autorização da Divisão de Farmácia ................................... 60

Anexo C – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ..................... 61

Anexo D – Questionário ........................................................................ 65

Anexo E – Artigos publicados durante o doutorado .............................. 66

Anexo F – Material suplementar da frequência do alelo menor ............ 68

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS

% por cento

= igual a

± mais ou menos

µL microlitros

mL mililitros

rpm rotacões por minuto

1KGP Do ingles,1000 Genomes Project

AA aminoacido

ABCB cassete de ligacao de atp subfamília B

ABCC cassete de ligacao de atp subfamília C

ABCG cassete de ligacao de atp subfamília G

ADME absorcao, distribuicao, metabolismo e excrecao

AFR africano

AMO amarelo

AMR americano mixo

ATP trifosfato de adenosina

BR brasileiro

BCRP proteína de resistencia de câncer de mama

COMT catecol O-metiltransferase

CYP citocromo P450

DNA acido desoxirribonucleico

DPYD dihidropirimidina desidrogenase

EAFR ExAC africano

EAS Do ingles, East Asian

EDTA acido etilenodiamino tetra-acetico

EUR europeu

ExAC Do ingles, Exome Aggregation Consortium

FDA Do ingles, Food Drug Administration

FMO monoxigenases contendo flavina

GST glutationa S-transferase

HCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo

HCV Do ingles, Hepatitis C Virus

HWE Do ingles, Hardy–Weinberg equilibrium

JPT japones de Toquio

LAT latino

LIM Laboratorio de investigacao medica

MAF Do ingles, Minor allele frequency

MATE proteína de extrusao de farmacos e toxinas

MRP proteína de resistencia a multiplas drogas

NA Nao disponível

NAT arilamina N-acetiltransferase

NFE Do ingles, Non-Finnish European

NGO negro

NQO NAD(P)H quinona oxidorredutase

OAT transportadores de ânions orgânicos

OATP polipeptídios transportadores de ânions orgânicos

OCT transportadores de cations orgânicos

P-gp glicoproteína-P

PCR reacao em cadeia da polimerase

PRD pardo

SLC transportadores de soluto

SLCO polipeptídeo C de transporte de ânions orgânico

SNP Do ingles, Single Nucleotide Polymorphism

SULT sulfotransferase

SUS Sistema Único de Saude

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TPMT tiopurina S-metiltransferase

UGT uridina 5'-difosfo-glucuronosiltransferase

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Proporção de enzimas que contribuem para o metabolismo de

Fase I .......................................................................................................................... 3

Figura 2. Proporção de enzimas que contribuem para o metabolismo de fase

II .................................................................................................................................. 6

Figura 3. Exemplos dos efeitos do polimorfismo ADME no resultado da

exposição medicamentosa e exógena. ....................................................................... 7

Figura 4. Transportadores ABC e SLC expressos na maioria das barreiras

epiteliais. ................................................................................................................... 11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Farmacogenes analisados. .......................................................... 16

Tabela 2. Descrição dos painéis customizados ........................................... 29

Tabela 3. Características demográficas ....................................................... 29

Tabela 4. Frequências alélicas menores de polimorfismos funcionais comuns

em genes de enzimas metabolizadoras de fármacos de Fase I estratificados

por etnia baseada no 1000 Genomes Project .............................................. 34


em genes de enzimas metabolizadoras de fármacos de Fase II estratificados

por etnia baseada no 1000 Genomes Project .............................................. 35


em genes transportadores de fármacos estratificados por etnia baseada no

1000 Genomes Project ................................................................................ 36

RESUMO Kim V. Frequência de polimorfismos nos genes responsáveis pela absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) de medicamentos na população brasileira [tese]. Sao Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo; 2018. Introdução: A variação genética em genes que codificam a absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) de medicamentos frequentemente afeta a farmacocinética da droga e resulta na variabilidade da eficácia e segurança do medicamento. No entanto, a frequência da variação genética nos genes ADME diferem entre as populações. O objetivo deste estudo foi analisar as variações genéticas nos genes ADME nos pacientes brasileiros portadores do vírus da hepatite C e comparar com outros bancos de dados (1000 Genomes Project e Exome Aggregation Consortium). Métodos: Um total de 147 genes ADME foram genotipados em 100 amostras por sequenciamento de DNA genômico usando SureSelectXT (Agilent) e MiSeq, NextSeq (Illumina). Resultados: Um total de 2004 SNPs em 147 genes foram analisados, incluindo enzimas de fase I (n=50), enzimas de fase II (n=37) e transportadores (n=60). Uma coleção de variantes genéticas indica que há pelo menos 2 vezes mais variações do que semelhanças entre os pacientes com hepatite C e os principais grupos continentais. Estas diferenças foram observadas em vários genes relevantes, incluindo CYP1A2, CYP3A4, NAT2, ABCB1 e SLCO1B1. Além disso, pacientes auto declarados como branco, pardo, negro e asiático também apresentaram diferenças de frequência alélica quando comparados à europeus, americanos mixos, africanos e asiáticos nos polimorfismos dos genes CYP1A1, CYP2B6, GSTP1 e ABCG2, respectivamente. Conclusão: Concluímos que os pacientes com hepatite C tem uma frequência alélica de genes ADME diferente dos outros bancos de dados. Embora a personalização do tratamento medicamentoso com base no genótipo individual, e não na etnia, possa ser a mais apropriada, as diferenças nas frequências alélicas entre os continentes devem ser consideradas ao projetar ensaios clínicos de novos medicamentos. Descritores: farmacogenetica; genes de absorcao, distribuicao, metabolismo e excreção; diversidade genética; polimorfismo de nucleotídeo único; sequenciamento de nova geração; Brasil; hepatite C.

ABSTRACT Kim V. Frequency of polymorphisms in the genes responsible for the absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) of drugs in brazilian population [thesis]. Sao Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo”; 2018. Background: Genetic variation in genes encoding drug absorption, distribution, metabolism, and excretion (ADME) proteins often affects the drug pharmacokinetics and results in variability in drug efficacy and safety. However, the frequency of genetic variation in the ADME genes differ among populations. The aim of this study was to analyze the genetic variations in the ADME genes in Brazilian patients with hepatitis C and to compare to other databases (1000 Genomes Project e Exome Aggregation Consortium). Methods: A total of 147 ADME were genotyped in 100 samples from Brazil by targeted genomic DNA sequencing using SureSelectXT (Agilent) and MiSeq, NextSeq (Illumina). Results: A total of 2004 SNPs in 147 genes that were analyzed, including phase I enzymes (n=50), phase II enzymes (n=37), drug transporters (n=60). We provide a collection of genetic variants that indicate that there are at least 2-times more variation than similarities between patients with hepatitis C and major continental groups. These differences were observed in several relevant genes including CYP1A2, CYP3A4, NAT2, ABCB1 and SLCO1B1. Moreover, white, brown, black and Asian self-reported patients also showed allele frequency differences when compared to European, mixed American, African and Asian for polymorphisms of the genes CYP1A1, CYP2B6, GSTP1 and ABCG2. respectively. Conclusion: We conclude that the hepatitis C patients has an allele frequency of ADME genes different from other data bases. While personalization of drug treatment based on individual genotype rather than ethnicity may be more appropriate, differences in allelic frequencies across continents should be considered when designing clinical trials of new drugs. Descriptors: pharmacogenetics; absorption, distribution, metabolism and excretion genes; genetic diversity; single nucleotide polymorphism; next-generation sequencing; Brazil; hepatitis C.

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Farmacogenética

Muitos medicamentos apresentam uma variabilidade interindividual

em termos de eficácia e reações adversas indesejáveis. Esta variabilidade

pode ter impacto significativo sobre os resultados clínicos e o sucesso ou

fracasso no desenvolvimento de drogas. Embora, em parte, essa

variabilidade possa ser atribuída às características dos indivíduos, tais como

a idade, gênero, comorbidades e fatores ambientais, a variação genética é

um fator importante na resposta aos medicamentos(1, 2).

A Farmacogenética estuda as influências genéticas sobre as

respostas a medicamentos, descreve o uso da informação genética e orienta

na escolha da terapia farmacológica individual(3). A partir deste princípio, a

descoberta das variações gênicas específicas associadas a uma resposta

terapêutica, boa ou inadequada a determinado fármaco deverá permitir a

individualização das escolhas terapêuticas com base no genótipo de cada

indivíduo(4).

Recentemente, os avanços tecnológicos têm levado às mais

rentáveis e rápidas metodologias de sequenciamento. Entre elas, o

sequenciamento de nova geração é capaz de gerar informações sobre

milhões de pares de bases em uma única corrida, com uma grande

economia de tempo e custo(5). Assim, a integração da farmacogenética em

programas de saúde, pesquisa clínica e desenvolvimento de drogas pode ter

uma maior utilidade e aplicação em muitas áreas terapêuticas.

Assim, a descrição das distribuições de frequência dos polimorfismos

dos genes ADME nos pacientes portadores da hepatite C poderá contribuir

para a predição de resposta da droga e toxicidade, iniciando um novo tipo de

conduta clínica e direcionando para tratamentos personalizado.

2

1.2 Polimorfismo de nucleotideo único

As variacões nas sequencias de nucleotídeos, que ocorrem na

populacao geral, podendo ser encontradas com frequencia ≥ 1%, sao

denominados polimorfismos geneticos(6). As formas mais comuns de

ocorrerem sao atraves de delecões, mutacões, substituicões de base unica

(em ingles: Single Nucleotide Polymorphisms, ou SNPs), ou variacões no

numero de sequencias repetidas (VNTR), micro e minisatelites.

Um numero consideravel de evidencias sugerem que SNPs em

genes que codificam enzimas metabolizadoras de medicamentos e

transportadores de medicamentos envolvidas na biossíntese e reparo do

DNA, poderiam determinar a eficacia dos medicamentos e sua toxicidade(7).

O polimorfismo de nucleotídeo único é um importante marcador para

estudos farmacogenéticos, que podem ser usados para associação

fenotípica com uma variante funcional e para otimizar a terapia

medicamentosa personalizada(8). As diferenças quanto às respostas

terapêuticas entre os indivíduos geralmente estão associadas aos

polimorfismos genéticos, presentes em genes que afetam a farmacocinética

ou a farmacodinâmica(9). Tais polimorfismos podem alterar a expressão e/ou

a atividade de sítios de ligação de medicamentos, por afetarem a

estabilidade do RNA mensageiro, ou modificarem a estrutura conformacional

da proteína correspondente(10). Como consequência, essas alterações

podem levar à redução ou aumento da atividade da proteína codificada(11).

1.3 Genes de absorção distribuição, metabolismo e excreção (ADME)

1.3.1 Enzimas metabolizadoras da fase I

As enzimas de fase I são responsáveis por catalisar as reações de

oxidação, redução, hidrólise, ciclização e deciclização. Estas reações

resultam na introdução de novos grupos polares (oxidação), na modificação

3

de grupos funcionais existentes (redução) ou no desmascaramento de

grupos funcionais polares existentes (hidrólise). Muitas vezes, o produto do

metabolismo de fármacos da fase I não será suficientemente polar para ser

excretado, assim deve sofrer um metabolismo adicional por enzimas

adicionais de fase I ou fase II(12). A figura 1 mostra a proporção de enzimas

que contribuem para o metabolismo de Fase I.

FONTE: Evans, 1999(13)

Figura 1. Proporção de enzimas que contribuem para o metabolismo de Fase I

1.3.1.1 Citocromo P450 (CYP P450)

As enzimas do CYP P450 pertencem a uma superfamília de heme-

proteínas amplamente distribuídas em todos os organismos e estão

envolvidas no metabolismo de uma variedade de compostos quimicamente

diferentes(14). Essas enzimas diferem uma da outra na sua sequencia de

aminoacidos, na regulacao por agentes inibidores e indutores, e na

especificidade das reacões que catalisam. As enzimas da superfamília CYP

P450 são responsáveis por 70% a 80% de toda fase I do metabolismo

4

oxidativo de muitas drogas. Os processos metabólicos visam transformar um

fármaco em uma molécula intermediária com menor atividade biológica. Os

polimorfismos descritos nos genes CYPs têm sido frequentemente

relacionados com significantes reações a medicamentos(15, 16).

O CYP2C9 é uma das isoformas do CYP P450 responsável pela

depuração metabólica de até 15-20% de todos os fármacos submetidos ao

metabolismo de fase I(17, 18), é expresso principalmente no fígado, e o nível

de expressão é relatado como sendo o segundo mais alto entre as isoformas

do CYP(19). A variante rs1799853 do CYP2C9 (R144C 430C>T) no éxon 3 é

o alelo definidor para o haplótipo CYP2C9*2. De acordo com a maioria dos

dados in vitro, a afinidade do substrato não é afetada substancialmente pelo

haplótipo *2, mas a taxa máxima de metabolismo (Vmax) é reduzida para

aproximadamente 50% do CYP2C9*1 (tipo selvagem)(17). Indivíduos

homozigotos para esta variante apresentaram valores de depuração muito

menores para o S-acenocumarol, S-varfarina, fenitoína, tolbutamida,

ibuprofeno, natribionato, fluvastatina, fenprocumon, quando comparados a

indivíduos homozigotos para R (Arg)(20, 21). Esta variante existe em cerca de

10 a 20% da população caucasiana e é rara nas populações asiáticas e afro-

americanas(22).

O CYP2D6 é altamente polimórfico e está envolvido no metabolismo

de até 25% das drogas de uso comum na clínica(23). Esta variante rs1065852

do gene CYP2D6 (100C>T) é responsável pela atividade enzimática

diminuída encontrado em frequências altas na população asiática,

especialmente no leste asiático 42,7%(24), mas rara em populações

caucasianas(25).

O CYP2E1 é uma enzima conhecida por metabolizar o

acetaminofeno, a isoniazida, a clorzoxazona, procarcinogênios e toxinas (26,

27). Além disso, a presença de CYP3A7*2 (rs2257401) está associada com

maior concentração / razão de dose de tacrolimus(28) (figura 3).

5

1.3.1.2 Monoxigenases contendo flavina (FMO)

Há cinco membros da família FMO (FMO1-5), sendo o FMO3 o mais

estudado, devido à associação com trimetilaminúria(29). As enzimas FMO

oxigenam substratos que contêm nucleófilos geralmente com enxofre ou

nitrogênio. A função biológica da FMO é pouco compreendida, no entanto,

muitos FMOs compartilham especificidade de substrato com muitos CYPs,

mas frequentemente resultam em produtos diferentes. Os xenobióticos

metabolizados pelas enzimas FMO incluem cetoconazol e tamoxifeno(30, 31).

Ao contrário das enzimas CYP, os FMOs não requerem uma redutase para

transferir elétrons de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) e

não contêm uma porção hemossódica, além disso, as enzimas FMO não são

prontamente induzidas ou inibidas e, portanto, não são tão propensas a

interações medicamentosas(32).

1.3.2 Enzimas metabolizadoras da fase II

As enzimas de fase II são responsáveis pelas reações de conjugação,

com várias substituições hidrofílicas para formar metabólitos solúveis em

água(12, 33). A nova porção química é geralmente ativada por uma coenzima,

em seguida, transferida para um grupo funcional, tipicamente álcoois,

aminas, ácidos carboxílicos e tióis, na própria droga original ou a outra

introduzida no produto do metabolismo da fase I. Os metabólitos resultantes

são mais solúveis em água e, portanto, mais fáceis de excretar e/ou têm

atividade reduzida. As reações de fase II que desempenham o maior papel

no metabolismo de drogas incluem: glucuronidação, conjugação de

glutationa, acetilação, sulfatação, metilação e conjugação de aminoácidos. A

figura 2 mostra a proporção de enzimas que contribuem para o metabolismo

de Fase II.

6

FONTE: Evans, 1999(13) Figura 2. Proporção de enzimas que contribuem para o metabolismo de fase II

1.3.2.1 UDP-glucuronyltransferases (UGT)

A glucuronidação mediada pela enzima uridina 5'-difosfo-

glucuronosiltransferase (UGT) é uma via metabólica da fase II responsável

pelo metabolismo de aproximadamente 10% dos 200 medicamentos mais

prescritos(34), mas possui grande variação interindividual na depuração

devido ao polimorfismo genético da UGT(35).

O polimorfismo genético mais bem estabelecido das enzimas da fase

II é a variável na região TATA box presente na região promotora do gene

UGT1A1 que causa a Síndrome de Gilbert, caracterizada por uma

hiperbilirrubinemia indireta benigna que ocorre na ausência de hemólise ou

doença estrutural do fígado e a outros efeitos colaterais na utilização de

algumas drogas como o Indinavir e Irinotecan(36) (figura 3). Assim, a

presença de mutação no gene UGT1A1 em pacientes hepatopatas pode

levar ao aumento da bilirrubina sérica, supervalorizando o acometimento

hepático da condição patológica(37). Outros dados sugerem que a variação

genética da região promotora do gene UGT1A1 é alta entre pacientes com

bilirrubina maior que 1mg/dL, e que a genotipagem para UGT1A1*28 deve

7

ser considerada na avaliação dos pacientes com hepatite C crônica com

hiperbilirrubinemia(38).

FONTE: Sim, 2013(39)

Figura 3. Exemplos dos efeitos do polimorfismo ADME no resultado da exposição medicamentosa e exógena.

1.3.2.2 Glutationa S-transferase (GST)

Além das capacidades antioxidantes da glutationa na remoção de

espécies reativas de oxigênio; a conjugação da glutationa com compostos

lipofílicos endógenos e exógenos é um processo importante na redução da

toxicidade e aumento da excreção. A conjugação de glutationa é realizada

por enzimas glutationa-S-transferase (GST). Estas enzimas podem ser

divididas em sete classes baseadas na identidade de aminoácidos, alfa,

kappa, mu, ômega, pi, teta e microssomal. As GSTs são altamente

expressas e respondem por até 10% da proteína citosólica em alguns órgãos.

Essas enzimas ocorrem como um homo ou hetero dímeros com ambas as

subunidades sendo da mesma classe(40).

8

GSTs são altamente indutíveis com mais de 100 compostos

endógenos e exógenos encontrados para aumentar a expressão de GST,

muitos dos compostos que induzem GSTs são eles próprios substratos para

as enzimas(41). Genes que codificam GSTs em humanos com a maior

quantidade de intervariação individual são membros das classes do mu

(GSTM1-5), pi (GSTP1), alfa (GSTA1-4) e teta (GSTT1-2)(40). Xenobióticos

conhecidos por serem metabolizados por enzimas GST incluem N-acetil-p-

benzo-quinona imina (NAPQI); o metabolito tóxico do acetaminofeno, tiotepa,

bem como outros agentes quimioterápicos que levaram à hipótese de que as

GSTs desempenham um papel na resistência às drogas tumorais(42-44).

1.3.2.3 N-Acetyltransferases (NAT)

NAT1 e NAT2 são enzimas polimórficas com papéis importantes na

desativação ou ativação de numerosos xenobióticos em humanos. Devido à

expressão da isoenzima no fígado, as variantes genéticas do NAT2 têm sido

associadas principalmente ao metabolismo, resposta e toxicidade do

fármaco. O genótipo NAT2 confere um fenótipo de acetilação lento,

intermediário ou rápido, resultando em diferenças nas taxas metabólicas do

fármaco e suscetibilidade à toxicidade do fármaco(45).

A maioria dos estudos farmacogenéticos do gene NAT2 são aqueles

que relatam uma associação com hepatotoxicidade induzida por drogas

antituberculose. Devido à redução do metabolismo, os acetiladores lentos

NAT2 têm depuração reduzida e aumento da exposição à isoniazida e

hidrazina em comparação com os acetiladores rápidos(46). O perfil de

acetilador lento NAT2 tem sido associado a um aumento do risco de

hepatotoxicidade, lesão hepática e hepatite induzida pelo tratamento da

tuberculose em comparação com os acetiladores rápidos (e às vezes

intermediários)(47, 48). No entanto, existem numerosos estudos contraditórios

que não encontram uma associação entre o aumento do risco de

hepatotoxicidade induzida por estas drogas antituberculose e genótipo

9

acetilador lento(49, 50),ou genótipo NAT2 com reações adversas induzidas por

isoniazida em indivíduos saudáveis(51). Meta-análises sugerem que há um

risco significativamente aumentado de lesão hepática e hepatotoxicidade

induzida por drogas antituberculose em acetiladores lentos NAT2(52-54), mas

um viés de publicação para resultados positivos é relatado(52, 54).

1.3.3 Transportadores

Os transportadores de membrana desempenham papéis críticos na

movimentação de uma infinidade de substâncias endógenas e exógenas

através das membranas celulares e organelas, incluindo os principais

metabólitos de nutrientes, açúcares, peptídeos, aminoácidos e nucleosídeos,

elementos raros, como hormônios e neurotransmissores, e xenobióticos.

Esses transportadores mantêm a homeostase e medeiam processos

importantes para farmacocinética e toxicocinética. Esses transportadores

são codificados por numerosas famílias de genes, responsáveis por

aproximadamente 4% dos genes no genoma humano(55). Medicamentos

utilizados na clínica geralmente têm estruturas físico-químicas similares com

certos substratos endógenos.

Nas últimas duas décadas, uma variedade de transportadores de

membrana foram reconhecidos como transportadores de drogas. Estes

transportadores de drogas são de essencial importância na determinação da

farmacocinética, eficácia e efeitos adversos do fármaco. Assim, os

transportadores de fármacos são caracterizados por duas superfamílias

principais, os transportadores de soluto (SLC) ou os transportadores de

cassete de ligação de ATP (ABC) que podem ser funcionalmente

classificados em transportadores de influxo e efluxo de acordo com a direção

do movimento dos substratos(56).

Membros selecionados da família SLC (ou seja, transportador de

ânions orgânicos (OATs), polipeptideo transportador de ânions orgânicos

(OATPs), transportador de cátions orgânicos (OCT), transportadores de

10

cátion/carnitina orgânicos (OCTNs) e proteína de extrusão de fármacos e

toxinas (MATEs)) são apresentados em caixas azuis e membros da família

ABC (proteínas de resistência a múltiplos fármacos (MDRs), proteína de

resistência ao câncer de mama (BCRP) e proteínas associadas a resistência

a múltiplos fármacos (MRPs)) são mostradas em caixas verdes (Figura 4).

Os transportadores SLC não dependem diretamente da hidrólise de

ATP e são em grande parte, mas não exclusivamente, transportadores de

absorção; isto é, eles estão geralmente envolvidos na captação de pequenas

moléculas nas células. Por outro lado, os transportadores de fármaco ABC

utilizam hidrólise de ATP e funcionam como transportadores de efluxo.

Várias isoformas de transportadores de fármacos SLC e ABC são altamente

expressas em células epiteliais (em superfícies apicais e basolaterais) que

separam quase todos os compartimentos de fluidos corporais (incluindo

aqueles que contêm urina, líquido cefalorraquidiano ou bile), bem como no

cérebro endotelial e outras células, como as células circulantes no sangue

(57-60).

FONTE: Nigam, 2015(61)

11

Figura 4. Transportadores ABC e SLC expressos na maioria das barreiras epiteliais.

Em alguns casos, no entanto, há diferenças marcantes nas

afinidades do substrato para diferentes transportadores, além de seus

padrões de expressão de tecido relativamente distintos. Estudos de knockout

in vivo(62) e certos fenótipos clínicos humanos ajudaram a esclarecer ainda

mais a importância relativa de transportadores específicos para um

determinado medicamento ou toxina(63). Por exemplo, parece que os

principais transportadores diuréticos que funcionam paralelamente no lado

basolateral (em contato com o sangue) das células do túbulo proximal do rim

são SLC22A6 (OAT1) e SLC22A8 (OAT3), e os principais transportadores

em células do túbulo proximal do rim que trabalham em série para excreção

líquida do antidiabético metformina, parecem ser SLC22A2 (OCT2; na

superfície basolateral) e um transportador MATE (na superfície apical)(64).

1.3.3.1 Cassete de ligação de ATP (ABC)

O transportador ABCB1, também conhecido como proteína de

resistência a múltiplos fármacos 1 (MDRP1), é um dos 49 membros da

superfamília de transportadores de ABC que codificam proteínas

transportadoras e canais que funcionam como bomba de efluxo. ABCB1 é

um dos transportadores mais estudados, assim vários estudos avaliaram a

associação entre o polimorfismo multirresistência(65). De acordo com 1000

Genomes Project (1KGP) o alelo C do SNP sinônimo (Gly412Gly),

rs1128503 (G>A), varia na frequência alélica de 11 a 70% dependendo da

população étnica, sendo G o alelo menor em asiáticos e A sendo o alelo

menor em africanos. Embora muitos estudos tenham realizado a

caracterização de potenciais associações fenotípicas para este SNP

silencioso, a literatura não tem consenso(66). Como uma breve ilustração,

estudos encontraram aumento da exposição a drogas ou resposta a drogas

associada ao genótipo AA, GG, ou nenhum efeito genético foi encontrado

em relação a rs1128503(67-69).

12

1.3.3.2 Transportadores de soluto (SLC)

O gene SLC19A1 codifica a proteína 1 transportadora de folato

reduzida (RFC1), uma proteína transportadora. O RFC1 é um transportador

bidirecional de alta capacidade de 5-metil-tetra-hidrofolato e monofosfato de

tiamina. Também transporta agentes quimioterapêuticos antifolatos, como o

metotrexato, para as células. A variante mais extensamente estudada do

gene SLC19A1 é T>C (rs1051266), um polimorfismo comum não sinônimo

no exon 2 que resulta na substituição do aminoácido histidina por arginina.

As frequências genotípicas estimadas entre os caucasianos foram: TT = 0,22,

CT = 0,47, CC = 0,31. A frequência do alelo menor C foi de 58% em

hispânicos, 47% em asiáticos e 33% em africanos(70). Esta variante tem sido

amplamente estudada por sua função na captação de transporte e sua

associação com risco para doenças e resposta a drogas e toxicidade(71, 72).

13

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo primário

Analisar a frequência de polimorfismos dos genes responsáveis pela

absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) de medicamentos

em pacientes brasileiros portadores do vírus da hepatite C.

2.2 Objetivo secundário

Criar um painel de farmacogenômica personalizado que interroga a

maioria das variações genéticas importantes presentes em um conjunto de

genes responsáveis pela farmacocinética de medicamentos.

14

3. MÉTODOS

A pesquisa foi desenvolvida no ambulatório de hepatites virais da

Divisão de Gastroenterologia e Hepatologia e na Divisão de Farmácia do

HCFMUSP, no laboratório de Investigação Médica 07 (LIM07), LIM42, no

laboratório de Sequenciamento em Larga Escala (SELA) da Rede PREMiUM

da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e na Division of

Liver Diseases, Department of Medicine, Liver Cancer Program, Tisch

Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, USA no

período de maio de 2014 a julho de 2018.

3.1 Questões éticas

O protocolo de pesquisa nº 1142/09, intitulado “Frequencia do

polimorfismo no gene CYP3A4 em pacientes portadores de carcinoma

hepatocelular (CHC) e em controles sadios” foi aprovado pela Comissao de

Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) da Diretoria Clínica

do HCFMUSP no dia 17 de dezembro de 2009. Porém, o pesquisador

executante anterior desligou-se do grupo da pesquisa e a aluna Vera Kim

assumiu como pesquisador executante para finalizar o projeto incompleto.

Além disso, em virtude das novas metodologias de biologia molecular,

diminuição dos custos de sequenciamento em larga escala, e a gama de

novos medicamentos para hepatite C crônica e carcinoma hepatocelular,

acreditamos que a pesquisa de apenas um polimorfismo do gene

CYP3A4*1B seria insuficiente e inadequada em vista da atualização da

metodologia. Assim, alteramos o título e a metodologia do projeto para

“Frequencia de polimorfismos nos genes responsaveis pela absorcao,

distribuição, metabolismo e excreção (ADME) de medicamentos em

pacientes portadores de carcinoma hepatocelular e hepatite C” (Anexo A).

15

3.2 População

Brasileiros portadores do vírus da hepatite C atendidos no Hospital

das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Critérios de inclusão:

Idade superior a 18 anos;

Diagnóstico comprovado de hepatite C por sorologia e PCR.

3.3 Casuística

O recrutamento dos portadores do vírus da hepatite C foi realizado

através dos pacientes atendidos no ambulatório de hepatites virais da

Divisão de Gastroenterologia e Hepatologia e dos dados de relatórios do

SIGH de dispensação da Divisão de Farmácia (Anexo B).

Após a explicação do projeto, obtemos o termo de consentimento

livre e esclarecido (TCLE) apresentado no anexo C e realizamos uma breve

entrevista, com o objetivo de obter informações como sexo, idade, etnia,

descendência, uso de medicamentos, presença de doenças, comorbidades

entre outros no anexo D.

3.4 Construção do painel customizado

A Pharmacogenomics Knowledge Base (PharmGKB) foi usada para

pesquisar importantes genes relacionados à farmacogenômica(73). Foram

adicionados genes ADME derivados da Tabela FDA de Biomarcadores

Farmacogenômicos em Rótulos de Medicamentos(74) e genes

pharmaADME.org(75). Além disso, adicionamos farmacogenes derivados de

16

pesquisas no banco de dados PubMed usando combinações de termos

variantes para resposta a drogas, genes ADME, variações genéticas e

polimorfismos (junho de 2016). Um total de 518 farmacogenes e genes

relacionados foram incluídos nos painéis, porém para a tese selecionamos

apenas os genes responsáveis pelo metabolismo da fase I, fase II e

transportadores. Assim, está listada na tabela 1 abaixo os 147 genes,

incluindo enzimas de fase I (n = 50), fase II (n = 37) e transportadores (n =

60).

Tabela 1. Farmacogenes analisados.

Gene Nome inteiro do gene Classificação

ADH1B Alcohol Dehydrogenase 1B (Class I), Beta Polypeptide Fase I ADH1C Alcohol Dehydrogenase 1C (Class I), Gamma Polypeptide Fase I ADH7 Alcohol Dehydrogenase 7 (Class IV), Mu Or Sigma Polypeptide Fase I ALDH1A1 Aldehyde Dehydrogenase 1 Family Member A1 Fase I ALDH1A2 Aldehyde Dehydrogenase 1 Family Member A2 Fase I ALDH3A1 Aldehyde Dehydrogenase 3 Family Member A1 Fase I ALDH5A1 Aldehyde Dehydrogenase 5 Family Member A1 Fase I AOX1 Aldehyde Oxidase 1 Fase I CBR1 Carbonyl Reductase 1 Fase I CBR3 Carbonyl Reductase 3 Fase I CES2 Carboxylesterase 2 (intestine, liver) Fase I CMPK1 Cytidine/Uridine Monophosphate Kinase 1 Fase I CYB5R3 Cytochrome B5 Reductase 3 Fase I CYP11B2 Cytochrome P450, family 11, subfamily B, polypeptide 2 Fase I CYP1A1 Cytochrome P450 Family 1 Subfamily A Member 1 Fase I CYP1A2 Cytochrome P450 Family 1 Subfamily A Member 2 Fase I CYP1B1 Cytochrome P450 Family 1 Subfamily B Member 1 Fase I CYP20A1 Cytochrome P450 Family 20 Subfamily A Member 1 Fase I CYP24A1 Cytochrome P450 Family 24 Subfamily A Member 1 Fase I CYP27B1 Cytochrome P450 Family 27 Subfamily B Member 1 Fase I CYP2A13 Cytochrome P450 Family 2 Subfamily A Member 13 Fase I CYP2A6 Cytochrome P450 Family 2 Subfamily A Member 6 Fase I CYP2A7 Cytochrome P450 Family 2 Subfamily A Member 7 Fase I CYP2B6 Cytochrome P450 Family 2 Subfamily B Member 6 Fase I CYP2C19 Cytochrome P450 Family 2 Subfamily C Member 19 Fase I CYP2C8 Cytochrome P450 Family 2 Subfamily C Member 8 Fase I CYP2C9 Cytochrome P450 Family 2 Subfamily C Member 9 Fase I CYP2D6 Cytochrome P450 Family 2 Subfamily D Member 6 Fase I CYP2E1 Cytochrome P450 Family 2 Subfamily E Member 1 Fase I CYP39A1 Cytochrome P450 Family 39 Subfamily A Member 1 Fase I CYP3A4 Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 4 Fase I CYP3A43 Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 43 Fase I CYP3A5 Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 5 Fase I CYP3A7 Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 7 Fase I CYP4B1 Cytochrome P450 Family 4 Subfamily B Member 1 Fase I CYP4F11 Cytochrome P450 Family 4 Subfamily F Member 11 Fase I CYP4F2 Cytochrome P450 Family 4 Subfamily F Member 2 Fase I

17

CYP51A1 Cytochrome P450 Family 51 Subfamily A Member 1 Fase I CYP7A1 Cytochrome P450 Family 7 Subfamily A Member 1 Fase I DPYD Dihydropyrimidine Dehydrogenase Fase I EPHX1 Epoxide Hydrolase 1 Fase I FMO1 Flavin Containing Monooxygenase 1 Fase I FMO2 Flavin Containing Monooxygenase 2 Fase I FMO3 Flavin Containing Monooxygenase 3 Fase I FMO4 Flavin Containing Monooxygenase 4 Fase I GSR Glutathione-Disulfide Reductase Fase I NOS3 Nitric Oxide Synthase 3 Fase I PON1 Paraoxonase 1 Fase I PON2 Paraoxonase 2 Fase I XDH Xanthine Dehydrogenase Fase I CHST11 Carbohydrate (chondroitin 4) sulfotransferase 11 Fase II CHST2 Carbohydrate (N-acetylglucosamine-6-O) sulfotransferase 2 Fase II CHST3 Carbohydrate (chondroitin 6) sulfotransferase 3 Fase II COMT Catecol O-Metiltransferase Fase II GSTA1 Glutathione S-Transferase Alpha 1 Fase II GSTA2 Glutathione S-Transferase Alpha 2 Fase II GSTA4 Glutathione S-Transferase Alpha 4 Fase II GSTA5 Glutathione S-Transferase Alpha 5 Fase II GSTM1 Glutathione S-Transferase Mu 1 Fase II GSTM2 Glutathione S-Transferase Mu 2 Fase II GSTM3 Glutathione S-Transferase Mu 3 Fase II GSTM4 Glutathione S-Transferase Mu 4 Fase II GSTM5 Glutathione S-Transferase Mu 5 Fase II GSTP1 Glutathione S-Transferase Pi 1 Fase II GSTZ1 Glutathione S-Transferase Zeta 1 Fase II NAT1 N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) Fase II NAT2 N-acetyltransferase 2 (arylamine N-acetyltransferase) Fase II NQO1 NAD(P)H Quinone Dehydrogenase 1 Fase II SULT1A1 Sulfotransferase Family 1A Member 1 Fase II SULT1B1 Sulfotransferase Family 1B Member 1 Fase II SULT1C2 Sulfotransferase Family 1C Member 2 Fase II SULT1C4 Sulfotransferase Family 1C Member 4 Fase II SULT1E1 Sulfotransferase Family 1E Member 1 Fase II SULT2A1 Sulfotransferase Family 2A Member 1 Fase II SULT2B1 Sulfotransferase Family 2B Member 1 Fase II TPMT Thiopurine S-Methyltransferase Fase II UGT1A1 UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A1 Fase II UGT1A10 UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A10 Fase II UGT1A3 UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A3 Fase II UGT1A4 UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A4 Fase II UGT1A5 UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A5 Fase II UGT1A6 UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A6 Fase II UGT1A7 UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A7 Fase II UGT1A8 UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A8 Fase II UGT1A9 UDP Glucuronosyltransferase Family 1 Member A9 Fase II UGT2A1 UDP Glucuronosyltransferase Family 2 Member A1 Fase II UGT2B7 UDP Glucuronosyltransferase Family 2 Member B7 Fase II ABCA1 ATP Binding Cassette Subfamily A Member 1 Transportador ABCB1 ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1 Transportador ABCB11 ATP Binding Cassette Subfamily B Member 11 Transportador ABCB4 ATP Binding Cassette Subfamily B Member 4 Transportador ABCB5 ATP Binding Cassette Subfamily B Member 5 Transportador ABCB6 ATP Binding Cassette Subfamily B Member 6 Transportador

18

ABCC1 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 1 Transportador ABCC10 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 10 Transportador ABCC11 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 11 Transportador ABCC2 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 2 Transportador ABCC3 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 3 Transportador ABCC4 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 4 Transportador ABCC5 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 5 Transportador ABCC6 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 6 Transportador ABCC8 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 8 Transportador ABCC9 ATP Binding Cassette Subfamily C Member 9 Transportador ABCG1 ATP Binding Cassette Subfamily G Member 1 Transportador ABCG2 ATP Binding Cassette Subfamily G Member 2 Transportador SLC10A1 Solute Carrier Family 10 Member 1 Transportador SLC10A2 Solute Carrier Family 10 Member 2 Transportador SLC13A1 Solute Carrier Family 13 Member 1 Transportador SLC14A1 Solute Carrier Family 14 Member 1 Transportador SLC15A1 Solute Carrier Family 15 Member 1 Transportador SLC15A2 Solute Carrier Family 15 Member 2 Transportador SLC19A1 Solute Carrier Family 19 Member 1 Transportador SLC22A1 Solute Carrier Family 22 Member 1 Transportador SLC22A11 Solute Carrier Family 22 Member 11 Transportador SLC22A12 Solute Carrier Family 22 Member 12 Transportador SLC22A14 Solute Carrier Family 22 Member 14 Transportador SLC22A16 Solute Carrier Family 22 Member 16 Transportador SLC22A17 Solute Carrier Family 22 Member 17 Transportador SLC22A2 Solute Carrier Family 22 Member 2 Transportador SLC22A3 Solute Carrier Family 22 Member 3 Transportador SLC22A4 Solute Carrier Family 22 Member 4 Transportador SLC22A6 Solute Carrier Family 22 Member 6 Transportador SLC22A7 Solute Carrier Family 22 Member 7 Transportador SLC22A8 Solute Carrier Family 22 Member 8 Transportador SLC22A9 Solute Carrier Family 22 Member 9 Transportador SLC25A2 Solute Carrier Family 25 Member 2 Transportador SLC25A27 Solute Carrier Family 25 Member 27 Transportador SLC26A8 Solute Carrier Family 26 Member 8 Transportador SLC28A1 Solute Carrier Family 28 Member 1 Transportador SLC28A2 Solute Carrier Family 28 Member 2 Transportador SLC29A1 Solute Carrier Family 29 Member 1 Transportador SLC2A1 Solute Carrier Family 2 Member 1 Transportador SLC30A8 Solute Carrier Family 30 Member 8 Transportador SLC31A1 Solute Carrier Family 31 Member 1 Transportador SLC47A1 Solute Carrier Family 47 Member 1 Transportador SLC47A2 Solute Carrier Family 47 Member 2 Transportador SLC51A Solute Carrier Family 51 Alpha Subunit Transportador SLC6A4 Solute Carrier Family 6 Member 4 Transportador SLC6A6 Solute Carrier Family 6 Member 6 Transportador SLCO1A2 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1A2 Transportador SLCO1B1 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1B1 Transportador SLCO1B3 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1B3 Transportador SLCO1B7 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1B7 Transportador SLCO1C1 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1C1 Transportador SLCO2B1 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 2B1 Transportador SLCO3A1 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 3A1 Transportador SLCO4C1 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 4C1 Transportador

19

3.5 Processamento das amostras

As amostras de sangue foram coletadas em tubo contendo ácido

etilenodiamino tetra-acético (EDTA), centrifugadas (centrífuga Eppendorf®,

modelo 5415R, Hamburgo, Alemanha) por 5 minutos a 14.000 rotações por

minuto (rpm) à temperatura ambiente e separadas em creme leucocitário e

plasma, e em seguida, foram estocadas em microtubos estéreis de 2,0

mililitros (mL) em freezer -20ºC até o momento da extração do ácido

desoxirribonucleico (DNA) genômico.

Para garantir o sigilo e confidencialidade das amostras, cada

paciente recebeu um código de identificação com siglas e números.

3.7 Extração de DNA genômico (DNAg)

O DNA genômico foi isolado a partir de leucócitos utilizando o kit

QIAmp® DNA Blood mini kit (Qiagen®, Hilden, Alemanha), de acordo com

instruções do fabricante descritas a seguir. Foram adicionados 200 µL de

creme leucocitário equilibrado em temperatura ambiente a um micro tubo de

1,5 ml contendo 20 µL de proteinase K e 200 µL de buffer AL. Essa solução

foi homogeneizada por agitação em Vortex (Vortexgenie®, Bohemia, EUA)

por 15 segundos e incubado a 56º C por 10 minutos.

Após centrifugação (centrífuga Eppendorf®, modelo 5415R,

Hamburgo, Alemanha) por 10 segundos a 14.000 rpm, foram adicionados

200 µL de etanol 100% à amostra, homogeneizando por agitação.

Novamente, após breve centrifugação, essa solução foi transferida para uma

coluna contendo sílica e centrifugada por 1 min a 8.000 rpm.

O tubo coletor foi descartado em descarte apropriado. A coluna

contendo DNA genômico fixado foi transferida para um novo tubo coletor de

2mL. Foram adicionados 500 µL de buffer AW1 e centrifugado a 8.000 rpm

novamente por 1 min. Foram adicionados 500 µL s de buffer AW2 e então

centrifugado a 14.000 rpm por 3 min. A coluna foi transferida para um micro

20

tubo de 1,5 ml estéril, foram adicionados 200 µL de buffer AE. Por fim, a

amostra foi incubada a temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada a

14.000 rpm por 3 minutos.

O resultado da extração de DNAg foi analisado por eletroforese em

gel de agarose 1% (Agarose LE Uniscience®, São Paulo, Brasil) através de

comparação da intensidade das bandas com o marcador de peso molecular

“DNA Low mass ladder” (Invitrogen, Carlsbad, CA) corados com brometo de

etídio(6) e por NanoDrop (Thermo Fisher Scientific®, Estados Unidos) através

da relação 260/280 para verificar a pureza do DNA. Um valor superior a 1,80

de absorção foi aceito para análise posterior.

3.8 Quantificação e Fragmentação das amostras

Para preparo da biblioteca de DNA do painel de captura de genes,

foram utilizados os materiais, reagentes e as instruções especificadas no

protocolo SureSelectXT Target Enrichment System Kit for Illumina Paired-

End Multiplexed Sequencing Library customizado 1kb-499kb (Agilent®), com

o auxílio de uma estação de trabalho robótica BRAVO Automated Liquid

Handling Platform (Agilent®), equipada com uma pinça projetada para

prender as placas de 96 poços e uma cabeça 96 canais para prender as

pipetas, foi utilizada para o manuseio automático de líquidos.

A quantidade de DNA foi determinada usando o fluorímetro Qubit®

2.0 (Invitrogen) com os reagentes de quantificação Qubit dsDNA BR Assay.

Um valor superior a 1,7 de absorção 260/280 foi aceito para análise posterior.

As amostras foram diluídas com buffer TE 1X na concentração de

200 ng para um volume final de 50 μL para fragmentação no Covaris®. Em

seguida, utilizamos 1 μL da amostra amplificada e diluímos em 3 μL do

tampão High Sensitivity D1000 ScreenTape no TapeStation 2200 (Agilent®)

para a análise das bibliotecas em relação à qualidade, quantidade de DNA e

tamanho dos fragmentos gerados entre 150-200 pares de bases.

21

3.9 Purificação das amostras

Após a fragmentação, as bibliotecas tiveram reparos nas

extremidades de seus fragmentos. Para isso, foram adicionados em cada

reação 35,2 μL de água livre de nucleases, 10 μL de 10× End Repair Buffer,

1,6 μL de dNTP Mix, 1 μL de T4 DNA Polymerase, 2 μL de Klenow DNA

Polymerase e 2,2 μL de T4 Polynucleotide Kinase. As reações foram

incubadas no termociclador Mastercycler® pro (Eppendorf®) a 20ºC por 30

minutos e a 4ºC.

As bibliotecas foram purificadas com a utilização do protocolo de

purificação com a utilização de beads magnéticas, AMPure XP beads e uma

estante magnética. Foram adicionados 180 μL de AMPure XP beads para

cada amostra, homogeneizado com a pipeta 10 vezes para cima e para

baixo e incubado a temperatura ambiente por 5 minutos. Colocamos as

amostras na estante magnética, esperamos a separação da solução das

beads por 3-5 minutos e cuidadosamente a solução foi removida das beads.

Foi adicionado 200 μL de etanol 70% (Merck®) para cada amostra na estante

magnética e após 1 minutos o etanol foi removido, e esta etapa foi repetida

mais uma vez. Em seguida, depois de um breve aquecimento a 37ºC por 1-2

minutos no termociclador o etanol evaporou e adicionamos 15 μL de água

livre de nucleases para cada amostra e incubamos a temperatura ambiente

por 2-3 minutos. Transferimos 13 μL do sobrenadante para a placa de PCR

e as beads foram descartadas.

Após a purificação, as bibliotecas tiveram adaptadores ligados às

extremidades de seus fragmentos. Para isso, foi adicionado em cada

amostra (13 μL) o master mix de uma solução com 15,5 μL de água livre de

nucleases, 10 μL de 5× T4 DNA Ligase Buffer, 10 μL de SureSelect Adaptor

Oligo Mix diluído em água livre de nucleases 1:10, 1,5 μL de T4 DNA Ligase

e homogeneizados. As reações foram incubadas no termociclador

Mastercycler® pro (eppendorf®) a 20ºC por 15 minutos e a 4ºC.

22

As bibliotecas foram purificadas novamente adicionando 90 μL de

AMPure XP beads para cada amostra com os adaptadores ligados,

homogeneizados e incubados a temperatura ambiente por 5 minutos.

Colocamos as amostras na estante magnética, esperamos a separação da

solução das beads por 3-5 minutos e cuidadosamente a solução foi removida

das beads. Foi adicionado 200 μL de etanol 70% (Merck®) para cada

amostra na estante magnética e após 1 minutos o etanol foi removido, e esta

etapa foi repetida mais uma vez. Em seguida, depois de um breve

aquecimento a 37ºC por 1-2 minutos no termociclador o etanol evaporou e

adicionamos 32 μL de água livre de nucleases para cada amostra e

incubamos a temperatura ambiente por 2-3 minutos. Transferimos 30 μL do

sobrenadante para a placa de PCR e as beads foram descartadas.

Após a purificação, as bibliotecas tiveram as amostras amplificadas.

Para isso, foram adicionados em cada amostra (30 μL) uma solução com 6

μL de água livre de nucleases, 1,25 μL de SureSelect Primer, 1,25 μL de

SureSelect ILM Indexing Pre-Capture PCR Reverse Primer, 10 μL de 5×

Herculase II Reaction Buffer, 0,5 μL de 100 mM dNTP Mix, 1 μL de

Herculase II Fusion DNA Polymerase e homogeneizados. As reações foram

incubadas no termociclador Mastercycler® pro (eppendorf®) a 98ºC por 2

minutos, seguido de 10 ciclos a 98ºC por 30 segundos, 65ºC por 30

segundos e 72ºC por 1 minuto, seguido de 1 ciclo a 72ºC por 10 minutos e a

4ºC.

As bibliotecas foram purificadas novamente adicionando 90 μL de

AMPure XP beads para cada 50 μL da amostra amplificada,

homogeneizados e incubados a temperatura ambiente por 5 minutos.

Colocamos as amostras na estante magnética, esperamos a separação da

solução das beads por 3-5 minutos e cuidadosamente a solução foi removida

das beads. Foi adicionado 200 μL de etanol 70% (Merck®) para cada

amostra na estante magnética e após 1 minutos o etanol foi removido, e esta

etapa foi repetida mais uma vez. Em seguida, depois de um breve

aquecimento a 37ºC por 1-2 minutos no termociclador o etanol evaporou e

23

adicionamos 30 μL de água livre de nucleases para cada amostra e

incubamos a temperatura ambiente por 2-3 minutos. Transferimos 30 μL do

sobrenadante para a placa de PCR e as beads foram descartadas.

Em seguida, utilizamos 1 μL da amostra amplificada e diluímos em 3

μL do tampão High Sensitivity D1000 ScreenTape no TapeStation 2200

(Agilent®) para a análise das bibliotecas em relação à qualidade, quantidade

de DNA e tamanho dos fragmentos gerados entre 225-275 pares de bases.

3.10 Hibridização e captura das bibliotecas

Para cada biblioteca, foi preparada uma reação de hibridização, na

qual foi utilizada uma concentração de 750 ng/μL de DNA, preparado de um

volume de 3,4 μL e concentração inicial de acima de 220 ng/μL. Para isso

foram adicionados 30 μL da amostra no tubo eppendorf e desidratado a 45ºC

no concentrador a vácuo. Após a desidratação, foi adicionado 3,4 μL de

água livre de nucleases e homogeneizado com pipeta e vortex, e

centrifugado por 1 minuto. Transferimos 3,4 μL de cada amostra da

biblioteca para uma placa.

Em cada amostra, foi adicionado 5,6 μL de SureSelect Block Mix (2,5

μL de SureSelect Indexing Block 1, 2,5 μL de SureSelect Block 2, 0,6 μL de

SureSelect ILM Indexing Block 3) e homogeneizado. As reações foram

incubadas no termociclador Mastercycler® pro (eppendorf®) a 95ºC por 5

minutos e a 65ºC por pelo menos 5 minutos. Então, sem retirar as reações

do termociclador a 65ºC e adicionamos 20 μL do mix de hibridação de

captura da biblioteca preparada previamente (13μL de Hybridization Buffer

mixture, 5 μL de 10% RNAse Block, 2 μL da biblioteca) para cada amostra e

homogeneizamos 8-10 vezes para cima e para baixo com a pipeta. Em

seguida, as amostras foram incubadas a 65ºC por 24 horas com a tampa

aquecida a 105ºC no termociclador. Nessa reação ocorreu a hibridização

entre as sondas presentes no reagente SureSelect XT Custom Capture

Library e os fragmentos de DNA da biblioteca. As sondas são sequências de

24

RNA complementares as sequências de DNA presentes nos éxons dos

genes do painel de ADME. As sondas são biotiniladas, o que permite que

elas sejam separadas por afinidade com estreptavidina.

Após incubação, 200 μL das beads de estreptavidina foram

adicionados para cada amostra, homogeneizadas com a pipeta até

ressuspensão das beads e centrifugadas a temperatura ambiente por 30

minutos. Depois de uma breve centrifugação as beads foram deixadas em

uma estante magnética até a amostra clarear e tiveram seus sobrenadantes

descartados. As beads foram ressuspendidas em 200 μL de SureSelect

Wash Buffer 1 e incubadas a temperatura ambiente por 15 minutos. Depois

de uma breve centrifugação as beads foram deixadas em uma estante

magnética até a amostra clarear e tiveram seus sobrenadantes descartados.

As beads foram ressuspendidas em 200 μL de SureSelect Wash Buffer 2

previamente aquecido a 65ºC e incubadas no termociclador a 65ºC por 10

minutos. Em seguida, as beads foram deixadas em uma estante magnética

até a amostra clarear e tiveram seus sobrenadantes descartados. Esta etapa

de lavagem com SureSelect Wash Buffer 2 se repetiu por mais 3 vezes, e,

então, as amostras foram ressuspendidas em 30 μL de água livre de

nucleases.

3.11 Adição de índices e amplificação das bibliotecas

É um processo no qual são adicionadas combinações de sequências

específicas (índices) às suas extremidades 5' e 3', de modo a possibilitar a

identificação de cada amostra após o sequenciamento. Esta etapa também

amplifica o DNA das bibliotecas, com o objetivo de aumentar a quantidade

de DNA inicial que irá para o sequenciamento.

Para cada amostra foram determinadas combinações únicas de

pares de primers. Então, em cada reação, foram adicionados 18,5 μL de

água livre de nucleases, 10 μL de 5× Herculase II Reaction Buffer, 1 μL de

Herculase II Fusion DNA Polymerase, 0,5 μL de 100 mM dNTP Mix e 1 μL

25

de SureSelect ILM Indexing Post-Capture Foward PCR Primer. Em cada

reação, 0,5 μL de cada par de primer específico foi adicionado. 14 μL de

cada amostra homogeneizada com a pipeta foi adicionada e as reações

foram incubadas no termociclador a 98ºC por 2 minutos, seguidas de 16

ciclos a 98ºC por 30 segundos, 57ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto,

seguida de 1 ciclo a 72ºC por 10 minutos e 4ºC.

Adicionamos 90 μL de AMPure XP beads para cada 50 μL da

biblioteca amplificada, homogeneizados e incubados a temperatura ambiente

por 5 minutos. Colocamos as amostras na estante magnética, esperamos a

separação da solução das beads por 3-5 minutos e cuidadosamente a

solução foi removida das beads. Foi adicionado 200 μL de etanol 70%

(Merck®) para cada amostra na estante magnética e após 1 minutos o etanol

foi removido, e esta etapa foi repetida mais uma vez. Em seguida, depois de

um breve aquecimento a 37ºC por 1-2 minutos no termociclador o etanol

evaporou e adicionamos 30 μL de água livre de nucleases para cada

amostra e incubamos a temperatura ambiente por 2-3 minutos. Transferimos

30 μL do sobrenadante para a placa de PCR e as beads foram descartadas.

Em seguida, utilizamos 2 μL da amostra amplificada e diluímos em 2

μL do tampão High Sensitivity D1000 ScreenTape no TapeStation 2200

(Agilent) para a análise das bibliotecas em relação à qualidade, quantidade

de DNA e tamanho dos fragmentos gerados entre 250-350 pares de bases.

Os resultados dessa análise encontram-se na figura 4.

As bibliotecas também foram quantificadas por PCR em tempo real,

com o kit QPCR NGS Library Quantification Kit. Esse procedimento foi

realizado para se obter uma precisão maior na quantificação das bibliotecas,

o que é necessário para misturar as bibliotecas em proporções equimolares

antes de sequenciá-las. Era esperado que houvesse uma similaridade maior

na concentração calculada por cada equipamento (TapeStation e

termociclador em tempo real). Essa diferença demonstra a necessidade do

procedimento de quantificação por PCR em tempo real para o cálculo correto

de concentração das bibliotecas, já que este método é mais sensível, de

26

acordo com a equipe do laboratório de Sequenciamento em Larga Escala

(SELA) da Rede PREMiUM, que foram os responsáveis pela realização

dessas técnicas da qual acompanhei.

3.12 Sequenciamento de nova geração

As amostras preparadas para o sequenciamento de genes ADME foram

sequenciadas no MiSeq® e NextSeq®, (Illumina, San Diego, EUA)

disponibilizado pela rede PREMiUM FMUSP, utilizando os reagentes

presentes no MiSeq® Reagent Kit v2 (300 cycles) e NextSeq® 500/550 Mid

Output Kit v2 (300 cycles).

3.13 Análise de bioinformática

Os dados brutos (fastq) foram alinhados ao genoma humano 19 pelo

software BWA-MEM(76) e ordenados pela ferramenta bamsort do pacote

biobambam2(77). A chamada de variantes foi realizada pelo software

freebayes (v0.9.10-3-g47a713e)(78) de maneira simultânea em toda a

casuística, seguida de filtragem para excluir variantes com baixo suporte

estatístico e strand bias (ferramenta vcffilter do pacote vcflib)(79).

Posteriormente foi realizada a quebra das variantes multialélicas em linhas

individuais e normalização à esquerda dos inDels pelo software vt(80). A

anotação das variantes foi realizada pelo software annovar(81).

Assim, comparamos a frequência de polimorfismos dos nossos

pacientes com dois bancos de dados. O primeiro banco, o 1000 Genomes

Project (1KGP) criou o maior catálogo público de dados de variações e

genótipos humanos, com o objetivo de identificar a maioria das variantes

genéticas estudadas com frequências de pelo menos 1% nas populações.

Utilizamos a frequência do alelo menor das seguintes populações europeias

(Toscani na Itália, finlandês na Finlândia, britânico na Inglaterra e na

27

Escócia, população ibérica na Espanha e residentes de Utah), americana

mista (Ancestrais Mexicanos de Los Angeles EUA, Porto-riquenhos de Porto

Rico, colombianos de Medellín Colômbia e Peruanos de Lima Peru), africana

(Ioruba em Ibadan Nigéria, Luhya em Webuye Quênia, Gâmbia em divisões

ocidentais na Gâmbia; Mende na Serra Leoa, Esan na Nigéria SW EUA;

Caribenhos africanos em Barbados) e japonesa (japonês em Tóquio

Japão)(70).

O segundo banco, a Exome Aggregation Consortium (ExAC), é uma

coligação de investigadores que procuram agregar e harmonizar uma ampla

variedade de projetos de sequenciamento em larga escala do exoma, e

tornar os dados disponíveis para toda a comunidade científica. O conjunto de

dados abrange 60.706 indivíduos sequenciados como parte de vários

estudos genéticos de doenças específicas e da população(82).

3.14 Controle de qualidade

Testes de controle de qualidade foram realizados em dados

utilizando PLINK(83). Incluímos apenas SNPs com pelo menos 95% de taxa

de genotipagem, Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) 0,0001 e minor allele

frequency (MAF) 0,01.

28

4. RESULTADOS

4.1 Amostras do estudo

No período de outubro de 2015 a maio de 2016, foram realizadas 100

coletas de sangue de pacientes com hepatite C em seguimento no

Ambulatório do Serviço de Gastroenterologia e na Divisão de Farmácia do

Hospital das Clínicas. Um painel piloto para 16 amostras foi adquirido para

realizarmos um teste inicial. Assim, selecionamos 205 alvos que

compreendem 2026 regiões no tamanho de 324 kbp associados à

farmacocinética e farmacodinâmica de medicamentos. No total, 16 amostras

foram sequenciadas com sucesso no sequenciador MiSeq (Illumina®), porém

para a tese incluímos apenas 6 pacientes. A cobertura média foi de 113

leituras por nucleotídeo com um desvio padrão de 46 e no total 1685

variantes foram identificadas. O segundo painel para 96 amostras foi

utilizado para sequenciar 3.449 alvos que compreendem 2.557 regiões no

tamanho de 500 kbp associados à farmacocinética e farmacodinâmica de

medicamentos. No total, 96 amostras foram sequenciadas com sucesso no

sequenciador NextSeq (Illumina®), porém para a tese incluímos apenas 94

pacientes. A cobertura média foi de 93 leituras por nucleotídeo com um

desvio padrão de 19 e no total 10.804 variantes foram identificadas (Tabela

2).

29

Tabela 2. Descrição dos painéis customizados

Painel 16 Painel 96

N total/N analisado 16/6 96/94

Sequenciamento (Illumina) MiSeq NextSeq Target Enrichment System

SureSelectXT customizado

SureSelectXT customizado

Tamanho da regiao alvo (kbp) 324 500 Cobertura 99.54% 94% Media ± desvio padrao 113 ± 46× 93 ± 19× N total SNPs 1684 10804

4.2 Caracterização das amostras

A tabela 3 mostra os dados demográficos da coorte de 100 pacientes

que foram sequenciados. A maioria dos indivíduos eram do sexo masculino

(63%), idade média de 59 anos (34-74 anos) e diagnosticados com o vírus

da hepatite C.

Tabela 3. Características demográficas

Total Branco Pardo Negro Amarelo

N 100 69 15 8 8

Idade media (intervalo)

59 (34-74)

60 (34-74)

54 (39-67)

59 (43-70)

64 (55-74)

Masculino 63 45 11 5 2

Feminimo 37 24 4 3 6

BMI (intervalo) 26,9 (19–41)

26,9 (19–39)

28,6 (22–41)

26,7 (19–30)

23,6 (22–27)

Um total de 7065 SNPs passaram pelo primeiro filtro de controle de

qualidade com taxa de chamada de 0,82%. A seguir, 4231 SNPs foram

incluídos para a avaliação da prevalência genética após considerar o filtro de

controle de qualidade que remove os SNPs que não estavam em HWE

0,0001, MAF 0,01 e SNPs no cromossomo X (18 SNPs). Após o controle de

qualidade, foram selecionados 2004 SNPs de 147 farmacogenes.

As frequências do alelo menor (MAF) em genes clinicamente

relevantes envolvidos nas reações do metabolismo da fase I, fase II e

30

transportadores de fármacos estão listados nas tabelas 4, 5 e 6,

respectivamente. A MAF dos pacientes com hepatite C foi comparada entre

o banco 1KGP e ExAC. Selecionamos as enzimas de fase I como o CYP

P450 (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C19, CYP2C8, CYP2D6,

CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 e CYP4F2), monoxigenases contendo

flavina (FMO3), e dihidropirimidina desidrogenase (DPYD); enzimas de fase

II como Catecol O-Metiltransferase (COMT), arilamina N-acetiltransferase 2

(NAT2), sulfotransferase (SULT), tiopurina S-metiltransferase (TPMT) e

uridina 5'-difosfo-glucuronosiltransferase (UGT); e os transportadores como

cassete de ligação de ATP subfamília B membro 1 (ABCB1), cassete de

ligação de ATP subfamília C membro 1 e 2 (ABCC1 e ABCC2), cassete de

ligação de ATP subfamília G membro 2 (ABCG2), transportadores de soluto

(SLC22A1) e polipeptídeo C de transporte de ânions orgânico (SLCO1B1 e

SLCO1B3) são de grande relevância clínica, devido à sua associação do

alelo com a resposta e toxicidade aos medicamentos.

4.3 Frequência do alelo menor de enzimas metabolizadoras da Fase I

A frequência do alelo menor foi analisada em 655 polimorfismos de

50 genes da fase I do metabolismo. Porém, selecionamos 28 polimorfismos

de 14 genes clinicamente relevantes e comparamos a frequência do alelo

menor com 1KGP e ExAC (Tabela 4). O nosso estudo mostra que diversos

polimorfismos como o rs4079369 do gene CYP2A6 apresentam uma MAF

(6%) similar entre as etnias com o banco de dados do 1KGP (6%) e ExAC

(8%). Porém, existem diversas variantes como rs2472304 e rs2470890 do

gene CYP1A2 que apresentam uma MAF geral de 51%, enquanto o 1KGP e

ExAC mostram uma frequência de 24% e 46%, respectivamente.

Quando comparamos entre as populações de etnias similares, a

variante rs1799853 do gene CYP2C9 tem uma MAF de 13% para os

pacientes negros, enquanto o 1KGP e ExAC mostram uma MAF de 1% e 2%,

respectivamente. Por outro lado, populações com menos miscigenações,

31

como a população japonesa, apresentam uma frequência similar. O nosso

estudo com pacientes amarelos, japoneses de Tóquio do 1KGP e asiáticos

do Leste do ExAC apresentam a frequência para o alelo menor T entre 25-27%

para o polimorfismo rs2242480 do gene CYP3A4. Por outro lado, existem

diferenças demográficas em populações africanas e a frequência do alelo

menor é diferente entre elas. Os pacientes da raça negra apresentaram uma

maior diferença, não podendo comparar com populações africanas como

mostra este polimorfismo rs28371706 do gene CYP2D6 com frequência do

alelo menor de 6%, 22% segundo o 1KGP e 20% como indica o ExAC.

4.4 Frequência do alelo menor de enzimas metabolizadoras da Fase II


48 genes da fase II do metabolismo. Porém, selecionamos 21 polimorfimos

de 11 genes clinicamente relevantes e comparamos a frequência do alelo

menor com 1KGP e ExAC (Tabela5). O nosso estudo identificou

polimorfismos como rs1800822 (FMO3) apresentam uma frequência do alelo

menor T similar entre as raças brancas (7%, 6%, 5%), negras (6%, 7%, 8%)

e amarelas (25%, 23%, 20%) com o banco de dados 1KGP e ExAC,

respectivamente. Porém, existe uma diferença da frequência deste alelo

menor entre os pacientes pardos (13%), americanos mixos (23%) e latinos

(30%), onde a frequência dos americanos mixos é próximo dos pacientes da

raça amarela.

Para a variante rs1208 do gene NAT2, a frequência do alelo menor G

é similar entre as populações caucasianas da nossa coorte de brancos

(46%), EUR do 1KGP (44%) e NFE do ExAC (43%), porém para a variante

rs4680 do gene COMT a frequência do alelo menor A é diferente entre a

nossa coorte branca (37%) e os bancos de dados caucasianos EUR e NFE

(50% e 53%). Cabe ressaltar que o polimorfismo rs28365062 do gene

UGT2B7 possui uma frequência do alelo menor similar entre os brancos,

pardos e negros, porém tem a frequência diferente entre a nossa coorte de

32

raça amarela (0%), japonesa de Tóquio do 1KGP (10%) e do leste asiático

do ExAC (5%).

4.5 Frequência do alelo menor transportadores


51 genes transportadores de fármaco. Porém, selecionamos 19 polimorfimos

em 7 genes clinicamente relevantes e comparamos a frequência do alelo

menor com 1KGP e ExAC (Tabela 6). O polimorfismo rs717620 do gene

ABCC2 afeta a resposta de drogas antiepilépticas(84), influencia o

metabolismo da eritromicina(85) e está associada à toxicidade entre pacientes

tratados com fluorouracil, leucovorina e oxaliplatina(86). O nosso mostra que

este polimorfismo apresenta uma frequência do alelo menor similar entre as

etnias quando comparamos a coorte com o banco de dados 1KGP e ExAC.

Porém, existem diversas variantes como rs2306283 do gene SLC1B1 que

apresenta uma frequência do alelo menor geral de 46%, enquanto o 1KGP e

ExAC mostram uma frequência do alelo menor de 38% e 52%,

respectivamente.

A variante rs1867351 do gene SLC22A1 tem uma frequência do alelo

menor de 19% para a nossa coorte de pacientes da raça negra, enquanto o

1KGP e ExAC mostram uma frequência menor de 33% e 30%. Por outro

lado, a variante rs2231142 (G>T) do ABCG2 apresentou uma frequência do

alelo menor T de 15%, 10%, 6%, 25% entre os brancos, pardos, negros e

amarelos, respectivamente. Observamos uma frequência similar quando

comparamos com o 1KGP (9%, 14%, 1%, 32%) e ExAC (10%,24%, 3%,

30%). Este polimorfismo está associado com o aumento da concentração

plasmática de rosuvastatina(87, 88).

34

Tabela 4. Frequências alélicas menores de polimorfismos funcionais comuns em genes de enzimas metabolizadoras de fármacos de Fase I estratificados por etnia baseada no 1000 Genomes Project Gene SNP Alelo

Maior/Menor

Troca AA

BR geral

BRC PRD NGO AMO 1KGP geral

EUR AMR AFR JPT ExAC geral

NFE LAT EAFR EAS

CYP1A1 rs1048943 T>C I462V 0.13 0.12 0.13 0.06 0.19 0.13 0.03 0.35 0.01 0.21 0.09 0.03 0.39 0.01 0.24

CYP1A2 rs762551 A>C intronico 0.28 0.25 0.37 0.38 0.33 0.37 0.32 0.24 0.44 0.40 NA NA NA NA NA

rs2472304 G>A intronico 0.51 0.60 0.30 0.31 0.31 0.24 0.60 0.33 0.03 0.21 0.46 0.64 0.24 0.12 0.16

rs2470890 C>T N516N 0.50 0.59 0.27 0.31 0.31 0.24 0.60 0.33 0.03 0.21 0.46 0.65 0.23 0.11 0.16

CYP2A6 rs28399433 A>C intronico 0.08 0.08 0.03 0.0 0.50 0.13 0.07 0.10 0.08 0.28 0.10 0.07 0.14 0.08 0.23

rs1137115 C>T V17V 0.19 0.20 0.13 0.13 0.29 0.24 0.23 0.19 0.22 0.15 0.25 0.25 0.17 0.22 0.22

rs4079369 G>C intronico 0.06 0.06 0.03 0.13 0.0 0.06 0.09 0.03 0.09 0.0 0.08 0.09 0.03 0.09 0.04

CYP2B6 rs8192709 C>T R22C 0.05 0.04 0.10 0.0 0.06 0.05 0.06 0.04 0.04 0.04 0.05 0.06 0.03 0.04 0.04

rs4803419 C>T intronico 0.30 0.28 0.33 0.06 0.62 0.29 0.32 0.35 0.08 0.42 0.34 0.32 0.49 0.11 0.46

rs2279343 A>G K262R 0.28 0.27 0.30 0.44 0.17 NA NA NA NA NA 0.06 0.04 0.03 0.06 0.03

CYP2C19 rs4244285 G>A P227P 0.18 0.18 0.10 0.25 0.19 0.22 0.15 0.11 0.17 0.32 0.19 0.15 0.10 0.18 0.31

rs4986893 G>A W212X 0.02 0.0 0.0 0.0 0.25 0.01 0.0 0.0 0.0 0.07 0.01 0.0 0.0 0.0 0.07

CYP2C8 rs11572103 T>A I269F 0.03 0.01 0.03 0.13 0.0 0.05 0.0 0.01 0.19 0.0 0.02 0.00 0.01 0.16 0.0

rs1058930 G>C I264M 0.06 0.07 0.03 0.0 0.0 0.02 0.06 0.02 0.0 0.0 0.04 0.05 0.02 0.01 0.0

CYP2C9 rs1057910 A>C I359L 0.05 0.05 0.07 0.0 0.0 0.05 0.07 0.04 0.0 0.02 0.06 0.07 0.04 0.01 0.03

rs1799853 C>T R144C 0.13 0.14 0.17 0.13 0.0 0.05 0.12 0.10 0.01 0.0 0.09 0.13 0.07 0.02 0.0

CYP2D6 rs16947 G>A R296C 0.37 0.39 0.39 0.44 0.06 0.36 0.34 0.33 0.55 0.14 0.34 0.34 0.25 0.52 0.15

rs28371706 G>A T107I 0.03 0.04 0.0 0.06 0.0 0.06 0.0 0.01 0.22 0.0 0.02 0.0 0.01 0.20 0.0

rs1065852 G>A P34S 0.23 0.21 0.20 0.13 0.50 0.24 0.20 0.15 0.11 0.36 0.25 0.25 0.15 0.15 0.59

rs1135840 G>C T486S 0.41 0.40 0.43 0.44 0.44 0.40 0.45 0.52 0.32 0.5 0.46 0.45 0.64 0.36 0.30

CYP2E1 rs2515641 C>T F421F 0.20 0.17 0.27 0.19 0.25 0.30 0.13 0.18 0.66 0.20 0.17 0.11 0.17 0.61 0.17

CYP3A4 rs2242480 C>T intronico 0.23 0.19 0.20 0.56 0.25 0.42 0.08 0.39 0.85 0.27 0.23 0.10 0.44 0.74 0.26

rs2687116 A>C intronico 0.11 0.08 0.10 0.44 0.0 0.22 0.03 0.10 0.72 0.0 0.09 0.04 0.08 0.62 0.0

CYP3A5 rs1799853 C>T R144C 0.13 0.14 0.17 0.13 0.0 0.05 0.12 0.10 0.01 0.0 0.09 0.13 0.07 0.02 0.0

CYP4F2 rs2108622 C>T V433M 0.28 0.30 0.30 0.13 0.17 0.24 0.29 0.24 0.08 0.23 0.27 0.29 0.22 0.10 0.25 DPYD rs1801265 A>G R29C 0.18 0.15 0.23 0.44 0.0 0.26 0.22 0.23 0.44 0.06 0.23 0.22 0.21 0.42 0.07

FMO3 rs2266782 G>A E158K 0.43 0.41 0.47 0.44 0.06 0.35 0.37 0.32 0.50 0.21 0.38 0.41 0.31 0.47 0.20

rs1800822 C>T S147S 0.08 0.07 0.13 0.06 0.25 0.14 0.06 0.23 0.07 0.23 0.11 0.05 0.30 0.08 0.20

1KGP: 1000 Genomes Project Phase 3; AA: aminoácido; AMR: americano mixo (n=694); AFR: africano (n=1322); AMO: amarelo (n=8); BR: brasileiro (n=100); BRC: branco (n=69); CYP: citocromo P450; DPYD: dihidropirimidina desidrogenase; EAFR: ExAC africano (n=5.203); EAS: leste asiático (n=4.327); EUR: europeu (n=1006); ExAC: Exome Aggregation Consortium (n=60.706); FMO: monoxigenases contendo flavina; JPT: japonês de Tóquio, (n=208); LAT: latino (n=5.789); NA: não disponível; NFE: europeu (não finlandês) (n=33.370); NGO: negro (n=8); PRD: pardo (n=15); SNP: nucleotideo de polimorfismo único.

35

Tabela 5. Frequências alélicas menores de polimorfismos funcionais comuns em genes de enzimas metabolizadoras de fármacos de Fase II estratificados por etnia baseada no 1000 Genomes Project Gene SNP Alelo

Maior/Menor

Troca AA

BR geral

BRC PRD NGO AMO 1KG geral


NFE LAT EAFR EAS

COMT rs4818 C>G L136L 0.45 0.23 0.37 0.19 0.38 0.30 0.40 0.30 0.17 0.37 0.34 0.40 0.19 0.20 0.32

rs4680 G>A V158M 0.36 0.37 0.33 0.38 0.13 0.37 0.50 0.38 0.28 0.28 0.47 0.53 0.41 0.32 0.28

GSTP1 rs1695 A>G I105V 0.35 0.32 0.43 0.38 0.19 0.35 0.33 0.48 0.48 0.10 0.33 0.32 0.54 0.44 0.18

rs4147581 C>G intronico 0.49 0.44 0.33 0.19 0.25 0.42 0.49 0.33 0.07 0.64 0.49 0.51 0.34 0.15 0.69

GSTZ1 rs1046428 C>T M82T 0.21 0.22 0.17 0.19 0.17 0.15 0.19 0.26 0.08 0.03 0.18 0.19 0.29 0.10 0.03

rs7975 G>A E32K 0.31 0.34 0.17 0.25 0.33 0.31 0.32 0.21 0.30 0.52 0.37 0.40 0.27 0.35 0.51

NAT2 rs1208 A>G R268K 0.41 0.46 0.33 0.44 0.06 0.32 0.44 0.37 0.39 0.02 0.38 0.43 0.35 0.39 0.04

rs1799930 G>A R197Q 0.29 0.27 0.43 0.19 0.19 0.26 0.28 0.17 0.24 0.25 0.28 0.29 0.14 0.26 0.25

rs1801280 T>C I114T 0.40 0.45 0.30 0.38 0.06 0.29 0.45 0.36 0.29 0.02 0.38 0.46 0.31 0.30 0.04

NQO1 rs1800566 G>A P187S 0.27 0.26 0.30 0.31 0.33 0.29 0.21 0.33 0.18 0.35 0.25 0.19 0.41 0.19 0.45

SULT1A1 rs1801030 T>C V223M 0.05 0.01 0.07 0.31 0.0 NA NA NA NA NA 0.03 0.0 0.02 0.30 0.0

TPMT rs1800462 C>G A80P 0.01 0.01 0.0 0.0 0.0 0.0 0.01 0.01 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

UGT1A1 rs4124874 G>T intronico 0.54 0.57 0.50 0.19 0.0 0.41 0.58 0.47 0.10 0.69 NA NA NA NA NA

rs10929303 C>T UTR3 0.23 0.28 0.17 0.06 0.0 0.25 0.23 0.22 0.42 0.13 NA NA NA NA NA

rs8330 C>G UTR3 0.23 0.28 0.17 0.06 0.0 0.25 0.24 0.22 0.44 0.13 NA NA NA NA NA

rs10929302 G>A intronico 0.29 0.25 0.37 0.38 0.0 0.30 0.27 0.36 0.34 0.18 NA NA NA NA NA

UGT1A6 rs6759892 T>G S7A 0.35 0.35 0.27 0.44 0.0 0.36 0.38 0.34 0.38 0.22 0.39 0.41 0.24 0.39 0.22

UGT1A7 rs7586110 T>G intronico 0.30 0.32 0.20 0.38 0.0 0.30 0.36 0.26 0.25 0.21 NA NA NA NA NA

UGT2B7 rs28365062 A>G T245T 0.16 0.17 0.20 0.13 0.0 0.15 0.16 0.32 0.15 0.10 0.17 0.15 0.41 0.15 0.05

rs7439366 C>T Y268H 0.44 0.43 0.47 0.50 0.0 0.33 0.49 0.32 0.23 0.29 0.44 0.52 0.27 0.29 0.29

rs12233719 G>T A71S 0.02 0.0 0.0 0.0 0.31 0.03 0.0 0.01 0.0 0.13 0.01 0.0 0.01 0.0 0.14

1KGP: 1000 Genomes Project Phase 3; AA: aminoácido; AMR: americano mixo (n=694); AFR: africano (n=1322); AMO: amarelo (n=8); BR: brasileiro (n=100); BRC: branco (n=69); COMT: catecol O-metiltransferase; EAFR: ExAC africano (n=5.203); EAS: leste asiático (n=4.327); EUR: europeu (n=1006); ExAC: Exome Aggregation Consortium; GST: glutationa S-transferase; JPT: japonês de Tóquio, (n=208); LAT: latino (n=5.789); NA: não disponível; NAT: N-acetyltransferase; NFE: europeu (não finlandês) (n=33.370); NGO: negro (n=8); NQO: NAD(P)H quinona oxidorredutase; PRD: pardo (n=15); SNP: nucleotideo de polimorfismo único; SULT: sulfotransferase; TPMT: tiopurina S-metiltransferase; UGT: uridina 5'-difosfo-glucuronosiltransferase.

36

Tabela 6. Frequências alélicas menores de polimorfismos funcionais comuns em genes transportadores de fármacos estratificados por etnia baseada no 1000 Genomes Project Gene SNP Alelo

Maior/Menor

Troca AA

BR geral

BRC PRD NGO AMO 1KGP geral


NFE LAT EAFR EAS

ABCB1 rs2235015 C>A intronico 0.23 0.22 0.30 0.38 0.0 0.22 0.21 0.15 0.39 0.10 0.18 0.19 0.13 0.35 0.05

rs1128503 G>A G412G 0.37 0.38 0.37 0.19 0.44 0.42 0.42 0.40 0.14 0.60 0.46 0.43 0.0 0.19 0.64

rs1045642 G>A I1145I 0.44 0.47 0.43 0.25 0.38 0.40 0.52 0.43 0.15 0.48 0.50 0.53 0.45 0.20 0.38

rs10276036 T>C intronico 0.37 0.38 0.37 0.25 0.44 0.43 0.42 0.41 0.19 0.60 0.46 0.43 0.51 0.25 0.63

ABCC1 rs212091 T>C UTR3 0.12 0.13 0.03 0.19 0.17 0.14 0.14 0.14 0.11 0.29 NA NA NA NA NA

ABCC2 rs717620 C>T UTR5 0.18 0.19 0.20 0.06 0.13 0.13 0.21 0.17 0.03 0.19 0.17 0.20 0.12 0.06 0.22

rs2273697 G>A V417I 0.22 0.25 0.17 0.13 0.13 0.19 0.20 0.16 0.19 0.12 0.20 0.20 0.16 0.19 0.09

rs3740066 C>T I1324I 0.36 0.41 0.27 0.25 0.19 0.29 0.37 0.34 0.22 0.23 0.34 0.37 0.35 0.26 0.24

ABCG2 rs2231142 G>T Q141K 0.14 0.15 0.10 0.06 0.25 0.12 0.09 0.14 0.01 0.32 0.12 0.10 0.24 0.03 0.30

rs2231164 T>C intronico 0.32 0.25 0.40 0.38 0.44 0.43 0.13 0.40 0.77 0.47 0.25 0.13 0.49 0.69 0.46

rs2622628 C>A intronico 0.15 0.13 0.23 0.25 0.0 0.24 0.05 0.23 0.48 0.18 NA NA NA NA NA

SLC22A1 rs1867351 T>C S52S 0.28 0.25 0.30 0.19 0.50 0.28 0.18 0.29 0.33 0.47 0.25 0.21 0.37 0.30 0.40

rs683369 C>G F160L 0.18 0.20 0.20 0.0 0.13 0.12 0.21 0.11 0.01 0.13 0.17 0.22 0.08 0.04 0.14

rs2282143 C>T P341L 0.08 0.06 0.07 0.13 0.19 0.07 0.01 0.02 0.08 0.15 0.04 0.01 0.05 0.07 0.13

rs628031 G>A V408M 0.33 0.33 0.37 0.31 0.25 0.31 0.41 0.22 0.27 0.19 0.36 0.41 0.17 0.27 0.27

SLCO1B1 rs2306283 G>A N130D 0.46 0.49 0.40 0.25 0.44 0.38 0.60 0.53 0.18 0.34 0.52 0.59 0.57 0.23 0.25

rs4149056 T>C V174A 0.14 0.14 0.20 0.13 0.06 0.09 0.16 0.13 0.01 0.12 0.13 0.16 0.11 0.03 0.13

rs4149057 T>C L191L 0.49 0.46 0.40 0.25 0.44 0.37 0.61 0.50 0.14 0.34 0.53 0.62 0.52 0.20 0.25

SLCO1B3 rs7311358 A>G M233I 0.21 0.17 0.20 0.50 0.25 0.30 0.14 0.16 0.64 0.31 0.20 0.15 0.21 0.56 0.28

1KGP: 1000 Genomes Project Phase 3; AA: aminoácido; ABCB: cassete de ligação de ATP subfamília B; ABCC: cassete de ligação de ATP subfamília C; ABCG: cassete de ligação de ATP subfamília G; AMR: americano mixo (n=694); AFR: africano (n=1322); AMO: amarelo (n=8); BR: brasileiro (n=100); BRC: branco (n=69); CYP: citocromo P450; DPYD: dihidropirimidina desidrogenase; EAFR: ExAC africano (n=5.203); EAS: leste asiático (n=4.327); EUR: europeu (n=1006); ExAC: Exome Aggregation Consortium (n=60.706); JPT: japonês de Tóquio, (n=208); LAT: latino (n=5.789); NA: não disponível; NFE: europeu (não finlandês) (n=33.370); NGO: negro (n=8); PRD: pardo (n=15); SLC: transportadores de soluto; SLCO: polipeptídeo C de transporte de ânions orgânico; SNP: nucleotideo de polimorfismo único.

37

5. DISCUSSÃO

A farmacogenética está sendo usada para desenvolver terapias

personalizadas específicas para indivíduos de diferentes grupos étnicos ou

raciais. Até o momento, os estudos farmacogenéticos foram realizados

principalmente em coortes de estudos, consistindo de brancos não

hispânicos de descendência europeia. Um colapso da diversidade genética

associado à primeira colonização humana da Europa durante o período do

Paleolítico Superior, seguido pela recente mistura de ancestrais africanos,

europeus e nativos americanos resultou em diferentes grupos étnicos com

diferentes graus de diversidade genética(89). Há evidências robustas de

ensaios clínicos para diferentes condições médicas que mostram que

indivíduos de diferentes grupos étnicos experimentam respostas variáveis a

agentes terapêuticos específicos(90). As diferenças na frequência das

variantes farmacogenômicas podem influenciar a variabilidade

interpopulacional na eficácia do medicamento e no risco de reações

adversas ao medicamento (RAMs).

De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE),

o Censo Demográfico realizado em 2010, apresentou uma distribuição

percentual da população residente, segundo a cor ou raça que 47,7% eram

brancos, 43,1% eram pardos, 7,6% eram negros, 1,1% eram amarelos, 0,4%

eram indígenas e 0,0% não declarados(91). Nós investigamos a diversidade

de variantes genéticas de 147 nos principais genes de ADME de uma coorte

miscigenada de pacientes portadores do vírus da hepatite C atendidos no

HCFMUSP e comparamos com indivíduos de ascendência europeia,

africana e asiática.

Neste estudo, examinamos variações genéticas relacionadas a

ADME dentro dos principais fármacos em um conjunto de dados.

Examinando uma coorte miscigenada, relatamos um estudo de

sequenciamento direcionado de farmacogenes estabelecidos para

38

correlacionar com os bancos de dados 1000 Genomes e ExAC. A variação é

relativamente frequente dentro desses genes clinicamente importantes, com

a maioria das etnias tendo múltiplas variantes clinicamente acionáveis.

O CYP1A2 codifica um membro da família dos genes que

metabolizam o fármaco do CYP P450, importante para o metabolismo da

cafeína e dos antipsicóticos. O gene CYP1A2 é encontrado em um cluster

com CYP1A1 e CYP1B1 no cromossomo 15(92, 93). Um substrato bem

conhecido do CYP1A2 é a cafeína; indivíduos que são portadores de um ou

mais alelos do CYP1A2*1C são metabolizadores "lentos" da cafeína,

enquanto que os portadores da variante rs762551 CYP1A2*1F são

metabolizadores "rápidos" da cafeína. A mesma quantidade de cafeína

tenderá, portanto, a ter um efeito mais estimulante sobre os metabolizadores

lentos do CYP1A2 do que sobre os metabolizadores rápidos do CYP1A2. A

frequência alélica do CYP1A2*1F não varia muito entre as raças e tem

menor frequência entre os pacientes brancos (Tabela 4). Um estudo de

mulheres saudáveis não hormonais na pré-menopausa concluiu que as

bebedoras de 3 ou mais xícaras de café por dia tendiam a ter menor volume

mamário, mas somente se tivessem pelo menos um alelo rs762551 (C) (p =

0,02), que foi considerado consistente com relatos de que o café protege

apenas portadores do alelo C contra o câncer de mama(94).

O CYP2C19 é clinicamente importante para o metabolismo de

medicamentos, incluindo clopidogrel(95) e omeprazol(96). Por exemplo, para o

clopidogrel recomenda-se uma terapia antiplaquetária alternativa (por

exemplo: prasugrel, ticagrelor) para metabolizadores pobres ou

intermediários(97). Para metabolizadores ultra-rápidos do CYP2C19,

considera-se o aumento da dose de omeprazol de 100 a 200%(98). Sabe-se

que o CYP2C19*2 (rs4244285) e *3 (rs4986893) afetam o metabolismo e/ou

as respostas de vários medicamentos comumente prescritos, incluindo

antidepressivos(99-101), drogas antiplaquetárias e antiulcerosas(102). O alelo

mais comumente mutado é o CYP2C19*2 em caucasianos metabolizadores

lentos(102), enquanto o CYP2C19*3 é raro entre os indivíduos

39

caucasianos(103). No presente estudo, descobrimos os mesmos resultados de

que a incidência de CYP2C19*2 entre os pacientes brancos (18%) foi

semelhante à encontrada em outras populações caucasianas, 1KGP (15%) e

ExAC (15%), enquanto o CYP2C19*3 também é raro na nossa coorte branca

(0%).

O tratamento com omeprazol para reduzir o Helicobacter pylori

mostrou variar dependendo do genótipo CYP2C19 de um paciente, variando

de 28% a 100% em pacientes homozigotos para alelos do CYP2C19 que

codificam proteínas totalmente funcionais levando a metabolismo deficiente.

O fato de que metabolizadores lentos para muitos CYPs P450 alcançam

maior sucesso terapêutico para algumas drogas, as concentrações efetivas

são maiores e mais duradouras(104). No entanto, outras drogas claramente

atuam abaixo do esperado em portadores de alelos CYP2C19 de função

reduzida. Um exemplo de tal droga é o clopidogrel, que acrescentou um

alerta na caixa do FDA, alertando pacientes e profissionais de saúde que a

droga pode ser menos eficaz em pessoas que têm variantes do CYP2C19

que não podem converter a droga efetivamente em sua forma ativa. Estudos

recentes chegam a conclusões semelhantes sobre as consequências dos

portadores do alelo CYP2C19*2 prescritos com clopidogrel para reduzir seu

risco cardiovascular. Um estudo de 245 pacientes franceses com menos de

45 anos de idade que receberam clopidogrel após sobreviverem a um

primeiro ataque cardíaco concluiu que portadores de alelo rs4244285 (A)

estavam com risco 4x maior (IC: 1,81-9,02, p = 0,0006) para eventos

cardiovasculares adversos subsequentes(105).

O CYP2C8 é uma enzima metabolizadora de fase I que desempenha

um papel integral na biotransformação de compostos xenobióticos e

endógenos estruturalmente diversos. O rs11572103 (c.805A>T; p.I269F) é

designado como CYP2C8*2 e está localizado no éxon 5. O CYP2C8*2 é

comum em africanos (19%), mas é raro em brancos e asiáticos(106). Os

resultados são similares para a frequência na nossa coorte negra de 13% e

raro para os pacientes brancos e amarelos, 1% e 0%, respectivamente

40

(tabela 4). In vitro, o CYP2C8*2 foi associado a uma diminuição da atividade

enzimática e a uma menor depuração intrínseca de paclitaxel, amodiaquina

e repaglinida em comparação com a enzima do tipo selvagem(106-109).

O SNP rs1057910 (A), localizada no gene CYP2C9 do citocromo

P450 codifica mais comumente o aminoácido isoleucina na posição 359, e o

alelo resultante também é conhecido como CYP2C9*1. O rs1057910 (C)

codifica uma leucina nesta mesma posição e o alelo resultante é

denominado CYP2C9*3. Este SNP também é conhecido como Ile359Leu,

indivíduos portadores deste SNP podem apresentar risco aumentado de

desenvolver sangramento gastrointestinal agudo durante o uso de AINEs,

como o aceclofenaco, celecoxibe, diclofenaco e ibuprofeno(110). Além disso,

um risco de reações adversas cutâneas graves ao tomar fenitoína droga

antiepiléptica(111). Segundo o 1KGP, o alelo CYP2C9*3 tem uma frequência

de 7% em EUR, 4% em AMR, 0% em AFR e 2% em japoneses. Nossos

resultados corroboram com as frequências alélicas de 5%, 7%, 0% e 0% nos

pacientes brancos, pardos, negros e amarelos, respectivamente. Esse

achado é semelhante ao de outras populações do nas quais a frequência do

alelo CYP2C9*3 (Tabela 4). Frequências mais baixas foram relatadas para a

variante CYP2C9*3 em populações do leste asiático; 1,1–2,1% em

japonês(112) e coreano(113) e a maior frequência de CYP2C9*3 foi relatada em

indivíduos da Sri Lanka Tamil residentes na Inglaterra (0,5%)(70).

Nakamura et al.(114) sugerem que instabilidades térmicas e redução

da depuração intrínseca pela proteína codificada pelo alelo rs1065852 (T)

são as principais razões pelas quais os asiáticos apresentam atividades

metabólicas mais baixas do que os caucasianos para drogas metabolizadas

principalmente pelo CYP2D6, uma vez que este (T) alelo ocorre em maior

frequência em asiáticos. Em mulheres coreanas com câncer de mama

metastático, o genótipo CYP2D6*10 está associado com concentrações

plasmáticas de endoxifeno no estado estacionário significativamente mais

baixas (o metabólito ativo do tamoxifeno), e é encontrado com mais

frequência entre os não respondedores(115), embora outro grande estudo

41

randomizado (BIG 1-98) envolvendo principalmente pacientes brancos

(>98%) não tenha encontrado tal associação entre variantes do CYP2D6 e

controle da doença(116). A frequência alélica do CYP2D6*10 (rs1065852)

varia entre os diferentes grupos étnicos: 21% em brancos, 20% em pardos,

13% em negros, e 50% em amarelos (tabela 4).

O CYP4F2 regula a biodisponibilidade da vitamina E e da vitamina K,

um cofator crítico para a coagulação do sangue. Variações no CYP4F2 que

afetam a biodisponibilidade da vitamina K também afetam a dosagem de

antagonistas da vitamina k, como a varfarina ou o acenocumarol(117). Um

estudo em três populações caucasianas separadas foi o primeiro a relatar

que o alelo T em rs2108622 no CYP4F2 estava associado a um aumento na

dose de varfarina. O estudo calculou que cada alelo T em rs2108622 está

associado a um aumento de 4 a 12% na dose de varfarina, de modo que um

paciente com o genótipo TT poderia requerer uma dose aproximada de 1

mg/dia de varfarina em comparação com um paciente com o genótipo CC(118).

Nossos resultados mostram que a frequência de rs2108622 foi a mais

próxima da relatada para a nossa coorte de brancos (30%), EUR do 1KGP

(29%) e NFE ExAC (29%) (Tabela 4).

As variantes na COMT, enzima metabolizadora de fase II, têm sido

associadas a transtornos psiquiátricos, incluindo esquizofrenia, percepção da

dor mediada por receptores opióides e câncer de mama. Acredita-se que a

associação de polimorfismos da COMT com doenças neuropsiquiátricas

esteja relacionada ao metabolismo de neurotransmissores de

catecolaminas(119), enquanto o papel da COMT no câncer de mama é

provavelmente resultado da metilação de catecolestrogênios(120). Além disso,

a COMT é uma das principais vias de degradação da dopamina e os

polimorfismos COMT Val/Met estão associados à atividade enzimática, que

está relacionada ao envolvimento da dopamina no processo de dependência

à nicotina. Esta meta-análise descobriu que pacientes com o genótipo AA

que são tratados com terapia de reposição de nicotina têm uma

probabilidade aumentada de cessação do tabagismo em comparação com

42

pacientes com o genótipo GG(121). A variante no gene COMT (rs4680) tem

uma frequência alélica menor de aproximadamente 50% em caucasianos,

em nossa coorte de brancos foi de 37%.

As glutationa S-transferases (GSTs), também enzima metabolizadora

de fase II, são responsáveis pela desintoxicação de uma série de fármacos e

potenciais carcinógenos através da conjugação da glutationa. GSTP1 está

dentro da classe Pi das isoformas de GST. As variantes da GSTP1 têm sido

associadas à toxicidade e aos resultados de várias drogas anticancerígenas,

particularmente agentes de platina. Um estudo avaliou os preditores

farmacogenéticos de resposta ou eventos adversos graves em câncer cólon

retal avançado. Pacientes com um genótipo variante homozigoto para

GSTP1 eram mais propensos a descontinuar FOLFOX por causa da

neurotoxicidade (24% vs 10%; p = 0,01)(122). A alta frequência para o

polimorfismo rs4147581 do gene GSTP1 em asiáticos dos bancos 1KGP

(64%) e ExAC (69%) aumenta o risco de eventos adversos em comparação

aos pacientes da raça amarela (25%).

O NAT codifica enzimas envolvidas na acetilação de aminas

aromáticas e heterocíclicas(123). O genótipo AA do SNP rs1799930 está

associado com um risco aumentado de hepatotoxicidade quando tratados

com etambutol, isoniazida, pirazinamida e rifampicina em indivíduos com

tuberculose, em comparação com o genótipo GG(124). Enquanto o genótipo

CT do rs1801280 está associado com o aumento do risco de anemia,

quando tratados com cisplatina e ciclofosfamida em mulheres com

neoplasias do ovário, em comparação com o genótipo TT(125). O

polimorfismo rs1801280 tem uma alta frequência de 40% nos pacientes com

hepatite C, porém baixa para os amarelos (6%). Esse resultado corrobora ao

de outras populações do 1KGP e ExAC, como mostra a tabela 5.

O TPMT codifica a S-metiltransferase tiopurina, que catalisa a S-

metilação de drogas tiopurinas (como 6-mercaptopurina (6-MP) e azatioprina)

e compostos sulfidrílicos aromáticos e heterocíclicos. A variação do TPMT

pode levar à toxicidade da tiopurina(126). O polimorfismo rs1800462 ocorreu

43

com uma frequência geral de 1% nos pacientes brancos. Esse resultado

corrobora ao de outras populações caucasianas, nas quais a frequência foi

de 1% em europeus e 0% em outras etnias (Tabela 5).

UGT1A1 é a única enzima responsável pela glucuronidação da

bilirrubina, permitindo sua excreção. É também responsável pela

glucuronidação de outros xenobióticos, como o SN-38, o metabólito ativo do

irinotecano(127). Pacientes epilépticos com genótipo G/G em UGT2B7 *2 e *3,

rs7439366 e rs12233719, respectivamente, apresentam associação com

concentrações aumentadas de ácido valpróico em comparação com

genótipo T/T. Então, pacientes com epilepsia com esses genótipos podem

ser necessários aumentar (ou diminuir) a dose de ácido valpróico para

assegurar seu efeito terapêutico(128). O polimorfismo rs12233719 é uma

variante comum entre as populações asiáticas, com frequência alélica em

pacientes da raça amarela, japonesa de Tóquio e leste asiático de 31%, 13%

e 14%, respectivamente(129). Indivíduos homozigotos para o alelo presente

têm 32% da atividade enzimática normal, e pode apresentar-se com a

síndrome de Gilbert(130).

Um dos genes responsáveis pelas enzimas do transporte de

fármacos, o ABCB1 é um dos genes mais importantes envolvidos no

transporte dos medicamentos, incluindo antidepressivos, antipsicóticos, anti-

hipertensivos e analgésicos. O rs1045642 apresentou uma frequência de 47%

nos brancos, 43% nos pardos, 25 % nos negros e 38% nos amarelos e a

frequência destes polimorfismos no 1000 Genomes e ExAC foram

semelhantes aos encontrados no nosso estudo. O alelo A deste polimorfismo

está associado à diminuição do risco de hepatotoxicidade quando tratados

com nevirapina em indivíduos com HIV, em comparação com alelo G(131).

O polimorfismo rs1128503 do gene ABCB1 está associado ao

aumento do período de sobrevida global de 0,34 a 0,44 entre os pacientes

tratados com oxaliplatina para neoplasias colorretais(132). Por outro lado, o

polimorfismo rs10276036 está associado ao risco aumentado de morte em

pacientes com osteossarcoma após quimioterapia(133). Polimorfismo

44

rs1045642 está associado às concentrações séricas aumentadas de

digoxina e hepatotoxicidade induzida pela nevirapina(134, 135) e rs212091 à

falência virológica na terapia com antiretrovirais(136). No presente estudo,

observamos que a frequência geral dos polimorfismos do gene ABCB1 entre

os pacientes com hepatite C foi semelhante à encontrada em outras

populações gerais, no 1KPG e ExAC. Maiores frequências da variante

rs1128503 foram relatadas para populações asiáticas nos 3 bancos de

dados (Tabela 6).

O polimorfismo 22273697, também conhecido como c1249G> A ou

p.V471I, é um polimorfismo não-sinônimo do gene ABCC2. De um estudo

inicial de caso-controle de 146 pacientes com epilepsia, seguido de

replicação em outros 279 pacientes, o alelo rs2273697 (A) foi associado a

reações neurológicas adversas ao uso de carbamazepina (p=0,001).

Estudos funcionais mostraram que este SNP reduziu seletivamente o

transporte de carbamazepina através da membrana celular(137). Além disso,

este SNP rs2273697 influencia a farmacocinética de talinol e irinotecano(138,

139). A frequência da nossa coorte de pacientes com hepatite C corrobora

com os bancos 1KGP e ExAC para as 4 etnias (tabela 6). Outro SNP

rs3740066 no gene ABCC2 é relatado que está associado a um maior risco

de desenvolver colestase intra-hepática da gravidez com base em um estudo

de aproximadamente 70 pacientes argentinos(140).

A variante rs1751034 (C>T) do ABCC4 apresenta uma frequência do

alelo menor de 25% nos brancos, 23% nos pardos, 6 % nos negros e 25%

nos amarelos. Os genótipos CC e CT do SNP rs1751034 estão associados

com o aumento das concentrações intracelulares de tenofovir quando

tratados em indivíduos com HIV, em comparação com o genótipo TT(141).

O rs4149056, SNP encontrado no gene SLCO1B1, que codifica a

proteína do polipetideo de transporte de anions orgânicos. Esta proteína,

encontrada principalmente no fígado, regula a absorção de inúmeras drogas

e compostos naturais. A variante rs4149056 (C) define o alelo SLCO1B1*5

que dá origem a uma alteração de aminoácidos (de valina para alanina no

45

resíduo 174) que tem reduzida atividade de captação e transporte. Portanto,

os fármacos metabolizados pelo SLCO1B1 tendem a acumular

concentrações circulantes mais elevadas(142). SLCO1B1*5 está associado

com alto risco de doenças musculares quando tratados com sinvastatina.

Outras drogas associadas à variante *5 incluem cerivastatina, pravastatina e

rosuvastatina(143, 144). Segundo o 1KPG, a frequência da variante rs4149056

do gene SLCO1B1 é relatada como diferente entre populações caucasianas

(16%) e africanas (1%). Porém, na nossa coorte de brancos (14%) e negros

(13%) esta diferença não foi observada. Outro SNP relacionado à eventos

adversos, é a variante rs628031 do gene SLC22A1 que está associado a

efeitos colaterais gastrointestinais quando tratado com metformina(145).

46

6. CONCLUSÕES

Descrevemos a distribuição da frequência do alelo menor de 2004

polimorfismos de genes ADME em pacientes portadores do vírus da hepatite

C. Assim, concluímos que a estes pacientes tem uma frequência alélica de

genes ADME diferente de outras populações. Embora a personalização do

tratamento medicamentoso com base no genótipo individual, e não na etnia,

possa ser a mais apropriada, as diferenças nas frequências alélicas entre os

continentes devem ser consideradas ao projetar ensaios clínicos de novos

medicamentos.

Além disso, concluímos uma seleção de 147 genes ADME para

compor o painel farmacogenômico.

47

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59

ANEXOS

Anexo A – Aprovação CAPPesq

60

Anexo B – Autorização da Divisão de Farmácia

61

Anexo C – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

65

Anexo D – Questionário

QUESTI ONÁRI O

Nom e:__ _ __ _ __ _ __ _ __ _ __ _ __ _ __ _ __ _ __ __ _ __ _ _ __ _ _ _ _ __ _ __ _ RG/ HC-FMUSP:_ __ _ __ _ __ __ _ _ __ _

Endereço:__ __ _ __ _ __ _ __ _ __ _ __ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ __ Bairro__ _ __ _ __ __ _ __ _ __ __ _ _ __ _

Telefone:_ __ _ __ _ __ _ __ _ __ _ __ _ _ _ _RG:_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ E-Mail:_ _ _ _ _ _ _ _____________________

1 - I dade:____ DN:___/___/___ Nacionalidade:__________________ Naturalidade:____________________

2 - Sexo:_____ 3 - Religião:________________________________ 4 – Peso:________ 5 – Altura:________

6 - Raça: 1 – Branca 2 – Negra 3 – Amarela 4 – Parda 5 – Outra ________________________

7 - Descendência Paterno: Materno:

Avó: 1 - Brasileiro 2 – Outro __________________ Avó: 1 - Brasileiro 2 – Outro __________________

Avô: 1 - Brasileiro 2 – Outro __________________ Avô: 1 - Brasileiro 2 – Outro __________________

Bisavós: 1 - Brasileiro 2 – Outro _______________ Bisavós: 1 - Brasileiro 2 - Outro _______________

8 - Profissão:_________________________ Nela tem contato com sangue: 1 – Sim (Ano(s) ___ ___) 2 – Não

9 - Escolar idade: 1 – Primário 2 – Secundário 3 – Universitário

1 0 - Situação Conjugal: 1 – Solteiro 2 – Amigado 3 – Casado 4 – Separado/Divorciado 5 – Viúvo

1 1 - Qual diagnóst ico? ( Hepat ite A,B,C,cirrose,carcinom a?) __ _ __ _ __ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ Como ficou sabendo que

estava infetado(a): _________________________________ Quando descobriu a doença: ___/___/___ Onde fez o

exame (nome do laboratório/hospital que fez o exame)_____________________________Genótipo(1,2,3)_______

1 2 - Já fez algum tratam ento: 1 – Sim 2 – Não Quando: (______________ a ______________)

Como tratou (Qual medicação usou?) : _________________________ Quanto tempo tratou? : _________________

A carga viral chegou a ficar indetectável? : 1 – Sim 2 – Não Efeitos colaterais : _____________________________

1 3 – Novos m edicam entos para Hepat ite C: 1 – Sofosbuvir 2 – Daclastavir 3 – Simeprevir 4 – Ribavirina

5 – Interferon peguilado Tempo de tratamento: 12 semanas 24 semanas Início: ___/___/___

1 4 - Já fez transplante de fígado? : 1 – Sim 2 – Não Quando: ___/___/___

1 5 - Outras doenças: __ _ __ _ ___________________________________________________________________

1 6 - Medicam entos em uso:_ _ ___________________________________________________________________

1 7 - Fum a: 1- Sim 2- Não 3- Ex-fumante Há quanto tempo:___________ Quantos/dia:___________________

1 8 – I ngere bebidas alcóolicas: 1- Sim 2- Nunca 3- Só no passado

N.o ____________

I dent if icação do a plicador

Nom e___________

Data ___/ ___/ ____

Espaço reservado para etiqueta

do paciente

66

Anexo E – Artigos publicados durante o doutorado

68

Anexo F – Material suplementar da frequência do alelo menor

Cromossomo

início Fim Posição Função do gene

Fases Gene SNP Alelo menor

Alelo maior

BR geral

BR branco

BR pardo

BR negro

BR amarelo

1 47799639 47799639 1p33 exonic Phase I CMPK1 rs7543016 G C 0.43 0.42 0.4 0.44 0.25

1 47840592 47840592 1p33 exonic Phase I CMPK1 rs6656779 G A 0.03 0.02 0.03 0.13 0

1 47834209 47834209 1p33 exonic Phase I CMPK1 rs35687416 T G 0.05 0.04 0.07 0.19 0

1 47838652 47838652 1p33 exonic Phase I CMPK1 rs72553947 G A 0.01 0.01 0 0 0

1 47838627 47838627 1p33 exonic Phase I CMPK1 rs72553946 A G 0.01 0.01 0 0 0

1 47279175 47279175 1p33 exonic Phase I CYP4B1 rs4646487 T C 0.13 0.14 0.07 0.13 0.17

1 47282772 47282772 1p33 exonic Phase I CYP4B1 rs2297809 T C 0.14 0.13 0.13 0.25 0

1 47282755 47282755 1p33 exonic Phase I CYP4B1 rs59694031 C G 0.03 0 0.1 0.13 0

1 98348885 98348885 1p21.3 exonic Phase I DPYD rs1801265 G A 0.19 0.15 0.23 0.44 0

1 97981395 97981395 1p21.3 exonic Phase I DPYD rs1801159 C T 0.23 0.2 0.3 0.19 0.44

1 98165091 98165091 1p21.3 exonic Phase I DPYD rs2297595 C T 0.05 0.05 0.03 0.06 0

1 97915624 97915624 1p21.3 exonic Phase I DPYD rs17376848 G A 0.04 0.05 0.03 0 0.06

1 97770920 97770920 1p21.3 exonic Phase I DPYD rs1801160 T C 0.07 0.09 0.07 0 0

1 98039437 98039437 1p21.3 exonic Phase I DPYD rs61622928 T C 0.01 0.01 0 0 0

69

1 97981421 97981421 1p21.3 exonic Phase I DPYD rs1801158 T C 0.03 0.03 0.03 0 0

1 98015269 98015269 1p21.3 exonic Phase I DPYD rs57918000 A G 0.01 0.01 0.03 0 0

1 226019633 226019633 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs1051740 C T 0.3 0.31 0.23 0.25 0.38

1 226026406 226026406 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs2234922 G A 0.21 0.18 0.37 0.13 0.13

1 226019653 226019653 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs1131873 A G 0.16 0.15 0.1 0.19 0.25

1 226032229 226032229 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs1051741 T C 0.11 0.09 0.17 0.06 0.13

1 226027659 226027659 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs2292568 T C 0.07 0.06 0.07 0.06 0.13

1 226033030 226033030 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs4149230 C G 0.07 0.06 0.07 0.06 0.13

1 226032928 226032928 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs4149229 A G 0.02 0 0 0.06 0.19

1 226027548 226027548 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs34143170 T C 0.04 0.06 0.03 0 0

1 226032979 226032979 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs45550332 A G 0.01 0.01 0.03 0 0

1 226019500 226019500 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs2234698 C T 0.03 0.04 0 0 0

1 226032919 226032919 1q42.12 exonic Phase I EPHX1 rs45540739 A G 0.01 0.01 0.03 0 0

1 171252287 171252287 1q24.3 exonic Phase I FMO1 rs1126692 G A 0.2 0.2 0.17 0.31 0

1 171250044 171250044 1q24.3 exonic Phase I FMO1 rs742350 T C 0.2 0.19 0.2 0.31 0

1 171174531 171174531 1q24.3 exonic Phase I FMO2 rs2020863 G A 0.11 0.12 0.1 0.13 0

1 171168545 171168545 1q24.3 exonic Phase I FMO2 rs2307492 C T 0.1 0.11 0.07 0.06 0

1 171154959 171154959 1q24.3 exonic Phase I FMO2 rs2020870 G A 0.05 0.05 0.07 0 0.17

1 171168497 171168497 1q24.3 exonic Phase I FMO2 rs140394156 C T 0.01 0.01 0 0 0

70

1 171076966 171076966 1q24.3 exonic Phase I FMO3 rs2266782 A G 0.43 0.41 0.47 0.44 0.06

1 171083174 171083174 1q24.3 exonic Phase I FMO3 rs909530 T C 0.29 0.25 0.43 0.38 0.31

1 171076935 171076935 1q24.3 exonic Phase I FMO3 rs1800822 T C 0.08 0.07 0.13 0.06 0.25

1 171080080 171080080 1q24.3 exonic Phase I FMO3 rs1736557 A G 0.05 0.06 0 0 0.25

1 171083242 171083242 1q24.3 exonic Phase I FMO3 rs2266780 G A 0.16 0.17 0.2 0.13 0.06

1 171077274 171077274 1q24.3 exonic Phase I FMO3 rs75904274 T G 0.01 0.01 0 0 0

1 110279701 110279701 1p13.3 exonic Phase II GSTM3 rs7483 T C 0.32 0.33 0.3 0.13 0.17

2 169830328 169830328 2q31.1 exonic Transporter ABCB11 rs2287622 A G 0.42 0.43 0.4 0.5 0.25

2 169842746 169842746 2q31.1 exonic Transporter ABCB11 rs7563233 C T 0.09 0.04 0.23 0.31 0

2 169847412 169847412 2q31.1 exonic Transporter ABCB11 rs2287616 G A 0.02 0.01 0 0 0.31

2 169870855 169870855 2q31.1 exonic Transporter ABCB11 rs3815675 G A 0.02 0.01 0 0 0.31

2 169824983 169824983 2q31.1 exonic Transporter ABCB11 rs11568364 C T 0.06 0.03 0.13 0.19 0

2 169869901 169869901 2q31.1 exonic Transporter ABCB11 rs4148777 G A 0.03 0.01 0.07 0 0.17

2 220083279 220083279 2q35 exonic Transporter ABCB6 rs1109866 C T 0.19 0.16 0.23 0.38 0.17

2 201526330 201526330 2q33.1 exonic Phase I AOX1 rs55754655 G A 0.13 0.1 0.2 0.25 0

2 38298150 38298150 2p22.2 exonic Phase I CYP1B1 rs1056837 A G 0.48 0.48 0.5 0.44 0

2 38298203 38298203 2p22.2 exonic Phase I CYP1B1 rs1056836 C G 0.48 0.49 0.5 0.44 0

2 38302390 38302390 2p22.2 exonic Phase I CYP1B1 rs10012 C G 0.26 0.28 0.27 0.19 0.13

2 38302177 38302177 2p22.2 exonic Phase I CYP1B1 rs1056827 A C 0.26 0.28 0.23 0.19 0.13

71

2 38298139 38298139 2p22.2 exonic Phase I CYP1B1 rs1800440 C T 0.13 0.13 0.13 0.19 0

2 38301803 38301803 2p22.2 exonic Phase I CYP1B1 rs9341249 G C 0.03 0.02 0.07 0 0

2 38298394 38298394 2p22.2 exonic Phase I CYP1B1 rs79204362 T C 0.02 0.03 0 0 0

2 204154552 204154552 2q33.2 exonic Phase I CYP20A1 rs1048013 C T 0.47 0.43 0.4 0.44 0.5

2 108994808 108994808 2q12.3 exonic Phase II SULT1C4 rs1402467 G C 0.33 0.26 0.47 0.44 0.5

2 234680951 234680951 2q37.1 exonic Phase II UGT1A1 rs201427749 T C 0.01 0.01 0 0.06 0

2 234545861 234545861 2q37.1 exonic Phase II UGT1A10 rs17854828 T C 0.12 0.09 0.3 0.06 0

2 234545294 234545294 2q37.1 exonic Phase II UGT1A10 rs11683356 A G 0.02 0.04 0 0 0

2 234545583 234545583 2q37.1 exonic Phase II UGT1A10 rs10187694 A G 0.02 0.01 0 0.06 0

2 234638249 234638249 2q37.1 exonic Phase II UGT1A3 rs7574296 G A 0.46 0.44 0.5 0.19 0.19

2 234637853 234637853 2q37.1 exonic Phase II UGT1A3 rs6706232 A G 0.46 0.44 0.5 0.19 0.19

2 234637803 234637803 2q37.1 exonic Phase II UGT1A3 rs3821242 C T 0.43 0.41 0.47 0.31 0.19


2 234638580 234638580 2q37.1 exonic Phase II UGT1A3 rs45449995 G A 0.03 0.04 0 0 0

2 234638006 234638006 2q37.1 exonic Phase II UGT1A3 rs17868336 G A 0.02 0.01 0 0.06 0



2 234627937 234627937 2q37.1 exonic Phase II UGT1A4 rs2011404 T C 0.14 0.2 0 0 0

2 234627608 234627608 2q37.1 exonic Phase II UGT1A4 rs2011425 G T 0.1 0.1 0.1 0.13 0

72

2 234627914 234627914 2q37.1 exonic Phase II UGT1A4 rs12468274 C T 0.08 0.08 0.07 0.13 0

2 234628270 234628270 2q37.1 exonic Phase II UGT1A4 rs3732217 A G 0.09 0.08 0.07 0.19 0

2 234627536 234627536 2q37.1 exonic Phase II UGT1A4 rs6755571 A C 0.03 0.03 0 0.13 0







2 234621787 234621787 2q37.1 exonic Phase II UGT1A5 rs3755322 G C 0.1 0.09 0.1 0.13 0


2 234622110 234622110 2q37.1 exonic Phase II UGT1A5 rs12475068 G C 0.1 0.09 0.1 0.13 0

2 234622061 234622061 2q37.1 exonic Phase II UGT1A5 rs3755320 A C 0.1 0.09 0.1 0.13 0



2 234622382 234622382 2q37.1 exonic Phase II UGT1A5 rs17862868 C G 0.1 0.1 0.1 0.13 0

2 234622412 234622412 2q37.1 exonic Phase II UGT1A5 rs3892170 C G 0.1 0.09 0.1 0.13 0

2 234621850 234621850 2q37.1 exonic Phase II UGT1A5 rs45470199 G A 0.02 0.01 0 0.13 0

2 234601669 234601669 2q37.1 exonic Phase II UGT1A6 rs6759892 G T 0.34 0.35 0.27 0.44 0

73

2 234601965 234601965 2q37.1 exonic Phase II UGT1A6 rs1105880 G A 0.3 0.31 0.27 0.44 0

2 234602202 234602202 2q37.1 exonic Phase II UGT1A6 rs1105879 C A 0.27 0.29 0.23 0.31 0


2 234602277 234602277 2q37.1 exonic Phase II UGT1A6 rs17863783 T G 0.05 0.03 0.07 0.19 0

2 234590970 234590970 2q37.1 exonic Phase II UGT1A7 rs17868323 T G 0.47 0.48 0.33 0.44 0

2 234590974 234590974 2q37.1 exonic Phase II UGT1A7 rs17863778 C A 0.47 0.48 0.33 0.44 0




2 234591339 234591339 2q37.1 exonic Phase II UGT1A7 rs17864686 A G 0.16 0.15 0.33 0 0

2 234591000 234591000 2q37.1 exonic Phase II UGT1A7 rs114052958 C G 0.01 0.01 0 0 0

2 234526871 234526871 2q37.1 exonic Phase II UGT1A8 rs1042597 G C 0.29 0.29 0.27 0.06 0.19


2 234526794 234526794 2q37.1 exonic Phase II UGT1A8 rs1042591 G T 0.02 0.01 0.03 0 0

2 234527183 234527183 2q37.1 exonic Phase II UGT1A8 rs17863762 A G 0.02 0.02 0 0.06 0

2 234526510 234526510 2q37.1 exonic Phase II UGT1A8 rs45504099 A C 0.01 0.01 0 0 0

2 234526784 234526784 2q37.1 exonic Phase II UGT1A8 rs17862841 T C 0.01 0.01 0 0 0


2 234580678 234580678 2q37.1 exonic Phase II UGT1A9 rs72551330 C T 0.02 0.02 0 0 0

74

2 234581168 234581168 2q37.1 exonic Phase II UGT1A9 rs151216459 T G 0.01 0.01 0 0 0.13

2 31606670 31606670 2p23.1 exonic Phase I XDH rs4407290 A G 0.02 0.02 0 0 0

2 31606685 31606685 2p23.1 exonic Phase I XDH rs113345553 T C 0.01 0.01 0 0 0

3 183685534 183685534 3q27.1 exonic Transporter ABCC5 rs939336 A G 0.4 0.42 0.43 0.25 0.19


3 183699516 183699516 3q27.1 exonic Transporter ABCC5 rs7636910 C T 0.35 0.36 0.27 0.31 0.44


3 183696387 183696387 3q27.1 exonic Transporter ABCC5 rs1053386 A G 0.03 0.02 0 0.13 0

3 121641693 121641693 3q13.33 exonic Transporter SLC15A2 rs2293616 A G 0.45 0.45 0.47 0.25 0.13

3 121643804 121643804 3q13.33 exonic Transporter SLC15A2 rs2257212 T C 0.45 0.45 0.47 0.25 0.13



3 121646641 121646641 3q13.33 exonic Transporter SLC15A2 rs1143670 G A 0.45 0.45 0.47 0.25 0.13

3 38357961 38357961 3p22.2 exonic Transporter SLC22A14 rs240033 G C 0.3 0.28 0.4 0.31 0.33

3 195956827 195956827 3q29 exonic Transporter SLC51A rs17852687 C T 0.47 0.47 0.33 0.5 0.13

4 89061114 89061114 4q22.1 exonic Transporter ABCG2 rs2231137 T C 0.07 0.05 0 0.44 0.25

4 89052323 89052323 4q22.1 exonic Transporter ABCG2 rs2231142 T G 0.13 0.14 0.1 0.06 0.25

4 89052964 89052964 4q22.1 exonic Transporter ABCG2 rs2231139 A G 0.01 0 0.03 0.06 0

4 100239319 100239319 4q23 exonic Phase I ADH1B rs1229984 T C 0.1 0.07 0.1 0.06 0.17

75

4 100235053 100235053 4q23 exonic Phase I ADH1B rs1789882 A G 0.13 0.12 0.2 0.06 0.17

4 100229017 100229017 4q23 exonic Phase I ADH1B rs2066702 A G 0.03 0.02 0.07 0 0

4 100235140 100235140 4q23 exonic Phase I ADH1B rs2018417 A C 0.02 0.03 0 0 0

4 100229016 100229016 4q23 exonic Phase I ADH1B rs75967634 T C 0.01 0.01 0.03 0 0

4 100268190 100268190 4q23 exonic Phase I ADH1C rs283413 A C 0.02 0.01 0.07 0.06 0

4 100260789 100260789 4q23 exonic Phase I ADH1C rs698 C T 0.24 0.24 0.33 0.19 0

4 100341861 100341861 4q23 exonic Phase I ADH7 rs971074 T C 0.15 0.17 0.07 0.19 0

4 69964337 69964337 4q13.2 exonic Phase II UGT2B7 rs7438284 A T 0.44 0.43 0.47 0.5 0

4 69964338 69964338 4q13.2 exonic Phase II UGT2B7 rs7439366 T C 0.44 0.43 0.47 0.5 0

4 69964271 69964271 4q13.2 exonic Phase II UGT2B7 rs28365062 G A 0.16 0.17 0.2 0.13 0

4 69962610 69962610 4q13.2 exonic Phase II UGT2B7 rs28365063 G A 0.15 0.14 0.1 0.06 0.38

4 69962449 69962449 4q13.2 exonic Phase II UGT2B7 rs12233719 T G 0.02 0 0 0 0.31

4 69964391 69964391 4q13.2 exonic Phase II UGT2B7 rs34661811 A C 0.03 0.03 0 0.13 0

4 69962375 69962375 4q13.2 exonic Phase II UGT2B7 rs61361928 C T 0.01 0.01 0 0 0

5 131676320 131676320 5q31.1 exonic Transporter SLC22A4 rs1050152 T C 0.34 0.35 0.4 0.25 0

5 140682891 140682891 5q31.3 exonic Transporter SLC25A2 rs3749779 C A 0.03 0.02 0.07 0 0.06

5 140682958 140682958 5q31.3 exonic Transporter SLC25A2 rs10075302 A C 0.07 0.09 0 0.06 0

6 43412865 43412865 6p21.1 exonic Transporter ABCC10 rs2125739 C T 0.31 0.33 0.37 0.13 0

6 43406501 43406501 6p21.1 exonic Transporter ABCC10 rs2277122 T C 0.05 0.04 0.03 0 0.25

76

6 43412935 43412935 6p21.1 exonic Transporter ABCC10 rs2125740 C T 0.06 0.05 0.1 0.06 0

6 43400342 43400342 6p21.1 exonic Transporter ABCC10 rs45535935 G T 0.03 0.04 0 0 0

6 24503590 24503590 6p22.3 exonic Phase I ALDH5A1 rs2760118 T C 0.32 0.33 0.33 0.31 0

6 24503597 24503597 6p22.3 exonic Phase I ALDH5A1 rs3765310 T C 0.03 0.04 0 0 0

6 46563817 46563817 6p12.3 exonic Phase I CYP39A1 rs7761731 T A 0.38 0.34 0.5 0.44 0.33

6 52617731 52617731 6p12.2 exonic Phase II GSTA2 rs2180314 C G 0.43 0.43 0.4 0.5 0.5

6 52617738 52617738 6p12.2 exonic Phase II GSTA2 rs2234951 A G 0.02 0 0.03 0 0.33

6 160551204 160551204 6q25.3 exonic Transporter SLC22A1 rs683369 G C 0.17 0.2 0.2 0 0.13


6 160543123 160543123 6q25.3 exonic Transporter SLC22A1 rs1867351 C T 0.28 0.25 0.3 0.19 0.5


6 160543148 160543148 6q25.3 exonic Transporter SLC22A1 rs12208357 T C 0.05 0.06 0.1 0 0

6 160575907 160575907 6q25.3 exonic Transporter SLC22A1 rs35270274 T G 0.01 0 0.03 0.06 0

6 160575837 160575837 6q25.3 exonic Transporter SLC22A1 rs34059508 A G 0.02 0.02 0 0 0

6 160557646 160557646 6q25.3 exonic Transporter SLC22A1 rs34205214 A G 0.01 0 0.03 0.06 0


6 110777962 110777962 6q21 exonic Transporter SLC22A16 rs6907567 G A 0.22 0.19 0.2 0.44 0.33

6 110778128 110778128 6q21 exonic Transporter SLC22A16 rs714368 C T 0.22 0.19 0.2 0.44 0.33

6 110760008 110760008 6q21 exonic Transporter SLC22A16 rs12210538 G A 0.22 0.23 0.3 0.13 0

77

6 110763875 110763875 6q21 exonic Transporter SLC22A16 rs723685 G A 0.08 0.09 0.03 0.13 0

6 110759943 110759943 6q21 exonic Transporter SLC22A16 rs35948062 T C 0.02 0.01 0.03 0 0

6 110763935 110763935 6q21 exonic Transporter SLC22A16 rs41288594 C T 0.02 0.02 0.03 0 0

6 110778093 110778093 6q21 exonic Transporter SLC22A16 rs147338757 T C 0.01 0.01 0 0 0

6 160670282 160670282 6q25.3 exonic Transporter SLC22A2 rs316019 A C 0.11 0.11 0.03 0.19 0.19

6 160645832 160645832 6q25.3 exonic Transporter SLC22A2 rs316003 C T 0.31 0.28 0.27 0.38 0.31




6 46623698 46623698 6p12.3 exonic Transporter SLC25A27 rs3757241 T C 0.15 0.14 0.17 0.25 0

6 35923246 35923246 6p21.31 exonic Transporter SLC26A8 rs2295852 C T 0.4 0.4 0.5 0.31 0.06

6 35980121 35980121 6p21.31 exonic Transporter SLC26A8 rs743923 T C 0.32 0.33 0.3 0.25 0.25

6 35967772 35967772 6p21.31 exonic Transporter SLC26A8 rs17713154 C T 0.15 0.17 0.1 0.06 0.06

6 35960390 35960390 6p21.31 exonic Transporter SLC26A8 rs17707331 T C 0.14 0.17 0.07 0.06 0.06

6 18139214 18139214 6p22.3 exonic Phase II TPMT rs2842934 G A 0.2 0.22 0.13 0.19 0.44

6 18130918 18130918 6p22.3 exonic Phase II TPMT rs1142345 C T 0.05 0.07 0 0 0.06

6 18139228 18139228 6p22.3 exonic Phase II TPMT rs1800460 T C 0.04 0.05 0 0 0

6 18130993 18130993 6p22.3 exonic Phase II TPMT rs56161402 T C 0.01 0.01 0.03 0 0

6 18143955 18143955 6p22.3 exonic Phase II TPMT rs1800462 G C 0.01 0.01 0 0 0

78

7 87229501 87229501 7q21.12 exonic Transporter ABCB1 rs2214102 T C 0.06 0.06 0.1 0.06 0

7 87160618 87160618 7q21.12 exonic Transporter ABCB1 rs2032582 A T 0.36 0.04 0 NA 0.17



7 87229440 87229440 7q21.12 exonic Transporter ABCB1 rs9282564 C T 0.09 0.1 0.1 0 0

7 87179809 87179809 7q21.12 exonic Transporter ABCB1 rs2229109 T C 0.03 0.04 0.03 0 0

7 87160645 87160645 7q21.12 exonic Transporter ABCB1 rs9282563 A G 0.01 0.01 0 0 0

7 20682884 20682884 7p21.1 exonic Transporter ABCB5 rs17143212 T C 0.04 0.03 0.03 0.13 0.17

7 99447241 99447241 7q22.1 exonic Phase I CYP3A43 rs800667 C T 0.15 0.12 0.23 0.31 0

7 99262835 99262835 7q22.1 exonic Phase I CYP3A5 rs10264272 T C 0.02 0.01 0.1 0 0

7 99262805 99262805 7q22.1 exonic Phase I CYP3A5 rs28383472 C T 0.01 0.01 0.03 0 0

7 99273815 99273815 7q22.1 exonic Phase I CYP3A5 rs28383468 A G 0.02 0.03 0 0 0

7 99250236 99250236 7q22.1 exonic Phase I CYP3A5 rs28365083 T G 0.01 0.02 0 0 0

7 99306685 99306685 7q22.1 exonic Phase I CYP3A7 rs2257401 C G 0.2 0.15 0.2 0.44 0.25

7 91743150 91743150 7q21.2 exonic Phase I CYP51A1 rs7797834 G A 0.37 0.39 0.37 0.31 0

7 150696111 150696111 7q36.1 exonic Phase I NOS3 rs1799983 T G 0.31 0.35 0.27 0.13 0

7 150696078 150696078 7q36.1 exonic Phase I NOS3 rs9282804 T C 0.03 0.01 0.03 0.13 0

7 94937446 94937446 7q21.3 exonic Phase I PON1 rs662 C T 0.34 0.34 0.2 0.44 0.5

7 94946084 94946084 7q21.3 exonic Phase I PON1 rs854560 T A 0.36 0.39 0.27 0.38 0

79

8 18080196 18080196 8p22 exonic Phase II NAT1 rs4986783 G T 0.02 0.02 0.03 0 0

8 18080116 18080116 8p22 exonic Phase II NAT1 rs4986782 A G 0.02 0.01 0.03 0.06 0

8 18258316 18258316 8p22 exonic Phase II NAT2 rs1208 G A 0.42 0.46 0.33 0.44 0.06

8 18257795 18257795 8p22 exonic Phase II NAT2 rs1041983 T C 0.37 0.33 0.47 0.44 0.31

8 18257854 18257854 8p22 exonic Phase II NAT2 rs1801280 C T 0.4 0.45 0.3 0.38 0.06

8 18257994 18257994 8p22 exonic Phase II NAT2 rs1799929 T C 0.38 0.43 0.27 0.31 0.06

8 18258103 18258103 8p22 exonic Phase II NAT2 rs1799930 A G 0.28 0.27 0.43 0.19 0.19

8 18258370 18258370 8p22 exonic Phase II NAT2 rs1799931 A G 0.05 0.04 0.03 0.06 0.13

8 18257704 18257704 8p22 exonic Phase II NAT2 rs1801279 A G 0.03 0.01 0.07 0.19 0

8 18258279 18258279 8p22 exonic Phase II NAT2 rs55700793 G A 0.02 0.01 0.07 0 0


8 118184784 118184784 8q24.11 exonic Transporter SLC30A8 rs16889462 A G 0.02 0.01 0 0.06 0

9 107562804 107562804 9q31.1 exonic Transporter ABCA1 rs2230808 T C 0.43 0.38 0.47 0.31 0.5



9 107620835 107620835 9q31.1 exonic Transporter ABCA1 rs9282541 A G 0.02 0.01 0.03 0 0

9 107620889 107620889 9q31.1 exonic Transporter ABCA1 rs115216814 T A 0.01 0.01 0.03 0 0

10 101604207 101604207 10q24.2 exonic Transporter ABCC2 rs3740066 T C 0.37 0.41 0.27 0.25 0.19


80

10 101611294 101611294 10q24.2 exonic Transporter ABCC2 rs8187710 A G 0.09 0.09 0.17 0 0

10 101606861 101606861 10q24.2 exonic Transporter ABCC2 rs1137968 T G 0.07 0.07 0.1 0 0

10 101595996 101595996 10q24.2 exonic Transporter ABCC2 rs17222723 A T 0.07 0.07 0.1 0 0


10 101595975 101595975 10q24.2 exonic Transporter ABCC2 rs8187692 T G 0.01 0 0 0.13 0

10 101605503 101605503 10q24.2 exonic Transporter ABCC2 rs7899457 T C 0.02 0.01 0.03 0 0


10 101560169 101560169 10q24.2 exonic Transporter ABCC2 rs7080681 A G 0.01 0.01 0 0 0

10 101564012 101564012 10q24.2 exonic Transporter ABCC2 rs113646094 G C 0.02 0.01 0.03 0.06 0

10 96541616 96541616 10q23.33

exonic Phase I CYP2C19 rs4244285 A G 0.18 0.18 0.1 0.25 0.19

10 96602622 96602622 10q23.33

exonic Phase I CYP2C19 rs3758580 T C 0.18 0.18 0.1 0.25 0.19

10 96522561 96522561 10q23.33

exonic Phase I CYP2C19 rs17885098 C T 0.06 0.05 0.1 0.06 0.25

10 96602623 96602623 10q23.33

exonic Phase I CYP2C19 rs3758581 A G 0.04 0.04 0.07 0 0

10 96609775 96609775 10q23.33

exonic Phase I CYP2C19 rs17886522 C A 0.01 0.01 0 0 0.25

10 96540410 96540410 10q23.33

exonic Phase I CYP2C19 rs4986893 A G 0.01 0 0 0 0.25

10 96534922 96534922 10q23.33

exonic Phase I CYP2C19 rs17878459 C G 0.03 0.03 0.03 0 0

10 96818106 96818106 10q23.33

exonic Phase I CYP2C8 rs11572103 A T 0.02 0.01 0.03 0.13 0

10 96826966 96826966 10q23.33

exonic Phase I CYP2C8 rs11572081 T C 0.03 0.01 0.1 0.06 0

10 96798749 96798749 10q23.33

exonic Phase I CYP2C8 rs10509681 C T 0.12 0.13 0.13 0.13 0

81

10 96827030 96827030 10q23.33


10 96818119 96818119 10q23.33

exonic Phase I CYP2C8 rs1058930 C G 0.06 0.07 0.03 0 0

10 96748737 96748737 10q23.33

exonic Phase I CYP2C9 rs1057911 T A 0.05 0.05 0.07 0 0

10 96741053 96741053 10q23.33

exonic Phase I CYP2C9 rs1057910 C A 0.05 0.05 0.07 0 0

10 96702047 96702047 10q23.33


10 96748635 96748635 10q23.33


10 96709023 96709023 10q23.33

exonic Phase I CYP2C9 rs149158426 T C 0.01 0.01 0 0 0

10 135347397 135347397 10q26.3 exonic Phase I CYP2E1 rs915909 T C 0.01 0.01 0.03 0 0

10 135351362 135351362 10q26.3 exonic Phase I CYP2E1 rs2515641 T C 0.2 0.17 0.27 0.19 0.25

10 135345675 135345675 10q26.3 exonic Phase I CYP2E1 rs6413419 A G 0.06 0.04 0.1 0.19 0

11 17418477 17418477 11p15.1 exonic Transporter ABCC8 rs757110 C A 0.3 0.34 0.17 0.25 0.33

11 67353970 67353970 11q13.2 exonic Phase II GSTP1 rs4891 C T 0.36 0.34 0.4 0.5 0.19

11 67352689 67352689 11q13.2 exonic Phase II GSTP1 rs1695 G A 0.36 0.01 0 0 0.14

11 67353579 67353579 11q13.2 exonic Phase II GSTP1 rs1138272 T C 0.04 0.06 0 0 0

11 64332779 64332779 11q13.1 exonic Transporter SLC22A11 rs75933978 T G 0.01 0.01 0 0 0

11 64359286 64359286 11q13.1 exonic Transporter SLC22A12 rs3825016 C T 0.41 0.31 0.43 0.25 0

11 64360274 64360274 11q13.1 exonic Transporter SLC22A12 rs11231825 T C 0.41 0.31 0.4 0.25 0

11 64359274 64359274 11q13.1 exonic Transporter SLC22A12 rs3825017 T C 0.02 0.01 0 0.13 0

11 62751911 62751911 11q12.3 exonic Transporter SLC22A6 rs11568628 A C 0.06 0.05 0.1 0 0.06

82

11 62751812 62751812 11q12.3 exonic Transporter SLC22A6 rs11568629 C T 0.06 0.05 0.1 0 0.06

11 62752014 62752014 11q12.3 exonic Transporter SLC22A6 rs11568626 T C 0.01 0 0.03 0.06 0


11 62766431 62766431 11q12.3 exonic Transporter SLC22A8 rs2276299 T A 0.16 0.16 0.13 0.25 0.31

11 62763226 62763226 11q12.3 exonic Transporter SLC22A8 rs57743826 T C 0.03 0.03 0.03 0 0

11 74883577 74883577 11q13.4 exonic Transporter SLCO2B1 rs12422149 A G 0.2 0.2 0.17 0.19 0.31

11 74907582 74907582 11q13.4 exonic Transporter SLCO2B1 rs2306168 T C 0.07 0.04 0.17 0.13 0.19

11 74907721 74907721 11q13.4 exonic Transporter SLCO2B1 rs61555831 T C 0.04 0.04 0.03 0.06 0

11 74876951 74876951 11q13.4 exonic Transporter SLCO2B1 rs1109407 A G 0.01 0.01 0.03 0 0

11 74880370 74880370 11q13.4 exonic Transporter SLCO2B1 rs35199625 A G 0.02 0.01 0 0 0.19

12 58158558 58158558 12q14.1 exonic Phase I CYP27B1 rs8176345 T C 0.06 0.07 0.07 0 0

12 21487544 21487544 12p12.1 exonic Transporter SLCO1A2 rs10841795 G A 0.13 0.15 0.1 0.06 0

12 21428307 21428307 12p12.1 exonic Transporter SLCO1A2 rs11568565 A G 0.05 0.06 0 0.06 0

12 21457434 21457434 12p12.1 exonic Transporter SLCO1A2 rs11568563 G T 0.04 0.03 0.07 0.06 0

12 21329738 21329738 12p12.1 exonic Transporter SLCO1B1 rs2306283 A G 0.47 0.49 0.4 0.25 0.44

12 21331625 21331625 12p12.1 exonic Transporter SLCO1B1 rs2291075 T C 0.41 0.42 0.5 0.44 0.13


12 21331549 21331549 12p12.1 exonic Transporter SLCO1B1 rs4149056 C T 0.14 0.14 0.2 0.13 0.06

12 21329813 21329813 12p12.1 exonic Transporter SLCO1B1 rs11045819 A C 0.13 0.14 0.1 0.13 0

83

12 21329761 21329761 12p12.1 exonic Transporter SLCO1B1 rs11045818 A G 0.12 0.14 0.1 0.06 0

12 21391976 21391976 12p12.1 exonic Transporter SLCO1B1 rs34671512 C A 0.07 0.08 0.07 0.06 0

12 21353557 21353557 12p12.1 exonic Transporter SLCO1B1 rs57040246 T C 0.01 0.01 0.03 0 0

12 21358922 21358922 12p12.1 exonic Transporter SLCO1B1 rs74064211 T C 0.01 0 0.03 0.06 0

12 21329802 21329802 12p12.1 exonic Transporter SLCO1B1 rs2306282 G A 0.01 0 0 0 0.19

12 21036411 21036411 12p12.2 exonic Transporter SLCO1B3 rs2053098 A G 0.2 0.17 0.2 0.5 0.25

12 21011480 21011480 12p12.2 exonic Transporter SLCO1B3 rs4149117 T G 0.2 0.17 0.2 0.5 0.25

12 21015760 21015760 12p12.2 exonic Transporter SLCO1B3 rs7311358 G A 0.2 0.17 0.2 0.5 0.25

12 21054369 21054369 12p12.2 exonic Transporter SLCO1B3 rs3764006 G A 0.19 0.15 0.27 0.38 0.19

12 21028208 21028208 12p12.2 exonic Transporter SLCO1B3 rs60140950 C G 0.1 0.12 0.1 0 0

12 21069049 21069049 12p12.2 exonic Transporter SLCO1B3 rs60571683 A G 0.09 0.11 0.03 0.06 0

12 21014030 21014030 12p12.2 exonic Transporter SLCO1B3 rs57585902 G A 0.01 0 0.07 0 0

12 20968741 20968741 12p12.2 exonic Transporter SLCO1B3 rs149944473 T C 0.01 0 0 0.13 0


12 21243035 21243035 12p12.2 exonic Transporter SLCO1B7 rs73241802 A C 0.01 0.01 0 0.06 0

13 95726541 95726541 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs1189466 A G 0.04 0.04 0 0 0.25

13 95727780 95727780 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs1678339 T C 0.04 0.04 0 0 0.25


13 95714976 95714976 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs1751034 C T 0.23 0.25 0.23 0.06 0.25

84



13 95859035 95859035 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs2274407 A C 0.11 0.12 0.1 0.06 0.38

13 95839003 95839003 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs1557070 A G 0.05 0.02 0.07 0.31 0

13 95863008 95863008 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs11568658 A C 0.03 0.02 0.07 0 0.13

13 95696540 95696540 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs11568695 T C 0.02 0 0.07 0.13 0

13 95815415 95815415 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs3765534 T C 0.03 0.01 0.07 0 0.25

13 95715014 95715014 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs11568655 G A 0.03 0 0.07 0.19 0

13 95727794 95727794 13q32.1 exonic Transporter ABCC4 rs45504892 A C 0.01 0.01 0 0.06 0




13 99358401 99358401 13q32.3 exonic Transporter SLC15A1 rs4646227 G C 0.04 0.02 0 0.25 0

13 99356607 99356607 13q32.3 exonic Transporter SLC15A1 rs8187838 T G 0.02 0.03 0 0 0

13 99376167 99376167 13q32.3 exonic Transporter SLC15A1 rs8187820 T C 0.02 0 0.07 0.06 0

14 77794283 77794283 14q24.3 exonic Phase II GSTZ1 rs1046428 T C 0.21 0.22 0.17 0.19 0.17

14 77793207 77793207 14q24.3 exonic Phase II GSTZ1 rs7975 A G 0.31 0.34 0.17 0.25 0.33

14 77793237 77793237 14q24.3 exonic Phase II GSTZ1 rs7972 A G 0.09 0.1 0.03 0.06 0

14 70263648 70263648 14q24.2 exonic Transporter SLC10A1 rs4646285 T C 0.1 0.13 0.03 0 0.13

85


15 75012987 75012987 15q24.1 exonic Phase I CYP1A1 rs1799814 T G 0.03 0.04 0 0 0

15 75012979 75012979 15q24.1 exonic Phase I CYP1A1 rs41279188 T G 0.01 0.01 0.03 0 0


15 85478410 85478410 15q25.3 exonic Transporter SLC28A1 rs2242048 A G 0.14 0.15 0.17 0.06 0



15 85478729 85478729 15q25.3 exonic Transporter SLC28A1 rs2242046 A G 0.38 0.43 0.37 0.19 0


15 85448796 85448796 15q25.3 exonic Transporter SLC28A1 rs8187755 T A 0.02 0.01 0.03 0.13 0

15 85447434 85447434 15q25.3 exonic Transporter SLC28A1 rs45523532 T G 0.01 0.01 0 0.06 0


15 45554267 45554267 15q21.1 exonic Transporter SLC28A2 rs1060896 C A 0.46 0.36 0.37 0.19 0

15 45545478 45545478 15q21.1 exonic Transporter SLC28A2 rs11854484 C T 0.49 0.38 0.3 0.19 0

15 92647645 92647645 15q26.1 exonic Transporter SLCO3A1 rs1517618 G C 0.09 0.09 0.07 0.19 0

15 92638193 92638193 15q26.1 exonic Transporter SLCO3A1 rs2286355 A G 0.4 0.45 0.33 0.06 0.38

15 92694207 92694207 15q26.1 exonic Transporter SLCO3A1 rs2302085 T C 0.02 0.01 0 0 0.25

15 92459258 92459258 15q26.1 exonic Transporter SLCO3A1 rs147724901 T C 0.02 0.01 0.07 0 0

15 92647684 92647684 15q26.1 exonic Transporter SLCO3A1 rs72655652 C A 0.01 0.01 0 0 0

86

16 16162019 16162019 16p13.11

exonic Transporter ABCC1 rs35605 T C 0.2 0.25 0.07 0.13 0.13

16 16138322 16138322 16p13.11

exonic Transporter ABCC1 rs246221 C T 0.43 0.4 0.43 0.38 0.38

16 16139714 16139714 16p13.11

exonic Transporter ABCC1 rs35587 C T 0.41 0.39 0.4 0.38 0.38

16 16228242 16228242 16p13.11

exonic Transporter ABCC1 rs2230671 A G 0.23 0.23 0.13 0.25 0.25

16 16162039 16162039 16p13.11

exonic Transporter ABCC1 rs8187858 T C 0.07 0.07 0.1 0.06 0

16 16138313 16138313 16p13.11

exonic Transporter ABCC1 rs2230669 A G 0.05 0.06 0.03 0 0

16 16139720 16139720 16p13.11


16 16232380 16232380 16p13.11

exonic Transporter ABCC1 rs35148086 T C 0.02 0.01 0 0.13 0

16 16173232 16173232 16p13.11

exonic Transporter ABCC1 rs45511401 T G 0.04 0.04 0.03 0.06 0



16 16251599 16251599 16p13.11


16 16251531 16251531 16p13.11

exonic Transporter ABCC6 rs58694313 T C 0.01 0.01 0.03 0 0

16 69745145 69745145 16q22.1 exonic Phase II NQO1 rs1800566 A G 0.27 0.26 0.3 0.31 0.33

16 69748869 69748869 16q22.1 exonic Phase II NQO1 rs1131341 A G 0.01 0.01 0 0 0

16 28617413 28617413 16p11.2 exonic Phase II SULT1A1 rs28374453 G A 0.02 0 0.03 0.13 0

16 28617485 28617485 16p11.2 exonic Phase II SULT1A1 rs1801030 C T 0.05 0.01 0.07 0.31 0

16 28617507 28617507 16p11.2 exonic Phase II SULT1A1 rs41278160 T C 0.07 0.08 0.03 0.06 0.13


87

16 28617552 28617552 16p11.2 exonic Phase II SULT1A1 rs3176926 G C 0.31 0.32 0.3 0.31 0.19


16 28619920 28619920 16p11.2 exonic Phase II SULT1A1 rs1126446 G A 0.3 0.3 0.3 0.31 0.19

16 28619911 28619911 16p11.2 exonic Phase II SULT1A1 rs1126447 C T 0.29 0.3 0.3 0.31 0.19

17 48762223 48762223 17q21.33


17 48761105 48761105 17q21.33


17 48753423 48753423 17q21.33


17 48768486 48768486 17q21.33

exonic Transporter ABCC3 rs1051640 G A 0.15 0.14 0.2 0.13 0.06

17 48761053 48761053 17q21.33

exonic Transporter ABCC3 rs11568591 A G 0.06 0.09 0 0 0

17 48734136 48734136 17q21.33

exonic Transporter ABCC3 rs35777968 A G 0.01 0.01 0 0.06 0

17 48744953 48744953 17q21.33

exonic Transporter ABCC3 rs11568602 C G 0.02 0.01 0.07 0 0

17 48745035 48745035 17q21.33

exonic Transporter ABCC3 rs11568601 C A 0.02 0.01 0 0.06 0

17 19642952 19642952 17p11.2 exonic Phase I ALDH3A1 rs2228100 C G 0.26 0.24 0.33 0.38 0.17

17 19458972 19458972 17p11.2 exonic Transporter SLC47A1 rs16960203 T C 0.04 0.04 0 0.13 0.06


19 41597751 41597751 19q13.2 exonic Phase I CYP2A13 rs8192789 T C 0.05 0.05 0.03 0.19 0.06

19 41594450 41594450 19q13.2 exonic Phase I CYP2A13 rs8192784 A G 0.05 0.05 0.03 0.19 0.06

19 41594442 41594442 19q13.2 exonic Phase I CYP2A13 rs141107958 T A 0.01 0.01 0.03 0 0

19 41349786 41349786 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs145014075 T G 0.11 0.09 0.17 0.19 0

88


19 41354606 41354606 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs4986892 T G 0.25 0.23 0.33 0.25 0.5


19 41355849 41355849 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs2302990 G A 0.27 0.25 0.37 0.31 0.21

19 41350664 41350664 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs1809810 A T 0.01 0.01 0 0.06 0.07

19 41356281 41356281 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs1137115 T C 0.18 0.2 0.13 0.13 0.29

19 41350594 41350594 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs2002977 A G 0.06 0.06 0.07 0.13 0

19 41356188 41356188 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs56283800 T C 0.06 0.06 0.07 0.13 0




19 41354553 41354553 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs28399441 T C 0.02 0 0.07 0.13 0

19 41356310 41356310 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs8192720 A G 0.02 0.01 0.07 0 0.29

19 41351267 41351267 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs28399454 T C 0.02 0 0.07 0.13 0

19 41352936 41352936 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs28399448 T C 0.02 0.02 0 0.06 0

19 41354533 41354533 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs1801272 T A 0.02 0.01 0.03 0 0

19 41349759 41349759 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs6413474 C T 0.01 0.01 0.03 0 0

19 41350630 41350630 19q13.2 exonic Phase I CYP2A6 rs56314118 G A 0.01 0.01 0 0.06 0

19 41381647 41381647 19q13.2 exonic Phase I CYP2A7 rs12460590 A C 0.32 0.31 0.33 0.25 0.33

89

19 41381683 41381683 19q13.2 exonic Phase I CYP2A7 rs71358943 T G 0.09 0.07 0.13 0.19 0

19 41381671 41381671 19q13.2 exonic Phase I CYP2A7 rs200525410 G A 0.01 0.01 0.03 0 0

19 41515263 41515263 19q13.2 exonic Phase I CYP2B6 rs2279343 G A 0.29 0.27 0.3 0.44 0.17

19 41512841 41512841 19q13.2 exonic Phase I CYP2B6 rs3745274 T G 0.3 0.29 0.3 0.44 0.19


19 41509950 41509950 19q13.2 exonic Phase I CYP2B6 rs2279341 C G 0.05 0.05 0.1 0 0.06

19 41497274 41497274 19q13.2 exonic Phase I CYP2B6 rs8192709 T C 0.05 0.01 0 0 0.06

19 41518221 41518221 19q13.2 exonic Phase I CYP2B6 rs28399499 C T 0.01 0.01 0 0.06 0

19 41515255 41515255 19q13.2 exonic Phase I CYP2B6 rs45482602 A C 0.01 0.01 0 0.06 0


19 16025176 16025176 19p13.12

exonic Phase I CYP4F11 rs1060463 C T 0.49 0.45 0.4 0.31 0.5

19 15990431 15990431 19p13.12

exonic Phase I CYP4F2 rs2108622 T C 0.28 0.3 0.3 0.13 0.17

19 16008388 16008388 19p13.12

exonic Phase I CYP4F2 rs3093105 C A 0.22 0.19 0.37 0.25 0

19 49096065 49096065 19q13.33

exonic Phase II SULT2B1 rs2302948 T C 0.22 0.21 0.23 0.31 0.17

21 37442632 37442632 21q22.12

exonic Phase I CBR1 rs25678 C G 0.12 0.13 0.1 0 0.17

21 37444973 37444973 21q22.12

exonic Phase I CBR1 rs20572 T C 0.1 0.11 0.07 0 0.17

21 37445039 37445039 21q22.12

exonic Phase I CBR1 rs2230192 A G 0.04 0.04 0 0.06 0

21 37444937 37444937 21q22.12

exonic Phase I CBR1 rs2230191 A G 0.02 0.01 0 0.06 0

21 37507745 37507745 21q22.12

exonic Phase I CBR3 rs881711 C T 0.15 0.15 0.13 0.06 0.33

90

21 37518706 37518706 21q22.12

exonic Phase I CBR3 rs1056892 A G 0.34 0.35 0.4 0.25 0.17

21 37507501 37507501 21q22.12

exonic Phase I CBR3 rs8133052 A G 0.48 0.46 0.47 0.31 0.5

21 37507769 37507769 21q22.12

exonic Phase I CBR3 rs881712 T C 0.4 0.41 0.4 0.31 0.5



21 46950863 46950863 21q22.3 exonic Transporter SLC19A1 rs79091853 T C 0.01 0.01 0 0 0.13


22 19950235 19950235 22q11.21

exonic Phase II COMT rs4633 T C 0.36 0.38 0.3 0.44 0.17

22 19951271 19951271 22q11.21

exonic Phase II COMT rs4680 A G 0.36 0.37 0.33 0.38 0.13

22 19951207 19951207 22q11.21

exonic Phase II COMT rs4818 G C 0.45 0.49 0.37 0.19 0.38

22 19950268 19950268 22q11.21

exonic Phase II COMT rs740602 A G 0.04 0.01 0.13 0.19 0

22 19951237 19951237 22q11.21

exonic Phase II COMT rs8192488 T C 0.01 0.01 0.03 0 0

22 19950263 19950263 22q11.21

exonic Phase II COMT rs6267 T G 0.01 0.01 0 0 0.17

22 42523943 42523943 22q13.2 exonic Phase I CYP2D6 rs16947 A G 0.38 0.39 0.39 0.44 0.06

22 42522613 42522613 22q13.2 exonic Phase I CYP2D6 rs1135840 C G 0.43 0.4 0.43 0.44 0.44

22 42526694 42526694 22q13.2 exonic Phase I CYP2D6 rs1065852 A G 0.2 0.21 0.2 0.13 0.5

22 42525772 42525772 22q13.2 exonic Phase I CYP2D6 rs28371706 A G 0.03 0.04 0 0.06 0

22 42525134 42525134 22q13.2 exonic Phase I CYP2D6 rs61736512 T C 0.02 0.01 0.07 0 0

Frequência de polimorfismos nos genes responsáveis pela ... · absorção, distribuição,...

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